WO2002072615A1

WO2002072615A1 - Methode de purification de proteines

Info

Publication number: WO2002072615A1
Application number: PCT/JP2002/002248
Authority: WO
Inventors: Kozo Takeda; Norimichi Ochi
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2002-03-11
Publication date: 2002-09-19
Also published as: US20080255342A1; US7332289B2; EP1380589A1; EP3088412A1; US7927815B2; JP2009062380A; ES2869895T3; JP5036679B2; EP1380589A4; JP4391086B2; US20040138424A1; EP2336149A1; JPWO2002072615A1; EP3088412B1

Description

明細書

タンパク質精製方法技術分野

本発明はタンパク質の精製方法に関し、さらに詳しくは抗体などの生理活性タンパク質を含有する試料中から夾雑物としての D N Aを除去する方法に関する。背景技術

遺伝子組換え技術の発達によって、種々のタンパク質製剤が安定した供給量で提供されるようになった。特に、近年通常の医薬品に比べて選択性の高い様々な抗体医薬品が遺伝子組換え技術によって開発されており、臨床試験に入っている。このような遺伝子組換え技術によつて産生された生理活性タンパク質を含有する製剤においては、宿主 D N Aやウィルスの汚染による D N A夾雑物を除去する必要がある。現在、バイオ医薬品における D N Aの許容量は 1 0 0 p g D N A 一投与量以下であることが世界保健機構（WH O) により示されている。この基準を満たすために、一般には、宿主細胞から得られる生理活性タンパク質を含有する水性培地を陰ィオン交換クロマトグラフィ一、ハイドロキシァパタイトク口マトグラフィー、もしくはこれらの組合せで処理することにより D NAを除去している。

特に、生理活性タンパク質が哺乳動物細胞を宿主として得られた抗体であるときには、プロテイン Aもしくはプロテイン Gが I g Gの F c鎖に結合する性質を利用して、プロテイン Aもしくはプロテイン Gのァフィ二ティカラムクロマトグラフィ一処理を行つた後に種々のクロマトグラフィ一で精製している。

例えば、特表平 5— 5 0 4 5 7 9号では、哺乳動物細胞培養から得られた抗体含有水性培地をプロティン Aもしくはプロティン Gカラムクロマトグラフィーに適用して抗体をカラムに吸収させ、次いで酸性溶液（濃度約 0 . 1 Mのクェン酸、 p H 3 . 0 - 3 . 5 ) を用いて抗体を溶出させ、得られる酸性溶出液をイオン交換カラムクロマトグラフィー、サイズ排除力ラムクロマトグラフィ一に順次適用して精製している。しかし、これらの各種クロマトグラフィー工程やその組合せは時間、労力、コストがかかり、煩雑であり、また効果も安定していない。

従って、より簡単な方法で、確実に DNA夾雑物を除去でき、しかも生理活性タンパク質の損失が少なく、かつ実施コストの低い生理活性タンパク質、特に抗体の精製方法が求められている。発明の開示

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことに、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性水溶液状態とし、緩衝液を添加して pHを中性域に上昇させ、生じた粒子をフィルター濾過することにより、煩雑なクロマトグラフィ一工程を行わずに D N A夾雑物を効率よく除去できることを見い出してして本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下のものを提供する。

(1) 以下の段階：

1 ) 生理活性タンパク質含有試料を p Hが中性域の低伝導度水溶液状態とし、 2) 生じる粒子を除去する、

を含む、生理活性タンパク質含有試料中の DN A夾雑物を除去する方法。

(2) 以下の段階：

1) 生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、

2) 得られる試料の pHを中性域に調整し、

3) 生じる粒子を除去する、

を含む、生理活性タンパク質含有試料中の D N A夾雑物を除去する方法。

(3) 以下の段階：

1) 抗体含有試料をプロテイン Aもしくはプロテイン Gのァフィ二テイク口マトグラフィ一に適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、

2) 得られる溶出液に緩衝液を添加して p Hを中性域に上昇させ、

3) 生じる粒子を除去する、

を含む、抗体含有試料中の DN A夾雑物を除去する方法。 (4)低伝導度の酸性水溶液の伝導度が、 0〜100mMのモル濃度である前記（2) 又は（3) 記載の方法。

(5) 低伝導度の酸性水溶液のイオン強度が、 0〜0.2である前記（2)又は（3) 記載の方法。

(6)低伝導度の酸性水溶液の導電率が、 0〜300 mS/raである前記（ 2 )又は（ 3 ) 記載の方法。

(7) 酸性水溶液が塩酸、クェン酸、酢酸の水溶液から選択される前記（2) 〜

(6) のいずれかに記載の方法。

(8) 酸性水溶液の pHが 1.5〜3.9である前記（7) 記載の方法。

(9) 処理後の生理活性タンパク質含有試料中の DNA夾雑物が DNA 濃度 22.5pg/nil以下である前記（1) 〜（7) のいずれかに記載の方法。

(10) 緩衝液が T r i s水溶液である前記（3) 記載の方法。

(1 1) 緩衝液を添カ卩して pHを 4.3〜7.5に上昇させる前記（3) 記載の方法。

(12) 生理活性タンパク質が抗体である前記（1) 又は（2) に記載の方法。 (13) 抗体がヒト型化モノクローナル抗体である前記（3) 又は（12) 記載の方法。

(14) 抗体がヒト型化抗 I L一 6レセプター抗体である前記（13) 記載の方法。

(15) 抗体がヒト型化抗 HM1. 24抗原モノクローナル抗体である前記（1 3) 記載の方法。

(16) 抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗 PTHr P抗体）である前記（13) 記載の方法。

(17) 抗体がヒト型化抗組織因子抗体である前記（13) 記載の方法。

(18) 粒子をフィルター濾過によって除去する前記（1) 〜（3) のいずれかに記載の方法。

(19) 前記（1) 又は（2) 記載の方法によって得られる精製生理活性タンパク質。

(20) 前記（3) 記載の方法によって得られる精製抗体。

(21) pHが中性域の低伝導度水溶液中で抗体- DNA複合体を実質的に含まない精製抗体。

( 2 2 ) 精製抗体中の DNA濃度が 22.5pg/ml以下である精製抗体。発明を実施するための最良の形態

本発明の方法で精製する生理活性タンパク質含有試料に含まれる生理活性タンパク質は、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（G— C S F ) 、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM— C S F)、エリスロポエチン (E P O)、トロンボポェチン等の造血因子、インターフェロン'、 IL-1や IL-6等のサイト力イン、モノクローナル抗体、組織プラスミノーゲン活性化因子 (T P A：)、ゥロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第 V I I I因子、レプチン'、インシュリン、幹細胞成長因子（S C F)などを含むが、これらに限定されない。タンパク質の中でも、 E P O、 G— C S F、モノクロナール抗体等の抗体が好ましく、さらに好ましくはモノクローナル抗体である。プロテイン Aもしくはプロテイン Gァフィ二テイクロマトグラフィーを用いて実施する本発明の態様では、モノクローナル抗体が好ましい。生理活性タンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られたものを含むが、好ましいのは遺伝子組換え法により得られたものである。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とァミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の 1又は複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。さらには、生理活性タンパク質は P E G等により化学修飾されたものも含む。

生理活性タンパク質が糖鎖を有するタンパク質である場合、糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞 (CHO細胞)、 BHK細胞、 COS 細胞、ヒト由来の細胞等があるが、この中でも、 CHO細胞が最も好ましい。生理活性タンパク質が E P〇である場合には、 E P Oはいかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト尿より種々の方法で抽出し、分離精製したもの、遺伝子工学的手法（例えば特開昭 6 1— 1 2 2 8 8号）によりチャイニーズハムスター卵巣細胞（C H O) 、 B H K細胞、 C O S細胞、ヒト由来の細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。さらには、 PEG等により化学修飾された EPOも含む（国際特許出願公開番号 WO 90/1 2874 参照）。さらに、糖鎖のついていない EPOを PEG等により化学修飾したものも含む。また、 E P Oのァミノ酸配列中の N—結合炭水化物鎖結合部位もしくは 0_結合炭水化物鎖結合部位において、 1以上のグリコシルイ匕部位の数を増加させるように改変した E P〇類似体も含む（例えば、特開平 8— 1 51 398号、特表平 8— 506023号参照）。さらには、糖鎖結合部位の数は変化させずに、シアル酸等の含量を増加させることにより糖鎖の量を増加させたものであってもよい。

生理活性タンパク質が G— CSFである場合には、 G— CSFは高純度に精製された G— C S Fであれば全て使用できる。本発明における G— CS Fは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（CHO) 細胞、 C 1 27細胞、 COS細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、イースト菌又は C H〇細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくは C H O細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。さらには、 P E G等により化学修飾された G— CS Fも含む（国際特許出願公開番号 WO 9 0/ 1 2874参照）。'

生理活性タンパク質がモノクロ一ナル抗体である場合には、モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、感作抗原を通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリ一ユングすることによつて作成できる。さらに、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変されたキメラ抗体を含む。あるいは再構成（r e s h a p e d) したヒト型化抗体を本発明に用いることもできる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、再構成ヒト型化抗体を得ることができる。

なお、必要に応じ、再構成ヒト型化抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（FR) 領域のアミノ酸を置換してもよい（S a t oら、 C a n c e r Re s. 53 : 1— 6, 1 993) 。このような再構成ヒト型化抗体としてヒト型化抗 I L一 6レセプター抗体（h P M— 1 ) が好ましく例示される（国際特許出願公開番号 W〇 92— 1 9759を参照）。また、ヒト型化抗 HM1. 24抗原モノクローナル抗体（国際特許出願公開番号 WO 98— 14580を参照）、ヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ぺプチド抗体（抗 P TH 1- P抗体）（国際特許出願公開番号 WO 98— 1 3388を参照）、ヒト型化抗組織因子抗体（国際特許出願公開番号 WO 99- 5 1 743 を参照）なども本発明で使用する好ましい抗体である。

さらに、トランスジエニック動物ゃファ一ジデイスプレイ等によつて作製されたヒト抗体も好ましい。

本発明では、生理活性タンパク質含有試料もしくは抗体含有試料とは、 .好ましくは、培養により得られた生理活性タンパク質もしくは抗体を含む CHO細胞などの哺乳動物細胞の培養培地、あるいはこれに部分的精製などの一定の処理を施したものをいう。

本発明の好ましい態様では、以下の段階：

1 ) 生理活性タンパク質含有試料を p Hが中性域の低伝導度水溶液状態とし、

2) 生じる粒子を除去する、

を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の DN A夾雑物を除去する。本発明において、 pHが中性域の低伝導度水溶液とは、通常、モル濃度が 0〜 1 00 mM、好ましくは 0〜 50 mM、さらに好ましくは 0〜 30 mMの水溶液または、イオン強度が 0〜 0.2、好ましくは 0〜0.12の水溶液または、導電率が 0〜300mS/ni、好ましくは 0〜200mS/m、さらに好ましくは 0〜150mS/ni の水溶液であって、 pH4〜8，好ましくは pH4. 5〜7. 5の水溶液をいう。本発明の別の好ましい態様では、以下の段階： 1 ) 生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアル力リ性水溶液状態とし、

2 ) 得られる試料の p Hを中性域に調整し、

3 ) 生じる粒子を除去する、

を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の D N A夾雑物を除去する。本発明の別の好ましい態様では、生理活性タンパク質が抗体であるときに極めて有用であり、以下の段階：

1 ) 抗体含有試料をプロテイン Aもしくはプロテイン Gのァフィ二テイクロマトグラフィ一に適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、

2 ) 得られる溶出液に緩衝液を添カ卩して p Hを中性域に上昇させ、

3 ) 生じる粒子を除去する、

を含む方法によって、抗体含有試料中の D N A夾雑物を除去する。

本発明の方法では、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性水溶液状態とし、好ましくはプロテイン Aもしくはプロテイン Gァフィ二テイクロマトグラフィーを低伝導度の酸性水溶液で溶出させることによつて低伝導度の酸性水溶液状態とする。本発明における低伝導度の酸性水溶液とは、通常、モル濃度が 0〜 1 0 0 mM、好ましくは 0〜 5 0 mM, さらに好ましくは 0〜 3 0 mMの水溶液または、イオン強度が 0〜 0. 2、好ましくは 0〜0.12の水溶液または、導電率が 0〜300mS/m、好ましくは 0〜200mS/m、さらに好ましくは 0〜150mS/m の水溶液であって、 p H1.5〜3.9、好ましくは p H2.0〜3.9、さらに好ましくは pH2.0 ~3.0 の水溶液をいう。酸性水溶液は、塩酸、クェン酸、酢酸などの水溶液から選択してよい。精製しょうとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、使用する低伝導度の酸性水溶液の種類、伝導度、 p Hはそれぞれ異なっており、当業者は本明細書に記載の方法に従って予備試験を行うことにより、これらの最適条件を容易に設定できる。

本発明の方法では、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性水溶液状態とした後、得られる試料に緩衝液を添加して p Hを中性域に上昇させる。あるいは、抗体含有試料をプロテイン Aもしくはプロテイン Gのァフィ二テイクロマトグラフィ一に適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加して p Hを中性域に上昇させる。この段階で添加する緩衝液は、例えば Tris-HCl緩衝液、リン酸緩衝液などを含み、更には Tris水溶液、 Na₂HP0₄水溶液、 NaOH水溶液などをも含むものである。中性域とは精製しょうとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、それぞれ異なっており、一般的には p H 4〜 8 , 好ましくは p H4.3〜7.5、さらに好ましくは p H4.5〜7.5である。使用する緩衝液の種類、中性域の p Hについては、当業者は本明細書に記載の方法に従って予備試験を行うことにより、最適条件を容易に設定できる。

また、本発明の方法で使用する低伝導度のアルカリ性水溶液とは、通常、モル濃度が 0〜： 1 0 0 mM、好ましくは 0〜 5 0 mM、さらに好ましくは 0〜 3 0 m Mの水溶液または、ィオン強度が 0〜 0 . 2、好ましくは 0〜0.12の水溶液または、導電率が 0〜300mS/m、好ましくは 0〜200mS/m、さらに好ましくは 0〜150 mS/mの水溶液であつて、一般には p H 7 . 5〜： 1 3である（ p Hは精製しょうとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、それぞれ異なっている），。

本発明の方法では、上記段階で中性域になった溶液は粒子（白濁）を生じる。この粒子をフィルタ一濾過によって除去することによって D N A夾雑物を効率よく除去することができる。濾過に用いるフィルタ一は、例えば、 1.0〜0.2 μ ιηの Cellulose Acetate Filter System (Corning製.）もしくは TFFなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。

また、上記粒子を除去するための方法としては遠心分離操作等も考えられ、粒子を効率的の除去できる手法であればよく、フィルター濾過に限定されるものではない。

本発明者らは特別の理論に拘束されるものではないが、この粒子は生理活性タン'パク質と D NAとによって形成される複合体であると推定している。粒子をフィルタ一除去することによって DNA-生理活性タンパク質複合体中に含まれる生理活性タンパク質が少量ロスとなるが、生理活性タンパク質の全体からすると数％であり、後述する実施例に記載するように、生理活性タンパク質の約 9 0 % を回収することができた。

また、この DNA-生理活性タンパク質複合体が樹脂上で生じるためにプロティン Aもしくはプロティン Gカラムクロマトグラフィ一単独では DNA夾雑物とタンパク質の分離が効果的に行えないのではないか、と推測している。

本発明の方法により精製された生理活性タンパク質は、さらに陽イオン交換ク口マトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、もしくはこれらの組合せなどにより精製して医薬製剤に用いることができる。

DNA定量法としてはスレッシュホールド総 DNA定量法により測定し、測定に先だって DNA抽出操作を実施するが、これらに限定されるものではない。

本発明の方法により、 D NA夾雑物を極めて簡単な方法で、 DNA濃度を極めて低濃度まで（例えば 22.5pg/ml) 効率よく除去することが可能となり、生理活性タンパク質、特に抗体の精製がはるかに効果的となった。また、本発明の方法によりコストを低減することができ、格別の技術的意義を有するものである。本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。実施例

実施例 1 ： h P M— 1 (ヒト型化抗 I L一 6レセプター抗体）精製におけるプ口ティン Aァフィ二テイク口マトグラフィ一の緩衝液組成の検討 .

(1)検討材料（抗体含有試料）

h P M— 1抗体（ヒト型化抗 I L— 6レセプター抗体）産生 CHO細胞培養上清液 (以下 CM と略す) (細胞遠心除去済み： -80°C保存）含有試料は、上記 CMを 0.22 μ πι Cellulose Acetate(CAと略す) Filter System (CORNING)を用いて濾過し、精製検討に使用した。なお、 h PM— 1抗体は、国際特許出願公開番号 WO 9 2 / 1 9 7 5 9号公報の実施例 1 0に記載されたヒトェロンゲーシヨンファタター I αプロモーターを利用し、特開平 8— 9 9 9 0 2号公報の参考例 2に記載された方法に準じて作成した。

(2)使用機器

塩酸溶出検討時

HPLC： L-6200 Intelligent Pump (HITACHI) L-4200 UV-VIS Detector(HITACHI)

D-2500 Chromato-Integrator(HITACHI)

カラム： HR5/2(Pharraacia社)， 5mmI.D. X 20mmH

Media： POROS 50A(PerSeptive社), 0.4ml

Lot;A250-039,Code;SPECIAL

粒子検討時

HPLC： Waters PrepLC4000 System(Waters)

Waters2000 System Controller(W aters)

Waters486 Tunable Absorbance Detector(W aters)

Waters741 Data Module (Waters)

分光光度計： U-2000(HITACHI)

カラム： XK26(Pharmacia社), 26mmI.D. X lOOmmH

Media： POROS 50A(PerSeptive社)， 53ml

Lot;A250-039,Code;SPECIAL

(3)分析、定量法

h P M- 1定量法：直線濃度勾配法による PLRP-S カラム (ポリマーラボラトリーズ社)を用いる逆相 HPLCにより定量する。

DNA量測定法：スレッシュホールド総 DNA定量法により測定する。測定に先だつて DNA抽出操作（D N Aエキストラクターキットく和光純薬〉等）を実施する。また、測定にはスレッシュホールド総 D N A定量キット（モレキュラーデバイス社製）を用いる。

濁度測定法：粒子形成の状況をモニターするために測定サンプルを分光光度計 U-2000(HITACHI)に供し、 660nmにおける吸収を測定する。

( 1 ) 溶出条件の検討

プロテイン Aァフィ二ティークロマトグラフィ一において溶出液として用いる緩衝液組成を変更した検討を行い、 h P M— 1回収率及び溶出液による DNA除去状況を確認した。上記抗体含有試料を以下の表 1に示す条件で力ラムにかけた。表 1に示す平衡化緩衝液にてプロテイン A樹脂を平衡化し、.続いて上記抗体含有試料負荷その後、洗浄 1、洗浄 2、溶出と実施する。溶出プロファイルを A280mn で監視し、タンパク質のピークを単離した。なお、表中 C-P Bufferはクェン酸一リン酸緩衝液を示す。

【表 1】

溶出法 1、 2 , 3において、クロマトグラム上で差異は確認されなかった。また、各溶出画分を 300mM Tris溶液で pH7.0に調整したところ、塩酸溶出画分 (溶出法 2、溶出法 3)では粒子が生じた。更に、粒子形成と h P M- 1回収率及び残存 DNA量との相関を求める検討をも行つた。

粒子相関検討として、溶出法 2における溶出液塩酸中に NaClを添カロし、添カロ NaCl濃度 (0mM,50mM，100mM)と各種要因との相関を求めた。添カ卩 NaCl濃度と各種要因との相関検討として、それぞれの NaCl添加による Protein A溶出画分を 300mM Tris溶液で pH7.0に調整したサンプル'を濾過前、その pH調整後サンプルを 0.22 μ m CA Filterにて濾過したサンプルを濾過後とした。濾過前及ぴ濾過後サンプルを上記測定法で h P M— 1回収率 (濾過後のみ）を測定し、残存 DNA量を測定した。

回収率

各溶出条件における h PM— 1回収率を測定した。その結果、溶出法 1における回収率は 98.6°/。と良好であった。また溶出法 2における回収率では 83.8%〜 97.1%、溶出法 2における回収率では 83.5%〜93.7%とばらつきが生じたが、検討スケールが小さレ、要因 (樹脂量: 0.4ml)から生じるばらつきであると推測された。そこで、精製スケールをアップした検討（溶出法 2) では安定して h P M— 1回収率 90%以上を示す事を確認した。従って、塩酸溶出の場合であっても、 h P M 一 1の回収率は良好であることが判明した。

溶出液塩酸中の添加 NaCl濃度と各種要因相関

溶出液塩酸中の添加 NaCl濃度と各種要因相関を調べた結果を表 2に示す。【表 2】

濾過後の h PM— 1回収率は lOOmM NaCl添加サンプルで 88%を示し、順に 50mM NaCl添加の 86%、 OmM NaCl添加の 81%であつた。残存 DNA量に関しては、濾過前後のサンプルでともに、 OmM NaCl添カ卩サンプノレが低値を示し、特に濾過後の OmM NaCl添加サンプルでは llpg DNA/mg h PM— 1と極めて低値であった。

また、 pH調整後サンプノレにおいて濁度の高値なサンプル程、濾過後の hPM 一 1回収率及び残存 DNA量が低値を示している。この結果は、粒子形成に h P M— 1及び DNAが関与している可能性が高い事を示すものである。おそらく pH を 7.0に調整する事により h PM— 1と DNAが相互作用し粒子を生じると推測される。 h PM— 1回収率を高くするという点からは、添カ卩 NaCl濃度を増加させることが好ましく、逆に残存 DNA量減少を重視するという点からは、溶出液塩酸中に NaClを無添加とすることが望ましい。実施例 2 ：ヒト型化抗 PTHr P抗体の精製

ヒト型化抗 P TH r P抗体含有試料（CHO細胞で培養した培養上清を 0.45+0.2 μηι CA SARTOBRAN Ρフィルタ一（sartorius) で濾過したもの）をプロテイン Aァフィ二ティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の条件により精製した。なお、 PTHr P抗体は、国際特許出願公開番号 WO 98/ 13388号公報に記載の方法によって作成した。実験条件

精製装置： AKTA explorer (Amershain Pharmacia Biotech)

カラム： HR5/5, CIO, XK-26 (Amersha a Pharmacia Biotech)

樹月旨： I'Pi'otein A Sepharose Fast Flow

負荷：培養上清直接負荷 (pH6.6〜7.5)

溶出画分調整： 1M Tris 水溶液により各種 pH に調整し、 0.2 i m Cellulose Acetate (以下 CAと略す)フィルター濾過により DNAを除去（以下の（1 ) において条件を検討）。

プロテイン Aカラムを 150mM NaCl入りタエン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で十分に平衡化した後、上記抗体含有 CMを負荷した。続いて結合していない不純物を 150mM NaCl入りクェン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で洗浄、更に導電率を下げる目的でクェン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で洗浄を行い、その後 20ιηΜクェン酸水溶液にて溶出を実施した。溶出プロファイルを A280nmで監視し、タンパク質ピークを分取した。このプロテイン A溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。

( 1 ) 溶出後の残存 DNA除去条件検討

残存 DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適 pH条件を設定する検討を行った。プロテイン A溶出画分を、 1.0M Tris 水溶液により以下の各検討 pH (未調整 (2.7), 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 )に調整した。その後、一定時間放置し、 0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後 1.0M Tris 水溶液により pH7に調整し、 DNA定量を行つた。表 3に各検討 pH及ぴ放置時間と残存 DNAの結果示す。

【表 3】

残存 DNA除去検討結果（単位： pg I mL)

(培養上清中の DNA : 6, 637， 200 pg I mし、フィルタ一未処理中の DNA : 25, 110 pg ' mL)

表から明らかなように、 pH5.5、 6.0における 0,6,24時間放置すべてにおいて' DNAが検出限界以下となった。また DNA除去状況に関しては pH5.5、 6.0を中心として pHが高く、又は低くなるにつれて DNA除去の効率が悪くなることが観察された。 ' 実施例 3 ：ヒト型化抗 HM 1 . 2 4抗原モノクローナル抗体の精製

ヒト型化抗 HM 1 . 2 4抗原モノクローナル抗体含有試料（C H O細胞で培養した培養上清）をプロティン Aァフィ二ティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の表 4に記載の条件により精製した。なお、 HM 1 . 2 4抗原モノクローナル抗体は、国際特許出願公開番号 W〇 9 8 1 4 5 8 0号公報に記載の方法によって作成した。

実験条件

カラム： rProtein A FF, 5 inL (16 mmlD x 25 mniH)

流速： 5 niL I min (150 cm I h)

サンプル：培養上清直接負荷

【表 4】

プロテイン Aカラムを 150mM NaCl入りクェン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で十分に平衡化した後、上記抗体含有 CMを負荷した。続いて結合していない不純物を 150mM NaCl入りクェン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で洗浄、更に導電率を下げる目的でクェン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で洗浄を行い、その後 20mMクェン酸水溶液にて溶出を実施した。溶出プロファイルを A280mnで監視し、タンパク質ピークを分取した。このプロテイン A溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。残存 DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適 pH条件を設定する検討を行った。プロテイン A溶出画分を、 l.OM Ti'is 水溶液により以下の各検討 pH(pH = 4.5 - 7.5)に調整した。その後、一定時間放置し、 0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後 l.OM Tris水溶液により pH7に調整し、 DNA 定量及び逆相カラムによるヒト型化抗 HM 1 . 2 4抗原モノクローナル抗体の定量を行った。表 5に DNA量の測定結果を、また表 6にヒト型化抗 HM 1 . 2 4 抗原モノクローナル抗体の収量測定の結果を示す。

【表 5】

残存 DNA除去の検討（単位： pg/ml)

実験 1

(培養上清中の DNA： 235200 pg/ml)

実験 2

(培養上清中の DNA： 5448000 pg/ml,

一濾過処理を行う前の試料中の DNA： 4330 pg/ml)

【表 6】

フィルター処理によるヒト型化抗 HM 1 . 2 4抗原モノクローナル抗体回収率

Protein Aァフィ二ティークロマトグラフィー精製した後のサンプルにおいては大量の DNAが存在していたが、実験 1では pH 7.5, 6.5, 5.5と pHの低下に従つて DNA量が減少しており、また時間は 0時間の方が DNA除去率が高い傾向があった。実験 2では pH = 4.5, 5.0, 5.5の条件で同様の実験を行ったが、この間においては pHおよび時間に関係なく十分に DNAが同程度に除去されていた。更に回収量の計算からヒト型化抗 HM 1 . 2 4抗原モノクローナル抗体はほとんど消失していないことが判明した。実施例 4 ：エリス口ポェチン (E P O)の精製

EPO含有試料（CHO細胞で培養：中外製薬製）を用いて以下の条件検討を実施する。

E P O含有試料組成（ 1 mMリン酸緩衝液）；

残存 DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適 pH条件を設定する検討を行う。 E P O含有試料に低伝導度の酸性溶液（2.5mM HCl 水溶液）を添加し、更に 20%塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料 DNAを添加する。 1.0M Tris水溶液により以下の各検討 pH(pH = 5.0又は 6.6)に調整し、続いて 0.22um CAフィルター濾過処理を行う。その後、ろ過前後の画分の DNA定量を行う。以上の検討により DNAを多量に含んだ E P〇含有試料から DNA量が効率的に減少するのを確認する。実施例 5 ：顆粒球コロニー刺激因子（G— CSF) の精製

G— CS F含有試料（CHO細胞で培養：中外製薬製）を用いて以下の条件検討を実施する。

G— CS F含有試料組成（20mM Ti'is-HCl緩衝液）；

残存 DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適 pH条件を設定する検討を行う。 E P O含有試料に低伝導度の酸性溶液（2.5mM HC1 水溶液）を添カロし、更に 20%塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料 DNAを添加する。 1.0^1 ¾13水溶液にょり以下の各検討 11( 1^ = 4.3又は6.6)に調整し、続いて 0.22um CAフィルター濾過処理を行う。その後、ろ過前後の画分の DNA定量を行う。以上の検討により DNAを多量に含んだ G— CS F含有試料から DNA量が効率的に減少するのを確認する。実施例 6 ：ゥシ血清アルブミン（BSA) の精製

BSA含有試料を用いて以下の条件検討を実施する。

残存 DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適 pH条件を設定する検討を行う。 B S A含有試料に低伝導度の酸性溶液（2.5mM HCl 水溶液）を添加し、更に 20%塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料 DNAを添加する。 1.0M Tris水溶液にょり以下の各検討pH(pH 4.9又は7.5)に調整し、続いて 0.22um CAフィルター濾過処理を行う。その後、ろ過前後の画分の DNA定量を行う。以上の検討により DNAを多量に含んだ BSA含有試料から DNA量が効率的に減少するのを確認する。

Claims

請求の範囲

1 . 以下の段階：

1 ) 生理活性タンパク質含有試料を p Hが中性域の低伝導度水溶液状態とし、 2 ) 生じる粒子を除去する、

2 . 以下の段階：

1 ) 生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアル力リ性水溶液状態とし、

2 ) 得られる試料の p Hを中性域に調整し、

3 ) 生じる粒子を除去する、

3 . 以下の段階：

1 ) 抗体含有試料をプロティン Aもしくはプロティン Gのァフィ二テイク口マトグラフィ一に適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、

2 ) 得られる溶出液に緩衝液を添加して p Hを中性域に上昇させ、

3 ) 生じる粒子を除去する、

を含む、抗体含有試料中の D N A夾雑物を除去する方法。

4 . 低伝導度の酸性水溶液の伝導度が、 0〜： !OOmMのモル濃度である請求項 2 又は 3記載の方法。

5 . 低伝導度の酸性水溶液のイオン強度が、 0〜0.2である請求項 2又は 3記載の方法。

6 . 低伝導度の酸性水溶液の導電率が、 0〜300 mS/mである請求項 2又は 3記載の方法。

7 . 酸性水溶液が塩酸、クェン酸、酢酸の水溶液から選択される請求項 2〜 6 のいずれかに記載の方法。

8 . 酸性水溶液の p Hが 1.5〜3.9である請求項 Ί記載の方法。

9 . 処理後の生理活性タンパク質含有試料中の DNA 夾雑物が DNA 濃度 22.5pg/ml以下である請求項 1〜 7のいずれかに記載の方法。

1 0. 緩衝液が T r i s水溶液である請求項 3に記載の方法。

1 1. 緩衝液を添加して p Hを 4.3〜7.5に上昇させる請求項 3に記載の方法。

1 2. 生理活性タンパク質が抗体である請求項 1又は 2に記載の方法。

1 3. 抗体がヒト型化モノクローナル抗体である請求項 3又は 1 2記載の方法。

14. 抗体がヒト型化抗 I L一 6レセプター抗体である請求項 1 3記載の方法。

1 5. 抗体がヒト型化抗 HM 1. 24抗原モノクローナル抗体である請求項 1 3 記載の方法。

1 6.抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗 PTHr P抗体）である請求項 1 3記載の方法。

1 7. 抗体がヒト型化抗組織因子抗体である請求項 1 3記載の方法。

1 8. 粒子をフィルター濾過によって除去する請求項 1〜 3のいずれかに記載の方法。

1 9. 請求項 1又は 2記載の方法によって得られる精製生理活性タンパク質。

20. 請求項 3記載の方法によつて得られる精製抗体。

21. p Hが中性域の低伝導度水溶液中で抗体- DNA複合体を実質的に含まない精製抗体。

22. 精製抗体中の DNA濃度が 22.5pg/ml以下である精製抗体。