KR20130105813A

KR20130105813A - 세포 배양물에서 수득한 액체의 ｐＨ 변화에 의해 프로테아제를 불활성화시키는 방법

Info

Publication number: KR20130105813A
Application number: KR1020137004097A
Authority: KR
Inventors: 알렉산더 야코비; 도로테 암브로지우스; 필리네 도베르틴; 크리스티안 에커만; 프란츠 노트헬퍼
Original assignee: 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
Priority date: 2010-08-20
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2013-09-26
Also published as: EP2606142A1; AU2011290782A1; SG187834A1; CN103068999A; US20120295323A1; CA2807693A1; JP2013534143A; US20180346950A1; EP2606142B1; WO2012022688A1

Abstract

본 발명은 생물 약제를 정제하는 조작을 개시할 때, 세포 배양 상청액 내의 pH의 반복적 변화에 의해 프로테아제를 불활성화시키는 방법에 관한 것이다. 우선, pH는 pH 3 내지 5, 이어서 pH 7 내지 9로 설정된다.

Description

세포 배양물에서 수득한 액체의 ｐＨ 변화에 의해 프로테아제를 불활성화시키는 방법{METHOD FOR INACTIVATING PROTEASES BY pH CHANGE IN A LIQUID OBTAINED FROM A CELL CULTURE}

본 발명은 생물 약제 제품의 제조 분야 내이다. 특히, 본 발명은 무세포 배양 상청액 중에서의 단백질 가수분해 활성 효소의 불활성화에 의해 생물 약제 제품을 제조하는 방법을 개선시키는 것에 관한 것이다.

생체 분자, 예컨대 단백질, 폴리뉴클레오티드, 다당류 등은 약물로서, 진단제로서, 식품에의 첨가제, 세정제 등으로서, 연구 시약으로서, 그리고 다수의 기타 용도로서 그 상업적인 중요성이 점점 커져 가고 있다. 이러한 생체 분자에 대한 요구는 - 단백질의 경우를 예를 들어 말하면 - 일반적으로 천연 원료 유래의 분자를 분리함에 의해서는 더 이상 충족시킬 수 없고, 생물 공학적 제조 방법의 사용이 요구된다.

단백질의 생물 공학적 제조 방법은 DNA 단편을 적합한 발현 벡터 내로 클로닝시키는 것으로부터 시작된다. 발현 벡터를 적합한 원핵 또는 진핵 발현 세포 내로 형질감염시킨 후, 후속적으로 형질감염된 세포들을 선별하고, 선별된 세포들을 발효기에서 배양시켜 원하는 단백질을 발현시킨다. 이어서, 세포 또는 배양 상청액을 수거하고, 이에 포함된 단백질은 워크업(worked up) 및 정제한다.

수거된 액체, 예컨대, 무세포 배양 상청액 중에 프로테아제가 존재한다는 것이 알려져 있다. 모노클로날 항체 또는 재조합 단백질과 같은 생물 약제뿐만 아니라 고정화 단백질 A와 같은 크로마토그래피 물질 둘 다는 프로테아제에 의해 매우 빠르게 분해되거나 구조적으로 손상될 수 있다. 이는 생성물의 품질(균질성, 기능성) 및 크로마토그래피 물질의 질적 저하(compromise)를 초래하여 결합 능력이 감소되고, 그 결과 결합된 생성물 분획이 오염된다. 특히, 무혈청 배양 및 고생산성 세포에 있어서, 생산된 생물 약제는 높은 상대 농도로 존재하므로, 특히 단백질 가수분해로 인해 손상되는 경향이 있어 수율도 감소되고 생성물의 품질도 저하된다.

프로테아제에 의해 유발된 단백질 손상은 중성 pH에서도 일어날 수 있으나, 특히, 예를 들어, 포획 단계, 예컨대 양이온 교환 크로마토그래피(컨디셔닝)에 있어서 원하는 결합 조건을 생성하기 위하여 무세포 배양 상청액을 정제 공정을 위해 산성 pH 수준으로 조절해야 하는 경우에 광범위한 단백질 분해가 관찰될 수도 있다.

일부 프로테아제들, 예를 들어, 펩신과 같은 소화 효소는 pH 수준의 변화에 의해 비가역적으로 불활성화된다는 것이 알려져 있다(Z. Bohak, Purification and Characterization of Chicken Pepsinogen and Chicken Pepsin, Journal of Biological Chemistry 244 (17) (1969) 4633-4648; B. Turk, V. Turk, Lysosomes as Suicide Bags in Cell Death: Myth or Reality?, Journal of Biological Chemistry 284 (33) (2009) 21783-21787). 프로테아제 억제제를 첨가하는 것도 제안되었다(A.J. Barrett, A. A. Kembhavi, M. A. Brown, H. Kirschke, C. G. Knight, M. Tamai and K. Hanada, L-trans-Epoxysuccinyl-leucylamido(4-guanidino)butane (E-64) and its analogues as inhibitors of cysteine proteinases including cathepsins B, H and L, Biochem. J. 201 (1982) 189-198). 그러나, 이들은 매우 고가이고, 독성이며, 생성물로부터 제거하기 어렵다. 따라서, 이들은 안전한 의약을 경제적으로 생산하기 위한 선택할 수 있는 것이 아니다.

본 발명은, 생물 약제의 정제 공정을 개시시에, 세포 배양 상청액 내의 pH를 반복적으로 변화시킴으로써 프로테아제를 불활성화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이점은, 생성물의 품질과 생성물의 수율이 개선된다는 것, 및 크로마토그래피 물질의 수명이 더 연장된다는 것이다.

놀랍게도, 포유동물 세포주(예를 들어, CHO, "차이니즈 햄스터 난소" 세포)의 수거된 무세포 발효 상청액이, pH를 산성으로 변화시킴으로써 활성화될 수 있고, 또한 후속적으로는 pH를 중성 범위로 변화시킴으로써 최적의 pH에서 그 활성이 비가역적으로 불활성화될 수도 있는 프로테아제를 함유하고 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 중성 pH 수준에서 활성인 프로테아제는 pH 수준을 산성으로 변화시킴으로써 중성 조건 하에 그 활성이 비가역적으로 불활성화될 수도 있다.

특히, 본 발명은 세포 배양물에서 수득한 액체 중에서 프로테아제를 불활성화시키는 방법으로서,

(a) 상기 액체의 pH를 3 내지 5로 조절하는 단계, 및 이후

(b) 상기 액체의 pH를 7 내지 9로 조절하는 단계

를 포함하는 방법에 관한 것이다.

도 1: 2회의 pH 변화에 의한 CCF 유래의 프로테아제의 활성화 및 불활성화.
도 2: 산성 pH에서의 모델 기질 인터페론(IFN)의 분해. 0.1mg/㎖의 인터페론을 10%(v/v)의 세포 배양 상청액(CCF)을 이용하여 37℃, pH 4에서 0 또는 14시간 동안 pH를 변화시키거나 변화시키지 않으면서 항온처리하고(2 내지 4 레인), SDS-PAGE에 의해 분리하였다. pH 변화는 20℃에서 수행하였으며, pH 4 및 pH 7에서 5분간 잠시 중단시켰다. IFN은 pH 불활성화가 없었던 경우보다 pH 변화에 의해 현저히 적게 분해된다(3 레인). 14시간 후, IFN은 완전히 분해되었다(4 레인).
레인의 레이아웃:
1 - 마커
2 - 항온처리 전의 IFN (0.1mg/㎖)
3 - pH를 변화시키면서 14시간 항온처리한 CCF + IFN (pH 4)
4 - pH를 변화시키면서 14시간 항온처리한 CCF + IFN (pH 4)
도 3: pH 4.0에서 10%(v/v)의 CCF를 이용한 3시간의 항온처리에 의한 단백질 IFN의 분해, RP-HPLC를 이용한 이의 분석. 중화에 의한 프로테아제의 불활성화 및 후속적인 pH 4.0에서의 IFN과의 항온처리 후, 3시간 후에 72%의 IFN이 RP-HPLC로 여전히 검출될 수 있는 반면, 동시에 불활성화시키지 않으면, IFN의 43%만이 온전한 상태로 존재한다. 따라서, 단백질 가수분해 활성은 야생형 단백질과 비교했을 때 그 절반까지 감소될 수 있다.
도 4: 산성 및 중성 pH에서의 형광 검정. CCF 내의 프로테아제는 pH 3.5(●) 및 pH 7(▲)에서 활성이다. pH 3.5 및 pH 7의 CCF에 존재하는 프로테아제에 의해 생성되는 단백질 가수분해 활성의 척도로서, 펩타이드 기질의 절단에 의한 형광단의 방출을 측정하였다.
도 5: pH 변화의 유무에 따른 중성 프로테아제의 단백질 가수분해 활성. 중성 프로테아제는 pH < 5로의 산성화 및 후속적인 중화에 의해 거의 완전하게 비가역적으로 불활성화될 수 있다. 활성의 측정은 각각의 경우에 pH 7에서 수행하였으며, 펩타이드 기질의 절단에 의한 형광단의 방출을 단백질 가수분해 활성의 척도로서 측정하였다.
도 6: pH 변화의 유무에 따른 산성 프로테아제의 단백질 가수분해 활성. CCF 내에서 프로테아제의 활성화/불활성화는 도 1과 유사하게 pH를 변화시켜 수행하였다. 활성화된 프로테아제는 pH < 5에서 활성이고, 기질을 절단한다. pH ≥ 7에서 간단히 항온처리하여 불활성화시킨 활성화된 프로테아제는 pH 3.7에서 35%로 감소된 잔류 활성을 나타낸다. 활성의 측정은 각각의 경우에 pH 3.7에서 수행하였으며, 펩타이드 기질의 절단에 의한 형광단의 방출을 단백질 가수분해 활성의 지표로서 측정하였다.

본 발명은 정제 공정의 개시시에 세포 배양 상청액 내의 pH를 반복적으로 변화시킴으로써 프로테아제를 불활성화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이점은 생성물의 품질과 수율이 개선되는 것, 및 크로마토그래피 물질의 수명이 더 연장된다는 것이다.

놀랍게도, 포유동물 세포주(예를 들어, CHO, "차이니즈 햄스터 난소" 세포)의 수거된 무세포 발효 상청액이, pH를 산성으로 변화시킴으로써 활성화될 수 있고, 또한 후속적으로 pH를 중성 범위로 변화시킴으로써 최적의 pH에서 그 활성이 비가역적으로 불활성화될 수도 있는 프로테아제를 함유하고 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 중성 pH 값에서 활성인 프로테아제는 중성 조건 하에 pH 수준을 산성으로 변화시킴으로써 그 활성이 비가역적으로 불활성화될 수도 있다.

다른 양상에서, 본 발명은 세포 배양물로부터 수득한 액체 중에서 단백질 분해를 감소시키는 방법으로서,

(a) 상기 액체의 pH를 3 내지 5로 조절하는 단계, 및 이후

(b) 상기 액체의 pH를 7 내지 9로 조절하는 단계

를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

세포 배양 상청액을 산성화시킨 후, 존재하는 프로테아제의 활성화가 분명하게 나타나는데, 이는 본래의 리소좀 단백질 가수분해 효소(카텝신)의 존재를 나타낸다. 이들 프로테아제는 식균 작용을 하는 단백질의 분해에 관여하고, 모든 조직에서 비활성 대용형(proform)으로서 매우 흔하게 발현되며, 엔도솜 내의 세포 내부에 위치하고 있다. 리소좀을 형성하기 위해 이들 구획이 성숙하게 되면, 리소좀 프로테아제의 자가 촉매적 활성화 및 인트랜스(in trans) 활성화 둘 다를 초래하는 pH의 현저한 저하가 수반된다. 세포외 공간으로의 카텝신의 분비는 주로 종양 조직의 전이와 관련해 논의되며, 세포 배양물에서의 일부 개별 카텝신 분비에 대해서도 기술된 바 있다.

중성 pH 값에서의 단백질 가수분해 활성은 한편으로는 분비된 프로테아제에 의한 것이고, 다른 한편으로는 생산 공정 동안 세포막으로부터 분리되어 용액에서 활성 상태를 지속하는 것으로 추정되는, 막에 본래 위치하고 있던 프로테아제에 의한 것일 수 있다.

통상적으로, 생물 약제 공정에 있어서, 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 생성물-함유 세포 배양 상청액으로부터 분리한다. 이어서, 무세포 상청액을 무균 여과시키고(공극 크기 최대 0.2μM), 포획 단계 전에 재완충을 위해 투석 여과한다. 2회의 pH 변화에 의한 불활성화는 세포로부터 세포 배양 상청액을 분리한 직후 최대한 빠른 시점에 수행할 수 있고, 이는 임의의 다른 후속 공정 단계에서도 사용될 수 있다.

pH 수준을 선택할 때에는, 생성물 분자 및 기술 장비가 손상되지 않아야 하기 때문에, pH < 3(생성물 단백질의 화학적 변형 및 강철 컨테이너의 부식 증가) 및 pH > 9(아스파라긴 및 글루타민의 탈아미드화)는 피해야 한다. 각 pH 값에서의 체류 시간도 생성물 단백질의 안정성에 의존한다. 산성화에 의한 프로테아제의 활성화 시간 간격은 가능한 짧아야 하지만, 5분 이상이 유리하다. 예를 들어, 5분 내지 30분의 체류 시간이 유리하고, 5분 내지 15분이 바람직하다. 산성 pH 수준에서의 활성화에 대한 체류 시간이 더 길어지면, 표적 단백질의 단백질 가수분해성 분해는 증가될 수 있다. 중성적으로 활성인 모든 프로테아제가 이미 불활성화되어 더 이상 단백질 가수분해 활성이 검출될 수 없으므로, 중성 pH에서의 산성 프로테아제의 불활성화를 위한 후속 체류 단계 시간 간격은 중요하지 않으며, pH도 수회의 공정 단계를 거치면서 유지되거나 다시 변할 수 있다. 중성화 단계에 유리한 체류 시간은, 예를 들어 5분 내지 60분이다.

각각의 표적 pH 값으로의 조절은 아세트산 또는 염산과 같은 산, 또는 수산화나트륨 용액 또는 Tris와 같은 가성소다/염기의 1회 첨가 또는 적정에 의해 용액 중에서 교반하면서 수행하였다. 산성 단계에서는, 3 내지 5의 pH 값이 유리하게 선택되는데, 예컨대 pH 3.5 내지 4.5, 바람직하게는 pH 4가 선택된다. 중화에 의한 산성 프로테아제의 후속적 불활성화는 7 내지 9의 pH 값이 유효한 것으로 증명되었으며, 바람직하게는 pH 7.4 내지 8.5이다.

본 발명은 4℃ 내지 37℃, 바람직하게는 15℃ 내지 37℃, 바람직하게는 20℃ 내지 37℃의 온도 범위에서 수행될 수 있다. 본 발명을 수행하기 위한 바람직한 범위는 20℃ 내지 30℃이다.

2회의 pH 변화에 의한 산성 프로테아제 및 중성 프로테아제를 불활성화시키는 공정은 포유동물 세포(CHO 및 NS0)의 무세포 배양 상청액에 대해 성공적으로 수행되었다. 또한, 그 결과는 다른 생산 유기체의 배양 상청액에도 전환될 수 있고, 다양한 생물 약제 제품의 제조에 있어서 생성물 단백질의 요건의 범위 내에서, 특히 이의 pH 안정성 범위 내에서 사용될 수 있다.

본 발명은 순전히 물리화학적 방법 및 생화학적 방법만을 이용한다. 상이한 pH 단위를 통한 2회의 pH 변화(도 1)에 의해, 산성 프로테아제 활성을 75%까지 그리고 중성 프로테아제 활성을 90%까지 비가역적으로 제거할 수 있다. 프로테아제 활성은 2가지 검출 방법, a) 펩타이드 절단 후의 형광 방출에 의해, 그리고 b) 본래의 단백질 기질의 분해에 의해 검출될 수 있다.

생성물과 장비에 유해한 프로테아제는 신속하고도 간단한 물리화학적 방법에 의해 생물 약제 의약을 생산하는 동안 비가역적으로 불활성화될 수 있다. 세포 배양 상청액은 가변적인 방식으로 사용될 수 있고, 그 결과 다양한 정제 기술에 의해 수득될 수 있다.

탱크에의 산과 가성소다의 첨가는 일은 매우 빠르고 쉽게 행할 수 있어, 산업용 규모로 확장할 수도 있다. 프로테아제의 불활성화 후, 세포 배양 상청액은 매우 가변적인 방식으로 정제 공정에 맞게 조정될 수 있다. 유지 시간 또는 pH 값은 통상적인 생산 공정과는 대조적으로 중요하지 않다.

실시예

실시예 1: 포획 단계 전, 수거 후 pH 의 변화

CHO 세포를 유가식 배양으로 11일간 성장시킨다(최종 체적 80L). 세포 배양 상청액(CCF)을 20℃로 유지하고, 관류 디스크 원심분리를 사용하여 세포로부터 분리하고, 여과 캐스케이드를 통해 멸균-여과한다. 이어서, 아세트산을 첨가하여 CCF의 pH 값을 pH 4로 저하시킨다. 표적 pH에 도달한 후, 수산화나트륨 용액을 첨가하여 CCF를 pH 7.5로 중화시키기 전에 이를 5 내지 10분간 유지한다. 추가의 처리(포획 단계) 전에, 포획 단계에 적합한 결합 조건을 달성하기 위하여 50kD의 MWCO 막을 통해 CCF를 한외여과/투석여과한다.

실시예 2: 멸균 여과 전, CCF 및 세포의 분리 직후 pH 의 변화

CHO 세포를 유가식 배양으로 11일간 성장시킨다(최종 체적 80L). 세포 배양 상청액(CCF)을 관류 디스크 원심분리를 사용하여 세포로부터 분리하고, 20℃로 유지한다. 이어서, 일정한 속도로 교반하면서 아세트산을 첨가하여 CCF의 pH 값을 pH 4로 저하시킨다. 표적 pH에 도달한 후, 수산화나트륨 용액을 첨가하여 CCF를 pH 7.5로 중화시키기 전에 이를 5 내지 10분간 유지한다. 이어서, 처리된 CCF를 여과 캐스케이드를 통해 멸균-여과한다. 추가의 처리(포획 단계) 전에, 포획 단계에 적합한 결합 조건을 달성하기 위하여 50kD의 MWCO 막을 통해 CCF를 한외여과/투석여과한다.

실시예 3: 바이러스의 불활성화 전, rProtA 포획 단계 후의 pH 변화

CHO 세포를 유가식 배양으로 11일간 성장시킨다(최종 체적 80L). 세포 배양 상청액(CCF)을 관류 디스크 원심분리를 사용하여 세포로부터 분리하고, 여과 캐스케이드를 통해 멸균-여과시킨 후, PBS(pH 7.5) 상에서 rProteinA 친화도 크로마토그래피를 이용하는 포획 단계에 적합한 결합 조건을 달성하기 위하여 50kD의 MWCO 막을 통해 CCF를 한외여과/투석여과한다. MabSelect 크로마토그래피 컬럼을 컬럼 매트릭스 1㎖ 당 32mg의 mAb로 충전하고, 항체를 아세테이트 완충액(pH 3.5)을 사용하는 단계에서 용출시킨다. 생성물을 함유하고 있는 분획의 pH를 1M의 Tris를 첨가하여 교반하면서 pH 7.5로 조절하고, 바이러스의 산성 불활성화에 적합한 조건을 선택하기 전에 상기 pH를 주위 온도에서 10분간 유지한다.

재료 및 방법

세포 배양 상청액

치료 단백질의 분비 생산에 최적화된 뮤린 및 CHO 생산 세포주를 무혈청 배지 중에서 수일간 배양한다. 세포 배양 상청액(CCF, 무세포 세포 배양액)을 여과 또는 원심분리에 의해 세포 및 불용성 성분들로부터 분리하고, 각각의 pH로 조절한 후 활성 검정을 위해 10 내지 20%(v/v)로 사용한다.

pH 값의 조절

아세트산을 첨가하여 세포 배양 상청액을 산성화한다. 샘플들을 즉시 혼합하고, 선택된 pH에서 5 내지 10분 동안 항온처리한다. 침전되는 성분들을 원심분리에 의해 펠렛화하여 제거한다. 수산화나트륨 용액 또는 1M의 Tris 염기를 첨가하여 pH를 상승시킨다.

프로테아제 부류를 측정하기 위한 억제 실험

개개의 프로테아제 부류들을 억제하기 위해, 시판되고 있는 상이한 억제제와 CCF를 항온처리하고, 이어서 임의의 잔류 활성을 활성 검정에서 조사한다. 억제제의 농도는 제조업자에 의해 권고된 것을 사용한다.

활성 검정

형광 검정, 형광단의 방출에 의한 분석

단백질 가수분해 활성의 동역학적 및 정량적 측정을 위해 사용된 기질은 상이한 펩타이드-형광단 접합체이고, 이의 절단은 아미노메틸쿠마린(AMC)과 같은 형광 염료를 방출시키거나 또는 N-메틸아미노벤조일-디아미노프로피온산(Nma) 상의 디니트로페닐(Dnp)에 의한 켄칭 효과(quenching effect)를 제거한다. 형광 신호의 증가는 Multilabel-Counter Victor² ^{, 3}(미국 메사추세츠주 소재의 Perkin Elmer)에서 λ_Ex =380nm; λ_Em　= 460nm (AMC), λ_Ex = 340nm; λ_Em=460nm에서 측광학적으로 모니터링할 수 있다 (도 3).

동역학적 및 정량적 측정을 위한 모든 검정은 pH 7(100mM의 Tris/HCl, 200mM의 NaCl) 및 pH 3.5(100mM의 Na-아세테이트, 200mM의 NaCl)에서 10 내지 20%(v/v)의 CCF의 존재 하에, 0.2mM의 펩타이드-AMC, 10 내지 20μM의 펩타이드-MCA 또는 5 내지 10μM의 DnP-펩타이드-Nma의 기질 포화 상태에서 수행한다.

분해 검정, PAGE 및 RP - HPLC 에 의한 분석

단백질 가수분해 활성의 정량 분석에 사용된 기질은 인터페론 부류(IFN)의 천연 단백질이다. IFN은 그 크기가 22.5kD이고, 용액 중에 단량체로 존재한다. 분해 검정을 위해, 0.1mg/㎖의 IFN을 37℃, pH 4에서 24시간까지 10%(v/v)의 CCF와 함께 항온처리하고, SDS-Page 및 호이케쇼펜(Heukeshoven)에 따른 은 염색(Heukeshoven, J., Dernick, R., Improved silver staining procedure for fast staining in PhastSystem Development Unit. I. Staining of sodium dodecyl sulphate gels. Electrophoresis, 9, (1988) 28-32)에 의해 검출하거나, 단백질의 분해를 단백질 가수분해 활성의 척도로서 RP-HPLC에 의해 측정한다.

RP-HPLC 분석은 물 중의 0.2%(v/v) TFA(용액 A) : 아세토니트릴 중의 0.15%(v/v) TFA(용액 B)의 구배 용출에 의한 Vydac 214 TP-C₄ 컬럼을 사용하는, UV 검출기(Waters 2487 Dual Absorbance Detector)가 장착된 Waters에 의해 제조된 HPLC 장치(Waters 2695 alliance) 상에서 수행한다(표 1).

결과

CCF의 프로테아제에 의해 절단되는 기질은 산성 pH 값(pH < 5) 및 pH 7 부근의 중성 범위 내에 위치하고 있는 2개의 피크를 갖는다. 각 프로테아제의 활성은 단백질 분해 및 형광원인 펩타이드 기질이 절단된 후의 형광 방출에 의해 모니터링될 수 있다(도 2 및 도 4). 도 2는 10%(v/v) CCF의 존재 하에 pH 4에서 IFN이 분해됨을 나타낸다. 단지 몇 시간 후에 IFN은 산성 조건 하에 분해되고(4 레인), 도 4는 pH 3.5 및 pH 7에서의 항온처리 후 시간의 경과에 따른 20%(v/v) CCF에 의한 Dnp-펩타이드-Nma-기질의 절단 과정을 나타낸다. 증가하는 형광 신호는 펩타이드 기질 절단에 대한 척도이다. 활성은 산성 및 중성 pH 값 둘 다에서 관찰된다.

이러한 활성은 프로테아제 부류-특이적 억제제에 의해 억제되어, 다수의 프로테아제 부류가 CCF 내에 존재하며 이하의 두 그룹으로 분류될 수 있음을 나타낼 수 있다: 낮은 pH 수준에서만 활성인 산성-활성 프로테아제 및 중성 pH 수준에서만 활성인 중성-활성 프로테아제. 산성 활성 프로테아제는 중성 pH 값에서는 활성을 갖지 않고, 중성 활성인 프로테아제는 산성 pH 값에서는 활성을 갖지 않는다. 중성-활성 프로테아제가 세포 분리시에 이미 활성인 반면에, 반응 조건이 산성화될 때까지 CCF 내의 산성 활성 프로테아제의 활성화는 일어나지 않는다.

중성 프로테아제를 불활성화시키기 위한 2단계의 pH 변화

비처리된 CCF의 중성 프로테아제의 활성은 형광 검정으로 pH 7에서 측정될 수 있다(도 5, 원형 ●). 중화 단계 후 pH 7에서 pH < 5로 2단계의 pH 변화를 CCF에 행하면, pH 7에서의 형광 검정에서 사실상 추가의 활성은 검출될 수 없다(도 5, 삼각형 ▲).

CCF의 간단한 산성화 및 후속적 중화는 중성-활성 프로테아제의 총체적이면서도 비가역적인 단백질 가수분해 활성의 손실을 초래한다.

산성 프로테아제를 불활성화시키기 위한 2단계의 pH 변화

CCF의 산성화에 의해 활성화된 프로테아제의 단백질 가수분해 활성은 형광 검정 및 단백질 분해 검정으로 pH 3.5에서 검출될 수 있다 (도 6, 사각형 ■). 그러나, 이러한 활성은 CCF가 산성화 후에 중화되는 경우에는 유지되지 않는다. 산성 프로테아제에 대해 최적인 pH 3.5의 반응 조건이 중화 후에 회복되는 경우에, 형광 검정에서 측정가능한 산성 프로테아제의 활성은 비처리된 CCF와 비교했을 때 65%까지 감소된다(도 6, 삼각형 ▲).

또한, 단백질의 분해도 2번의 pH 변화에 의해 감소된다. 모델 단백질 IFN의 분해는 중화 단계 후 현저히 감소된다(도 3, 회색 막대 그래프).

pH를 반복적으로 변화시킨 결과, 천연 단백질 기질인 IFN의 분해를 50%까지 감소시키는 것이 가능하였다(도 3, RP-HPLC에 의한 정량).

Claims

세포 배양물로부터 수득한 액체 중에서 프로테아제를 불활성화시키는 방법으로서,
(a) 상기 액체의 pH를 3 내지 5로 조절하는 단계, 및 이후
(b) 상기 액체의 pH를 7 내지 9로 조절하는 단계
를 포함하는, 세포 배양물로부터 수득한 액체 중에서 프로테아제를 불활성화시키는 방법.
세포 배양물로부터 수득한 액체 중에서 단백질 분해를 감소시키는 방법으로서,
(a) 상기 액체의 pH를 3 내지 5로 조절하는 단계, 및 이후
(b) 상기 액체의 pH를 7 내지 9로 조절하는 단계
를 포함하는, 세포 배양물로부터 수득한 액체 중에서 단백질 분해를 감소시키는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 pH가 3.5 내지 4.5의 범위 내인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 pH가 5분 내지 30분의 시간 동안 유지되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 pH 조절이 20℃ 내지 30℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 pH가 7.4 내지 8.5의 범위 내인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 pH가 5분 내지 60분의 시간 동안 유지되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 pH 조절이 20℃ 내지 30℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체가 포유동물의 세포 배양물 유래의 액체인 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항에 있어서, 상기 액체가 포유동물의 세포 배양물 유래의 무세포 액체인 것을 특징으로 하는, 방법.