WO2002057316A1 - Nouvel anticorps monoclonal - Google Patents

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Tomoyuki Tahara
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody that recognizes a human BST2 antigen present on a cell surface. Specifically, the present invention relates to a monoclonal antibody or a functional fragment thereof that binds to the human BST2 antigen and can be localized inside the cell by internalization to the cell. The present invention also relates to a conjugate obtained by binding the monoclonal antibody or a functional fragment thereof to a therapeutic reagent.
  • Cancer is the leading cause of death in Japan, and the number of patients is increasing year by year. There is a strong demand for the development of highly effective and safe drugs and treatments.
  • One type of hematopoietic tumor, multiple myeloma, is an incurable B-cell tumor that causes abnormalities in the final stages of B-cell differentiation.
  • the course of multiple myeloma is similar to that of end-stage plasma cell leukemia (Plasma cell leukemia), and the secretion of immunoglobulin chains in neoplasms characterized by the accumulation of clones of plasma cells Often accompanied by Tumor bone marrow infiltration involves uncontrolled proliferation of myeloma cells with numerous complications such as anemia, hypoglobulinemia, and bacterial infection. Also, in multiple myeloma, increased levels of interleukin 6 (IL6) result in increased osteoclasts that lead to bone pain, fractures and hypocalcemia. High concentrations of myeloma immunoglobulin and hypercalcemia are often associated with renal failure.
  • IL6 interleukin 6
  • Chemotherapy is the standard treatment with multidrug therapy using melphalan and prednisolone, but the disease recurs after induction of remission with an intermediate duration of about 2 years (Alexanian et al., New Zealand). Engl and J Medicine., 1994 Vol 330: 484).
  • these drugs not only act specifically on tumor cells, but also show toxicity on normal cells, causing serious side effects and a limited therapeutic effect.
  • Ultra-high-dose chemotherapy combined with hematopoietic stem cell transplantation since the 1980s It is being actively studied but its clinical efficacy remains low.
  • IL-6 is thought to be a major growth factor for multiple myeloma cells (Kawano et al., Nature., 1988 Vol 332: 83; Klein et al., Blood., 1991 Vol 73: 517).
  • Treatment of multiple myeloma patients with neutralizing antibodies against IL-6 or IL-6 receptor has been attempted to block the -6 signaling system.
  • suppression of myeloma cell growth was observed in patients with leukemia mutations in the disease, the tumor recurred and was not clinically effective (Bataille et al., Blood., 1995 Vol.
  • CD19 (Grossbard et al., Br J Haematol., 1998 Voll02: 509)
  • CD20 Humanssein et al., Blood., 1999 Yol94 [Suppl.1]: 313)
  • CD38 Methy et al., Semin Hematol., 1999 Vol36 [Suppl.3]: 30
  • CD54 Human et al., Cancer Res., 1995 Vol55: 610
  • CD138 (Wijdenes et al., Br J Haematol., 1996 Vol94: 318)
  • Muc Myeloma cell-expressing antigens such as -1 (Treon et al., Blood., 1999 Vol93: 1287) have been reported as candidates for target antigens for antibody therapy, but have not yet
  • bone marrow stromal antigen 2 (also referred to as BST2 or HM1.24 antigen) has been reported as one of the antigens highly expressed in myeloma cells (Goto et al., Blood., 1994). Vol 84: 1922; O tomo et al., Biochem Biopliys Res Com., 1999 Vol 258: 583).
  • BST2 is a type II transmembrane glycoprotein consisting of 180 amino acid residues and having a molecular weight of about 30 kDa. Cells that form homodimers by SS binding Expressed on the membrane.
  • BST2 protein is not expressed in normal peripheral blood cells, bone marrow cells, reactive lymphocytes, liver, kidney, heart, etc., but is highly expressed in plasma cells and myeloma cells. Although the detailed biological activity is not yet known, BST2 is thought to be involved in terminal differentiation of B cells (Ishikawa et al., Genomics., 1995 Vol 26: 527). As for antibodies against human BST2, a mouse monoclonal antibody (Goto et al., Blood., 1994 Vol 84: 1922) produced by immunizing a non-human mammal such as a mouse with a human BST2-expressing cell line has been reported. ing.
  • BST2 has been reported to be expressed not only in myeloma but also in other lymphoid tumors
  • anti-BST2 antibody therapy is expected to exert an effect on these tumors.
  • these antibodies do not have the activity to induce BST2 modulat ion by antibody conjugation (Ozaki et al., Hematology, Oncology, 2000 Vol. 41: 128), and increase the efficacy and side effects of therapeutic agents such as chemotherapeutic agents and radionuclides.
  • No anti-BST2 antibody has been reported yet that induces rapid internalization, which can be greatly reduced.
  • an antibody that binds to an antigen protein expressed on the cell surface and induces internalization inside the cell can be generally obtained, but such an antibody is used for all cell surface antigens. It is not always clear if the information is obtained.
  • An object of the present invention is to develop an antibody capable of binding to human BST2 and having an activity of inducing localization (internalization) in a cell such as a tumor cell that expresses human BST2, thereby simultaneously treating the disease.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent based on a novel mechanism of action for the treatment of difficult diseases such as multiple myeloma.
  • the present inventors have conducted intensive studies on the production of antibodies against human BST2, and have obtained an anti-BST2 antibody with rapid internalization properties into target cells. Succeeded and completed the present invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a monoclonal antibody or a functional fragment thereof which binds to a human BST2 antigen present on a cell surface and can be localized inside the cell by internalization on the cell.
  • the cells are RPMI8226 strain (ATCC CCL-155), and after binding the monoclonal antibody under ice-cooling, the internalization proceeds within 120 minutes after the start of culture at 37,
  • the average fluorescent intensity of the fluorescent substance indicating the abundance of the human BST2 / monoclonal antibody complex on the cell surface is 50% or less of the time when the culture was started.
  • the monoclonal antibody of (1) or a functional fragment thereof is the monoclonal antibody of (1) or a functional fragment thereof.
  • the cells are RPMI8226 strain, and after binding the monoclonal antibody under ice-cooling, internalization proceeds within 90 minutes after the start of culture at 37 ° C, and the (1) The monoclonal antibody or a functional fragment thereof according to (1), wherein the average fluorescent intensity of the fluorescent substance indicating the abundance of the human BST2 / monoclonal antibody complex is 50% or less at the start of the culture.
  • the cells are RPMI8226 strain, and after binding the monoclonal antibody under ice-cooling, internalization proceeds within 60 minutes after the start of culture at 37 ° C.
  • the cell is RPMI8226 strain, and after the monoclonal antibody is bound under ice-cooling, internalization proceeds within 30 minutes after the start of culture at 37, and human cells on the cell surface (1)
  • the cells are RPMI8226 strain, and after binding the monoclonal antibody under ice-cooling, internalization proceeds within 15 minutes after the start of culture at 37, and the cells on the cell surface
  • the monoclonal antibody of (1) or a functional fragment thereof is the monoclonal antibody of (1) or a functional fragment thereof.
  • a pharmaceutical composition targeting human BST2-expressing cells comprising the complex of (12) or (13) as an active ingredient.
  • a hybridoma was prepared by fusing spleen cells of a non-human animal immunized with a polypeptide containing at least a partial amino acid sequence of the human BST2 antigen with myeoma cells, and a human BST2 antigen was prepared from the hybridoma. Selecting a hybridoma that produces an antibody that binds to the human BST2 antigen produced from the selected hybridoma, and reacting the antibody with a cell that expresses a human BS antigen, and culturing the cell. 2. The method for producing a monoclonal antibody or a functional fragment thereof according to claim 1, wherein selection is performed using a decrease in the abundance of the human BST2 / antibody complex on the cell surface as an index.
  • the present invention relates to the monoclonal antibody or the antibody according to any one of the above (1) to (11).
  • Biologically active substance refers to any biological change in a cell into which the substance has been introduced, such as (1) promotion or suppression of proliferation of the cell, (2) promotion or suppression or dedifferentiation of differentiation, (3) A substance that can cause changes in the action such as signal transmission from the cell to another cell, and (4) Cell death.
  • chemotherapeutic agents for chemotherapeutic agents, radionuclides, bacterial toxins, various cytokins or hormones, transcription factors, enzymes involved in sugar chain synthesis or degradation, or cells.
  • examples include DNA or RNA.
  • the definitions of the terms used in the present specification are as follows.
  • Human BST2 is an abbreviation of bone marrow strom ant igen 2, a type II transmembrane glycoprotein consisting of 180 amino acid residues and having a molecular weight of about 30 kDa, which forms a homodimer through disulfide bonds to form plasma cells and bone marrow.
  • proteins that are specifically expressed on the cell membrane of cells such as tumor cells (eg, Goto et al., Supra; Ohtomo et al., Supra).
  • Internalization or “rapid internalization” refers to the non-specific uptake of cells by a mechanism called phagocytosis (endocytosis). Rather, the antibody forms an immune complex with the cell surface antigen and is taken up in the cell in a short time. For example, depending on the reaction conditions and the properties of the antibody and antigen, etc., in general, when an antibody is taken up by this mechanism, the immune complex of the antibody and the receptor moves on the cell surface in an energy-dependent manner after binding, Eventually, after concentration (caving), it is taken up into cells within one to several minutes, at the latest within 12 hours.
  • An antibody that binds to an antigen on the surface of a cell and is taken into a cell by internalization may be referred to herein as an “antibody having an inducing activity”.
  • the average fluorescence intensity of the fluorescent substance indicating the abundance of the human BST2 / monoclonal antibody complex on the cell surface is 50% or less of that at the start of the culture '' means that cells having the human BST2 antigen on the cell surface
  • the amount of human BST2 / monoclonal antibody complex formed by immunological reaction with human BST2 on the cell surface at the start of culturing is determined after a certain period of time relative to the abundance of human BST2 / monoclonal antibody complex 100.
  • the ratio of the remaining amount of the complex is It means that it is 50% or less, in other words, that 50% or more of the anti-BST2 antibody forming the immunological complex has been taken up into the cell by the internalization.
  • Prodrug refers to a precursor drug that is converted into an active drug by the action of endogenous enzymes and the like when administered in vivo.
  • “Chemotherapeutic agent” refers to a drug that selectively treats a disease caused by a tumor or the like by acting on the pathogen without causing significant damage to the patient.
  • one letter of the alphabet used to represent an amino acid means the following amino acid.
  • G glycine, (A) alanine, (V) valine, (L) leucine, (I) isoleucine, (S) serine, (T) threonine, (D) aspartic acid, (E) glutamic acid, (N ) Asparagine, (Q) glutamine, (10 lysine, (R) arginine, (0 cysteine, (M) methionine, (F) fenylalanine, (Y) tyrosine, (W) tributofan, (H) histidine, (P
  • the letters of the alphabet used to represent DNA are as follows: (A) adenine, (C) cytosine, (G) guanine, (T) thymine. The invention will be described in detail.
  • Human BST2 is known in the technical field such as a chemical synthesis method, a cell culture method, and the like, in addition to a genetic recombination technique, based on a known base sequence or amino acid sequence (SEQ ID NO: 1 or 2, respectively). It can be produced by appropriately using a method.
  • the partial sequence of human BST2 can be produced by a genetic recombination technique or a chemical synthesis method according to a method known in the technical field described later, or human BST2 can be appropriately cleaved using a protease. By doing so, it can be manufactured.
  • the antibodies of the present invention include various anti-human BST2 monoclonal antibodies characterized by having internalization-inducing properties.
  • Examples of the antibody include an anti-human BST2 monoclonal antibody as described in Examples 7 to 15 below, or the amino acid sequence of each of the heavy chain and / or light chain constituting the antibody.
  • monoclonal antibodies consisting of heavy and / or light chains which have internalization-inducing properties.
  • the partial modification (deletion, substitution, insertion, addition) of the amino acid as described above into the amino acid sequence of the antibody of the present invention is introduced by partially modifying the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence. can do.
  • the antibodies of the present invention include antibodies having any of the immunoglobulin classes and subclasses, and are preferably antibodies having the human immunoglobulin class and subclass.
  • preferred classes and subclasses are immunoglobulin G (IgG). , Especially IgGl and IgG4, with the preferred light chain being /.
  • a preferred example of the antibody or a fragment thereof of the present invention is that the antibody or the fragment thereof is bound to a myeloma cell line RPMI8226 (ATCC CCL-155) under ice-cooling, and then cultured at 37 ° C. for about 120 minutes. Within, preferably within about 90 minutes, more preferably within about 60 minutes, particularly preferably within about 30 minutes, even more preferably within about 15 minutes, and the human BST2 / antibody on the cell surface The average fluorescence intensity of the fluorescent substance indicating the abundance of the BST2 antibody complex is 50% or less at the start of the culture.
  • Another preferred example of the antibody or a fragment thereof of the present invention recognizes an epitope composed of at least eight consecutive or discontinuous amino acid residues in the amino acid sequence of human BST2 (SEQ ID NO: 2). And a sequence comprising a monoclonal antibody or a fragment thereof having internalization-inducing properties.
  • Still another preferred example of the antibody of the present invention or a fragment thereof is an antibody having a property of cross-reacting with human BST2 and monkey BST2.
  • Such antibodies are expected to recognize the same or very similar epitope structures in human BST2 and monkey BST2, and various tests using monkeys as experimental animals are possible prior to human clinical trials. It has the advantage of being capable.
  • a specific example of such an antibody is an antibody produced by hybridoma 9-16-1 (FERM BP-7821) or hybridoma b-76-8 (FE West BP-7822).
  • the antibody fragment in the present invention means a part of the antibody as defined above, and specifically, F (ab ') 2, Fab', Fab, Fv, disuplpide-1 inked FV, Single- Chain FV (scFV) and polymers thereof (DJ King., Applicat ions and Engineering of Monoclonal Ant ibodies., 1998 TJ International Ltd.).
  • Such an antibody fragment can be obtained by a conventional method, for example, digestion of an antibody molecule with a protease such as papain or pepsin, or a known genetic engineering technique.
  • “Functional fragment” refers to a fragment of an antibody that specifically binds to an antigen to which the antibody specifically binds.
  • the antibody of the present invention can be produced, for example, by the following method. That is, for example, human BST2 or a part thereof as defined above, or a conjugate with an appropriate substance (for example, bovine serum albumin, etc.) for enhancing the antigenicity of the antigen, or human BST2 on the cell surface If necessary, immunostimulants
  • Monoclonal antibodies are prepared by preparing hybridomas from antibody-producing cells obtained from immunized animals and myeloma cells (myeloma cells) that are not capable of producing autoantibodies, cloning the hybridomas, and reacting with the antigen used for immunization. To produce a monoclonal antibody exhibiting a specific affinity, and selecting a clone having internalization-inducing properties by the method described below.
  • the antibody of the present invention is a human antibody by using a non-human animal that retains a human antibody gene that has not been rearranged and produces a human antibody specific to the immunogen by immunization.
  • the human antibody means an antibody that is an expression product of a human-derived antibody gene, or a functional fragment thereof.
  • Cell fusion is performed, for example, by mixing antibody-producing cells and myeloma cells in a highly concentrated polymer solution such as polyethylene glycol (e.g., a molecular weight of 1500 to 6000), usually for about 30 to 40, for about 1 to 10 minutes.
  • a highly concentrated polymer solution such as polyethylene glycol (e.g., a molecular weight of 1500 to 6000), usually for about 30 to 40, for about 1 to 10 minutes.
  • Screening of hybridoma clones producing monoclonal antibodies can be performed by culturing hybridomas, for example, in a microtiter plate, and determining the reactivity of the culture supernatant in the growing wells for immunogens by ELISA, for example. And the like, and immunological methods such as radioimmunoassay and fluorescent antibody method.
  • the hybridoma For production of a monoclonal antibody from a hybridoma, the hybridoma can be cultured in vitro and isolated from the culture supernatant. It can also be isolated from ascites by culturing it in vivo in ascites of mice, ruds, guinea pigs, hamsters, or egrets.
  • a gene encoding a monoclonal antibody is cloned from an antibody-producing cell such as a hybridoma and inserted into an appropriate vector, which is then used as a host (for example, mammalian cell strains such as Chinese hamster ovary (CH0) cells, Escherichia coli, Yeast cells, insect cells, plant cells, etc.) to produce recombinant antibodies using genetic recombination technology (PJ Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P Shepherd and C.
  • a host for example, mammalian cell strains such as Chinese hamster ovary (CH0) cells, Escherichia coli, Yeast cells, insect cells, plant cells, etc.
  • transgenic animals goats, sheep or pigs, in which the gene of the antibody of interest is incorporated into the endogenous gene, are prepared using transgenic animal production technology, and the antibody is extracted from the milk of the transgenic animal. It is also possible to obtain large amounts of monoclonal antibodies derived from genes.
  • hybridomas When hybridomas are cultured in vitro, the hybridomas are grown, maintained, and stored in accordance with various conditions such as the characteristics of the cell type to be cultured, the purpose of the test and research, and the culture method.
  • a known nutrient medium or a known basal medium as used to produce monoclonal antibodies It can be carried out using any nutrient medium derived and prepared therefrom.
  • the produced monoclonal antibody may be obtained by a method known in the art, for example, chromatography using a protein A column, ion exchange chromatography, water-phobic chromatography, ammonium sulfate precipitation, gel filtration, affinity mouth chromatography, etc. Purification can be performed by combining them.
  • the monoclonal antibody or a fragment thereof of the present invention produced by the above method can be conjugated with a therapeutic agent to form a complex that can be used for therapeutic purposes such as missile therapy.
  • a therapeutic agent which bind to the antibody, but are not limited to, Yodo (131 Iodine: 131 I, Iodine 125 1), Lee Tsu Application Benefits um (90 Yt trium: 90 Y) , b down-di Um ⁇ ! ! : Radionuclide (LW.
  • Bacterial toxins such as (Pseudomonas exotoxin), diphtheria toxin, and ricin (Ricin), and chemotherapeutic agents such as methotrexate, mitomycin, and calixamicin (Calicheamicin)
  • Maytans inoid which can be converted into a prodrug by binding to an antibody, is preferred (Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol. 52: 127, Liu et al., Proc Natl Acad Sc USA, 1996 Vol. 93). : 8681).
  • the linkage between the antibody and the therapeutic agent may be either covalent or non-covalent (eg, ionic).
  • therapeutic agents that have a functional group (for bacterial toxins or chemotherapeutic agents) that can form a bond with an ionic group (for radionuclide) that can form a complex with the coordinating group.
  • the complex of the present invention can be obtained by bringing the antibody into contact with an antibody. Alternatively, a biotin-avidin system could be used in forming the complex.
  • the therapeutic agent is a protein or peptide, it can be produced as a fusion protein of the antibody and the protein or peptide by genetic engineering. It is.
  • Nshinoido (Maytans inoid) compound bound antibody can be made (Chari et aL, Cancer Res, 1992 Vol52:. 127, US Patent 5, 208, 020) 0 maytansine or Ansami toc in P-3 is reduced with lithium hydride aluminum to prepare maytansinol.
  • the prepared maytansinol is esterified with N-methyl-N- (methyldithiopropanoyl) -L-alanine in the presence of dicyclohexylcarbodiimide and zinc chloride, and then purified by a silica gel column etc. Then, a maytansine derivative ( May-SS_Me) is prepared.
  • the antibody is reacted with N-succinimidyl-3- (2-pyridylthio) propionic acid or the like or succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid or the like, and the antibody is reacted with a dithiopyridyl group or a maleimide group, respectively.
  • May-SH prepared by reducing May-SS-Me with dithiothreitol or the like, is reacted with an antibody having a dithiopyridyl group or a maleimide group introduced therein to produce a maytansinoid compound-bound antibody.
  • compositions containing the anti-human BST2 antibody of the present invention or the anti-human BST2 antibody conjugated to the above-mentioned therapeutic agent is also included in the scope of the present invention.
  • the composition should contain a therapeutically effective amount of the therapeutic agent and will be formulated into various forms for oral and parenteral administration.
  • a therapeutically effective amount refers to an amount that gives a therapeutic effect for a given symptom or administration schedule.
  • the composition of the present invention may contain, in addition to the antibody, physiologically acceptable additives in pharmaceutical preparations, such as diluents, preservatives, solubilizers, emulsifiers, adjuvants, antioxidants, isotonic agents, and excipients.
  • agent and carrier may be included. It can also be a mixture with other drugs such as other antibodies or antibiotics.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline glucose, and buffered saline. Further, it may contain stabilizers such as amino acids, saccharides, and surfactants, which are well known in the art, and an agent for preventing adsorption to the surface.
  • stabilizers such as amino acids, saccharides, and surfactants, which are well known in the art, and an agent for preventing adsorption to the surface.
  • examples of the form of the preparation include a lyophilized preparation (in this case, it can be reconstituted by adding a buffered aqueous solution as described above), a sustained release preparation, an enteric preparation, an injection or an infusion.
  • the route of administration may be oral, or parenteral, including intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal injection or drug delivery, but the optimal route will be selected by studies using animals.
  • a method in which the composition of the present invention is brought into direct contact with the affected part of a patient may be possible.
  • the dose will be determined as appropriate by conducting tests in animals and conducting clinical studies. In general, the patient's condition or severity, age, weight, sex, etc., should be considered.
  • the antibody or pharmaceutical composition of the present invention can be applied to the treatment or prevention of various diseases or conditions that may be caused by cells expressing BST2.
  • diseases or conditions include lymphocytic tumors such as multiple myeloma and rheumatism.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can selectively act on autoantibody-producing cells, ie, plasma cells (plasma B cells) expressing BST2.
  • the human monoclonal antibody of the present invention can be applied to prolong the life of patients suffering from primary local cancer.
  • FIG. 1 shows the reactivity of the anti-human BST2 antibody to the RPMI8226 cell line.
  • FIG. 2 shows the internalization-inducing activity of an anti-human BST2 antibody (7-90G).
  • FIG. 3 is a micrograph showing anti-BST2 antibody internalized in RPMI8226 cells after 15 minutes of 37 culture.
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence of full-length human BST2 DNA.
  • FIG. 5 shows the amino acid sequence of full-length human BST2.
  • FIG. 6 is a diagram showing 500 t1H NMR of the synthesized maytansine compound.
  • FIG. 7 is a graph showing the antitumor effect of maytansine-conjugated b-76-8 antibody on a human myeloma mouse model.
  • Full-length human BST2 DNA (SEQ ID NO: 1) was modified by polymerase chain reaction (PCR) to add a Not I sequence at its 5 'end and an Xba I and termination codon at its 3' end. .
  • PCR polymerase chain reaction
  • K0D-Plus- (Toyobo) DNA polymerase and human bone marrow-derived PolyA + RNA CDNA (approximately 20 ng) synthesized from Superscript II (manufactured by Clontecli) using Superscript II (manufactured by Gibco-BRL) as type III at 94 ° C, 15 seconds; 50 ° (30 seconds; and 68 ° (: 1 minute)
  • the modified BST2 sequence was isolated as a NotI-XbaI fragment and lig
  • Soluble BST2 protein was prepared by the following method in an expression system using baculovirus.
  • FLAG N-terminal-DYKDDDDK-C-terminal, Brizzard et al., Biotechniues (1994) 16: 730
  • FLAG-sBST2 FLAG at the N-terminus of the BST2 partial peptide having an amino acid sequence of 54-180 (amino acid number 54-180 of SEQ ID NO: 2)
  • FLAG-sBST2 FLAG at the N-terminus and dal thione-S-transferase at the C-terminus
  • GST Smith et al., Gene (1988) 67:31
  • FLAG-SBST2-GST Two types of soluble BST2 expression plasmids were prepared.
  • the FLAG-SBST2 vector has the following DNA sequence consisting of a secretory signal sequence at the 5 'end, a Bglll sequence at the 5' end to add a FLAG codon, and a BamHI E sequence at the 3 'end.
  • the reaction was carried out for 1 minute at seconds; and 72. Modified BST2 sequence was isolated as a BamHI-Notl fragment. Then, the SI ato Flag fragment and the BamHI-Notl fragment were ligated to a pFastBacl (GIBC0) vector cleaved with Bglll and Notl enzymes. The resulting plasmid was named pFastBacl / FBST2.
  • FLAG-SBST2-GST adds the BamHI sequence at the 5 'end and the NotI sequence at the 3' end, so that the primers 5'_CGAGGATCCCATATGCGGGACGGCCTTCGGGC-3 '(SEQ ID NO: 6) and 5'_AAGGAAAAGCGGCCGCCTGCAGCAGAGCGCTGAGG_3' No. 7) was used to modify by PCR.
  • PCR was performed using EX-Taci polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) and 20 ng of pFastBacl / FBS for 30 cycles at 94 ° C, 30 seconds; 56 ° C, 30 seconds; and 72 ° C, 1 minute. I let it.
  • the modified BST2 sequence was isolated as a BamHI-Notl fragment.
  • a Notl sequence was added to the 5 'end, and a ⁇ I sequence was added to the 3' end.
  • PCR was performed using EX-TaQ polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) and 20 ng of pGEX plasmid (Amersham Pharmacia Biotech) for 30 cycles at 94 ° C, 30 seconds; 56, 30 seconds; and 72 ° C. The reaction was performed for 1 minute.
  • the modified GST sequence was isolated as a Notl-Kpnl fragment, and the above-described BamHI-Notl fragment and Notl-Kpnl fragment were ligated into a BamHI-Kpnl-cleaved pFastBacl / FBST2 vector.
  • the resulting plasmid was named pFastBacl / FBST2 / GST.
  • the recombinant virus was prepared by a manual method using the expression vector prepared in Example 2 and BAC-T0-BAC Baculovirus Expression System manufactured by GIBC0B.RL.
  • the obtained recombinant baculovirus was prepared by adding 0.3 ml of the recombinant baculovirus-containing supernatant to 5 ml of 3xl0 6 Sf9 cells (manufactured by Invitrogen) and adding 4 ml of the supernatant to a flask (T-Flask 25 cm 2 , manufactured by CORNING). After culturing for 27 days at 27 days, the culture supernatant was collected and the recombinant baculovirus was amplified. The same operation was performed until the target amount of virus was obtained. (Example 4) Expression of soluble human BST2
  • soluble BST2 To express large amounts of soluble BST2, add 80 ml of the virus prepared in Example 3 to 800 ml of HiFive TM cells (lxlOVml, manufactured by Invitrogen), culture at 27 ° C for 60 hours, and culture supernatant. Was recovered. The collected supernatant was centrifuged and then passed through a 0. PES filter (manufactured by CORNING) to remove extraneous waste such as cells.
  • soluble BST2 (FLAG-SBST2, FLAG-SBST2-GST) from the culture supernatant prepared in Example 4 was performed by the following method.
  • the culture supernatant containing soluble BST2 was purified using a FLAG M2 affinity column (manufactured by SIGMA) according to the instructions provided with PBS (-) as the adsorption buffer and 0.1 M glycine-HCl buffer as the elution buffer.
  • the solution was purified using affinity (pH 3).
  • the eluted fraction was adjusted to around pH 7.2 by adding 1 M Tris-HCl (pH 8.0).
  • the prepared antibody solution was replaced with PBS (-) using a dialysis membrane (10000 cuts, manufactured by Spectrum Laboratories), and sterilized by filtration through a membrane filter with a pore size of 0, MILLEX-GV (manufactured by MILLIP0RE).
  • a single band of purified FLAG-sBST2 and FLAG_sBST2-GST was obtained by SDS / PAGE electrophoresis.
  • mice used for immunization had a homozygous genetic background for both endogenous Ig heavy chain rupture and / c light chain disruption, and a chromosome 14 fragment containing the human Ig heavy chain locus. (SC20)) and the human Ig / c chain transgene (KCo5).
  • SC20 human Ig heavy chain locus
  • KCo5 human Ig / c chain transgene
  • This mouse was produced by crossing a mouse with a human Ig heavy chain locus (strain A) and a mouse with a human Ig / c chain transgene (strain mouse.
  • SC20 a report by Tomizuka et al. (Tomizuka.
  • strain B is homozygous for both endogenous Ig heavy chain and ⁇ light chain disruption, and human Ig K chain.
  • Male mice of strain A and female mice of strain B Or strain A female mice and strain B males The following solids (Ishida & Lonberg, IBCs 11th Ant Body Engineering, Abstract 2000) obtained by crossing mice and in which human Ig heavy chain and ⁇ light chain are simultaneously detected in serum Used for immunization experiments.
  • the human antibody-producing mouse can be obtained from Kirin Brewery Co., Ltd. under a contract.
  • the preparation of the monoclonal antibody in this example was prepared according to a general method as described in, for example, Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures (written by Tamoe Ando et al., Published by Kodansha 1991).
  • human BST2 as an immunogen, the pTracer-CMV / hBST2 vector prepared in Example 1 and FLAG-SBST2 prepared in Example 5 were used.
  • a human antibody-producing mouse that produces human immunoglobulin prepared in Example 6 was used as the animal to be immunized.
  • the pTracer-CMV / hBST2 vector (10 g / animal) prepared in Example 1 is introduced and expressed into human antibody-producing mice using Trans IT TM In Vivo Gene Delivery System Reagent (Takara Shuzo Co., Ltd.). First immunization. After the initial immunization, the vector was transduced and expressed three times a week, and boosted. Further, the FLAG-SBST2 (10 Mg) prepared in Example 5 was boosted by tail vein injection, and the FLAG-SBST2 (10/2 g) was similarly treated three days before the acquisition of spleen cells described below. I was immunized.
  • the spleen was surgically obtained from the immunized mouse, and the collected spleen cells were mixed with mouse myeloma SP2 / 0 (ATCC No .: CRL1581) at a ratio of 5: 1, and polyethylene glycol 1500 (Boehringer Mannheim) was used as a fusion agent.
  • a number of hybridomas were produced by cell fusion using The selection of the hybridoma was performed using a DMEM medium containing HAT containing 10% fetal calf serum (Fetal Calf Serum, FCS) and hypoxanthine (H), aminopterin (A), and thymidine (T) (Gibco BRL). ).
  • a single clone was obtained by a limiting dilution method using HT-containing DMEM medium.
  • the culture was performed in a 96-well microtiter plate (manufactured by Becton Dickinson).
  • Selection (screening) of hybridoma clones producing anti-human human monoclonal antibodies and characterization of the human monoclonal antibodies produced by each hybridoma were carried out by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and fluorescence-activated This was done by measuring in the evening (FACS).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • each hybridoma producing the human anti-human hBST2 monoclonal antibody of the present invention is represented by the symbol Was used.
  • the following hybridoma clones represent a single clone: 2-1L, 2-20J, 5-71, 5-85H, 7-90G, 8-190, b-76-8 or 9-16-1.
  • Hypri-Doma clones 5-71, 7-90G, 9-16-1 and b-76-8 were transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (1-chome, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) International deposit was made at No. 1, 1 Central 6) under the provisions of the Budapest Treaty.
  • Ibri dorma clones 5-71 and 7-90G are accession numbers FERM BP-7417 and FEM BP-7418, respectively (as of December 26, 2000)
  • hybrididoma clones 9-16-1 and b-76- 8 are the accession numbers FERM BP-7821 and FERM BP-7822, respectively (as of December 7, 2001).
  • Example 8 Detection of monoclonal antibody having human immunoglobulin ⁇ chain FLAG-SBST2-GST (1 g / ml 50 mM Na 2 HCO 3> Pell) prepared in Example 5 was transferred to a 96-well microplate for ELISA (Maxi sorp , Nunc) and incubated at room temperature for 30 minutes to adsorb FLAG-SBST2-GST to the microplate. Next, the supernatant was discarded, a blocking reagent (SuperBlock TM Blocking Buffer, manufactured by PIERCE) was added to each well, and the mixture was incubated at room temperature for 10 minutes to block a site where FLAG-sBST2-GST was not bound. Thus, a microplate in which each well was coated with FLAG-SBST2-GST was prepared.
  • ELISA Maxi sorp , Nunc
  • TMB coloring substrate solution
  • the FLAG-SBST2-GST (1 i / ml 50 mM Na 2 HCO 3 , 50 1 / well) prepared in Example 5 was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (Maxi soriK Nunc), and the mixture was added at room temperature for 30 minutes. After incubating, FLAG-SBST2-GST was adsorbed to the microplate. Next, the supernatant was discarded, and a blocking reagent (SuperBlock TM Blocking Buffer, manufactured by PIERCE) was added to each well, followed by incubation at room temperature for 10 minutes. Each well was washed twice with PBS-T.
  • SuperBlock TM Blocking Buffer manufactured by PIERCE
  • the culture supernatant (501) of each hybridoma was added to each well of the microplate coated with FLAG-SBST2-GST, reacted for 30 minutes, and then each well was washed twice with PBS-T. Next, each well was subjected to a peroxidase-labeled anti-human IgG1 antibody, anti-human IgG2 antibody, anti-human IgG3 antibody or anti-human IgG4 antibody (diluted 2,000-fold, 50 / well, respectively). , The Binding Site) and incubated at room temperature for 30 minutes. After washing three times with PBS-T, a substrate buffer (TMB, well, DAK0) was added to each well, and incubated at room temperature for 20 minutes.
  • TMB substrate buffer
  • Myeloma-derived cell line RPMI8226 (ATCC CCL-
  • Negative controls were prepared using human IgGl antibody (manufactured by Sigma) or human IgG4 antibody (manufactured by Sigma) at a concentration of 2/1111 in a hybridoma culture medium, and then added to 50 / zl according to each subclass. Incubated for 30 min. After washing twice with SB, 0.0125 mg / ml of RPE fluorescently labeled ⁇ heron anti-human IgL / F (ab ') 2 antibody (manufactured by DAK0) 301 was added, and incubated at ice temperature for 30 minutes.
  • the culture supernatant containing the anti-BST2 antibody was prepared by the following method.
  • Anti-BST2 antibody-producing hybridomas were analyzed by using insulin (5 g / ml, Gibco BRL), human transferrin (5 g / ml, Gibco BRL), ethanolamine (0.01 mM, Sigma), sodium selenate (2.5x10- 5 ⁇ , sigma) were habituated to contain eRDF medium (Kyokuto pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the cells were cultured in a spinner flask. When the viable cell ratio of the hybridoma reached 90%, the culture supernatant was recovered.
  • the collected supernatant was subjected to a lO / zm and 0.2 l filter (manufactured by Gelman Science) to remove miscellaneous waste such as hybridoma.
  • the anti-BST2 antibody was purified from the culture supernatant by the following method. Using a Hyper D Protein II column (manufactured by NGK), the culture supernatant containing the anti-BST2 antibody was used as the adsorption buffer in PBS (-), and the elution buffer was 0.1 M sodium citrate buffer (pH It was affinity purified using 3). The eluted fraction is 1 MTris_HCl (H 8.0) was added to adjust the pH to around 7.2. The prepared antibody solution was replaced with PBS (-) using a dialysis membrane cut, Spectrum Laboratories), and sterilized by filtration through a 0.22 xm membrane filter, MILLEX-GV (MILLIPORE). Purified anti-BST2 antibody was obtained. The concentration of the purified antibody was calculated by measuring the absorbance at 280 MI and setting 1 mg / ml to 1.450D.
  • Fluorescent labeling of the anti-BST2 antibody was performed by the following method. Alexa Fluor TM 488 (Molecular Probes) was bound to the anti-BST2 antibody prepared in Example 12 according to the attached instructions. To 0.5 ml of 2 mg / ml anti-BST2 antibody was added 501 1M carbonate buffer, mixed with Alexa Fluor TM 488, and reacted with stirring for 1 hour at room temperature. Hydroxylamine was added to stop the reaction, and the mixture was applied to a gel filtration column (NAP5, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) to remove Alexa Fluor TM 488 unbound to the antibody. Under these conditions, six fluorescent substances bound to one antibody molecule. The fluorescently labeled antibody bound to RPMI8226, and its binding activity was equivalent to the unlabeled antibody.
  • Alexa Fluor TM 488 Molecular Probes
  • Antigen internalization-inducing activity of an antibody was determined by Andrzej et al. (LI ⁇ uno l.
  • Unbound Mexa Fluor TM 488-labeled anti-BST2 antibody was removed from cells by washing four times with ice-cold RPMI medium containing 10% FCS. After resuspending in RPMI medium containing 10% FCS warmed to 37 ° C, culture at 37 ° C. After 0, 15, 30, 60, and 120 minutes of incubation, use ice-cold SB to stop internalization. Washed twice. To detect the antibody bound to hBST2 on the cell surface, add 0.0125 mg / ml RPE fluorescently labeled ⁇ egan anti-human IgL ⁇ F (ab ') 2 antibody (DAK0) 30/21 Incubation for 30 minutes on ice.
  • the cells were suspended in a FACS buffer solution, and the average fluorescence intensity of each cell was measured by FACScan (manufactured by Becton Dickinson).
  • the background level was set using the Alexa Flour TM 488-labeled IgGl ⁇ antibody and RPMI8226 strain as controls for the average fluorescence intensity at the start of cultivation at 37 ° C for samples treated as described above, for Alexa 3-5, for RPE Then, the sensitivity was set as shown in Figs. Figure 2 shows the results.
  • the average fluorescence intensity of Alexa Fluor TM 488 did not decrease when cultured at 3rc, the average fluorescence intensity of the RPE fluorophore, which indicates the amount of BST2 / anti-BST2 antibody immune complex on the cell surface, was 37%.
  • the average fluorescence intensity of the RPE fluorescent substance decreased to less than 50% at 15 minutes of culture, and the anti-BST2 antibody (7-90G) efficiently internalized BST2. Antibodies.
  • the state of the internalization was observed by fluorescence microscopy (Fig. 3).
  • N- methyl -N- of 26mg prepared in a separate method according References (methyl-di Chio prop Noiru) - L-Aranin was dissolved in CH 2 C 1 2 of 3 ml, here dicyclohexyl of 30mg Kishiruka Rupojiimido ( 2 equivalents) and 1 M zinc chloride 201 (1 equivalent) were added and stirred at room temperature for 30 minutes. However, the reaction did not proceed under these conditions, so the amount of 1 M zinc chloride added was changed to mn ⁇ (5 equivalents), and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes.
  • 11.8 mg of maytansinol was dissolved in 1 ml of CH 2 C 12 and added to carry out an esterification reaction.
  • FIG. 6 shows 500 band z 1H NMR of the obtained May-SS-Me form.
  • IC5 of May -SS-Me obtained in the cytotoxic activity test of human myeloma cell line IM9 described in Example 19. Is ⁇ , which is less than 1/100 that of ansami tocin. P-3.
  • the introduced PDP group was 3.4 molecules / antibody.
  • the May-SH (170 g / 800 L) prepared in Example 16 and the PDP-i-dani b-76-8 (10 mg / 9 mL) prepared in Example 17 were reacted at 4 ° C. for 40 hours.
  • the reaction solution was applied to a Sepliadex TM G-25 column equilibrated with a phosphate buffer (pH 7.4) to remove unreacted May-SH.
  • Dithiothreitol was added to a part of the obtained sample so as to be ImM, and reacted at room temperature for 5 minutes. After the reaction, the absorbance of the released pyridine-2-thione at 343 nm was measured, and the molar concentration of the PDP group present in the reaction system was quantified.
  • the introduced maytansine compound was 1.8 molecules / antibody.
  • Cysteine was added to a concentration of 0.1 M, and the reaction solution was equilibrated with phosphate buffer (PH7.4). Maytansine binding over time! )
  • the -76-8 antibody ( May-b-76-8) was purified.
  • IM9 cells human myeloma cell line IM9 cells (ATCC CCL-159) was examined in the same manner as in Example 11. As a result, the May-b-76-8 antibody showed the same reactivity as the b-76-8 antibody.
  • the anti-tumor activity of the May-b-76-8 antibody was performed as follows. In each 96-well flat-bottomed plate (manufactured by Becton Dickinson), 2 x10 5 cells / ml of IM9 cells were added to 100 // 1 and b-76-8 antibody, May-b-76-8 antibody, or control human. IgGl was added, and the cells were cultured in a carbon dioxide incubator for 24 hours.
  • MTS (3- (4,5-dimethylthiylthiazol-2-yl) -5- (3carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulphophenyl) -2H-tetrazolium, manufactured by FLOMEGA)
  • the solution was added to each well and incubated for an additional 2 hours.
  • the surviving cells were then measured for absorbance at a wavelength of 490 nm using a microplate reader (MTP-300, manufactured by Corona Electric).
  • MTP-300 microplate reader
  • the antibody to be administered was prepared at 800 g / ml using filtered and sterilized PBS (-), and used as the antibody to be administered.
  • mice Human myeloma-transplanted mice were prepared using SCID mice (CLEA Japan) to prepare human myeloma cell line IM9 cells at 2.5 ⁇ 10 7 cells / ml with PBS ( ⁇ ).
  • the IM9 cell solution 200 / zl was injected from the tail vein to a SCID mouse (female, 6 weeks old) (CLEA Japan) to which anti-ashia mouth GM1 (manufactured by Wako Pure Chemical) 100 1 was administered into the tail vein the day before.
  • Antibodies prepared between day 6 and day 10 after IM9 cell transplantation were administered to these mice intravenously 200 11 1 each day.
  • the anti-tumor effect of the May-b-76_8 antibody was evaluated by the survival time of mice.
  • the PBS (-) control group and the isotype control In the human IgGl-administered group, death was observed around 20 days after IM9 cell transplantation. In the PBS (-)-administered group, death died on the 22nd day after transplantation, and the same was observed in the group administered with isotype control IgGl. Survival was observed.
  • the b-76-8 antibody-administered group showed a longer survival time compared to the control group (p ⁇ 0.01, Logrank test).
  • the monoclonal antibody of the present invention has a characteristic of binding to the human BST2 antigen on the cell surface and being localized inside the cell by internalization, a therapeutically useful drug bound to this antibody is used as a BST2 Can be efficiently delivered into cells such as multiple myeloma cells, lymphoid tumor cells, and primary local cancer cells that express the protein on the cell surface, and have a new effect on the treatment of difficult-to-treat diseases. It has the advantage of providing a therapeutic agent based on a mechanism.

Description

明 細 書 新規モノクローナル抗体 技術分野
本発明は、 細胞表面に存在するヒ卜 BST2抗原を認識する抗体に関する。 具体的 には、本発明は該ヒト BST2抗原に結合し該細胞へのィンターナリゼーションによ り該細胞内部へ局在化しうるモノクローナル抗体又はその機能的断片に関する。 本発明はまた、 該モノクローナル抗体又はその機能的断片と、 治療用試薬とを 結合したものである複合体に関する。
背景技術
癌 （腫瘍） は、 わが国における死亡原因の第一位を占め、 さらに患者数は年々 増加してきており、 有効性及び安全性の高い薬剤や治療法の開発が強く望まれて いる。 造血器腫瘍の一つである多発性骨髄腫 （mul t iple mye loma) は、 B細胞の 分化の最終段階に異常を来す不治の B細胞腫瘍である。 臨床的には、 多発性骨髄 腫の経過は、 末期の形質細胞性白血病 （pl asma cel l leukemia) と類似しており、 形質細胞のクローンの蓄積を特徴とする新生物で免疫グロプリン鎖の分泌を伴う ことが多い。 腫瘍による骨髄浸潤には貧血、 低グロブリン血症及びバクテリア感 染等の多数の合併症を伴った制御不能な骨髄腫細胞の増殖がみられる。 また、 多 発性骨髄腫ではインタ一ロイキン 6 ( IL6) レベルが増大するが、 骨の痛み、 骨 折及び低カルシウム血症を導く破骨細胞の増大をもたらす。 高濃度の骨髄腫免疫 グロプリン及び高カルシウム血症に関して、 腎不全もともなうことも多い。
これまで多発性骨髄腫患者に対し種々の治療法が試みられてきたが、 いまだ患 者全体の臨床的効果は低い。 化学療法はメルファラン及びプレドニゾロンを用い た多剤併用治療が標準的な治療であるが、 約 2年の中間的な持続とともに寛解の 導入後再発して死亡する （A lexanian e t al. , N ew E ngl and J Med ic ine. , 1994 Vol 330 :484) 。 また、 これら薬剤は、 腫瘍細胞だけに特異的に作用するの ではなく、 正常細胞に対しても毒性を示すため重篤な副作用が発現し、 治療効果 にも限界がある。 1980年代より造血幹細胞移植を併用した超大量化学療法が未だ 活発に検討されているが臨床的な効果は低いままである。
正常細胞への毒性を低減するため、 放射性核種や他の細胞毒性物質を結合した ターゲッティング抗体の使用が試みられている （Goldenberg.， Semin Nucl Med. , 1989 Vol 19:332) 。 しかしながら、 腫瘍細胞内部へ夕ーゲッティング抗体が取 り込まれる割合は一般に低く、 総注入量の 0.01%から 0.001%にすぎない (Vaughan et al.f Brit J Radiol., 1987 Vol 60:567) 。 標的細胞内への迅速な 局在化 （インタ一ナリゼーシヨン） 特性を併せもつ抗体を開発することにより、 化学合成毒素、 杭がん剤及び放射性核種などの治療用試薬との結合によりそれら 細胞毒性物質の迅速な細胞内放出を達成でき、 有効性の向上及び副作用が低減す る可能性がある。
これまで多発性骨髄腫を対象とした抗体療法の試みが行われてきている。 IL - 6 は多発性骨髄腫細胞の主要な増殖因子であると考えられ （Kawano et al. , Nature., 1988 Vol 332:83 ； Klein et al. , Blood. , 1991 Vol 73:517) 、 IL-6 シグナル伝達系を阻止することを目的とし、 IL- 6あるいは IL-6レセプターに対 する中和抗体を用いた多発性骨髄腫患者の治療が試みられている。 しかし、 疾患 の白血病変異を伴う患者において骨髄腫細胞の増殖抑制が観察されたものの、 腫 瘍が再発し臨床的な有効性は得られていない （Bataille et al. , Blood., 1995 Vol 86:68 ； Van Zaanen et al. , Br J Haematol., 1998 Voll02:783; 日本臨床 免疫学会会誌 1997 vol20:87 ) 。 さ らに CD19 (Grossbard et al. , Br J Haematol., 1998 Voll02:509) , CD20 (Hussein et al. , Blood., 1999 Yol94[Suppl.1] :313), CD38 (Maloney et al. , Semin Hematol. , 1999 Vol36 [Suppl.3] :30), CD54 (Huang et al. , Cancer Res. , 1995 Vol55:610), CD138(Wijdenes et al. , Br J Haematol., 1996 Vol94:318), Muc-1 (Treon et al., Blood., 1999 Vol93: 1287)等の骨髄腫細胞発現抗原が、 抗体療法の標的抗原 の候補として報告されているがいまだ実用化には至っていない。
近年、 骨髄腫細胞に高発現している抗原の一つとして、 Bone marrow stromal antigen 2 (BST2、 あるいは HM1.24抗原とも称される）が報告されている （Goto et al. , Blood. , 1994 Vol84:1922 ； O tomo et al. , Biochem Biopliys Res Com醒., 1999 Vol258:583) 。 BST2は 180アミノ酸残基からなる分子量約 30kDa の type II膜貫通糖タンパク質である。 S-S結合によりホモダイマーを形成し細胞 膜上に発現している。 BST2タンパク質は、 正常な末梢血細胞、 骨髄細胞、 反応性 リンパ球、 肝臓、 腎臓、 心臓等には発現しておらず、 形質細胞と骨髄腫細胞に特 異性高く発現している。 詳細な生物学的活性は未だ不明であるが、 BST2は B細胞 の終末分化に関与するものと考えられている （Ishikawa e t al.， Genomics. , 1995 Vol26 : 527) 。 ヒト BST2に対する抗体については、 ヒト BST2発現細胞株をマ ウス等の非ヒト哺乳動物に免疫することにより作製されたマウスモノクローナル 抗体 （Goto et al. , Blood. , 1994 Vol 84 : 1922) が報告されている。 また、 この マウスモノクローナル抗体の可変領域とヒト免疫グロプリンの定常領域からなる キメラ抗体も報告されている （Ozaki e t al.， Blood. , 1999 Vol93 : 3922) 。 こ の抗体をヒト骨髄腫細胞を移植された S C I Dマウスに対して骨髄腫細胞の注入 1 0日後に投与した場合、 腫瘍増殖は抑制された （Ozaki et al. , Blood. , 1997 Vol90 : 3179) 。 このように BST2をターゲット抗原とした多発性骨髄腫の抗体療法 は有望であることが予想される。 また、 BST2は、 骨髄腫のみならず他のリンパ球 系腫瘍にも発現していることが報告されているため、 抗 BST2抗体療法はこれら腫 瘍にも効果を発揮することが予想される。 しかしながら、 これら抗体は、 抗体結 合による BST2 modulat ionを起こす活性はなく （尾崎ら 血液，腫瘍科、 2000 Vol41 : 128) 、 化学療法剤や放射性核種などの治療用試薬の有効性増加 ·副作用 の低減が大いに期待できる迅速なインターナリゼ一シヨンを誘導する抗 BST2抗体 は未だ全く報告されていない。 また、 一般に細胞表面に発現する抗原蛋白質に結 合し、 当該細胞内部へのインターナリゼーシヨンを誘導する抗体が取得されうる ことは知られているが、 すべての細胞表面抗原についてそのような抗体が取得さ れるものであるかは必ずしも明らかではない。
発明の開示
本発明の目的は、 ヒト BST2に結合でき、 かつ、 ヒト BST2を発現する腫瘍細胞等 の細胞の内部への局在化 （インターナリゼーシヨン） 誘導活性を併せ持つ抗体を 開発することにより、 現在治療困難な多発性骨髄腫等の疾患の治療のために新し い作用機序に基づく治療剤を提供することである。
本発明者らは、 ヒト BST2に対する抗体の作製に関して鋭意研究した結果、 標的 細胞内への迅速なインターナリゼーシヨン特性をもつ抗 BST2抗体を取得すること に成功し本発明を完成させた。 本発明は下記の発明を包含する。
( 1 ) 細胞表面に存在するヒト BST2抗原に結合し、 該細胞へのインターナリゼ一 シヨンにより該細胞内部へ局在化しうることを特徴とするモノクローナル抗体又 はその機能的断片。
( 2 ) 前記細胞が RPMI8226株 (ATCC CCL- 155)であり、 氷冷下で前記モノクローナ ル抗体を結合した後、 37 にて培養開始後 120分以内にィンターナリゼーシヨン が進行し、 前記細胞表面上のヒト BST2/前記モノクローナル抗体複合体の存在量 を示す蛍光物質の平均蛍光強度が、 培養開始時の 50 %以下を示すものである、
( 1 ) のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
( 3 ) 前記細胞が RPMI8226株であり、 氷冷下で前記モノクローナル抗体を結合し た後、 37°Cにて培養開始後 90分以内にインターナリゼーシヨンが進行し、 前記細 胞表面上のヒト BST2/前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍光物質の 平均蛍光強度が、 培養開始時の 50%以下を示すものである、 （1 ) のモノクロ一 ナル抗体又はその機能的断片。
( 4 ) 前記細胞が RPMI8226株であり、 氷冷下で前記モノクローナル抗体を結合し た後、 37°Cにて培養開始後 60分以内にインターナリゼーシヨンが進行し、 前記細 胞表面上のヒト BST2/前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍光物質の 平均蛍光強度が、 培養開始時の 50%以下を示すものである、 （1 ) のモノクロ一 ナル抗体又はその機能的断片。
( 5 ) 前記細胞が RPMI8226株であり、 氷冷下で前記モノクローナル抗体を結合し た後、 37 にて培養開始後 30分以内にインターナリゼーシヨンが進行し、 前記細 胞表面上のヒ卜 BST2/前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍光物質の 平均蛍光強度が、 培養開始時の 50%以下を示すものである、 （1 ) のモノクロ一 ナル抗体又はその機能的断片。
( 6 ) 前記細胞が RPMI8226株であり、 氷冷下で前記モノクローナル抗体を結合し た後、 37でにて培養開始後 15分以内にインターナリゼーシヨンが進行し、 前記細 胞表面上のヒ卜 BST2/前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍光物質の 平均蛍光強度が、 培養開始時の' 50%以下を示すものである、 （1 ) のモノクロ一 ナル抗体又はその機能的断片。
( 7 ) 配列番号 2のアミノ酸番号 50〜180のアミノ酸配列中のェピトープを認識 する、 （1 ) のモノクロ一ナル抗体又はその機能的断片。
( 8 ) IgGK / ) 又は IgG4 ( K )である、 （1 ) のモノクロ一ナル抗体又はその機 能的断片。
( 9 ) ヒト抗体である、 （1 ) のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
(10) 受託番号 FERM BP-7 17, PERM BP- 7418、 FE腹 BP- 7821又は FE腹 BP - 7822の ハイブリド一マ（それぞれ 5- 71、 7-90G, 9- 16- 1又は b- 76- 8)により産生される、
( 1 ) のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
( 11) 受託番号 FERM BP - 7417、 FERM BP- 7418、 FERM BP- 7821又は FERM BP- 7822の ハイプリド一マ（それぞれ 5 71、 7- 90G、 9- 16- 1又は b- 76- 8)よりヒト抗体遺伝子 をクローニングし、 該遺伝子を発現可能な状態で宿主細胞に導入し、 該宿主細胞 を培養することにより取得される、 （1 ) のモノクローナル抗体又はその機能的 断片。
(12) ( 1 ) から （l i) のいずれかのモノクローナル抗体又はその機能的断片と、 治療用薬剤とを結合したものである複合体。
(13) 治療用薬剤が、 放射性核種、 細菌毒素、 化学療法剤及びプロドラッグから 選ばれる少なくともひとつである （12) の複合体。
(14) (12) 又は （13) の複合体を有効成分として含む、 ヒト BST2を発現する細 胞を標的とする医薬組成物。
( 15) リンパ球性腫瘍、 リウマチ、 又は原発性局所癌に適用するものである (14) の医薬組成物。
(16) 多発性骨髄腫に適用するものである G4) の医薬組成物。
(17) ヒト BST2抗原の少なくとも部分アミノ酸配列を含むポリぺプチドを免疫し た非ヒト動物の脾臓細胞とミエ口一マ細胞との融合によりハイプリド一マを調製 し、 該ハイプリドーマよりヒト BST2抗原に結合する抗体を産生するハイプリドー マを選抜し、 前記選抜されたハイプリドーマより産生されたヒト BST2抗原に結合 する抗体を、 ヒト BS 抗原を発現する細胞と反応させ、 前記細胞を培養する過程 で該細胞表面のヒ卜 BST2/前記抗体複合体の存在量の低下を指標とした選抜を行 うことを特徴とする、 請求項 1に記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片 の作製方法。
また、 本発明は前記 （1) から （11) のいずれかのモノクローナル抗体又はそ の機能的断片に、 生物学的に活性な物質を化学的又は遺伝子工学的手法により結 合させることにより、 ヒト BST2を発現する細胞の内部へ前記生物学的に活性な物 質を導入する方法をも提供する。 「生物学的に活性な物質」 とは、 該物質が導入 された細胞に対して何らかの生物学的変化、 例えば①該細胞の増殖の促進又は抑 制、 ②分化の促進若しくは抑制又は脱分化、 ③該細胞から他の細胞への信号伝達 等の作用の変化、 ④細胞の死、 などをもたらしうる物質のことを言う。 具体的に は、 化学療法剤、 放射性核種、 細菌毒素、 各種のサイト力イン類若しくはホルモ ン類、 転写因子、糖鎖の合成若しくは分解に関連する酵素、 又は細胞に対して前 記機能を有する DNA若しくは RNAなどが挙げられる。 本明細書で使用する用語の定義は以下のとおりである。
「ヒト BST2」 とは、 bone marrow s t romal ant igen 2の略称であり、 180ァミノ 酸残基からなる分子量約 30kDaのタイプ I I膜貫通糖タンパク質で、 ジスルフィ ド 結合によりホモダイマーを形成し形質細胞、 骨髄腫細胞等の細胞の細胞膜上に特 異的に発現しているタンパク質をいう （例えば Goto ら，上記； Ohtomoら，上記） 。
「インターナリゼーシヨン」 又は 「迅速なインターナリゼーシヨン」 とは、 一 般に食作用 （エンドサイト一シス ： endocytos i s) と称される機構のうち、 細胞 の非特異的なとりこみの飲作用などを示すのではなく、 抗体が細胞表面抗原と免 疫複合体を形成し、 短時間で細胞内に取りこまれる現象を示す。 例えば、 反応条 件や抗体 ·抗原の性質等により異なるが、 一般に抗体がこの機序でとり込まれる 場合、 抗体と受容体の免疫複合体は、 結合後エネルギー依存的に細胞表面を移動 し、 やがて一極に集中 （キヤッビング） したあと、 1〜数分、 遅くとも 1 2時間 以内に細胞内に取り込まれる。 細胞表面の抗原に結合し、 インターナリゼーショ ンにより細胞内に取り込まれる抗体を、 本明細書では 「イン夕一ナリゼ一シヨン 誘導活性を有する抗体」 と称することがある。
「細胞表面上のヒト BST2/前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍光 物質の平均蛍光強度が、 培養開始時の 50%以下を示す」 とは、 ヒト BST2抗原を細 胞表面に有する細胞を抗 BST2抗体の存在下で培養する際に、 培養開始時に細胞表 面上のヒト BST2との免疫学的反応によって形成されたヒト BST2/モノクローナル 抗体複合体の存在量 100に対する一定時間経過後の該複合体の残存量の割合が 50 %以下であること、言い換えれば免疫学的複合体を形成する抗 BST2抗体の 50 % 以上がィンターナリゼーシヨンによって細胞内部にとり込まれたこと、 を意味す る。
「プロドラッグ」 とは、 生体内に投与されると内因性酵素等の作用によって活 性型の薬剤に変換される前駆体薬剤をいう。
「化学療法剤」 とは、 腫瘍等に基因する疾患を患者に対し著しい障害を与える ことなく病原に選択的に作用して治療する薬剤をいう。
本明細書又は図面においてアミノ酸を表記するために用いられるアルファべッ トの一文字は、 各々次に示すアミノ酸を意味する。
(G) グリシン、 （A) ァラニン、 （V) バリン、 （L) ロイシン、 （I) イソロイ シン、 (S) セリン、 （T) スレオニン、 (D) ァスパラギン酸、 (E) グルタミン 酸、 （N) ァスパラギン、 （Q) グルタミン、 （10 リジン、 （R) アルギニン、 (0 システィン、 （M) メチォニン、 (F) フエ二ルァラニン、 (Y) チロシン、 (W) トリブトファン、 （H) ヒスチジン、 （P) プロリン。 また DNAを表記するた めに用いられるアルファベットの一文字の意味は、 各々次に示す。 （A) アデ二 ン、 ( C ) シトシン、 ( G) グァニン、 (T) チミン。 以下、 本発明を詳細に説明する。
ヒト BST2は、 公知の塩基配列又はアミノ酸配列 （各々、 配列番号 1又は 2 ) に 基づいて、 遺伝子組換え技術のほか、 化学的合成法、 細胞培養方法等のような技 術的分野において知られる方法を適宜用いることにより製造することができる。 またヒト BST2の部分配列は、 後述する技術的分野において知られる方法に従って、 遺伝子組換え技術又は化学的合成法により製造することもできるし、 またヒト BST2をタンパク分解酵素等を用いて適切に切断することにより製造することがで さる。
本発明の抗体には、 インターナリゼーシヨン誘導特性を有することを特徴とす る各種の抗ヒト BST2モノクローナル抗体が包含される。 該抗体の例には、 後述の 実施例 7から実施例 1 5に記載されるような抗ヒト BST2モノクローナル抗体、 あ るいは、 該抗体を構成する重鎖及び/又は軽鎖の各々のアミノ酸配列において 1 若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する 重鎖及び/又は軽鎖からなるモノクローナル抗体であつて、 インターナリゼーシ ョン 導特性を有する抗体も包含される。 本発明の抗体のアミノ酸配列中への、 前記のようなアミノ酸の部分的改変 （欠失、 置換、 挿入、 付加） は、 そのアミノ 酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより導入することができ る。 この塩基配列の部分的改変は、 既知の部位特異的変異導入法 （Si t e spec i f ic mutagenes is) を用いて常法により導入することができる （Proc Nat l Acsd Sc i USA. , 1984 Vol 81 : 5662 ； Sambrook e t al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989) Second edi t ion, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 。 本発明の抗体には、 いずれのィムノグロブリンクラス及びサブクラス を有する抗体も包含するが、 好ましくはヒトイムノグロプリンクラス及びサブク ラスを有する抗体であり、 好ましいクラス、 サブクラスはィムノグロブリン G (IgG)、 特に IgGl及び IgG4であり、 好ましい軽鎖は/ である。
本発明の抗体又はその断片の好ましい例は、 該抗体又はその断片を氷冷下で骨 髄腫細胞株 RPMI8226 (ATCC CCL- 155)に結合した後、 37°Cにて培養開始後約 120分 以内、 好ましくは約 90分以内、 さらに好ましくは約 60分以内、 特に好ましくは約 30分以内、 さらに特に好ましくは約 15分以内にインターナリゼーションが進行し、 該細胞表面上のヒト BST2/抗 BST2抗体複合体の存在量を示す蛍光物質の平均蛍光 強度が、 培養開始時の 50%以下を示すものである。
本発明の抗体又はその断片の好ましい別の例は、 ヒ卜 BST2のアミノ酸配列 （配 列番号 2 ) 中の連続又は不連続の少なくとも 8個のアミノ酸残基によつて構成さ れるェピトープを認識し、 かつ、 インターナリゼ一シヨン誘導特性を有するモノ クローナル抗体又はその断片からなる配列である。 例えば配列番号 2のアミノ酸 番号 10〜180、 2 Ο〜180、 3 Ο〜180、 40〜180、 50〜180、 50〜Π0、 5 O〜160、 50〜150、 50〜140、 50〜130、 50〜120、 50〜110、 50〜100、 50〜90、 50〜80、 50 〜70、 50〜60のアミノ酸配列中のェピトープを認識し、 かつ、 インターナリゼ一 シヨン誘導特性を有するモノクローナル抗体又はその断片である。
本発明の抗体又はその断片の好ましいさらに別の例は、 ヒト BST2及びサル BST2 に対して交差反応を示す性質を有する抗体である。 このような抗体は、 ヒト BST2 とサル BST2において、 同一又は極めて類似したェピトープ構造を認識するものと 想定され、 ヒトに対する臨床試験に先立ちサルを実験動物とした種々の試験が可 能であるという利点を有する。 このような抗体の具体例は、 ハイプリ ドーマ 9 - 16-1 (FERM BP- 7821) 又はハイプリドーマ b- 76- 8 (FE西 BP- 7822) の産生する抗 体である。
本発明における抗体の断片とは、 前記で定義した抗体の一部分を意味し、 具体 的には F (ab' ) 2 、 Fab'、 Fab 、 F v、 d i sulp ide-1 inked FV、 Singl e-Chain FV (scFV)及びこれらの重合体等が挙げられる （D. J. King. , Appl icat ions and Engineering of Monoc lonal Ant ibod ies. , 1998 T. J. Internat ional Ltd) 。 こ のような抗体断片は慣用法、例えばパパイン、 ペプシン等のプロテアーゼによる 抗体分子の消化、 あるいは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。
「機能的断片」 とは、 抗体が特異的に結合する抗原に対して、 特異的に結合する 抗体の断片を意味する。
本発明の抗体は、 例えば、 下記のような方法によって製造することができる。 即ち、 例えば、 前記で定義したようなヒト BST2若しくはその一部、 又は抗原の抗 原性を高めるための適当な物質 （例えば、 bovine serum albumin等） との結合物、 又はヒト BST2を細胞表面に多量に発現している細胞を、 必要に応じて免疫賦活剤
(Freimd' s Adjuvant等） とともに、 マウス、 ゥサギ、ャギ、ゥマ等の非ヒト哺乳 動物に免疫する。 あるいは、 BST2を組み込んだ発現べクタ一を非ヒト哺乳動物に 投与することにより免疫感作を行うことができる。 モノクローナル抗体は、 免疫 感作動物から得た抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞 （ミエロー マ細胞） からハイプリドーマを調製し、 ハイプリドーマをクローン化し、 免疫に 用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローン を選択し、 さらに後述する方法によりインタ一ナリゼーシヨン誘導特性を有する クローンを選抜することによって製造される。 また好ましくは、 再配列されてい ないヒト抗体遺伝子を保持し、 免疫感作により当該免疫原に特異的なヒト抗体を 産生する非ヒ卜動物を用いることにより、 本発明の抗体はヒト抗体であってもよ い。 ここで、 ヒト抗体とは、 ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体、 又は その機能的な断片を意味する。
さらに具体的には下記のようにして製造することができる。 モノクローナル抗 体を分泌するハイプリドーマの調製は、 ケーラー及びミルシュタインらの方法
(Nature. , 1975 VoL 256 :495-497) 及びそれに準じて行うことができる。 即ち、 前述の如く免疫感作された動物から取得される脾臓、 リンパ節、 骨髄又は扁桃等、 好ましくはリンパ節又は脾臓に含まれる抗体産生細胞と、 好ましくはマウス、 ラ ット、 モルモット、 ハムスター、 ゥサギ又はヒト等の哺乳動物に由来する自己抗 体産生能のないミエローマ細胞とを、 細胞融合させることにより調製される。 細 胞融合は例えば、 ポリエチレングリコール （例えば分子量 1500〜6000) 等の高濃 度ポリマー溶液中、通常約 30〜40 、約 1〜10分間、 抗体産生細胞とミエローマ細 胞を混合することによって行うことができる。 モノクローナル抗体を産生するハ イブリドーマクローンのスクリーニングは、 ハイプリ ドーマを、 例えばマイクロ タイ夕一プレート中で培養し、 増殖の見られたゥエル中の培養上清の免疫抗原に 対する反応性を、 例えば E L I S A等の酵素免疫測定法、 ラジオィムノアツセィ、 蛍光抗体法などの免疫学的方法を用いて測定することにより行なうことができる。 ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、 ハイブリドーマをインビ トロで培養して培養上清から単離することができる。 また、 マウス、 ラッド、 モ ルモット、 ハムスター又はゥサギ等の腹水中等でのインビポで培養し、 腹水から 単離することもできる。
また、 ハイプリドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコードする 遺伝子をクローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主 （例えばチ ャィニーズハムスター卵巣 （CH0) 細胞等の哺乳類細胞株、 大腸菌、 酵母細胞、 昆虫細胞、 植物細胞など） に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて組換型抗体を調 製す る こ と ができ る （ P. J. Delves. , ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES. , 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean. , Monoc lonal Ant ibod ies. , 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J. W. Goding. , Monoc lonal Ant ibod ies :princ iples and pract ice. , 1993 ACADEMIC PRESS) 。 さらに、 トラ ンスジエニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込 まれたトランスジエニックなゥシ、 ャギ、 ヒッジ又はブタを作製し、 そのトラン スジエニック動物のミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体 を大量に取得することも可能である。 ハイプリドーマをインビトロで培養する場 合には、 培養する細胞種の特性、 試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合 わせて、 ハイプリドーマを増殖、 維持及び保存させ、 培養上清中にモノクローナ ル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地又は既知の基本培地か ら誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
産生されたモノクローナル抗体は、 当該分野において周知の方法、 例えばプロ ティン Aカラムによるクロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎 水クロマトグラフィー、硫安塩析法、 ゲル濾過、 ァフィ二テイク口マトグラフィ 一等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
上記の方法で作製された本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、治療用 薬剤とコンジユゲー卜することによって、 ミサイル療法等の治療目的に使用可能 な複合体を形成できる。 抗体へ結合させる治療用薬剤の例としては、 以下のもの に限定されないが、 ョード （131Iodine : 131I, Iodine 1251)、 イ ッ ト リ ウム (90Yt trium:90Y) 、 イ ン ジ ウ ム ^！！ ：出 ） 、 テ ク ネ チ ウ ム (99mTechnet ium:99mTc) 等 の 放 射 核 種 （ L W. Goding.， Monoclonal Ant ibodies :principles and pract ice. , 1993 ACADEMIC PRESS) 、 緑膿菌毒素
(Pseudomonas exotoxin) 、 ジフテリアトキシン (diphtheria toxin) 、 リシン (Ricin)のような細菌毒素、 及びメトトレキセート （Methotrexate) 、 マイ卜マ イシン （mi tomycin) 、 カリキアマイシン （Cal icheamicin) などの化学療法剤
( D. J. King. , Appl icat ions and Engineering of Monoclonal Ant ibodies. , 1998 T. J. Internat ional Ltd > M. L. Grossbard. , Monoclonal Ant ibody-Based Therapy of Cancer. , 1998 Marcel Dekker Inc) 等が挙げられ、 より好ましくは、 抗体との結合によりプロドラッグ化できるメイタンシノイド （Maytans inoid) 等 がよい (Chari et al. , Cancer Res. , 1992 Vol52 : 127, Liu et al.， Proc Nat l Acad Sc i USA. , 1996 Vol93 : 8681) 。 抗体と治療用薬剤の結合は共有又は非共有 結合 （例えばイオン結合） のいずれでもよい。 例えば、 抗体分子中の反応性基
(例えばアミノ基、 力ルポキシル基、水酸基等） 又は配位性基を利用し、 必要に 応じてより反応性の基を結合するか又は反応性の基に変換した後、 該反応性基と 反応して結合を形成しうる官能基 （細菌毒素、 化学療法剤の場合） 又は該配位性 基との間で錯体を形成しうるイオン性基 （放射性核種の場合） をもつ治療用薬剤 . と抗体とを接触させることによって、本発明の複合体を得ることができる。 ある いは複合体の形成に際してピオチン-アビジン系の利用も可能であろう。 また、 治療用薬剤がタンパク質又はペプチドである場合は、 遺伝子工学的手法により抗 体と前記タンパク質又はペプチドとの融合タンパク質として生産することも可能 である。
さらに具体的には、 下記のようにしてメイ夕ンシノイド （Maytans inoid) 化合 物結合抗体を作製できる（Chari et aL， Cancer Res. , 1992 Vol52 : 127, U. S. Patent 5, 208, 020) 0 メイタンシン又は ansami toc in P - 3を、 水素化リチウムアル ミニゥムにて還元し、 メイタンシノールを調製する。 調製されたメイタンシノ ールを、 ジシクロへキシルカルポジイミド、 塩化亜鉛存在下にて、 N-メチル -N- (メチルジチォプロパノィル） - L-ァラニンとエステル化後、 シリ力ゲルカラム等 で精製し、 メイタンシン誘導体 （May-SS_Me) を調製する。 抗体を N-スクシンィ ミジル- 3- (2-ピリジルチオ）プロピオン酸等又はスクシンィミジル- 4- (N-マレイ ミドメチル）シクロへキサン- 1-カルボン酸等と反応させ、 抗体にそれぞれジチォ ピリジル基又はマレイミド基を導入する。 May- SS- Meをジチオトレイトール等で 還元し調製した May- SHを、 ジチォピリジル基又はマレイミド基を導入した抗体と 反応させ、 メイタンシノイド化合物結合抗体を作製できる。 また、 本発明の抗ヒト BST2抗体、 あるいは上記治療用薬剤と結合した抗ヒ卜 BST 2抗体を含有する医薬組成物もまた本発明の範囲内に含まれる。 該組成物に は治療上有効量の治療用薬剤が含まれているべきであり、 経口、非経口投与用の 種々の形態に製剤化される。 ここで、治療上有効量とは、 所与の症状や投与計画 について治療効果を与える量をいう。 本発明の組成物は、 抗体に加えて、 生理学 的に許容され得る製剤上の添加物、 例えば希釈剤、 保存剤、 可溶化剤、 乳化剤、 アジュバント、 酸化防止剤、 等張化剤、 付形剤及び担体のうち 1種又は複数を含 むことができる。 また、 他の抗体又は抗生物質のような他の薬剤との混合物とす ることもできる。 適切な担体には、 生理的食塩水、 リン酸緩衝生理食塩水、 リン 酸緩衝生理食塩水グルコース液、 及び緩衝生理食塩水が含まれるが、 これらに限 定されるものではない。 さらに当該分野において周知であるアミノ酸、 糖類、界 面活性剤等の安定化剤、 表面への吸着防止剤を含んでいてもよい。 製剤の形態と しては、 凍結乾燥製剤 （この場合上記のような緩衝水溶液を添加することにより 再構成して使用可能である。 ） 、 徐放製剤、 腸溶性製剤、注射剤又は点滴剤など を含む製剤を、治療目的、治療計画に応じて選択可能である。 投与経路は、 経口経路、 並びに静脈内、 筋肉内、 皮下及び腹腔内の注射又は配 薬を含む非経腸的経路が考えられるが、 動物を用いた試験により最適の経路が選 択される。 あるいは、患者の患部に直接本発明の組成物を接触させる方法も可能 であろう。 投与量は、 動物を用いた試験、 臨床試験の実施により適宜決定される が、 一般に患者の状態若しくは重篤度、 年齢、体重、 性別などが考慮されるべき である。
本発明の抗体又は医薬組成物は、 BST2を発現している細胞に起因する可能性を 有する種々の疾患又は症状の治療又は予防への適用が可能である。 その疾患又は 症状としては、 多発性骨髄腫等のリンパ球性腫瘍、 リウマチなどが挙げられる。 リウマチの場合、自己抗体産生細胞、 すなわち BST2を発現している形質細胞 （プ ラズマ B細胞） に対して本発明の医薬組成物を選択的に作用させることができる。 また、 本発明のヒトモノクローナル抗体は、 原発性の局所癌に罹患している患者 の延命にも適用可能である。 図面の簡単な説明
図 1は、 抗ヒト BST2抗体の RPMI8226細胞株に対する反応性を示す図である。 図 2は、 抗ヒト BST2抗体 （7-90G) のインターナリゼーシヨン誘導活性を示す図 である。
図 3は、 37 培養 15分後の RPMI8226細胞内に内在化する抗 BST2抗体を示す顕微 鏡写真である。
図 4は、 完全長ヒト BST2DNAの塩基配列を示す図である。
図 5は、 完全長ヒト BST2のアミノ酸配列を示す図である。
図 6は、 合成したメイタンシン化合物の 500腿 z 1H NMRを示す図である。
図 7は、 メイタンシン結合 b- 76- 8抗体のヒト骨髄腫マウスモデルに対する抗腫 瘍効果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明がその実施例に 記載される態様のみに限定されるものではない。 (実施例 1 ) ヒ卜 BST2発現べクタ一の調製
完全長ヒト BST2 DNA (配列番号 1 ) を、 その 5 ' 末端に Not I配列を、 その 3 ' 末端に Xba Iと終結コドンを付加するためにポリメラ一ゼ連鎖反応（PCR)によ り修飾した。 プライマー 5 ' -AAGGAAAAAAGCGGCCGCGTGGAATTCATGGCATCTAC-3 ' (配 列番号 3 ) 及び 5 ' -CTAGTCTAGATCATCACTGCAGCAGAGCGCTGAGG-3 ' (配列番号 4 ) を使用し、 K0D- Plus- (東洋紡社製） DNAポリメラーゼ及びヒ ト骨髄由来 PolyA+RNA (Clontecli社製) から Superscript I I (Gibco- BRL社製)で合成した cDNA (約 20ng) を錶型として、 94°C、 15秒； 50° (、 30秒；及び 68° (：、 1分間 、 30サイ クルの PCR反応を行った。 修飾された BST2配列を、 Not I-Xba I断片として単離し、 そして同一酵素で開裂されていた pTracer_CMV (Invi trogen社製） ベクターにラ ィゲートした。 得られたプラスミドを pTracer- CMV/hBST2と命名した。
(実施例 2 ) 可溶型ヒ卜 BST2発現べクタ一の調製
可溶型 BST2タンパク質をバキュロウィルスを用いた発現系にて以下の方法にて 調製した。 54- 180のアミノ酸配列を持つ BST2部分ペプチド（配列番号 2のァミノ 酸番号 54〜180)の N末端に FLAG (N末端— DYKDDDDK— C末端、 Brizzard et al. , Biotechni ues (1994) 16 : 730) (FLAG-sBST2) 、 N末端に FLAG及び C末端にダル 夕チオン— S—トランスフェラ一ゼ （GST、 Smi th et al. , Gene (1988) 67 : 31) (FLAG-SBST2-GST)を付けた 2種類の可溶型 BST2発現プラスミ ドを作製した。 FLAG-SBST2ベクタ一は、 5 ' 末端に分泌シグナル配列、 FLAGコドンを付加するた めに 5 ' 末端 Bgl ll配列、 3 ' 末端 BamHI E列からなる下記の DNA配列 5 ' -
CGAGACTACAAGGATGACGATGACAAGGGATCC-3 ' (配列番号 5 ) の cDNAを合成した (Signal- Flag断片） 。 5 ' 末端 BamHI配列、 sBST2領域、 終結コドン、 3 ' 末端 に Not I 配 列 を 付 加 す る た め 、 プ ラ イ マ ー 5' _ CGAGGATCCCATATGCGGGACGGCCTTCGGGC-3' ( 配 列 番 号 6 ) 及 び 5' _ AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCACTGCAGCAGAGCGCTGAGG-3' (配列番号 7 ) を使用して PCRに より修飾した。 PCRを、 EX- TaQポリメラーゼ （宝酒造株式会社） 及び約 20ngのヒ ト脾臓由来 1st s trand DNA (Clontecli社製） を使用して、 35サイクルの、 94°C、 30秒； 56°C、 30秒；及び 72で、 1分間をもって反応させた。 修飾された BST2配列 を、 BamHI - Notl断片として単離した。 そして SI a卜 Flag断片と BamHI- Notl断片 を Bglllと Notl酵素で開裂した pFastBacl (GIBC0社製） ベクターにライゲートし た。 得られたプラスミドを pFastBacl/FBST2と命名した。
同様に FLAG- SBST2- GSTは、 5 ' 末端に BamHI配列を、 3， 末端に Not I配列を付 加するため、 プライマ一 5'_CGAGGATCCCATATGCGGGACGGCCTTCGGGC- 3' (配列番号 6) 及び 5'_AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTGCAGCAGAGCGCTGAGG_3' (配列番号 7 ) を使用 して PCRにより修飾した。 PCRは、 EX- Taciポリメラーゼ （宝酒造株式会社） 及び 20ngの pFastBacl/FBS を使用して、 30サイクルの、 94°C、 30秒； 56°C、 30秒； 及び 72°C、 1分間をもって反応させた。 修飾された BST2配列を、 BamHI- Notl断片 として単離した。 また、 GSTと終結コドン配列を付加するため、 5 ' 末端に Notl 配列を、 3 ' 末端に Κρη I配列を付加する ため、 プライ マー 5' - AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGG-3' (配列番号 8) 及び 5'- CGGGGTACCTCAATCCGATTTTGGAGGATGGTCGCC - 3' (配列番号 9) を使用して PCRにより修飾した。 PCRは、 EX- TaQポリメラーゼ （宝酒造株式会 社） 及び 20ngの pGEXプラスミド （Amersham Pharmacia Biotech社製） を使用し て、 30サイクルの、 94°C、 30秒； 56 、 30秒；及び 72°C、 1分間をもって反応さ せた。 修飾された GST配列を Notl-Kpnl断片として単離し、 前述の BamHI- Notl断片 と Notl- Kpnl断片を、 BamHI- Kpnlで開裂した pFastBacl/FBST2ベクターにライゲ 一卜した。 得られたプラスミドを pFastBacl/FBST2/GSTと命名した。
(実施例 3) 組換体発現ウィルスの調製
組換体ウィルスの作製は実施例 2で作製された発現ベクターと GIBC0B.RL社製 BAC-T0-BAC Baculovirus Expression Systemを用いてマニュアルの方法にて行つ た。 得られた組換体バキュロウィルスは、 3xl06個の Sf9細胞 （Invitrogen社製） 5mlに組換体バキュロウィルス含有上清を 0.3ml添加し、 フラスコ （T-Flask 25 cm2, CORNING社製） で 4日間、 27 で培養後、 培養上清を回収し、 組換体バキュ ロウィルスの増幅を行った。 目的のウィルス量が得られるまで同様な操作を行つ た。 (実施例 4 ) 可溶型ヒ卜 BST2の発現
可溶型 BST2の大量発現は、 800mlの HiF ive™細胞 (lxlOVml, Invi t rogen社製) に実施例 3で作製された 80mlのウィルスを加え、 27°Cで 60時間培養し、 培養上清 を回収した。 回収した上清は、 遠心後、 0. の PESフィルター （CORNING社製） に供し、 細胞等の雑排物を除去した。
(実施例 5 ) 可溶型ヒト BST2の精製
実施例 4で作製された培養上清からの可溶型 BST2 (FLAG-SBST2, FLAG-SBST2- GST)の精製は以下の方法で行った。 可溶型 BST2を含む培養上清を FLAG M2ァフィ 二ティ カラム （SIGMA社製） を用い、 付属の説明書に従い吸着緩衝液として PBS (-）、 溶出緩衝液として 0. 1 M グリシン-塩酸緩衝液 （pH 3) を用いてァフィ 二ティ一精製した。 溶出画分は 1 M Tri s-HCl (pH 8. 0) を添加して pH7. 2 付近に 調整した。 調製された抗体溶液は、 透析膜 （ 10000カ ッ ト， Spect rum Laboratories社製） を用いて PBS (-)に置換し、 孔径 0. のメンブランフィル ター MILLEX- GV (MILLIP0RE 製） でろ過滅菌し、 SDS/PAGE電気泳動で単一バンド の精製 FLAG- sBST2， FLAG_sBST2- GSTを得た。
(実施例 6 ) ヒ卜抗体産生マウスの作製
免疫に用いたマウスは、 内因性 Ig重鎖破壌及び/ c軽鎖破壊の両者についてホモ 接合体の遺伝的背景を有しており、 かつヒト Ig重鎖遺伝子座を含む 1 4番染色体 断片 （SC20) ) 及びヒト Ig /c鎖トランスジーン （KCo5) を同時に保持する。 この マウスは、 ヒト Ig重鎖遺伝子座を持つ系統 （系統 A) のマウスと、 ヒト Ig /c鎖ト ランスジーンを持つ系統 （系統 のマウスとの交配により作製した。 系統 Aは、 内因性 Ig重鎖及び κ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、 子孫伝達可能な 1 4番染色体断片（SC20)を保持するマウス系統であり、 例えば富塚らの報告 (Tomizuka. et al.， Pro Nat l. Acad. Sc i. USA. , 2000 Vol97 : 722) に記載 されている。 また、 系統 Bは、 内因性 Ig重鎖及び κ軽鎖破壊の両者についてホモ 接合体であり、 ヒト Ig K鎖トランスジーン （KCo5) を保持するマウス系統であり、 例えば F ishwi ldらの報告 (Nat. B iotechnol. , 1996 Vol l4 : 845) に記載されてい る。 系統 Aの雄マウスと系統 Bの雌マウス、 あるいは系統 Aの雌マウスと系統 Bの雄 マウスの交配により得られた、 血清中にヒト I g重鎖及び κ軽鎖が同時に検出さ れる固体 （I shida & Lonberg, IBC s 11 th Ant ibody Engineer ing, Abs t rac t 2000)を以下の免疫実験に用いた。 なお、 前記ヒト抗体産生マウスは、 契約を結 ぶことによって、 麒麟麦酒株式会社より入手可能である。
(実施例 7 ) ヒ卜 B S T 2に対するヒ卜モノクローナル抗体の調製
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、 単クローン抗体実験操作入門 (安東民衛ら著作、 講談社発行 1991) 等に記載されるような一般的方法に従つ て調製した。 免疫原としてのヒ ト BST2は、 実施例 1で調製した pTracer - CMV/hBST2ベクターと実施例 5で調製した FLAG- SBST2を用いた。 被免疫動物は、 実施例 6で作製したヒ卜免疫グロプリンを産生するヒト抗体産生マウスを用いた。 ヒト抗体産生マウスに、 実施例 1で作製した pTracer- CMV/hBST2ベクター （10 g /匹） を Trans IT™ In Vivo Gene De l ivery Sys tem試薬 （宝酒造株式会社 製） を用いて導入，発現することにより初回免疫した。 初回免疫から同ベクター を 1週間毎に 3回導入 ·発現し追加免疫した。 さらに、 実施例 5で作製した FLAG-SBST2 (10 M g )を尾静脈内注射により追加免疫し、 さらに以下に述べる脾 臓細胞の取得 3日前に FLAG- SBST2 (10 /2 g )を同様にして免疫した。
免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得し、 回収した脾臓細胞をマウスミエ ローマ SP2/0 (ATCC No. ： CRL1581) と 5 ： 1で混合し、 融合剤としてポリェチレ ングリコール 1500 (Boehringer Mannhe im社製） を用いて細胞融合させることに より多数のハイプリドーマを作製した。 ハイプリドーマの選択は、 10%のゥシ胎 児血清 （Fetal Cal f Serum, F C S ) とヒポキサンチン（H)、 アミノプテリン（A)、 チミジン （T ) を含有する HAT含有 DMEM培地 （Gibco BRL社製） 中で培養すること により行った。 さらに、 HT含有 DMEM培地を用いて限界希釈法によりシングルクロ ーンにした。 培養は、 96- we l l マイクロタイタープレート （べクトンディツキン ソン社製） 中で行った。 抗ヒト ヒトモノクローナル抗体を産生するハイプ リドーマクローンの選択 （スクリーニング） 及び各々のハイプリドーマが産生す るヒトモノクローナル抗体の特徴付けは、 後述する酵素標識免疫吸着アツセィ (ELISA)及び蛍光活性化セルソ一夕一（FACS)により測定することにより行つた。 ヒトモノクローナル抗体産生ハイプリドーマの ELISAによるスクリーニングは、 以下に述べる 3種類の ELISA及び FACS解析により、 ヒト免疫グロブリンァ鎖 Qilg r ) 及びヒト免疫グロブリン軽鎖 κを有し、 かつヒト hBST2に特異的な反応性を 有するヒトモノクローナル抗体を産生する多数のハイプリドーマを得た。 なお、 本実施例を含め以下のいずれの実施例中、 並びに実施例における試験結果として 示した表又は図中においては、 各々の本発明のヒト抗ヒト hBST2モノクローナル 抗体を産生するハイプリドーマクローンは記号を用いて命名した。 以下のハイブ リドーマクローンはシングルクローンを表わす： 2- 1L, 2-20J, 5-71, 5-85H, 7- 90G、 8-190、 b- 76- 8又は 9-16- 1。
それらの内 4つのハイプリ ドーマクローン 5- 71、 7 - 90G、 9 - 16 - 1及び b-76 - 8を、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば 市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) にブダペスト条約の規定下で国際寄託した。 八 イブリ ドーマクローン 5- 71及び 7- 90Gは各々受託番号 FERM BP- 7417、 FE M BP- 7418であり （平成 12年 12月 26日付） 、 ハイプリドーマクローン 9-16 - 1及び b - 76-8 は各々受託番号 FERM BP- 7821及び FERM BP- 7822である （平成 13年 12月 7日付） 。
(実施例 8 ) ヒト免疫グロプリン τ鎖を有するモノクローナル抗体の検出 実施例 5で作製した FLAG- SBST2- GST ( 1 g/ml 50mMNa2HCO3> ゥエル） を、 ELISA用 96穴マイクロプレート （Maxi sorp、 Nunc社製） の各ゥエルに加え、 室温で 30分ィンキュベー卜し、 FLAG- SBST2- GSTをマイクロプレートに吸着させた。 次いで、 上清を捨て、 各ゥエルにブロッキング試薬 （SuperBlock™ Blocking Buf fer, PIERCE社製） を加え室温で 10分間インキュベートし、 FLAG- sBST2- GSTが 結合していない部位をブロックした。 このようにして、 各ゥエルを FLAG-SBST2 - GSTでコ一ティングしたマイクロプレートを作製した。
各ゥエルに、 各々の八イブリドーマの培養上清 （50 1) を加え、 室温下で 30 分反応させた後、 各ゥエルを、 0. l%Tween20含有リン酸緩衝液 （PBS- T) で 2回洗 浄した。 次いで、 過酸化酵素で標識されたャギ抗ヒ 卜 IgGF (ab' ) 2抗体 (Biosource Internat ional社製） を 10%プロックエース （大日本製薬株式会社 製）含有 PBS - Tで 2, 000倍に希釈した溶液 （50 1/ゥエル） を、 各ゥエルに加え、 室温下 30分インキュベートした。 マイクロプレートを、 PBS-Tで 3回洗浄後、 発色 基質液 （TMB) 、 100 1/ゥエル、 DAK0社製） を各ゥエルに加え、 室温下で 20分 間インキュベートした。 各ゥエルに、 2M硫酸 （50 l/ゥエル） を加え、 反応を 止めた。 波長 450M1 (参照波長 570mn) での吸光度をマイクロプレートリーダー (ΜΤΡ- 300,コロナ電気社製） で測定した。 その結果、 300クローン以上の抗ヒト BST2抗体が取得できた。 その一部を表 1に示す。
(実施例 9 ) ヒ卜免疫グロプリン軽鎖 κ (IgL /c ) を有するモノクローナル抗体 の検出
実施例 5で作製した FLAG-SBST2- GST ( 1 i /ml 50mMNa2HCO3, 50 1/ゥエル） を、 ELISA用 96穴マイクロプレート （Maxi soriK Nunc社製） の各ゥエルに加え、 室温で 30分ィンキュベートし、 FLAG- SBST2- GSTをマイクロプレートに吸着させた。 次いで、 上清を捨て、 各ゥエルにブロッキング試薬 （SuperB lock™ Bl ocking Buf fer, PIERCE社製） を加え室温で 10分間インキュベートした。 各ゥエルを、 PBS- Tで 2回洗浄した。 FLAG-SBST2- GSTをコーティングしたマイクロプレートの 各ゥエルに、 各々のハイプリドーマの培養上清 （50 ^ 1) を加え、 30分反応させ た後、 各ゥエルを、 PBS- Tで 2回洗浄した。 次いで、 各ゥエルに、 過酸化酵素で標 識したャギ抗ヒ ト Ig κ抗体 （2， 000倍希釈、 50 1 /ゥエル、 Biosource Internat ional社製） を加え、 室温下で 30分間インキュベートした。 PBS- Tで 3回 洗浄後、 基質緩衝液 （TMB、 100 1Zゥエル、 DAK0社製） を各ゥエルに加え、 室 温下で 20分間インキュベートした。 次いで、 2M硫酸 （50 2 1) を各ゥエルに加え、 反応を止めた。 波長 450nm (参照波長 570nm) での吸光度をマイクロプレートリ一 ダー （MTP- 300,コロナ電気社製） で測定した。 その結果を表 1に示す。
表 1
クローン サフクラス FLAG-SBST2-GST
EL I S A
Figure imgf000022_0001
2 20 J I gG 1 (K) 0. 637
5 7 I I gG 1 (K) 0 536
5 85H I gGl (K) 0 552
6 26H I gG4 (K) 1 040
7 90 G I gG 1 (K) 0 325
8 19 O I gG 1 (K) 0 515
b 76-8 I gG 1 (K) 0 823
9 16- 1 I gG4 (K) 0 7 1
Control I gG 1 (K) 0 014
Control I gG4 (K) 0 013
(実施例 1 0) 各モノクローナル抗体のサブクラス同定
実施例 5で作製した FLAG- SBST2 - GST (l 2 g/ml 50mMNa2HC03, 50 / l/ゥェル） を、 ELISA用 96穴マイクロプレート （Maxisorp、 Nunc社製） の各ゥエルに加え、 室温で 30分ィンキュペートし、 FLAG-SBST2- GSTをマイクロプレートに吸着させた。 次いで、 上清を捨て、 各ゥエルにブロッキング試薬 （SuperBlock™ Blocking Buffer, PIERCE社製） を加え室温で 10分間インキュベートした。 各ゥエルを、 PBS- Tで 2回洗浄した。 FLAG- SBST2- GSTをコーティングしたマイクロプレートの 各ゥエルに、 各々のハイプリドーマの培養上清 （50 1) を加え、 30分反応させ た後、 各ゥエルを、 PBS- Tで 2回 洗浄した。 次いで、 各ゥエルに、 それぞれ過酸 化酵素で標識したヒッジ抗ヒト IgGl抗体、 ヒッジ抗ヒト IgG2抗体、 ヒッジ抗ヒト IgG3抗体又はヒッジ抗ヒ卜 IgG4抗体 （各 2, 000倍希釈、 50 1/ゥエル、 The Binding Site社製） を加え、 室温下で 30分間インキュベートした。 PBS- Tで 3 回洗浄後、 基質緩衝液 （TMB、 ウエル、 DAK0社製） を各ゥエルに加え、 室温下で 20分間インキュベートした。 次いで、 2M硫酸 （50/il) を各ゥエルに加 え、 反応を止めた。 波長 450nm (参照波長 570iim) での吸光度をマイクロプレート リーダ一 （MTP- 300,コロナ電気社製） で測定した。 その結果を表 1に示した。 (実施例 1 1 ) hBST2発現細胞に対する各モノクローナル抗体の反応試験
BST2が発現していると報告されている骨髄腫由来細胞株 RPMI8226 (ATCC CCL-
155, Goto et al.， Blood. , 1994 Vol84:1922; Ohtomo et al. , Biochem Biophys Res Commun. , 1999 Vol 258:583) に対する各モノクローナル抗体の反 応性の検討を FACS解析で行った。 2xl06/mlの濃度で RPMI8226細胞株を 1%ゥサ ギ血清入り、 0.1漏 3、 2%FCS含有 PBSの Staining Buffer (SB) に浮遊させた。 細胞浮遊液 （100 lZゥエル） を 96 - well 丸底プレート （べクトンディツキンソ ン社製） に分注した。 各々のハイプリドーマの培養上清 を加え、 氷温 下 30分間インキュベートした。 陰性コントロールは各サブクラスに応じ、 ヒト IgGl抗体 （シグマ社製） 又はヒト IgG4抗体 （シグマ社製） を用い、 ハイプリ ドー マ培養培地で 2 /1111の濃度に調製し、 50/zl添加後氷温下 30分間インキュベート した。 SBで 2回洗浄した後、 0.0125 mg/mlの RPE蛍光標識ゥサギ抗ヒト IgL/ F (ab' ) 2抗体（DAK0社製） 30 1 を加え、 氷温下 30分間インキュベートした。 SBで 2回洗浄した後、 300 lの FACS緩衝液に懸濁し、 FACS (FACScan, べクトンディ ッキンソン社製） で各細胞の平均蛍光強度を測定した。 その結果、 何れの抗体も RPMI8226細胞株に強い結合活性を有する抗体であることがわかった （図 1) 。
(実施例 1 2) 各抗体の調製
抗 BST2抗体を含む培養上清の調製は以下の方法にて行った。 抗 BST2抗体産生ハ イブリドーマをゥシインシュリン （5 g/ml、 Gibco BRL社製） 、 ヒトトランスフ エリン （5 g/ml、 Gibco BRL社製） 、 エタノールァミン （0.01mM、 シグマ社製） 、 亜セレン酸ナトリウム （2.5x10— 5 πιΜ、 シグマ社製） 含有 eRDF培地 （極東製薬社 製） に馴化した。 スピナ一フラスコにて培養し、 ハイプリ ドーマの生細胞率が 90%になった時点で培養上清を回収した。 回収した上清は、 lO/zm と 0.2 ΠΙのフ ィルター (ゲルマンサイエンス社製) に供し、 ハイプリ ドーマ等の雑排物を除去 した。
上記培養上清からの抗 BST2抗体の精製は以下の方法で行った。 抗 BST2抗体を含 む培養上清を Hyper D Protein Α カラム （日本ガイシ製） を用い、 付属の説明書 に従い吸着緩衝液として PBS (-)、 溶出緩衝液として 0.1 M クェン酸ナトリウム緩 衝液 （pH 3) を用いてァフイエティー精製した。 溶出画分は 1 MTris_HCl ( H 8. 0) を添加して pH7. 2 付近に調整した。 調製された抗体溶液は、 透析膜 カット、 Spec t rum Laboratories社製） を用いて PBS (-)に置換し、 孔径 0. 22 x m のメンブランフィルタ一 MILLEX-GV (MILLIPORE 製） でろ過滅菌し、 精製抗 BST2 抗体を得た。 精製抗体の濃度は 280 MIの吸光度を測定し、 1 mg/ml を 1. 45 0D と して算出した。
(実施例 1 3 ) 抗 BST2抗体の蛍光標識
抗 BST2抗体の蛍光標識化は以下の方法で行った。 Al exa Fluor™488 (Molecul ar Probes社製） を付属の説明書に従い、 実施例 1 2で調製した抗 BST2 抗体に結合させた。 2mg/mlの抗 BST2抗体 0. 5mlに 50 1の 1M炭酸緩衝液を添加後、 Alexa FluorTM488と混合し、 撹拌しながら室温 1時間反応させた。 ヒドロキシル アミンを添加し反応を止め、 ゲルろ過カラム （NAP5、 Amersham Pharmac ia Biotech社製） に混合液を供し、 抗体に未結合の Alexa FluorTM488を除去した。 この条件で抗体 1分子に 6つの蛍光物質が結合した。 蛍光標識された抗体は RPMI8226に結合し、 その結合活性は標識されていない抗体と同等であった。
(実施例 1 4 ) 各抗 B S T 2抗体の交叉反応性
各モノクローナル抗体のマウス及びァカゲザルの血液細胞への交叉反応性を FACS解析で調べた。 lmLへパリン （Novo社製） 入りヒト末梢血 10 mL、 あるいはァ 力ゲザル末梢血 lOmLを 10mLの PBS (-)で 2倍に希釈し、 20mLの Fico l卜 Panue PLUS液 (Amersham Pharmacia Biotech社製）上に重層した。 1500 r. p. m.で 30分間遠心後、 単核球画分を回収し PBS (-）で 2回洗浄した。 マウスの血液細胞は、 以下のように 調製した。 EDTAコートした試験管に、 眼窩採血により末梢血 を採取した。 さらに滅菌水を 300 /x L添加後すぐに 2xの PBS (-）を 300 z L添加し、 PBS (-）で 2回洗 浄した。 調製された各細胞は 1%ヒ ト血清入り、 0. l¾NaN3、 2%FCS含有 PBSの Staining Buf fer (SB) に 2xl0Vmlの濃度で浮遊させた。 細胞浮遊液 （100 x l Z ゥエル） を 96- we l l 丸底プレート （べクトンディッキンソン社製） に分注した。 実施例 13で作製された各々の Alexa標識抗体を 5 g/mLの濃度で氷温下 30分間ィン キュペートした。 SBで 2回洗浄した後、 1の FACS緩衝液に懸濁し、 FACS (FACScan, べクトンディッキンソン社製） で各抗体の反応性を調べた。 その結 果、 いずれの抗体もヒト末梢血細胞に結合したが、 マウス末梢血細胞に反応しな かった。 一方、 b- 76-8及び 9-16- 1は、 ヒト末梢血細胞だけでなくァカゲザルの末 梢血細胞にも同様に結合できた。
(実施例 1 5 ) BST2インタ一ナリゼーシヨン誘導活性評価
抗体による抗原インターナリゼーシヨン誘導活性は、 Andrzejら （L I舰 uno l.
2000 Vol 165 : 6037) の方法に従い以下の方法にて行った。 2xl06/mlの濃度で RPMI8226株を氷冷 10% 牛胎児血清 （FCS) 、 1%ゥサギ血清含有 RPMI培地に浮遊さ せ、 細胞浮遊液 （100 // 1 /ゥエル） を 96- wel l 丸底プレート （べクトンディツキ ンソン社製） に分注した。 実施例 13で作製された Alexa FluorTM488標識抗 BST2抗 体を氷冷 10% FCS含有 RPMI培地 （GIBC0BRL社製） で 700ng/mlの濃度に調製し、 各 ゥエルに 100 i l 分注後、 氷上で 30分間反応させた。 氷冷 10% FCS含有 RPMI培地で 4回洗浄することにより、 結合されていない Mexa Fluor™488標識抗 BST2抗体を 細胞から除去した。 37°Cに温めた 10% FCS含有 RPMI培地に再懸濁後 37°Cで培養し、 培養 0， 15, 30, 60, 120分間後にインターナリゼーシヨンを停止させるために氷 冷 SBで 2回洗浄した。 細胞表面上の hBST2と結合している抗体を検出するため、 0. 0125 mg/ml の RPE蛍光標識ゥサギ抗ヒト IgL κ F (ab' ) 2抗体（DAK0社製） 30 /2 1を 加え、 氷温化 30分間インキュベートした。 SBで 2回洗浄した後、 の FACS緩 衝液に懸濁し、 FACScan (べクトンディッキンソン社製) で各細胞の平均蛍光強 度を測定した。 バックグラウンドレベルの設定は、 コントロールとして Alexa Flour™ 488標識 IgGl κ抗体と RPMI8226株を用いて前述の処理を行った試料の 37°C培養開始時の平均蛍光強度を、 Alexaでは 3〜 5、 RPEでは 6〜 8を示すよう に感度を設定することにより行った。 その結果を図 2に示す。 Alexa Fluor™488 の平均蛍光強度は 3rcで培養しても低下することは無かったが、 細胞表面上の BST2/抗 BST2抗体免疫複合体の存在量を示す RPE蛍光物質の平均蛍光強度は、 37°C の培養時間の経過と共に低下し、 培養 15分で RPE蛍光物質の平均蛍光強度は、 50% 以下に低下し、 抗 BST2抗体 （7- 90G) は、 効率良く BST2のインターナリゼーショ ンを誘導する抗体であった。 また、 蛍光検鏡法によりインターナリゼーシヨンの 様子を観察した （図 3 ) 。 インターナリゼーシヨン開始 15分後には、 キヤッピン グ形成が観察され、 RPE蛍光物質は細胞表面染色のみ観察されたが、 Alexa FluorTM488蛍光物質は、 細胞表面上だけでなく、 膜に隣接した領域内にインター ナライズされた状態でも見られ、 また、 膜内周囲に散在した細かい点が、 ゴルジ 装置であると考えられる位置の顆粒群にも存在した。 さらに以上の特徴は、 抗体 が治療用薬剤等で標識されても BST2を細胞内にインターナライズする能力を損な うことなく、 治療用薬剤を細胞内に効率良く暴露できる可能性が高いことを強く 示唆する。 他の抗 BST2抗体も同様な活性が観察された。
(実施例〗 6 ) チオール基導入メイタンシンの作製
本実施例におけるメイタンシンへのチオール基導入は、 Chari らの方法 (Cancer Res. , 1992 Vol 52 : 127) や U. S. Patent 5， 208, 020に記載されるよう な方法を参考にし行った。
すなわち 20mgの ansami toc in P-3 (和光純薬工業社製） を 4mlの THFに溶解し、 -23°Cに冷却しつつ 33mg水素化リチウムアルミニウム （10当量） にて 5時間還元 した。 反応液を 20mlの 10mMリン酸バッファ一 （pH6. 5) に溶解後、 当量の酢酸ェ チルで 2度抽出した。 酢酸ェチル層を濃縮乾固後、 シリカゲルカラム (CH2C 12 :MeOH=20 : l)で精製し、 11. 8mgのメイタンシノールを調製した。
参考文献に従い別法にて調製された 26mg の N-メチル -N- (メチルジチォプロパ ノィル）- L-ァラニンを 3mlの CH2C 12に溶解し、 ここに 30mgのジシクロへキシルカ ルポジイミド（2当量）、 1 M塩化亜鉛 20 1 (1当量）を添加して室温で 30分撹拌 した。 しかし、 この条件では反応が進まなかったため、 1 M塩化亜鉛の添加量を mn \ (5当量） に変え室温で 30分撹拌した。 ここに 11. 8mgのメイタンシノール を l mlの CH2C12に溶解して添加し、 エステル化反応を行った。 3時間後反応液を 濃縮乾固し、 主生成物を分取 TLC (CH2C12 :MeOH-10 : l) 、 続いて分取 HPLC (ODS力 ラム、 展開溶媒 60% CH3CN)を用いて精製した。 結果、 2. 5mgのメイタンシン誘導 体 （May_SS- Me体） を得た。 得られた May- SS- Me体の 500匪 z 1H NMRを図 6に示す。 実施例 1 9に記載されているヒト骨髄腫細胞株 IM9の細胞障害活性試験で、 得ら れた May- SS-Me体の IC5。は ΙΟηΜであり、 ansami tocin. P- 3の 1 0 0 0分の 1以下の 活性であった。 得られた May- SS - Me体 2.5mgを 0.46mlエタノール + 0.32ml 0.1Mリン酸バッファ 一 (pH7.5, ImM EDTA含有） 溶液に溶解後、 ここに lOOmMのジチオスレィ トール 80ul (1.5当量） を加え、 窒素ガス存在下 4°Cで 4時間還元した。 この結果得ら れた還元化合物（May_SH)は、 60%ァセトニトリルで平衡化した 0DSカラムで精製 した （最終収量 2. Omg) 。
(実施例 1 7) 抗 BST2抗体 (b-76 - 8) の PDPィ匕
本実施例における抗体へのチオール基の導入は、 N-スクシンィミジル- 3- (2-ピ リジルジチォ）プロピオネート（SPDP、 PIERCE社製）を用い、 Chari らの方法
( Cancer Res., 1992 Vol52 : 127) と新生化学実験講座 ·分子免疫学 ΠΙ (日本 生化学会編、 東京化学同人発行 1992) に記載されるような方法を参考にし調製 した。 精製抗体 b- 76- 8を、 0.1M NaClを含む 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.5) にて 2.6 mg/mLの濃度に調製した。 2.6 mg/mLの抗体溶液 5mLに 11.5mMの SPDP -エタノール液を 42.3 L滴下し、 23°Cで 40分間反応させた。 反応液を 2mM EDTA含有 0.1Mリン酸カリウム緩衝液 （PH7.0) で平衡化した SephadexTM G- 25力 ラム（NAP25TM、 Amersham Pharmacia Bio tech社製）にかけ、 未反応の SPDPを除去 した。 得られたサンプルの一部へ ImMになるようにジチオトレイトールを加え、 室温 5分間反応させた。 反応後、 遊離したピリジン- 2-チオンの 343 nmの吸光度 を測定し、 反応系に存在していた PDP基のモル濃度を定量した （ピリジン- 2-チォ ンの ε =8.08xl03) 。 その結果、 導入された PDP基は 3.4分子/抗体であった。
(実施例 1 8) メイタンシン結合 b-76—8抗体の調製
実施例 16で作製された May - SH (170 g/800 L) と実施例 17で作製された PDPィ匕 b-76-8 (10 mg/9mL) を 4°Cで 40時間反応させた。 反応液をリン酸緩衝液 (pH7.4) で平衡化した SepliadexTM G- 25カラムにかけ、 未反応の May-SHを除去 した。 得られたサンプルの一部へ ImMになるようにジチオトレイトールを加え、 室温 5分間反応させた。 反応後、 遊離したピリジン- 2-チオンの 343 nmの吸光度 を測定し、 反応系に存在していた PDP基のモル濃度を定量した。 その結果、 導入 されたメイタンシン化合物は 1.8分子/抗体であった。 0.1M になるようにシステ インを添加し、 反応液をリン酸緩衝液 （PH7.4) で平衡化した Sephadex G- 25カラ ムにかけメイタンシン結合！) -76-8抗体（May-b- 76- 8)を精製した。
(実施例 1 9 ) メイタンシン結合 b - 7 6— 8抗体の抗腫瘍活性
実施例 11と同法にてヒト骨髄腫細胞株 IM9 細胞 (ATCC CCL-159)に対する反応性を 調べた。 その結果、 May- b- 76- 8抗体は、 b- 76- 8抗体と同等の反応性を示した。 May-b- 76- 8抗体の抗腫瘍活性は、 次のように行った。 96ゥエル平底プレート （ベ クトンディッキンソン社製） の各ゥエルに 2 xl05個/ mlの IM9細胞を 100 // 1 と、 b- 76-8抗体、 May- b- 76- 8抗体、 あるいはコントロールヒト IgGlを加え、 炭酸ガス 培養器内で 24時間培養した。 その後、 MTS (3- (4, 5-d ime thyl thiazo l-2-yl) -5- (3carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulphophenyl) -2H-te t razol ium, フ ロ メ ガ社 製） 溶液を 20 1各ゥエルに添加し、 さらに 2時間培養した。 次いで、 生存して いる細胞を波長 490nmの吸光度をマイクロプレー卜リーダー （MTP-300,コロナ電 気社製） で測定した。 その結果、 IM9細胞に対しコントロールヒト IgGlと b-76 8 抗体を添加した場合、 有意な細胞障害活性は観察されなかったが、 May- b_76-8抗 体は濃度依存的な細胞障害活性が観察され、 IC5Qは ΙΟηΜ (メイタンシン濃度） /5. 5nM (抗体濃度） であった。
(実施例 2 0 ) メイタンシン結合 b - 7 6—8抗体のヒ卜骨髄腫マウスモデルに対 する抗腫瘍効果
投与抗体は、 濾過滅菌した PBS (-)を用いて 800 g/ml に調製し、 投与抗体とし た。
ヒト骨髄腫移植マウスは、 SCIDマウス （日本クレア） を用いてヒ卜骨髄腫細胞 株 IM9 細胞を、 PBS (-)で 2. 5x 107個/ ml になるように調製した。 前日に抗ァシァ 口 GM1 (和光純薬社製） 100 1 を尾静脈内投与した SCIDマウス （メス、 6週 令） （日本クレア） に上記 IM9 細胞液 200 /z l を尾静脈より注入した。 これらマ ウスに対し、 IM9細胞移植後 6日目から 10日目の間に調製した抗体をそれぞれ 200 11 1 静脈内連日投与した。
May- b-76_8抗体の抗腫瘍効果については、 マウスの生存期間で評価した。 その 結果、 図 7に示すように PBS (-)コントロール投与群とアイソタイプコントロール ヒト IgGl投与群では、 IM9細胞移植後 20日目あたりから死亡が観察され、 PBS (-） 投与群では移植後 22日目に前例死亡し、 ァイソタイプコントロ一ルヒ卜 IgGl投与 群でも同様な生存期間が観察された。 b- 76-8抗体投与群ではコントロール群と比 較して、 生存期間の延長が認められた （pく 0. 01， Logrank tes t ) 。 さらに、 b- 76 - 9- 8抗体投与群と比較して May- b-76- 8抗体投与群では、 有意な生存期間の延長 が観察された （Pく 0. 05) 。 一方、 b-76- 8抗体と May- SH ( 1. 9 nmol/sho t) を同時 に投与しても b- 76- 8投与群と比較して有意な生存期間の延長は観察されなかった ( p >0. 1) 。 以上の結果より、 May- b- 76- 8抗体がヒト骨髄腫移植マウスに対して 抗腫瘍効果を有すること、 さらに本抗体の抗腫瘍効果は b_76 - 9-8抗体単独投与よ りも強いことが示された。 この事実はインターナリゼーシヨンを有する抗 BST2抗 体にメイタンシンノィド化合物等の抗腫瘍活性のある物質を結合させることによ りさらに強い抗腫瘍効果が期待できることを示し、 画期的な骨髄腫治療薬になる ことができる。 本明細書は、 本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2000- 403245号の明 細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。 本明細書で引用した全ての刊 行物、 特許及び特許出願は、 そのまま参考として本明細書に取り入れるものとす る。 配列表フリーテキス卜
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本発明のモノクローナル抗体は、 細胞表面のヒト BST2抗原に結合し、 インター ナリゼーシヨンによって該細胞内部へ局在化しうる特徴を有しているため、 この 抗体に結合させた治療上有用な薬剤を、 BST2を細胞表面に発現する多発性骨髄腫 細胞、リンパ球系腫瘍細胞、原発性局所癌細胞などの細胞内に効率よく送達するこ とが可能になり、 治療困難な疾患の治療に対し、 新しい作用機序に基づく治療剤 を提供する利点を有する。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 細胞表面に存在するヒト BST2抗原に結合し、 該細胞へのインターナリゼ一 シヨンにより該細胞内部へ局在化しうることを特徴とするモノクローナル抗 体又はその機能的断片。
2. 前記細胞が RPMI8226株（ATCC CCL- 155)であり、 氷冷下で前記モノクローナ ル抗体を結合した後、 にて培養開始後 120分以内にインターナリゼーシ ョンが進行し、 前記細胞表面上のヒト BST2/前記モノクローナル抗体複合体 の存在量を示す蛍光物質の平均蛍光強度が、 培養開始時の 50%以下を示すも のである、 請求項 1記載のモノク口一ナル抗体又はその機能的断片。
3. 前記細胞が RPMI8226株であり、 氷冷下で前記モノクロ一ナル抗体を結合し た後、 37°Cにて培養開始後 90分以内にインターナリゼーシヨンが進行し、 前 記細胞表面上のヒ卜 BST2/前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍 光物質の平均蛍光強度が、 培養開始時の 50 %以下を示すものである、 請求項 1記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
4. 前記細胞が RPMI8226株であり、 氷冷下で前記モノクローナル抗体を結合し た後、 37°Cにて培養開始後 60分以内にインターナリゼーシヨンが進行し、 前 記細胞表面上のヒト BST2/前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍 光物質の平均蛍光強度が、 培養開始時の 50 %以下を示すものである、 請求項 1記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
5. 前記細胞が RPMI8226株であり、 氷冷下で前記モノクローナル抗体を結合し た後、 37でにて培養開始後 30分以内にインターナリゼーシヨンが進行し、 前 記細胞表面上のヒト BST2/前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍 光物質の平均蛍光強度が、 培養開始時の 50 %以下を示すものである、 請求項 1記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
6. 前記細胞が RPMI8226株であり、 氷冷下で前記モノクローナル抗体を結合し た後、 37°Cにて培養開始後 15分以内にインターナリゼーシヨンが進行し、 前 記細胞表面上のヒ卜 BST2/前記モノクローナル抗体複合体の存在量を示す蛍 光物質の平均蛍光強度が、 培養開始時の 50 %以下を示すものである、 請求項 1記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
7. 配列番号 2のアミノ酸番号 50〜 180のアミノ酸配列中のェピトープを認識 する、 請求項 1記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
8. IgGl ( K ) 又は IgG4 ( / )である、 請求項 1記載のモノクローナル抗体又は その機能的断片。
9. ヒト抗体である、 請求項 1記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
10. 受託番号 FERM BP-7417, FERM BP- 7418、 FERM BP- 7821又は FERM BP- 7822の ハイプリドーマにより産生される、 請求項 1記載のモノクローナル抗体又は その機能的断片。
11. 受託番号 FERM BP- 7417、 FERM BP - 7418、 FERM BP-7821又は FERM BP- 7822の ハイプリドーマよりヒト抗体遺伝子をクローニングし、 該遺伝子を発現可能 な状態で宿主細胞に導入し、 該宿主細胞を培養することにより取得される、 請求項 1記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
12. 請求項 1〜 1 1のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその機能 的断片と、 治療用薬剤とを結合したものである複合体。
13. 治療用薬剤が、 放射性核種、 細菌毒素、 化学療法剤及びプロドラッグから 選ばれる少なくともひとつである、 請求項 1 2記載の複合体。
14. メイタンシン結合抗体である、 請求項 1 3記載の複合体。
15. 請求項 1 2又は請求項 1 3記載の複合体を有効成分として含む、 ヒト BST2 を発現する細胞を標的とする医薬組成物。
16. リンパ球性腫瘍、 リウマチ又は原発性局所癌に適用するものである、 請求 項 1 5記載の医薬組成物。
17. 多発性骨髄腫に適用するものである、請求項 1 5記載の医薬組成物。
18. ヒト BST2抗原の少なくとも部分アミノ酸配列を含むポリベプチドを免疫し た非ヒト動物の脾臓細胞とミエローマ細胞との融合によりハイプリ ドーマを 調製し、 該ハイプリドーマよりヒト BST2抗原に結合する抗体を産生するハイ プリ ドーマを選抜し、 前記選抜されたハイプリ ドーマより産生されたヒト BST2抗原に結合する抗体を、 ヒト BST2抗原を発現する細胞と反応させ、 前記 細胞を培養する過程で該細胞表面のヒ卜 BST2/前記抗体複合体の存在量の低 下を指標とした選抜を行うことを特徴とする、 請求項 1に記載のモノクロ' ナル抗体又はその機能的断片の作製方法。
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