WO2002066638A1 - Gene recombinant contenant une sequence de repetition inversee et utilisation correspondante - Google Patents

Gene recombinant contenant une sequence de repetition inversee et utilisation correspondante Download PDF

Info

Publication number
WO2002066638A1
WO2002066638A1 PCT/JP2002/001554 JP0201554W WO02066638A1 WO 2002066638 A1 WO2002066638 A1 WO 2002066638A1 JP 0201554 W JP0201554 W JP 0201554W WO 02066638 A1 WO02066638 A1 WO 02066638A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
sequence
human mammal
inverted repeat
recombinant
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/001554
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Motoya Katsuki
Mitsuyoshi Ishida
Minoru Kato
Original Assignee
Gencom Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gencom Corporation filed Critical Gencom Corporation
Priority to US10/296,243 priority Critical patent/US20040010130A1/en
Priority to JP2002566344A priority patent/JP3765574B2/ja
Priority to EP02700672A priority patent/EP1371727A4/en
Publication of WO2002066638A1 publication Critical patent/WO2002066638A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant gene containing an inverted repeat of a target gene. More specifically, the present invention relates to a recombinant gene into which an inverted repeat sequence of a target gene has been integrated so that it can be expressed in mammalian cells. The present invention also relates to a transgenic animal obtained using the above-mentioned recombinant gene. Background art
  • the knockout method requires a lot of labor and time, and is not practical for analyzing a large number of drugs or candidate proteins to be targeted by the drug, and is therefore more effective and simpler than the conventional knockout method. There is a need for a method for suppressing gene function.
  • RNAi is the transfer of double-stranded RNA (dsRNA) from a part of mRNA encoding a part of a certain gene (called target gene) to a cell.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • target gene a part of a certain gene
  • RNAi inhibitory action has not been elucidated, genetic analysis in C. elegans indicates that ego-1, mut-2, mut-7, mut-8, mut-9, red-1, The involvement of genes such as rde-2 and rde-4 has been reported (Grishok et al., 2000).
  • RNAi has been established as a gene knockout technology in C. elegans, and is a major tool for genome function analysis using whole nucleotide sequence information obtained from the C. elegans whole genome sequencing project. (Fraser et al., 2000; Gonczy et al., 2000). In the analysis of mammalian genome functions, it is expected to be an efficient method for suppressing gene expression as a method that is less time-consuming and labor-intensive than gene knockout.
  • An object of the present invention is to improve the method of introducing dsRNA so that RNAi has a long-term effect in mammalian cells such as mice.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and consequently found that the extrinsic ribator 1 "was a ubiquitous ribonuclease, and that Jinnanced green fluorescent protieh (EGFP) was used (Cormack et al., 1996). ), A part of chicken beta globin gene insulator rooster (240 base pairs), CMV enhancer, EGFP inverted repeat sequence downstream of human EFla promoter, and SV40 poly A addition signal. A transgene was constructed, and this gene was transfected into fertilized eggs of EGFP transgenic mice. The EGFP fluorescence during the early developmental stage was examined. The present invention has been completed based on these findings.
  • EGFP Jinnanced green fluorescent protieh
  • a recombinant gene containing an inverted repeat of a target gene that can be expressed in mammalian cells that can be expressed in mammalian cells.
  • a recombinant gene comprising an inverted repeat of a target gene downstream of a promoter sequence operable in mammalian cells
  • the target gene is a gene of an exogenous reporter protein or a mutant protein thereof;
  • the recombinant gene of the present invention can preferably be used for the production of a transgenic non-human mammal, which is preferably a mouse, rat, hamster, guinea pig, egret, dog, It is a non-human mammal selected from the group consisting of cats, pomas, sea lions, sheep, pigs, goats and monkeys.
  • a recombinant vector comprising the above-described recombinant gene of the present invention.
  • transgenic non-human mammal or a progeny thereof, or a part thereof, which expresses an inverted repeat of a target gene.
  • transgenic non-human mammal its progeny, or a part thereof, wherein the inverted repeat sequence of the target gene is the inverted 'repeated sequence of the gene of the exogenous reporter protein or its mutant protein.
  • the non-human mammal is selected from the group consisting of a mouse, a rat, a hamster, a monoremot, a penguin, a dog, a cat, a pen, a peony, a sheep, a pig, a goat and a sanole.
  • a recombinant gene containing an inverted repeat sequence of a target potato under an enhancer sequence and a promoter sequence, or a recombinant vector containing the recombinant gene is introduced into cells of a non-human mammal.
  • a method for suppressing stalking of a target gene comprising: BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows the construction of a plasmid containing the EGFP inverted repeat sequence gene.
  • FIG. 2 is a diagram showing the construction of a plasmid containing the EGFP inverted repeat sequence gene containing 5, INS240.
  • FIG. 3 is a diagram showing the construction of a plasmid containing the antisense strand EGFP.
  • FIG. 4 is a diagram showing the structure of an EGFP dsRNA expression transgene fragment (3.7 kb) (upper row) and the structure of an EGFP antisense RNA expression transgene fragment (3.0 kb) (lower row).
  • Figure 5 shows the fluorescence image (left column) and visible light image (right column) of the embryo after transgene injection into the pronucleus of the fertilized egg.
  • FIG. 6 shows mice with reduced EGFP fluorescence on the body surface.
  • the offspring mice from day 1 to day after birth were irradiated with a 365 nm ultraviolet lamp and observed in a box, and mice with reduced EGFP fluorescence on the body surface were observed.
  • the middle mouse among the three pups is the dimmed mouse.
  • FIG. 7 shows EGFP fluorescence observation of mouse lymphocytes in which EGFP fluorescence has been reduced on the body surface.
  • Mouse Nos. HIR-1-16L and HIR-7-238L are mice in which RAi expression was observed.
  • a B6C3F1 mouse was used as a Q negative control, which was a mouse in which no RNAi effect was observed in each litter.
  • FIG. 8 shows EGFP fluorescence observation (observation after long-term breeding) of mouse lymphocytes with reduced EGFP fluorescence on the body surface. Using the same mice as those used in FIG. 7, this analysis was performed 6 months after the analysis shown in FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the recombinant gene of the present invention is characterized by containing an inverted repeat sequence of a target gene that can be expressed in mammalian cells.
  • a recombinant gene having such a structure By introducing a recombinant gene having such a structure into mammalian cells, the inverted repeat sequence of the target gene can be expressed in the cells, thereby increasing the expression of the target gene by the RNAi (RNAinterference) effect. It becomes possible to suppress.
  • RNAi RNAinterference
  • An inverted repeat sequence refers to a sequence in which a target gene and its inverted sequence are juxtaposed via an appropriate sequence. Specifically, when the target gene has a double strand consisting of the following n base sequences,
  • the reverse arrangement has the following arrangement:
  • the inverted repeat sequence is a sequence in which the above two types of sequences are arranged via an appropriate sequence. Two types of inverted repeat sequences can be considered: a case where the sequence of the target gene is upstream of the sequence of the reverse sequence and a case where the sequence of the reverse sequence is upstream of the sequence of the target gene.
  • the inverted repeat sequence used in the present invention may be any of the above, but preferably, the inverted sequence is present upstream of the sequence of the target gene.
  • the sequence existing between the target gene sequence and its reverse sequence is a region that forms a hairpin loop when transcribed into R R.
  • the length of this region is not particularly limited as long as a hairpin loop can be formed, but is generally from Otp to 700 bp, preferably about 0 to 300 bp, more preferably about 0 to 100 bp. is there.
  • a restriction enzyme site may be present in this sequence.
  • Any gene can be used as the target gene used in the present invention.
  • the target gene is a gene intended to suppress the expression (knockout is intended). Gene).
  • Such target genes include genes that have been cloned but whose functions are unknown.
  • the target gene may be a gene for an exogenous reporter protein or a mutant protein thereof.
  • the gene of such an exogenous reporter protein or its mutant protein is used as a target gene, the RNAi effect can be easily detected and evaluated by the transgenic technique using the recombinant gene of the present invention. be able to.
  • mutant protein of the exogenous reporter protein one or more (for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 10) amino acid sequences in the above-described wild-type reporter protein are used. 5) amino acid substitutions, deletions, additions and
  • the gene of the mutant protein of the reporter protein include a gene in which a part of the nucleotide sequence in the gene of the reporter protein is deleted, a gene in which the nucleotide sequence of the reporter gene is replaced with another nucleotide sequence, A gene in which another base sequence is inserted into a part of the reporter gene is used.
  • the number of bases subject to deletion, substitution or addition is not particularly limited, but is usually about 1 to 60, preferably about 1 to 30 and more preferably about 1 to 10. It is desirable that these mutant genes maintain their functions as the reporter gene '.
  • the gene for the mutant protein can be produced by any method known to those skilled in the art, such as chemical synthesis, genetic engineering techniques, and mutagenesis.
  • the mutagen can be mutated by contacting the mutagenic agent with DNA encoding the natural reporter protein, irradiating ultraviolet rays, or using genetic engineering techniques such as PCR.
  • a gene encoding a protein can be obtained.
  • Site-directed mutagenesis which is one of the genetic engineering techniques, is particularly useful because it is a technique that can introduce a specific mutation at a specific position.
  • an inverted repeat sequence of the target gene exists downstream of the promoter sequence operable in mammals. With such a configuration, it becomes possible to express the inverted repeat sequence of the target gene in mammalian cells. That is, in the recombinant gene of the present invention, the inverted repeat sequence of the target gene is placed under the control of the above promoter.
  • the promoter sequence used in the present invention is not particularly limited as long as it can operate in mammals.
  • promoters examples include, for example, gene promoters derived from viruses (eg, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus), various mammals (eg, human, rabbit, etc.). , Dogs, cats, monoremots, /, musters, rats, mice, etc.).
  • promoters derived from each mammal include, for example, albumin, endothelin, osteocalcin, muscle creatine kinase, collagen type I and type II, and italic AMP-dependent protein kinase ⁇ -subunit (The. Pyological 'The Journal of Biological Chemistry, Vol. 271,-No.
  • promoters described in, for example, Molecular Medicine extra edition, manual disease model mouse; Kenichi Yamamura, 'Matsuya Katsuki, Shinichi Aizawa, Nakayama Shoten, etc.' can also be used.
  • Preferred promoters for use in the present invention include the I-to-EFla promoter used in the examples of the present specification, and other examples include the following.
  • CMV enhancer It is generally used as a combination of the CMV enhancer and the / 3 actin promoter.
  • pCAGGS chicken beta-actin promoter and cytomega ⁇ virus enhancer, beta-actin intron and bovine globin poly-adenylation signal.
  • Apolipoprotein E promoter Promoter intended for expression in fetal liver For references, see Simonet et al., 1993, J. Biol. Chem., 268, 8221-8229.
  • a transgenic mouse may be prepared by introducing the gesom itself.
  • a transgenic mouse see 0kamoto M., et al., J. Exp. Med., 175, 71 (1992).
  • the recombinant gene of the present invention may contain an enhancer sequence upstream of the promoter sequence.
  • enhancer sequence examples include the CMV enhancer described above.
  • the recombinant gene of the present invention may contain an insulator sequence or a part thereof.
  • An insulator sequence is a gene sequence that protects a transgenic animal from suppression of gene expression due to “position effects”. It is expected to be a committee for the effects of nearby cis-elements.
  • the position of the insulator sequence or a part thereof is not particularly limited, it is preferably present on the 5 ′ side (upstream) of the transgene (that is, the inverted repeat sequence of the target gene) from the viewpoint of the effect. Most preferably, the insulator sequence or a portion thereof is upstream of the promoter sequence (or upstream of the enhancer sequence, if present).
  • the recombinant gene of the present invention may include a poly A-attached caro signal sequence downstream of the inverted repeat sequence of the target gene. Insertion of the poly A additional signal sequence can terminate transcription of the desired messenger RNA.
  • poly A additional signal sequence examples include, but are not limited to, SV40 poly A additional signal.
  • the expression vector of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • the present invention further relates to a recombinant vector containing the above-described recombinant gene according to the present invention and a transformant having the recombinant vector.
  • butter in the case of using a bacterium as a host include, for example, pBTrP2, pBTacl, pBTac2 (all commercially available from Perlinger Mannheim), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX- 1 (Promega), pQE-8 (QIAGEN), pQE-30 (QIAGEN), pKYPIO (JP-A-58-110600), pKYP200 [Agrc. Biol. Chem., 48, 669 (1984)] ] PLSA1 [Agrc. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGELl [Proc. Natl.
  • PBluescrlptll SK +, pBluescriptII SK (-) (Stratagene PTrS30 (FERMBP-5407), pTrS32 (FERM BP-5408), pGEX (Pharmacia), pET-3 (Novagen), pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194 PUC18 [Gene, 33, 103 (1985)], pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (Takara Shuzo), PSTV29 (Takara Shuzo), pUC118 (Takara Shuzo), pPAl (Special ⁇ Showa 63-233798), pEG400 CJ. Bacteriol., 172, 2392 (1 990)] and pQE-30 (manufact
  • vectors using yeast as a host include, for example, YEpl3 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), Ycp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15, and the like. It is not limited to.
  • the vector using an animal cell as a host include, for example, pcDNAI, pcDM8 (commercially available from Funakoshi), pAGE107 [JP-A-3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (1990)], PAS3-3 (Japanese Hei 2-227075), pCDM8 (Nature, 329, 840, (1987)), pcDNAI / AmP (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J. Blochem., 101, 1307 (1987)), Examples include, but are not limited to, pAGE210. Any host cell that can express the target gene can be used as a host cell for preparing a transformant.
  • bacteria for example, Escherichia, Serratia, Corynepacterium, Plebipacterium, Pseudomonas, Bacillus, Micropacterium, etc.
  • yeasts yeasts (Krybium sp., Saccharomyces) Genus, Schizosaccharomyces, Trichosporon, Schiziomyces, etc.
  • animal cells Nonamarba cells, C0S1 cells, C0S7 cells, CH0 cells, etc.
  • plant cells insect cells (Sf9 cells, Sf21 cells, High5 cells, etc.) Etc.
  • Any method can be appropriately selected for introducing the recombinant vector into the host depending on the type of the host and the like.
  • Examples of the method for introducing into a bacterial host include a method using calcium ions and a protoplast method.
  • methods for introducing into yeast include an electroporation method, a spheroblast method, and a lithium acetate method.
  • Examples of the method for introducing animal cells include an electroporation method, a calcium phosphate method, a ribofusion method and the like.
  • the present invention further provides an embryo generated from a fertilized egg of a non-human mammal into which the above-described recombinant gene or recombinant vector of the present invention has been introduced, and the embryo or uterus or oviduct of a corresponding non-human mammal. It also relates to fetuses that have been transplanted and developed. These animals are transgenic non-human mammals that express inverted repeats of the target gene.
  • non-human mammal examples include an organelle, a cell, a tissue, and an organ of a non-human mammal, as well as a head, a finger, a hand, a foot, an abdomen, and a tail.
  • Non-human mammals include, for example, but are not limited to, mice, rats, hamsters, guinea pigs, egrets, dogs, cats, dogs, horseshoe, higgins, pusta, goats and monkeys It is not something to be done.
  • Non-human mammals are preferably rodent mammals such as mice, rats and guinea pigs, and mice or rats are particularly preferred.
  • mice examples include pure strains such as C57BL / 6 strain, DBA / 2 strain, BALB / c strain, and hybrid strains such as B6C3F1 strain and B6D2F1 strain, and closed colony strains such as ICR strain. And the like.
  • Examples of rats include Wistar, SD, and the like.
  • the transgenic non-human mammal of the invention may have a DNA that incorporates the inverted repeat of the target gene to be expressed at a particular site.
  • to be expressed at a specific site means that the inverted repeat sequence of a target gene can be expressed at a specific site such as a specific site in a cell, an organelle, a cell, a tissue or an organ.
  • An axon in a nerve cell or the like is fisted as the specific intracellular site.
  • the organelle include nucleus, mitochondria, Golgi apparatus, endoplasmic reticulum, ribosome, cell membrane, and the like.
  • Cells include, for example, mammalian hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, knee ⁇ cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, ( ⁇ skin cells, fibroblasts, Fibrocytes, muscle cells, fat cells, immune cells, megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells And any cells such as stem cells or cancer cells, etc.
  • tissue examples include any tissue in which the above cells are present, the brain (plano nucleus, basal sphere, hippocampus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, pineal gland, etc.) ), Spinal cord, pituitary, stomach, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, large intestine, small intestine, duodenum, rectum, blood vessels, thymus, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testis Ovary, placenta, uterus, bone, joints, etc. skeletal muscle and the like, also may be in blood cells, or cultured cells of the cell.
  • the organs heart, kidney, ⁇ , liver, spleen ani I can do it.
  • the transgenic non-human mammal of the invention has incorporated the inverted repeat of the target gene to express at a particular time.
  • specific time refers to a specific time from embryonic development, childbirth, development, etc., to death. Therefore, the specific period is any stage of embryo development, including the time when a foreign gene is introduced, and any time after the birth, which is hourly, daily, weekly, monthly, or yearly. Is also good.
  • transgenic non-human mammal of the present invention in order to express the inverted repeat sequence of the target gene at a specific time, a promoter region capable of expressing a protein at a specific time, a protein at a specific time, A transgenic non-human mammal having an inverted repeat sequence of a target gene is produced using an expression vector into which a signal sequence capable of expressing the target gene has been incorporated.
  • a protein expression induction system or to administer a protein expression inducer to a non-human mammal at a specific time. It is.
  • an inducible expression system using tetracytaline ecdysone can be used.
  • those administered are tetracycline or an analog thereof, respectively.
  • Exdison or its analogs Exdison or its analogs.
  • a cr e-1 o XP system using a recombinase is used.
  • the aforementioned resistance gene to antibiotics such as tetracycline, kanamycin, hygromycin, and puromycin into the expression vector. It is.
  • the arrangement of the resistance gene in the expression vector of the present invention is not particularly limited, it is usually preferable to arrange the resistance gene downstream of the reporter gene or its mutant gene, and upstream of the promoter region or signal sequence.
  • the transgenic non-human mammal of the present invention comprises a plant operable on mammalian cells. It can be produced by introducing a recombinant gene (hereinafter, also referred to as a transgene) containing an inverted repeat sequence of a target gene downstream of an oral motor sequence into a subject animal. Specifically, by introducing the transgene into a fertilized egg, JK stem cell, somatic cell, sperm, or unfertilized egg of the target non-human mammal, all the cells including the germ cell Thus, a transgenic non-human mammal integrated on the chromosome can be obtained.
  • a recombinant gene hereinafter, also referred to as a transgene
  • transgenes in fertilized eggs, embryonic stem cells, somatic cells, sperm, and unfertilized eggs should be present on the chromosome of all cells, including germ cells and somatic cells, of the non-human mammals of interest. Must be secured.
  • Progeny of this type of animal that has inherited the gene of a transgenic non-human mammal in which the gene has been integrated into the chromosome of all cells, including germ cells also have the gene.
  • a homozygous animal having the transgene on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing the male and female animals, it is confirmed that all offspring stably maintain the gene, and that they have the gene, It can be subcultured in normal breeding conditions.
  • the transgenic non-human mammal of the present invention is preferably used for fertilized eggs, fertilized eggs, spermatozoa, germ cells including their progenitor cells, etc., preferably in the early stage of embryogenesis in the development of non-human mammals. (More preferably, at the stage of a single cell or a fertilized egg cell, and generally before the 8-cell stage).
  • a fertilized egg used when a transgene is introduced into a fertilized egg of a target non-human mammal or its ancestor is obtained by crossing a male non-human mammal of the same species with a female non-human mammal.
  • fertilized eggs can be obtained by natural mating, it is preferable to artificially regulate the estrous cycle of female non-human mammals and then mate them with male non-human mammals.
  • Methods for artificially regulating the estrous cycle of female non-human mammals include, for example,
  • a preferred method is to administer follicle-stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin) and then luteinizing hormone (human chorionic gonadotropin), for example, by intraperitoneal injection.
  • the preferable amount and interval of administration of the hormone can be appropriately determined depending on the type of the non-human mammal.
  • transgene of the present invention can be obtained by introducing a transgene of interest into somatic cells by the above-described transfection method, and fusing this cell (or its nucleus) with the above-mentioned germ cell by a known cell fusion method.
  • Non-human mammals can also be created. 'The construction and construction method of the transgene is as described above in this specification. Transgene transfer at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ and somatic cells of the target animal.
  • the transgenic non-human mammal having the transgene is obtained by artificially transplanting and implanting the transgene into a female non-human mammal.
  • LHRH luteinizing hormone-releasing hormone
  • the method of artificially implanting and implanting is preferred.
  • the dose of LHRH or an analog thereof and the timing of mating with the male nonhuman mammal after the administration can be appropriately selected depending on the type of the nonhuman mammal and the like. Whether or not the introduced gene has been integrated into the genomic DNA can be confirmed by extracting DNA from the tail of the offspring and testing by Southern hybridization or PCR.
  • the presence of the transgene in the germ cells of the produced animal after the introduction of the transgene means that the progeny of the produced animal will retain the transgene in all of its germ cells and somatic cells.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the transgene have the transgene in all of its germ cells.
  • transgenic animals For details of transgenic animals, see, for example, Manipulating the Mouse Embryo (Brigid Hogan et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986), Gene Targeting,-A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press ( 1993), Biomanual Series 8, Gene Targeting, Generation of Mutant Mice Using ES Cells, Yodosha (1995), Developmental Engineering Manual, Transgenic 'Mice Making, Kodansha (1987), etc. Can be referenced.
  • RNAi effect In a transgenic non-human mammal that expresses the inverted repeat sequence of the target gene according to the present invention, expression of the target gene is expected to be suppressed by the RNAi effect. That is, the expression of a target gene is suppressed by introducing a recombinant gene containing an inverted repeat sequence of a target gene downstream of an enhancer sequence and a promoter sequence or a recombinant vector containing the recombinant gene into cells of a non-human mammal. A method for performing this is also within the scope of the present invention.
  • the model animal in which the function of the target gene is knocked out as described above is useful for functional analysis of a novel gene.
  • Example 1 Construction of transgene 5, INS 240 CE EGFP IR
  • a vector was prepared from a vector having a 240-residue insulator of the same sequence on both the 5 'and 3' sides of the Kuguchi-Jungsite. Subsequently, the results of the model experiments showed that the best results were obtained when an insulator sequence was inserted only on the 5th side of the transgene. Therefore, pUC19 5,3 'INS240 CE EGFP which has an insulator of 240 residues of the same sequence on both 5', 3 and 3 sides and an inverted repeat of EGFP downstream of the CMV enhancer and EFla promoter. By removing the 3 'insulator sequence inserted into the 3' end of the transgene, a transgene, 5 'INS 240 CE EGFP IR was constructed as follows.
  • PUC19 5 ', 3' INS240 Insulator sequence derived from chicken beta globin is divided into 10 fragments, chemically synthesized, and a 240 bp fragment ligated with DNA Ligase is multi-cloned into PUC19 vector.
  • site pCE-EGFP-1 Literature name: Takada, T., et al., Selective production oi transgenic mice using green fluoresent protein as a marker. Nature Biotech. 15: 458-461, 1997), inserted in two steps, ligated, and transformed into Escherichia coli J1109 strain to obtain plasmid PUC195, 3 'INS240 CE EGFP (Fig. 1). ).
  • the fragment containing the insulator sequence was cut from PUC195,, 3, and INS240 CE EGFP IR (Fig. 2) as follows.
  • PUC19 5 ', 3' INS240 CE EGFP IR was treated with Kpnl and Swal. Approximately 5.4 kbp of the DNA fragment obtained by electrophoresis confirmed pUC195 ', 3, INS240 CE EGFP IR / Kpnl and Swal vectors. Furthermore, after dephosphorylation treatment with BAP to prevent self-ligation, phenol extraction, black-mouth extraction, and ethanol precipitation were performed to remove BAP.
  • Plasmid pEGFP-1 SwL in which a Linker having a Swal restriction enzyme site was inserted into the Af III restriction enzyme site of pEGFP- ⁇ (Clontech) was treated with Kpnl and Swal, After electrophoresis on a gel, a DNA fragment of about 1. Okbp was cut out and used as a Kpnl-Swal fragment (Fig. 2).
  • PUC195 5,, 3, INS240 CE EGFP IR / Kpnl, Swal vector and Kpnl-Swal fragment were ligated using DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara), E. coli SURE2 strain was transformed, EcoT22I and Swal Positive clones were obtained by screening according to the fragment length of DNA treated with Notl. After confirming the DNA sequence, it was named PUC19 5 'INS240 CE EGFP I ⁇
  • a transgene having an EGFP antisense sequence was constructed downstream of the same insulator, CMV enhancer, and EF-1 ⁇ promoter.
  • Methods include removal of the IR sequence from PUC19 5 'INS240 CE EGFP and introduction of a KpnI restriction enzyme site, and introduction of an EGFP antisense strand between EcoRI and KpnI. The method is described below.
  • Plasmid DNA, pUC195 5 'INS240 CE EGFP IR was treated with Notl to obtain pUC195, INS240 CE EGFP IR / Notl vector. Furthermore, after dephosphorylation treatment with CIAP to prevent self-ligation, phenol extraction, extraction with chloroform, and ethanol precipitation were performed for purification.
  • PUC195, INS 240 CE EGFP IR / Notl vector and Kpnl Linker with Kpnl restriction enzyme site were ligated with DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara), E. coli JM109 was transformed, and Kpn I site was introduced.
  • the plasmid pUC19 5 'INS240 CE KpL was obtained.
  • pUC19 5 'INS240 CE KpL was treated with EcoRI and Kpnl, an agarose gel electrophoresis fragment was cut out and collected, and used as a PUC195 5' INS240 CE KpL / EcoRI, Kpnl vector.
  • CIAP was dephosphorylated, followed by phenol extraction, black-mouthed form extraction, and ethanol precipitation to remove CIAP.
  • LITMUS28 EGFP constructed by inserting an EGFP marker gene into Litmus28 was treated with EcoRI and Kpnl. After electrophoresis on an agarose gel, a LITMUS28 EGFP / EcoRI-Kpnl DNA fragment was obtained (FIG. 3).
  • PUC195, INS240 CE EGFP IR plasmid DNA was prepared in large quantities by the alkaline lysis method. This plasmid was treated with EcoT22I and Swal, a DNA fragment of about 3.7 kbp was separated by agarose gel electrophoresis, and recovered by electroelution. Furthermore, purification was performed by extraction with phenolic lip form and lip form and ethanol precipitation. After further purification by ultracentrifugation, it was diluted to 1.5 ng / ml with PBS (-) '. This solution was filtered through a 0.22 m diameter filter to obtain a transgene fragment.
  • PUC195, INS240 CE EGFP AS plasmid DNA was prepared in large quantities by the alkaline lysis method. This plasmid was treated with EcoT22I and Swal, a DNA fragment of about 2.9 kbp was separated by agarose gel electrophoresis, and recovered by electroelution. The product was further purified by phenol-form-form extraction, form-form extraction and ethanol precipitation. After further purification by ultracentrifugation, it was diluted to 1.2 ng / ml with PBS (-). This solution was filtered through a 0.22 ⁇ diameter filter to obtain a transgene fragment.
  • Example 3 Examination of expression of RNAi effect in early mouse embryo
  • RNAi effect in early mouse embryos was examined by the following method.
  • (1) Production of fertilized eggs-Fertilized eggs were produced according to the method of Toyoda et al. (1971) In vitro fertilization. That is, female mice were intraperitoneally injected with PMSG and hCG (5 units) at 48-hour intervals, then eggs were collected at 16-18 hours, and EGFP transgenic mice (Masaru Okabe, et al, FEBS Letters 407 ( 1997) 313-319) Sperm (sperm collected about 1.5 hours before egg collection) was inseminated (about 100-150 sperm1).
  • pronuclear stage fertilized eggs were cryopreserved by a simple vitrification method according to the method of Nakao et al. (1997).
  • the frozen fertilized eggs were thawed before the experiment and subjected to a microinjection operation.
  • Microinjection of the transgene into the fertilized egg pronucleus was performed according to the method of Katsuki et al. (1987).
  • the fertilized eggs were transferred to droplets of modified Witten's medium (m ⁇ medium), and for intranuclear injection, the male pronucleus was confirmed under a phase-contrast microscope (Invert Scope D: Zeiss), and the purified DNA solution was washed. 2pl was injected.
  • For intracytoplasmic injection approximately 2 pl of DNA solution was injected into the cytoplasm.
  • Viable embryos are transferred to mWM medium and 5 ° /. C0 2, was further body outside cultured under conditions of 95% Air, 37 ° C.
  • Fig. 5 shows the fluorescence image (left column) and visible light image (right column) of the embryo three days after the transgene was injected into the pronucleus of the fertilized egg.
  • a is a fragment obtained by injecting an EGFP antisense sequence gene fragment
  • b is a fragment obtained by injecting an EGFP antisense sequence gene fragment
  • c is a fragment obtained by injecting no DNA.
  • the microinjected fertilized eggs are transferred to mWM medium, cultured at 5% CO 2 , 95% Air, and 37 ° C for 10 days.At the 2-cell stage, they are transferred to the oviduct of a pseudopregnant female ICR strain mouse. Transplanted. A cesarean section was performed 18 days later to obtain pups. ⁇ In the box (UVP, C-10), the obtained pups were irradiated with a 365 nm ultraviolet lamp (UVL, UVL-56) and EGFP fluorescence observation was performed. Microinjection of EGFP dsRA-expressing gene was performed. Among the pups obtained from the fertilized eggs, pups with reduced EGFP fluorescence were observed by visual observation of the body surface (Fig.
  • mice were bred under SPF environment.
  • blood was partially collected from the orbital venous plexus using heparin-attached blood collection tubes, peripheral blood mononuclear cells were separated using Lynholite M (CEDARLA E), and FACScan (BD)
  • CEDARLA E Lynholite M
  • BD FACScan

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子及ぴその利用 技術分野
本発明は、 標的遺伝子の逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子に関する。 より 詳細には、 本発明は、 標的遺伝子の逆向き反復配列を哺乳動物の細胞内で発現で きるように組み込んだ組み換え遺伝子に関する。 本発明は、 上記組み換え遺伝子 を用いて得られるトランスジエニック動物にも関する。 背景技術
従来の医薬品開発では、 最初に機能が明らかなタンパク質 （例えば、 インター フエロン を体内から見つけ、この D N Aを単離する方法で研究を行って来た。 近年においては、 ゲノム解析計画の推進によって D N Aの配列決定技術が急速に 進歩した。 cD NA解析における最近の方法では、最初に D NAを単離して配列を 決定し、 次の段階で、 D NAデータベースに登録されている公知の配列と似てい る力否かで D NAの機能を推定する。 そして、 更に次の段階で、 実際に、 蛋白レ ベル、 さらには、 個体 （主として哺乳類実験動物） レベルにおける D NAの機能 を解明している。 これまで、 個体レベルにおける D NAの機能解明においては、 遺伝子ノックアウト動物を作成し、 その表現型を解析するという方法で行われて きた。 しかしながら、 このノックアウト法は多大な労力と時間がかかり、 数多く の医薬品、または医薬品のターゲットとなる候補蛋白の解析には実用的ではない。 従って、 これまでのノックアウト法より有効でかつ、 より簡便な、 動物個体での 遺伝子機能抑制方法が望まれている。
R NA i (R NAinterference) とは、 ある遣伝子 （ターゲット遺伝子とよぶ） の一部をコードする mR N Aの一部を二本鎖にした R N A (double stranded R N A : d s R NA) を細胞へ導入すると、 ターゲット遺伝子の発現が抑制される現 象を言う。 1 9 9 8年、 生体内への d s R N Aの導入が導入遺伝子と同じ遺伝子 の発現に対して抑制作用を持つことが、 線虫において発見された （Fire et al. , 1998) 0その後、真菌類、植物 Nicotiana tabacciimと Oryza sativa、プラナリア、 卜リノ ノソーマ Trypanosoma brucei (Ngo, H. , Tschudi, C.， Gull, K. , and Ullu, E. )、ノヽェ Drosophila melanogaster (Kennerdell and Carthew, 1998) 及び脊椎 動物であるゼブラフィッシュでも観察され、 R NA iは種を越えて普遍的に存在 する現象であると考えられるようになった。 哺乳類ではマウスの初期胚 （Wianny and Zernikca-Goetz, 2000) において作用が報告されている。 R NA iの阻害作 用の分子機構は解明されていないが、 線虫における遺伝学的解析から、 ego - 1、 mut- 2、 mut- 7、 mut-8、 mut- 9、 red- 1、 rde- 2、 rde-4等の遺伝子の関与が報告さ れている (Grishok et al. , 2000)。
R NA iの技術的応用については， 線虫において、 遺伝子ノックアウト技術と して確立し、線虫全ゲノム配列決定計画により得られた全塩基配列情報を用いた、 ゲノム機能解析の主要な手段として利用されている（Fraser et al. , 2000 ; Gonczy et al. , 2000)。 哺乳動物のゲノム機能解析においても、 遺伝子ノックアウトより 時間的、 労力的に負担の少ない方法として、 効率的な遺伝子発現抑制の方法とし て期待されている。
しかし現在までの所、 d s R NAの導入方法として、 哺乳動物の実験動物 （例 えば、 マウス等） においては、 d s R N Aを直接注入する非遺伝的な方法しか報 告されておらず （Wianny and Zernikca-Goetz, 2000)、 従来の遺伝子破壌技術の 完全な代替はできていない。 すなわち、 受精卵へ d s R NAを直接注入すると、 細胞が分裂すると共に各細胞内の d s R NAが希釈され、 効率的に遺伝子抑制が 起らなくなってしまうと考えられている。
線虫 (Travernarkaris et al.， 2000) やショウジョウノくェ (Kennerdell and Carhtew, 2000) では、 逆方向反復配列を持つ遺伝子を導入し、生体内でヘアピン 構造の d s R NAを転写し、 R NA i発現を起こすトランスジヱニック動物の作 成が成功している。 このような遺伝的な方法の確立が哺乳動物においても期待さ れているが、 これまでのところ、 成功には至っていないのが現状である。 発明の開示
本発明は、 マウスなどの哺乳動物細胞で R NA iが長期にわたり効果を持つよ うに、 d s R NAの導入方法を改良することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 外来性リボー タ1 "~逾伝ナとし一し、 Jinnanced green fluorescent protieh (EGFP)遣 is子 (Cormack et al.， 1996) を用い、 ニヮトリベータグロビン遺伝子インスレーター酉己列の一 部 （240塩基対）、 CMVェンハンサー、 ヒト EFl aプロモーターの下流に EGFPの逆 向き反復配列を持ち、 さらに SV40ポリ A付加シグナルを持つ、導入遺伝子を構築 し、 この遺伝子を、 EGFP トランスジエニックマウスの受精卵へ導入し、 初期発生 過程における EGFP蛍光を検討したところ、発生が正常に進んでレ、るにもかかわら ず、 EGFPの蛍光が消失することを見い出した。 本発明はこれらの知見に基づいて 完成したものである。
即ち、 本発明によれば、 哺乳動物細胞で発現可能な標的遺伝子の逆向き反復配 列を含む組み換え遺伝子が提供される。
本発明の好ましい態様によれば、
哺乳動物細胞で作動可能なプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆向き反復 配列を含む組み換え遺伝子；
プロモーター配列の上流にェンハンサー配列を含む上記組み換え遺伝子； さらにィンスレーター配列又はその一部を含む、 上記組み換え遺伝子； 標的遺伝子の逆向き反復配列の下流にポリ A付加シグナル配列を含む、 上記組 み換え遺伝子；
標的遺伝子が、 外来性レポータータンパク質またはその変異タンパク質の遺伝 子である、 上記組み換え遺伝子；並びに .
外来'！"生レポータータンノ ク質カ S、 Enhanced green fluorescent protien (EGFP) である、 上記組み換え遺伝子；
が提供される。 本発明の組み換え遺伝子は好ましくは、 トランスジヱニック非ヒト哺乳動物の 作成のために使用することができ、 非ヒト哺乳動物は好ましくは、 マウス、 ラッ ト、ハムスター、 モルモット、 ゥサギ、 ィヌ、ネコ、 ゥマ、 ゥシ、 ヒッジ、 ブタ、 ャギおよびサルから成る群から選,ばれる非ヒト哺 動物である。
本発明の別の側面によれば、 上記した本発明の組み換え遺伝子を含む組み換え ベクターが提供される。
本宪明のさらに別の側面によれば、 上記した組み換えベクターを有する形質転 換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の組み狭え遺伝子又は組み 換えべクタ一を導入した非ヒト哺季 L動物の受精卵から発生した胚が提供される。 本発明のさらに別の側面によれば、 上記の胚を、 対応する非ヒト哺乳動物の子 宫または卵管へ移植して発生させた胎児が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 標的遺伝子の逆向き反復配列を発現する、 トランスジエニック非ヒト哺乳動物又はその子孫又はそれらの一部が提供される。 本発明の好ましい態様によれば、
標的遺伝子の逆向き反復配列を特定の部位で発現するように組み込んだ D NA を有する、 上記したトランスジヱニック非ヒト哺乳動物又はその子孫又はその一 部；
標的遺伝子の逆向き反復配列を特定の時期に発現するように組み込んだ D NA を有する、 上記したトランスジエニック非ヒト哺乳動物又はその子孫又はその一 部；
標的遺伝子の逆向き反復配列が、 外来性レポータータンパク質またはその変異 タンパク質の遺伝子の逆向き'反復配列である、 上記したトランスジエニック非ヒ ト哺乳動物又はその子孫又はその一部が提供される。
本発明において好ましくは、非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、ハムスター、 モノレモッ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥマ、 ゥシ、 ヒッジ、 ブタ、 ャギおよぴサノレ から成る群から選ばれる非ヒト哺乳動物である。 本発明のさらに別の側面によれば、 ェンハンサー配列及びプロモーター配列の 下 に標的遺伝芋の逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子又は当該組み換え遺伝 子を含む組み換えべクターを非ヒト哺乳動物の細胞に導入することを含む、 標的 遺伝子の癸現を抑制する方法が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 EGFP逆向き反復配列遺伝子を含むプラスミドの構築を示す図である。 図 2は、 5， INS240を含む EGFP逆向き反復配列遺伝子を含むプラスミドの構築 を示す図である。
図 3は、 アンチセンス鎖 EGFPを含むプラスミドの構築を示す図である。
図 4は、 EGFP dsRNA発現導入遺伝子断片 （3 . 7 k b ) の構造 （上段） と EGFP アンチセンス RNA発現導入遺伝子断片 （3 . O k b ) の構造 （下段） を示す図で ある。
図 5は、 受精卵前核へ導入遺伝子を注入した後の胚の蛍光画像 （左列） 及ぴ可 視光画像 （右列） を示す。
図 6は、体表面において EGFP蛍光が減少したマウスを示す。 誕生後 1〜 日の 仔マウスに 365nm紫外線ランプを照射し、 喑箱中で観察したところ、 体表面にお いて EGFP蛍光が減少したマウスが観察された。 図中、 3匹の仔マウスの中で中央 のマウスが減光マウスである。
図 7は、体表面で EGFP蛍光が減少したマウスリンパ球の EGFP蛍光観察を示す。 マウス No. HIR - 1- 16L、 HIR-7-238L は R Ai発現が認められたマウスである。 マ ウス No. HIR- 1- 17L、 HIR- 7- 237Lは、 それぞれの同腹で、 RNAi効果が認められな かったマウスである Q ネガティブコントロールとして B6C3F1マウスを用いた。 図 8は、 体表面で EGFP蛍光が減少したマウスリンパ球の EGFP蛍光観察 （長期 飼育後の観察） を示す。 マウスは,図 7で用いたものと同一個体を用い、 図 7に示 した解析の 6ヶ月後に本解析を実施した。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の組み換え遺伝子は、 哺乳動物細胞で発現可能な標的遺伝子の逆向き反 復配列を含むことを特徴とする。 このような構造を有する組み換え遺伝子を哺乳 動物の細胞に導入することにより、 細胞内で標的遺伝子の逆向き反復配列を発現 させることができ、 これにより RNA i (RNAinterference) 効果により標的 遺伝子の発現を抑制することが可能になる。
逆向き反復配列とは、 標的遺伝子並びにその逆向きの配列が適当な配列を介し て並列している配列を言う。 具体的には、 標的遺伝子が、 以下に示す n個の塩基 配列から成る 2本鎖を有する場合、
5, -XXX2 Xn_xXn- 3 '
3' ~Y^2 Υ„-ιΥ„~ 5'
その逆向き配列は以下の配列を有する。
5 ' 一 Υ2Υ「3'
3， -ΧηΧη_1 Χ2Χ「5，
(ここで、 Xで表される塩基と Υで表される塩基において、 添え字の数字が同じ ものは互いに相捕的な塩基である）
逆向き反復配列は上記 2種の配列が適当な配列を介して配列である。 逆向き反 復配列としては、 標的遺伝子の配列が逆向き配列の上流にある場合と、 逆向き配 列が標的遺伝子の配列の上流にある場合の 2つの場合が考えられる。 本発明で用 いる逆向き反復配列は上記の何れでもよいが、 好ましくは、 逆向き配列が標的遺 伝子の配列の上流.に存在する。
標的遺伝子の配列とその逆向き配列の間に存在する配列は、 R Ν Αに転写され た際にヘアピンループを形成する領域である。 この領域の長さは、 ヘアピンルー プを形成できる限り特には限定されないが、 一般的には、 O t pから 700 b p であり、 好ましくは 0〜300 b p程度、 より好ましくは 0〜 100 b p程度で ある。 この配列の中には制限酵素部位が存在していてもよレ、。 本発明で用いる標的遺伝子としては任意の遺伝子を使用できる。 本宪明の組み 換え遺伝子を用いてトランスジエニック動物を作成し、 R NA iによる遺伝子ノ ックアウトを意図する場合には、 標的遺伝子は発現を抑制することを意図する遺 伝子（ノックァゥトを意図する遺伝子）である。このような標的遺伝子としては、 クローニングはされているが機能が未知の遺伝子も含まれる。
あるいは、 標的遺伝子は、 外来性レポータータンパク質またはその変異タンパ ク質の遺伝子であってもよい。 このような外来性レポータータンパク質またはそ の変異タンパク質の遺伝子を標的遺伝子として使用した場合は、 本発明の組み換 え遺伝子を用いたトランスジエニック技術において R NA i効果を容易に検出及 び評価することができる。
外来性レポータータンパク質としては、 ェンハンスド ·グリーン · フルォレツ セント 'プロ.ティン (Enhanced green fluorescent protien)、 クリーン ' フノレオ レツセン卜 · プロテイン (Green fluorescent protien) s ェクオ ン、 クロラム フエニコーノレ · ァセチノレトランスフェラーゼ、 j3—ガラク トシダーゼ、 ノレシフェ ラーゼ、 j8—ダルクロニダーゼなどが挙げられる。
外来性レポータータンパク質の変異タンパク質としては、 上記した野生型のレ ポータータンパク質のアミノ酸配列中に 1〜複数個 （例えば 1〜 2 0個、 好まし くは 1〜1 0個、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸の置換、 欠失、 付加及び
/又は揷入を有するタンパク質であって、 好ましくは野生型のレポータータンパ ク質と同等以上の機能を維持している。
レポ一タータンパク質の変異タンパク質の遺伝子として具体的には、 レポータ 一タンパク質の遺伝子中の塩基配列の一部が欠損した遺伝子、 レポ一ター遺伝子 の塩基配列が他の塩基配列で置換された遺伝子、 レポータ一遺伝子の一部に他の 塩基配列が揷入された遺伝子などが用いられる。 欠損、 置換または付加を受ける 塩基の数は、 特に限定されないが、 通常、 1ないし 6 0個程度、 好ましくは 1か ら 3 0個程度、 より好ましくは 1ないし 1 0個程度である。 なお、 これらの変異 遺伝子は、 レポーター遺伝子'としでの機能を維持していることが望ましい。 変異タンパク質の遺伝子は、 化学合成、 遺伝子工学的手法、 突然変異誘発など の当業者に既知の任意の方法で作製することができる。 具体的には、 天然型レポ 一タータンパク質をコードする D NAに対して変異原となる薬剤を接触作用させ たり、 紫外線を照射したり、 あるいは P C R法などの遺伝子工学的手法を用いる ことにより変異タンパク質をコ一ドする遺伝子を取得することができる。 遺伝子 工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入 できる手法であることから特に有用であり'、 Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2^ ED. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.， 1989、 及び Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38， John Wi'ley & Sons (1987- 1997)等に記載の方法に準じて実施することができる。
本発明の組み換え遺伝子では、 哺乳動物で作動可能なプロモーター配列の下流 に標的遺伝子の逆向き反復配列が存在する。 このような構成をとることにより、 哺乳動物の細胞内において標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることが可能 になる。 即ち、 本発明の組み換え遺伝子では、 標的遺伝子の逆向き反復配列は上 記プロモーターの制御下に置かれるように配置されている。
本発明で用いるプロモータ一配列は、 哺乳動物で作動可能であれば特に限定さ れない。
このように非ヒト動物で発現可能なプロモーターとしては、 例えば、 ウィルス (例、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ゥ ィルスなど） 由来遺伝子プロモーター、 各種哺乳動物 （例えば、 ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モノレモット、 /、ムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモータ 一などが用いられる。 各哺乳動物由来のプロモーターとしては、 例えば、 アルプ ミン、 エンドセリン、 ォステオカル.シン、 筋クレアチンキナーゼ、 コラーゲン I 型および II型、サイタリック AM P依存タンパクキナーゼ β サブュニット（ザ. ジャ一ナノレ ·ォブ ·パイォロジカル 'ケミストリー （The Journal of Biological Chemistry) , Vol. 271,- No. 3, ppl638- 1644， 1996) N 心房ナトリゥム利尿性因子、 ドーパミン J3—水酸ィ匕酵素、ニューロフィラメント軽鎖（ザ'ジャーナル'ォプ ' バイオ口ジカノレ ·ケミス トリー（The Journal of Biological Chemistry)， Vol. 270, No. 43, pp25739-25745, 1995 および同 Vol. 272, No. 40, pp25112 - 25120， 1997)、 メタ_口チォネィン、メタ口プロティナーゼ 1糸且織ィンヒビタ一、平滑筋 αァクチ ン、 ポリペプチド鎖延長因子 1 a (E F— 1 α )、 β ァクチン、 αおよび ]3 ミオ シン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク、 血清アミロイド P コンポーネント、 レニンなどのプロモーターが用いられる。
上記以外にも、 例えば、 Molecular Medicine臨時増刊号、 マニュアル疾患モデ ルマウス ；山村研一、 '勝木元也、 相沢慎一編、 中山書店等の文献に記載されてい るプロモーターも使用することができる。
本発明で用いるのに好ましいプロモーターとしては、 本明細書の実施例で使用 した I ト EFl aプロモーターが挙げられるが、 それ以外にも以下のものが挙げら れる。
( 1 ) j3ァクチンプロモーター
一般的には C MVェンハンサ一と /3ァクチンプロモーターの糸且み合わせとして 使用される。 例え 、 pCAGGS ; chicken beta-actin promoter and cytomega丄 o virus enhancer, beta-actin intron and bovine globin poly-adenylation signal な ど。 引用文献としては、 H. Niwa, K. Yamanami, J. Miyazaki, Gene, 108, (1991) 193-199を参照。
( 2 ) C MVプロモーター
一般的には、 C MVェンハンサ一と C MVプロモーターの組み合わせとして使 用される。引用文献としては、 Janet A. Sawicki et al Experimental Cell Research 244, 367-369 (1998)を参照。
( 3 ) メタ口チォネインプロモーター
引用文献としては、 Establishment of Transgenic Mice Carrying Human Fetus - Specif ic CYP3A7 Yong Li, et al, Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 329, No. 2, 235-240, 1996を参照。
( 4 ) Apolipoprotein E プロモーター 胎児肝臓での発現を意図したプロモーター。引用文献としては、 Simonet et al. , 1993, J. Biol. Chem. , 268, 8221-8229を参照。
( 5 ) 導入したい遺伝子本来のプロモーター
この場合は、 ゲソムそのものを導入することにより トランスジエニックマウス を作成する場合が挙げられる。 引用文献としては、 0kamoto M.， et al. , J. Exp. Med. , 175, 71 (1992)を参照。
本発明の組み換え遺伝子は、 プロモーター配列の上流にェンハンサー配列を含 んでいてもよい。 使用できるェンハンサー配列としては上記した CMVェンハン サ一などが挙げられる。
本発明の組み換え遺伝子は、 ィンスレーター配列又はその一部を含ん いても ょレ、。インスレーター配列とは， トランスジエニック動物においては， 「位置効果」 からの遺伝子発現の抑制から守る遺伝子配列のことである。 近隣のシスエレメン トの影響に対するパリアとして期待されている。
ィンスレーター配列又はその一部の位置は特に限定されないが、導入遺伝子（即 ち、 標的遺伝子の逆向き反復配列） の 5 ' 側 （上流） に存在することが、 効果の 面から好ましい。 最も好ましくは、 インスレーター配列又はその一部は、 プロモ 一ター配列の上流，（又はェンハンサー配列が存在する場合にはその上流） に存在 する。
- 本発明で使用できるィンスレーター配列としては、 本明細書の実施例で使用し た-ヮトリベータグロビン由来インスレーター配列の他にも以下のものが挙げら れるが、 これらに限定されるものではない。
( 1 ) ショウジヨウバエ scsおよび scs，配列
Rebecca Kellum and Paul Schedl, Cell, Vol. 64, 941-950， March 8， 1991
( 2 ) ショウジヨウバエ gypsy トランスポゾンのインスレーター酉己歹 lj
Holdrige, C. , and D. Dorsett, 1991 Mol. Cell. Biol. 11： 1894 - 1900
( 3 ) ゥニァリルサルファターゼインスレータ配列
Koji Akasaka, et. al. , Cellular and Molecular Biology 45 ( 5 ) , 555 - 565， 1999 ( 4 ) ヒ ト T細胞レセプター α / δ遺伝子座 BEADエレメント
Zhong, X. P. , and M. S. Krangel, 1997 Proc. Natul. Acad. Sci. USA
( 5 ) ヒ トアポリポ蛋白 B- 100 (apoB) マトリックスアタッチメント部位
Namciu et al， 1998, Mol. Cell. Biol. 18： 2382-2391
本発明の組み換え遺伝子は、 標的遺伝子の逆向き反復配列の下流にポリ A付カロ シグナル配列を含んでいてもよい。 ポリ A付加シグナル配列を挿入することによ り、 目的とするメッセンジャー R NAの転写を終結することができる。
ポリ A付加シグナル配列の具体例としては、 SV40ポリ A付加シグナルなどが挙 げられるが、 これに限定されるわけではない。
本発明の発現べクタ一は、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って 製造することができる。
本発明はさらに、 上記した本発明による組み換え遺伝子を含む組み換えべクタ 一及ぴ該組み換えベクターを有する形質転換体にも関する。
細菌を宿主とする場合のベタターの具体例としては、例えば、 pBTrP2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもぺーリンガーマンハイム社より市販）、 pKK233-2 (Pharmacia社 製）、 pSE280 (Invitrogen社製）、 pGEMEX- 1 (Promega社製）、 pQE-8 (QIAGEN社製）、 pQE-30 (QIAGEN社製）、 pKYPIO (特開昭 58 - 110600)、 pKYP200 [Agrc. Biol. Chem.， 48， 669 (1984)〕ヽ PLSA1〔Agrc. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)〕、 pGELl〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82， 4306 (1985) ] .pBluescrlptll SK+,pBluescriptII SK (-) (Stratagene 社製）、 pTrS30 (FERMBP- 5407)、 pTrS32 (FERM BP- 5408)、 pGEX (Pharmacia社製）、 pET- 3 (Novagen社製）、 pTerm2 (US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、 pTP5、pC194、pUC18〔Gene， 33， 103 (1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28 (宝 酒造社製）、 PSTV29 (宝酒造社製）、 pUC118 (宝酒造社製）、 pPAl (特^昭 63-233798)、 pEG400 CJ. Bacteriol. , 172， 2392 (1990)〕、 pQE- 30 (QIAGEN社製）等が挙げられ るが、 これらに限定されるわけではない。
酵母を宿主とするベクターの具体例として、 例えば、 YEpl3 (ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 Ycp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等が挙げられるが、 これら に限定されるわけではない。
動物細胞を宿主とするベクターの具体例として、 例えば、 pcDNAI、 pcDM8 (フナ コシ社より市販）、 pAGE107 〔特開平 3- 22979 ; Cytotechnology, 3， 133, (1990)〕、 PAS3-3 ( 特 開 平 2 - 227075) 、 pCDM8 〔 Nature, 329, 840, (1987) 〕 、 pcDNAI/AmP (Invitrogen社製）、pREP4 (Invitrogen社製）、pAGE103 [J. Blochem. , 101, 1307 (1987)〕、 pAGE210等が挙げられるが、 これらに限定されるわけではない。 形質転換体を作成する際に使用する宿主細胞としては、 目的とする遺伝子を発 現できるものは全て用いることができる。 例えば、 細菌 （例えば、 エッシェリヒ ァ属、 セラチア属、 コリネパクテリゥム属、 プレビパクテリゥム属、 シユードモ ナス属、バチルス属、 ミクロパクテリゥム属等）、酵母 （クルイべ口ミセス属、 サ ッカロマイセス属、 シゾサッカロマイセス属、 トリコスポロン属、 シヮニォミセ ス属等）、 動物細胞 （ナマルバ細胞、 C0S1細胞、 C0S7細胞、 CH0細胞等）、 植物細 胞、 昆虫細胞 (Sf9細胞、 Sf21細胞、 High5細胞等）等を用いることができる。 組み換えベクターの宿主への導入方法は、 宿主の種類等に応じて任意の方法を 適宜選択できる。 細菌宿主への導入方法としては、 例えば、 カルシウムイオンを 用いる方法やプロトプラスト法等を挙げることができ、 酵母への導入方法として は、 例えば、 エレクトロポレーシヨン法、 スフヱロブラスト法又は酢酸リチウム 法など挙げることができ、 動物細胞べの導入方法としては、 例えば、 エレクトロ ポーレーシヨン法、 リン酸カルシウム法、 リボフヱクシヨン法等を挙げることが できる。
本発明はさらに、 上記した本発明の組み換え遺伝子又は組み換えベクターを導 入した非ヒト哺乳動物の受精卵から発生した胚、 並ぴにこの胚を、 対応する非ヒ ト哺乳動物の子宮または卵管へ移植して発生させた胎児にも関する。 これらの動 物は、 標的遺伝子の逆向き反復配列を発現するトランスジエニック非ヒト哺乳動 物である。
該非ヒト哺乳動物の一部としては、 非ヒト哺乳動物の細胞内小器官、 細胞、 組 織および臓器のほか、 頭部、 指、 手、 足、 腹部、 尾などが挙げられる。 非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、 ラット、ハムスター、モルモット、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥマ、 ゥシ、 ヒッジ、 プタ、 ャギおよぴサルなどが挙げら れるが、 これらに限定されるものではない。 非ヒト哺乳動物としてはマウス、 ラ ット、 モルモッ トなどの齧歯目の哺乳動物が好ましく、 マウス又はラットが特に 好ましい。 マウスとしては、 例えば、 純系としては C57BL/6系統、 DBA/2系統、 BALB/c系統などが挙げられ、 交雑系としては B6C3F1系統、 B6D2F1系統などが挙 げられ、 クローズドコロニーとしては、 ICR系統などが挙げられる。 ラットの具 体例としては、 例えば、 W i s t a r， S Dなどが挙げられる。
好ましい実施態様の一つにおいては、 本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳 動物は、 標的遺伝子の逆向き反復配列を特定の部位で発現するように組み込んだ D N Aを有していてもよい。
本明細書で言う 「特定の部位で発現するように」 とは、 細胞内特定部位、 細胞 内小器官、 細胞、 組織または臓器などの特定部位で標的遺伝子の逆向き反復配列 を発現し得ることをいう。
細胞内特定部位としては神経細胞等における軸索などが拳げられる。 細胞内小 器官としては、 例えば、 核、 ミ トコンドリア、 ゴルジ体、 小胞体、 リボソーム、 細胞膜などが挙げられる。 細胞とは、 例えば、 哺乳動物の肝細胞、 脾細胞、 神経 細胞、 グリア細胞、膝臓 β細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス 細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 （^皮細胞、 線維芽細胞、 線維細胞、 筋細胞、 脂肪細 胞、 免疫細胞、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳 腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞または ガン細胞などの細胞が挙げられる。 組織としては、 上記細胞が存在するあらゆる 組織、 脳 （扁祧核、 大脳基底球、 海馬、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 松果 体など）、 脊髄、 下垂体、 胃、 生殖腺、 甲状腺、 胆嚢、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 大腸、小腸、 十二指腸、 直腸、血管、胸腺、 顎下腺、末梢血、前立腺、 精巣、 卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などが挙げられ、また血球系細胞でもよく、 上記細胞の培養細胞でもよい。 臓器としては心臓、 腎臓、 腌臓、 肝臓、 脾臓が挙 げられる。 ，
好ましい実施態様の一つにおいては、 本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳 動物は、 標的遺伝子の逆向き反復配列を特定の時期に発現するように組み込んだ
D N Αを有していてもよい。
本明細書で言う 「特定の時期」 とは、 胚発生、 出産、 発生などから、 死亡まで のある特定の時期を指す。 したがって、 特定の時期としては、 外来遺伝子を導入 した時期を含めた胚発生の各ステージ、 生後から時間単位、 日単位、 週単位、 月 単位、 年単位の時期が経過したいずれの時期であってもよい。
本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物において、 標的遺伝子の逆向き反 復配列を特定の時期に発現させるためには、 特定の時期にタンパク質を発現し得 るプロモータ一領域、 特定の時期にタンパク質を発現し得るシグナル配列などを 組み込んだ発現べクタ一を用いて、 標的遺伝子の逆向き反復配列を有するトラン スジヱニック非ヒ ト哺乳動物を製造する。 , 標的遺伝子の逆向き反復配列を特定の時期に発現させるためには、 タンパク質 発現誘導系を構築したり、 特定の時期にタンパク質発現誘導剤を非ヒト哺乳動物 に投与することによつても可能である。 該タンパク質発現誘導系としては、 例え ば、 テトラサイタリンゃェクジソン（ecdysone)を利用した誘導発現システムを利 用することができ、 その際投与されるものは、 それぞれテトラサイクリンあるい はその類縁体、 ェクジソンあるいはその類縁体である。 また、 リコンビナーゼを 利用した c r e— 1 o X Pシステムなどが用いられる。
さらに、 標的遺伝子の逆向き反復配列を特定の時期に発現させるためには、 前 記したテトラサイクリン、 カナマイシン、 ハイグロマイシン、 ピューロマイシン などの抗生物質に対する耐性遺伝子などを発現べクターに組み込むことによって も可能である。 本発明の発現ベクターにおける該耐性遺伝子の配置は特に限定さ れないが、 通常、 レポーター遺伝子またはその変異遺伝子の下流、 プロモータ一 領域やシグナル配列の上流に配置するのが好ましい。
本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物は、 哺乳動物細胞で作動可能なプ 口モーター配列の下流に標的遺伝子の逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子 （以 下、 導入遺伝子とも称する） を対象動物に導入することによって作製できる。 具 体的には、 該導入遺伝子を対象となる非ヒト哺乳動物の受精卵、 JK性幹細胞、 体 細胞、 精子、 又は未受精卵へ導入することによって、 該遺伝子が胚芽細胞を含む すべての細胞の染色体上に組み込まれたトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得- ることができる。 受精卵、 胚性幹細胞、 体細胞、 精子、 未受精卵における導入遺 伝子の導入は、 対象の非ヒト哺季し動物の胚芽細胞および体細胞を含む全ての細胞 の染色体上に存在するように確保されなくてはならない。 . 該遺伝子が胚芽細胞を含むすべての細胞の染色体上に組み込まれたトランスジ エニック非ヒト哺乳動物の遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫は、 同様に該. 遺伝子を有する。 導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取 得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を安定に保 持し、 また、 該遺伝子を有することを確認して、 通常の飼育環境で繁殖継代する ことができる。
本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物の作成方法について以下により具 体的に説明する。
本発明のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物は、 受精卵、 受精卵、 精子おょぴ その始原細胞を含む生殖細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生 における胚形成初期の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階 で、 かつ一般に 8細胞期以前） に導入遺伝子を導入することによって作出するこ とができる。
導入遺伝子の構成及び構築法は本明細書中上記した通りである。
導入遺伝子を対象の非ヒト哺乳動物またはその先祖の受精卵に導入する際に用 いられる受精卵は、 同種の雄非ヒト哺乳動物と雌非ヒト哺乳動物とを交配させる ことによって得られる。 受精卵は自然交配によっても得られるが、 雌非ヒト哺乳 動物の性周期を人工的に調節した後、 雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ま しい。 雌非ヒト哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、 例えば初め に卵胞刺激ホルモン (妊馬血清性性腺刺激ホルモン）、次いで黄体形成ホルモン（ヒ ト絨毛性性腺刺激ホルモン） を例えば腹腔注射などにより投与する方法が好まし い。 好ましいホルモンの投与量及び投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類により適宜 決定できる。
導入遺伝子の導入法としては、 公知の方法 （例えば、 リン酸カルシウム法、 電 気パルス法、 リポフエクション法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パー ティクルガン法、 D E A E—デキストラン法など）を用いることができる。また、 上記した導入法により体細胞に目的とする導入遺伝子を導入し、 この細胞 （又は その核） を上述の生殖細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発 明のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物を作出することもできる。 ' 導入遺伝子の構成及び構築法は本明細書中上記した通りである。 受精卵細胞段 階における導入遺伝子の導入は、 対象動物の生殖細胞および体細胞のすべてに存 在するように確保される。
受精卵に導入遺伝子が導入された後、 雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植 ·着床 することにより、 導入遺伝子を有するトランスジヱニック非ヒト哺乳動物が得ら れる。黄体形成ホルモン放出ホルモン（L H R H)あるいはその類縁体を投与後、 雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、 受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒト 哺乳動物に、 導入遺伝子が導入された受精卵を人工的に移植 ·着床させる方法が 好ましい。 L HR Hあるいはその類縁体の投与量ならびにその投与後に雄非ヒト 哺乳動物と交配させる時期は非ヒト哺乳動物の種類等により適宜選択できる。 導入遺伝子がゲノム D N Aに組み込まれているか否かは、 産仔の尾部より D N Aを抽出し、 サザンハイブリダィゼーション又は P C R法等によって検定するこ とによって確認できる。
導入遺伝子の導入後の作出動物の生殖細胞において、 導入遺伝子が存在するこ とは、 作出動物の後代が、 その生殖細胞およぴ体細胞の全てに導入遺伝子を保持 することを意味する。 導入遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその生殖細 胞ぉよぴ体細^のすべてに導入遺伝子を有する。 導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を ¾配することによりす ての子孫が該導入遺伝子を有するように繁殖継 代することができる。 このようにして得られた子孫も本発明の動物に含まれる。 なお、 トランスジヱニック動物の作成の詳細については、例えば、 Manipulating the Mouse Embryo (Brigid Hogan et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986)、 Gene Targeting, - A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 バイオマニュアルシリーズ 8， ジーンターゲッティン グ， E S細胞を用いた変異マウスの作製， 羊土社 （1995)、発生工学実験マユユア ル， トランスジエニック 'マウスの作り方， 講談社 （1987)等を参照することがで きる。
本発明による標的遺伝子の逆向き反復配列を発現するトランスジエニック非ヒ ト哺乳動物においては、 R NA i効果により、 標的遺伝子の発現は抑制されてい ることが期待される。 即ち、 ェンハンサー配列及びプロモーター配列の下流に標 的遺伝子の逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子又は当該組み換え遺伝子を含む 組み換えベクターを非ヒト哺乳動物の細胞に導入することを含む、 標的遺伝子の 発現を抑制する方法も本発明の範囲内である。
.上記したような標的遺伝子の機能がノックアウトしているモデル動物は、 新規 遺伝子の機能解析などに有用である。
本出願の優先権主張の基礎となる出願である特願 2 0 0 1 - 4 6 0 8 9号の明 細書に開示した内容は全て引用により本明細書に開示したものとする。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されることはない。 実施例
実施例 1 ：導入遺伝子 5， INS 240 CE EGFP IRの構築
ィンスレーター検討における初期の研究において、ク口一ユングサイトの 5'側、 3'側両方に同じ配列の 240残基のインスレーターを持つベクターから作製した。 その後、 モデル実験の結果から、 導入遺伝子の 5， 側のみにインスレーター配列 を揷入したときが最も有効であると示唆する結果を得た。 従って、 5'側、 3，側両 方に同じ配列の 240残基のインスレーターを持ち、 CMVェンハンサー、 EFl aプロ モーター下流に EGFPの逆向き反復配列を持つ pUC19 5， 3 ' INS240 CE EGFP か ら導入遺伝子の 3 ' 末端に挿入されていた 3 ' インスレーター配列を除くことに より、 導入遺伝子である 5 ' INS 240 CE EGFP IRを下記の通り構築した。
PUC19 5' , 3' INS240 (ニヮトリベータグロビン由来インスレーター配列の遺 伝子を 10本のフラグメントに分けて化学合成後、 D N A Ligaseで結合させた 240 塩基対のフラグメントを PUC19ベクターのマルチクローニングサイトへ揷入した ベクター）の XhoI'、 Afl II部位へ pCE - EGFP- 1 (文献名： Takada, T.，他、 Selective production oi transgenic mice using green f luoresent protein as a marker. Nature Biotech. 15： 458-461, 1997) の Xhol - Afl II 間断片を 2段階で挿入 して、 ライゲーシヨンし、 大腸菌 J1109株をトランスフォームして、 プラスミ ド PUC19 5，， 3' INS240 CE EGFPを得た （図 1 )。
PUC19 5，， 3， INS240 CE EGFPの Kpnl、 Sail切断部位へ Litmus28 EGFPの Kpn I-Xho I断片を挿入後、 ライゲーシヨンし、 大腸菌 SURE2株 （ストラタジーン社） をトランスホームして、逆向き反復配列を持つプラスミド、 PUC19 5' ， 3' INS240 CE EGFP IRを得た （図 1 )。
PUC19 5， ， 3， INS240 CE EGFP IRから 3， インスレーター配列を含む断片を切 断 （図 2 ) は以下の通り行なった。
PUC19 5' , 3' INS240 CE EGFP IRを Kpnlと Swalにより処理した。 電気泳動の 約 5. 4kbpの D N A断片により， pUC19 5' , 3， INS240 CE EGFP IR/Kpnl, Swalベ クタ一を確認した。 さらに、 セルフライゲーシヨンを防ぐため BAPにより脱リン 酸ィ匕処理した後、 フエノール抽出、 クロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿を行い、 BAPを除去した。
pEGFP-Ι (クロンテック） の Af III制限酵素部位に、 Swal制限酵素部位を持つ Linkerを挿入したプラスミド pEGFP- 1 SwLを Kpnlと Swalで処理し、 ァガロー ゲルで電気泳動し、約 1. Okbpの D N A断片を切り出し、 Kpnl-Swal断片とした（図 2 )。
PUC19 5， ，3， INS240 CE EGFP IR/Kpnl, Swalベクターと Kpnl - Swal断片とを D NA Ligation Kit ver. 2 (Takara) を用いてライゲーシヨンし、 大腸菌 SURE2 株をトランスフォームして、 EcoT22Iと Swal, Notlで処理した D NAの断片長に よるスクリ一ユングによりポジティブクローンを得た。 D NAの配列を確認後、 PUC19 5' INS240 CE EGFP I と命名した ^
逆向き反復配列のコントロールとして、 同様のインスレーター、 CMVェンハン サー、 EF- 1 αプロモーターの下流に、 EGFPアンチセンス配列を持つ導入遺伝子を 構築した。 方法は、 PUC19 5' INS240 CE EGFP からの IR配列の除去と Kpn I 制限酵素部位の導入、 および、 Eco RI-Kpn I間への EGFPアンチセンス鎖の導入 である。 その方法を以下に示す。
先ず、 EGFP逆向き反復配列遺伝子断片の切断と Kpnl リンカ一の揷入 （図 3 ) を以下の通り行なった。
プラスミド D NA， pUC19 5' INS 240 CE EGFP IRを Notlにより処理し、 pUC19 5， INS 240 CE EGFP IR/Notlベクターとした。 さらに、 セルフライゲ一ションを 防ぐため CIAPにより脱リン酸化処理後、 フエノール抽出、 クロ口ホルム抽出、ェ タノール沈殿を行い、 精製した。
PUC19 5， INS 240 CE EGFP IR/Notl ベクターと Kpnl制限酵素部位を持つリン カー Kpnl Linker を D NA Ligation Kit ver. 2 (Takara) でライゲーシヨンし、 大腸菌 JM109をトランスフォームし、 Kpn Iサイトを導入したプラスミド pUC19 5' INS240 CE KpLを得た。
次に、 pUC19 5' INS240 CE KpLを EcoRI， Kpnlで処理し、 ァガロースゲル電気 泳動断片を切り出し回収し、 PUC19 5' INS240 CE KpL/EcoRI, Kpnlベクターとし た。 さらに， 次の操作でのセルフライゲーシヨンを防ぐため CIAPにより脱リン酸 化処理した後， フエノール抽出、 クロ口ホルム抽出、エタノール沈殿を行い、 CIAP を除去した。 Litmus28へ EGFPマーカー遺伝子を挿入し構築した LITMUS28 EGFP を EcoRI と Kpnlで処理した。ァガロースゲルで電気泳動し、 LITMUS28 EGFP/EcoRI- Kpnl D N A断片を得た （図 3 )。
PUC19 5， INS240 CE KpL/EcoRI— Kpnlベクターと LITMUS28 EGFP/EcoRI-Kpnl EGFP 断片を D NA Ligation Kit ver. 2を用いてライゲーシヨンし、 J 109大腸菌をト ランスフォームし、 BsrGIと Swalによる制限酵素断片長によるスクリーニングに より、 ポジティブクローンを得た。 さらにシークェンシングにより配列を確認し た。 このプラスミドを， pUC19 5' INS240 CE EGFP ASと命名した。 実施例 2 ：導入遺伝子断片の調製
( 1 ) EGFP逆向き反復配列遺伝子断片の調製 （図 4の上段の図）
PUC19 5， INS240 CE EGFP IRプラスミ ド D N Aを、 アルカリ溶解法により大量 調製した。 このプラスミドを、 EcoT22Iおよび Swalで処理し、 ァガロースゲル電 気泳動により約 3. 7kbpの D N A断片を分離後、 電気溶出法により回収した。 さら にフエノールク口口ホルム、 クロ口ホルム抽出及びエタノール沈殿により精製し た。 超遠心分離によりさらに精製後， PBS (-) 'で 1. 5ng/mlになるように希釈した。 この溶液を 0. 22 m径のフィルターでろ過し、 導入遺伝子断片とした。
( 2 ) EGFPアンチセンス配列遺伝子断片の調製 （図 4の下段の図）
PUC19 5， INS240 CE EGFP ASプラスミド D NAを、 アルカリ溶解法により大量 調製した。 このプラスミドを、 EcoT22Iおよび Swalで処理し、 ァガロースゲル電 気泳動により約 2. 9kbpの D N A断片を分離後、電気溶出法により回収した。 さら にフエノールクロ口ホルム、 クロ口ホルム抽出及びエタノール沈殿により精製し た。 超遠心分離によりさらに精製後、 PBS (-)で 1. 2ng/mlになるように希釈した。 この溶液を 0. 22 μ ΐη径のフィルターでろ過し、 導入遺伝子断片とした。 実施例 3 ：マウス初期胚における R NA i効果発現の検討
マウス初期胚における R NA i効果発現の検討は以下に示す方法で行った。 ( 1 ) 受精卵の作出 - 受精卵の作出は、 豊田らの手法に従い （1971) 体外受精で行った。 すなわち、 メスマウスに 4 8時間間隔で PMSG及ぴ hCG(5単位）を腹腔内注射し、その後 16-18 時間に卵子を採取し、 EGFP トランスジエニックマウス（Masaru Okabe, et al, FEBS Letters 407 ( 1997 ) 313-319) 精子 （卵子採取の約 1. 5時間前に精子採取） を 媒精した（約 100-150精子 1)。媒精約 6時間後に卵子の第 2極体の放出と雌雄 両前核の有無を確認し、 受精卵のみを選抜した。 得られた前核期受精卵は中尾ら の手法 （1997) に従って、 簡易ガラス化法を用い凍結保存した。 凍結された受精 卵は実験前に融解し、 顕微注入操作に供した。
( 2 ) 導入遺伝子の顕微注入
受精卵前核への導入遺伝子の顕微注入は， 勝木らの手法 （1987) に従って行つ た。 受精卵は修正ウィッテン培地 （m丽培地） の液滴に移し， 核内注入では、 位 相差顕微鏡 （Invert Scope D： Zeiss 社） 下で雄性前核を確認した後、 精製した D NA溶液を約 2pl注入した。細胞質内注入では、細胞質内に D N A溶液を約 2pl 注入した。 生存胚は mWM培地に移し， 5°/。C02， 95% Air, 37°Cの条件下でさらに体 外培養した。
( 3 ) 発生中の胚における EGFP発現の観察
各発生段階にある胚を、 mMW培地に移した後，蛍光実体顕微鏡 (MZ.FL III, Leica 社） を用いて EGFPの発現を観察し、 撮影を行った。
受精卵前核へ導入遺伝子をインジェクションした日から 3日後における胚の蛍 光画像 （左列） 及び可視光画像 （右列） を図 5に示す。
この時、 胚の発生段階は morulaであった。 図 5において、 aは EGFP逆向き反 復配列遺伝子断片、 bは EGFPァンチセンス配列遺伝子断片を注入したもの、 c は D NAをインジェクションしなかったものである。
胚は発生に伴い、 2日後から EGFPの蛍光が観察されはじめた。 EGFP逆向き反 復配列遺伝子断片を注入した胚において、 EGFP蛍光の消失が観察された （図 5の a )0 実施例 4 ：マウス個体における R NA i効果発現の検討
マウス個体における R NA i効果発現の検討は、 以下に示す方法で行った。
( 1 ) 受精卵の作出及び導入遺伝子の顕微注入 ' 受精卵の作出及び導入遺伝子の顕微注入は、 位相差顕微鏡 （DMIRB： Leica社） を使用し、 その他は、 実施例 3と同様の方法で行った。 即ち、 EGFP トランスジェ ニックマウス精子を用いて得た受精卵前核へ精製した DM溶液を 2pl 入した。
( 2 ) マウス個体における RNAi効果発現の検討
顕微注入した受精卵は mWM培地に移し、 5%C02、 95% Air, 37°Cの条件で一晚培 養し、 2細胞期の段階で、 偽妊娠の雌 ICR系統マウスの卵管へ移植した。 18日後 に帝王切開を行い、 仔マウスを取得した。 喑箱 （UVP社、 C-10型） 中、 得られた 仔マウスに 365nm紫外線ランプ （UVP社 UVL- 56型） を照射し、 EGFP蛍光観察を行 つたところ、 EGFP dsR A発現遺伝子を顕微注入した受精卵から得た仔マウスの中 に、 体表面の目視において、 EGFP蛍光が減少した仔マウスが認められた （図 6、 長波長紫外線により生ずる Blue hazeを除去する為、 紫外線用安全メガネをフィ ルターとして使用し、 Panasonicデジタルビデオカメラを用いて撮影した）。一方、 アンチセンス RNA発現遺伝子を顕微注入した受精卵から得た仔マウスには、 EGFP 蛍光が減少した仔マゥスは認められなかつた。 ―
( 3 ) R NA i効果発現マウスの解析
仔マウスは SPF環境下で飼育した。 3週齢以降のマウスについて、 へパリン付 着採血管を用いて眼窩静脈叢から部分採血し、 リンホラィト M (CEDARLA E社） を 用いて末梢血単核球細胞を分離し、 FACScan (BD社） により解析を行った。 この 結果、 EGFP蛍光が減少したリンパ球細胞群の存在を確認した （図 7 )。 この EGFP 蛍光の減少は、 長期に渡って飼育した後のマウスリンパ球においても確認された
(図 8 )。 . 産業上の利用の可能性 本発明の手法により、 新規遺伝子の遺伝子機能を胎児又は実験動物個体で解析 する場合、 従来のノックアウト法よりも迅速に結果を得ることができ、 疾病等の 関連遺伝子の解析、 医薬品のターゲット遺伝子の解析等において産業上有用であ る。

Claims

請求の範囲
I . 哺乳動物細胞で発現可能な標的遺伝子の逆向き反復配列を含む組み換え 遺伝子。 '
' 2 . 哺乳動物細胞で作動可能なプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆向 き反復配列'を含む、 請求項 1に記載の組み換え遺伝子。
3 . プロモーター配列の上流にェンハンサー配列を含む、 請求項 1又は 2に 記載の組み換え遺伝子。
4 . さらにインスレーター配列又はその一部を含む、 請求項 1力 ら 3の何れ かに記載の組み換え遺伝子。，
5 . 標的遺伝子の逆向き反復配列の下流にポリ A付カ卩シグナル配列を含む、 請求項 1から 4の何れかに記載の組み換え遺伝子。
6 . 標的遺伝子が、 外来性レポータータンパク質またはその変異タンパク質 の遺伝子である、 請求項 1力 ら 5の何れかに記載の組み換え遺伝子。
7 . 外来千生レポータータンノくク質力 S、 Enhanced green fluorescent protien (EGFP) である、 請求項 6に記載の組み換え遺伝子。
8 . トランスジヱニック非ヒト哺乳動物の作成のために使用する、 請求項 1 から 7の何れかに記載の組み換え遺伝子。
9 . 非ヒト哺乳動物が、マウス、 ラット、ハムスター、モルモット、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥマ、 ゥシ、 ヒッジ、 プタ、 ャギおよぴサルから成る群から選ばれ る非ヒト哺乳動物である、 請求項 8に記載の組み換え遺伝子。
1 0 . 請求項 1カゝら 9の何れかに記載の組み換え遺伝子を含む組み換えべク ター。
I I . 請求項 1 0に記載の組み換えべクターを有する形質転換体。
1 2 · 請求項 1カゝら 9の組み換え遺伝子又は請求項 1 0に記載の組み換えべ クターを導入した非ヒト哺乳動物の受精卵から発生した胚。
1 3 . 請求項 1 2に記載の胚を、 対応する非ヒト哺乳動物の子宫または卵管 へ移植して^生させた胎児。
1 4 . 標的遺伝子の逆向き反復配列を発現する、 トランスジヱニック非ヒト 哺乳動物又はその子孫又はそれらの一部。
1 5 . 標的遺伝子の逆向き反復配列を特定の部位で発現するように組み込ん だ D NAを有する、 請求項 1 4に記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物又は その子孫又はその一部。 '
1 6 . 標的遺伝子の逆向き反復配列を特定の時期に発現するように組み込ん だ D NAを有する、 請求項 1 4又は 1 5に記載のトランスジエニック非ヒト哺乳 動物又はその子孫又はその一部。
1 7 . 標的遺伝子の逆向き反復配列が、 外来性レポータータンパク質または その変異タンパク質の遺伝子の逆向き反復配列である、 請求項 1 4から 1 6の何 れかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物又はその子孫又はその一部。
1 8 . 非ヒト哺乳動物が、 マウス、 ラット、ノヽムスター、 モルモット、 ゥサ ギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥマ、 ゥシ、 ヒッジ、 プタ、 ャギおよびサルから成る群から選 ばれる非ヒト哺乳動物である、 請求項 1 4から 1 7の何れかに記載のトランスジ エニック非ヒト哺乳動物又はその子孫又はその一部。 ■
1 9 . ェンハンサー配列及びプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆向き 反復配列を含む組み換え遺伝子又は当該組み換え遺伝子を含む組み換えベクター を非ヒト哺乳動物の細胞に導入することを含む、 標的遺伝子の発現を抑制する方 法。
PCT/JP2002/001554 2001-02-22 2002-02-21 Gene recombinant contenant une sequence de repetition inversee et utilisation correspondante WO2002066638A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/296,243 US20040010130A1 (en) 2001-02-22 2002-02-21 Recombinant gene containing inverted repeat sequence and utilization thereof
JP2002566344A JP3765574B2 (ja) 2001-02-22 2002-02-21 逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子及びその利用
EP02700672A EP1371727A4 (en) 2001-02-22 2002-02-21 RECOMBINANT GENE CONTAINING A REVERSE REPETITION SEQUENCE AND USE THEREOF

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001046089 2001-02-22
JP2001-46089 2001-02-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002066638A1 true WO2002066638A1 (fr) 2002-08-29

Family

ID=18907778

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2002/001554 WO2002066638A1 (fr) 2001-02-22 2002-02-21 Gene recombinant contenant une sequence de repetition inversee et utilisation correspondante

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20040010130A1 (ja)
EP (1) EP1371727A4 (ja)
JP (1) JP3765574B2 (ja)
WO (1) WO2002066638A1 (ja)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003042382A1 (fr) * 2001-11-14 2003-05-22 Gencom Corporation Cellules es a effet arni accru
WO2003046186A1 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Toudai Tlo, Ltd. siRNA EXPRESSION SYSTEM AND METHOD FOR PRODUCING FUNCTIONAL GENE KNOCK-DOWN CELLS USING THE SYSTEM
WO2003070932A1 (fr) * 2002-02-22 2003-08-28 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Polynucleotide pour gene cible
WO2004009813A1 (ja) * 2002-07-18 2004-01-29 Mitsubishi Chemical Corporation パピローマウイルスベクターを用いたＲＮＡｉ表現型を有する非ヒト哺乳動物の作製方法
WO2004048583A3 (en) * 2002-11-22 2004-11-11 Inst Clayton De La Rech Compositions and systems for the regulation of genes
WO2005028646A1 (ja) * 2003-09-22 2005-03-31 Riken 効率的なdna逆位反復構造の調製方法
WO2005028655A1 (fr) * 2003-09-23 2005-03-31 Ning Li Procede d'augmentation de l'efficacite d'un animal transgenique
US7629153B2 (en) 2001-08-02 2009-12-08 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vector production systems
US7893036B2 (en) 2001-07-12 2011-02-22 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing
US8551773B2 (en) 2000-11-13 2013-10-08 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vectors and their applications
US8748169B2 (en) 2001-10-02 2014-06-10 Research Development Foundation Methods and compositions relating to restricted expression lentiviral vectors and their applications
JP2016208845A (ja) * 2015-04-28 2016-12-15 国立大学法人広島大学 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法およびキット、並びに、その利用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004180641A (ja) * 2002-12-06 2004-07-02 Gencom Co ＲＮＡｉ表現型を有する非ヒト哺乳動物の作製方法
AR064985A1 (es) 2007-01-22 2009-05-06 E Vision Llc Lente electroactivo flexible

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0859059A2 (en) * 1997-01-17 1998-08-19 Director-General, National Institute Of Animal Industry Methods and materials for introducing exogenous genes into cultured cells or fertilized eggs
WO2000044914A1 (en) * 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
WO2001036646A1 (en) * 1999-11-19 2001-05-25 Cancer Research Ventures Limited Inhibiting gene expression with dsrna
WO2001068836A2 (en) * 2000-03-16 2001-09-20 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
WO2001075164A2 (en) * 2000-03-30 2001-10-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3541A (en) * 1844-04-17 Ma-chine for splitting leathek
US229266A (en) * 1880-06-29 David m
JPS58110600A (ja) * 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
JP2564268B2 (ja) * 1985-08-28 1996-12-18 協和醗酵工業株式会社 融合抗原ポリペプチド
JPH0322979A (ja) * 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
WO1994012629A1 (en) * 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
US20050229272A1 (en) * 1999-12-30 2005-10-13 Monica Driscoll Compositions and methods for gene silencing

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0859059A2 (en) * 1997-01-17 1998-08-19 Director-General, National Institute Of Animal Industry Methods and materials for introducing exogenous genes into cultured cells or fertilized eggs
WO2000044914A1 (en) * 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
WO2001036646A1 (en) * 1999-11-19 2001-05-25 Cancer Research Ventures Limited Inhibiting gene expression with dsrna
WO2001068836A2 (en) * 2000-03-16 2001-09-20 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
WO2001075164A2 (en) * 2000-03-30 2001-10-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKASHI HIDEO ET AL.: "Kiku kinosei kakusan o tsukuru 5 RNA interference o riyo shita idenshi hatsugen knockout ho", PHARM. TECH. JPN., vol. 18, no. 2, 1 February 2002 (2002-02-01), pages 149 - 158, XP002978819 *
BILLY E. ET AL.: "Specific interference with gene expression induced by long, double-stranded RNA in mouse embryonal teratocarcinoma cell lines", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 98, no. 25, December 2001 (2001-12-01), pages 14428 - 14433, XP002198114 *
CAPLEN N.J. ET AL.: "Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 98, no. 17, August 2001 (2001-08-01), pages 9742 - 9747, XP002206452 *
ELBASHIR S.M. ET AL.: "Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells", NATURE, vol. 411, no. 6836, May 2001 (2001-05-01), pages 494 - 498, XP002206451 *
KACHIKI MOTOYA ET AL.: "RNAi ho no mouse eno oyo", THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN NENKAI KOEN YOSHISHU, vol. 121, no. 1, 5 March 2001 (2001-03-05), pages 169 *
PADDISON P.J. ET AL.: "Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, no. 3, 5 February 2002 (2002-02-05), pages 1443 - 1448, XP002958925 *
SVOBODA P. ET AL.: "RNAi in mouse oocytes and preimplantation embryos: effectiveness of hairpin dsRNA", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 287, no. 5, October 2001 (2001-10-01), pages 1099 - 1104, XP002958924 *
SVOBODA P. ET AL.: "Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference", DEVELOPMENT, vol. 127, no. 19, 2000, pages 4147 - 4156, XP001064763 *
UI-TEI K. ET AL.: "Sensitive assay of RNA interference in drosophila and Chinese hamster cultured cells using firefly luciferase gene as target", FEBS LETT., vol. 479, no. 3, August 2000 (2000-08-01), pages 79 - 82, XP004337469 *
WIANNY F. ET AL.: "Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development", NAT. CELL BIOL., vol. 2, no. 2, 2000, pages 70 - 75, XP002138445 *
YANG S. ET AL.: "Specific double-stranded RNA interference in undifferentiated mouse embryonic stem cells", MOL. CELL. BIOL., vol. 21, no. 22, November 2001 (2001-11-01), pages 7807 - 7816, XP002198113 *

Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9476062B2 (en) 2000-11-13 2016-10-25 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vectors and their applications
US8551773B2 (en) 2000-11-13 2013-10-08 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vectors and their applications
US10226538B2 (en) 2000-11-13 2019-03-12 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vectors and their applications
US9023646B2 (en) 2000-11-13 2015-05-05 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vectors and their applications
US9731033B2 (en) 2000-11-13 2017-08-15 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vectors and their applications
US8232260B2 (en) 2001-07-12 2012-07-31 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing
US7893036B2 (en) 2001-07-12 2011-02-22 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing
US9850487B2 (en) 2001-07-12 2017-12-26 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing
US8530438B2 (en) 2001-07-12 2013-09-10 University Of Massachusetts Vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing
US10731155B2 (en) 2001-07-12 2020-08-04 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing
US8557785B2 (en) 2001-07-12 2013-10-15 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering RNAS that mediate gene silencing
US9175287B2 (en) 2001-07-12 2015-11-03 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing
US9260725B2 (en) 2001-08-02 2016-02-16 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vector production systems
US7629153B2 (en) 2001-08-02 2009-12-08 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vector production systems
US8900858B2 (en) 2001-08-02 2014-12-02 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vector production systems
US9340798B2 (en) 2001-10-02 2016-05-17 Research Development Foundation Methods and compositions relating to restricted expression lentiviral vectors and their applications
US8748169B2 (en) 2001-10-02 2014-06-10 Research Development Foundation Methods and compositions relating to restricted expression lentiviral vectors and their applications
WO2003042382A1 (fr) * 2001-11-14 2003-05-22 Gencom Corporation Cellules es a effet arni accru
WO2003046186A1 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Toudai Tlo, Ltd. siRNA EXPRESSION SYSTEM AND METHOD FOR PRODUCING FUNCTIONAL GENE KNOCK-DOWN CELLS USING THE SYSTEM
WO2003070932A1 (fr) * 2002-02-22 2003-08-28 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Polynucleotide pour gene cible
WO2004009813A1 (ja) * 2002-07-18 2004-01-29 Mitsubishi Chemical Corporation パピローマウイルスベクターを用いたＲＮＡｉ表現型を有する非ヒト哺乳動物の作製方法
WO2004048583A3 (en) * 2002-11-22 2004-11-11 Inst Clayton De La Rech Compositions and systems for the regulation of genes
WO2005028646A1 (ja) * 2003-09-22 2005-03-31 Riken 効率的なdna逆位反復構造の調製方法
WO2005028655A1 (fr) * 2003-09-23 2005-03-31 Ning Li Procede d'augmentation de l'efficacite d'un animal transgenique
JP2016208845A (ja) * 2015-04-28 2016-12-15 国立大学法人広島大学 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法およびキット、並びに、その利用

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2002066638A1 (ja) 2004-06-24
EP1371727A1 (en) 2003-12-17
US20040010130A1 (en) 2004-01-15
EP1371727A4 (en) 2004-07-28
JP3765574B2 (ja) 2006-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6700306B2 (ja) 受精前の卵細胞、受精卵、及び標的遺伝子の改変方法
Rivera-Pérez et al. Goosecoid is not an essential component of the mouse gastrula organizer but is required for craniofacial and rib development
EP2493288B1 (en) Homologous recombination in the oocyte
CN105518132B (zh) 缺乏lincRNA的非人类动物
Haueter et al. Genetic vasectomy—Overexpression of Prm1‐EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice
JP3765574B2 (ja) 逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子及びその利用
JP2003528620A (ja) プリオンのないトランスジェニック有蹄類
JP2022113700A (ja) ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集に基づく、Ｆｅｌ ｄ１ノックアウト並びに関連組成物及び方法
Hickman-Davis et al. Transgenic mice
JP2003144141A (ja) ＲＮＡｉ効果が増強したＥＳ細胞
EP1362911A1 (en) Transgenic animal having drug metabolism enzyme gene and utilization thereof
WO2017175745A1 (ja) 生殖細胞欠損動物を用いる遺伝子改変動物の作製方法
US20050229266A1 (en) Method for producing non-human mammal RNAi phenotype using papilloma virus vector
US20050283845A1 (en) Method for producing non-human mammal having RNAi phenotype
Lai et al. Skeletal Genetics: From Gene Identification to Murine Models of Disease
Kasimanickam Application of CRISPR‐Cas9 Technology in Bovine Reproduction
Frazier Animal Transgenesis and Cloning
Rabbits 15 Methods to Create Transgenic
Bősze et al. Methods to create transgenic and genome-edited rabbits.
WO2008062904A1 (fr) Procédé permettant l'expression stable de transgène
CN116555345A (zh) 用于研究gne肌病的动物模型的方法和应用
US7847148B2 (en) Oasis gene-deficient mouse
KR20050022811A (ko) 여윈 표현형을 갖는 유전자 이식 생쥐
Jonas et al. The science behind GM research animals
JPH1033087A (ja) グルタミン酸トランスポーター遺伝子機能欠損非ヒト動物

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2002 566344

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002700672

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10296243

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002700672

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2002700672

Country of ref document: EP