JPH06505731A - 免疫グロブリンのＦ（ａｂ´）↓２フラグメントを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫グロブリンのＦ（ａｂ’　）２フラグメントを製造する方法技術分野 本発明は培養培地を酸性化してタンパク質を消化することにより免疫グロブリン タンパク質からＦ（ａｂ’）ｔおよびＦａｂ’フラグメントを製造することに関 する。本発明は特に培養培地でハイブリドーマ細胞を培養した後モノクローナル 抗体を含む上清の酸性化によりかかる抗体からＦ（ａｂ’　）！フラグメントを 製造することに関する。

背景技術 Ｇクラスの免疫グロブリン（［ｇＧ）は２つのＨ鎖および２つのし鎖から成る。

Ｌ鎖はジスルフィド（Ｓ−３）架橋によりそれぞれＨ鎖と結合し、Ｈ鎖は、ヒン ジ領域として知られている位置で、免疫グロブリンのサブクラス（ｒｇＧｌ　、 ［ｇＧ２ａ　、　ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ３）に依存して、１〜３つのジスルフ ィド架橋により相互に結合する。それぞれのＨ鎖の約１／２はＬ鎖と結合し免疫 グロブリンの抗原認識構造を形成しそれぞれの２つのＨ鎖の他の１／２は非共有 結合力により強固に相互反応する。ＩｇＧ分子の消化は種々のフラグメントを形 成させる。Ｆ（ａｂ’　）２フラグメントはＩｇＧ分子が分離してＩｇＧ分子の ２つの結合したＬ鎖−Ｈ鎖部分かなおヒンジ領域で１つ以上のＳ−８架橋により 結合している場合に得られる（例えばペプシン切断）。［ｇＧ分子の非共有相互 反応Ｈ鎖部分は分離してＦｃと称するフラグメントを形成する。

Ｆ（ａｂ’　）２フラグメントの１つ以上のＳ−８架橋原子団は化学的な還元に より実質的に切断することができＦａｂ’フラグメントが形成される。Ｆａｂフ ラグメントはＳ−８架橋が切断されまたはＦｃフラグメントを伴うような分子を 切断することにより［ｇＧ分子から直接形成させることができる（例えばパパイ ン切断）。

次の議論で、ＦａｂおよびＦａｂ’フラグメントは抗原結合性および薬物動態学 に関して同様の実体とみなされる（　ｒＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆ　Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇＹ、第３版、Ｗ、　Ｊ、　Ｈｅｒｂｅｒｔ等編（Ｌｏｎｄｏｎ：　Ｂｌ ａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　１９８ ５年）」、　１０８ページから若干の無関係な内容を削除して引用した、ＩｇＧ 分子の図、図６を参照〕。ＦａｂおよびＦａｂ’フラグメントはそれらの形成経 路についておよびヒンジ領域のいくらかがそのフラグメントに結合するかどうか についての可能性が正式には異なる。Ｆａｂフラグメントはヒンジ領域の部分が 全＜Ｆａｂフラグメントを引きつけないように切断して形成される。Ｆａｂ’フ ラグメントはジスルフィド結合を還元して化学的にＦ（ａｂ’）ｔを切断するこ とにより形成しヒンジ領域の部分を残すか残さない場合がある。免疫学的に、Ｆ ａｂおよびＦａｂ’フラグメントは本質的に同一の様式で反応する。ＩｇＧ以外 の免疫グロブリンもＦ（ａｂ’　）＊、Ｆａｂ’（Ｆａｂ）およびＦｃの元にな り本発明の範囲内に含まれる。従ってＩｇＧを模範の免疫グロブリンとして用い るが、この理由はＩｇＧが最も普通の免疫グロブリンであり一般に最も安定なフ ラグメントを生成するからである。

Ｆ（ａｂ’　）ｚフラグメントは約１００．０００ダルトンの分子量を有し通常 安定である。Ｆ（ａｂ’　）！の化学的還元切断（例えばシスティンに関して） から得られるＦａｂ’フラグメントおよびＩｇＧから直接形成されたＦａｂフラ グメントは約５０．．０００ダルトンの分子量を有する。［ｇＧ分子のＦｃ部分 は安定なフラグメント（Ｆｄ）を形成することができあるいはさらに切断されて 多数の小さなフラグメントを生じる場合がある。プロテイナーゼのペプシンを用 いたＩｇＧ分子の消化は代表的にＦ（ａｂ’　）ｔおよびＰｃフラグメントの形 成を起こし、プロテイナーゼのパパインを用いた消化は代表的にＦａｂおよびＪ ’ｃフラグメントの形成を生じる。

モノクローナル抗体のＦ（ａｂ’　）２およびＦａｂ’フラグメントは診断およ び医薬分野のどちらにも有用である。これらがＦｃ部分に帰される元の［ｇＧ分 子の好ましくない副作用を示さず元の［ｇＧ分子の抗原特異的結合特性を保持す るＩｇＧ分子の小さなフラグメントに相当するからである。Ｆ　（ａｂ’　）ｚ およびＦａｂ’フラグメントはともにラジオイムノシンチグラフィおよび放射性 免疫療法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）のような技術に有用である 。それぞれが異なる薬物動態および排出特性を有しＦｃ部分の欠如か好ましくな い非特異的結合を減少させるからである。しかし、現状ではこれらのフラグメン トはこれらの製造において生じる困難性によりこれらを十分に活用できていない 。

インビボの適用について、免疫グロブリンの一層小さなＦ（ａｂ’　）２および Ｆａｂ’フラグメントは無傷の元の免疫グロブリンが自ら分布するよりも著しく 速く患者の血管外容積中でそれ自身が分布する。これによりＦ（ａｂ’）ｔおよ びＦａｂ’フラグメントは血管外抗原と一層迅速に反応し従って患者における所 望の作用の発生が促進される。さらに、フラグメントの小さな寸法によりこれら は大きな元の免疫グロブリンより速（患者の体内から排泄される。この迅速なり リアランスの結果、ヒ１〜を監視する処理（ｐｅｒｓｏｎ　ｏｖｅｒｓｅｅｉｎ ｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）によりモノクローナル抗体の動態を変えることができ 、従って放射性活性または迅速な送達のための薬物送達系で、本質的に、患者を 一層迅速に処置することができる。

マウス免疫グロブリンのインビボ投与に応じて高まるヒト抗マウス免疫応答はＦ （ａｂ’）ｚおよびＦａｂ’　フラグメントの投与により減少させることができ る。これは、一般に、免疫グロブリンの本質的免疫原性部位である免疫グロブリ ンのＰｃ部分を除去することに起因する。また免疫グロブリンのＰｃ部分は種々 の組織中のＦｃ受容体との望ましくない相互反応の原因であり望ましくない相互 反応はモノクローナル免疫グロブリンの好ましくない蓄積の原因の一部分である 。

また個々の患者に対して１種より多いモノクローナル抗体の混合物すなわち”カ クテル”を用いた処置の調整は抗体フラグメントの使用により高められる。例え ば、免疫グロブリンのＦ（ａｂ’　）ｌフラグメントは容易に還元したジスルフ ィド架橋により結合されるため、ｒＳｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）Ｊ 　Ｂｒｅｎｎａｎ等著に記載された方法と同様の方法を用いて異なる特異性の２ つのモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）フラグメント（Ｆ（ａｂ’　）！のｌ／ ２〕を共有結合させることにより異種三機能分子（ｈｅｔｅｒｏ−ｂｉｆｕｎｃ ｔｉｏｎａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を生産することかできる。インビボ試験のた めに、マクロファージおよび単球のような細胞に対して免疫グロブリンの結合を 仲介するＰｃは免疫グロブリンフラグメントを用いて著しく減少させることがで き、従ってかかるアッセイのパックグラウンドレベルが減少する。消化中に元の 分子から分離されるＰｃ部分に起因する望ましくない副作用を伴わずにＦ（ａｂ ’　）２およびＦａｂ’フラグメントが無傷の元の免疫グロブリンの抗原結合特 性を保持するため、これらのフラグメントの生産および使用が極めて望ましい。

免疫グロブリンを本発明に記載したフラグメントに転換する方法では、技術的に 簡単な方法として医薬または診断の品位の免疫グロブリンフラグメントの製造を 高収率で行うことができる。

Ｆ（ａｂ’　）２およびＦａｂ’フラグメントの生産における主要な問題はフラ グメントの収率が一般に低く、５０％未満であることである。目下、高度に精製 されたＩｇＧフラグメントの生産方法には消化処理を開始する前に［ｇＧを腹水 症流体（ａｓｃｉｔｅｓ　ｆｌｕｉｄ）または細胞培養培地から精製することが 必要である。またこれらの方法は消化を達成するために、キモパパイン、トリプ シンまたはペプシンのような精製したプロテアーゼを免疫グロブリンに添加する 必要がある。これらの必要条件はともに生産コストを増し、品質保証を複雑にす る。薬剤はエンドトキシン含量が低く無菌である必要がある。免疫グロブリンに 添加したプロテアーゼは医薬の品位のモノクローナル抗体として有用とするため に医薬品として同一の標準品にまで同一の条件下に特別に精製する必要がある。

さらに、プロテアーゼの使用により生じる外因性生成物を除去する必要がある。

あるいはまた、プロテアーゼはプロテアーゼにより製造されるモノクローナル抗 体から分離され得る支持体に付着させることができる。支持されたプロテアーゼ は１ｇＧフラグメントを製造するために用いた支持されたプロテアーゼのいくつ かの間にかなりの不安定性が存在するという追加の問題を有する。この不安定性 は支持されたプロテアーゼの分解生成物による製造されたフラグメントの汚染を 起こす。最後に、ビーズ化したアガロースに結合させたキモパパインのような、 支持させた試薬を伴う消化反応は、時々試験する必要かあり、さもなければ、消 化反応は免疫グロブリンの不完全な消化または過剰な消化のために失敗する。

Ｗａｔａｎａｂｅ等はｒＶｏｘ　Ｓａｎｇ、　４８：　１〜７（１９８５）Ｊに 血漿誘導プロテアーゼのプラスミンを用いた処理によるヒト免疫グロブリンから のＦａｂおよびＦｃフラグメントの製造方法を記載している。

ＰａｒｈａｍはｒＪ、［ｍｍｕｎｏｌ、　、１３１：２８９５〜２９０２（１９ ８３）Ｊてペプシン、キモパパインまたはトリプシンを用いた処理によるマウス 免疫グロブリンのＦａｂおよび／またはＦ（ａｂ’）ｚフラグメントの製造につ いて報告している。Ｐａｔｈａｍはモノクローナル抗体の比較的純粋（〉５０％ ）なＦ（ａｂ’）ｚフラグメントをクエン酸の添加により腹水症流体のｐＨを３ ．５まで低くした後直接に腹水症流体からペプシンを用いて生産することかでき ることを示した（最大ペプシン活性は約ｐＨ２，０で生じるが、通常免疫グロブ リンを完全に崩壊させて無益なフラグメントを生じさせる）。腹水症流体中の汚 染物質となる血清タンパク質は透析により排除される主として低分子量フラグメ ントに消化されＦ　（ａｂ’　）２フラグメントはＴｒｉｓ−ＩＣＩ　Ｃ）リス （ヒドロキシメチルアミノ）メタン−ＨＣｌ　）　、ｐＨ７，５を溶離液として 用いてジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース上での反応混合物のクロマ トグラフィにより精製された。Ｕｌｔｅｅ等に対する米国特許第４．９３７．１ ８３号（’　１８３特許）には抗体−化合物または中間体化合物コンジュゲート を含む抗体をパパイン、キモパパインおよびフィシンのような予め活性化したチ オールプロテアーゼを用いて消化することにより抗体フラグメントを調製する方 法が記載されている。′１８３特許の実施により得られるＦ（ａｂ’）２フラグ メントは遊離のＦ（ａｂ’　）ｌフラグメントとしては存在しないが、むしろ抗 体Ｆ（ａｂ”）ｘ−化合物、中間体またはコンジュゲートとして存在する。Ｓｃ ｈｌａｅｇｅｒ等はｒＤｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄａｒｄ　、６ ６：４０３〜４０８（１９８７）　Ｊで４，５未満のｐＨに酸性化し、３７°Ｃ で１６時間温装した血清を減少させたあるいは血清を含まない培養上清からＦ（ ａｂ’　）２フラグメントを製造する方法を記載している。Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ 等は１０％、５９６．２．５９６．０．５％および０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ ）を含む培養培地でハイブリドーマ細胞を培養した。ハイブリドーマ細胞を培養 し上清からそれら細胞を分離した後、上清を酸性化して温度した。パパインまた はペプシンのようなプロテアーゼは酸性化した上清には添加しなかった。Ｓｃｈ ｌａｅｇｅｒ等は低レベルのＦＣＳ（０，５％または０％）を培養培地に用いた 際、酸性化および温度後に有為なプロテアーゼ活性か得られることを見出した。

高いＦＣＳレベルでは、酸性化した上清のプロテアーゼ活性が減少した。これら の著者はプロテアーゼ活性がハイブリドーマ細胞による調整後に培地中に存在す るリゾソームカテプシンＤに類似する１つまたは２つの細胞性（酸性）プロテア ーゼから生じると推測した。すなわち、プロテアーゼが生じかつ培地か培地中で ハイブリドーマ細胞を培養することにより調整される。Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ等は 酸性化した上清中のプロテアーゼ活性がペプスタチンＡの存在により１００％阻 害されることを見出した。

従来の技術にはプロテアーゼの添加を用いておよび用いないでＧクラスの免疫グ ロブリンを消化することによりＦ　（ａｂ’　）２およびＦａｂフラグメントを 製造する方法が記載されているが、それらの技術はＦ（ａｂ’　）２およびＦａ ｂフラグメントの大量を製造する商業上有利な方法を記載してはいない。既知の 技術には、単独または組み合わせて、時間の長い、高価なしかもそれら生成物の 質および純度において時として不確実である方法が記載されている。Ｆ（ａｂ’ 　）２フラグメントを入手することができるが、臨床上の研究におけるそれらの 使用は著しく制限され、それらはＩｇＧに比へて一般に高価である。このような Ｆ（ａｂ’　）２およびＦａｂフラグメントの”経済的な利用不能”は、これら のフラグメントの有用性か広く認識されているにもかかわらず、かかるフラグメ ントを経済的に製造する方法に対する必要性が果たされていないことを示す。本 発明は受け入れることができる薬理学的存在量の酸性化させる化合物をモノクロ ーナル抗体を含むハイブリドーマで調整した上清流体に添加することによりかか るフラグメントを経済的な手段で製造する方法を記載している。

発明の開示 本発明は免疫グロブリンを産生ずるハイブリドーマ細胞により調整したほとんど 血清を含まない組織培養培地中に存在する免疫グロブリンタンパク質を消化する ことにより抗体のＦ（ａｂ’）ｔおよびＦａｂ’フラグメントを製造する方法に 関する。この方法は製薬上受は入れることができる酸を培養培地に添加しく診断 のための利用に関しては、広範囲の酸を用いることができる）、培養培地中で免 疫グロブリンを無用なフラグメントに転化させることなく前記免疫グロブリンを Ｆ　（ａｂ’　）ｚおよび／またはＦａｂ’フラグメントに（中和後に還元的化 学的切断により）転化するために十分な時間１５〜５０°Ｃの範囲の消化温度で 消化し、消化が本質的に完了した後、消化培地を中和し、さらにフラグメントを 含む培地を濾過して望ましくない成分を除去することを必要とする（　ＩｇＧの フラグメントへの転化は４℃で達成されたが、必要な時間は一層長い。しかし、 免疫グロブリンおよび／またはフラグメントの本質は低温を必要とする場合には 、これは本発明により達成される）。本発明では望ましくないＦｃフラグメント 、エンドトキシンおよび存在がかかるフラグメントの製薬上の使用を妨げあるい は高価な精製方法を必要とする他の物質を含まないＦ（ａｂ’　）ｌおよびＦａ ｂ’フラグメントを製造する方法を記載する。本発明の方法はクエン酸を用いて ハイブリドーマ培養上清を２．０〜５．０の範囲のｐＨにまで酸性化する。

クエン酸の使用は免疫グロブリンを消化するためのプロテアーゼの使用に関して クエン酸／炭酸ナトリウム溶液を滅菌することができる容易性のためおよびクエ ン酸が一般に汚染物質として見なされないため好ましい。汚染物質として見なさ れずに用いることかできる他の酸はリン酸、塩酸、および酢酸等である。

本発明の方法から得られる）’　（ａｂ’　）２およびＦａｂ’フラグメン炭酸 ナトリウムを含むことがある。

図面の簡単な説明 図１はＨＰＬＣＤＥＡＥクロマトグラフィ後にＭＹ９０４調整培地からの２つの 別々のプロテアーゼ活性を図示する。

図２は本発明の方法により調整した還元および非還元ＭＹ９０４Ｆ（ａｂ’）ｚ フラグメントの２次元交差免疫電気泳動を図示する。

図３はＭＹ９０４のｐ’　（ａｂ’　）ｔフラグメントのＳＤＳポリアクリルア ミドチューブゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を図示する。

図４は１０ツトのＭＹ９０４モノクローナル抗体および３０ツトのＭＹ９０４　 Ｆ　（ａｂ’　）２フラグメントの免疫電気泳動を図示する。

図５は３つの異なるヤギ抗血清、１つの抗血清を各オフタロニープレートに用い てＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）２についてオフタロ二一試験をした結果を図示 する。さらに、 図６はＩｇＧ分子のＦ（ａｂ’　）２、Ｆａｂ、　ＦｃおよびＦｄ部分を図示す る。

発明を実施するための最良の形態 本発明は免疫グロブリンの酵素による消化におけるｐＨ低下の原理および重要な 作用を示す。平の作用は免疫グロブリン分子をタンパク分解消化に対し影響を受 けやすくすることであるが、はぼ中性のｐＨでは、免疫グロブリンは良く知られ ているように消化が困難である。有望な機構は免疫グロブリン分子のＦｃドメイ ンの変性（または３次構造の変化）であり、これによりドメインが存在するプロ テアーゼ物質の影響を受けやすくなる。以下に示す例は本発明の方法を用いて達 成した結果を例示する。

用語の説明 免疫グロブリンはＩｇと略記する。ここで用いたように、用語モノクローナル抗 体、免疫グロブリン、および免疫グロブリンタンパク質を特に示さない限り交換 可能に用いる。

Ｆ（ａｂ’　）２、ＦａｂおよびＦｃフラグメントは免疫グロブリン、モノクロ ーナル抗体、または免疫グロブリンタンパク質から生じる。

Ｆａｂ’はＦ　（ａｂ’　）２フラグメントの化学的還元的切断から生じジスル フィドヒンジ領域の部分を含む。

Ｆａｂは免疫グロブリンの切断から直接生じ、ジスルフィドヒンジ領域のいかな る部分をも含まない。

Ｆａｂ’およびＦａｂフラグメントは抗原結合および薬物動態に関し免疫学的に 等価である。

本発明の最良の形態 本発明の方法はＩｇＧをＦ（ａｂ’）ｚまたはＦａｂ’フラグメントに消化する ために未精製モノクローナル抗体ＩｇＧを含むハイブリドーマ調整培地にクエン 酸を添加することを特徴とする特許ぎない。［ｇＧのすべてのサブクラスを本発 明の方法で用いることができる。クエン酸および炭酸ナトリウムの溶液は滅菌す ることができプロテアーゼ溶液に比べ比較的容易にパイロジエンを含まなく　（ ｎｏｎｐｙｒｏｇｅｎｉｃ）することができる。Ｆ（ａｂ’　）ｚまたはＦａｂ ’フラグメントの製造のために本発明の方法の最良の形態では、ＩＭのクエン酸 溶液をモノクローナル抗体のような免疫グロブリンを含むハイブリドーマ培養培 地に添加した。モノクローナル抗体を生産するのに用いたハイブリドーマ細胞を クエン酸の添加前に培地から除去した。あるいはまた、ＡＣＣＵＳＹＳＴｍａｃ ｈｉｎｅ　（米国、ミネソタ州、クーンラピッド所在の８ＮＤＯＴＲＯＮＩＣ８ Ｃｏｒｐ、　）のような商業上入手し得る装置を用いてハイブリドーマ細胞を含 まないモノクローナル抗体を含む調整培地を生産することができる。十分なりエ ン酸を調整培地に添加してｐＨを最適値、一般にｐＨ３，５に調節したが、マウ スＩｇＧｓモノクローナル抗体に対してはＩ］Ｈ５，０とした。代表的に、０． ０４ｍ１の１Ｍクエン酸を調整培地の１ｍｌ当たりに添加した。酸性化した後、 培地を約２０°Ｃ〜約４０°Ｃの範囲の温度で約１時間〜約４８時間の範囲の時 間装置した。最適時間は一般に約１８時間であり最適温度は一般に約２５°Ｃで あった。免疫グロブリンのＦ　（ａｂ’　）！フラグメントへの転化は、所望に より例えば免疫グロブリン出発材料の消耗または副反応の発生により、反応溶液 のｐＨを１Ｍ炭酸ナトリウム溶液または同様の塩基性溶液の添加により高めるこ とで、停止させた（必要とする１Ｍ炭酸ナトリウムの量は添加したクエン酸の容 積の約２，５倍である）。消化後に残る低分子量のペプチドフラグメントを除去 し、フラグメント溶液の塩および緩衝剤を公称３０．０００の分子量カットオフ 膜を用いるダイアフィルトレージョンにより、同時に５ｍＭリン酸カリウム（ｐ Ｈ７，５）に交換する。Ｆ（ａｂｊ　）２生成物はＤＥＡＥセルロースカラムか ら溶出するが元の免疫グロブリンおよび他の汚染物質はＤＥＡＥカラムに結合し たままであった。代表的に、ゲル電気泳動により検出可能な唯一の汚染物質は、 たとえあるにしても５％未満の未消化免疫グロブリンである。未消化免疫グロブ リンはＤＥＡＥセルロースの無菌で、低パイロジエンのカラムでのクロマトグラ フィにより１％未満に減少させた。この方法はすべてのマウス免疫グロブリンＧ サブクラスＩｇＧ１および［ｇＧ３に適用可能であった。少なくともいくつかの マウス［ｇＧ２クラス抗体はこの方法に耐える。免疫グロブリンのＦａｂ’フラ グメントはジチオスレイトール、システィンまたは２−メルカプトエタノールの ような還元剤を用いた化学的還元による本発明の方法により製造した精製Ｆ（ａ ｂ’）ｚフラグメントから製造することかできる。いかなる過剰な還元剤もダイ アフロー、透析、またはゲル濾過クロマトグラフィにより除去することができる 。Ｆａｂ’フラグメントは試験された免疫グロブリンから直接製造されることか 現在認められている。

免疫グロブリンの高度に精製したＦ　（ａｂ’　）２フラグメントはモルを基に して理論的に８４％〜１０４％の収率範囲で得られた（表９、質量を基にすると ５０９６より高い）。マウス［ｇＧ２モノクローナル抗体はマウス［ｇＧＩに用 いるより穏やかな条件を用いて転化させる。一般に、マウスＩｇＧ３を、例えば 、３７℃、ｐｉ（５，０で約３時間装置することによりＦ（ａｂ’）２フラグメ ントに転化させることができる。

免疫グロブリンＭＹ９０４をここに含まれる表および図に要約した実験に用いた 。ＭＹ９０４モノクローナル抗体はＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに供託したハイブリドーマ細胞株からまたはこの出願の 嬢り受け人である、り・−ルターコーポレーションから入手することかできる多 数の他のモノクローナル抗体からＦ（ａｂ’　）２フラグメントだけを首尾よく 製造する典型的な目的のために選択された。他のモノクローナル抗体はＫＣ−４ ，１ｇＧａ型、Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，受託番号Ｆ（８８７０９；　ＫＣ−４、Ｉ ｇＭ型、Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，受託番号ＨＢ８７１０　；クールターコーポレー ションからの対照マウスＩｇＧ１　：クールターコーポレーションからのＴｌｌ 　；クールターコーポレーションからのＭｃ５　；　ＢｒＥ３、Ａ、　Ｔ、　Ｃ ，Ｃ，受託番号ＨＢＩＯ０２８；クールターコーポレーションからの２Ｈ４；お よびＫＣ−１６、Ａ、Ｔ、　Ｃ１Ｃ，受託番号ＣＲＬ８９９４である。

ＭＹ９０４およびここに示したような他の試験した免疫グロブリンはマウス免疫 グロブリンである。しかし、本発明は、例えば、ヒト、ウサギもしくはヤギのよ うな他の種からの免疫グロブリンまたはラット免疫グロブリンに適用可能である 。さらに、キメラ化した免疫グロブリンを本発明で用いることかできあるし）は 本発明を用いて得たフラグメントをキメラ化することができる。

Ｆ（ａｂ’）２および／またはＦａｂ’フラグメントの製造において、出発材料 として用いる調整培地は高レベルの非免疫グロブリンタンパク質、例えば血清タ ンパク質を含まないことが重要である。これらのタンパク質が最終製品に汚染を 引き起こし消化反応の進行を阻害するからである。本発明で用いる培養培地はわ ずかの広く知られているタンパク質添加物、例えばインシュリンおよび上皮組織 成長因子を含んでいるにすぎず、血清を含んでいない。

クエン酸添加により達成される、それぞれのモノクローナル抗体の収率を最適化 するための、正確なｐＨを実験により決定した。測定は十分なりエン酸を調整培 地試料に添加して４．５．４゜２５．４．００．３．７５．３．５．３．２５、 および３．００までの一層低いｐｉ（にすることにより行った。次いてそれぞれ の酸性化培地を２５°Ｃで１８時間温装した。それぞれの試料に存在するＩｇＧ をｐＨに依存する速度てＦ（ａｂ’）２フラグメントに転化する。Ｆ（ａｂ’） ｔに転化した［ｇＧの割合はＴＳＫ−Ｒ−２５０ＨＰＬＣカラム（米国、カリフ ォルニア化、リッチモンド所在のＢｉｏＲａｄ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用 いた分析ゲル濾過クロマトグラフィを溶媒としてリン酸緩衝溶液を使用して測定 した。［ｇＧ対Ｆ（ａｂ’　）２の割合は２８０ナノメータ（ｎｍ）の吸光度を 測定する相対的ピーク高さにより決定する。ＩｇＧのＦ（ａｂ′）２への転化の ｐＨ依存性（１８時間、２５°Ｃ）を表１に示す。

表１．モノクローナル抗体ＭＹ９０４に対するクエン酸で調整したｐＨとハイブ リドーマ調整培地中でのＦ（ａｂ’　）ｚの形成との関係 装置試料　ｍｇ／ｍｌ　ＭＹ９０４１ｇＧ１　ｍｇ／ｍｌ　ＭＹ９０４　Ｆ（ａ ｂ’　）を表１に示す結果はｐＨ３，５が［ｇＧのｐ　（ａｂ’　）２への転化 にとって最適であることを示す。実験で用いたモノクローナル抗体、ＭＹ９０４ 　（米国、フロリダ州、ヒアレア所在のクールターコーポレーション）はＩｇＧ １アイソタイプである。表１の結果はすべてのＩｇＧＩアイソタイプモノクロー ナル抗体に対してあてはまる。

これらの結果はＦ　（ａｂ’　）２の最大収量および免疫グロブリンの検出不能 な量を示している。最適ｐＨは３．５であるが、免疫グロブリンの有意な転化は ｐｉ（４，５およびそれより高いｐＨで発生する。

Ｆ　（ａｂ’　）ｚの収量に及ぼす作用を同様の一連の実験で試験した。ＭＹ９ ０４ハイブリドーマ調整培地をクエン酸を用いてｐＨ３，５に調整した。次いて 試料をアリコートに分割し種々の温度の水浴中で１８８時間温置た。結果を表２ に示す。

表２．ｐＨ３，５に調整し１８８時間温置たＭＹ９０４で調整した培地に対する 温室温度と収量との関係 ｍｇ／ｍｌ　ｍｇ／ｍｌ 温置温度温室　ＭＹ９０４１ｇＧＩ　ＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）２表２に示 すように、温度か高くなるとＩｇＧ濃度は減少するが、反応のための最適温度は ２５℃であることが見出された。Ｆ（ａｂ’　）ｚフラグメントの存意な損失は ２５°Ｃより高い温度で発生した。おそらく、高い温度でのｐＨ３，５の培地中 のＦ　（ａｂ’　）ｚのさらなる酵素による分解の動態は［ｇの消化に比例して 加速されＦ（ａｂ’　）ｚフラグメントは形成されるよりも速く小さなフラグメ ントに消化される。

次の連続した実験は消化活性かハイブリドーマ細胞により生産される活性物質に 依存するかどうかあるいは消化が抗体、ｐＨまたは温度に単独で依存するかとう かを決定するために実施した。精製したＭＹ９０４モノクローナル抗体をＮｕｔ ｒｉｄｏｍａ−３Ｐ細胞培養培地（米国、インディアナ州、インディアナポリス 所在のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　） に約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。培養培地のｐＨをクエン酸を用いて３ ．５に調整し、抗体を含む培地をいくつかの試料に分割し、さらに培地の個々の 試料を種々の温度で約１８時間温室した。以前の実験では酵素による反応の速度 が温度とともに増加することを示したので、免疫グロブリンのＦ　（ａｂ’　） ２フラグメントへの迅速な転化は一層高められた温度で発生する。従って、Ｆ（ ａｂ’　）！フラグメントの適切な収率が、最小のＩｇＧ汚染で、２５°Ｃより 高い温度（例えば３７°Ｃ）でこれらの実験に通常用いられる１８時間より少な い時間温室することにより達成されることが予測される。表３に示した、これら の実験の結果は温度が上昇するにつれｐ　（ａｂ’　）ｔの形成を伴わない若干 のＩｇＧの損失が起こることを示している。

表３．ｐＨ３，５に調整し１８８時間温置た調整培地（未調整好中球を添加した 培地）を用いない精製ＭＹ９０４に対する温室温度とＦ（ａｂ’　）２の収率と の間の作用 ｍｇ／ｍｌ　ｍｇ／ｍｌ 温置温度温室　ＭＹ９０４　［ｇＧＩ　ＭＹ９０４　Ｆ（ａｂ’　）を表３の結 果は温度の上昇に伴いＭＹ９０４抗体濃度が緩徐に減少することを示すが、試験 試料のいずれにも対応するＦ（ａｂ’　）ｓフラグメントの増加か認められない 。これらの結果は抗体のＦ（ａｂ’　）ｚフラグメントへの消化がプロテアーゼ であるかまたはプロテアーゼのように作用する物質てあって、さらに抗体生産中 にハイブリドーマ細胞により副生されまたはハイブリドーマ細胞から生じるいく つかの物質に依存することを示している。

モノクローナル抗体の単離および精製はこの物質の損失を招いた。従って、単離 および精製後には、クエン酸を添加した場合の免疫グロブリンのｐ’　（ａｂ’ 　）２フラグメントへの消化は発生せず、この理由は消化物質（ｄｉｇｅｓｔｉ ｎｇｓｕｂｓｔａｎｃｅ）または助触媒（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が失われているか らである。

モノクローナル抗体ＭＹ９０４を用いる実験中に、著しく過剰なタンパク質分解 酵素であると考えられるものが少なくともいくつかのロフトのハイブリドーマ調 整培地中に存在することが見出された。過剰の内因性免疫グロブリン中でモノク ローナル抗体を転化するのに十分なタンパク質分解酵素が存在するかどうかを決 定するために、培地のｐＨをクエン酸で３．５に調整した後３ｍｇ／ｍｌのＭＹ ９０４モノクローナル抗体を含む調整培地（最初の培地）の試料を追加の２０ｍ ｇまての精製ＭＹ９０４抗体で強化した。強化した試料を３７°Ｃで３時間温置 しアッセイした。結果を表４に示すがこれは調整した培地が、追加の、精製した 免疫グロブリンを消化するのに十分な”プロテアーゼ“を含むことを示した。

表４．精製したＭＹ９０４モノクローナル抗体を調整Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−８Ｐ 細胞培養培地中ｐＨ３，５，３７°Ｃで３時間温置する場合の過剰なＦ（ａｂ’ 　）！形成活性 残留プロテアーゼ活性がダイアフィルトレージョン後にＦ（ａｂ’　）２生成物 中に残っているか否かを決定するため、５つの（５）ＭＹ９０４　Ｆ（ａｂ’　 ）ｚ最終生成物のバルク濃縮物を精製したＭＹ９０４免疫グロブリンで強化した 。強化した生成物のアリコートをそのまま（ｐＨ７，２）試験するかまたはｐＨ ３，５に調整し、２５°Ｃで１８８時間温置た。次いて残留１ｇＧ１免疫グロブ リンの量を高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により決定した。ｐ　（ａ ｂ’　）２の濃度に変化は認められなかった。表５の結果はｐＨを３．５に調整 する場合、２９６またはそれ未満の最初の免疫グロブリンの転化活性がＦ（ａｂ ’　）、の最終生成物に残ることを示す。Ｆ（ａｂ’）ｉの生成物には免疫電気 泳動、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ）　（還元するか還元せずに）、あるいはオフタロニー免疫沈降のような方 法により検出し得る汚染物質は観察された残留酵素活性以外に存在しない。

表５．５０ットの精製したＭＹ９０４　Ｆ（ａｂ’　）２生成物０中のタンパク 質分解活性の消耗 ハイブリドーマ調整培地に存在するタンパク質分解活性の特徴付け。

タンパク質分解酵素をそれらの活性を阻害する際に効果的なおよび効果的でない 阻害剤により分類し確認することができる。

見出される４つの通常の種類のプロテアーゼは＝（１）セリン活性部位、（２） チオール活性部位：（３）金属要求活性部位プロテアーゼ；および（４）ペプシ ンまたはリゾソームカテプシンに関連する酸プロテアーゼである。一般に、トリ プシンおよびキモトリプシンのようなセリン活性部位エステラーゼ（プロテアー ゼを含む）はフェニルメチルスルホニルフルオリド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ）（ＰＭＳＦ）およびジイソプロピルフル オリルリン酸（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｆｌｕｏｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅＸＤ ＦＰ）または大豆からのペプチドトリプシン阻害剤のような活性部位アルキル化 化合物により阻害される。チオールプロテアーゼは水銀剤（チメロサール）およ びＰＭＳＦに感受性のあるシスティン活性部位を有する。メタロプロテアーゼは エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属配位化合物により阻害される 。ペプシンおよびカテプシンーＤのような酸プロテアーゼだけが一般に特異的な ペプチド阻害剤、ペプスタチンＡにより阻害される。免疫グロブリンのＦ（ａｂ ’　）２および／またはＦａｂ’フラグメントへの転化の原因であるハイブリド ーマ調整培地中のプロテアーゼの種類を決定するために、ＭＹ９０４調整培地か らのＦ（ａｂ’）２の製造を監視した。この実験において、試験すべきそれぞれ の阻害剤をＭＹ９０４（３ｍｇ／ｍｌ）調整培地のアリコートに添加した。調整 培地のｐＨをクエン酸で３．５に調整し調整培地を２５°Ｃて１８時間温温室た 。阻害剤を含まない調整培地のアリコートをｐＨ３，５に調整しＭＹ９０４免疫 グロブリンのそのＦ（ａｂ’　）２フラグメントへの転化速度のための対照とし て用いた。転化はＦ（ａｂ’）ｚまたはＭＹ９０４免疫グロブリンのピーク高さ を測定するクロマトグラフィによる分析により決定した。調整培地のアリコート を、いかなる種類の処理も行わずに出発ＭＹ９０４　＋！１度のための対照とし て用いた。この実験の結果を［ｇＧのＦ　（ａｂ’　）２への転化の原因である プロテアーゼの特異性を決定するために表６に示す。

表６．免疫グロブリンのＦ（ａｂ’　）２への転化に及ぼすプロテアーゼ阻害剤 の作用 表７は精製免疫グロブリンを強化したＮｕｔｒｉｄｏｍａ培地（ハイブリドーマ で調整していない）に精製したプロテアーゼ、カテプシンＤを添加した実験の結 果を示す。その他の点で、表７の実験は、カテプシンＤを添加した以外、ハイブ リドーマ調整培地を試験した表６のものと同様である。

表７に示した結果はカテプシンＤかマウス免疫グロブリンをＦ（ａｂ’　）２に 消化することができることを示す。しかし、カテプシンＤか免疫グロブリンの消 化の原因であるハイブリドーマ調整培地中のプロテアーゼである場合、カテプシ ンＤの基質の加水分解を阻害するパターンか表６で観察される免疫グロブリンの Ｆ（ａｂ’　）２への転化を阻害するパターンと同一であると考えられる。表６ および７の阻害剤のパターンか性質上類似するため、カテプシンＤがハイブリド ーマ調整培地中で免疫グロブリンをＦ　（ａｂ’　）２に転化することができる と結論付けることができる。調整培地に存在する他の物質は消化の効率に影響を 及ぼしあるいは重要な活性化剤である場合がある。

表７．　ＭＹ９０４免疫グロブリンのカテプシンＤによるＦ（ａｂ’）２への転 化におけるプロテアーゼ阻害剤の作用表８は広範なスペクトラムのプロテアーゼ 基質Ｓ−２２８８（スウェーデン国、ストックホルム所在のカビビトラム（Ｋａ ｂｉＶｉ　ｔｒｕｍ）のＨ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロピル−アルギニル−ｐ −ニトロアニリドジハイドロクロライド〕の加水分解が阻害されるパターンを示 す。基質Ｓ−２２８８上のカテプシンＤの活性阻害のパターンは表７で観察され る阻害のパターンとは全く異なる。表８の調整培地は、クエン酸添加前に、７． ４より高いｐＨを有する。示された結果はカテプシンＤＯ３−２２８８基質がｐ Ｈ７，４でｐＨ３，５より速く（１，０２対０．５）分解する。これはマウス免 疫グロブリンＧのフラグメントへの転化の速度が中性のｐＨより酸性のｐＨ（ｐ ）ｌ　４．５またはそれ未満）で著しく速いという以前の観察に反する。この予 期しない違いは作用を受けるＳ−２２８８基質が免疫グロブリンをＦ（ａｂ’　 ）ｔフラグメントに分解する有効な原理を決定する可能性を妨げない。ｐＨを４ ．５またはそれ未満に低下させる重要な作用によりｐＨ７，４でタンパク質分解 消化に著しい低抗性かある免疫グロブリンの配列にプロテアーゼか接近できるよ うにする免疫グロブリンの構造または配座の変化を起こすことかできる。通常、 免疫グロブリンは消化に対し極めて抵抗性かあり、この理由のいくらかは、分子 か反応性部位を切断試薬による攻撃から保護するように折り畳むからである。

表８の結果はＤＦＰがＳ−２２８８の分解を阻害するのに効果的である唯一のプ ロテアーゼ阻害剤であることを示した。表７はペプスタチン、アジドおよびチメ ロサールが免疫グロブリンのＦ（ａｂ’　）２への転化を有意に阻害する唯一の 種類であることを示す。さらに１つの観察結果はＳ−２２８８により測定された 酵素活性がｐＨ３，５および３７°Ｃで温室する間に速やかに低下することであ る。３時間後、プロテアーゼ活性の低下はＳ−２２８８を分解するプロテアーゼ 活性かほとんど残留しないように完全となる。これはＦ（ａｂ’）ｚ生成物中に プロテアーゼ活性かわずかにしか残らずタンパク質量解か低いｐＨではプロテア ーゼの自己消化により本質的に制約があることを示す。［ｇＧの転化活性（Ｆ　 （ａｂ’　）２への〕は中性のｐＨて数年間安定であることか本発明者により見 出された。

表８．３−２２８８プロテアーゼ基質を切断する調整培地の能力に及はすプロテ アーゼ阻害剤の作用 図１はジエチルアミノエチルセルロースカラム（ＤＥＡＥ）を用いる高速液体ク ロマ１〜グラフイ（ＨＰＬＣ）を使用してＭＹ９０４調整培地から２つの明瞭な プロテアーゼ活性を解明する。クロマトグラフィの前に、ＭＹ９０４免疫グロブ リンを除去するためにＭＹ９０４調整培地をプロティンＡセファロースで処理し た。プロティンＡカラム溶出液をプールし塩としてＹＭ−３０膜上で１０倍に濃 縮した。

緩衝剤を０．０１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７，２に交換した。濃縮した調整培地 は、免疫グロブリンを除き、プロティンバック５ＰＷＤＥＡＥ　ＨＰＬＣカラム （米国、メイン州、ミルフォード所在のウォーターズ　コーポレーション）にか けた。０．ＯＩＭのリン酸カリウム溶液を２８０ナノメータの吸光度かベースラ インに到達するまてカラムを展開するのに用いた。次いてカラムをリン酸カリウ ド、ｐＨ７，２の０．１Ｍ〜０．５Ｍの直線濃度勾配を用いて展開した。リン酸 カリウム溶液をカラム上に圧送しカラム溶出液の両分を、ＭＹ９０４免疫グロブ リンをＦ（ａｂ’　）２に転化する能力についてアッセイを行い、さらにそれら のＳ−２２８８切断活性についてＭＹ９０４１ｇＧで強化しｐＨ３，５に酸性化 した後に、アッセイを行った。

図１に示すように、結果は有意なプロテアーゼ活性を有した試料が濃度勾配を開 始する前または０．２５Ｍのリン酸カリウムを用いる溶出後のいずれにも溶出し なかったことを示す。溶出したＳ−２２８８活性のピーク（セリンプロテアーゼ を示す）は観察されたＦ（ａｂ’　）２活性に転化する免疫グロブリンの２つの 主要なピーク（ＡおよびＢ）から有意にシフトした。免疫グロブリン転化活性を 示す２つのピーク（ＡおよびＢ）をさらにプロテアーゼ阻害剤に対するそれらの 感受性に関して特徴付けた。ピークＡはペプスタチンにより阻害されるが、ジイ ソブロピルフルオリルホスフエートによっては阻害されないことが見出された（ カテプシンＤまたはペプシンのような酸性プロテアーゼに類似する）。ピークＢ はジイソブロピルフルオリルホスフエートにより阻害されるか、ペプスタチンに よっては阻害されないことが見出された（セリンまたはチオールプロテアーゼに 類似する）。これらの結果は免疫グロブリンを酸性のｐＨでＦ（ａｂ’　）２フ ラグメントに転化することができるハイブリドーマ調整培地に少なくとも２つの 明瞭な活性化剤か存在することを明らかに示している。

表９は７つの連続したフラグメント調製物からのＭＹ９０４　Ｆ（ａｂ’　）２ フラグメントの収量を示す。出発材料はＭＹ９０４マウスＩｇＧ調整培地であっ た。それぞれの調製物中の抗体の出発量をＭＹ９０４モノクローナル抗体に対し て特異的なラジオイムノアッセイにより決定した。ＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　 ）２の理論収率は質量を基にした出発ＭＹ９０４モノクローナル抗体の６６．７ ％であると計算された（（１００，０００ダルトン）／（１５０，０００ダルト ン）＝　０．６６７　）　、収率はＬｏｗｒｙタンパク質で測定したＭＹ９０４ 　Ｆ（ａｂ’　）２のミリグラム（ｍｇ）で示す実際の収量をミリグラムで示す 理論収量で割って計算した。７つの連続した製造試験にわたるＭＹ９０４　Ｆ（ ａｂ’　）２の平均収率は理論的収率の９５９６であった。

表９．７つの連続した試料調製物からのＭＹ９０４調整培地でのＭＹ９０４　Ｆ 　（ａｂ’　）２の収量平均収量　９５％ 表１０は、ＭＹ９０４調整培地出発材料および表９に記載した７つの連続した試 料調製物のための精製したＭＹ９０４　Ｆ（ａｂ’　）ｚ最終生成物について、 リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ　Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ　Ｌｙｓａｔｅ）アッセイによ り評価した、エンドトキシンの濃度を示す。出発材料の総エンドトキシン含有量 を５つの調製物３〜７で決定した。これらの５つの調製物の４つ（３，４，６お よび７）において、出発材料から最終生成物までの総エンドトキシン単位に減少 が認められた。７つの調製物のすべてにおいて、生成物Ｆ（ａｂ’）２はＦ（ａ ｂ’　）２のミリグラム当たり２．５未満のエンドトキシン単位を有した。従っ て、時間当たりに２　ｍｇ／ｋｇ体重のＦ（ａｂ’）２ドーズ、またはもっと高 いドーズを、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）ガイドラインの下にヒトに注入するこ とができる。ＦＤＡガイドラインは５工ンドトキシン単位／ｋｇ体重／時間で許 容し得るエンドトキシンレベルを設定している。

表１０．　ＭＹ９０４調製出発材料および表９の試料調製物の精製ＭＹ９０４　 Ｆ　（ａｂ’　）ａ中のエンドトキシンの濃度図２〜５はＭＹ９０４モノクロー ナル抗体およびＭＹ９０４モノクローナル抗体から誘導したＦ（ａｂ’　）２フ ラグメントを用いて種々の試験をした結果を図示する。

図２は上述のように調製したＭＹ９０４　Ｆ（ａｂｌ　）ｘフラグメントの２次 元免疫電気泳動の結果を示す。１５μｇのＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）ｔを０ ．０７３ＭのＴｒｉｓ　（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）〕、０．０ ２４　Ｍ　（７）バルビツール、ｐＨ８，６ノ緩衝液を用いた１％Ｗ／Ｖ（７） アガロースを含む第１次元（Ａ）で試験した。次いでゲルの第２次元（Ｂ）を０ ．０７３ＭのＴｒｉｓ、０．０２４Ｍのバルビツール、ｐＨ８，６の１％Ｖ／Ｖ のヤギ抗マウス全血清（Ｃａｐｐｅｌ）を含む緩衝液を有する１９６Ｗ／Ｖのア ガロースを用いてキャスト（ｃａｓｔ）した。次いでプレートを９０°回転し次 元Ｂで電気泳動した。次いでゲルを洗浄しクーマシープルーＲ−２５０で染色し た。特異的抗マウス［ｇＧ血清対照と比較した電気泳動の移動度に基づきマウス Ｆ（ａｂ’）２と同一の唯一の沈降素弧形（ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ　ａｒｃ）は 沈降素弧形（１）であった。この分析の結論は試験したＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ ’　）２のロットがマウスＦ（ａｂ’　）ｘを含むに過ぎず検出可能なマウスタ ンパク質を含まないことである。

図３はＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）２のＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム〕 ポリアクリルアミドチューブゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）から得た結果を 示す。還元しまたは還元しないＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）ｔのＩＯマイクロ グラム（μｇ）試料をＳＤＳを含むポリアクリルアミドチューブゲル中で電気泳 動した。非還元分離ゲル（ｌおよび３）は５９６アクリルアミドおよび０．１３ ％ビスアクリルアミド（Ｂｉｓ）を含み：還元したものの（２−メルカプトエタ ノールによる）ゲル（２および４）は１０％アクリルアミドおよび０．２６％Ｂ ｉｓを含んでいた。分離ゲルは０．１％ＳＤＳを有す、最終濃度０．３７５のＴ ｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，８の緩衝液を含んでいた。スタッキングゲルは０゜ １２５　ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ６，８の０．１％ＳＤＳを有する、緩衝 液を含む３．５％アクリルアミドおよび０．０９％Ｂｉｓであった。電極緩衝液 は２％ＳＤＳ　、　２０％グリセロールおよび０．００５％ブロモフェノールブ ルー（還元した試料ゲルのために５９６２−メルカプトエタノールを添加した） を有する０、０５　Ｍ　Ｔｒｉｓおよび０．３８４Ｍグリシン、ｐＨ６，８を含 んでいた。染色はクー′マシーブルー　Ｒ−２５０を用いて実施した。

ゲル＃ｌは５％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動した１０μｇの非還元ＭＹ ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）２である。単一バンドがゲル＃３中の標準タンパク質 の移動度に対する分子量からの内挿法により９７．５００ダルトン〔マウスＩｇ Ｇ　Ｆ　（ａｂ’　）２に類似〕と評価された分子量を有することが観察された 。

ゲル＃２は１０９６アクリルアミドゲルを用いて電気泳動した１０８ｇの還元Ｍ Ｙ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）２である。１つのバンドが２５．５００ダルトン（ マウスＩｇＧのＬ鎖およびＦｃを除去した後のマウス１ｇＧのＨ鎖のフラグメン トに類似）と評価された分子量を有する（若干の残像を有し）ことが観察された 。このピークの分子量をゲル＃４の標準タンパク質の移動度に対する分子量から の内挿法により評価した。

ゲル＃３は分子量標準である：ミオシン（２００，０００ダルトン）、β−ガラ クトシダーゼ（１１６，０００ダルトン）、ホスホリラーゼＢ　（９２，５００ ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６６、０００ダルトン）および卵アルブミン （４３，０００ダルトン）を還元せずに５％アクリルアミドゲルで電気泳動した 。

ゲル＃４は分子量標準である：β−ガラクトシダーゼ（１１６゜０００ダルトン ）、ホスホリラーゼＢ　（９２，５００ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６６ 、０００ダルトン）、卵アルブミン（４３，０００ダルトン）、カルボニックア ンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）およびトリプシン阻害剤（２０，１００ ダルトン）を還元して１０％アクリルアミドゲルで電気泳動した。

図３のデータの分析はＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）２が、非還元条件の下に、 ９７．５００ダルトンの分子量を有することを示した。これは約１００、０００ ダルトンのマウス［ｇＧ　Ｆ（ａｂ’　）２の分子量と矛盾しない。還元条件の 下にＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）ｚを分析することはこれが２５、５００ダル トンのジスルフィド結合したサブユニットを含むことを示した。これは約２５． ０００ダルトンの４つのサブユニットから成るタンパク質と矛盾せず２つのＬ鎖 および２つの半分のＨ鎖を有し、それぞれが約２５．０００ダルトンであるマウ ス［ｇＧＦ（ａｂ’　）、に類似している。同様の非還元条件下のＭＹ９０４１ ｇＧの分析は１４４．０００ダルトンの分子量評価を与える。還元条件の下、Ｍ Ｙ９０４１ｇＧは５４．８００ダルトン（マウス［ｇＧ　Ｈ鎖に類似）および２ ４、１００ダルトン（マウスｒｇｃ　Ｌ鎖に類似）で表われる２つのバンドを示 す。

図４はＭＹ９０４調製培地から製造された３つのロットのＦ（ａｂ’　）を生成 物およびＭＹ９０４１ｇＧの１つのロットを免疫電気泳動を用いて示す。ウェル １はＭＹ９０４モノクローナル抗体を含む。ウェル２および５には、参照のため に、ロットＣフラグメントと称するＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）２フラグメン トが含まれる。ウェル３および６には同様にロットＣフラグメントと称するＭＹ ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）２フラグメントが含まれる。最後に、ウェル４および ７にはロットＣフラグメントと称するＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）２が含まれ る。（ぼみＡおよびＣにはマウスＩｇＧのＦｃ領域に特異的なりギ抗マウス［ｇ Ｇ血清が含まれる。くぼみＢおよびＤにはマウスＩｇＧのＦ（ａｂ’　）２領域 に特異的なりギ抗マウスＩｇＧ血清が含まれる。くほみＥおよびＦにはマウス［ ｇＧのＨおよびＬ鎖の両方に反応するヤギ抗マウス■ｇＧ血清が含まれる。

ＭＹ９０４およびＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）２試料を図４に示した方向に陽 極および陰極を用いたゲル中で電気泳動した。電気泳動後、ヤギ抗マウス血清を 示したようにくぼみに添加した。沈降素反応を行った。沈降素ラインを明らかに するためにクーマシーブルーを用いてゲルを染色する前に非沈降素（ｎｏｎ−ｐ ｒｅｃｉｐｉｔｉｎ）タンパク質をゲルの外に拡散させた。所定の試料ウェルに おいて、隣接する抗血清から離れていく沈降素弧形は抗血清による試料の認識を 示している。

マウスＩｇＧのＦｃ領域に特異的なりギ抗マウス［ｇＧ血清を用いた、ウェルｌ に対する結果はＭＹ９０４１ｇＧ中にＰｃが存在することを示す。これはポジテ ィブな対照である。試料ウェル２．３および４はマウスＩｇＧのＦｃ領域に特異 的なりギ抗マウス［ｇＧ血清を含むくぼみＡおよびＣとの沈降素弧形を示さない 。これはこれらの試料にＦｃが存在しないことを示している。これはＦｃを除去 したＦ　（ａｂ’　）２の構造と矛盾しない。試料２．３および４はくぼみＢお よびＤとの沈降素弧形を示し、これによりＦ（ａｂ’）２構造か存在することか 示される。試料ウェル５．６および７はマウス［ｇＧのＨ鎖およびＬ鎖の両方と 反応するヤギ抗マウス［ｇＧ血清との沈降素弧形を示す。この反応はＦ　（ａｂ ’　）２構造が存在することを確認している。

図５は３つの異なるヤギ抗血清、１つの抗血清をそれぞれのオフタロニープレー トに用いたＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）ｚのオフタロニー試験の結果を示す。

これらの試験において、ＭＹ９０４１ｇＧをそれぞれの３つのオフタロニープレ ートの上部ウェル、ウェルＩに負荷した。ＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）２の５ つの異なる試料、ロットＡ′〜Ｅ′をそれぞれのプレートの中央の抗血清ウェル を取り巻く他の５つのウェルにピペットで分注した。特異的な抗血清をプレート の中央のウェルにピペットで分注し沈降素ラインを形成するように拡散させた。

非沈降素タンパク質をプレート外に洗浄除去しプレートをクーマシーブルーを用 いてタンパク質について染色した。それぞれのプレートのウェル２から時計回り の順に、ウェルは：ウエル２−ロットＡ′、ウェル３−ロットＢ′ウェル４−ロ ットＣ′、ウェル５−ロットＤ′およびウェル６−ロットＥ′を含む。

プレート１の中央のウェルをヤギ抗マウスＩｇＧ　（ＬおよびＨ鎖の両方と反応 する無傷の［ｇＧ　）で満たした。プレート１のオフタロニー反応の結果は試料 がマウスＩｇＧを含むことを示す沈降素ラインをすべての６つの試料が形成する ことであった。ウェル１の試料（ＭＹ９０４１ｇＧ）からの沈降素ラインは２つ の隣接する試料（ＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂ’　）！を含む２および６〕と同一性 が不完全であることを示した。これはＭＹ９０４　Ｆ　（ａｂｌ　）２試料中に 含まれないＦｃフラグメントを有するＭＹ９０４と矛盾しない。ウェル２〜６中 のすべての５つのＦ（ａｂ’　）２試料は相互に同一性が完全てありそれらが同 一の構造でないとしても、極めて類似していることを示す。

プレート２の中央のウェルをマウス［ｇＧからのＦ（ａｂ’）ｚに特異的なりギ 抗マウスＩｇＧで満たした。結果はすべての６つの試料が相互に完全に一致して 反応することを示す。これはそれぞれの試料がマウス［ｇＧのＦ（ａｂ’　）２ 構造を含むことを示す。

ＭＹ９０４１ｇＧはＦ（ａｂ’）ｔフラグメントと同様に反応する。Ｆｃフラグ メントがＭＹ９０４　［ｇＧ中に存在するが、Ｆｃフラグメントに対する抗血清 力価が存在しないからである。その結果、不完全な一致を示す弧形は生じない。

プレート３の中央のウェルをマウス［ｇＧのＦｃ領域に特異的なりギ抗マウス１ ｇＧで満たした。抗血清との沈降素反応を示したウェルｌ−６中の唯一の試料は ウェルｌ中のＭＹ９０４　［ｇＧであった。これはマウスＩｇＧ　Ｆｃがウェル ｌの無傷のＭＹ９０４１ｇＧに存在するにすぎずウェル２〜６のＭＹ９０４　Ｆ 　（ａｂ’　）２の試料に存在しないことを示す。これらの結果はここに記載し た消化および精製方法かＭＹ９０４１ｇＧを切断しＭＹ９０４　［ｇＧからＦｃ を除去する事実と矛盾せずその証明となる。消化および精製方法を実施したと仮 定すれば、ウェルｌだけか沈降素反応を示すと考えられる。

Ｆｉｇ、　３ １／１５＋０５１０ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０６　 ８２１４−４Ｂ２１１０８　８２１４−４Ｂ （７２）発明者　スマリガ　ポーレット　エリザベスアメリカ合衆国　フロリダ 州　３３１８１　ノース　マイアミ　エヌイー　ワンハンドレッドトウニンティ ーサード　ストリートＩ （７２）発明者　オコーネル　ニドワードアメリカ合衆国　フロリダ州　３３１ ５５　マイアミ　ニスダブリニー　７７　コート

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．抗体Ｆ（ａｂ′）２およびＦａｂ′フラグメントを製造するに当り、 （ａ）血清をほとんど含有せず、免疫グロブリンのハイブリドーマ培養によって 調整された培地中に存在する免疫グロブリンタンパク質を酸性消化し、 （ｂ）該酸性消化が実質的に完了した後に生成した酸性消化培地を中和し； （ｃ）Ｆ（ａｂ′）２フラグメント、および工程（ｂ）の後の追加の還元的化学 的切断工程によって前記Ｆ（ａｂ′）２から生成したＦａｂ′フラグメントを単 擁する ことを特徴とする抗体Ｆ（ａｂ′）２およびＦａｂ′フラグメントの製造方法。
2. ２．酸性にするための酸としてクエン酸を使用することを特徴とする請求項１記 載の方法。
3. ３．酸性消化をｐＨ２．０〜５．０で行うことを特徴とする請求項１記載の方法 。
4. ４．酸性消化をｐＨ約３．５で行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
5. ５．調整培地の血清含有量が５％未満であることを特徴とする請求項１記載の方 法。
6. ６．調整培地が血清をほとんど含有していないことを特徴とする請求項１記載の 方法。
7. ７．免疫グロブリンをヒト、マウス、ウサギ、ヤギおよびラットの免疫グロブリ ンからなる群から選定することを特徴とする請求項１記載の方法。
8. ８．ヒト免疫グロブリンを組織培養においてヒトーマウス・トリハイブリドーマ または形質転換Ｂ細胞によって生成することを特徴とする請求項７記載の方法。
9. ９．免疫グロブリンとしてＧクラスのマウス免疫グロブリンを使用することを特 徴とする請求項１記載の方法。
10. １０．５％未満の血清を含有し、免疫グロブリンのハイブリドーマ培養によって 調整された組織培養の培地中に存在するクラスＧのマウス免疫グロブリンタンパ ク質からＦ（ａｂ′）２およびＦａｂ′フラグメントを製造するに当り、前記調 整培地のｐＨをクエン酸の添加により２．０〜５．０に調整し； 生成したクエン酸および免疫グロブリンを含有する培地を約２０℃〜約４０℃の 範囲の温度で温置して前記フラグメントを生成する ことを特徴とするＦ（ａｂ′）２およびＦａｂ′フラグメントの製造方法。
11. １１．ｐＨを約３．５とすることを特徴とする請求項１０記載の方法。
12. １２．温度を約２５℃とすることを特徴とする請求項１０記載の方法。
13. １３．免疫グロブリンタンパク質としてモノクローナル抗体を使用することを特 徴とする請求項１０記載の方法。
14. １４．血清をほとんど含有せず、クラスＧのマウス免疫グロブリンタンパク質の ハイブリドーマ培養によって調整された組織培養の培地において、クラスＧのマ ウス免疫グロブリンタンパク質からＦ（ａｂ′）２およびＦａｂ′フラグメント を製造するに当り、 （ａ）培養されたハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ培地を分離し； （ｂ）適当量のクエン酸を添加することにより、工程（ａ）のハイブリドーマ細 胞を含有していない培地のｐＨを、約３．０〜約４．５の範囲のｐＨまで低下さ せ； （ｃ）工程（ｂ）の酸性にした培地を、免疫グロブリンタンパク質のほとんどす べてがＦ（ａｂ′）２および／またはＦａｂ′フラグメントに転化するのに十分 な時間の間約２５℃の温度で温置し； （ｄ）塩基を添加して培地のｐＨを約６〜約８の範囲のｐＨまで上昇させること により、工程（ｃ）の温置を終了させ；（ｅ）公称カットオフ分子量約３０，０ ００グルトンの膜を使用してダイヤフィルトレーションを行って低分子量のもの を除去すると供に工程（ｃ）の溶液の塩および緩衝剤を５ｍＭリン酸カリウム、 ｐＨ約７．５に変えることにより、工程（ｄ）の培地を精製し； （ｆ）所要に応じて、工程（ｅ）の溶液をクロマトグラフィによってその免疫グ ロブリン含有量を減少させ、モノクローナル抗体Ｆ（ａｂ′）２または工程（ｄ ）の後の追加の還元的化学的切断工程によって前記Ｆ（ａｂ）２から生成したモ ノクローナル抗体Ｆａｂ′フラグメントの薬として有用な溶液を得ることを特徴 とするＦ（ａｂ′）２およびＦａｂ′フラグメントの製造方法。
15. １５．温置時間を３〜２４時間の範囲とし、温置時間をｐＨおよび温度と逆比例 させることを特徴とする請求項１４記載の方法。
16. １６．血清は５％未満であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
17. １７．培地は本質的に血清を含有していないことを特徴とする請求項１４記載の 方法。
18. １８．血清をほとんど含有せず、ハイブリドーマ培養によって調整され、免疫グ ロブリンタンパク質を含有する組織培養の培地を２．０〜５．０の範囲のｐＨま で酸性にし；この酸性にした培地を温置して前記免疫グロブリンをモノクローナ ル抗体Ｆ（ａｂ′）２に転化し：該抗体Ｆ（ａｂ′）２を含有する消化培地を６ 〜８の範囲のｐＨに調整し； モノクローナル抗体Ｆａｂ′が所望の最終生成物である場合には化学的還元によ って前記抗体Ｆ（ａｂ′）２フラグメントを切断し：前記ｐＨを調整した培地を 精製して前記抗体Ｆ（ａｂ′）２またはＦａｂ′フラグメントの溶液を得る方法 によって製造されたモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ′）２およびＦａｂ′フラグメ ント。
19. １９．ヒト、マウス、ラット、ヤギおよびウサギの免疫グロブリンからなる群か ら選定した免疫グロブリンから得たモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ′）２およびＦ ａｂ′フラグメントであることを特徴とする請求項１８記載のＦ（ａｂ′）２ま たはＦａｂ′フラグメント。
20. ２０．組織培養においてヒトマウス・トリハイブリーマまたは形質転換Ｂ細胞に よって生成したヒト免疫グロブリンから得たモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ′）２ またはＦａｂ′フラグメントであることを特徴とする請求項１９記載のＦ（ａｂ ′）２またはＦａｂ′フラグメント。
21. ２１．ｐＨ３．５まで酸性にした調整培地において免疫グロブリンを温置するこ とによって精製したモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ′）２またはＦａｂ′フラグメ ントであることを特徴とする請求項１８記載のＦ（ａｂ′）２またはＦａｂ′フ ラグメント。
22. ２２．免疫グロブリンを含有し、ハイブリドーマで調整された培地からＦ（ａｂ ′）２およびＦａｂ′フラグメントを製造するに当り、前記免疫グロブリンを含 有する培地のｐＨを、前記調整培地中に存在する物質が前記免疫グロブリンを前 記フラグメントに転化させるｐＨまで下げるのに十分な程の前記免疫グロブリン の構造および配座を変える酸によって、前記免疫グロブリンを含有する培地を処 理することを特徴とするＦ（ａｂ′）２およびＦａｂ′フラグメントの製造方法 。
23. ２３．酸としてクエン酸を使用することを特徴とする請求項２２記載の方法。
24. ２４．Ｆ（ａｂ′）２またはＦａｂ′フラグメントヘの転化がほぼ完結した後に 、前記フラグメントをダイアフィルトレーションによって精製することを特徴と する請求項２２記載の方法。