WO2002064159A1 - Remedies for tumor in hematopoietic organs - Google Patents

Description

明 細 書 造血器腫瘍の治療剤 発明の分野

本発明は、 骨髄腫における HM1.24抗原の発現増強剤と してのイ ン ターフェロン _α及びイ ンターフェロ ン _γ並びに IRF-2蛋白質の使用 に関する。

また、 本発明は、 リ ンパ球系腫瘍における HM1.24抗原の発現増強 剤と してのィ ンターフェ口 ン αおよびィ ンターフェ口 ン γ並びに IR F-2 蛋白質の使用に関する。 さ らに、 本発明は、 抗 HM1.24抗体とィ ンターフェ口 ンひまたはィ ンターフェ口 ン _Ί とを用いて白血病を治 療する方法に関する。 背景技術

正常ヒ ト末梢血中に存在する白血球 （leukocyte) には、 顆粒球 (granulocyte) 、 単球 (monocyte) およびリ ンノヽ球 、丄 ymphocyte ) があり、 顆粒球はさらに細胞質内の特殊顆粒の染色性によって、 好中球 (neutrophi丄 、 好酸球 (eosinophil) 、 好塩 U求 (basoph il) に分けられる。 これらの血球の産生は、 共通の未分化な造血幹 細胞から骨髄球系幹細胞およびリ ンパ球系幹細胞が分化し、 さ らに これらの幹細胞から最終的に各系統の白血球が分化する。 これら造 血幹細胞を含めた血球系細胞は造血器細胞ともよばれている。 造血 器細胞の腫瘍 （造血器腫瘍） には白血病、 リ ンパ腫、 骨髄腫等があ る。

白血病は造血器細胞が腫瘍化した疾患であり、 骨髄が白血病細胞 によ り 占拠され、 正常造血機能が抑制されるために、 正常血液細胞 の産生が低下し、 貧血、 白血球減少症と血小板減少症が現れる。 ま た、 白血病細胞の発生源から骨髄性白血病 （myelocytic leukemia ) と リ ンパ球性白血病 （lymphocytic leukemia) に二大別され、 さ らにそれぞれ急性と慢性に分けられる。 尚、 亜型と して、 骨髄系と リ ンパ球系の二系統の細胞形質を有する系統混合白血病 （mixed li neage leukemia) も知られている。

腫瘍化は造血幹細胞レベルでおこ り、 分化、 成熟のある一定の段 階で分化が停止し、 それより上流の細胞のみで腫瘍を構成している 場合と、 生体の調節能を逸脱し自律性増殖を示すものの、 分化 ·成 熟能を保持している場合がある。 前者には急性白血病 （acute leuk emia) 力 後者には慢性白血病 （chronic leukemia) や骨髄異形成 症候群 (myelodysplastic syndrome) 力 S含まれる。 急性白血病は、 増殖細胞の帰属から、 急性骨髄性白血病 （acute myelocytic leuke mia； AML) 、 急性単球性白血病 (acute monocytic leukemia； AMoL ) 、 急性赤白血病 (acute erythroleukemia), 巨核芽球性白血病 ( megakaryoblast ic leuKemia 、 急†生リ ンノヽ个生白血病 (acute lympn ocyteic leukemia； ALL) 、 に大另 llされる。

また、 亜型と して急性前骨髄性白血病 （acute promyelocytic le ukemia； APL) が知られている。 尚、 急性白血病と骨髄異形成症候 群は、 FAB分 |¾ (French-American - British classificationリにより 分類するこ とができる。 FAB分類では、 急性リ ンパ性白血病は Ll、 L 2、 L3に分類され、 例えば、 パーキッ ト リ ンパ腫は L3に分類される 。 また、 急性骨髄性白血病は、 M0、 Ml、 M2、 M3、 M4、 M5、 M6、 M7に 分類され、 例えば、 赤白血病は M6に、 巨核芽球性白血病は M7に分類 される。 これらの分類方法、 検査方法は周知であり、 多く の成書に 記載されている （例えば、 新臨床内科学、 高久史麿、 尾形悦郎、 医 学書院、 1999) 。 慢性白血病も増殖細胞も帰属から、 慢性骨髄性白血病 （chronic myelocytic leukemia； CML) と'擾十玍リ ンノヽ十生白 JEU丙 ( chronic lymp hocytic leukemia； CLL) .に分類される。 また、 慢性骨髄性白血病 の亜型と して、 慢性骨髄単球性白血病 （chronic myelomonocytic 1 eukemia) が知られ、 慢性リ ンパ性白血病の亜型として前リ ンパ球 十生白血病 (prolymphocytic leukemia) 力 S失卩られて ヽる。

リ ンパ腫は、 リ ンパ節などのリ ンパ組織を構成する細胞に由来す る腫瘍の総称であり、 主にリ ンパ球の腫瘍化によって引き起こされ る造血器細胞腫瘍である。 悪性リ ンパ腫 （Malignant lymphoma) は 、 ホジキン病 （Hodgkin's disease) と非ホジキンリ ンパ腫 （non- H odgkin lymphoma； NHL) に分けることができるが、 いずれもリ ンパ 球系細胞が腫瘍化したもので、 T細胞系または B細胞系に分けるこ とができる。

非ホジキンリ ンパ腫には、 B細胞系腫瘍である濾胞性リ ンパ腫、 濾胞外套リ ンパ腫、 Burkitt リ ンパ腫、 pre-B リ ンパ腫等がある。 また、 T細胞系腫瘍では、 成人 T細胞白血病 （adult T-cell leuke mia； ATL) や非 ATL 末梢性 T リ ンパ腫（PNTL) が知られている。 ま た、 T細胞と B細胞の 2型のあるびまん性リ ンパ腫も非ホジキンリ ンパ腫に含まれる。 さらに、 亜型と して、 B細胞系腫瘍であるヘイ リー細胞 （有毛細胞） 白血病 （hairy cell leukemia)力 S知られてレヽ る。

リ ンパ球性白血病やリ ンパ腫は、 リ ンパ球の主要構成細胞が腫瘍 化したものであり、 リ ンパ球系腫瘍とも呼ばれ、 B細胞腫瘍と T細 胞腫瘍に大別される。 例えば、 B細胞腫瘍には急性 B リ ンパ性白血 病 （B- ALL) 、 慢性 B リ ンパ性白血病 （B- CLL) 、 pre_Bリ ンパ腫、 B urkittリ ンパ腫、 濾胞性リ ンパ腫、 濾胞外套リ ンパ腫、 びまん性リ ンパ腫等が含まれる。 T細胞腫瘍には、 急性 Tリ ンパ性白血病 （T- ALL) 、 慢性 T リ ンパ性白血病 （T-CLL) 、 成人 T細胞白血病 （ATL ) 、 非 ATL末梢性 Τ リ ンパ腫 （PNTL) 等が含まれる （図解臨床癌シ リーズ、 NO. 17 白血病 . リ ンパ腫、 杉村隆ら、 MED I CAL VIEW社、 1987 ; B細胞腫瘍、 高月清、 西村書店 1991 ; 新臨床内科学、 高久 史麿、 尾形悦郎、 医学書院、 1999) 。 尚、 骨髄腫もリ ンパ系腫瘍の ひとつであるが、 特徴的な臨床所見を呈する。

骨髄腫 （myel oma) は、 形質細胞種 （plasmacyt oma) 、 多発性骨 髄腫 （mul t ipl e mye loma) とも呼ばれ、 モノ ク ローナルな形質細胞 の骨髄内集積を特徴とする腫瘍性疾患である。 骨髄腫は、 免疫グロ プリ ンを産生し分泌する終末分化 B細胞、 すなわち形質細胞がモノ ク口一ナルに主として骨髄において増加する疾患で、 この疾患の患 者の血清中にはモノクローナルな免疫グロブリ ンもしく はその構成 成分である L鎖、 H鎖などが検出される。

骨髄腫の治療としては、 これまで化学療法剤等が使用されている が、 完全寛解に導き、 患者の生存期間を延長するような有効な治療 剤は見いだされておらず、 新たな作用メ力ニズムによる治療効果を 有する薬剤の登場が待たれていた。 また、 リ ンパ腫や白血病では、 ある程度有効な化学療法が開発されているが、 副作用の点から新た な薬剤が望まれていた。

一方、 Go t o , T. らは、 ヒ ト骨髄腫細胞をマウスに免疫して得られ たモノク ローナル抗体 （マウス抗 HM1. 24抗体） を報告している （B1 ood ( 1994) 84 , 1922-1930) 。 ヒ ト骨髄腫細胞を移植したマウスに 抗 Ml . 24抗体を投与すると、 この抗体が腫瘍組織に特異的に集積し たこと （小阪昌明ら、 日本臨床 （1995 ) 53， 627-635 ) から、 抗 HM 1. 24抗体はラジオアイソ トープ標識による腫瘍局在の診断や、 ラジ オイムノセラピーなどのミサイル療法に応用することが可能である ことが示唆されている。 また、 上記 Blood ( 1994) 84 , 1922- 1930には、 抗 HMl. 24抗体が、 in vi troにおいて、 ヒ ト骨髄腫細胞株 RPMI 8226に対して細胞傷害活 性を有することが述べられている。 また、 マウス抗 HM1. 24抗体をキ メラ化したキメラ抗 HM1. 24抗体、 およびヒ ト型化した再構成抗 HM1. 24抗体が、 骨髄腫細胞に特異的に結合すること、 さ らには細胞傷害 活性を有することが示されている （Blood ( 1999 ) 93， 3922-3930) 一方、 リ ンパ球系腫瘍に関しても、 抗 HM1. 24抗体が認識する抗原 タンパク質がリ ンパ球系腫瘍に発現していること、 および抗 HM1. 24 抗体がリ ンパ球系腫瘍に対し、 CDC 活性や ADCC活性による細胞傷害 活性を有し、 抗腫瘍効果を発現することが示されている （W098/356 98) 。 このよ う に、 HM1. 24抗原は、 終末分化 B細胞である骨髄腫細 胞のみならず、 リ ンパ球系腫瘍においても高発現しており、 HM1. 24 抗原を認識する抗 HM1. 24抗体は、 リ ンパ球系腫瘍の治療剤として有 用であることが示されている。

このよ う に、 HM1. 24抗原は、 終末分化 B細胞である骨髄腫細胞や リ ンパ球系腫瘍細胞に特異的に高発現しており、 この抗原を認識す る抗丽 1. 24抗体は、 細胞表面の HM1. 24抗原分子数に比例して殺細胞 活性を発揮することから、 抗 HM1. 24抗体を用いた免疫療法は多発性 骨髄腫やリ ンパ球系腫瘍に有効な治療法と考えられる。 従って、 抗 HM1. 24抗体の抗原である HM1. 24抗原の細胞表面上の発現量を増強す ることができれば、 よ り少量の抗体投与によ り同等の細胞傷害活性 が期待でき、 副作用をよ り低下させることが可能となる。

さらに、 HM1. 24抗原を発現していない造血器腫瘍細胞に対して、 細胞表面上の HM1. 24抗原の発現量を増強することができれば、 通常 は抗 HM1. 24抗体単独では効果を示さない造血器腫瘍細胞に対しても 、 抗 HM1. 24抗体による ADCC活性や CDC 活性を介した細胞傷害活性、 殺細胞活性を期待することができる。

一方、 ウィルス増殖抑制活性を示す物質と して発見されたイ ンタ 一フエロンは、 現在、 ほ乳類においては、 ひ， β , 0/及び ωの 4種 類に分類され、 多彩な生理活性を有することが知られている （Pest ka, S.， et. al. , Ann. Rev. Biochem. (1987) 56, 727-777; Langer,

J丄 ， et. al. , Immunology Today (1988) 9， 393 - 400 ) 。 し力 し ながら、 イ ンターフェロン ο;およびイ ンターフェロ ン γが、 骨髄腫 細胞ゃリ ンパ球系腫瘍等の造血器腫瘍細胞において、 HM1.24抗原の 発現量を増加させる作用を有することについては報告がなかった。 他方、 イ ンターフェロ ン調節因子（interferon regulatory facto r)(IRF)-l および 2は、 IFN-j3遺伝子の転写調節因子と して同定さ れた。 IRF-1 および 2は一般に同じ遺伝子制御配列に結合し、 IRF - 1 は転写活性化因子、 IRF- 2 は転写抑制因子として拮抗的に作用す ることが知られている。 IRF- 2 を高発現させた NIH3T3細胞は細胞飽 和密度の上昇、 メチルセルロースゲルでのコ ロニー形成、 ヌー ドマ ウスでの造腫瘍性が認められ、 IRF-2 は癌遺伝子と して機能するこ とが明らかになつている。

一方、 最近の研究の進展により、 IRF- 2 が細胞周期の調節に働く ヒス ト ン H 4の発現に必要であることが示されている。 また、 IRF- 2 fま筋肉糸田胞 ίこお ヽて vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM- 1)の発現を上昇させることが示され、 VCAM- 1の活性化には IRF-2 の 酸性領域 （182 から 218 ) が作用していることも明らかになつてい る。 このこ とから IRF - 2 は転写抑制因子と して働くばかりでなく、 転写活性化因子と して作用を示す場合も知られている。

しかしながら、 IRF- 2蛋白質が匪 1.24抗原遺伝子のプ口モーター

(HM1.24プロモーター） に結合し、 該プロモーターを活性化するこ とは知られていなかった。 発明の開示

現在行われている骨髄腫の治療は、 上記のごとく、 未だ完全では なく、 骨髄腫を完全寛解に導き、 患者の生存期間を延長させる画期 的な治療剤あるいは治療法が待たれている。 抗 HM1. 24抗体による骨 髄腫の治療は、 特異性及び有効性の点で画期的な治療剤となる可能 性があり、 抗 HM1. 24抗体の作用をよ り効果的に発揮させる方法が望 まれている。

また、 現在行われているリ ンパ球系腫瘍の治療には、 種々の化学 療法、 X線療法、 骨髄移植等が挙げられるが、 いずれの治療方法も 未だ完全ではなく、 リ ンパ球系腫瘍を寛解に導き、 患者の生存期間 を延長させる画期的な治療剤あるいは治療法が待たれている。 さ ら には、 リ ンパ性白血病以外の白血病、 すなわち、 急性骨髄性白血病 や慢性骨髄性白血病等の骨髄性白血病に効果のある治療法が待たれ ている。 これら骨髄腫、 リ ンパ球系腫瘍、 骨髄性白血病を、 寛解に 導き、 患者の生存期間を延長させることができる薬剤や治療方法は 、 造血器腫瘍全般の治療薬、 治療方法となり うる。

従って、 本発明の目的のひとつは、 骨髄腫細胞において、 HM1. 24 抗原の発現量を増加させることで、 抗丽 1. 24抗体の骨髄腫抑制作用 を増強させる手段を提供することである。

また、 本発明のも うひとつの目的は、 リ ンパ球系腫瘍において、 HM1. 24抗原の発現量を増加させることで、 抗 HM1. 24抗体のリ ンパ球 系腫瘍抑制作用を増強させる手段を提供することである。

さ らに、 本発明のさらなる 目的は、 骨髄性白血病において、 HM1. 24抗原の発現を新たに誘導する手段を提供し、 抗 HM1. 24抗体による 骨髄性白血病抑制作用を誘導する手段を提供することである。

これらは、 HM1. 24抗原の発現量を増強するか、 もしくは、 新たに HM1. 24抗原を誘導する手段を用いて、 抗 HM1. 24抗体により造血器腫 瘍を治療する手段を提供するものである。 ' 本発明者らは、 かかる方法を提供すべく、 HM1. 24抗原の発現量を 増加させるまたは新たに HM1. 24抗原を細胞表面上に発現させる薬剤 を探索した結果、 イ ンターフェ ロ ンお、 イ ンターフェロ ン γおよび IRF-2蛋白質が所望の活性を有することを見出し、 本発明を完成す るに至った。

従って、 本発明は、 インターフェロンひ、 インターフェロ ン γ 、 または IRF-2蛋白質を有効成分とする、 配列番号 ： 2に示されるァ ミ ノ酸配列を有する蛋白質 （HM1. 24抗原） の造血器腫瘍細胞におけ る発現増強剤または発現誘導剤を提供する。

前記造血器腫瘍は、 例えば、 白血病、 リ ンパ腫、 骨髄腫などであ り、 この白血病と しては急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急 性リ ンパ性白血病、 慢性リ ンパ性白血病などが挙げられ、 前記リ ン パ腫と しては、 ホジキン病、 T細胞性非ホジキンリ ンパ腫、 B細胞 性非ホジキンリ ンパ腫などが挙げられ、 前記骨髄腫としては多発性 骨髄腫が挙げられる。

本発明者はまた、 上記の HM1. 24抗原発現増強剤または発現誘導剤 によ り HM1. 24抗原が発現した造血器腫瘍細胞に、 該 HM1. 24抗原に特 異的に結合する抗原を結合させることにより、 該造血器腫瘍細胞に 対する抗腫瘍効果を増強することができることを見出した。

従って本発明はまた、 インターフェ ロ ンお、 インターフェ ロ ンお または IRF - 2蛋白質と併用することを特徴と し、 有効成分と して配 列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合 する抗体を含んでなる造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物を提供 する。

本発明はまた、 有効成分と して （ 1 ) インターフェ ロ ンお、 イン ターフェロン τ;または IRF- 2蛋白質、 および （ 2 ) 配列番号 ： 2に 示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体、 を 含んでなる造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物を提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 2に示されるアミノ酸配列を有する蛋 白質に特異的に結合する抗体と併用することを特徴と し、 有効成分 と して、 イ ンターフ ェ ロ ンお 、 イ ンターフェロン γ、 または IRF-2 蛋白質を含む造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物を提供する。 前記の造血器腫瘍は、 例えば、 白血病、 リ ンパ腫または骨髄腫で ある。 上記白血病としては急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リ ンパ性白血病、 慢性リ ンパ性白血病などが挙げられ、 上記リ ンパ腫と してはホジキン病、 Τ細胞性非ホジキンリ ンパ腫、 Β細胞 性非ホジキンリ ンパ腫などが挙げられ、 そして上記骨髄腫と しては 多発性骨髄腫等が挙げられる。

前記抗体は、 好ましく は細胞傷害活性を有する抗体であり、 この 細胞傷害活性は例えば ADCC活性である。 抗体は好ましくはモノク ロ ーナル抗体、 キメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体、 またはヒ ト抗体である。 モノクローナル抗体は、 好ましく は寄託番号 FERM BP- 5233であるハ イブリ ドーマによって産生される抗 HM1. 24抗体であり、 前記キメラ 抗体またはヒ ト型化抗体は、 好ましくは寄託番号 FERM BP-5233であ るハイプリ ドーマによつて産生される抗 HM1. 24抗体のキメラ抗体ま たはヒ ト型化抗体である。

本発明はさ らに、 造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキッ トであって、

( 1 ) 配列番号 ： 2に示されるァミ ノ酸配列を有するタンパク質 に特異的に結合する抗体 ； および

( 2 ) 上記抗体を、 配列番号 2に示されるアミ ノ酸配列を有する タンパク質の発現を増強する薬剤と組み合わせて患者に投与するこ とを指示する指示書 ； を含むキッ トを提供する。

本発明はまた、 造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキッ ト であって、 （ 1 ) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列を有するタン パク質の発現を増強する薬剤 ； および

( 2 ) 上記薬剤を、 配列番号 ： 2に示されるァミノ酸配列を有す るタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて患者に投与す ることを指示する指示書 ；

を含むキッ トを提供する。

本発明はまた、 造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキッ ト であって、

( 1 ) 配列番号 2に示されるアミ ノ酸配列を有するタンパク質の 発現を増強する薬剤 ；

( 2 ) 配列番号 ： 2に示されるァミノ酸配列を有するタンパク質 に特異的に結合する抗体 ； および

( 3 ) 上記薬剤および抗体を組み合わせて患者に投与することを 指示する指示書 ；

を含むキッ トを提供する。

本発明はまた、 HM1. 24抗原の発現増強剤をスク リ一二ングする方 法であって、

( 1 ) HM1. 24遺伝子プロモーター領域を有するレポーター遺伝子 を有する細胞を調製する工程 ；

( 2 ) 前記細胞に被験物質を接触させる工程 ；

( 3 ) レポーター遺伝子の発現を検出する工程、

を含む方法を提供する。

本発明はまた、 上記の方法によつて選択される HM1. 24抗原の発現 増強剤を提供する。

本発明はまた、 上記の発現増強剤を含み、 配列番号 ： 2に示され るアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み 合わせて使用することを特徼とする造血器腫瘍治療用医薬組成物を 提供する。

本発明はまた、 発現を増強する薬剤をスク リーニングする方法で あって、

( 1 ) 細胞と被験物質を接触させる工程 ；

( 2 ) 前記細胞の IRF- 2蛋白の発現量を測定する工程、

を含む方法を提供する。

本発明はまた、 上記の方法によって選択される IRF - 2タンパク質 の発現増強剤を提供する。

本発明はまた、 上記の発現増強剤を含み、 配列番号 ： 2に示され るァミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み 合わせて使用することを特徴とする造血器腫瘍治療用医薬組成物を 提供する。 図面の簡単な説明

図 1は、 イ ンターフ ロ ン ひ の非存在下 （上） 又は存在下 （下） で培養した骨髄腫細胞株 U266を、 標識と してヒ ト I gG (対照） 又は抗 HM1. 24抗体を用いてフロ ーサイ トメ ト リーによ り分析した結果を示 す。

図 2は、 ィ ンターフ ェ ロ ン ひ の非存在下 (上) 又は存在下 (下) で培養した患者骨髄腫細胞を、 標識と してヒ ト I gG (対照） 又は抗 HM 1. 24抗体を用いてフロ ーサイ トメ ト リーによ り分析した結果を示す 図 3は、 HM1. 24抗原をコー ドする遺伝子のプロモーター領域を揷 入したレポータープラスミ ドにより形質転換した U266細胞をィンタ 一フエロンひの非存在下又は種々の濃度での存在下で培養した後ル シフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。

図 4は、 HM1.24抗原をコー ドする遺伝子のプロモーター領域の内 、 転写開始点から 151b_P上流まで、 又は 77bp上流までを挿入したレ ポータープラスミ ドにより形質転換された U266細胞又は HEL 細胞を 、 インターフェ ロ ンお (1000U/ml) の存在下で培養した後にルシ フ工ラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。

図 5は、 イ ンターフェロン γの非存在下 （上） は存在下 （下） で 培養した骨髄腫細胞株 U266を、 標識と してヒ ト IgG (対照） 又は抗 HM 1.24抗体を用いてフ ローサイ トメ ト リーによ り分析した結果を示す 図 6は、 イ ンターフヱロン yの非存在下 （上） 又は存在下 （下） で培養した患者骨髄腫細胞を、 標識としてヒ ト IgG (対照） 又は抗 HM 1.24抗体を用いてフ ローサイ トメ ト リーによ り分析した結果を示す 図 7は、 U266培養細胞に IFN-αを添加することによ り産生され HM 1.24プロモーター領域に結合する転写因子の量の経時的変化を示す 電気泳動図であり、 図面代用写真である。 NE (-) は核抽出物添加せ ず。 Ohは IFN-o;刺激なしの核抽出物を添加。 0.5 〜8hは IFN- α (10 00U/ml) 刺激後それぞれの時間経過した核抽出物を添加。 +cold は未標識 ISRE2 プローブ 50n_g添加、 +cold unrelated は未標識 adp 配列 50ng添加。

図 8は、 HM1.24プロモーターに結合する転写因子を、 各種の抗体 を用いて同定した結果を示す電気泳動図であり、 図面代用写真であ る。 NE (-) は核抽出物添加せず。 Ohは IFN-α刺激なしの核抽出物を 添加。 8hは IFN-o; (1000U/ml) 刺激後 8hの核抽出物を添加。 +col d は未標識 ISRE2 プローブ 50ng添加。 +cold unrelated は未標識 ad P 配列 50ng添加。 抗体はそれぞれ 2 μ g添加。 図 9は、 ΗΜ1· 24プロモーターレポータープラスミ ドと IRF- 2 発現 プラスミ ドとを U266細胞に導入し、 レポーター活性を測定した場合 の結果を示すグラフである。

図 10は、 ヒ ト白血病細胞株 HEL および急性骨髄性白血病患者から 採取した細胞を、 インターフェロン αの非存在下 （左） または、 存 在下 （右） で培養し、 標識としてヒ ト I gG (対照） または抗 HM1. 24 抗体を'用いてフローサイ トメ ト リーによ り分析した結果を示す。 黒 塗りが対照であり、 白抜きが抗 HM1. 24抗体による染色を示す。

図 11は、 急性リ ンパ性白血病患者および B細胞性非ホジキンリ ン パ腫患者から採取した細胞を、 インターフェロン αの非存在下 （左 ) または、 存在下 （右） で培養し、 標識と してヒ ト I gG (対照） ま たは抗丽 1. 24抗体を用いてフローサイ トメ ト リーによ り分析した結 果を示す。 黒塗りが対照であり、 白抜きが抗 HM1. 24抗体による染色 を示す。

図 12は、 T細胞性非ホジキンリ ンパ腫患者から採取した細胞を、 イ ンターフェロ ン αの非存在下 （左） または、 存在下 （右） で培養 し、 標識と してヒ ト I gG (対照） または抗 HM1. 24抗体を用いてフロ 一サイ トメ ト リーによ り分析した結果を示す。 黒塗りが対照であり 、 白抜きが抗 HM1. 24抗体による染色を示す。

図 13は、 ヒ ト白血病細胞株 HEL を標準細胞とし、 健常人の末梢血 単核球をエフェクター細胞と して用いた際の、 種々のヒ ト型化抗 HM 1. 24抗体による ADCC活性を測定した結果を示す。 発明の実施の形態

ィ ンターフェ口 ンひ及びィ ンターフェロン

ィ ンターフェ口ンは、 ウィルス増殖抑制活性を示す物質と して発 見されたものであり、 現在、 哺乳類においては a、 β、 γ、 ωの 4 種類が知られている。 これらは、 ウィルス増殖抑制活性に加え、 細 胞増殖抑制活性や多彩な免疫調節作用を示すことが知られ、 既に医 薬品として使用されている （イ ンターフェロ ン "サイ トカイ ン" 、 大沢利昭編、 （1990) 115〜133、 東京化学同人 ； Pestka， S. et a 1.， Ann. Rev. Biochem. (1987) 56, 727~777； Langer J. A. et al .， Immunology. Today (1988) 9， 393〜權） 。

本発明で使用されるィンターフェ口ン α及びィンターフェロ ン γ は、 HM1.24抗原の発現量を増加させる活性を有する限り変異体を用 いることも可能である。 匪 1.24抗原の発現量を測定するには、 実施 例に記載されたように、 骨髄腫細胞株あるいは骨髄腫患者から採取 した骨髄腫細胞を用いて、 フローサイ トメ ト リーによ り検出するこ とができる。 変異体としては、 例えば、 1 もしく は数個、 あるいは 複数個のアミ ノ酸残基が、 欠失または置換または挿入または付加等 によ り変異されたィンターフェ口ン α及ぴィンターフェ口ン γであ つてもよレヽ。

欠失または置換または挿入を蛋白に導入する方法と しては、 対応 する遺伝子を改変する部位特異的変異誘発法を用いるこ とができる (Hashimoto- Gotoh, Gene (1995) 152, 271-275, Zoller , Methods Enzymol. (1983) 100， 468-500, Kramer, Nucleic Acids Res. (1 984) 12, 9441-8456, Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 8 2, 488-492、 「新細胞工学実験プロ トコール 東京大学医科学研究 所 制癌研究部編 （1993) p241-248j ) 。

また、 市販の PCRを利用した 「部位特異的変異誘発システム （GIB C0-BRL ) や 「QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit 」 （ ス トラタジーン社製） を利用することも可能である。 また、 蛋白質 中のアミ ノ酸の変異は自然界においても生じることもある。 また、 この様に変異を導入された蛋白がもとの蛋白と同様の活性を有する ことは、 Mark, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81， 5662— 5666に 示されている。

アミ ノ酸残基の置換においては、 性質の保存されたアミ ノ酸どう しで置換することが好ましい。 例えば、 疎水性アミノ酸 （A， I， L , M， F， P， W, Y， V) 、 親水性アミノ酸 （R， D， N， C ， E， Q， G， H， K， S， T) 、 脂肪族側鎖を有するアミ ノ酸 （ G, A, V, L , I， P) 、 水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 （ S ， T， Y) 、 硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 （C， M) 、 カル ボン酸及びアミ ド含有側鎖を有するアミノ酸 （D， N， E， Q) 、 塩基含有側鎖を有するアミノ酸 （R， Κ, H) 、 芳香族含有側鎖を 有するアミ ノ酸 （H， F , Y, W) どう しの置換が好ましい。

さ らに、 変異体と しては、 インターフェロンひ又はインターフエ ロン γのペプチ ド断片を用いることも可能である。 特に、 インター フヱ ロ ン α又はィンターフヱ ロ ン V受容体との結合部位を有するぺ プチド断片が好ましい。 好ましくは 100個以上、 さらに好ましく は 1 30個以上、 さらに好ましく は 150個、 最も好ましく は 160個以上の連 続するァミ ノ酸残基から構成されるぺプチド断片である。

IRF-2 蛋白質

ィ ンターフェ 口 ン調節因子（interferon regulatory factor) (IRF )-1 および 2は IFN - j8遺伝子の転写調節因子として同定された （Ta niguchi, T. et al. , Nucleic Acids Res. (1989) 17, 8372 Tanig uchi, T. et al. , Cell (1989) 58, 729) 。 IRF- 1 および 2は一般 に同じ遺伝子制御配列に結合し、 IRF-1 は転写活性化因子、 IRF - 2 は転写抑制因子と して拮抗的に作用することが知られている。 IRF- 2 を高発現させた NIH3T3細胞は細胞飽和密度の上昇、 メチルセル口 ースゲルでのコ口ニー形成、 ヌー ドマウスでの造腫瘍性が認められ 、 IRF-2 は癌遺伝子と して機能することが明らかになつている。 一方、 最近の研究の進展により、 IRF-2 が細胞周期の調節に働く ヒ ス トン H 4の発現に必要であることが示されている。 また、 IRF- 2 は筋肉細胞において vascular cell adhesion molecule - 1 (VCAM- 1)の発現を上昇させることが示され、 VCAM-1の活性化には IRF-2 の 酸性領域 （182 から 218 ) が作用していることも明らかになつてい る。 このことから IRF - 2 は転写抑制因子と して働くばかりでなく、 転写活性化因子として作用を示す場合も知られている。

ハイブリ ドーマ

本発明で使用される抗体を産生するハイプリ ドーマは、 基本的に は公知技術を使用し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 HM 1.24抗原蛋白質や HM1.24抗原を発現する細胞を感作抗原として使用 して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細 胞を通常の細胞融合法によつて公知の親細胞と融合させ、 通常のス ク リーニング法によ り、 モノ ク ローナルな抗体産生細胞をスクリー ニングすることによって作製できる。

具体的には、 モノクローナル抗体を作製するには次のよ うにすれ ばよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原である HM1.24抗原発現細胞と しては、 ヒ ト多発性骨髄腫細胞株である KPMM2 (特開平 7- 236475) や KPC-32 (Goto, T. et al. , Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 14 00) を用いることができる。 また、 感作抗原と して配列番号 1に示 すアミノ酸配列を有する蛋白質、 あるいは抗 HM1.24抗体が認識する ェピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを使用することがで きる。

なお、 感作抗原と して使用される、 配列番号 1 に示すアミ ノ酸配 列を有する蛋白質の cDNAは pUC19 ベタターの Xbal切断部位の間に挿 入されて、 プラスミ ド pRS38-pUC19 として調製されている。 このプ ラスミ ド _PRS38- pUC19 を含む大腸菌（E. coli) は、 平成 5年 （1993 年） 10月 5 日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託 センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に 、 Escherichia coli DH5 a (pRS38-pUC19) と して、 受託番号 FERM B P-4434と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託されている （特開平 7 - 196694参照） 。 このプラスミ ド pRS38- pUC19 に含まれる cDNA断片 を用いて遺伝子工学的手法により、 抗匪 1.24抗体が認識するェピト ープを含むペプチドまたはポリペプチ ドを作製することができる。 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるもので はないが、 細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択す るのが好ましく、 一般的にはげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラ ッ ト、 ハムスター等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われ る。 例えば、 一般的方法と して、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内また は、 皮下に注射することによ り行われる。

具体的には、 感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline) や生 理食塩水等で適当量に希釈、 懸濁したものを所望によ り通常のアジ ュパント、 例えば、 フロイ ン ト完全アジュパントを適量混合し、 乳 化後、 哺乳動物に 4〜 2 1 日毎に数回投与するのが好ましい。 また 、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。

このよ う に免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確 認した後に、 哺乳動物から免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付さ れる。 細胞融合に付される好ましい免疫細胞と しては、 特に脾細胞 が挙げられる。

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と しての哺乳動物のミェ ローマ細胞は、 すでに、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3X63Ag8.6 53 (J. Immnol. (1979) 123: 1548-1550 ) ， P3X63Ag8U.1 (Curren t Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7) ， N S-l (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511 - 519) , MPC-11 (Margulies. D. H. et al. , Cell (1976) 8: 405-415 ) ， SP2/0 (Shulman, M. et al. , Nature (1978) 276: 269-270) ， FO (de St. Groth, S. F. et al. , J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21 ) ， S194 (Trowbridge, I . S. J. Exp. Med. (1978) 148: 313 - 3 23) ， R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277: 131-133 ) 等が適宜使用される。

前記免疫細胞と ミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方 法、 たとえば、 ミルスティ ンらの方法 (Kohler. G. and Milstein, ， Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) 等に準じて行う ことがで きる。

よ り具体的には、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在 下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤と しては例えば 、 ポリ エチレングリ コール (PEG), センダイ ウィルス（HVJ) 等が使 用され、 更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキ シド等の補助剤を添加使用することもできる。

免疫細胞と ミエローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミエローマ 細胞に対して免疫細胞を 1〜： L0倍とするのが好ましい。 前記細胞融 合に用いる培養液としては、 例えば、 前記ミエローマ細胞株の増殖 に好適な RPMI1640培養液、 MEM 培養液、 その他、 この種の細胞培養 に用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さらに、 牛胎児血清 (FCS) 等の血清補液を併用することもできる。

細胞融合は、 前記免疫細胞と ミエローマ細胞との所定量を前記培 養液中でよく混合し、 予め、 37°C程度に加温した PEG 溶液、 例えば 、 平均分子量 1000— 6000程度の PEG 溶液を通常、 30〜60% ( w v ) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする融合細胞 （ハ イブリ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し 、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリ ドー マの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。

当該ハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 (ヒポキサンチン、. アミノブテリ ンおよびチミジンを含む培養液） で培養することによ り選択される。 当該 HAT 培養液での培養は、 目 的とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに 十分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界希釈 法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスク リー ニングおよび単一クローニングが行われる。

また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得 る他に、 ヒ ト リ ンパ球を in v i t roで HM1. 24抗原または HM1. 24抗原発 現細胞で感作し、 感作リ ンパ球をヒ ト ミエロ ーマ細胞、 例えば U266 と融合させ、 HM1. 24抗原または HM1. 24抗原発現細胞への結合活性を 有する所望のヒ ト抗体を得ることもできる （特公平卜 59878 参照） 。 さ らに、 ヒ ト抗体遺伝子の全てのレパー ト リ ーを有する ト ラ ンス ジェニック動物に抗原となる HM1. 24抗原または HM1. 24抗原発現細胞 を投与し、 前述の方法に従い所望のヒ ト抗体を取得してもよい （国 際特許出願公開番号 W093/12227 , W092/03918 , W094/02602 , W094/2 5585 , W096/34096 , W096/33735参照） ₀

さ らに、 ヒ ト抗体ライブラ リーを用いて、 パンニングによ り所望 のヒ ト抗体を単離することもできる。 例えば、 ヒ ト抗体の可変領域 を一本鎖抗体と して （s cFv) と してファージディスプレイ法によ り ファージの表面に発現させ、 HM1. 24抗原を固定化したプレートを用 いて、 HM1. 24抗原に結合するファージを選択することができる。 選 択されたファージの遺伝子を解析すれば、 HM1. 24抗原に結合する抗 体の可変領域をコー ドする遺伝子を同定することができる。 これら の遺伝子配列を用いれば、 抗 HM1. 24ヒ ト抗体を作製することができ る。 これらの方法は既に周知の方法であり、 W092/01047 , W092/207 91， 廳 3/06213， 廳 3/11236， W093/19172 , 應 5/01438， 簡 5/153 88を参考にすることができる。

このよ うにして作製されるモノ ク ローナル抗体を産生するハイブ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養することが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存することが可能である。

当該ハイブリ ドーマからモノ ク ローナル抗体を取得するには、 当 該ハイプリ ドーマを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に投与して増殖させ、 その腹水と して得る方法などが採用され る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。

モノ ク ローナル抗体

具体的には、 抗 HM1. 24抗体産生ハイプリ ドーマの作製は、 Got o , T. らの方法 （Blood ( 1994 ) 84. 1922-1930) によ り行うことができ る。 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日 本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、 平成 7年 4 月 27日に FERM BP- 5233と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託され た抗 HM1. 24抗体産生ハイブリ ドーマを BALB/cマウス （日本ク レア製 ) の腹腔内に注入して腹水を得、 この腹水から抗 HM1. 24抗体を精製 する方法や、 本ハイプリ ドーマを適当な培地、 例えば、 10 %ゥシ胎 児血清、 5 % BM-CondimedHl ( Boehr inger Mannhe im 製） 含有 RPMI 1640培地、 ハイブリ ドーマ SFM 培地 （GIBC0- BRL 製） 、 PFHM- I I培 地 （GIBC0- BRL製） 等で培養し、 その培養上清から抗 HM1. 24抗体を 精製する方法で行う ことができる。

組換え型抗体

本発明では、 モノ ク ローナル抗体と して、 抗体遺伝子をハイプリ ドーマからクローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを 宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体 を用いることができる （例えば、 Carl, A. K. Borrebaeck, James, W . Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in th e United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照） 。 具体的には、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマから、 抗 体の可変 （V) 領域をコー ドする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法 （Chirgwin, J.M. ら、 Bi ochemistry (1979) 18， 5294-5299 ) 、 AGPC法 ( Chmczynski , P. ら 、 (1987) 162, 156-159) 等により全 RNA を調製し、 mRNA Purific ation Kit (Pharmacia製） 等を使用して mRNAを調製する。 また、 Qu ickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製） を用いるこ とによ り mRNAを直接調製することができる。

得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成す る。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First- strand cDN A Synthesis Kit 等を用いて行うことができる。 また、 cDNAの合成 および増幅を行うには 5ノ -Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製） および PCR を用いた 5 ' -RACE 法 （Frohman, M. A. ら、 Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. ら、 Nuclei c Acids Res. (1989) 17， 2919-2932 ) を使用するこ とができる。 得られた PCR 産物から目的とする DNA 断片を精製し、 ベクター DNA と連結する。 さ らに、 これより耝換えベクターを作成し、 大腸菌等 に導入してコロニーを選択して所望の耝換えべクターを調製する。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、 例えば、 ジデォキシ法に よ り確認する。

目的とする抗体の V領域をコードする DNA が得られれば、 これを 所望の抗体定常領域 （C領域） をコー ドする DNA と連結し、 これを 発現ベクターへ組み込む。 または、 抗体の V領域をコー ドする DNA を、 抗体 C領域の DNA を含む発現ベクターへ組み込んでもよい。 本発明で使用される抗体を製造するには、 後述のよ うに抗体遺伝 子を発現制御領域、 例えば、 ェンハンサー、 プロモータ一の制御の もとで発現するよう発現ベクターに組み込む。 次に、 この発現べク ターにより宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させることができる 改変抗体

本発明では、 ヒ トに対する異種抗原性を低下させること等を目的 として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ （Ch imeric) 抗体、 ヒ ト型化 （Humanized ) 抗体などを使用できる。 こ れらの改変抗体は、 既知の方法を用いて製造することができる。

キメラ抗体は、 前記のよ うにして得た抗体 V領域をコ一ドする DN A をヒ ト抗体 C領域をコー ドする DNA と連結し、 これを発現べクタ 一に組み込んで宿主に導入し産生させることによ り得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W096/02576参 照） 。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメ ラ抗体を得る ことができる。

例えば、 キメ ラ抗 HM1.24抗体の L鎖および H鎖を含むプラスミ ド を有する大腸菌は、 各々 Escherichia coli DH5 a (pUC19-l.24L-g κ ) および Escherichia coli

DH5a (pUC19-l.24H-g y 1)と して、 独立行政法人産業技術総合研究 所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、 平成 8年 8月 2 9 日に、 各々 FERM BP- 5646およ び FERM BP - 5644と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託されている (特願平 8- 264756参照） 。

ヒ ト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒ ト抗体とも称され、 ヒ ト 以外の哺乳動物、 たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR； comp lementarity determining region; をヒ 卜キ几体の相 fe決定領域へ 移植したものであり、 その一般的な遺伝子組換え手法も知られてい る （欧州特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W096 /02576参照) 。

具体的には、 マウス抗体の CDR と ヒ ト抗体のフレームワーク領域 (framework-region； FR) を連結するように設計した DNA 配列を、 末端部にォーパーラップする部分を有するように作製した数個のォ リ ゴヌクレオチ ドから PCR 法により合成する。 得られた DNA をヒ ト 抗体 C領域をコードする DNA と連結し、 次いで発現ベクターに組み 込んで、 これを宿主に導入し産生させることによ り得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W096/02576参 照） 。

CDR を介して連結されるヒ ト抗体の FRは、 相補性決定領域が良好 な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成 ヒ ト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように 抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい (Sato, . et al. , Cancer Res. (1993) 53， 851-856 ) 。

例えば、 ヒ ト型化抗 HMl.24抗体の L鎖および H鎖を含むプラスミ ドを有する大腸菌は、 各々 Escherichia coli DH5 a (pUC19-RVLa-A HM-gk)および Escherichia coli DH5 a (pUC19- RVHr- AM - g γ 1 )と し て、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日 本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、 平成 8年 8 月 29曰に、 各々 FERM BP-5645*5 i tt^FERM BP— 5643と してブダぺス 卜 条約に基づき国際寄託されている （特願平 8- 264756参照） 。

キメラ抗体、 ヒ ト型化抗体には、 ヒ ト抗体 C領域が使用され、 細 胞傷害活性を呈するヒ ト抗体 C領域と して、 ヒ ト 例えば、 Cy 1， C ₇2, C y 3, C y 4 を使用することができる。 これらのうち、 特 に C _Y 1， C y 3 を有する抗体が強力な細胞傷害活性、 すなわち、 AD CC活性、 CDC 活性を有し、 本発明に好適に使用される。

キメラ抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒ ト抗体 由来の C領域からなり、 ヒ ト型化抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗 体の相補性決定領域と ヒ ト抗体由来のフ レームワーク領域 （framew ork region； FR) および C領域からなり、 ヒ ト体内における抗原性 が低下しているため、 本発明の治療剤の有効成分と して有用である 本発明に使用される ヒ ト型化抗体の好ましい具体例と しては、 ヒ ト型化抗 HM1.24抗体が挙げられる 098/14580 参照） 。

発現および産生

前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法によ り発現させ 、 取得するこ とができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプ 口モーター、 発現される抗体遺伝子、 その 3 ' 側下流にポリ Aシグ ナルを機能的に結合させた DNA あるいはそれを含むベクターによ り 発現させるこ とができる。 例えばプロモーターノエンハンサ一と し ては、 ヒ トサイ トメガロウィルス前期プロモーター/ェンハンサー

(human cytomegalovirus immediate early promoter/ enhancer) を挙げることができる。

また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモ 一ターノエンハンサ一と して、 レ ト ロウイルス、 ポリオ一マウイノレ ス、 アデノウイルス、 シミアンウィルス 40 (SV40) 等のウィルスプ 口モーター/ェンハンサーゃヒ トェロ ンゲーシヨ ンファクター 1 _α (HEF1 a ) などの哺乳類細胞由来のプロモーターノエンハンサーを 用いればよい。

例えば、 SV40プロモーター/ェンハンサーを使用する場合、 Mull iganらの方法 (Nature (1979) 277, 108) 、 また、 HEFlaプロモー ターノエンハンサーを使用する場合、 Mizushima らの方法 （Nuclei c Acids Res. (1990) 18, 5322) に従えば容易に実施することがで きる。

大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 抗体分泌のため のシグナル配列、 発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現 させることができる。 例えばプロモーターと しては、 lacZプロモー ター、 araBプロモーターを挙げることができる。 lacZプロモーター を使用する場合、 Wardらの方法 （Nature (1098) 341，

544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) 、 araBプロモーターを 使用する場合、 Betterらの方法 （Science (1988) 240, 1041-1043 ) に従えばよい。

抗体分泌のためのシグナル配列と しては、 大腸菌のぺリプラズム に産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei， S. P. et al J.Bacter iol. (1987) 169, 4379 ) を使用すればよい。 ペリプラズムに産生 された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切にリ フォールド （refo Id) して使用する （例えば、 W096/30394を参照） 。

複製起源としては、 SV40、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス 、 ゥシパピローマウィルス（BPV) 等の由来のものを用いることがで き、. さらに、 宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べクタ 一は選択マーカーと して、 アミ ノグリ コシドトランスフェラーゼ（A PH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサンチング ァニンホスホリ ポシルトランスフェラーゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むこ とができる。

本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の産生系を使用す ることができる。 抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in v ivo の産生系がある。 in vitroの産生系と しては、 真核細胞を使用 する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を用い る産生系がある。 動物細胞と しては、 （ 1 ) 哺乳類細胞、 例えば、 CHO, C0S、 ミ エローマ、 B HK (baby hamster kidney ) 、 HeLa, Vero、 （ 2 ) 両生類細胞、 例えば、 アフリカッメガエル卵母細胞、 あるいは （ 3 ) 昆虫細胞、 例えば、 sf9， sf21, Tn5などが知られて いる。 植物細胞と しては、 ニコティアナ （Nicotiana ) 属、 例えば 二： 3ティアナ . タノ カム (Nicotiana tabacum ) 由来の糸田胞カ 失口ら れており、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞と しては、 酵母 、 例えば、、 サッカロ ミ セス (Sac char omyces ) 属、 列えばサッカロ ミセス * セ レビシェ (Saccharomyces serevisiae) 、 糸状菌、 例え ば、 ァスぺノレギノレス （Aspergillus ) 属、 例えばァスペルギルス · 二ガー (Aspergillus niger ) など力 S失口られている。

原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞と しては、 大腸菌（E. coli) 、 枯草菌が知られている。

これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し 、 形質転換された細胞を in vitroで培養することによ り抗体が得ら れる。 培養は、 公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液と して、 DM EM, MEM, RPMI1640, IMDM を使用することができ、 牛胎児血清（FCS ) 等の血清補液を併用することもできる。 また、 抗体遺伝子を導入 した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、 in vivo にて抗体を産 生してもよい。

一方、 in vivo の産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が挙げられる。 動物を使用する場合、 哺乳類動物 、 昆虫を用いる産生系がある。

哺乳類動物と しては、 ャギ、 プタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥシなどを 用いることができる （Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology App lication, 1993) 。 また、 昆虫と しては、 カイコなどを用いること ができる。

植物を使用する場合、 タバコなどを用いることができる。

これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、 動物または植物 の体内で抗体を産生させ、 回収する。 例えば、 抗体遺伝子をャギ j3 カゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺 伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。 抗体遺伝子が揷 入された融合遺伝子を含む DNA 断片をャギの胚へ注入し、 この胚を 雌のャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれる トランスジェ 二ックャギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。 トランスジ ニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を 増加させるために、 適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用 してもょレヽ （Ebert， K. M. et al. , Bio/Technology (1994) 12, 69 9-702 ) 。

また、 カイコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を挿入したパキュ ロウィルスをカイコに感染させ、 このカイコの体液よ り所望の抗体 を得る (Susumu, M. et al.， ature (1985) 315, 592-594 ) 。 さ らに、 タパコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用べクタ 一、 例えば pM0N530 に挿入し、 このベクターをァグロバタテリ ゥム ， ッメ ファシエンス (Agrobacterium tumefaciens ) のよ う なノ ク テリ アに導入する。 このパクテリ アをタバコ、 例えばニコチニァ ' タパカム （Nicotians tabacum ) に感染させ、 本タノくコの葉より所 望の抗体を得る （Julian, K. - Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1994 ) 24, 131-138 ) 。

上述のように in vitroまたは in vivo の産生系にて抗体を産生す る場合、 抗体重鎖 （H鎖） または軽鎖 （L鎖） をコー ドする DNA を 別々に発現べクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよい し、 あるいは H鎖および L鎖をコー ドする DNA を単一の発現べクタ 一に組み込んで、 宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開 番号 W094- 11523参照） 。

上述のように得られた抗体は、 ポリエチレングリ コール（PEG) 等 の各種分子と結合させ抗体修飾物と して使用することもできる。 本 願特許請求の範囲でいう 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含さ れる。 このよ うな抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な 修飾を施すことによって得ることができる。 これらの方法はこの分 野においてすでに確立されている。

抗体の分離、 精製

前記のように産生、 発現された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離 し均一にまで精製することができる。 本発明で使用される抗体の分 離、 精製はァフィ二ティークロマ トグラフィ一によ り行う ことがで きる。 ァフィ二ティークロマ トグラフィ一に用いるカラムと しては 、 例えば、 プロティ ン Aカラム、 プロティ ン Gカラムが挙げられる 。 プロテイン Aカラムに用いる担体として、 例えば、 Hype r D , P0R OS , Sepharos e F. F.等が挙げられる。

その他、 通常の蛋白質で使用されている分離、 精製方法を使用す ればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば、 上記ァフィニテ ィークロマ トグラフィ一以外のクロマ トグラフィー、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合わせれば、 本発明で使 用される抗体を分離、 精製することができる。 クロマ トグラフィー と しては、 例えば、 イオン交換クロマ トグラフィー、 疎水クロマ ト グラフィー、 ゲルろ過等が挙げられる。

抗体の濃度測定

上記方法で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定または E L I S A 等により行う ことができる。 すなわち、 吸光度の測定による場合に は、 本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプルを PBS (-)で適 当に希釈した後、 280nmの吸光度を測定し、 1 mg/mlを 1.350Dと し て算出する。 また、 ELISAによる場合は以下のよ うに測定すること ができる。 すなわち、 0.1M重炭酸緩衝液 （pH9.6) で l w g Zmlに 希釈したャギ抗ヒ ト IgG (BIO SOURCE 製） 100 1 を 96穴プレート

(Nunc製） に加え、 4 °Cでー晚イ ンキュベーショ ンし、 抗体を固層 化する。

ブロ ッキングの後、 適宜希釈した本発明で使用される抗体または 抗体を含むサンプル、 あるいは標品と してヒ ト IgG (CAPPEL 製） 10 0 μ 1 を添加し、 室温にて 1時間インキュベーショ ンする。 洗净後 、 5000倍希釈したアル力リ フォスファターゼ標識抗ヒ ト IgG (BIO S 0URCE 製） 100 μ 1 を加え、 室温にて 1時間インキュベートする。 洗浄後、 基質溶液を加えイ ンキュベーショ ンの後、 MICR0PLATE REA DER Model 3550 (Bio-Rad 製） を用いて 405nmでの吸光度を測定し 、 目的の抗体の濃度を算出する。

F CM解析

骨髄腫細胞と本発明で使用される抗体との反応性は、 FCM (フ口一 サイ トメ ト リー） 解析で行う ことができる。 細胞と しては、 樹立細 胞株あるいは新鮮分離細胞を用いることができる。 樹立細胞株と し ては、 骨髄腫由来 RPMI8226 (ATCC CCL 155) 、 同 U266(ATCC TIB 19 6)、 同 KPMM2 、 同 KPC-32、 形質細胞腫由来 ARH- 77 (ATCC CRL 1621) などを用いることができる。

上記細胞を PBS (-)で洗浄した後、 FACS緩衝液 （ 2 %ゥシ胎児血清 、 0.05%アジ化ナト リ ウム含有 PBS(_)) で 25 μ g /mlに希釈した抗 体あるいはコントロール抗体 100 μ 1 を加え、 氷温化 30分ィンキュ ペートする。 FACS緩衝液で洗浄した後、 25μ g /mlの FITC標識ャギ 抗マウス抗体 (GAM, Becton Dickinson 製） 100 μ 1 を加え、 氷温 化 30分間イ ンキュベートする。 FACS緩衝液で洗浄した後、 600 μ 1 あるレヽ ίま 1 mlの FACS緩衝液 ίこ懸獨し、 FACScan (Bec ton Dickinson 製） で各細胞の蛍光強度を測定すればよい。

スク リーユング方法

HM1. 24抗原の発現増強剤をスク リーニングするには、 例えば、 無 刺激の状態で HM1. 24抗原を発現していないか、 あるいは少なく発現 している細胞を用いて FCM 解析にて測定することができる。 例えば 、 実施例に記載の細胞を被検物質と 1〜 2 日イ ンキュベー トし、 つ いで一次抗体と してマウス抗ヒ ト HM1. 24抗体にて染色する。 細胞を 洗浄し、 さ らに二次抗体と して FITC標識抗マウス I _gG 抗体によ り染 色する。 最後に、 細胞を洗浄したのち、 フローサイ トメータによ り 細胞の FI TC蛍光強度を測定すればよい。

また、 前記の間接法による染色ではなく、 細胞を高濃度の免疫グ ロブリ ンで処理し、 Fcレセプターをブロ ックした後に F ITC標識した 抗ヒ ト HM1. 24抗体を用いた直接法による染色により FCM 分析するこ ともできる。

また、 HM1. 24プ口モーター配列を用いたレポータ一遺伝子ァッセ ィによ り HM1. 24抗原の発現増強剤をスク リ一ユングすることができ る。 レポーター遺伝子と しては、 ルシフェラーゼを用いることがで きる。 HM1. 24プロモーター配列をレポーター遺伝子の上流に含むプ ラスミ ドを構築し、 ついで、 細胞に形質転換した後、 得られた細胞 を被検物質と 1〜 2 日培養し、 回収された細胞をルシフヱラーゼァ ッセィするこ とで、 HM1. 24抗原の発現を増強する薬剤をスク リー二 ングするこ とができる。

細胞傷害活性

A D C C活性の測定

本発明に使用される抗体は、 .細胞傷害活性と して、 例えば、 ADCC 活性を有する抗体である。

本発明において造血器腫瘍細胞に対する ADCC活性は、 次のよ うに して測定するこ とができる。 まず、 ヒ トの末梢血や骨髄より比重遠 心法で単核球を分離し、 エフェクター細胞 （Effector cell ： E ) と して調製する。

また、 標的細胞 （Target cell ： T ) と しては、 RPMI8226 (ATCC CCL 155) , U266 (ATCC TIB 196) , KPMM2 , KPC-32, ARH-77 (ATCC CRL 1621)、 HEL、 患者由来の細胞などを⁵¹ Crにより標識して、 標的 細胞と して調製する。 次いで、 標識した標的細胞に ADCC活性を測定 する抗体を加えインキュベート し、 その後、 標的細胞に対し適切な 比のエフェクター細胞を加えィンキュベートする。

インキュベー ト した後上清を取り、 ガンマカウンターで放射活性 を測定する。 その際、 最大遊離放射能測定用に、 1 %の NP- 40 を用 いることができる。 細胞傷害活性 （％) は、 （A- C)バ B- C) X100 で 計算することができる。 なお、 Aは抗体存在下において遊離された 放射活性 （cpm ) 、 Bは NP- 40 によ り遊離された放射活性 （cpm ) 、 Cは抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性 （cpm ) であ る。

細胞傷害活性の増強

ADCC活性のような細胞傷害活性を発揮するには、 ヒ トにおいては 抗体定常領域 （C領域） と して Cy、 特に C_Y 1， Cy 3 を使用する ことが好ましい。 さ らに、 抗体 C領域のアミ ノ酸を一部付加、 改変 、 修飾することによ り、 よ り強力な ADCC活性、 あるいは CDC 活性を 誘導するこ とができる。

例えば、 ァミ ノ酸置換による IgG の IgM 様ポリマー化 （Smith, . I. F. & Morrison, S. L. BIO/TEC画 LOGY (1994) 12, 683-688 ) 、 アミ ノ酸付加による IgGの IgM様ポリマー化 （Smith, R. I.F. et al. ， J. Immunology (1995) 154, 2226-2236) 、 L鎖をコードする遺伝 子の直列連結での発現 （Shuford, W. et al.， Science (1991) 252 ， 724-727 ) 、 アミ ノ酸置換による IgG の二量体化 （Caron， P. et al. , J. Exp. Med. (1992) 176, 1191-1195, Shopes, B. , J. Immu nology (1992) 148， 2918-2922) 、 化学修飾による I g Gの二量体 ィ匕 （Wolff， E. A. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 2560-2565) 、 および抗体ヒ ンジ領域のアミノ酸改変によるエフェクター機能の導 入 (Norderhau , L. et al. , Eur. J. Immunol. (1991 )

21， 2379-2384) が挙げられる。

これらは、 プライマーを利用したオリ ゴマー部位特異的変異導入 法、 制限酵素切断部位を利用した塩基配列の付加、 共有結合をもた らす化学修飾剤を使用することによって達成される。

患者の治療

本発明の態様のひとつは、 HM1.24抗原の発現量を増強する薬剤、 または、 通常の状態では細胞表面上に HM 1.24抗原を発現していない 細胞に対して HM1.24抗原の発現を誘導する薬剤と、 抗 HM1.24抗体を 患者に投与することによ り、 造血器腫瘍を治療する方法に関する。 造血器腫瘍と しては、 例えば、 骨髄腫、 好ましくは多発性骨髄腫、 リ ンパ球系腫瘍、 例えばリ ンパ腫、 好ましく はホジキン病または非 ホジキンリ ンパ腫、 リ ンパ球性白血病、 好ましくは、 急性 Tリ ンパ 性白血病、 慢性 T リ ンパ球性白血病、 急性 B リ ンパ性白血病、 慢性 B リ ンパ性白血病、 および骨髄性白血病、 例えば急性骨髄性白血病 、 慢性骨髄性白血病である。 さ らに、 FAB分類で L1〜L3、 M0〜M7の 急性白血病も含まれる。

HM1.24抗原の発現量を増強する薬剤、 または、 通常の状態では細 胞表面上に HM1.24抗原を発現していない細胞に対して龍 1.24抗原の 発現を誘導する薬剤としては、 イ ンターフェロ ン 、 イ ンターフエ ロン γ、 IRF- 2蛋白質あるいは IRF- 2蛋白質をコードする DNA を含む ベクターであり、 好ましく は、 インターフェロン αまたはインター フエロ ン γである。 イ ンターフェロ ンひまたはイ ンターフェロ ン γ の投与量と しては、 人体に投与した際に、 血中濃度最高値と して 1 〜10000 I . U. /ml (国際単位） 、 より好ましくは 5〜： L000 I . U. /ml 、 さ らに好ましくは 5〜500

I . U. /ml , 最も好ましくは 5〜50 I . U. /mlになる投与量である。 静脈内投与の場合、 好ましく は 1万〜 1000万 I . U.、 より好ましく は 10万〜 1000万 I . 11.、 さ らに好ましくは 50万〜 500万 I . U.、 最も好 ましく は、 100万〜 500万 I . U.を 1回あたり投与するこ とである。 ィ ンターフェロ ンと抗 HM1. 24抗体は、 一緒に投与してもよいし、 別個 に投与してもよい。 後者の場合には、 まず、 イ ンターフェロ ンを投 与し、 96時間以内に抗 HM1. 24抗体を投与することが好ましい。 イン ターフヱロン投与と抗 HM1. 24抗体投与の間隔は、 イ ンターフェロ ン 投与によつて HM1. 24抗原の発現量が増強されている限り制限はない が、 好ましく は 96時間以内であり、 よ り好ましく は 72時間、 さ らに 好ましくは 48時間以内である。 .

患者の臨床応答に応じてィンターフェ口ンと抗 HM1. 24抗体を複数 回、 交互に投与することも本発明の範囲内である。 投与経路は、 血 流中に直接投与されるこ とが望ましく、 静脈内投与あるいは動脈内 投与が好ましい。 持続的に投与することも可能であり、 点滴静脈内 投与でもよい。 また、 皮下投与や筋肉投与でもよい。

本発明の他の態様は、 ィンターフェ口 ンひまたはィ ンターフェ口 ン V と抗 HM1. 24抗体を含有する造血器腫瘍の治療剤または医薬組成 物に関わる。 本発明の治療剤または医薬組成物は、 従来、 インター フエ口ンゃ抗体製剤に用いられてきた薬学的に許容しうるビヒクル 、 例えば、 生理食塩水または 5 %デキス トランを通常の安定化剤や 賦形剤と一緒に含有することができる。

本発明の他の態様では、 造血器腫瘍を有する患者を治療するため のキッ トであって、 抗 HM1.24抗体を有効成分と して含有する医薬組 成物と、 イ ンターフェロ ン αまたはイ ンターフェロ ン γ との併用療 法に関する記載を含む指示書とからなるキッ トを提供する。

本発明の他の態様では、 抗 HM1.24抗体を有効成分と して含有する 、 造血器腫瘍を有する患者を治療するための医薬組成物であって、 ィ ンターフェ口 ン αまたはィ ンターフェ口 ン γ と併用するための医 薬組成物を提供する。

本発明の他の態様は、 匪 1.24抗原の発現は増強する、 または誘導 する物質をコー ドする遺伝子を投与することに関わる。 例えば、 ィ ンターフェロンひ 、 イ ンターフェロ ンお、 IRF- 2の DNA 配歹 IJは公失口 であり、 所望のベクターに組み込んで患者に投与することができる 。 ベクターとしては、 遺伝子治療に用いられるアデノ ウイルスべク ター （伊!！えば、 pAdexLew) やレ ト ロウイルスベクター （ィ列えば、 pZIPne 0 ) などに挿入して、 生体内に投与する。 投与方法は、 ex vivo で あってもよいし、 in vivo であってもよい。 また、 naked DNA を投 与することも可能である。 実施例

実施例 1 . イ ンターフェロ ンひによる骨髄腫細胞における HM1.24 抗原発現量の増強

ヒ ト骨髄腫細胞株 U266 (ATCC TIB 196) および多発性骨髄腫患者 の骨髄由来の骨髄腫細胞を 10%ゥシ胎児血清 （Whittaker Bioprodu cts， Inc, Walkersville, MD, USA ) を含む RPMI1640培地 (Sigma, St Louis, M0， USA) を用い、 5 %炭酸ガス培養器中、 37°Cで培養 した。 マウス抗 HM1.24抗体を生産するハイプリ ドーマは、 独立行政 法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つ くば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に寄託番号 FERM BP-5233 (寄 託日 1995年 4月 27日） として寄託されている。

骨髄腫細胞 （ 1 X10⁵ /ml) を 1000U/mlの天然型イ ンターフエ ロン— _α (大塚製薬、 東京） 存在下又は非存在下に 48時間培養し、 HM1.24抗原 （それをコードする塩基配列を配列番号 ： 1に示す） の 変化をフ口一サイ トメ ト リ一で測定した。 細胞を 0.1%ゥシ血清ァ ルブミ ン （Sigma, St Louis, MO, USA) と 0.02%アジ化ナト リ ウム を添加したリ ン酸緩衝液 （Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) で 洗浄後、 ヒ ト免疫グロブリ ン （ 3 mgZml、 ミ ドリ十字、 大阪） を加 えた PBS (100 1 ) に浮遊させ、 4 °Cで 15分間、 反応させた。

その後、 2 μ 1 の FITC- ヒ ト IgGl ( 1 mg/ml) 又は FITC—抗 HM 1.24抗体 （ l mgZml) を加え、 4 °Cで 60分間、 染色した。 患者骨髄 腫細胞を用いた場合、 骨髄腫細胞の同定には 20μ 1 の PE- anti- CD38 (Becton Dickinson, San Jose , CA, USA ) をカロえ、 二重染色を行 つた。 染色後、 細胞を PBCで 2回洗浄し、 1 %パラホルムアルデヒ ド （和光純薬、 大阪） を含む PBS中で保存した。 その後、 フローサ ィ トメーター （EPICS XL, Coulter, Hialeah, FL, USA ) を用い、 丽 1.24抗原の発現を解析した。

その結果、 骨髄腫細胞株 U266 (図 1 ) および患者骨髄腫細胞 （図 2 ) は無刺激の状態で HM1.24抗原を発現しており、 イ ンターフエ口 ンー ひの刺激によ り、 HM1.24抗原の発現量はさらに増加した。

イ ンターフェ ロ ン一 _αは骨髄腫細胞の HMl.24抗原の発現をさらに 増強させ、 骨髄腫細胞へ結合する抗 HM1.24抗体の数を増加させた。 抗画 1.24抗体による治療の抗腫瘍効果は、 結合する抗体数に比例す ることから、 骨髄腫患者において、 インターフェロン一 αを投与し た後に抗 HM1.24抗体治療を行う ことは、 抗体による治療効果を増強 し、 よ り有効性を高める治療になると期待される。

実施例 2. レポーター遺伝子解析による HM1.24抗原の発現機能の 解析

抗原の発現誘導が HM1.24プロモーター領域によ り調節されている かどうか調べるために、 プロモーター領域でのレポーター遺伝子解 析を行った。

HM1.24プロモーター領域の遺伝子 （配列番号 ： 3 ) は PCR ク ロー ユングにより得た。 ヒ ト末梢血単核細胞よ り DNAzol reagent (GIBC 0 ) を用い、 ゲノム DNA を調製した。 得られたゲノム DNA を錶型と して、 プライマー HM2k (aaaggtaccagctgtctttctgtctgtcc ) (配歹 [J 畨号 ： 4 ) 、 及び BST2B (atagtcatacgaagtagatgccatccag リ (酉 ΰ列 番号 ： 5 ) を用い、 TaKaRa Taq (宝酒造、 大津） を用い Thermal Cy cler 480 (Perkin Elmer, CA, USA ) にて PCR (94°C 1 min 、 55 °C 1 min 、 72 °C 1 min 、 30cycles) を rつた。

得られた約 2 kbの断片を制限酵素 Kpnl及び Bglll (宝酒造） にて処 理し、 レポータージーンプラスミ ド pGL3_basic (Promega, WI， USA ) の Kpnl- Bglllサイ トに DNA ligation kit ver. II (宝酒造） を用 いてク ローニングし、 コンビテン ト E. coli JM109 (ニッボンジー ン） を形質転換した。 形質転換した大腸菌を 100μ g Zmlのアンピ シリ ンを含む LB培地にて 37°C培養し、 QIAGEN plasmid maxi kit ( QIAGEN, Hilden, Germany ) にてプラスミ ドを調製した。

得られたプラスミ ド HM- 2k/GL3 を制限酵素 Kpnl及び Xholにて処理 し、 kilo-sequence 用 deletion kit 、主酒造) こて deletion clone を作製し、 転写開始点上流一 493bpまでを含むプラスミ ド HM- 493/GL 3を得た。 また匪- 2k/GL3 を制限酵素 Kpnl及び ΑΠΙΙ にて処理し、 上記方法にて deletion cloneを作製し、 転写開始点上流— 151bp又 は _77bpまでを含む、 それぞれ HM- 151/GL3及び HM-77/GL3 を得た。 糸田胞へのプラスミ ド導人は Polyethylenimine— Transferrinfectio n Kit (Tf PEI-Kit) (Bender Mediystems , Vienna, Austria) 、 ノレシフ ェラ I ア ツセィは Dual- Lucif erase Reporter Assay Syst e m (Promega ) を用レヽた。 細胞株を 50 μ Μ Def f err ioxamine, 10%

FBS を含む RPMI- 1640 にて一晩培養した。 導入するプラスミ ドを Tf-PEIとの複合体にするため、 終濃度 20 μ g Zmlのレポータージー ンプラスミ ド、 0.4/i g /mlの pRL - SV40、 1 g /ml Tf-PEI 試薬 の混合液を作製し、 室温で 20分間インキュベート した。 5 X10⁵ 細 胞 /mlの細胞を Tf-PEI · プラスミ ド混合液の 3倍容加え、 4時間 37 °Cにてインキュベート し、 培地にて洗浄後、 2 X10⁵ 細胞 Zmlの濃 度で 1 wellあたり 100μ 1 を 96ウィル平底プレートで培養した。

I F Ν— αを終濃度 0， 10， 100、 又は lOOOUZmlとなるよ う添 加し、 37°C 2 日間培養した。 細胞を PBS (-)にて洗浄後、 20μ 1 の Pa ssive Lysis Bufferにて溶解し、 6 μ 1 を C96 White Polysorp Flu oronunc plate (Nunc) ίこァプフィ した。 Luminoskan (Labsystems ) にて基質液 30μ 1 、 測定時間 10秒にて Firefly 及び Renilaそれぞ れの発光強度を測定した。 測定値は、 Firefly/Renilaにて補正後、 コント ロール （medium) を 1 として相対活性を求めた。

その結果、 上流 2 kbp 及び 493bpともに IFN α濃度依存的にレポ 一ターのルシフエラーゼ活性が上昇しており、 プロモーター領域の 転写活性上昇が抗原の発現誘導を引き起こすことを確認した （図 3 さ らに、 転写開始点上流 151bp又は 77bpのレポータープラスミ ド を用いた結果では、 上流 151bpのレポータープラスミ ドでは IFN a 刺激によ りルシフエラーゼ活性の上昇が認められた。 一方上流 77bp のレポータープラスミ ドでは IFN α刺激による活性の変化は認めら れなかった （図 4 ) 。 77〜： 151bpの領域には GAS element, ISRE に 相同性の高い配列が存在し、 IFN α刺激に応答して活性化する転写 調節因子であることから、 IRF ファミ リ一の転写調節因子が活性に 関与していることが示された。

実施例 3. イ ンターフェ ロ ン Vによる骨髄腫細胞における HM1.24 抗原発現量の増強

実施例 1に記載の方法により、 1000U/mlの天然型ィンターフェ ロ ン T/ (R & D System社） を用いて解析した。 その結果、 骨髄腫細 胞株 U266 (図 5 ) および患者骨髄腫細胞 （図 6 ) において、 インタ 一フエロン α と同様に、 HM1.24抗原の発現量の増大が観察された。

実施例 4. IRF-2の HM1.24プロモーター領域への結合

HM1.24プ口モーター領域に結合する転写因子を同定するために、 HM1.24プロモーター領域をプローブと L^cElectrophoresis Mobil i ty Shift Assay (EMSA) を次のように行い、 結合因子として IRF-2 を同定した。

( 1 ) 核抽出物の調製

骨髄腫細胞 U266-B1 (ATCC-TIB196) を 10%FBS (HyClone) を含む RPMI - 1640 培地（GIBC0- BRL) にて 37°C、 5 % C0₂ インキュベーター 中で培養した。 インターフ ェ ロ ンお (IFN- a )(Pepro Tech EC)によ る細胞への刺激を行うため、 培地中に IFN— αを終濃度 1000U/ml となるよ うに添加し、 添加後 30分、 2時間、 4時間及び 8時間の細 胞を回収した。 細胞を冷 PBS (-)に懸濁、 l，000rpmにて遠心して上清 を捨て、 10mM Tris, lOmM NaCl, 6mM MgCl₂ 溶液に懸濁した。

氷中に 5分間静置後に再度遠心し、 上清を捨てた。 lOmM Tris, 1 OmM NaCl, 6mM MgCl₂ , ImM DTT, 0.4mM PMSF, ImM Na₃V0₄に細胞を 懸濁した。 ガラス製ホモジ工ナイザーを用いて細胞を氷上でホモジ ェナイズし、 6000 g 3分間遠心し、 上清を捨てた。 抽出緩衝液 （20 ⁰/₀グリセロ ーノレ、 20mM HEPES, 420mM NaCl, 1.5mM MgCl₂ , 0.2mM E DTA, 0.2mM PMSF, ImM DTT, 0. ImM Na₃V0₄ , 2 mg/mlアブ口チニン 、 5mgZmlロイぺプチン） に細胞を懸濁し、 氷中に 20分間静置した 。 12000 g 10分間遠心し、 上清を回収した。

( 2 ) 標識プローブの調製

プローブと して、 HM1.24プロモーター領域において GAS (IFN- y 活性化部位 ： GAS コンセンサス配列は ttncnnnaa (配列番号 ： 8 ) )、 ISRE (IFN—ひ lj激応答因子 ： ISREコ ンセンサス酉己歹【Jは ngaaanngaaac t (配列番号 ： 9 ))とホモロ ジ一のある配列 （ttcccagaa (配列番号 ： 10) および ggaaactgaaact (配列番号 ： 11) を含む ISRE2 を作製した 。 すなわち、 オリ ゴ DNA ISRE-F2 (aatttctgggaaactgaaactgaaaacct (酉己歹 U番号 ： 12) )及び ISRE— R2 (aattaggttttcagtttcagtttcccaga ( 配列番号 ： 13))を混合し、 ァニールさせ 2本鎖 DNA プローブ ISRE2 と した。

ま 7こ、 才ジ ゴ DNA adp— 1 catggcat ctact t cgtatgac tat tgcagagtgc c (酉己グ U番"^ ： 14ノ)及ひ adp— 2 (catgggcactctgcaatagtcatacgaagtaga tgc (配列番号 ： 15))を混合し、 ァニールさせ unrelated プローブ ad p と した。 プローブの標識は Band Shift Kit (Amersham Pharmacia Biotech) を用い、 その標準プロ トコールに準じて行った。 すなわ ち、 上記にて作製した 2本鎖 DNA50ng を [ひ —³² P]dATP (20μ Ci)( Amersham Pharmacia Biotech) を含む反応液中で Kle丽断片のポリ メラーゼ反応を 37°C、 1時間行った。 反応終了した溶液を 2倍に希 釈後 NicK Spin Column (Amersham Pnarmacia Biotech) に力、け、 16 OOrpm 、 4分間遠心して回収した溶液を標識プローブと した。

( 3 ) IFN -ひによる刺激によ り産生された結合因子の経時変化 Band Shift Kit (amersham pharmacia biotech, NJ, USA)の標準 プロ トコールに従って以下の操作を行った。 前記 （ 1 ) において経 時的に調製した抽出物 5 μ gにキッ ト添付の 10x 結合緩衝液 （100m M Tris-HCl (pH7.5) , 500mM NaCl, 5mMDTT) 2 μ I , 50%グリセ口 ール 4 μ 1 ， 1 %ΝΡ-40 1 μ 1 、 及び 1 _μ 1 の poly(dI- dC) · poly (dl-dC) を加え、 前記 （ 2 ) で調製した³² P 標識 ISRE-2プローブ 2 μ ΐ を添加し、 水を加えて全量を 20ulと した後、 この反応混合物を 室温にて 20分間ィンキュペートし、 前記抽出物中に存在する可能性 のある結合因子と前記³² P 標識 ISRE-2プローブとの結合を許容した 反応液 18 μ 1 に 10X染色液 （Kit に添付） 2 μ 1 を加え、 1 XTr is—グリ シン緩衝液 （25mM Tris, 190mMグリ シン、 1 mM EDTA, pH8 .1) 中、 7· 5 %アク リルアミ ドゲル上で電気泳動し、 電気泳動後、 ゲルを濾紙にはりつけて蛋白質を濾紙に移行させた。 ゲルドライヤ 一にて乾燥した濾紙を X線フィルムに感光させ、 シグナルを検出し た。

比較のため、 抽出物を添加しない反応液 [(NEC- )]、 インターフエ ロ ン αによ り刺激しないで培養した細胞培養物からの抽出物を添加 した反応液 [Oh] 、 8時間の培養液の抽出物に標識プローブの代り に未標識 ISRE2 プローブ 50ngを添加した反応液 [8h (+cold)] 、 及 び 8時間の培養後の抽出液に unrelated プローブ adp を 50ng添加し た反応液 [ 8 h ( + cold unrelated)]を用意し、 上記を同様に処理し てシグナルの検出を行った。

結果を図 7に示す。 この図 7から明らかな通り、 HM1.24プロモー ターの一部に相当する 2本鎖 DNA と結合する物質が、 イ ンターフエ 口ン刺激下で培養した U266- B1 細胞中に経時的に増加した。

( 4 ) 各種抗体との反応による転写因子の同定

前記 （ 1 ) に記載したようにして、 骨髄腫細胞 U266- Bl (ATCC-TI B196) を lOOOUZmlのィ ンターフェロ ン一ひの存在下で 8時間培養 し、 抽出物を調製した。 Band Shift Kit (Amercham Pharmacia Bio tech) の標準プロ トコールに従って次の操作を行った。 すなわち、 5 gの抽出物に抗体 2 μ gを添加し、 室温にて 15分間ィンキュベ ート し、 抽出液ノ抗体反応液を得た。 前記キッ ト添付の 10X結合緩 衝液 2 μ 1、 50%グリセロール 4 μ 1、 1 % ΝΡ-40 1 μ 1及び 1 μ 1 の Poly (dl-dC) · Poly (dl- dC) に、 前記抽出液/抗体反応液 2 _β 1及び前記 （ 2 ) で調製した標識プローブ 2 μ 1 を添加し、 水 を加えて全量を 20 μ 1 と した後、 この反応混合物を室温にて 20分間 ィンキュベー トした。

この反応混合物を、 前記 （ 3 ) に記載したようにして電気泳動に かけ、 シグナルの検出を行った。

上記の抗体と して、 次の抗体 （いずれも、 Santa Cruz Biotechno logyより） を使用した。

抗—ヒ ト STAT1 p84/p91 (E - 23) ： (説明） ゥサギポリ ク ローナノレ 抗体 (SC-346X)

抗ーヒ ト STAT2 (C-20) ：ゥサギポリ ク ローナル抗体 (SC-476X) 抗ーマウス STAT3 (K-15) ：ゥサギポリ ク ローナル抗体 （SC - 483X) 抗ーヒ ト ISGF-3o/p48 (C - 20) ：ゥサギポリ クローナル抗体 （SC- 4 96X)

抗—ヒ ト IRF- 1 (C - 20) ：ゥサギポリ クロ一ナル抗体 (SC-497X) 抗ーヒ ト IRF-2 (C-19) ：ゥサギポリ クローナル抗体 （SC- 498X) 抗—マウス ICSAT (M - 17) ：ャギポリ クローナル抗体 (SC-6059X) また、 対照と して、 インターフェロンの刺激なしに培養した細胞 の抽出物を用いた反応液 [Oh] ； lOOOUZmlのイ ンターフェロ ン一 α刺激下で 8時間培養した細胞の抽出物を添加し、 抗体を添加しな い反応液 [8h] ； 標識 ISRE2 プローブの代りに未標識 ISRE2 プロ一 ブ 50ngを添加した反応液 [8h( + cold)] ；及び標識 ISRE2 プローブの 代りに未標識の dpプ口ープ 50n_gを添加した反応液 [8h(+unrelated cold) を用意し、 上記の同様に処理した。

結果を図 8に示す。 図 8から明らかな通り、 インターフェ ロ ン一 の刺激下で培養した細胞のからの抽出物中の標識 ISRE2 プローブ と結合する成分は抗一 IRF-2 抗体とのみ結合し、 HM1.24プロモータ 一に結合してそれを活性化する因子は、 転写因子 IRF- 2 であること が示された。

実施例 5 . IRF- 2による HM1.24プ口モーター活性化の確認

IRF-2 共発現による HM1.24プロモーター活性への影響を U266細胞 を用いたレポータージーンアツセィによ り測定し、 実際に IRF- 2 が HM1.24プロモーターの転写活性化作用を持つことを明らかにした。 以下の実験では、 骨髄種細胞株 U266- B1(ATCC TIB196)を用いた。 細 胞は、 10%FBS(GIBC0 BRL)を含む RPMI- 1640 培地（GIBC0) (以下 medi um) によ り、 5 %C0₂ incubator にて培養した。

( 1 ) HM1.24プロモーター領域を含むプラスミ ドの構築

HM1.24プロモーター領域の遺伝子は PCR cloning により得た。 ヒ ト末梢血単核細胞よ り DNAzol reagent(GIBCO) を用い、 ゲノム DNA を調製した。 得られたゲノム DNA を錶型と して、 プライマー HM2k ( aaaggtaccagctgtctttctgtctgtcc) (配歹 lj番号 ： 16) 、 BST2B (atag tcatacgaagtagatgccatccag) (配歹 (J番号 ： 17) を用レヽ、 TaKaRa Taq ( 宝酒造、 大津） を用い Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer, CA, US A)にて PCR (94°C 1分間、 55°C 1分間、 72°C 1分間、 30サイ クル） を行った。

得られた約 2 kbの断片を制限酵素 Kpnl， Bglll (宝酒造） にて処 理し、 レポータージーンプラスミ ド pGL3- basic (Promega, WI， USA ) の Kpnl， Bglll サイ トに DNA ligation kit ver. II (宝酒造） を 用いてクローニングし、 コンビテント E. coli JM109 (ニッボンジー ン） を形質転換した。 形質転換した大腸菌を 100 w g/mlのアンピシ リ ンを含む LB培地にて 37°C培養し、 QIAGEN plasmid maxi kit (QLA GEN, Hilden, Germany) にてプラスミ ドを調製した。

得られたプラスミ ド HM- 2k/GL3 を制限酵素 Kpnl， Xholにて処理し 、 kilo-sequence 用 deletion kit (宝酒造) にて欠失クローンを作 製し、 転写開始点上流- 491bpまでを含むプラスミ ド HM- 491/GL3を得 た。 また HM- 2k/GL3 を制限酵素 Kpn I, Aflllにて処理し、 上記方法 にて欠失ク口ーンを作製し、 転写開始点上流- 151bpまでを含む HM-1 51/GL3, を得た。

さらに HM- 2k/GL3 を鎊型と してプライマー 10S (tttcggtacctaat taatcctctgcctg) (配列番号 ： 18) および GLプライマー 2 (ctttatgt ttttggcgtcttcca) (配列番号 ： 19) を用い、 TaKaRa Taq (宝酒造、 大津） を用 ヽ Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer, CA, USA) (こて PC R (94°C 1分間、 55°C 1分間、 72°C 1分間、 30サイクル） を 行った。 得られた断片を制限酵素 ΚρηΙ, Bglll (宝酒造） にて処理 し、 レポータージーンプラスミ ド pGL3-basic (Promega, WI, USA) の Kpnl， Bglll サイ トに ligation high (東洋紡） を用いてク ロー ユングし、 コンビテン ト E. coli JM109 (二ツボンジーン） を transf orm した。

形質転換した大腸菌を 1 0 0 _g/mlのアンピシリ ンを含む LB培地 にて 37°C培養し、 QIAGEN plasmid maxi kit (QIAGEN, Hilden, Ger many) にてプラスミ ドを調製した。 こ う して転写開始点上流 125bp までを含む HM- 125/GL3を得た。 また HM- 2k/GL3 を铸型と してプライ マー HMP700 (aaaggtaccagagtttacctggtatcctgg) (配歹 IJ番号 ： 20) お よび GLプライマー 2を用い、 同様の手順にて PCR を行い、 pGL3- bas icの K_PnI， Bglll サイ トに断片を導入することによ り、 転写開始点 上流約 700bp までを含む HM-700/GL3を得た。

さ らに HM- 2k/GL3 を铸型と してプライマー HMP700および 11A， (ca gaggattaattaggtaccgaaagagaggtgggctttt ) (配歹 [J番号 ： 21) を用い 、 K0D ポリ メラーゼ （東洋紡） を用い Thermal Cycler 480(Perkin Elmer, CA， USA) にて PCR (98。C 15秒、 65°C 2秒、 74°C 30秒 、 25サイクル） を行った。 得られた断片を Zero Blunt

ι'ΟΡΟ PCR cloning kit for sequencing ver. B v Invitrogen) を用 いて、 pCR4 Blunt-TOPO vectorに挿入した。 得られたプラスミ ドを 制限酵素 Kpnlにて処理し、 およそ 550bp の新片を回収し、 HM-125/G L3の Kpnlサイ トに ligation high を用いて導入した。 こ う して転写 開始点上流- 125〜- 145付近を欠失した dISRE/GL3 を得た。

( 2 ) IRF-2 発現プラスミ ドの構築

IRF- 2 発現プラスミ ドは以下のように作製した。 interferon- a (1000U/ml) にて刺激後 8時間経過した U266細胞より、 TRIzol試薬 (GIBC0-BRいを用レヽて全 RNA を抽出した。 First - strand cDNA Synt hesis kit (Pharmacia) を用い、 得られた RNA を錶型、 Notl - cKT 8 をプライマーと して逆転写反応を 37°C 1時間行った。 得られた cD NAを錶型、 IRF2-F2 (ttgtattggtagcgtgaaaaaagc) (配列番号 ： 22) 、 IRF2-R2 (cagctagttcacattatctcgtcc) (配列番号 ： 23) をプライ マーとして LA - Taq (宝酒造） を用いて PCR (94°C 45秒、 60°C 45 秒、 72°C 60秒、 40サイクル） を行った。

得られた PCR 反応液を铸型、 IRF2- Fl ( agagggtaccatgccggtggaa aggatgcg) (酉己歹 [J番号 ： 24) 、 IRF2-R1 (agtcggtaccttaactgctcttga cgcggg) (配列番号 ： 25) をプライマーとして K0D ポリ メラーゼ （東 洋紡） を用いて再度 PCR (94°C 45秒、 60°C 45秒、 72°C 60秒、 30サイクル） を行った。 得られた断片を制限酵素 Kpnlにて処理し、 発現プラスミ ド pTracer- CMV ( Invitrogen)の Kpnlサイ トに ligation high (東洋紡） を用いて導入し、 IRF - 2 発現プラスミ ド pIRF-2/Tr acer を得に。 ( 3 ) レポーター遺伝子活性の測定

細胞へのフ フス ミ 卜、導人 ttPolyethylenimine-Transf err infect io n Kit (Tf PEI-Kit) (Bender MedSystems, Vienna, Austria)を、 ノレ シフエフーセノ 'ッセィは Dual_Lucif erase Reporter Assay System (Promega) を用レヽた。 細胞株を 50μΜ Def f err ioxamine , 10 % FBS を含む RPMI- 1640 にてー晚培養した。 導入するプラスミ ドを Tf-PEI との複合体にするため、 終濃度 20μ g/mlのレポータージーンプラス ミ ド、 20 β g/ml©pIRF-2/Tracer または pTracer— CMV， 0.4 μ g/ml© PRL-SV40, 1 μ g/ml Tf-PEI reagent の混合液を作製し、 室温で 20 分間インキュベート した。

5 X10⁵ 細胞 /mlの細胞を Tf-PEI plasmid混合液の 3倍容加え、 4時間 37°Cにてインキュベート し、 培地にて洗浄後、 2 X10⁵ 細胞 /mlの濃度で 1 ゥェルあたり 100 μ 1 を 96ゥエル平底プレー トで培 養した。 IFN-ひを終濃度 0， 1000U/mlとなるよう添加し、 37°C 2 日 間培養した。 細胞を PBS (-)にて洗浄後、 20 1 の Passive Lysis Bu fferiこて溶角军し、 6 μ 1 を C96 White Polysorp Fluoronunc plate (Nunc)にアプライ した。 Luminoskan (Labsystems) ίこて基質液 30μ 1 、 測定時間 10秒にて Firefly, Renila それぞれの発光強度を測定 した。 測定値は Firefly/Renilaにて ト ランスフエクショ ン効率の補 正を行い相対活性を求めた。

( 4 ) 結果

HM1.24プロモーターレポータープラスミ ドと IRF- 2 発現プラスミ ドを U266細胞に導入し、 レポーター活性を測定した （図 9 ) 。 その 結果、 IRF-2 結合サイ トである ISREモチーフ配列を含む- 700およ び - 151で、 IRF- 2 共発現によ りルシフェラーゼ活性が上昇した。 一 方 ISRE配列を欠失した dISRE/GL3 では IRF-2 共発現によるルシフヱ ラーゼ活性に変化は認められなかった。 以上の結果よ り IRF-2 は HM 1.24プロモーターの ISRE領域に結合し、 その転写活性を増強するこ とが示された。

( 5 ) IRF-2 の強制発現による HM1.24抗原の発現増強の確認 IRF-2 による HM1.24抗原の発現量の変化は、 IRF-2 発現プラスミ ド （pIRF-2/Tracer)またはコン ト ロールプラスミ ド （pTracer/CMV) を U266細胞に上記方法にて導入し、 1〜 2 日間培養した後、 細胞を 回収し、 一次抗体と してマウス抗ヒ ト HM1.24抗体にて染色する。 細 胞を洗浄し、 さ らに二次抗体として FITC標識抗マウス IgG 抗体によ り染色する。 細胞を洗浄したのち、 フローサイ トメータによ り細胞 の FITC蛍光強度を測定する。 IRF-2 発現プラスミ ド導入細胞では、 コント口ールプラスミ ド導入細胞に比較して FITC強度の高い細胞が 多く存在することを確認する。

実施例 6. イ ンターフェロン αによるリ ンパ系腫瘍細胞における 丽 1.24抗原発現量の増強、 および骨髄性白血病細胞に おける HM1.24抗原の発現誘導

ヒ 卜骨髄性白血病細胞株肌 (Japanese Cancer Research Resour ces, Tokyo, Japan) および造血器腫瘍患者の骨髄やリ ンパ節由来 の腫瘍細胞は、 実施例 1に記載の方法で培養した。 また、 イ ンター フエロ ンひは実施例 1 と同一のものを用い、 イ ンターフェロ ンひ に よる刺激方法およびフローサイ トメ ト リーの測定方法も実施例 1 と 同様におこなった。 尚、 FITC—抗 HM1.24抗体として、 FITC—ヒ ト型 化抗匪 1.24抗体 （ l mg/ml) を使用した （国際特許公開番号 W098/14 580参照、 軽鎖および重鎖可変領域のパージョ ンは RVLaおよび RVHs ) 。 また、 骨髄性白血病細胞の同定には PE—抗 CD33抗体、 B細胞性 リ ンパ腫の同定には PE—抗 CD19抗体、 T細胞性リ ンパ腫の同定には PE—抗 CD4抗体 （全て Pharmingen, San Diego, CA,

USA) を 20μ 1加え、 二重染色を行った。 その結果、 IFN- α非刺激下では、 HEL および急性骨髄性白血病患 者由来の腫瘍細胞では、 HM1. 24抗原の細胞表面上への発現は、 殆ど 認められないか、 非常にわずかしか認められず、 これらの腫瘍細胞 では、 IFN- α非刺激下では HMl . 24抗原の発現は実質的に認められな かった。 一方、 急性リ ンパ球性白血病、 B細胞性非ホジキンリ ンパ 腫、 T細胞性非ホジキンリ ンパ腫患者由来の腫瘍細胞では、 IFN- Q; 非刺激下においても HMl. 24抗原の細胞表面上での発現が認められた 。 これに対し、 IFN-ひ で刺激した場合、 HEL および急性骨髄性白血 病患者由来の腫瘍細胞では HM1. 24抗原の発現が誘導された。

実質的に HM1. 24抗原を発現していないこれらの細胞に.おいても、 IFN- αは HM1. 24抗原を発現させることができた。 また、 急性リ ンパ 球性白血病、 Β細胞性非ホジキンリ ンパ腫、 Τ細胞非ホジキンリ ン パ腫患者由来の腫瘍細胞においても、 HM1. 24抗原の発現量が増大し た。 これら 5種の腫瘍細胞において、 IFN- α刺激によって発現した HM1. 24抗原の量はほぼ同程度であった。 これらの結果は、 IFN-ひ力 S 造血器腫瘍細胞全般に対して、 龍 1. 24抗原の発現誘導作用または発 現増強作用を有することを示す。

実施例 7 . イ ンターフ ェ ロ ンおによる抗 HM1. 24抗体の ADCC活性の 増強

ヒ ト骨髄性白血病細胞株 HEL を標的細胞と して用いた。 HEL ( 1 X lCT c e l l s) (こ 0. lmCiの ^{a 1} Cr— sodium cnromat e (New England Nuc丄 ea r， Bost on , MA , USA) を加え、 37°Cで 1時間放置した。 その後、 RP MI 1640で 3回洗浄し、 lxlO⁴ 個を円底 96ゥエルプレー ト （Corning ) に分注した。

種々の濃度のヒ ト型化抗 HM1. 24抗体 （国際特許公開番号 W098/145 80参照、 軽鎖および重鎖可変領域のパージョ ンは RVLaおよび RVHs) を加えた後、 エフェクター細胞と して、 健常人の末梢血単核球 （5x 10⁵個） を加え、 37°Cで 4時間放置した。 培養上清中の放射活性を ガンマ力ゥンターで測定し、 ADCCによる細胞傷害活性を以下の計算 式によ り求めた。 尚、 最大値は、 標的細胞に 1 % NP40を加えるこ と で細胞を破壌して測定した。 また、 最小値は、 培養液である RPMI 16 40のみを添加して測定した。

ADCC活性 （％) = (測定値一最小値） / (最大値一最小値） その結果、 IFN- αによる刺激を行わない場合には、 いずれのヒ ト 型化抗 HM1. 24抗体濃度においても顕著な ADCC活性は認められなかつ たが、 IFN-ひ で刺激した場合には、 ヒ ト型化抗 HM1. 24抗体による顕 著な ADCC活性が認められた。 また、 ADCC活性は抗体濃度依存性であ り、 細胞表面上の HM1. 24抗原の発現によつて ADCC活性が誘導された ことが示された。

この結果は、 IFN- α等の刺激によ り腫瘍細胞表面上の HM1. 24抗原 の発現量が上昇すれば、 抗 HM1. 24抗体による細胞傷害活性、 すなわ ち抗腫瘍効果が増強されることを示しており、 IFN- Q!等の HM1. 24抗 原発現増強剤と抗 HM1. 24抗体を併用することで、 よ り少量の抗 HM1. 24抗体使用量で同等の効果を期待できることを示す。 また、 抗 HM1. 24抗体単独では顕著な効果が期待できない造血器腫瘍細胞において も、 IFN -ひ等の発現誘導剤と抗 HM1. 24抗体との併用によ り、 抗腫瘍 効果が期待できることを示す。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . インターフ ェ ロ ン お 、 イ ンターフェロ ン yまたは IRF-2 蛋白 質を有効成分とする、 配列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有す る蛋白質 （HM1. 24抗原） の造血器腫瘍細胞における発現増強剤また は発現誘導剤。

2 . 前記造血器腫瘍が、 白血病、 リ ンパ腫または骨髄腫である請 求項 1から 4のいずれか 1項に記載の発現増強剤または発現誘導剤

3 . 前記白血病が急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リ ンパ性白血病または慢性リ ンパ性白血病である請求項 2に記載の発 現増強剤または発現誘導剤。

4 . 前記リ ンパ腫がホジキン病、 T細胞性非ホジキンリ ンパ腫ま たは B細胞性非ホジキンリ ンパ腫である請求項 2に記載の発現増強 剤または発現誘導剤。

5 . 前記骨髄腫が多発性骨髄腫である請求項 2に記載の発現増強 剤または発現誘導剤。

6 . 有効成分と して、 ( 1 ) イ ンターフェロ ンひ 、 イ ンターフエ ロ ン T/または IRF- 2 蛋白質、 および （ 2 ) 配列番号 ： 2に示される ァミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体、 を含んでな る造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。

7 . イ ンターフェロ ンひ 、 イ ンターフェロ ン γまたは IRF- 2 蛋白 質と併用することを特徴と し、 有効成分と して配列番号 ： 2に示さ れるァミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体を含んで なる造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。

8 . 配列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有する蛋白質に特異 的に結合する抗体と併用することを特徴とし、 有効成分として、 ィ ンターフェロ ン a、 イ ンターフェロン yまたは IRF- 2 蛋白質を含む 造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。

9 . 前記造血器腫瘍が、 白血病、 リ ンパ腫または骨髄腫である請 求項 6から 8のいずれか 1項に記載の造血器腫瘍の治療剤または医 薬組成物。 '

10. 前記白血病が急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リ ンパ性白血病または慢性リ ンパ性白血病である請求項 9に記載の造 血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。

11. 前記リ ンパ腫がホジキン病、 T細胞系非ホジキンリ ンパ腫ま たは B細胞系ホジキンリ ンパ腫である請求項 9に記載の造血器腫瘍 の治療剤または医薬組成物。

12. 前記骨髄腫が多発性骨髄腫である請求項 9に記載の造血器腫 瘍の治療剤または医薬組成物。

13. 前記抗体が細胞傷害活性を有する抗体である請求項 6から 8 のいずれか 1項に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。

14. 前記細胞傷害活性が ADCC活性である請求項 13に記載の造血器 腫瘍の治療剤または医薬組成物。

15. 前記抗体がモノク口ーナル抗体である請求項 6から 14のいず れか 1項に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。

16. 前記抗体がキメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である 請求項 15に記載の造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物。

17. 前記抗体が寄託番号 FERM BP- 5233であるハイプリ ドーマによ つて産生される抗 HM1. 24抗体である請求項 15に記載の造血器腫瘍の 治療剤または医薬組成物。

18. 前記キメラ抗体またはヒ ト型化抗体が、 寄託番号 FERM BP - 52 33であるハイブリ ドーマによつて産生される抗 HM1, 24抗体のキメ ラ 抗体またはヒ ト型化抗体である請求項 16に記載の造血器腫瘍の治療 剤または医薬組成物。

19. 造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキッ トであって、

( 1 ) 配列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有するタンパク質 に特異的に結合する抗体 ； および

( 2 ) 上記抗体を、 配列番号 2に示されるアミ ノ酸配列を有する タンパク質の発現を増強する薬剤と組み合わせて患者に投与するこ とを指示する指示書 ；

を含むキッ ト。

20. 造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキッ トであって、

( 1 ) 配列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有するタンパク質 の発現を増強する薬剤 ； および

( 2 ) 上記薬剤を、 配列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有す るタンパク質に特異的に結合する抗体と組み合わせて患者に投与す ることを指示する指示書 ；

を含むキッ ト。

21. 造血器腫瘍を有する患者を治療するためのキッ トであって、

( 1 ) 配列番号 2に示されるァミ ノ酸配列を有するタンパク質の 発現を増強する薬剤 ；

( 2 ) 配列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有するタンパク質 に特異的に結合する抗体 ； および

( 3 ) 上記薬剤および抗体を組み合わせて患者に投与することを 指示する指示書 ；

を含むキッ ト。

22. HM1. 24抗原の発現増強剤をスク リ一二ングする方法であって 、 ( 1 ) HM1. 24遺伝子プロモーター領域を有するレポーター遺伝子 を有する細胞を調製する工程 ；

( 2 ) 前記細胞に被験物質を接触させる工程 ； 並びに ( 3 ) レポーター遺伝子の発現を検出する工程、

を含む方法。

23. 請求項 22に記載の方法によつて選択される HM1. 24抗原の発現 増強剤。

24. 請求項 23に記載の発現増強剤を含み、 配列番号 ： 2に示され るアミ ノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み 合わせて使用することを特徴とする造血器腫瘍治療用医薬組成物。

25. IRF-2 タンパク質の発現を増強する薬剤をスク リーニングす る方法であって、

( 1 ) 細胞と被験物質とを接触させる工程 ； 並びに

( 2 ) 前記細胞の IRF-2蛋白の発現量を測定する工程、

を含む方法。

26. 請求項 25に記載の方法によつて選択される IRF- 2タンパク質 の発現増強剤。

27. 請求項 26に記載の発現増強剤を含み、 配列番号 ： 2に示され るアミ ノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体と組み 合わせて使用することを特徴とする造血器腫瘍治療用医薬組成物。

28. 配列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有する蛋白質 （HM1. 24抗原） の造血器腫瘍細胞における発現増強剤または発現誘導剤の 製造のためのイ ンターフェロ ン a；、 イ ンターフェロ ン γまたは IRF - 2 蛋白質使用。

29. 前記造血器腫瘍が、 白血病、 リ ンパ腫または骨髄腫である請 求項 28に記載の使用。

30. 前記白血病が急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リ ンパ性白血病または慢性リ ンパ性白血病である請求項 29に記載の使 用。

31. 前記リ ンパ腫がホジキン病、 Τ細胞性非ホジキンリ ンパ腫ま たは B細胞性非ホジキンリ ンパ腫である請求項 29に記載の使用。

32. 前記骨髄腫が多発性骨髄腫である請求項 29に記載の使用。

33. 造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物の製造のための、 （ 1 ) イ ンターフェロ ンひ 、 イ ンターフェロ ン γまたは IRF-2 蛋白質、 および （ 2 ) 配列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有する蛋白質 に特異的に結合する抗体の使用。

34. イ ンターフェロ ンひ 、 イ ンターフェロ ン γまたは IRF-2 蛋白 質と併用される造血器腫瘍の治療剤または医薬組成物の製造のため の、 配列番号 ： 2に示されるァミ ノ酸配列を有する蛋白質に特異的 に結合する抗体の組合せ使用。

35. 配列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有する蛋白質に特異 的に結合する抗体と併用される、 造血器腫瘍の治療剤または医薬組 成物の製造のためのイ ンターフェロ ンひ 、 イ ンタ一フエロン V また は IRF- 2 蛋白質の使用。

36. 前記造血器腫瘍が、 白血病、 リ ンパ腫または骨髄腫である請 求項 33から 35のいずれか 1項に記載の使用。

37. 前記白血病が急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リ ンパ性白血病または慢性リ ンパ性白血病である請求項 36に記載の使 用。

38. 前記リ ンパ腫がホジキン病、 Τ細胞系非ホジキンリ ンパ腫ま たは Β細胞系ホジキンリ ンパ腫である請求項 36に記載の使用。

39. 前記骨髄腫が多発性骨髄腫である請求項 36に記載の使用。

40. 前記抗体が細胞傷害活性を有する抗体である請求項 33から 35 のいずれか 1項に記載の使用。

41. 前記細胞傷害活性が ADCC活性である請求項 40に記載の使用。

42. 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項 33から 41のいず れか 1項に記載の使用。

43. 前記抗体がキメラ抗体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である 請求項 42に記載の使用。

44. 前記抗体が寄託番号 FERM BP-5233であるハイプリ ドーマによ つて産生される抗 HM1. 24抗体である請求項 45に記載の使用。

45. 前記キメ ラ抗体またはヒ ト型化抗体が、 寄託番号 FERM BP- 52 33であるハイブリ ドーマによつて産生される抗 HM1. 24抗体のキメラ 抗体またはヒ ト型化抗体である請求項 43に記載の使用。

46. 配列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有するタンパク質に 特異的に結合する抗体と組み合わせて使用する造血器腫瘍治療用医 薬組成物の製造のための、 請求項 23に記載の発現増強剤の使用。

47. 配列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有するタンパク質に 特異的に結合する抗体と組み合わせて使用する造血器腫瘍治療用医 薬組成物の製造のための請求項 26に記載の発現増強剤の使用。

48. 配列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有する蛋白質 （HM1. 24抗原） の造血器腫瘍細胞における発現増強または発現誘の方法に おいて、 イ ンターフ ェ ロ ンお 、 イ ンターフェロン T/または IRF- 2 蛋 白質を投与することを含んで成る方法。

49. 前記造血器腫瘍が、 白血病、 リ ンパ腫または骨髄腫である請 求項 48に記載の方法。

50. 前記白血病が急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リ ンパ性白血病または慢性リ ンパ性白血病である請求項 49に記載の方 法。

51 . 前記リ ンパ腫がホジキン病、 T細胞性非ホジキンリ ンパ腫ま たは B細胞性非ホジキンリ ンパ腫である請求項 49に記載の方法。

52. 前記骨髄腫が多発性骨髄腫である請求項 49に記載の方法。

53. 造血器腫瘍の治療方法において、 （ 1 ) イ ンターフ ェ ロ ンお 、 イ ンターフェロ ン γまたは IRF-2 蛋白質、 および （ 2 ) 配列番号 ： 2に示されるァミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗 体を投与することを含んで成る方法。

54. 前記造血器腫瘍が、 白血病、 リ ンパ腫または骨髄腫である請 求項 53に記載の方法。

55. 前記白血病が急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リ ンパ性白血病または慢性リ ンパ性白血病である請求項 53に記載の方 法。

56. 前記リ ンパ腫がホジキン病、 T細胞系非ホジキンリ ンパ腫ま たは B細胞系ホジキンリ ンパ腫である請求項 53に記載の方法。

57. 前記骨髄腫が多発性骨髄腫である請求項 53に記載の方法。

58. 前記抗体が細胞傷害活性を有する抗体である請求項 53に記載 の方法。

59. 前記細胞傷害活性が ADCC活性である請求項 58に記載の方法。

60. 前記抗体がモノクロ ーナル抗体である請求項 53から 59のいず れか 1項に記載の方法。

61 . 前記抗体がキメラ抗体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である 請求項 60に記載の方法。

62. 前記抗体が寄託番号 FERM BP- 5233であるハイプリ ドーマによ つて産生される抗 HM1. 24抗体である請求項 60に記載の方法。

63. 前記キメラ抗体またはヒ ト型化抗体が、 寄託番号 FERM BP-52 33であるハイプリ ドーマによって産生される抗 HM1. 24抗体のキメラ 抗体またはヒ ト型化抗体である請求項 61に記載の方法。

64. 造血器腫瘍の治療用方法において、 請求項 23に記載の発現増 強剤と、 配列番号 ： 2に示されるアミ ノ酸配列を有するタンパク質 に特異的に結合する抗体と組み合わせて使用することを含んで成る 方法。

65. 造血器腫瘍の治療方法において、 請求項 26に記載の発現増強 剤と、 配列番号 ： 2に示されるァミノ酸配列を有するタンパク質に 特異的に結合する抗体と組み合わせて使用することを含んで成る方 法。