JP2013534143A - 細胞培養物から得られた液体のpH変化によってプロテアーゼを不活性化するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
技術分野
本発明は、生物学的製剤の製造の分野に属する。本発明は、特に無細胞の細胞培養上清中のタンパク質分解活性酵素を不活性化することによって生物学的製剤を調製するプロセスを改良することに関する。
タンパク質、ポリヌクレオチド、多糖などの生体分子は、医薬として、診断用薬として、食品添加物、界面活性剤などとして、研究用試薬として、および多数の他の応用に、ますます商業的重要性を勝ち取りつつある。通常は、例えばタンパク質の場合、天然起源から分子を単離することではそのような生体分子のニーズにもう応えることができず、バイオテクノロジーの生産方法を使用する必要がある。
本発明は、生物学的製剤の精製プロセスの開始時に、細胞培養上清のpHを何度も変化させることによってプロテアーゼを不活性化する方法に関する。本発明の利点は、生成物の品質および生成物の収率の改良、ならびにクロマトグラフィー材料に関するより長い寿命である。
(a)その液体のpHを3〜5に調整する段階、および次に
(b)その液体のpHを7〜9に調整する段階
を含むプロセスに関する。
本発明は、精製プロセスの開始時に細胞培養上清のpHを何度も変化させることによってプロテアーゼを不活性化するためのプロセスに関する。本発明の利点は、生成物の品質および収率の改良ならびにクロマトグラフィー材料の寿命の延長である。
(c)その液体のpHを3〜5に調整する段階、および次に
(d)その液体のpHを7〜9に調整する段階
を含むプロセスに関する。
作業実施例1:回収後、捕捉段階前のpH変化
CHO細胞を最終体積80Lの流加培養で11日間成長させる。細胞培養上清(CCF)を20℃に維持し、貫流(throughflow)ディスク遠心分離機を使用して細胞から分離し、フィルターカスケードを通過させて無菌濾過する。次に、酢酸の添加によりCCFのpH値をpH4に低下させる。ターゲットpHに到達した後、それを5〜10分間維持してから、水酸化ナトリウム溶液の添加によってCCFをpH7.5に中和する。さらに処理する(捕捉段階)前に、捕捉段階に適切な結合条件を得るために、CCFに50kD MWCOメンブランを通過させて限外濾過/ダイアフィルトレーションする。
CHO細胞を最終体積80Lの流加培養で11日間成長させる。細胞培養上清(CCF)を貫流ディスク遠心分離機を使用して細胞から分離し、20℃に維持する。次に、常に撹拌しながら酢酸を添加することによりCCFのpH値をpH4に低下させる。ターゲットpHに到達した後、それを5〜10分間維持してから、水酸化ナトリウム溶液の添加によってCCFをpH7.5に中和する。次に、処理されたCCFにフィルターカスケードを通過させて無菌濾過する。さらに処理する(捕捉段階)前に、捕捉段階に適切な結合条件を得るために、CCFに50kD MWCOメンブランを通過させて限外濾過/ダイアフィルトレーションする。
CHO細胞を最終体積80Lの流加培養で11日間成長させる。細胞培養上清(CCF)を貫流ディスク遠心分離機を使用して細胞から分離し、フィルターカスケードを通過させて無菌濾過し、PBS(pH7.5)を用いるrプロテインAアフィニティークロマトグラフィーである捕捉段階に適切な結合条件を得るために、50kD MWCOメンブランを通過させて限外濾過/ダイアフィルトレーションする。MabSelectクロマトグラフィーカラムに、カラムマトリックス1mLあたり32mgのmAbをチャージし、酢酸緩衝液(pH3.5)を用いた段階で抗体を溶離させる。撹拌しながら1Mトリスを添加することによって、生成物を含有する画分のpHをpH7.5に調整し、そのpHを周囲温度で10分間維持してから、ウイルスの酸性不活性化に適切な条件を選択する。
細胞培養上清
治療用タンパク質の分泌生産のために最適化されたマウス生産細胞系およびCHO生産細胞系を無血清培地中で数日間培養する。細胞培養上清(CCF、無細胞の細胞培養液)を濾過または遠心分離によって細胞および不溶性成分から分離し、それぞれのpHに調整後、10〜20%(v/v)で活性アッセイのために使用する。
細胞培養上清を酢酸の添加によって酸性化する。試料を直ちに混合し、選択されたpHで5〜10分間インキュベーションする。沈降成分を遠心分離によってペレットにし、捨てる。水酸化ナトリウム溶液または1Mトリス塩基の添加によってpHを上昇させる。
個別の種類のプロテアーゼを阻害するために、CCFを異なる市販阻害剤と共にインキュベーションし、次に、残留活性があれば活性アッセイで調べる。使用した阻害剤の濃度は、製造業者が推奨する濃度である。
蛍光アッセイ、フルオロフォアの放出による分析
タンパク質分解活性の動態測定および定量測定に使用される基質は、種々のペプチド−フルオロフォア結合体であり、その切断は、アミノメチルクマリン(AMC)などの蛍光色素の放出またはN−メチルアミノベンゾイル−ジアミノプロピオン酸(Nma)に対するジニトロフェニル(Dnp)の消光作用の消失につながる。蛍光シグナルの増加は、Multilabel-Counter Victor2, 3(Perkin Elmer, Massachusetts, USA)を用いてλEx=380nm;λEm=460nm(AMC)、λEx=340nm;λEm=460nmで測光的にモニターしてもよい(図3)。
タンパク質分解活性の定性分析に使用される基質は、インターフェロンファミリー(IFN)のネイティブなタンパク質である。IFNは、分子量が22.5kDであり、溶液中でモノマーとして存在する。分解アッセイのために、0.1mg/ml IFNを10%(v/v)CCFと共に37℃、pH4で最大24時間インキュベーションし、SDS−PageおよびHeukeshovenによる銀染色によって検出する(Heukeshoven, J., Dernick, R., Improved silver staining procedure for fast staining in PhastSystem Development Unit. I. Staining of sodium dodecyl sulphate gels. Electrophoresis, 9, (1988) 28-32.)か、またはタンパク質の分解をタンパク質分解活性の測定値としてRP−HPLCによって決定する。
時間 溶液A 溶液B
[min] [%] [%]
5.0 60 40
15.0 30 70
15.1 10 90
19.0 10 90
19.1 60 40
21.0 60 40
CCF由来プロテアーゼによる基質切断は、酸性pH値pH<5およびpH7付近の中性範囲に位置する2個のピークを有する。それぞれのプロテアーゼの活性は、タンパク質の分解および蛍光発生ペプチド基質の切断後の蛍光放出によってモニターすることができる(図2および4)。図2に、10%(v/v)CCF存在下、pH4でのIFNの分解を示す。わずか2、3時間後にIFNは酸性条件下で分解し(レーン4)、図4に、pH3.5およびpH7でインキュベーション後の20%(v/v)CCFによるDnp−ペプチド−Nma基質の切断の経時的な進行を示す。漸増する蛍光シグナルが、ペプチド基質切断の測定値である。活性を、酸性および中性pH値の両方で観察する。
未処理CCF由来の中性プロテアーゼの活性は、pH7で蛍光アッセイにより測定することができる(図5、丸印)。pH7からpH<5に続いて中和という二段階変化にCCFが供されるとき、pH7の蛍光アッセイでは実質的にさらなる活性を検出することができない(図5、三角印)。
CCFの酸性化によって活性化されるプロテアーゼのタンパク質分解活性は、蛍光アッセイおよびタンパク質分解アッセイにおいてpH3.5で検出することができる(図6、四角印)。しかしながら、酸性化後にCCFを中和すると、この活性は維持されない。中和後に酸性プロテアーゼに至適なpH3.5の反応条件を復元すると、蛍光アッセイで測定可能な酸性プロテアーゼの活性は、未処理CCFに比べて最大65%減少する(図6、三角印)。
Claims (10)
- 細胞培養から得られた液体中のプロテアーゼを不活性化するためのプロセスであって:
(a)該液体のpHを3〜5に調整する段階、および次に
(b)該液体のpHを7〜9に調整する段階
を含むプロセス。 - 細胞培養から得られた液体中のタンパク質の分解を減少させるためのプロセスであって、
(a)該液体のpHを3〜5に調整する段階、および次に
(b)該液体のpHを7〜9に調整する段階
を含むプロセス。 - 段階(a)でのpHが、3.5〜4.5の範囲であることを特徴とする、請求項1または2記載のプロセス。
- 段階(a)でのpHが、5分〜30分間維持されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載のプロセス。
- 段階(a)でのpHが、20〜30℃の温度で行われることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載のプロセス。
- 段階(b)でのpHが、7.4〜8.5の範囲であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載のプロセス。
- 段階(b)でのpHが、5分〜60分間維持されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載のプロセス。
- 段階(b)でのpHが、20〜30℃の温度で行われることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項記載のプロセス。
- 液体が、哺乳動物細胞培養物由来の液体であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載のプロセス。
- 液体が、哺乳動物細胞培養物由来の無細胞液体であることを特徴とする、請求項9記載のプロセス。
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