WO2002068464A2 - Fusionsprotein zum blocken des hiv nef-proteins - Google Patents

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WO2002068464A2
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Matthias Geyer
Oliver Fackler
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    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)

Definitions

  • This invention relates to a novel fusion protein for blocking the HIV-Nef protein.
  • the invention further relates to nucleic acid sequences which encode this fusion protein or a biologically active part thereof, their complementary sequence, and an expression vector which contains such a nucleic acid sequence.
  • the present invention comprises a host cell transformed with such a vector and a method for producing an essentially pure fusion protein for blocking the HIV-Nef protein.
  • the present invention relates to therapeutic compositions which comprise the aforementioned fusion proteins or nucleic acid sequences in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, and to their use in the in vitro diagnosis / in vivo therapy of the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • HIV-1 Human Immunodeficiency Virus Type 1
  • Southeast Asia and the southern half of the African continent are particularly affected, where, according to the prevailing opinion, the virus has spread from monkeys to humans and then spread worldwide.
  • a problem with HIV infection is that it is rarely noticed by the patient. This is because the symptoms associated with the initial infection are more pronounced of a mild cold and are not associated with HIV. This phase is followed by a break of up to 10 years without symptoms, during which the virus is constantly increasing but is kept in check by the human immune system and can only be detected directly using the most sensitive methods. It leaves clearer traces
  • HIV was identified as the causative agent of AIDS almost 20 years ago, it has so far not been possible to cure HIV patients or develop an effective vaccine despite intensive research worldwide. Among other things, this is due to a lack of understanding of the basic mechanisms of disease development and the reactions of the immune system. While the loss of CD4 T helper cells as the cause of this
  • Nef protein of HIV A interesting example of functional interaction between virus and host cell is the Nef protein of HIV. Nef has no enzymatic activity and performs its functions exclusively through interactions with proteins of the host cell, but is nevertheless a key factor in the pathogenesis of HIV.
  • Nef is an abbreviation for "negative factor ', a name given to the viral protein incorrectly after initial studies in cell culture (in vi tro) in which the loss of the nex" -Genes no or even a positive impact on the replication of Had HIV.
  • the Nef protein is a myristoylated "additional protein" (accessory protein) of 27-35 kDa, which can only be found in the primate lentiviruses HIV-1, HIV-2 and SIV. Early experiments in Rhesus macaques with SIV that contained large deletions in the Nef gene showed that Nef was used for
  • Nef protein maintains optimal viral replication is essential for the course of AIDS and that a strong selection pressure maintains functional intact Nef variants in the infected host. This The role of Nef as a key factor in lentiviral pathogenesis has subsequently been confirmed for HIV-1 in humans (Deacon et al., 1995, Kirchhoff et al. 1995). Although the importance of Nef for the viral life cycle became apparent through this work, its function at the molecular level is controversial (Cullen, 1998). A total of three functions have been assigned to the Nef protein:
  • Nef increases viral infectivity at a stage after the virus has entered the cell (Aiken and Trono, 1995; Schwartz et al. 1995).
  • the Nef protein By interacting with components of the endocytosis mechanism, the Nef protein reduces the expression of CD4 and of antigens of the major histocompatibility complex class I (Major Histocompatibility Complex Class I, MHC I) on the surface of infected cells (Garcia and Miller 1991 ; Aiken et al. 1994; Schwartz et al. 1996).
  • MHC I Major Histocompatibility Complex Class I
  • Nef protein has a two-domain structure consisting of an N-terminal membrane anchoring region and a well-folded C-terminal core domain (Freund et al. 1994). Based on this observation, the structure of Nef for the core domain was determined by NMR spectroscopy (Grzesiek et al.
  • HIV-1 / -2 and SIV-Nef protein is expressed early when the cell is infected with HIV.
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • So-called long-term survivors who suffer from the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and who are infected with HIV for more than 12 years but do not develop an AIDS disease have extensive deletions in the HIV-Nef protein (Kirchhoff et al., 1995) , The importance of the Nef protein for the HIV virus became clear. Blocking the HIV-Nef protein is therefore a promising route in the treatment of the acquired immunodeficiency syndrome.
  • nucleic acid sequence that binds to the HIV-Nef protein in a highly specific manner and thereby blocks it.
  • the present invention is based on the observation that when comparing the structure and function of numerous sequences of the Nef protein from different HIV patients with a typical course of the disease (ie no long-term survivors), three sequential motifs occur which lie on the surface of the Nef protein and in all Sequences are highly conserved.
  • sequence motifs also "sequence signals”
  • sequence signals are mostly highly conserved in evolution and can be found in proteins of different species.
  • sequence signals are particularly important in mediating the interactions of proteins with one another.
  • the best preserved and functionally relevant amino acids are usually eponymous for the respective motif.
  • P proline
  • x any amino acid
  • LL Di - Leucine signal
  • the two highly conserved leucines are located in the center of the 33 amino acid long C-terminal loop and are thus easily accessible for interaction.
  • myristoylation signal is not very specific and occurs in a variety of eukaryotic proteins (which would result in a high frequency of undesirable effects if this signal were attacked), the
  • the Nef protein is the only cytosolic and non-transmembrane protein known to have a functional di-leucine motif.
  • This ligand consists of a novel fusion protein that contains both the LL binding domain and a PxxP binding domain, which are linked via a short connection sequence (polypeptide linker).
  • This hybrid molecule has a high binding affinity for the HIV-Nef protein.
  • the fusion protein disclosed herein is highly specific, making it an effective therapeutic agent for treating the acquired immune deficiency syndrome (AIDS) in humans with comparatively little or no undesirable effects is provided for the patient.
  • AIDS acquired immune deficiency syndrome
  • the invention is not limited to use in humans alone.
  • the fusion protein according to the invention can be used, for example, in any mammal which is infected with an HIV virus or an HIV-like virus (and which has a Nef homologue).
  • the fusion protein according to the invention is made up of the following components: (a) a protein domain that binds a di-leucine (LL) motif,
  • the protein domain that binds a di-leucine motif is through the amino acid sequence of Seq. ID. No. 1 or homologs (HEAT or Armadillo (ARM) repeat structures) or fragments thereof that retain LL-binding activity.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO. 1 corresponds to AS 171-518 of the ⁇ 1-adaptin protein. However, it has been found that the homologous sequence of amino acids 171-518 of the ⁇ 2-adaptin protein shows a similarly good LL binding activity. Similarly, the subunit H of the vacuolar (H + ) -ATPase (V1H) can also be used as an LL-binding domain (see also Fig. 2).
  • HEAT repeat structure 9 to 12 (AS 183-330 from SEQ ID NO. 1 or AS 352-499 in the ⁇ 1-adaptin protein) can be used as the minimal di-leucine-binding domain.
  • the PxxP motif-binding protein domain is characterized by an SH3 domain with that in Seq. ID. No. 2 defined amino acid sequence was formed.
  • the amino acid sequence of a complete fusion protein according to of the present invention is by Seq. ID. No. 3 defined.
  • the fusion protein according to the present invention can additionally contain a signal for membrane anchoring.
  • This signal is intended to increase the specificity and effectiveness of the fusion protein and to direct it to the membrane to which the HIV-Nef protein is also anchored.
  • this signal is a C-terminal farnesylation signal, the sequence of which is shown by Seq. ID. No. 4 is defined.
  • palmitoylation or myristoylation signals are also conceivable.
  • the fusion protein according to the invention is additionally equipped with a signal for degradation on the proteasome, where the protein complex consisting of the fusion protein and HIV-Nef is broken down.
  • This signal preferably consists of an ubiquitinylation signal, which is determined by Seq. ID. No. 5 is defined.
  • the present invention further includes
  • Fusion protein that contains the amino acid sequence of Seq. ID. No. 6 or homologs or fragments thereof that retain biological activity.
  • the present invention additionally relates to nucleic acid sequences for coding a fusion protein for blocking the HIV-Nef protein.
  • These nucleic acid sequences basically consist of three components, namely 1. a nucleic acid sequence encoding a protein domain that binds a di-leucine (LL) motif,
  • nucleic acid sequence encoding a protein domain that binds a PxxP motif
  • Encoded polypeptide linker through which the two domains (a) and (b) are connected.
  • changes in the nucleic acid sequence are considered which result in the generation of an equivalent amino acid at a predetermined location.
  • amino acid substitutions are the result of the replacement of one amino acid by another amino acid with similar structural ones and / or chemical properties, ie conservative amino acid replacements.
  • Amino acid substitutions can be made based on the similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or the amphipathic (amphiphilic) nature of the residues involved.
  • nonpolar (hydrophobic) amino acids are alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine.
  • Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, thyrosine, asparagine and glutamine.
  • Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine.
  • negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • “Insertions” or “deletions” typically range from one to five amino acids. The permitted degree of variation can be determined experimentally by systematically making insertions, deletions or substitutions of amino acids in a polypeptide molecule using DNA recombination techniques and by examining the resulting recombinant variants with regard to their biological activity.
  • Cysteines can result in undesired formation of multimers when the proteins are produced recombinantly, which leads to the purification and crystallization Procedures become complicated.
  • Each of the proposed modifications moves within the basic technical and scientific knowledge, as does the determination of the maintenance of the biological activity of the coded products.
  • DNA sequence is used either in the description or in the claims, it includes all such modifications and variations that result in the production of a biologically equivalent fusion protein for blocking HIV-Nef.
  • Biologically active here means that the modifications encode a fusion protein which retains its original function, i.e. which is able to block the HIV-Nef protein.
  • nucleic acids are, for example, those nucleic acids which have one or more substitutions, insertions and / or deletions in comparison with the corresponding sequence of SEQ ID NO. 7-10, the derivative being attached to the corresponding nucleic acid of SEQ ID NO. Under moderately stringent or stringent conditions. 7-10 binds.
  • derivatives are to be understood in particular as those nucleic acids in which at least 1, but also 2, 3, 4 or more nucleotides at one or both ends of the
  • nucleic acids or also inside the nucleic acids are missing or have been replaced by other nucleotides.
  • the nucleic acids of the present invention thus also comprise nucleic acids which have sequences which essentially correspond to the nucleic acids of SEQ ID NO. 7-10 are equivalent.
  • Nucleic acids according to the invention can, for example, at least approximately 80%, typically at least approximately 90% or 95% sequence identity to the nucleic acids of SEQ ID NO. 7-10. However, this always under the condition that the modifications fulfill the biological function of the fusion protein as defined above. The invention continues to see
  • the invention also includes derivatives which hybridize with the nucleic acids according to the invention under moderately stringent or stringent conditions.
  • Stringent hybridization and washing conditions are generally understood to mean the reaction conditions under which only duplex molecules are formed between oligonucleotides and desired target molecules (perfect hybrids) or only the desired target organism is detected.
  • Stringent hybridization conditions are understood to mean, in particular, 0.2 ⁇ SSC (0.03 M NaCl, 0.003 M sodium citrate, pH 7) at 65 ° C.
  • the hybridization temperature is below 65 ° C., for example above 55 ° C., preferably above 60 ° C., but in each case below 65 ° C.
  • Stringent hybridization temperatures depend on the size or length of the nucleic acid and its nucleotide compositions and are to be determined by a person skilled in the art by manual tests. Moderately stringent Conditions are reached, for example, at 42 ° C and washing in 0.2 x SSC / 0.1% SDS at 42 ° C.
  • the respective temperature conditions can differ depending on the chosen test conditions and depending on the nucleic acid sample to be examined and must then be adapted accordingly.
  • the invention also encompasses variants which include a
  • nucleic acid exchange for the nucleic acids of SEQ ID NO. 7-10 the exchange encoding an identical or functionally equivalent protein due to the degeneracy of the genetic code.
  • the present invention further relates to a vector, e.g. an expression vector which contains one of the aforementioned nucleic acid sequences.
  • vectors suitable for use in transforming bacterial cells are known, for example plasmids and bacteriophages such as phage ⁇ can be used as the most commonly used vectors for bacterial hosts.
  • viral vectors can be used in both mammalian and insect cells to express an exogenous DNA fragment.
  • Exemplary vectors are the SV40 or Polyo a virus.
  • the host cells can be transformed directly by "naked DNA" without using a vector.
  • the fusion protein according to the invention can be produced either in eukaryotic cells or prokaryotic cells.
  • suitable eukaryotic cells include mammalian cells, plant cells, yeast cells and insect cells.
  • suitable prokaryotic hosts include E. coli and Bacillus subtilis.
  • the invention further relates to a method for producing a substantially pure fusion protein for blocking the HIV-Nef protein, which comprises transforming a host cell with a vector, cultivating the host cell under conditions which allow expression of the sequence by the host cell and isolating of the fusion protein from the host cell.
  • compositions comprising an effective amount of a fusion protein as disclosed herein in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a composition can also be formed by an effective amount of a nucleic acid sequence.
  • compositions are suitable for in vivo therapy of the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • Nef inhibitor fusion protein for blocking Nef
  • multiple direct applications for therapeutic, diagnostic and research purposes are possible.
  • a first aspect of the in vivo use of the fusion protein according to the invention lies in the therapeutic treatment of an existing HIV infection.
  • HAART highly active anti-retroviral therapy
  • the Nef inhibitor is preferably provided in a soluble, cell-permeable form and administered orally.
  • the Nef inhibitor is preferably used in a composition in which it is present in a therapeutically effective amount.
  • An effective or therapeutically effective dose refers to an amount such that the symptoms are alleviated or the survival time of an AIDS patient is prolonged.
  • the toxicity and the therapeutic performance of the compounds according to the invention can be determined by standard pharmaceutical methods in cell cultures or animal experiments, for example to determine the LD 50 (the lethal dose for 50% of the population) and the ED 50 (the dose which is in 50% of the population is therapeutically effective).
  • the dose ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index and can be expressed as a ratio between LD 50 and ED 50.
  • Compounds that show high therapeutic indices are preferred. From Data obtained from cell culture assays and animal studies can be used in formulating a range of dosages for use in humans.
  • the dosage of the compounds according to the invention is preferably within a range of the circulating
  • Concentrations that include an ED 50 with little or no toxicity may vary within a range depending on the dosage form used and the route of administration.
  • the exact preparation, the route of administration and the dosage can be individually selected by the doctor with regard to the patient's condition. See, for example, FINGL et al, 1995 in "The pharmacological basis of therapeutics *, chapter 1, page 1.
  • the dosage amount and the dosage interval can be adjusted individually to provide plasma levels of the active component sufficient to maintain an HIV-Nef blocking effect to obtain.
  • the amount of the compound that is administered will depend on the patient being treated, its weight, the severity of the disease, the route of administration and the judgment of the prescriber.
  • prophylactic treatment is provided according to a further aspect of the invention.
  • This consists of a gene therapy approach in which the Nef inhibitor is preventive via a viral or non-viral vector system is introduced and thus intracellularly inhibits the activity of the Nef protein in the event of infection with HIV.
  • the fusion protein / nucleic acid according to the invention is preferably used in the form of a pharmaceutical composition in which they are mixed with suitable carriers or carriers in doses in such a way that the disease is treated or the disease state is improved.
  • a composition can contain (in addition to the protein / nucleic acid and carrier) diluents, fillers, salts, buffers, stabilizers, solubilizers and other materials that are well known in the art.
  • pharmaceutically acceptable means a non-toxic material that does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient (s).
  • the properties of the vehicle depend on the route of administration.
  • the pharmaceutical composition can also contain other agents which increase the activity of the fusion protein / nucleic acid or complement their activity or use in the treatment. Such additional factors and / or agents can be included in the pharmaceutical composition in order to achieve a synergistic effect or in order to
  • a therapeutically effective dose also refers to an amount of the compound sufficient to improve to achieve the symptoms, for example treatment, healing, prevention or improvement of such conditions.
  • Administration of the fusion protein / nucleic acid of the present invention used in the pharmaceutical composition for practicing the method of the present invention can be accomplished in a variety of different ways, such as by oral ingestion, inhalation, topical administration, or cutaneous, subcutaneous , intraperitoneal, parenteral or intravenous injection. Intravenous and oral administration to a patient is preferred.
  • a typical intravenous infusion composition can be prepared to contain 250 ml of sterile Ringer's solution and an appropriate amount
  • compositions for in vitro or in vivo diagnosis of the acquired
  • fusion proteins / nucleic acid sequences with a suitable detection reagent, by means of which the presence of the HIV Nef protein can be detected in a test kit.
  • the conjugation of the Nef inhibitor with a fluorescent dye results in clinical and research-related applications of the invention.
  • the labeled inhibitor molecule can be used for the identification and subcellular localization of the Nef protein in infected cells of clinical samples and in the research laboratory in FACS- or immunohistological tests (HIV-Nef is a good marker because it is expressed in large quantities early in the infection and there are no antibodies that recognize Nef well in FACS or immunofluorescence).
  • the fluorescence-labeled version of the inhibitor will ideally be created from the cell-permeable version, but also works without intrinsic cell entry, since the cells can be permeabilized for these tests in the laboratory.
  • Fig. 1 shows the structure-function relationship of the highly conserved motifs for myristoylation (MGxxxS), SH3-domain binding (PxxP) and di-leucine-binding domain binding (LL) in HIV-Nef.
  • Fig. 2 shows the binding of the di-leucine-binding domain from ⁇ 1- and ⁇ 2-adaptin and V1H to the di-leucine motif in HIV-1 Nef in vitro in the yeast two-hybrid system and in the GST pull-down experiment.
  • Fig. 3 shows the modular domain structure of the ß2-adaptin protein consisting of 14 HEAT repeats and the V1H protein consisting of 8 HEAT repeats.
  • Fig. 4 the identification of the HEAT repeat structure 9 to 12 (amino acid 352 to 499 in ßl-adaptin) as a minimal di-leucine-binding domain in the yeast two-hybrid system.
  • Fig. 5 Immunofluorescence images of NIH-3T3 cells inhibiting a functional di-leucine motif from CD3 ⁇ receptors by the expression of the di-leucine-binding domain from ß1- and ß2-adaptin and V1H in vivo.
  • Fig. 6 is a schematic representation of the modular domain arrangement in a fusion protein for blocking the HIV Nef protein.
  • Fig. 7 that the fusion protein consisting of an LL domain and an SH3 domain binds specifically to the HIV Nef protein.
  • FIG. 1 A) shows the three-dimensional protein structure of HIV-1 Nef with the labeled highly conserved motifs for protein interaction, which illustrates the exposure of the binding sites.
  • the sequence motif MGxxxS at the N-terminus of Nef initiates the co-translational myristoylation of the protein and thus that
  • the polyproline helix leads to the recognition of SH3 domains while the structurally opposite di-leucine motif (LL motif, or: ExxxLL) interacts with the di-leucine binding domain.
  • the representation of the full-length protein structure of Nef is based on the composition of the structures of the anchor domain (amino acids 1-57; Geyer et al., 1999) and the core domain (amino acids 57-206; Grzesiek et al., 1996), which by means of Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy have been determined and energy-minimized with subsequent molecular dynamics.
  • NMR Nuclear magnetic resonance
  • the degree of sequence conservation was determined from an alignment of 186 individual Nef amino acid sequences from different HIV-1 subtypes.
  • the surface accessibility of the individual amino acids, divided into main and side chain, was calculated using the Nef protein structure shown in A).
  • FIG. 2 A) shows the identification of the di-leucine-binding domain by binding the homologous fragments from ß-adaptins (bl- and b2-adaptin) and the subunit H of the vacuolar (H + ) -ATPase (V1H) the di-leucine motif in HIV-Nef.
  • the binding affinity was quantified by a ⁇ -galactosidase assay using yeast two-hybrid techniques. Approximately 10 colonies per culture were cultivated from three independent transformations of the plasmids in Y187 yeast cells (Clontech, CA) in liquid medium and the color change by ß-galactosidase was quantified with CPRG and ONPG reagents.
  • the specificity of the Fragments identified for the di-leucine motif are shown by the loss of binding by the double mutation L164 and L165 to alanine in Nef (LLAA).
  • the binding between the di-leucine binding domain from ß-adaptins or V1H and Nef was confirmed in Fig. 2 B) by a further experiment.
  • the wild-type Nef protein from the allele SF2 and the double mutant Nef (LLAA) were expressed as fusion proteins with glutathione-S-transferase (GST) in Escherichia coli and purified using GST-Sepharose beads.
  • GST glutathione-S-transferase
  • the di-leucine binding domain from V1H, ßl and ß2 were transcribed in vi tro and translated with the TnT T7 coupled reticulocyte lysate system (Promega, Wisconsin) in the presence of [ 35 S] -labeled cysteine.
  • the binding reaction between GST-Nef and di-leucine-binding domain translated in vitro was carried out in 10 mM CHAPS buffer and 50 raM NaCl at pH 7.4 and 4 ° C.
  • the GST beads were then washed three times in the buffer, the proteins were separated by 10% SDS-PAGE gel electrophoresis and visualized by autoradiography.
  • the binding experiment shows that the three homologous fragments from V1H, ß1-adaptin and ß2-adaptin bind weakly but specifically to the HIV-1 Nef protein
  • Fig. 3 shows the sequential domain architecture of ß2-Adaptin and V1H.
  • the so-called N-terminal trunk domain of the ⁇ -adaptins (amino acid 1-592) consists of 14 helical HEAT or Armadillo (ARM) repeats, which form a repetitive, modular structure.
  • the conserved amino acids which are typical for the tertiary structure folding and form the framework of the HEAT repeats, as well as the helical secondary structural elements of the HEAT repeats are shown above the sequence.
  • the minimal di-leucine binding domain that is formed by HEAT repeats 9 to 12 is highlighted by a box (see also Fig. 4).
  • Fig. 3 B shows the HEAT or Armadillo repeat structure of the human subunit H of the vacuolar (H +) - ATPase.
  • the 8 modular repeats are interrupted by an additional segment (amino acid 350-379), which increases the flexibility between the helical modules.
  • the two segments in V1H that bind to the di-leucine motif in Nef are highlighted by boxes.
  • Fig. 4 the minimal di-leucine binding domain is identified, which consists of a sequence of four HEAT repeats.
  • the modular domain organization of the ß-adaptine is shown as an example for ßl-adaptin above. 6 different fragments, each with four HEAT repeats, were cloned so that they overlap by two HEAT repeats. The quantification of the binding affinity of these fragments to Nef was determined using the yeast 2-hybrid ⁇ -galactosidase liquid assay as described in FIG. 2A. The result of this binding study is that the recognition site for the di-leucine motif in the four C- terminal HEAT repeats 9 to 12 (amino acids 352-499) is present. This sequence thus forms the minimal di-leucine-binding domain.
  • Fig. 5 shows the effect of the expression of the di-leucine binding domain on the localization of a di-leucine internalization motif in vivo.
  • a reporter construct consisting of the membrane-bound interleukin-2 receptor (IL2R) and the cytoplasmic di-leucine motif (LL) from CD3 ⁇ was cloned and transfected into NIH-3T3 cells. This molecule was visualized by immunofluorescence with the PE-conjugated anti-CD25 antibody.
  • Fig. A shows that the wild-type construct (IL2R-LL) is highly dependent on the cellular endocytosis machinery
  • FIG. 6 shows the LL-binding domain (LL domain), which comprises approximately 350 amino acids, which via a polypeptide linker of variable length (10 to 60 amino acids) with a 61 amino acid PxxP-binding domain (SH3 domain) is connected.
  • LL domain LL-binding domain
  • SH3 domain 61 amino acid PxxP-binding domain
  • the resulting fusion protein specifically targets the two highest conservation motifs (LL and PxxP) in Nef, which come from a very different cellular context.
  • Fig. 2 shows a sketch of a fusion protein with the reverse arrangement of the protein domains.
  • C) The fusion protein for blocking the HIV Nef protein can be further specified and optimized by introducing two additional sequential motifs. On
  • Farnesylation motif at the C-terminus for membrane anchoring ensures the localization of the fusion protein in the vicinity of the membrane-bound Nef protein.
  • a signal for ubiquitinylation can direct the complex from the fusion protein with Nef to degrade at the proteasome of the cell.
  • the arrangement of the domains, linkers and additional motifs must be optimized for the greatest affinity, specificity and functionality for blocking the HIV Nef protein.
  • Fig. 7 Two different Nef proteins from the two most commonly used HIV-1 strains NL4-3 and SF2 in the laboratory were used for the binding experiments.
  • the two Nef proteins were expressed as fusion proteins with glutathione-S-transferase (GST) in Echerichia Coli and purified using GST-Sepharose beads.
  • GST glutathione-S-transferase
  • the fusion protein consisting of the LL domain of the ß subunit of the adapter-protein complex AP-1 (ß-1) and the PxxP-binding SH3 domain of the tyrosine kinase Hck (SH3-Hck) was with two different lengths of
  • Linker cloned (see Figure 2).
  • the use of the two linkers of 60 amino acids in length and 106 amino acids in length leads to the two variants of the fusion protein LL-SH3 (470) and LL-SH3 (516) with a running behavior of 48 kDa and 56 kDa, respectively.
  • the chimera consists of AC: AAA40807 (ßl), AS171-578 (LL domain and linker) or AS 171-624, -Threonin- (for the restriction interface) and AC: P08631, AS 78-138 (Hck - SH3).
  • the fusion proteins were transcribed in vitro and translated with the TnT T7 coupled reticulocyte lysate system (Promega, Wisconsin) in the presence of [ 35 S] -labeled cysteine.
  • the binding assay between GST-Nef and in translated translational fusion protein was carried out in standard kinase extraction buffer (KEB) (250 mM NaCL, 0.5% NP40, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 1 mg / ml proteinase inhibitor cocktail). About 4 ⁇ l of the GST-Nef protein were slowly shaken with 7 ⁇ l of the fusion protein over 3 hours at 4 ° C. in 500 ⁇ l KEB. The GST beads were then washed three times in KEB, the proteins by 10% SDS-PAGE Gel electrophoresis separated and visualized by autoradiography.
  • KEB standard kinase extraction buffer
  • the binding experiment shows that the two fusion proteins of different lengths specifically bind to the HIV-1 Nef protein of the alleles NL4-3 and SF2 (lanes 2, 3 and 5, 6) while no binding between GST alone and the fusion proteins can be detected (lane 1, 4).
  • the high affinity of the binding is evident from the representation of 10% of the input of the fusion proteins (lane 7,
  • Kestler, H.W. Ringler, D.. , Mori, K., Panicali, D.L., Sehgal, P.K., Daniel, M.D. and Desrosiers, R. C. (1991) Importance of the nef gene for maintenance of high viral loads and for development of AIDS. Cell, 65, 651-662.
  • HIV-1 Nef leads to Inhibition or activation of T cells depending on its intracellular localization. I muni ty, 1, 373-384.
  • Nef stimulates human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA synthesis. J. Virol. , 69, 5048-5056.
  • Nef induces CD4 endocytosis: requirement for a critical dileucine motif in the membrane-proximal CD4 cytoplasmic domain.

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Abstract

Diese Erfindung betrifft ein neuartiges Fusionsprotein zum Blocken des HIV-Nef-Proteins. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuresequenzen, die dieses Fusionsprotein oder einen biologisch aktiven Teil hiervon kodieren, deren Komplementärsequenz, sowie einen Expressions-Vektor, der eine derartige Nukleinsäuresequenz enthält. Darüber hinaus umfaßt die vorliegende Erfindung eine mit einem derartigen Vektor transformierte Wirtszelle sowie ein Verfahren zur Erzeugung eines im wesentlichen reinen Fusionsproteins zum Blocken des HIV-Nef-Proteins. Zuletzt betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die die vorgenannten Fusionsproteine oder Nukleinsäuresequenzen in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen, sowie deren Verwendung bei der in vitro-Diagnose / in vivo-Therapie des erworbenen Immunmangelsyndroms (Aids).

Description

Fusionsprotein zum Blocken des HIV-Nef-Proteins
Diese Erfindung betrifft ein neuartiges Fusionsprotein zum Blocken des HIV-Nef-Proteins. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsauresequenzen, die dieses Fusionsprotein oder einen biologisch aktiven Teil hiervon kodieren, deren Komplementärsequenz, sowie einen Expressions-Vektor, der eine derartige Nukleinsäuresequenz enthält. Darüber hinaus umfaßt die vorliegende Erfindung eine mit einem derartigen Vektor transformierte Wirtszelle sowie ein Verfahren zur Erzeugung eines im wesentlichen reinen Fusionsproteins zum Blocken des HIV-Nef-Proteins. Zuletzt betrifft die vorliegende Erfindung therapeutische Zusammensetzungen, die die vorgenannten Fusionsproteine oder Nukleins uresequenzen in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen, sowie deren Verwendung bei der in vitro-Diagnose / in vivo-Therapie des erworbenen Immunmangelsyndroms (Aids) .
1981 wurden erstmals Patienten mit Symptomen beschrieben, die später unter dem Krankheitsbild der erworbenen
Immunschwäche (Acquired I munodeficiency Syndrome, AIDS) zusammengefasst wurden. Schon zwei Jahre später, Ende 1983, wurde ein Virus als Verursacher dieser Krankheit identifiziert, das heute als Humanes Immundefizienz Virus Typ 1 (HIV-1) bekannt ist. Nach Schätzungen der WHO sind bislang weltweit 24,8 Mio. Menschen der Infektion mit HIV-1 oder dem verwandten HIV-2 Virus zum Opfer gefallen, ca. 40 Mio. Menschen leben mit einer HIV Infektion, davon 2,7 Mio. Kinder unter 15 Jahren, und jährlich infizieren sich ca. 5 Mio. Menschen neu mit dem tödlichen Virus (Stand Dezember 2001) . Besonders betroffen sind dabei Südost-Asien sowie die südliche Hälfte des afrikanischen Kontinentes, wo sich das Virus nach der heute vorherrschenden Meinung vom Affen auf den Menschen übertragen und dann weltweit verbreitet hat. Diese Ausbreitung hält bis heute an und ist vor allem auf ungeschützte Sexualkontakte sowie auf den gemeinsamen Gebrauch von Injektionsnadeln bei Drogenkonsumenten zurückzuführen. In Deutschland ist die Situation mit geschätzten 60.000 HIV Infizierten zwar weniger dramatisch, stellt aber dennoch ein ernsthaftes Gesundheitsproblem dar.
Eine Tücke der Infektion mit HIV besteht darin, dass sie in den seltensten Fällen vom Patienten bemerkt wird. Dies liegt daran, dass die Symptome, die mit der initialen Infektion einhergehen, eher an eine leichte Erkältung erinnern und nicht mit HIV in Verbindung gebracht werden. Auf diese Phase folgt eine bis zu 10 Jahre lange Ruhepause ohne Beschwerden, in der das Virus sich zwar ständig vermehrt aber vom menschlichen Immunsystem in Schach gehalten wird und nur mit sensitivsten Methoden direkt nachweisbar ist. Deutlichere Spuren hinterlässt die
Infektion hingegen im Immunsystem, dessen Aktivität durch Antikörper im Blut des Patienten widergespiegelt wird, die gegen das Virus gerichtet sind. Mit der Zeit nimmt die Menge an CD4 T-Helferzellen, den Hauptzielzellen des Virus, langsam ab, bis das Immunsystem schließlich nicht mehr in der Lage ist, eine für einen Gesunden harmlose Infektion durch andere Krankheitserreger (sog. Opportunisten) zu kontrollieren. Das Auftreten dieser Sekundärinfektionen definiert den Ausbruch der Krankheit AIDS, die durch das Auftreten immer neuer opportunistischer Infektionen, den Verlust an T-Helferzellen und die zunehmende Schwächung des Patienten gekennzeichnet ist und in der Regel tödlich verläuft .
Obwohl HIV vor nahezu 20 Jahren als Erreger von AIDS identifiziert wurde, ist es trotz weltweiter intensiver Forschung bisher nicht gelungen, HIV Patienten zu heilen oder einen wirkungsvollen Impfstoff zu entwickeln. Dies ist unter anderem auf das mangelnde Verständnis der grundlegenden Mechanismen der Krankheitsentstehung und der Reaktionen des Immunsystems zurückzuführen. Während der Verlust der CD4 T-Helferzellen als Ursache für das
Auftreten von AIDS unumstritten ist, bleibt die Frage nach dem Mechanismus, über den HIV die Depletion dieses Zelltyps auslöst, weitgehend unklar. Sowohl das Absterben infizierter als auch nicht infizierter Zellen als Antwort auf die HIV Infektion wird diskutiert. Ähnlich ungeklärt bleibt, warum die durchaus vorhandene Immunantwort der Patienten nicht ausreicht, um die Infektion zu kontrollieren und über welchen Weg man Immunität, d.h. den immunologischen Schutz vor der HIV Infektion, herstellen kann. Bevor diese äußerst komplexen Sachverhalte eindeutig geklärt werden können, ist es unumgänglich, den Vermehrungszyklus von HIV auf molekularer Ebene besser zu verstehen.
Ein faszinierendes Beispiel funktioneller Interaktion zwischen Virus und Wirtszelle ist das Nef Protein von HIV. Nef besitzt keine enzy atische Aktivität und übt seine Funktionen ausschließlich über Wechselwirkungen mit Proteinen der Wirtszelle aus, ist aber dennoch ein Schlüsselfaktor für die Pathogenese von HIV.
Nef ist eine Abkürzung für „negative factor' , ein Name, der dem viralen Protein fälschlicherweise nach anfänglichen Untersuchungen in Zellkultur ( in vi tro) gegeben wurde, in denen der Verlust des nex"-Genes keinen oder sogar einen positiven Einfluss auf die Replikation von HIV hatte.
Das Nef-Protein ist ein myristoyliertes "zusätzliches Protein" (Accessory Protein) von 27-35 kDa, das nur bei den Primaten-Lentiviren HIV-1, HIV-2 und SIV anzutreffen ist. Frühe Experimente bei Rhesus-Makaken mit SIV, das große Deletionen im Nef-Gen enthielt, zeigten, daß Nef zur
Aufrechterhaltung einer optimalen viralen Replikation und für den Kranheitsverlauf von Aids essentiell ist, und daß ein starker Selektionsdruck funktioneil intakte Nef- Varianten im infizierten Wirt aufrechterhält (Kestler et al. 1991, Sawai et al . 1996, Khan et al . , 1998). Diese Rolle von Nef als ein Schlüsselfaktor für die lentivirale Pathogenese wurde nachfolgend für HIV-1 beim Menschen bestätigt (Deacon et al., 1995, Kirchhoff et al . 1995). Obwohl die Wichtigkeit von Nef für den viralen Lebenszyklus durch diese Arbeiten erkennbar wurde, ist dessen Funktion auf der molekularen Ebene umstritten (Cullen, 1998) . Dem Nef-Protein wurden insgesamt drei Funktionen zugeordnet:
1. verändert das Nef-Protein durch Interaktion mit Tyrosin- und Serin/Threonin-Kinasen die zellulären Signalwege (Baur et al. 1994, Iafrate et al . 1997, Hanna et al . 1998).
2. erhöht Nef die virale Infektivität in einem Stadium nach dem Eintritt des Virus in die Zelle (Aiken und Trono, 1995; Schwartz et al . 1995) .
3. verringert das Nef-Protein durch Interaktion mit Bestandteilen des Endozytose-Mechanismus die Expression von CD4 und von Antigenen der Haupthistokompatibilitäts- komplex-Klasse I (Major Histocompatibility Complex Class I, MHC I) auf der Oberfläche von infizierten Zellen (Garcia und Miller 1991; Aiken et al . 1994; Schwartz et al . 1996).
Unter Vorgabe der hohen Polymorphismen zwischen unterschiedlichen Nef-Allelen (Delassus et al . 1991) legt die Konservierung dieser genetisch getrennten Funktionen eine wichtige Rolle jeder individuellen Funktion im viralen Lebenszyklus nahe. In welcher Weise diese Funktionen zur Bedeutung des Nef-Proteins im infizierten Wirt beitragen ist jedoch größtenteils unbekannt und bleibt Gegenstand weiterer Forschungsarbeit. Proteolytische Experimente zeigten, daß das Nef-Protein eine Zwei-Domänen-Struktur aufweist, die aus einer N- terminalen Membran-Verankerungsregion und einer gut gefalteten C-terminalen Kern-Domäne (core domain) besteht (Freund et al . 1994). Auf Grundlage dieser Beobachtung wurde die Struktur von Nef für die Kern-Domäne durch NMR- Spektroskopie bestimmt (Grzesiek et al . 1996) und wurde ebenfalls durch Röntgen-Kristallographie bestimmt, jeweils in Komplex mit der SH3-Domäne der Fyn-Tyrosin-Kinase (Lee et al . , 1996; Arold et al . , 1997) als auch alleine (Arold et al., 1997). Die Strukturen stimmen jeweils gut miteinander überein, es fehlt ihnen jedoch eine flexible Schleife (flexible loop) am C-Terminus, die sich von Rest 159 bis 173 erstreckt. Kürzlich wurde auch die N-terminale Membranverankerungs-Domänen-struktur in ihrer myristoylierten und nichtmyristoylierten Form aufgeklärt, und zeigte eine flexible Polypeptid-Kette mit zwei helikalen Strukturelementen (Geyer et al . , 1999). Diese beiden Protein-Fragmente machen es nun möglich, Einsicht in das Nef-Protein voller Länge zu gewinnen und die vorgeschlagenen Funktionen des Nef-Proteins mit seinen strukturellen Merkmalen in Einklang zu bringen (Geyer et al., 2001) .
Das HIV-1/-2- und SIV-Nef-Protein wird frühzeitig bei einer Infektion der Zelle mit HIV exprimiert. 1995 wurde entdeckt, daß sogenannte Langzeitüberlebende, die unter dem erworbenen Immunmangelsyndrom (Aids) leiden und mehr als 12 Jahre mit HIV infiziert sind aber kein Aids-Erkrankungsbild entwickeln, weitreichende Deletionen im HIV-Nef-Protein besitzen (Kirchhoff et al . , 1995). Die Bedeutung des Nef- Proteins für das HIV-Virus wurde damit deutlich. Ein Blockieren des HIV-Nef-Proteins stellt also einen vielversprechenden Weg in der Behandlung des erworbenen Immunmangelsyndroms dar. Jedoch existiert derzeit in der HIV-Therapie kein dementsprechender Therapieansatz, der gegen das HIV-Nef-Protein gerichtet ist.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Protein bereitzustellen, das zum Blocken des HIV-Nef-Proteins geeignet ist. Diese Aufgabe wird durch die in den unabhängigen Patentansprüchen angegebenen Merkmale gelöst. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den abhängigen Patentansprüchen angegeben.
Es ist in der vorliegenden Erfindung gelungen, ein Fusionsprotein bzw. die dieses Protein kodierende
Nukleinsäuresequenz bereitzustellen, das hochspezifisch an das HIV-Nef-Protein bindet und dieses dadurch blockiert.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Beobachtung zugrunde, daß bei einem Struktur-Funktionsvergleich zahlreicher Sequenzen des Nef-Proteins von unterschiedlichen HIV- Patienten mit typischem Krankheitsverlauf (d.h. keine Langzeitüberlebenden) drei sequentielle Motive auftreten, die auf der Oberfläche des Nef-Proteins liegen und in allen Sequenzen hochkonserviert sind.
Die Funktionsweise von Proteinen wird oftmals durch spezifisch aufeinanderfolgende Aminosäuren reguliert. Diese sog. Sequenzmotive (auch "sequence Signals") sind in der Evolution meist hochkonserviert und lassen sich in Proteinen unterschiedlichster Spezies finden. Von besonderer Bedeutung sind solche Motive in der Vermittlung der Interaktionen von Proteinen untereinander. Die am besten konservierten und funktioneil relevanten Aminosäuren sind dabei in der Regel namensgebend für das jeweilige Motiv.
Dem Schlüssel-Schloß Prinzip folgend haben sich im Laufe der Evolution eine Vielzahl von Motiven entwickelt, die die Bindung ähnlicher Partner miteinander vermitteln. Für regulatorische Proteine ohne eigene enzymatische Aktivität kann man also vereinfacht sagen, dass ihre Funktion der Summe ihrer biologisch aktiven Motive entspricht.
Diese Motive sind im Falle des HIV-Nef-Proteins erstens ein N-terminales Myristoylierungssignal, das die
Membranverankerung (und damit die Lokalisation) des Nef- Proteins sicherstellt, zweitens eine PxxP-Protein-Sequenz (P = Prolin, x = jede beliebige Aminosäure), die SH3- Domänen bindet und damit typischerweise eine Funktion in der Signaltransduktion wahrnimmt und drittens ein Di- Leucin-Signal (LL) , ein Motiv, das typischerweise den intrazellulären Proteinverkehr "Trafficking" steuert. Die beiden hoch konservierten Leuzine liegen im Zentrum der 33 Aminosäure langen C-terminalen Schleife und sind so exponiert für Interaktionen leicht zugänglich.
Während das Myristoylierungssignal wenig spezifisch ist und in einer Vielzahl eukaryotischer Proteine vorkommt (wodurch bei einem Angriff an diesem Signal eine große Häufigkeit von unerwünschten Wirkungen zu erwarten wäre) , ist die
Kombination eines PxxP-Bindungsmotives und eines Di-Leucin- Bindungsmotives (LL) , wie sie im HIV-Nef-Protein vorkommen, einzigartig und hochspezifisch. Tatsächlich ist das Nef- Protein das einzige zytosolische und nichttransmembrane Protein, von dem bekannt ist, daß es ein funktionelles Di- Leucin-Motiv besitzt.
Mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein gelang es nunmehr, aus dieser einzigartigen Kombination zweier hochkonservierter Aminosäuresequenz-Motive im Nef-Protein Nutzen zu ziehen und einen hochspezifischen Liganden zu konstruieren. Dieser Ligand besteht aus einem neuartigen Fusionsprotein, das sowohl die LL-Bindungsdomäne als auch eine PxxP-Bindungsdomäne enthält, die über eine kurze Verbindungssequenz (Polypeptid-Linker) verbunden sind. Dieses Hybridmolekül besitzt eine hohe Bindungsaffinität zum HIV-Nef-Protein.
Da das Nef-Protein- kein bekanntes humanes Homolog besitzt (im Unterschied beispielsweise zur HlV-Protease) , ist das hierin offenbarte Fusionsprotein hochspezifisch, so daß ein wirkungsvolles Therapeutikum zur Behandlung des erworbenen Immunmangelsyndroms (Aids) beim Menschen bei vergleichsweise geringen oder keinen unerwünschten Wirkungen für den Patienten bereitgestellt wird. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Anwendung beim Menschen alleine beschränkt. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann beispielsweise bei jedem Säugetier eingesetzt werden, das mit einem HIV-Virus oder einem HIV-ähnlichen Virus infiziert ist (und das ein Nef-Homolog aufweist) .
Grundsätzlich ist das erfindungsgemäße Fusionsprotein aus folgenden Komponenten aufgebaut: (a) einer Proteindomäne, die ein Di-Leucin (LL) - Motiv bindet,
(b) einer Proteindomäne, die ein PxxP - Motiv bindet, und (c) einem Polypeptidlinker, durch den die beiden Domänen (a) und (b) verbunden sind.
Gemäß einer Ausführungs form der Erfindung ist die Proteindomäne, die ein Di-Leucin-Motiv bindet durch die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 1 oder Homologe (HEAT oder Armadillo (ARM) Repeat Strukturen) oder Fragmente hiervon, die eine LL-Bindungs-Aktivität beibehalten, definiert .
Die erfindungsgemäße Aminosauresequenz von SEQ ID NO. 1 entspricht den AS 171-518 des ßl-Adaptin Proteins. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass die homologe Sequenz der Aminosäuren 171-518 des ß2-Adaptin-Proteins eine ähnlich gute LL-Bindungsaktivität zeigt. Desgleichen kann auch die Untereinheit H der vakuolaren (H+) -ATPase (V1H) als LL- bindende Domäne eingesetzt werden (siehe auch Abb. 2) .
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass als minimale Di-Leuzin bindende Domäne die HEAT repeat Struktur 9 bis 12 (AS 183-330 von SEQ ID NO.l bzw. AS 352-499 im ßl- Adaptin-Protein) eingesetzt werden kann.
Gemäß einer weiteren Aus führungs form ist die PxxP-Motiv- bindende Proteindomäne durch eine SH3-Domäne mit der in der Seq. ID. Nr. 2 definierten Aminosäuresequenz gebildet. Die Aminosäuresequenz eines vollständigen Fusionsproteins gemäß der vorliegenden Erfindung ist durch Seq. ID. Nr. 3 definiert .
Vorzugsweise kann das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung zusätzlich ein Signal zur Membranverankerung enthalten. Dieses Signal soll Spezifität und Wirksamkeit des Fusionsproteins erhöhen und es zielgerichtet an die Membran lenken, an der auch das HIV-Nef-Protein verankert ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesem Signal um ein C-terminales Farnesylierungssignal, dessen Sequenz durch Seq. ID. Nr. 4 definiert ist. Weiterhin sind jedoch auch Palmitoylierungs- oder Myristoylierungs-signale denkbar.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Fusionsprotein zusätzlich mit einem Signal zur Degradation am Proteasom ausgestattet, wo der Proteinkomplex, bestehend aus dem Fusionsprotein und HIV- Nef, abgebaut wird. Dieses Signal besteht vorzugsweise aus einem Ubiquitinylisierungssignal, das durch Seq. ID. Nr. 5 definiert ist.
Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung ein
Fusionsprotein, das die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 6 oder Homologe oder Fragmente hiervon umfasst, die eine biologische Aktivität beibehalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft zusätzlich Nukleinsauresequenzen zur Kodierung eines Fusionsproteins zum Blocken des HIV-Nef-Proteins. Diese Nukleinsauresequenzen bestehen grundsätzlich aus drei Bestandteilen, nämlich 1. einer Nukleinsäuresequenz, die eine ein Di-Leucin (LL) -Motiv bindende Proteindomäne kodieren,
2. einer Nukleinsäuresequenz, die eine ein PxxP-Motiv bindende Proteindomäne kodieren und
3. einer Nukleinsäuresequenz, die einen
Polypeptidlinker kodiert, durch den die beiden Domänen (a) und (b) verbunden sind.
Gesamt- oder Teilsequenzen dieser Nukleinsauresequenzen sind in den Seq. ID. Nr. 7, 8, 9 und 10 definiert.
Für den auf dem einschlägigen Fachgebiet tätigen Fachmann ist offensichtlich, daß die Ausübung der vorliegenden Erfindung nicht auf die Verwendung der exakten Sequenzen beschränkt ist, wie sie in den Seq. ID. Nr. 1 - 10 definiert sind.
Modifikationen der Sequenzen, wie beispielsweise Deletionen, Insertionen oder Substitutionen in der Sequenz, die im sich ergebenden Protein-Molekül sogenannte "stille" Veränderungen (silent changes) erzeugen, werden ebenfalls als innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.
Als Beispiel hierfür werden Veränderungen in der Nukleinsäuresequenz betrachtet, die die Erzeugung einer äquivalenten Aminosäure an einer vorgegebenen Stelle zur Folge haben. Vorzugsweise sind derartige Aminosäure- Substitutionen das Ergebnis der Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, d.h. konservative Aminosäureersetzungen. Aminosäuresubstitutionen können auf Grundlage der Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie, und/oder der amphipatischen (amphiphilen) Natur der involvierten Reste vorgenommen werden. Beispiele für unpolare (hydrophobe) Aminosäuren sind Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Polare neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Thyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Positiv geladene (basische) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Und negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Aspartinsäure und Glutaminsäure ein.
"Insertionen" oder "Deletionen" bewegen sich typischerweise im Bereich von ein bis fünf Aminosäuren. Der erlaubte Variationsgrad kann experimentell durch systematisch vorgenommene Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in einem Polypeptidmolekül unter Verwendung von DNA-Reko binationstechniken und durch Untersuchen der sich ergebenden rekombinanten Varianten bezüglich ihrer biologischen Aktivität ermittelt werden.
Nukleotidveränderungen, die eine Veränderung der N- terminalen und C-terminalen Anteile des Proteinmoleküls zur Folge haben, ändern häufig die Protein-Aktivität nicht, weil diese Anteile üblicherweise nicht in der biologischen Aktivität involviert sind. Es kann ebenfalls erwünscht sein, ein oder mehrere der in der Sequenz vorliegenden Cysteine zu eliminieren, weil das Vorhandensein von
Cysteinen eine unerwünschte Bildung von Multimeren zur Folge haben kann, wenn die Proteine rekombinant erzeugt werden, wodurch die Reinigung und Kristallisations- Verfahren kompliziert werden. Jede der vorgeschlagenen Modifikationen bewegt sich innerhalb der technischen und naturwissenschaftlichen Grundkenntnisse, genauso wie die Bestimmung der Beibehaltung der biologischen Aktivität der kodierten Produkte.
Daraus ergibt sich, daß, wo der Begriff "DNA-Sequenz" entweder in der Beschreibung oder in den Ansprüchen verwendet wird, er alle derartigen Modifikationen und Varianten umfaßt, die in der Erzeugung eines biologisch äquivalenten Fusionsproteins zum Blocken von HIV-Nef resultieren.
Als „Teil* der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind insbesondere Derivate und Fragmente anzusehen, die ein biologisch aktives Protein kodieren. Biologisch aktiv bedeutet hier, dass die Abwandlungen ein Fusionsprotein kodieren, bei dem die ursprüngliche Funktion erhalten ist, d.h., das zum Blocken des HIV-Nef-Proteins in der Lage ist.
Derivate der vorstehenden Nukleinsäuren sind beispielsweise solche Nukleinsäuren, die eine oder mehrere Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen im Vergleich mit der entsprechenden Sequenz von SEQ ID NO. 7 - 10 aufweisen, wobei das Derivat unter moderat stringenten oder stringenten Bedingungen an die entsprechende Nukleinsäure von SEQ ID NO. 7 - 10 bindet. Unter Derivaten sind erfindungsgemäß insbesondere solche Nukleinsäuren zu verstehen, bei denen zumindest 1, aber auch 2, 3, 4 oder mehr Nukleotide an einem oder beiden Enden der
Nukleinsäuren oder auch im Inneren der Nukleinsäuren fehlen oder durch andere Nukleotide ersetzt wurden. Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfassen also auch Nukleinsäuren, die Sequenzen aufweisen, die im Wesentlichen zu den Nukleinsäuren der SEQ ID NO. 7 - 10 äquivalent sind. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren können z.B. zumindest ungefähr 80%, typischerweise zumindest ungefähr 90% oder 95% Sequenzidentität zu den Nukleinsäuren der SEQ ID NO. 7 - 10 aufweisen. Dies jedoch stets unter der Voraussetzung, dass die Abwandlungen die wie oben definierte biologische Funktion des Fusionsproteins erfüllen. Die Erfindung sieht weiterhin
Komplementärsequenzen zu den oben genannten Nukleinsäuren vor .
Die Erfindung umfasst - wie oben angesprochen - auch solche Derivate, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren unter moderat stringenten oder stringenten Bedingungen hybridisieren .
Unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen versteht man im allgemeinen die Reaktionsbedingungen, unter denen nur noch Duplexmoleküle zwischen Oligonukleotiden und gewünschten Zielmolekülen (perfekte Hybride) entstehen bzw. nur noch der gewünschte Zielorganismus nachgewiesen wird. Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen werden insbesondere 0,2 x SSC (0,03 M NaCl, 0,003 M Natriumeitrat, pH 7) bei 65°C verstanden. Bei kürzeren Fragmenten, beispielsweise Oligonukleotiden aus bis zu 20 Nukleotiden, liegt die Hybridisierungstemperatur unter 65°C, beispielsweise bei über 55°C, bevorzugt über 60°C, jeweils aber unter 65°C. Stringente Hybridisierungste peraturen sind abhängig von der Größe bzw. Länge der Nukleinsäure und ihrer Nukleotidzusammensetzungen und sind vom Fachmann durch Handversuche zu ermitteln. Moderat stringente Bedingungen werden beispielsweise bei 42 °C und Waschen in 0,2 x SSC/0,1% SDS bei 42°C erreicht.
Die jeweiligen Temperaturbedingungen können in Abhängigkeit von den gewählten Versuchsbedingungen und in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Nukleinsäure-Probe unterschiedlich sein und müssen dann entsprechend angepasst werden.
Die Erfindung umfasst auch solche Varianten, die einen
Nukleinsäureaustausch gegenüber den Nukleinsäuren von SEQ ID NO. 7 - 10 aufweisen, wobei der Austausch aufgrund der Degenerierung des genetischen Codes ein identisches oder funktioneil äquivalentes Protein kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, z.B. einen Expressionsvektor, der eine der vorgenannten Nukleinsauresequenzen enthält.
Zahlreiche Vektoren, die zur Verwendung beim Transformieren von bakteriellen Zellen geeignet sind, sind bekannt, beispielsweise können Plasmide und Bakteriophagen, wie beispielsweise der Phage λ, als die am häufigst verwendeten Vektoren für bakterielle Wirte verwendet werden. Sowohl in Säugetier- als auch Insektenzellen können beispielsweise virale Vektoren zur Expression eines exogenen DNA-Fragments verwendet werden. Beispielhafte Vektoren sind das SV40 oder Polyo a-Virus .
Die Transformierung der Wirtszellen kann alternativ direkt durch "nackte DNA" ohne Verwendung eines Vektors erfolgen. Die Erzeugung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins kann entweder in eukaryotischen Zellen oder prokaryotischen Zellen erfolgen. Beispiele von geeigneten eukaryotischen Zellen schließen Säugetierzellen, Pflanzenzellen, Hefezellen und Insektenzellen ein. Geeignete prokaryotische Wirte schließen E.coli und Bacillus subtilis ein.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Erzeugung eines im wesentlichen reinen Fusionsproteins zum Blocken des HIV-Nef-Proteins, das ein Transformieren einer Wirtszelle mit einem Vektor, ein Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Expression der Sequenz durch die Wirtszelle erlauben und ein Isolieren des Fusionsproteins aus der Wirtszelle umfassen.
Zuletzt umfaßt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge eines Fusionsproteins, wie hierin offenbart, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Eine derartige Zusammensetzung kann auch durch eine wirksame Menge einer Nukleinsäuresequenz gebildet sein.
Aus dem vorher bezüglich der Eigenschaften des HIV-Nef- Proteins und der Funktion des erfindungsgemäßen Fusionsproteins Dargelegten ergibt sich, daß diese
Zusammensetzungen zur in vivo-Therapie des erworbenen Immunmangelsyndroms (Aids) geeignet sind.
Für den hier beschriebenen Nef-Inhibitor (Fusionsprotein zum Blocken von Nef) sind multiple direkte Anwendungen für therapeutische, diagnostische und Forschungsszwecke möglich. Ein erster Aspekt des in vivo-Einsatzes des erfindungsgemäßen Fusionsproteins liegt in der therapeutischen Behandlung einer existierenden HIV- Infektion.
Eine Möglichkeit besteht hier im Einsatz des Inhibitors als Monopräparat . Es liegt jedoch auf der Hand, dass eine klinische Anwendung z.B. auch als Zusatz zu einer aktuellen Therapieform (HAART für highly active anti-retroviral therapy) erfolgen kann, die aus der Kombination von mindestens drei Präparaten gegen die viralen Enzyme (Reverse Transkriptase und Protease) besteht.
Der Nef-Inhibitor wird hierzu vorzugsweise in löslicher, zellpermeabler Form bereit gestellt und oral verabreicht werden. Zu diesem Zweck wird der Nef-Inhibitor vorzugsweise in einer Zusammensetzung eingesetzt, in der er in einer therapeutisch wirksamen Menge vorliegt.
Eine wirksame bzw. therapeutisch wirksame Dosis bezeichnet eine derartige Menge, die eine Linderung der Symptome oder eine Verlängerung der Überlebenszeit eines AIDS-Patienten zur Folge hat. Die Toxizität und die therapeutische Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Tierexperimenten bestimmt werden, beispielsweise zur Bestimmung der LD 50 (der lethalen Dosis für 50% der Population) und der ED 50 (der Dosis, die in 50% der Population therapeutisch wirksam ist) . Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und kann als Verhältnis zwischen LD 50 und ED 50 ausgedrückt werden. Verbindungen, die hohe therapeutische Indices zeigen, werden bevorzugt. Die aus Zellkulturassays und Tierstudien gewonnenen Daten können bei der Formulierung eines Bereichs an Dosierungen zur Verwendung beim Menschen verwendet werden. Die Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereiches der zirkulierenden
Konzentrationen, die einen ED 50 mit nur geringer oder keiner Toxizität einschließen. Diese Dosierung kann innerhalb eines Bereiches variieren, der von der Dosierungsform, die verwendet wird, und dem Verabreichungsweg abhängig ist.
Die exakte Zubereitung, der Verabreichungsweg und die Dosierung kann durch den Arzt individuell in Hinsicht auf den Zustand des Patienten ausgewählt werden. Siehe beispielsweise FINGL et al, 1995 in „The pharmacological basis of therapeutics* , Kapitel 1, Seite 1. Die Dosierungsmenge und das Dosierungsintervall können individuell eingestellt werden, um Plasmaspiegel der aktiven Komponente bereitzustellen, die ausreichend sind um eine HIV-Nef blockierende Wirkung aufrecht zu erhalten.
Grundsätzlich hängt die Menge der Verbindung, die verabreicht wird, vom behandelten Patienten, dessen Gewicht, dem Schweregrad der Erkrankung, dem Verabreichungsweg und der Beurteilung des verschreibenden Arztes ab.
Alternativ zum therapeutischen Einsatz ist gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung eine prophylaktische Behandlung vorgesehen. Diese besteht in einem gentherapeutischen Ansatz, in dem der Nef-Inhibitor über ein, virales oder nicht-virales, Vektorsystem präventiv eingeschleust wird und somit intrazellulär die Aktivität des Nef Protein im Falle einer Infektion mit HIV hemmt.
Wie bereits oben angesprochen, wird das erfindungsgemäße Fusionsprotein/ die erfindungsgemäße Nukleinsäure vorzugsweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet, in der sie mit geeigneten Trägern oder Trägerstoffen in Dosen derart vermischt werden, daß die Erkrankung behandelt oder der Erkrankungszustand verbessert wird. Eine derartige Zusammensetzung kann (zusätzlich zum Protein/Nukleinsäure und dem Träger) Verdünnungsmittel, Füllmaterialien, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisierungsmittel und andere Materialien enthalten, die in der Technik wohlbekannt sind. Der Begriff "pharmazeutisch akzeptabel" bedeutet ein nichttoxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des aktiven Inhaltsstoffes (der aktiven Inhaltsstoffe) nicht stört. Die Eigenschaften des Trägers hängen vom Verabreichungsweg ab. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin weitere Mittel enthalten, die die Aktivität des Fusionsproteins/der Nukleinsäure steigern oder deren Aktivität oder Verwendung bei der Behandlung ergänzen. Derartige zusätzliche Faktoren und/oder Mittel können in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten sein, um eine synergistische Wirkung zu erzielen oder um
Nebenwirkungen bzw. unerwünschte Wirkungen zu minimieren.
Techniken zur Formulierung bzw. Zubereitung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung sind in "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack
Publishing Co., Easton, PA, letzte Ausgabe, zu finden. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich ferner auf eine Menge der Verbindung, die ausreicht, um eine Verbesserung der Symptome zu erreichen, beispielsweise eine Behandlung, Heilung, Prävention oder Verbesserung derartiger Zustände. Die Verabreichung des Fusionsproteins/ der Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung, der (die) in der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Ausübung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann auf einer Vielzahl unterschiedlicher Wege, wie beispielsweise durch orale Stoffaufnahme, Inhalation, topische Verabreichung oder kutane, subkutane, intraperitoneale, parenterale oder intravenöse Injektion durchgeführt werden. Die intravenöse und orale Verabreichung an einen Patienten wird bevorzugt.
Eine typische Zusammensetzung zur intravenösen Infusion kann so hergestellt werden, daß sie 250 ml sterile Ringer 'sehe Lösung und eine geeignete Menge
Fusionsprotein/Nukleinsäure enthält. Siehe Remington's Pharmaceutical Science (15. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, Ps . , 1980).
Es ist jedoch auch möglich, diese Zusammensetzungen zur in vitro- oder in vivo-Diagnose des erworbenen
Immunmangelsyndroms einzusetzen. Im letzteren Fall ist eine Verbindung der Fusionsproteine/ Nukleinsauresequenzen mit einem geeigneten Nachweisreagenz vorteilhaft, durch das das Vorliegen des HIV Nef-Proteins in einem Test Kit nachgewiesen werden kann.
Durch die Konjugation des Nef-Inhibitors mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Phycoerythrin, Cy5, GFP) ergeben sich klinische und forschungsbezogene Anwendungen der Erfindung. Das markierte Inhibitormolekül kann zur Identifizierung und subzellulären Lokalisierung des Nef Proteins in infizierten Zellen klinischer Proben und im Forschungslabor in FACS- bzw. immunhistologischen Untersuchungen verwendet werden (HIV-Nef ist ein guter Marker, da es in grossen Mengen früh in der Infektion exprimiert wird und es gibt keine Antikörper, die Nef gut im FACS oder Immunfluoreszenz erkennen) . Die fluoreszenzmarkierte Version des Inhibitors wird idealerweise aus der zellper eablen Version erstellt werden, funktioniert aber auch ohne intrinsischen Zelleintritt, da die Zellen für diese Untersuchungen im Labor permeabilisiert werden können.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand der beiliegenden Abbildungen beschrieben. Die Abbildungen zeigen:
Abb. 1 die Struktur-Funktionsbeziehung der hochkonservierten Motive für die Myristoylierung (MGxxxS), SH3-Domänen Bindung (PxxP)und Di-Leuzin-bindende Domänen Bindung (LL) in HIV-Nef.
Abb. 2 die Bindung der Di-Leuzin-bindenden Domäne aus ßl- und ß2-Adaptin und V1H an das Di-Leuzin Motiv in HIV-1 Nef in vitro im Hefe-zwei-Hybrid System und im GST pull- down Experiment .
Abb. 3 die modulare Domänenstruktur des ß2-Adaptin Proteins bestehend aus 14 HEAT repeats und des V1H Proteins, bestehend aus 8 HEAT repeats.
Abb. 4 die Identifizierung der HEAT repeat Struktur 9 bis 12 (Aminosäure 352 bis 499 in ßl-Adaptin) als minimale Di-Leuzin-bindende Domäne im Hefe-Zwei-Hybrid System. Abb. 5 Immunofluoreszenzbilder von NIH-3T3 Zellen der Inhibierung eines funktionalen Di-Leuzin Motivs aus CD3γ Rezeptoren durch die Expression der Di-Leuzin-bindenden Domäne aus ßl- und ß2-Adaptin und V1H in vivo.
Abb. 6 eine schematische Darstellung der modularen Domänenanordnung in einem Fusionsprotein zum Blocken des HIV Nef Proteins.
Abb. 7 , daß das Fusionsprotein bestehend aus einer LL- Domäne und einer SH3-Domäne spezifisch an das HIV Nef Protein bindet.
In Abb. 1 zeigt A) die dreidimensionale Proteinstruktur von HIV-1 Nef mit den beschrifteten hochkonservierten Motiven zur Protein-Interaktion, die die Exponiertheit der Bindungsstellen veranschaulicht. Das Sequenzmotiv MGxxxS am N-Terminus von Nef initiiert die co-translationale Myristoylierung des Proteins und damit die
Membranständigkeit . Die Polyprolin-Helix (PxxP Motiv oder als exakte Beschreibung: PxxPxR) führt zur Erkennung von SH3-Domänen während das strukturell gegenüberliegende Di- Leuzin Motiv (LL Motiv, bzw. : ExxxLL) mit der Di-Leuzin bindenden Domäne interagiert. Die Darstellung der Voll- Längen-Proteinstruktur von Nef beruht auf der Zusammensetzung der Strukturen der Ankerdomäne (Aminosäuren 1-57; Geyer et al . , 1999) und der Kerndomäne (Aminosäuren 57-206; Grzesiek et al . , 1996), die mittels Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie bestimmt worden sind und mit anschließender Moleküldynamik energieminimiert wurden. B) zeigt die Korrelation von Sequenzkonservierung und Oberflächenzugänglichkeit, die die Struktur- Funktionsbeziehung des HIV-Nef Proteins verdeutlicht. Aminosäuren, die eine Schlüsselfunktion für die Faltung der Proteinstruktur einnehmen sind überdurchschnittlich hoch konserviert und liegen im Inneren der Struktur verborgen (siehe z.B. Trp-183). Demgegenüber sind Aminosäuren, die stark exponiert sind aber trotzdem hoch konserviert sind, häufig für die Interaktionen des Proteins wichtig (siehe LL-Motiv, L164, L165) . Die für die Funktionalität des viralen Proteins wichtigen Motive können so ermittelt werden.
Der Grad der Sequenzkonservierung wurde aus einem Alignment von 186 einzelnen Nef Aminosäuresequenzen unterschiedlicher HIV-1 Subtypen bestimmt. Die Oberflächenzugänglichkeit der einzelnen Aminosäuren, unterteilt in Haupt- und Seitenkette, wurde anhand der in A) gezeigten Nef Proteinstruktur berechnet.
In Abb. 2 zeigt A) die Identifizierung der Di-Leuzin- bindenden Domäne durch die Bindung der homologen Fragmente aus ß-Adaptinen (bl- und b2-Adaptin) und der Untereinheit H der vakuolaren (H+)-ATPase (V1H) an das Di-Leuzin Motiv in HIV-Nef. Die Affinität der Binding wurde durch einen ß- Galactosidase-Assay mit Hefe-Zwei-Hybrid Techniken quantitativ bestimmt. Etwa 10 Kolonien pro Kultur wurde aus je drei unabhängigen Transformationen der Plasmide in Y187 Hefezellen (Clontech, CA) in Flüssigmedium kultiviert und mit CPRG und ONPG Reagenzien die Farbveränderung durch ß- Galactosidase quantifiziert. Die Spezifität der identifizierten Fragmente für das Di-Leuzin-Motiv ist durch den Verlust der Bindung durch die Doppelmutation L164 und L165 zu Alanine in Nef (LLAA) gezeigt.
Die Bindung zwischen der Di-Leuzin-bindenden Domäne aus ß- Adaptinen oder V1H und Nef wurde in Abb. 2 B) durch ein weiteres Experiment bestätigt. Das wildtyp Nef Protein aus der Allele SF2 und die Doppelmutante Nef (LLAA) wurde als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) in Escheri chia Coli exprimiert und mittels GST-Sepharose Beads aufgereinigt . Die Di-Leuzin-bindende Domäne aus V1H, ßl und ß2 wurden in vi tro transkribiert und mit dem TnT T7 gekoppelten Reticulozyten Lysat System (Promega, Wisconsin) in Gegenwart von [35S] -markiertem Cystein translatiert . Die Bindungsreaktion zwischen GST-Nef und in vi tro translatierter Di-Leuzin-bindender Domäne wurde in 10 mM CHAPS Puffer und 50 raM NaCl bei pH 7.4 und 4°C durchgeführt. Anschließend wurden die GST-Beads drei Mal in dem Puffer gewaschen, die Proteine durch 10% SDS-PAGE Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Das Bindungsexperiment zeigt, dass die drei homologen Fragmente aus V1H, ßl-Adaptin und ß2-Adaptin eine schwache aber spezifische Bindung an das HIV-1 Nef Protein der
Allele SF2 aufweisen (Spur 2, 6 und 10) . Dagegen kann keine Bindung zwischen GST allein (GST) oder der Di-Leuzin Doppelmutante in Nef (GST-Nef (LLAA) ) und den V1H, ßl und ß2 Fragmenten detektiert werden (Spur 1, 5 und 9 bzw. Spur 3, 7 und 11) . Abb. 3 zeigt die sequentielle Domänenarchitektur von ß2- Adaptin und V1H. A) Die sog. N-terminale trunk Domäne der ß-Adaptinen (Aminosäure 1-592) besteht aus 14 helikalen HEAT oder Armadillo (ARM) Repeats, die eine repetitive, modulare Struktur bilden. Die konservierten Aminosäuren, die für die tertiäre Strukturfaltung typisch sind und das Gerüst der HEAT repeats bilden, sowie die helikalen Sekundärstrukturelemente der HEAT repeats sind oberhalb der Sequenz dargestellt. Die minimale Di-Leuzin-Bindungsdomäne, die durch die HEAT repeats 9 bis 12 gebildet wird, ist durch eine Box hervorgehoben (siehe auch Abb. 4) .
Abb. 3 B) zeigt die HEAT bzw. Armadillo Repeat Struktur der humanen Untereinheit H der vakuolaren (H+)-ATPase. Die 8 modularen Repeats werden durch ein zusätzliches Segment (Aminosäure 350-379) unterbrochen, das die Flexibilität zwischen den helikalen Modulen erhöht. Die beiden Segmente in V1H, die an das Di-Leuzin-Motiv in Nef binden sind durch Boxen hervorgehoben.
In Abb. 4 ist die minimale Di-Leuzin-bindende Domäne identifiziert, die aus einer Abfolge von vier HEAT Repeats besteht. Die modulare Domänenorganisation der ß-Adaptine ist exemplarisch für ßl-Adaptin oben dargestellt. 6 verschiedene Fragmente mit jeweils vier HEAT Repeats wurden so kloniert, dass sie sich um jeweils zwei HEAT Repeats überlappen. Die Quantifizierung der Bindungsa finität dieser Fragmente zu Nef wurde über den Hefe-2-Hybrid ß- Galactosidase-Flüssigassay bestimmt wie in Abb. 2A beschrieben. Das Ergebnis dieser Bindungsstudie ist, dass die Erkennungsstelle für das Di-Leuzin-Motiv in den vier C- terminalen HEAT Repeats 9 bis 12 (Aminosäuren 352-499) vorliegt. Diese Sequenz bildet damit die minimale Di- Leuzin-bindende Domäne.
Abb. 5 zeigt den Effekt der Expression der Di-Leuzin- bindenden Domäne auf die Lokalisation eines Di-Leuzin Internalisierungs Motivs in vivo. Ein Reporterkonstrukt bestehend aus dem membranständigen Interleukin-2 Rezeptor (IL2R) und dem cytoplasmatischen Di-Leuzin Motiv (LL) aus CD3γ wurde kloniert und in NIH-3T3 Zellen transfiziert . Diese Molekül wurde durch Immunofluoreszenz mit dem PE- konjugierten Anti-CD25 Antikörper sichtbar gemacht. Abb. A zeigt, dass das wildtyp-Konstrukt (IL2R-LL) durch die zelluläre Endozytose Maschinerie in hohem Maße von der
Zelloberfläche runterreguliert wird und ins Zytoplasma und den perinuklearen Raum internalisiert . Zur Kontrolle der Funktionalität des Di-Leuzin Motivs zur Endozytose zeigt die Mutation des LL-Motivs zu Alanin (IL2R-AA) keine Internalisationeigenschaften mehr. Vielmehr bleibt dieses Molekül vermehrt an der Oberfläche der Zelle sichtbar (B) . Die gleichzeitige Transfektion des funktionalen IL2R-LL Konstrukts und der Di-Leuzin bindenden Domäne von V1H, ßl- und ß2-Adaptin bewirkt nun einen Block des IL2R-LL Moleküls an der Plasmamembran und verhindert die Endozytose. (C, E und G) . Diese Domäne ist damit ein Inhibitor für die Di- Leuzin-Motiv vermittelte Internalisierung. Zur Kontrolle wurde die Expression der Di-Leuzin-bindenden Domäne von V1H, ßl und ß2 und ihre homogene Lokalisierung über einen FITC-conjugierten anti-myc Antikörper sichtbar gemacht (D, F und H) . In Abb. 6 zeigt A) die etwa 350 Aminosäuren umfassende LL- bindende Domäne (LL-Domäne) , die über einen Polypeptid- Linker variabler Länge (10 bis 60 Aminosäuren) mit einer 61 Aminosäuren großen PxxP-bindenden Domäne (SH3-Domäne) verbunden wird. Die Spezifität dieses Hybridmoleküles zum Blocken des HIV Nef Proteins ergibt sich aus der hier geschaffenen Chimäre einer Domäne aus vesikulären Transportprozessen (LL-Domäne) mit einer Domäne aus Signaltransduktionsprozessen (SH3-Domäne) .
Das damit geschaffene Fusionsprotein zielt spezifisch auf die beiden Motive höchster Konservierung (LL und PxxP) in Nef, die aus sehr unterschiedlichem zellulärem Kontext stammen.
B) von Abb. 2 stellt eine Skizze eines Fusionsproteins mit ungekehrter Anordnung der Proteindomänen dar. C) Das Fusionsprotein zum Blocken des HIV Nef Proteins kann durch die Einführung zweier zusätzlicher sequentieller Motive weiter spezifiziert und optimiert werden. Ein
Farnesylierungsmotiv am C-Terminus zur Membranverankerung (oder auch Palmitoylierungsmotiv, Myristoylierungsmotiv) gewährleistet die Lokalisation des Fusionsproteins in den Umgebung des membranständigen Nef Proteins . Ein Signal zur Ubiquitinylierung (oder auch Sumoylierung) kann den Komplex aus dem Fusionsprotein mit Nef zum Abbau am Proteasom der Zelle lenken. Die Anordnung der Domänen, Linker und zusätzlichen Motive muß auf größte Affinität, Spezifität und Funktionalität zum Blocken des HIV Nef Proteins optimiert werden.
Bindungsexperimente (Abb. 7) : Zwei verschiedene Nef Proteine von den beiden in Laboratorien am häufigsten benutzten HIV-1 Stämmen NL4-3 und SF2 wurden für die Bindungsexperimente verwendet. Die beiden Nef Proteine wurde als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) in Echerichia Coli exprimiert und mittels GST-Sepharose Beads aufgereinigt . Das Fusionsprotein bestehend aus der LL-Domäne der ß- Untereinheit des Adaptor-Protein-Komplexes AP-1 (ß-1) und der PxxP-bindenden SH3-Domäne der Tyrosin-Kinase Hck (SH3- Hck) wurde mit zwei unterschiedlichen Längen des
Verbindungslinkers kloniert (vgl. Abbildung 2). Die Verwendung der beiden Linker von 60 Aminosäuren Länge bzw. 106 Aminosäuren Länge führt zu den beiden Varianten des Fusionsproteins LL-SH3(470) und LL-SH3 (516) mit einem Laufverhalten von 48 kDa bzw. 56 kDa. [Im Detail besteht die Chimäre aus AC: AAA40807 (ßl), AS171-578 (LL-Domäne und Linker) bzw. AS 171-624, -Threonin- (für die Restriktionsschnittstelle) und AC: P08631, AS 78-138 (Hck- SH3) .] Die Fusionsproteine wurden in vi tro transkribiert und mit dem TnT T7 gekoppelten Reticulozyten Lysat System (Promega, Wisconsin) in Gegenwart von [35S] -markiertem Cystein translatiert .
Der Bindungsassay zwischen GST-Nef und in vi tro translatiertem Fusionsprotein wurde in Standard Kinase- Extraktions-Puffer (KEB) durchgeführt (250 mM NaCL, 0.5% NP40, 2 mM EDTA, 10% Glycerol, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) und 1 mg/ml Proteinase-Inhibitoren Cocktail) . Etwa 4 μl des GST-Nef Proteins wurden mit 7 μl des Fusionsproteins über 3 Stunden bei 4°C in 500 μl KEB langsam geschüttelt. Anschließend wurden die GST-Beads drei Mal in KEB gewaschen, die Proteine durch 10% SDS-PAGE Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Das Bindungsexperiment zeigt, dass die beiden Fusionsproteine unterschiedlicher Länge spezifisch an das HIV-1 Nef Protein der Allele NL4-3 und SF2 binden (Spur 2, 3 und 5, 6) während keine Bindung zwischen GST allein und den Fusionsproteinen detektiert werden kann (Spur 1, 4) . Die hohe Affinität der Bindung wird durch die Darstellung von 10% des Inputs der Fusionsproteine deutlich (Spur 7,
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Claims

Fusionsprotein zum Blocken des HIV-Nef-ProteinsPatentansprüche :
1. Fusionsprotein zum Blocken des HIV-Nef-Proteins, das aus Folgendem besteht:
(a) einer Proteindomäne, die ein Di-Leucin (LL) - Motiv bindet,
(b) einer Proteindomäne, die ein PxxP - Motiv bindet, und
(c) einem Polypeptidlinker, durch den die beiden Domänen (a) und (b) verbunden sind.
2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, bei dem die Proteindomäne von a) die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 1 oder Homologe oder Fragmente hiervon umfasst, die eine LL-Bindungs-Aktivität beibehalten .
3. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Proteindomäne von b) eine SH3-Domäne mit der
Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 2 oder Homologe oder Fragmente hiervon umfasst, die eine PxxP-Bindungs-Aktivität beibehalten.
4. Fusionsprotein, das die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 3 oder Homologe oder Fragmente hiervon umfasst, die eine biologische Aktivität beibehalten.
5. Fusionsprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das zusätzlich ein Signal zur Membranverankerung enthält.
6. Fusionsprotein nach Anspruch 5, bei dem das Signal ein C-terminales Farnesylierungssignal gemäß Seq. ID. Nr. 4 ist .
7. Fusionsprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das zusätzlich ein Signal zur Degradation am Proteasom enthält.
8. Fusionsprotein nach Anspruch 7, bei dem das Signal ein Ubiquitinylierungssignal gemäß Seq. ID. Nr. 5 ist.
9. Fusionsprotein, das die Aminosäuresequenz von Seq. ID. Nr. 6 oder Homologe oder Fragmente hiervon umfasst, die eine biologische Aktivität beibehalten.
10. Nukleinsäuresequenz zur Kodierung eines
Fusionsproteins zum Blocken des HIV-Nef-Proteins, das aus Folgendem in funktioneller Verbindung besteht:
(a) einer Nukleinsäuresequenz, die eine ein Di-Leucin (LL) - Motiv bindende Proteindomäne kodiert,
(b) einer Nukleinsäuresequenz, die eine ein PxxP - Motiv bindende Proteindomäne kodiert, und
(c) einer Nukleinsäuresequenz, die einen Polypeptidlinker kodiert, durch den die beiden Domänen (a) und (b) verbunden sind.
11. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10, bei der die Nukleinsäuresequenz von a) die Sequenz von Seq. ID. Nr. 7 oder einen Teil hiervon umfasst, der eine Proteindomäne mit LL-Bindungs-Aktivität kodiert.
12. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10 oder 11, bei der die Nukleinsäuresequenz von b) die Sequenz von Seq. ID. Nr.
8 oder einen Teil hiervon umfasst, der eine Proteindomäne mit PxxP-Bindungs-Aktivität kodiert.
13. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10, die die Seq. ID. Nr. 9 oder einen Teil hiervon umfasst, der ein biologisch aktives Fusionsprotein kodiert.
14. Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 10 - 13, die zusätzlich ein Signal zur Membranverankerung kodiert.
15. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10 - 14, die zusätzlich ein Signal zur Degradation am Proteasom kodiert.
16. Nukleinsäuresequenz, die die Seq. ID. Nr. 10 oder einen Teil hiervon umfasst, der ein biologisch aktives Fusionsprotein kodiert.
17. Nukleinsäuresequenz, die die Komplementärsequenz einer der Nukleinsauresequenzen von Anspruch 10 - 16 umfasst.
18. Vektor der eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10 - 17 enthält.
19. Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 18 transformiert ist.
20. Verfahren zur Erzeugung eines im wesentlichen reinen Fusionsproteins zum Blocken des HIV Nef-Proteins, das ein Transformieren einer Wirtszelle mit einem Vektor nach Anspruch 18, ein Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Expression der Sequenz durch die Wirtszelle erlauben, und ein Isolieren des Fusionsproteins aus der Wirtszelle umfassen.
21. Therapeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 - 9 umfasst, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
22. Therapeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer Nukleinsäure nach Anspruch 10 - 18 umfasst, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
23. Verwendung der Zusammensetzungen nach Anspruch 21 und 22 zur in vivo Prophylaxe und Therapie des erworbenen Immunmangelsyndroms (AIDS) beim Menschen.
24. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1-9, das weiterhin mit einem Nachweisreagenz konjugiert ist.
25. Fusionsprotein nach Anspruch 24, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiert ist.
26. Diagnostische Zusammensetzung, die ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1-9, 24 oder 25, oder eine Nukleinsäure nach Anspruch 10 - 18 umfasst.
27. Verwendung des Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1-9, 24 oder 25 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 26 bei der in vitro-Diagnose des erworbenen Immunmangelsyndroms (AIDS).
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