WO2002055515A1 - Derives chimiques et leur application comme agent antitelomerase - Google Patents

Derives chimiques et leur application comme agent antitelomerase Download PDF

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WO2002055515A1
WO2002055515A1 PCT/FR2002/000057 FR0200057W WO02055515A1 WO 2002055515 A1 WO2002055515 A1 WO 2002055515A1 FR 0200057 W FR0200057 W FR 0200057W WO 02055515 A1 WO02055515 A1 WO 02055515A1
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alkyl
carbon atoms
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amino
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PCT/FR2002/000057
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Patrick Mailliet
Jean-François RIOU
Marcel Alasia
Thomas Caulfield
Gilles Doerflinger
Jean-Louis Mergny
Abdelazize Laoui
Odile Petitgenet
Emmanuelle Renou
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Aventis Pharma S.A.
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    • C07D453/02—Heterocyclic compounds containing quinuclidine or iso-quinuclidine ring systems, e.g. quinine alkaloids containing not further condensed quinuclidine ring systems

Definitions

  • the present invention relates to cancer therapy and relates to new anticancer agents having a very specific mechanism of action. It also relates to new chemical compounds as well as their therapeutic application in humans.
  • the present invention relates to the use of new non-nucleotide chemical compounds which interact with specific structures of deoxyribonucleic acid (DNA). These new compounds consist of a distributing agent linked to an aminoaromatic group. These new compounds are useful in the treatment of cancer and act in particular as telomerase inhibiting agents. They are particularly useful for stabilizing DNA in a G-quadruplex structure (guanine tetrads).
  • the therapeutic application of telomerase inhibition via the stabilization of these G-quadruplexes is the arrest of cell mitosis and the death of rapidly dividing cells such as cancer cells and possibly the induction of cell senescence cancerous.
  • telomeres have the therapeutic advantage of blocking telomerase.
  • telomerase makes it possible to add repeated DNA sequences of the T T A G G type, called telomeric sequences, at the end of the telomer, during cell division.
  • telomerase makes the cell immortal. In fact, in the absence of this enzymatic activity, the cell loses 100 to 150 bases each division, which makes it rapidly sinking. When rapidly dividing cancer cells appeared, these cells appeared to have telomeres maintained at a stable length during cell division.
  • telomerase was highly activated and that it allowed the addition of repeating motifs of telomeric sequences at the end of the telomer and therefore allowed the conservation of the length of the telomer in cancer cells. It has appeared for some time that more than
  • telomerase is a highly renowned target for treating cancer cells.
  • the first obvious approach to blocking telomerase was the use of nucleotide structures (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (7), 2635-2639).
  • nucleotide structures Chole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (7), 2635-2639.
  • Patent WO 99/40087 describes the use of compounds which interact with the G-quadruplex structures which are perylenic compounds and carbocyanines containing at least seven rings including two heterocycles. It appeared quite surprisingly that simple structures made it possible to obtain an at least equivalent result with structures that were much less complicated from the chemical point of view.
  • the compounds of the present invention which meet the objective aimed at, that is to say which fix the G-quadruplex structure and thereby exhibit telomerase inhibiting activity correspond to the following general formula: aromatic nitrogen cycle - NR 3 - distributor - NR ' 3 - non-aromatic hydrocarbon chain in which
  • the nitrogen aromatic ring represents: o a quinoline optionally substituted by at least o an N (Ra) (Rb) group in which Ra and Rb, identical or different, represent hydrogen or a C1-C4 alkyl radical or o a ORa group in which Ra is defined as above o a quinoline having a nitrogen atom in quaternary form or o a benzamidine or o a pyridine
  • R3 and R'3, identical or different, independently of one another represent hydrogen or a C1-C4 alkyl radical
  • a triazine group optionally substituted by an alkyl radical having 1 to 4 carbon atoms, a thio, oxy or amino radical themselves optionally substituted by one or more short-chain alkyl chains containing 1 to 4 carbon atoms or alternatively a d atom 'halogen or
  • non-aromatic hydrocarbon chain means an alkyl (C1-C4), alkenyl (C2-C4), linear or branched chain, cycioalkyl (C3-C18), cycloalkenyl (C3-C18), heterocycloalkyl (C3-C18).
  • the heterocycloalkyl group optionally includes the nitrogen atom.
  • non-aromatic hydrocarbon chain can be optionally substituted by one or more atoms or radicals chosen from halogen atoms, hydroxy, aryl, heteroaryl, alkyloxy, aryloxy, thio, alkylthio, arylthio, amino, alkylamino radicals and / or arylamino, dialkylamino, diarylamino, amidino, guanidino, alkylcarbonylamino, or arylcarbonylamino, carboxyl, alkyloxycarbonyl or aryloxycarbonyl, aminocarbonyl, alkylaminocarbonyl and or arylaminocarbonyl, dialkylaminocarbonyl, alkylcarbonyl or arylcarbonyl, cyano and trifluoromethyl.
  • atoms or radicals chosen from halogen atoms, hydroxy, aryl, heteroaryl, alkyloxy, aryloxy, thio, alkylthio,
  • the alkyl chains of the optional substituents of the hydrocarbon chain preferably contain 1 to 4 carbon atoms and the aryl groups of the optional substituents of the hydrocarbon chain preferably contain 5 to 18 carbon atoms.
  • the compounds included above it is preferred, among all of the compounds included above, to use those comprising as a distributor a triazine or diazine group.
  • the diazine groups it is preferred to use pyrimidines or quinazolines.
  • the hydrocarbon chains the alkyl chains containing 2 to 3 carbon atoms are preferred, the heterocycloalkyl or cycloalkyl chains containing 4 to 7 carbon atoms.
  • R1 and R2 which are identical or different represent hydrogen or a straight or branched alkyl group containing 1 to 4 carbon atoms or
  • a halogen atom chosen from fluorine, chlorine, bromine or iodine - R3 and R'3, identical or different, independently of one another represent hydrogen or a C1-C4 alkyl radical.
  • the nitrogen aromatic ring represents: o a quinoline optionally substituted by at least o an N (Ra) (Rb) group in which Ra and Rb, identical or different, represent hydrogen or a C1-C4 alkyl radical or o a ORa group in which Ra is defined as above o a quinoline having a nitrogen atom in quaternary form or o a benzamidine or o a pyridine attached in position -4 or fused with an aryl or heteroaryl group optionally substituted by a C1 alkyl group C4
  • alk represents o an alkyl unit containing 2 to 3 linear or branched carbon atoms substituted by an amino, alkylamino and / or arylamino, dialkylamino or diarylamino radical o an alkenyl unit containing 2 to 3 carbon atoms, substituted by an amino radical, alkylamino and / or arylamino, dialkylamino or diarylamino o a heterocyclyl unit containing from 4 to 7 carbon atoms or one of its salts.
  • quinoleine units can be substituted by any other group not involved in the intended application, such as acridine or isoquinoline or quinazoline or quinoxaline groups or phthalazines or benzothiazines or benzoxazines or phenoxazines or phenothiazines are included in the definition of quinoleine groups.
  • Preferred among the compounds of formula (I) above are those which comprise a heterocycle chosen from the groups 4-aminoquinolyl, 4-alkyl- or 4-dialkylamino-quinolyl, 4-aminoquinolinium or quinolinium in which the quinolinium nucleus is optionally substituted by a methyl group.
  • the groups A they preferably represent the methylthio, amino, alkylamino or dialkylamino radicals in which the alkyl groups have 1 to 4 carbon atoms.
  • the non-aromatic hydrocarbon chain it preferably represents a 2- (dialkylamino) ethyl, 3- (dialkylamino) propyl, 2- (N-alkyl-N-arylamino) ethyl or 3- (N-alkyl-) chain.
  • Another object of the present invention relates to the compounds of formula (I) as new chemicals. It therefore relates to new products corresponding to the following formula (I):
  • halogen atom chosen from fluorine, chlorine, bromine or iodine
  • R 3 and R ' 3 identical or different, independently represent one of a hydrogen atom or a C1-C4 alkyl group
  • the nitrogen aromatic ring represents: o a quinoline optionally substituted by at least o an N (Ra) (Rb) group in which Ra and Rb, identical or different, represent hydrogen or a C1-C4 alkyl radical or o a ORa group in which Ra is defined as above o a quinoline having a nitrogen atom in quaternary form or o a benzamidine or o a pyridine attached in position -4 or fused with an aryl or heteroaryl group optionally substituted by a C1 alkyl group C4
  • - alk represents o an alkyl unit containing 2 to 3 linear or branched carbon atoms substituted by an amino, alkylamino and / or arylamino, dialkylamino, or diarylamino radical o an alkenyl unit containing 2 to 3 carbon atoms, substituted by an amino radical , alkylamino and / or arylamino, dialkylamino or diarylamino o a heterocyclyl unit containing from 5 to 7 carbon atoms or one of its salts.
  • the compounds of formula (I) which are preferred are those for which An represents a group chosen from the following units: 4-amino- or 4-methylamino- or 4-dimethylamino-quinolyl or quinolynium in which the quinolinium ring is optionally substituted by a methyl group.
  • the compounds of general formula (I) which are preferred are those for which A represents an amino or dimethylamino group or more preferably methylthio.
  • the compounds of general formula (I) which are preferred are those for which the non-aromatic hydrocarbon chain represents a 2- (dialkylamino) ethyl, 3- (dialkylamino) propyl, 2- (N-alkyl-N-arylamino) ethyl or 3- (N-alkyl-N-arylamino) propyl in which the alkyl groups contain 1 to 4 carbon atoms, in particular 1 to 2 carbon atoms and the aryl groups contain 5 to 18 carbon atoms, in particular 6 carbon atoms.
  • the non-aromatic hydrocarbon chain represents a 2- (N-alkyl-N-arylamino) ethyl chain
  • Another object of the present invention relates to the use of the compounds of formula (I) as a pharmaceutical product for human use.
  • (A) can be obtained by sequential displacement of the halogen atoms, very generally chlorine atoms, of the products of general formula
  • amine Ar Generally one operates with 1 mole of dihalo-s-triazine, or trihalo-s-triazine, and 1 mole of amine Ar.,. It is preferred to operate in an inert solvent such as optionally aqueous acetone or an optionally aqueous alcohol, such as ethanol, or a halogenated solvent, such as dichloromethane, or an ether such as diethyl ether or dioxane, or a polar aprotic solvent such as DMF, DMSO or NMP. According to a better way of implementing the invention, the operation is carried out at a temperature between 20 ° C and 50 ° C. Then 1 mole of amine Alk is added to the product of general formula (D), which can optionally be isolated. One operates in particular at a temperature between 50 ° C and reflux.
  • D general formula (D)
  • the products of general formula (A) in which Ar are defined as above and R represents a group NR1 R2 or OR1 or SR1 can also be prepared by nucleophilic displacement of a halogen atom, generally an atom of chlorine, of a product of general formula (A) in which R represents a halogen atom according to scheme 2:
  • R Cl (or F or Br or I)
  • R NR ⁇ 2 or OR 1 or SR.
  • R represents a halogen atom, preferably a chlorine atom
  • the reaction takes place in an inert medium under the reaction conditions, mention may be made, among inert solvents, of optionally aqueous acetone or an optionally aqueous alcohol such as ethanol, or a halogenated solvent such as dichloromethane, or an ether such as diethyl ether or dioxane, or a polar aprotic solvent such as DMF, DMSO or NMP.
  • the operation is preferably carried out at a temperature between 20 ° C. and reflux, in the presence in particular of an organic base, such as triethylamine, or an inorganic base, such as sodium hydroxide or sodium or potassium carbonate. It is also possible not to use a base during the amination reaction , and to isolate a hydrochloride from the product of general formula (A), the base of which can then be released.
  • an organic base such as triethylamine
  • an inorganic base such as sodium hydroxide or sodium or potassium carbonate. It is also possible not to use a base during the amination reaction , and to isolate a hydrochloride from the product of general formula (A), the base of which can then be released.
  • the incoming group represents an R1O " or R1S " group
  • an alkali or alkaline earth alcoholate or thioalcoholate such as a sodium or potassium or lithium or ammonium or cesium or barium salt
  • a polar aprotic solvent such as DMF or DMSO or NMP
  • the compounds for which R represents a hydrogen atom or a straight or branched alkyl group containing from 1 to 4 carbon atoms can also be prepared by condensation of a bisguanide of general formula (E) , with an acid derivative, preferably an acid chloride or a methyl ester of general formula (F) according to scheme 3:
  • the condensation between the bisguanide of general formula (E) and the acid derivative of general formula (F) is generally carried out in an alcohol such as methanol or ethanol. It is preferred to operate at a temperature between 0 ° C and the reflux temperature.
  • the bisguanides of general formula (E) symmetrical or asymmetrical can be obtained by operating under the conditions described in the literature and in particular according to patent J.P. 94-4993.
  • the s-triazines of general formula can be obtained in the form of libraries, by applying the methods described in schemes 1, 2, 3 in parallel and / or combinatorial chemistry in the liquid phase or in the solid phase, it being understood that , when working in the solid phase, any of the reactants is previously fixed on a solid support, chosen according to the chemical reaction involved, and that said chemical reaction is followed by a cleavage operation of the product the reaction of the solid support.
  • the present invention also relates to therapeutic compositions containing a compound according to the invention, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier according to the mode of administration chosen.
  • the pharmaceutical composition can be in solid, liquid or liposome form.
  • solid compositions mention may be made of powders, capsules, tablets.
  • oral forms it is also possible to include the solid forms protected from the acid environment of the stomach.
  • the supports used for the solid forms consist in particular of mineral supports such as phosphates, carbonates or organic supports such as lactose, celluloses, starch or polymers.
  • Liquid forms are made up of solutions of suspensions or dispersions. They contain as dispersive support either water or an organic solvent (ethanol, NMP or others) or mixtures of surfactants and solvents or complexing agents and solvents.
  • the administered dose of the compounds of the invention will be adapted by the practitioner according to the route of administration of the patient and the state of the latter.
  • the compounds of the present invention can be administered alone or in admixture with other anticancer agents.
  • anticancer agents include anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents, anticancer agents
  • alkylating agents and in particular cyclophosphamide, melphalan, ifosfamide, chlorambucil, busulfan, thiotepa, prednimustine, carmustine, lomustine, semustine, steptozotocine, decarbazine, temozolomide, procarbazine and l 'hexamethylmelamine
  • platinum derivatives such as cisplatin, carboplatin or oxaliplatin
  • antibiotic agents such as bleomycin, mitomycin, dactinomycin
  • antimicrotubule agents such as vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine, taxoides (paclitaxel and docetaxel) • anthracyclines such as doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, epirubicin, mitoxantrone, losoxantrone
  • fluoropyrimidines such as 5-fluorouracil, UFT, floxuridine,
  • cytidine analogues such as 5-azacytidine, cytarabine, gemcitabine, 6-mercaptomurine, 6-thioguanine
  • adenosine analogs such as pentostatin, cytarabine or fludarabine phosphate
  • the stabilization activity of the G-quadruplexes can be determined by a method using the formation of a complex with fluorescein, the experimental protocol of which is described below.
  • the oligonucleotide FAM + DABCYL carries the catalog reference, OL-0371-0802. It has the sequence: GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG corresponding to 3.5 repeats of the human telomeric motif (strand rich in G). Fluorescein is attached to the 5 'end, DABCYL to the 3' end, by the chemical arms described by Eurogentec. The concentration of the samples is checked by spectrophotometry, by recording the absorbance spectrum between 220 and 700 nm and using the molar extinction coefficient provided by the supplier.
  • the Tm of the reference sample without addition of product is 44 ° C. in a Lithium Chloride buffer. This temperature is brought to more than 55 ° C. in a sodium chloride buffer.
  • the addition of a G-quadruplex stabilizing compound induces an increase in Tm. This increase is considered significant if it is greater than 3 °.
  • the biological anti -lomerase activity is determined by the following experimental protocol:
  • the HL60 leukemia line is obtained from the ATCC (Americam Type Culture Collection, Rockville USA). The cells are cultured in suspension in RPMI 1640 medium containing, L-Glutamine at
  • telomerase activity is determined by a protocol for extending the oligonucleotide TS AATCGTTCGAGCAGAGTT 3 ' ), in the presence of a cellular extract enriched in telomerase activity and of compounds which are added to different concentrations (10, 1, 0.1 and 0.01 ⁇ g / ml).
  • the extension reaction is followed by PCR amplification of the extension products using the oligonucleotides TS and CXext ( 5 ′ GTGCCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA 3 ).
  • the reaction medium is prepared according to the following composition:
  • Bovine albumin serum 0.1 mg / ml
  • oligonucleotides are obtained from Eurogentec (Belgium) and are stored at -20 ° C at a stock concentration of 1 mg / ml in distilled water.
  • reaction samples are assembled in 0.2 ml PCR tubes and a drop of paraffin oil is placed on each of the reactions of the experiment before the tubes are closed.
  • reaction samples are then incubated in a Cetus 4800 type PCR apparatus under the following temperature conditions:
  • the samples are then analyzed by electrophoresis in 12% acrylamide gel in 1 ⁇ TBE buffer for 1 hour at a voltage of 200 volts, using a Novex electrophoresis system.
  • the acrylamide gels are then dried on a sheet of 3MMM Whatmann paper at 80 ° C for 1 hour.
  • the concentration of compound inducing a 50% inhibition of the telomerase reaction is determined using a semi-logarithmic graphical representation of the inhibition values obtained as a function of each of the concentrations of compound tested.
  • a compound is active as an antelomerase agent when the amount inhibiting 50% of the telomerase reaction is notably less than 5 ⁇ M.
  • the cytotoxic biological activity on human tumor lines is determined according to the following experimental protocol:
  • the human cell lines KB and A549 originate from the ATCC (Americam Type Culture Collection, Rockville USA).
  • the A549 cells are cultured in a layer in a culture flask in RPMI 1640 medium, L-Glutamine at 2 mM, Penicillin 200 U / ml, streptomycin 200 ⁇ g / ml and supplemented with 10% fetal calf serum inactivated by heat.
  • KB cells are cultured in a culture flask in Dulbelco's medium containing, 2 mM L-Glutamine, Penicillin 200 U / ml, streptomycin 200 ⁇ g / ml and supplemented with 10% of heat-inactivated fetal calf serum .
  • the cells in the exponential growth phase are trypsinized, washed in PBS 1X and are seeded in 96-well microplates (Costar) at a rate of 4x10 4 cells / ml for A549 and 1.5 ⁇ 10 4 cells / ml (0.2 ml / well) then incubated for 96 hours in the presence of variable concentrations of product to be studied (10, 1, 0.1 and 0.01 ⁇ g / ml, each point in quadruplicate). 16 hours before the end of the incubation, 0.02% final neutral red is added to each well. At the end of the incubation, the cells are washed with 1 ⁇ PBS and lysed with 1% of sodium lauryl sulfate. Cellular incorporation of the dye, which reflects cell growth, is spectrophotometrically evaluated at a wavelength of 540 nm for each sample using a Dynatech MR5000 reading device.
  • the concentration of compound inducing a 50% inhibition of growth is determined using a semi logarithmic graphical representation of the inhibition values obtained as a function of each of the concentrations of compound tested.
  • a compound is considered to be active as a cytotoxic agent if the inhibitory concentration of 50% of the growth of the tumor cells tested is notably less than 10 ⁇ M.
  • Example 1 Parallel synthesis of substituted derivatives of N6- [6-amino-4-methylsulfanyl- [1, 3,5] triazin-2-yl] -2-methyl-quinoline-4,6-diamine
  • the reaction medium is heated at reflux under argon for 24 hours. After cooling, the contents of the tube are evaporated under reduced pressure, taken up in 5 ml of water and 5 ml of ethyl acetate and filtered. The organic phase is decanted, dried and concentrated under reduced pressure.
  • Examples 1-1 to 1-26 were obtained by operating as above in a Zymark STEM RS2050 reactor.
  • the structures, the various operating conditions used and the characteristics of Examples 1-1 to 1-26 are summarized in the table below:
  • Example 2 Parallel synthesis of substituted derivatives of N6- [6-amino-4-diethylamino- [1, 3,5] triazin-2-yl] -2-methyl-quinoline-4,6-diamine
  • the reaction medium is heated at 120 ° C under argon for 16 hours. After cooling, the contents of the tube are evaporated under reduced pressure, taken up in 5 ml of water, filtered and washed with diethyl ether.
  • Examples 2-1 to 2-2 were obtained by operating as above in a Zymark STEM RS2050 reactor.
  • the structures, the various operating conditions used and the characteristics of Examples 2-1 and 2-2 are summarized in the table below:

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Abstract

La présente invention est relative à la thérapie du cancer et concerne de nouveaux agents anticancéreux ayant un mécanisme d'action bien particulier. Elle concerne aussi de nouveaux composés chimiques ainsi que leur application thérapeutique chez l'homme.

Description

DERIVES CHIMIQUES ET LEUR APPLICATION COMME AGENT
ANTITELOMERASE
La présente invention est relative à la thérapie du cancer et concerne de nouveaux agents anticancéreux ayant un mécanisme d'action bien particulier. Elle concerne aussi de nouveaux composés chimiques ainsi que leur application thérapeutique chez l'homme.
La présente invention concerne l'utilisation de nouveaux composés chimiques non nucléotidiques qui interagissent avec des structures spécifiques de l'acide désoxyribonucléique (ADN). Ces nouveaux composés sont constitués d'un agent répartiteur lié à un groupe aminoaromatique. Ces nouveaux composés sont utiles dans le traitement des cancers et agissent en particulier en tant qu'agents inhibiteurs de la télomérase. Ils sont particulièrement utiles pour stabiliser l'ADN en structure G-quadruplexe (tétrades de guanines). L'application thérapeutique de l'inhibition de la télomérase via la stabilisation de ces G-quadruplexes est l'arrêt de la mitose cellulaire et la mort des cellules à division rapide telles que les cellules cancéreuses et éventuellement l'induction de la sénescence des cellules cancéreuses.
Les composés de la présente invention présentent l'avantage du point de vue thérapeutique de bloquer la télomérase. Du point de vue biologique, la télomérase permet l'ajout de séquences d'ADN répétées du type T T A G G G, dites séquences telomeriques, à l'extrémité du télomère, lors de la division cellulaire. Par cette action la télomérase rend la cellule immortelle. En effet, en l'absence de cette activité enzymatique, la cellule perd à chaque division 100 à 150 bases, ce qui la rend rapidement senescente. Lors de l'apparition de cellules cancéreuses à division rapide, il est apparu que ces cellules présentaient des télomères maintenus à une longueur stable au cours de la division cellulaire. Dans ces cellules cancéreuses il est apparu que la télomérase était fortement activée et qu'elle permettait l'addition de motifs répétés de séquences telomeriques à la fin du télomère et permettait donc la conservation de la longueur du télomère dans les cellules cancéreuses. Il est apparu depuis quelques temps que plus de
85 % des cellules cancéreuses présentaient des tests positifs à la présence de télomérase alors que les cellules somatiques ne présentent pas cette caractéristique.
Ainsi la télomérase est une cible très convoitée pour traiter les cellules cancéreuses. La première approche évidente pour bloquer la télomérase a été l'utilisation de structures nucleotidiques (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(7), 2635-2639). Parmi les composés non nucleotidiques qui ont été utilisées dans l'art antérieur on peut citer les diaminoanthraquinones (Sun et al. J. Med. Chem. 40(14), 2113-6) ou les diethyloxadicarbocyanines (Wheelhouse R. T. Et al. J. Am. Chem. Soc. 1998(120) 3261-2).
Le brevet WO 99/40087 décrit l'utilisation de composés qui interagissent avec les structures G-quadruplexes qui sont des composés pérylènes et des carbocyanines contenant au moins sept cycles dont deux hétérocycles. II est apparu de façon tout-à-fait surprenante que des structures simples permettaient d'obtenir un résultat au moins équivalent avec des structures beaucoup moins compliquées du point de vue chimique. Les composés de la présente invention qui répondent à l'objectif visé c'est-à-dire qui fixent la structure G-quadruplex et par ce fait présentent une activité inhibitrice des télomérases répondent à la formule générale suivante : cycle aromatique azoté - NR3 - répartiteur - NR'3 - chaîne hydrocarbonée non aromatique dans laquelle
• le cycle aromatique azoté, représente : o une quinoléine éventuellement substituée par au moins o un groupe N(Ra)(Rb) dans lequel Ra et Rb, identiques ou différents représentent l'hydrogène ou un radical alkyle en C1-C4 ou o un groupe ORa dans lequel Ra est défini comme précédemment o une quinoléine possédant un atome d'azote sous forme quaternaire ou o une benzamidine ou o une pyridine
R3 et R'3, identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre l'hydrogène ou un radical alkyle en C1-C4
• le répartiteur représente :
0 un groupe triazine éventuellement substitué par un radical alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, un radical thio, oxy ou amino eux mêmes éventuellement substitués par une ou plusieurs chaînes alkyle à chaîne courte contenant 1 à 4 atomes de carbone ou encore un atome d'halogène ou
0 un groupe carbonyle ou
0 un groupe C(=NH)-NH-C(=NH) ou 0 un groupe alkylediyle contenant 3 à 7 atomes de carbone ou
0 un groupe diazine éventuellement substitué par les mêmes groupes que la triazine ou un de ses sels. On entend au sens de la formule ci-dessus par chaîne hydrocarbonée non aromatique une chaîne alkyle (C1-C4), alkényle (C2-C4), linéaire ou ramifiée, cycioalkyle (C3-C18), cycloalkényle (C3-C18), hétérocycloalkyle (C3-C18). Le groupe hétérocycloalkyle inclut éventuellement l'atome d'azote. II est évidemment entendu que la chaîne hydrocarbonée non aromatique peut être éventuellement substituée par un ou plusieurs atomes ou radicaux choisis parmi les atomes d'halogène, les radicaux hydroxy, aryle, hétéroaryle, alkyloxy, aryloxy, thio, alkylthio, arylthio, amino, alkylamino et/ou arylamino, dialkylamino, diarylamino, amidino, guanidino, alkylcarbonylamino, ou arylcarbonylamino, carboxyle, alkyloxycarbonyle ou aryloxycarbonyle, aminocarbonyle, alkylaminocarbonyle et ou arylaminocarbonyle, dialkylaminocarbonyle, alkylcarbonyl ou arylcarbonyl, cyano et trifluorométhyle.
Les chaînes alkyle des substituants éventuels de la chaîne hydrocarbonée contiennent de préférence 1 à 4 atomes de carbone et les groupes aryles des substituants éventuels de la chaîne hydrocarbonée contiennent de préférence 5 à 18 atomes de carbone.
On préfère parmi l'ensemble des composés ci-dessus inclus utiliser ceux comportant comme répartiteur un groupe triazine ou diazine. Parmi les groupes diazines on préfère utiliser les pyrimidines ou les quinazolines. Parmi les chaînes hydrocarbonée on préfère les chaînes alkyle contenant 2 à 3 atomes de carbone, les chaînes heterocycloalkyles ou cycloalkyles contenant 4 à 7 atomes de carbone.
Parmi les triazines on préfère les composés répondant à la formule (I) ci-dessous :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle : - A représente
• un groupe amino de formule NR1 R2 dans lequel R1 et R2 identiques ou différents représentent l'hydrogène ou un groupe alkyle droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone ou
• un groupe OR1 ou SR1 dans lequel R1 a la même signification que précédemment ou
• un groupe alkyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou ou un groupe trifluorométhyle ou • un atome d'hydrogène ou
• un atome d'halogène choisi parmi le fluor, le chlore, le brome ou l'iode - R3 et R'3, identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre l'hydrogène ou un radical alkyle en C1-C4.
- A^ représente :
• le cycle aromatique azoté, représente : o une quinoléine éventuellement substituée par au moins o un groupe N(Ra)(Rb) dans lequel Ra et Rb, identiques ou différents représentent l'hydrogène ou un radical alkyle en C1-C4 ou o un groupe ORa dans lequel Ra est défini comme précédemment o une quinoléine possédant un atome d'azote sous forme quaternaire ou o une benzamidine ou o une pyridine attachée en position -4 ou fusionnée avec un groupe aryle ou hétéroaryle éventuellement substituée par un groupe alkyle en C1-C4
- alk représente o un motif alkyle contenant 2 à 3 atomes de carbone linéaire ou ramifié substitué par un radical amino, alkylamino et/ou arylamino, dialkylamino ou diarylamino o un motif alkényle contenant 2 à 3 atomes de carbone, substitué par un radical amino, alkylamino et/ou arylamino, dialkylamino ou diarylamino o un motif hétérocyclyle contenant de 4 à 7 atomes de carbone ou un de ses sels.
Il est évident que les motifs quinoleines peuvent être substitués par tout autre groupe n'intervenant pas dans l'application visée, ainsi des groupes acridines ou isoquinoléines ou quinazolines ou quinoxalines ou phtalazines ou benzothiazines ou benzoxazines ou phénoxazines ou phénothiazines sont inclus dans la définition des groupes quinoleines.
On préfère parmi les composés de formule (I) ci-dessus ceux qui comportent un hétérocycle choisi parmi les groupes 4-aminoquinolyl, 4-alkyl- ou 4-dialkylamino-quinolyl, 4-aminoquinolinium ou quinolinium dont le noyau quinolinium est éventuellement substitué par un groupe méthyle.
En ce qui concerne les groupes A, ils représentent de préférence le radical méthylthio, amino, alkylamino ou dialkylamino radicaux dans lesquels les groupes alkyle possèdent 1 à 4 atomes de carbone. En ce qui concerne la chaîne hydrocarbonée non aromatique, elle représente de préférence une chaîne 2-(dialkylamino)éthyl, 3-(dialkylamino)propyl, 2-(N-alkyl-N-arylamino)éthyl ou 3-(N-alkyl-N- arylamino)propyl dans lesquels les groupes alkyle contiennent de préférence 1 à 4 atomes de carbone, encore plus préférentiellement 1 à 2 atomes de carbone et les groupes aryle contiennent de préférence 5 à 18 atomes de carbone, encore plus préférentiellement 6 atomes de carbone.
Un autre objet de la présente invention concerne les composés de formule (I) en tant que produits chimiques nouveaux. Il concerne donc les produits nouveaux répondant à la formule (I) suivante :
Figure imgf000007_0001
dans laquelle : - A représente
• un groupe amino de formule NR1 R2 dans lequel R1 et R2 identiques ou différents représentent un groupe alkyle droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone ou
• un groupe OR1 ou SR1 dans lequel R1 représente l'hydrogène ou a la même signification que précédemment ou • un groupe alkyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou un groupe trifluorométhyle ou
• un atome d'hydrogène ou
• un atome d'halogène choisi parmi le fluor, le chlore, le brome ou l'iode
- R3 et R'3, identiques ou différents, représentent indépendamment l'un tre un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C4
- Aη représente :
• le cycle aromatique azoté, représente : o une quinoléine éventuellement substituée par au moins o un groupe N(Ra)(Rb) dans lequel Ra et Rb, identiques ou différents représentent l'hydrogène ou un radical alkyle en C1-C4 ou o un groupe ORa dans lequel Ra est défini comme précédemment o une quinoléine possédant un atome d'azote sous forme quaternaire ou o une benzamidine ou o une pyridine attachée en position -4 ou fusionnée avec un groupe aryle ou hétéroaryle éventuellement substituée par un groupe alkyle en C1-C4
- alk représente o un motif alkyle contenant 2 à 3 atomes de carbone linéaire ou ramifié substitué par un radical amino, alkylamino et/ou arylamino, dialkylamino, ou diarylamino o un motif alkényle contenant 2 à 3 atomes de carbone, substitué par un radical amino, alkylamino et/ou arylamino, dialkylamino ou diarylamino o un motif hétérocyclyle contenant de 5 à 7 atomes de carbone ou un de ses sels.
Les composés de formule (I) qui sont préférés sont ceux pour lesquels An, représente un groupe choisi parmi les motifs suivants : 4-amino- ou 4-méthylamino- ou 4-diméthylamino-quinolyl ou quinolynium dont le noyau quinolinium est éventuellement substitué par un groupe méthyle.
Les composés de formule générale (I) qui sont préférés sont ceux pour lesquels A représente un groupe amino ou diméthylamino ou plus préférentiellement méthylthio.
Les composés de formule générale (I) qui sont préférés sont ceux pour lesquels la chaîne hydrocarbonée non aromatique représente une chaîne 2-(dialkylamino)éthyl, 3-(dialkylamino)propyl, 2-(N-alkyl-N- arylamino)éthyl ou 3-(N-alkyl-N-arylamino)propyl dans lesquels les groupes alkyle contiennent 1 à 4 atomes de carbone, notamment 1 à 2 atomes de carbone et les groupes aryle contiennent 5 à 18 atomes de carbone, notamment 6 atomes de carbone.
On préfère tout particulièrement les composés de formule générale (I) pour lesquels la chaîne hydrocarbonée non aromatique représente une chaîne 2-(N-alkyl-N-arylamino)éthyl telle que la chaîne 2-(N-m.tolyl-N-éthyl- amino)éthyl
Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation des composés de la formule (I) comme produit pharmaceutique à usage humain.
Les procédés de préparation des composés de formule (I)
Figure imgf000009_0001
sont décrits ci-après.
Dans le cas où An, et Alk sont présents, la triazine de formule générale
(A) peut être obtenue par déplacement séquentiel des atomes d'halogène, très généralement des atomes de chlore, des produits de formule générale
(B) par les aminés Ar, puis Alk de formule générale (C) selon le schéma 1 :
Figure imgf000010_0001
X = Cl (ou F ou Br ou I) (B) (C) (D)
Alk — NH (C) I R',
Figure imgf000010_0002
(A)
Schéma 1
Généralement on opère avec 1 mole de dihalogéno-s-triazine, ou trihalogéno-s-triazine, et 1 mole d'aminé Ar.,. On préfère opérer dans un solvant inerte tel que l'acétone éventuellement aqueux ou un alcool éventuellement aqueux, comme l'éthanol, ou un solvant halogène, tel que le dichlorométhane, ou un éther tel que l'oxyde de diéthyle ou le dioxane, ou un solvant aprotique polaire tel que le DMF le DMSO ou la NMP. Selon une meilleure manière de mettre en oeuvre l'invention on opère à une température comprise entre 20°C et 50°C. Ensuite on ajoute 1 mole d'aminé Alk au produit de formule générale (D), qui peut être éventuellement isolé. On opère notamment à une température comprise entre 50°C et le reflux.
Avantageusement, on peut opérer dans les conditions décrites dans J. Fluor. Chem., 1988, 39(1 ), 117-123.
Méthode générale 2
Selon une seconde méthode les produits de formule générale (A) dans lesquels Ar sont définis tels que précédemment et R représente un groupe NR1 R2 ou OR1 ou SR1 peuvent être également préparés par déplacement nucléophile d'un atome d'halogène, généralement un atome de chlore, d'un produit de formule générale (A) dans lequel R représente un atome d'halogène selon le schéma 2 :
Figure imgf000011_0001
(A) (A)
R = Cl (ou F ou Br ou I) R= NR^2 ou OR1 ou SR.,
Schéma 2
On opère généralement en condensant 1 mole de produit de formule générale (A) dans lequel R représente un atome d'halogène, préférentiellement un atome de chlore, avec 1 mole d'aminé R1 R2NH ou d'alcoolate R1O" ou de thioalcoolate R1S. La réaction a lieu en milieu inerte dans les conditions de la réaction. On peut citer parmi les solvants inertes l'acétone éventuellement aqueux ou un alcool éventuellement aqueux comme l'éthanol, ou un solvant halogène tel que le dichlorométhane, ou un éther tel que l'oxyde de diéthyle ou le dioxane, ou un solvant aprotique polaire tel que le DMF le DMSO ou la NMP. Lorsque le groupe entrant représente un groupe R1 R2NH, on opère de préférence à une température comprise entre 20°C et le reflux, en présence notamment d'une base organique, telle que la triéthylamine, ou minérale, telle que la soude ou le carbonate de sodium ou de potassium. Il est également possible de ne pas utiliser de base lors de la réaction d'amination, et d'isoler un chlorhydrate du produit de formule générale (A), dont la base peut ensuite être libérée. Lorsque le groupe entrant représente un groupe R1O" ou R1S" on opère préférentiellement avec un alcoolate ou un thioalcoolate alcalin ou alcalinoterreux, tel qu'un sel de sodium ou de potassium ou de lithium ou d'ammonium ou de césium ou de baryum, dans un solvant aprotique polaire tel que le DMF ou le DMSO ou la NMP, à une température comprise entre 50°C et le reflux. Méthode générale 3
Selon un troisième procédé de préparation les composés pour lesquels R représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, droit ou ramifié contenant de 1 à 4 atomes de carbone, peuvent également être préparés par condensation d'un bisguanide de formule générale (E), avec un dérivé d'acide, préférentiellement un chlorure d'acide ou un ester de méthyle de formule générale (F) selon le schéma 3 :
Figure imgf000012_0001
(E) (F) (A)
Schéma 3
La condensation entre le bisguanide de formule générale (E) et le dérivé d'acide de formule générale (F) est effectuée généralement dans un alcool comme le méthanol ou l'éthanol. On préfère opérer à une température comprise entre 0°C et la température de reflux.
Les bisguanides de formule générale (E) symétriques ou dissymétriques peuvent être obtenus en opérant dans les conditions décrites dans la littérature et en particulier selon le brevet J.P. 94-4993.
Méthode générale 4
Il est entendu que les s-triazines de formule générale peuvent être obtenues sous forme de librairies, en appliquant les méthodes décrites dans les schémas 1 , 2, 3 en chimie parallèle et/ou combinatoire en phase liquide ou en phase solide, étant entendu que, lorsqu'on travaille en phase solide, l'un quelconque des réactifs est préalablement fixé sur un support solide, choisi en fonction de la réaction chimique mise en jeu, et que ladite réaction chimique est suivie d'une opération de clivage du produit de la réaction du support solide. La présente invention concerne aussi les compositions thérapeutiques contenant un composé selon l'invention, en association avec un support pharmaceutiquement acceptable selon le mode d'administration choisi. La composition pharmaceutique peut se présenter sous forme solide, liquide ou de liposomes.
Parmi les compositions solides on peut citer les poudres, les gélules, les comprimés. Parmi les formes orales on peut aussi inclure les formes solides protégées vis-à-vis du milieu acide de l'estomac. Les supports utilisés pour les formes solides sont constitués notamment de supports minéraux comme les phosphates, les carbonates ou de supports organiques comme le lactose, les celluloses, l'amidon ou les polymères. Les formes liquides sont constituées de solutions de suspensions ou de dispersions. Elles contiennent comme support dispersif soit l'eau, soit un solvant organique (éthanol, NMP ou autres) ou de mélanges d'agents tensioactifs et de solvants ou d'agents complexants et de solvants.
La dose administrée des composés de l'invention sera adaptée par le praticien en fonction de la voie d'administration du patient et de l'état de ce dernier.
Les composés de la présente invention peuvent être administrés seuls ou en mélange avec d'autres anticancéreux. Parmi les associations possibles on peut citer
• les agents alkylants et notamment le cyclophosphamide, le melphalan, l'ifosfamide, le chlorambucil, le busulfan, le thiotepa, la prednimustine, la carmustine, la lomustine, la semustine, la steptozotocine, la decarbazine, la témozolomide, la procarbazine et l'hexamethylmélamine
• les dérivés du platine comme notamment le cisplatine, le carboplatine ou l'oxaliplatine
• les agents antibiotiques comme notamment la bléomycine, la mitomycine, la dactinomycine,
• les agents antimicrotubules comme notamment la vinblastine, la vincristine, la vindésine, la vinorelbine, les taxoides (paclitaxel et docétaxel) • les anthracyclines comme notamment la doxorubicine, la daunorubicine, l'idarubicine, l'épirubicine, la mitoxantrone, la losoxantrone
• les topoisomérases des groupes I et II telles. que l'étoposide, le teniposide, l'amsacrine, l'irinotecan, le topotecan et le tomudex,
• les fluoropyrimidines telles que le 5-fluorouracile, l'UFT, la floxuridine,
• les analogues de cytidine telles que la 5-azacytidine, la cytarabine, la gemcitabine, la 6-mercaptomurine, la 6-thioguanine
• les analogues d'adénosine telles que la pentostatine, la cytarabine ou le phosphate de fludarabine
• le methotrexate et l'acide folinique
• les enzymes et composés divers tels que la L-asparaginase, l'hydroxyurée, l'acide trans-rétinoique, la suramine, la dexrazoxane, l'amifostine, l'herceptin ainsi que les hormones oetrogéniques, androgéniques.
Il est également possible d'associer aux composés de la présente invention un traitement par les radiations. Ces traitements peuvent être administrés simultanément, séparément, séquentiellement. Le traitement sera adapté au malade à traiter par le praticien.
L'activité de stabilisation des G-quadruplexes peut être déterminée par une méthode utilisant la formation d'un complexe avec la fluoresceine dont le protocole expérimental est décrit ci-après.
Qligonucléotides
Tous les olignucléotides, modifiés ou non, ont été synthétisés par Eurogentec SA, Seraing, Belgique. L'oligoncléotide FAM + DABCYL porte la référence catalogue, OL-0371-0802. Il possède la séquence: GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG correspondant à 3.5 répétitions du motif télomérique humain (brin riche en G). La fluoresceine est attaché à l'extrémité 5', le DABCYL à l'extrémité 3', par les bras chimiques décrit par Eurogentec. La concentration des échantillons est vérifiée par spectrophotométrie, en enregistrant le spectre d'absorbance entre 220 et 700 nm et en utilisant le coefficient d'extinction molaire fourni par le fournisseur.
Tampons Toutes les expériences ont été réalisées dans un tampon cacodylate de sodium 10 mM pH 7.6 contenant 0.1 M de Chlorure de Lithium (ou de Chlorure de Sodium). L'absence de contamination fluorescente dans le tampon a été préalablement vérifiée. L'oligonucleotide fluorescent est ajouté à la concentration finale de 0.2 μM.
Etude de Fluorescence
Toutes les mesures de fluorescence ont été effectuées sur un appareil Spex Fluorolog DM1 B, en utilisant une largeur de raie d'excitation de 1.8 nm et une largeur de raie d'émission de 4.5 nm. Les échantillons sont placés dans une cuvette en quartz micro de 0.2 x 1 cm. La température de l'échantillon est contrôlée par un bain-marie extérieur. L'oligonucleotide seul a été analysé à 20, 30, 40, 50, 60, 70 et 80°C. Les spectres d'émission sont enregistrés en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 470 nm. Les spectres d'excitation sont enregistrés en utilisant soit 515 nm soit 588 nm comme longueur d'onde d'émission. Les spectres sont corrigés de la réponse de l'instrument par des courbes de référence. Une extinction importante (80- 90 %) de la fluorescence de la fluoresceine à température ambiante est observée, en accord avec un repli intramoléculaire de l'oligonucleotide à 20°C sous forme d'un G-quadruplex, ce qui induit une juxtaposition de ses extrémités 5' et 3', respectivement liées à la fluoresceine et au DABCYL. Cette juxtaposition entraîne un phénomène déjà décrit d'extinction de fluorescence, utilisé pour les "Molecular Beacons".
Tm en fluorescence :
Une solution stock d'oligonucléotide à la concentration en brin de
0.2 μM dans un tampon 0.1 M LiCI 10 mM cacodylate pH 7.6 est préalablement préparée, chauffée brièvement à 90°C et refroidie lentement à
20°C, puis distribuée par aliquots de 600 μl dans les cuves de fluorescence.
3 μl d'eau (pour le contrôle) ou 3 μl du produit à tester (stock à 200 μM, concentration finale 1 μM) sont alors ajoutés et mélangés. Les échantillons sont alors laissés à incuber pendant au moins 1 heure à 20°C avant chaque mesure. L'utilisation de temps d'incubation plus longs (jusqu'à 24 heures) n'a pas d'influence sur le résultat obtenu. Chaque expérience ne permet que la mesure d'un seul échantillon.
Celui-ci est d'abord incubé à une température initiale de 20°C, porté à 80°C en 38 minutes, laissé 5 minutes à 80°C, puis refroidi à 20°C en 62 minutes. Durant ce temps, la fluorescence est mesurée simultanément à deux longueurs d'onde d'émission (515 nm et 588 nm) en utilisant 470 nm comme longueur d'onde d'excitation. Une mesure est effectuée toutes les 30 secondes. La température du bain-marie est enregistrée en parallèle, et le profil de fluorescence en fonction de la température est reconstitué à partir de ces valeurs. Les profils de fluorescence sont ensuite normalisés entre 20°C et 80°C, et la température pour laquelle l'intensité d'émission à 515 nm est la moyenne de celles à haute et basse température est appelée Tm. Dans ces conditions, le Tm de l'échantillon de référence sans addition de produit est de 44°C dans un tampon Chlorure de Lithium. Cette température est portée à plus de 55°C dans un tampon Chlorure de Sodium. L'addition d'un composé stabilisant le G-quadruplex induit une augmentation du Tm. Cette augmentation est jugée significative si elle est supérieure à 3°.
L'activité biologique antitélomérase est déterminée par le protocole expérimental suivant :
Préparation de l'extrait enrichi en activité télomérase humaine
La lignée de leucémie HL60 est obtenue auprès de l'ATCC (Americam Type Culture Collection, Rockville USA). Les cellules sont cultivées en suspension dans du milieu RPMI 1640 contenant, L-Glutamine à
2 mM, Pénicilline 200 U/ml, streptomycine 200 μg/ml, gentamycine 50 μg/ml et additionné de 10 % de sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur.
Une aliquote de 105 cellules est centrifugée à 3000xG et le surnageant écarté. Le culot de cellules est resuspendu par plusieurs pipettages successifs dans 200 μl de tampon de lyse contenant CHAPS
0.5 %, Tris-HCI pH 7,5 10 mM, MgCI2 1 mM, EGTA 1 mM, β-mercaptoethanol
5 mM, PMSF 0.1 mM et glycérol 10 % et est conservé dans la glace pendant 30 minutes. Le lysat est centrifugé à 16 OOOOxG pendant 20 minutes à 4°C et 160 μl du surnageant est récupéré. Le dosage des protéines de l'extrait est effectué par la méthode de Bradford. L'extrait est conservé à -80°C.
Dosage de l'activité télomérase L'inhibition de l'activité télomérase est déterminée par un protocole d'extension de l'oligonucleotide TS AATCGTTCGAGCAGAGTT3'), en présence d'un extrait cellulaire enrichi en activité télomérase et des composés qui sont ajoutés à différentes concentrations (10, 1 , 0.1 et 0,01 μg/ml). La réaction d'extension est suivie d'une amplification PCR des produits d'extension à l'aide des oligonucleotides TS et CXext (5'GTGCCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA3).
Le milieu réactionnel est préparé selon la composition suivante :
Tris HCI pH 8,3 20 mM
MgCI2 1 ,5 mM Tween 20 0,005 % (P V)
EGTA 1 mM dATP 50 μM dGTP 50 μM dCTP 50 μM dTTP 50 μM
Oligonucléotide TS 2 μg/ml
Oligonucléotide CXext 2 μg/ml
Sérum Albumine bovine 0,1 mg/ml
Taq DNA polymérase 1 U/ml ' alpha 32P dCTP (3000 Ci/mmole) 0.5 μl
Extrait télomérase 200 ng sous un volume de 10 μl
Produit à tester ou solvant sous un volume de 5 μl
Eau bi-distillée QS 50 μl Les oligonucleotides sont obtenus auprès d'Eurogentec (Belgique) et sont conservés à -20°C à une concentration stock de 1 mg/ml dans de l'eau distillée.
Les échantillons réactionnels sont assemblés dans des tubes à PCR de 0.2 ml et une goutte d'huile de paraffine est déposée sur chacune des réactions de l'expérience avant la fermeture des tubes.
Les échantillons réactionnels sont ensuite incubés dans un appareil à PCR de type Cetus 4800 selon les conditions de températures suivantes :
15 minutes à 30°C, 1 minute à 90°C, suivis de 30 cycles de,
30 secondes à 94°C,
30 secondes à 50°C, et 1 minute 30 secondes à 72°C, suivis d'un cycle final de 2 minutes à 72°C.
Pour chacun des échantillons, une aliquote de 10 μl est pipettée sous la couche d'huile et mélangée avec 5 μl d'un tampon de dépôt contenant :
TBE 3X glycérol 32 % (P V) Bleu de bromophénol 0.03 %
Xylène cyanol 0.03 %
Les échantillons sont ensuite analysés par électrophorèse en gel d'acrylamide 12 % dans un tampon TBE 1X pendant 1 heure sous une tension de 200 volts, à l'aide d'un système d'électrophorèse Novex. Les gels d'acrylamides sont ensuite séchés sur une feuille de papier whatmann 3MM à 80°C pendant 1 heure.
L'analyse et la quantification des produits de la réaction sont effectuées à l'aide d'un appareil Instantlmager (Pacard). Pour chaque concentration de composé testée, les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la réaction et calculés à partir du contrôle enzymatique non traité et de l'échantillon sans enzyme (blanc) selon la formule suivante : (Valeur Composé - valeur blanc/ Valeur contrôle enzymatique - valeur blanc) x 100.
La concentration de composé induisant une inhibition de 50 % de la réaction télomérase (IC50) est déterminée à l'aide d'une représentation graphique semi logarithmique des valeurs d'inhibition obtenues en fonction de chacune des concentrations de composé testée.
On considère qu'un composé est actif en tant qu'agent antitélomérase lorsque la quantité inhibant 50 % de la réaction télomérase est notamment inférieure à 5 μM.
L'activité biologique cytotoxique sur des lignées de tumeur humaines est déterminée selon le protocole expérimental suivant :
Les lignées de cellules humaines KB et A549 sont originaires de l'ATCC (Americam Type Culture Collection, Rockville USA). Les cellules A549 sont cultivées en couche en flacon de culture dans du milieu RPMI 1640, L-Glutamine à 2 mM, Pénicilline 200 U/ml, streptomycine 200 μg/ml et additionné de 10 % de sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur. Les cellules KB sont cultivées en couche en flacon de culture dans du milieu de Dulbelco's contenant, L-Glutamine à 2 mM, Pénicilline 200 U/ml, streptomycine 200 μg/ml et additionné de 10 % de sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur. Les cellules en phase exponentielles de croissances sont trypsinées, lavées dans du PBS 1X et sont ensemencées en microplaques 96 puits (Costar) à raison de 4x104 cellules/ml pour A549 et de 1 ,5x104 cellules/ml (0.2 ml/puit) puis incubées pendant 96 heures en présence de concentrations variables de produit à étudier (10, 1 , 0.1 et 0.01 μg/ml, chaque point en quadruplicata). 16 heures avant la fin de l'incubation, 0.02 % final de rouge neutre est ajouté dans chaque puits. A la fin de l'incubation, les cellules sont lavées par du PBS 1X et lysées par 1 % de lauryl sulfate de sodium. L'incorporation cellulaire du colorant, qui reflète la croissance cellulaire, est évaluée par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 540 nm pour chaque échantillon à l'aide d'un appareil de lecture Dynatech MR5000.
Pour chaque concentration de composé testé, les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de croissance cellulaire et calculés à partir du contrôle non traité et du milieu de culture sans cellules (blanc) selon la formule suivante :
(Valeur Composé - valeur blanc/ Valeur contrôle cellules - valeur blanc) x 100.
La concentration de composé induisant une inhibition de 50 % de la croissance (IC50) est déterminée à l'aide d'une représentation graphique semi logarithmique des valeurs d'inhibition obtenues en fonction de chacune des concentrations de composé testée.
On considère qu'un composé est actif comme agent cytotoxique si la concentration inhibitrice de 50 % de la croissance des cellules tumorales testées est notamment inférieure à 10 μM.
Les exemples suivants et non limitatifs sont donnés pour illustrer l'invention.
Exemple 1 : Synthèse en parallèle de dérivés substitués de N6-[6-amino-4- méthylsulfanyl-[1 ,3,5]triazin-2-yl]-2-méthyl-quinoline-4,6- diamine
Figure imgf000020_0001
Préparation de la N6-(6-chloro-4-méthylsulfanyl-[1 ,3,5ltriazin-2-yl)-2-méthyl- quinoline-4,6-diamine
Dans un tricol de 1 litre, à une solution de 5 g (25 mmoles) de 2,6-dichloro-6- méthylsulfanyl-[1 ,3,5]triazine, qui peut être préparée selon J. Amer. Chem. Soc, 1945, 67, 662, dans 400 ml de tétrahydrofurane, on ajoute successivement 4,4 g (25 mmoles) de 2-méthyl-quinoline-4,6-diamine, qui peut être préparée selon J. Med. Chem. 1992, 35, 252, et 2,8 g (25 mmoles) de carbonate de sodium. Le mélange réactionnel est chauffé à reflux pendant 16 heures. Après évaporation du tétrahydrofurane, le résidu est repris par 400 ml d'un mélange d'eau et de dichorométhane (50-50 en volumes). La phase organique est décantée, séchée sur sulfate de sodium et concentrée à sec sous pression réduite. On obtient alors 7,5 g (88 %) de N6-(6-chloro-4- méthylsulfanyl-triazin-2-yl)-2-méthyl-quinoline-4,6-diamine, sous forme d'un solide jaune pâle dont les caractéristiques sont les suivantes :
- point de fusion = 294°C
- spectre de RMN 1H (300 MHz, (CD3)2SO d6, δ en ppm) : 2,43 (s : 3H) ; 2,52 (s : 3H) ; 6,47 (s : 1 H) ; 6,61 (mf : 2H) ; 7,62 (d large, J = 9 Hz : 1 H) ; 7,69 (d, J = 9 Hz : 1 H) ; 8,32 (mf : 1 H) ; 10,80 (mf : 1 H).
Synthèse en parallèle de N6-[6-(2-diméthylamino-éthylamino)-4-méthyl- sulfanyl-[1 ,3,5ltriazin-2-yl1-2-méthyl-quinoline-4,6-diamine (exemple 1-1 )
Dans un réacteur magnétique chauffant avec condenseur Zymark, de type STEM RS2050 contenant 25 puits en parallèle munis chacun d'un tube en verre de 50 ml, on introduit 50 mg (0,15 mmole) de N6-(6-amino-4- méthylsulfanyl-[1 ,3,5]triazin-2-yl)-2-méthylquinoline-4,6-diamine. Dans le premier tube (exemple 1-1), on ajoute successivement 5 ml de dioxane, 16 mg (0.15 mmole) de carbonate de sodium, 23 mg (0,15 mmole) d'iodure de sodium et 27 mg (0,3 mmole) de 2-diméthylamino-éthylamine. Le milieu réactionnel est chauffé au reflux sous argon pendant 24 heures. Après refroidissement, le contenu du tube est évaporé sous pression réduite, repris par 5 ml d'eau et 5 ml d'acétate d'éthyle et filtré. La phase organique est décantée, séchée et concentrée sous pression réduite. Le produit brut obtenu est alors purifié par LC/MS en utilisant une colonne de silice C18 Waters Xterra 3.5 μM, de diamètre 3 mm et de longueur 50 mm, en éluant par un gradient linéaire d'élution constitué au temps initial (t0 = 0 mn) par de l'eau contenant 0,05 % d'acide trifluoroacétique et au temps final (t, = 4 mn) par de l'acétonitrile contenant 0,05 %d'acide trifluoroacétique. On obtient ainsi, après purification, 58 mg de trifluoroacétate de N6-[(6-(méthyl-quinolin- 6-yl-amino)-4-méthylthio-triazin-2-yl]-quinaldine-4,6-diamine, dont les caractéristiques sont les suivantes :
- spectre de masse (DAD-TIC) = 454 (MH+)
- temps de rétention = 2,69 mn (les temps de rétention sont obtenus sur Colonne hypersil C18 5 μm 50 mm diamètre 4.6 mm marque Purity Elite en éluant avec un mélange de solvants A (H2O/TFA 0.05 %) et B (ACN/TFA 0.05 %) avec un gradiant linéaire allant de 95 % A/5 % B (t = 0 mn) à 10 % A/90 % B à t= 3,5 mn puis palier 2 mn).
Les exemples 1-1 à 1-26 ont été obtenus en opérant comme ci-dessus dans un réacteur Zymark STEM RS2050. Les structures, les diverses conditions opératoires utilisées et les caractéristiques des exemples 1-1 à 1-26 sont résumées dans le tableau ci-dessous :
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Exemple 2 : Synthèse en parallèle de dérivés substitués de N6-[6-amino-4- diéthylamino-[1 ,3,5]triazin-2-yl]-2-méthyl-quinoline-4,6-diamine
Figure imgf000024_0002
Préparation de la N6-(6-chloro-4-diéthylamino-π .3,51triazin-2-yl)-2-méthyl- quinoline-4,6-diamine
Dans un tricol de 1 litre, à une solution de 5 g (22,5 mmoles) de 2,6-dichloro- 4-diéthylamino-[1 ,3,5]triazine commerciale dans 300 ml de tétrahydrofurane, on ajoute successivement 3,91 g (22,5 mmoles) de 2-méthyl-quinoline-4,6- diamine, qui peut être préparée selon J. Med. Chem. 1992, 35, 252, et 2,4 g (22,5 mmoles) de carbonate de sodium. Le mélange réactionnel est chauffé à reflux pendant 20 heures. Après évaporation du tétrahydrofurane, le résidu est repris par 400 ml d'un mélange d'eau et de dichorométhane (50-50 en volumes). La phase organique est décantée, séchée sur sulfate de sodium et concentrée à sec sous pression réduite. On obtient alors 7,4 g (92 %) de N6- (6-chloro-4-diéthylamino-triazin-2-yl)-2-méthyl-quinoline-4,6-diamine, sous forme d'un solide jaune dont les caractéristiques sont les suivantes :
- point de fusion = 120°C - spectre de RMN 1H (300 MHz, (CD3)2SO d6, δ en ppm) : 1 ,14 (mt : 6H) ; 2,42 (s : 3H) ; de 3,50 à 3,70 (mt : 4H) ; 6,47 (s et mf : 3H en totalité) ; 7,54 (d large, J = 9 Hz : 1 H) ; 7,67(dd, J = 9 et 2 Hz : 1 H) ; 8,27 (mf : 1 H) ; 10,09 (mf : 1 H).
Synthèse en parallèle de N6-r(6-(3-diméthylamino-propylamino)-4- diéthylamino-F1 ,3,51triazin-2-yll-2-méthyl-quinoline-4,6-diamine (exemple 2-1)
Dans un réacteur magnétique chauffant avec condenseur Zymark, de type STEM RS2050 contenant 25 puits en parallèle munis chacun d'un tube en verre de 50 ml, on introduit 50 mg (0,13 mmole) de N6-(6-chloro-4- diéthylamino-[1 ,3,5]triazin-2-yl)-2-méthyl-quinoline-4,6-diamine. Dans le premier tube (exemple 2-1 ), on ajoute successivement 5 ml de DMF, 19 mg (0.14 mmole) de carbonate de potassium, 21 mg (0,14 mmole) d'iodure de sodium et 14 mg (0,14 mmole) de 3-diméthylamino-propylamine. Le milieu réactionnel est chauffé à 120°C sous argon pendant 16 heures. Après refroidissement, le contenu du tube est évaporé sous pression réduite, repris par 5 ml d'eau, filtré et lavé avec de l'oxyde de diéthyle. Le produit brut obtenu est alors purifié par LC/MS en utilisant une colonne de silice C18 Waters Xterra 3.5 μM, de diamètre 3 mm et de longueur 50 mm, en éluant par un gradient linéaire d'élution constitué au temps initial (t0 = 0 mn) par de l'eau contenant 0,05 % d'acide trifluoroacétique et au temps final (tf = 4 mn) par de l'acétonitrile contenant 0,05 % d'acide trifluoroacétique. On obtient ainsi, après purification, 12 mg de N6-[(6-(3-diméthylamino-propylamino)-4- diéthylamino-[1 ,3,5]triazin-2-yl]-2-méthyl-quinoline-4,6-diamine, dont les caractéristiques sont les suivantes :
- spectre de masse (DAD-TIC) = 423 (MH+)
- temps de rétention = 0,79 mn (les temps de rétention sont obtenus sur Colonne hypersil C18 5 μm 50 mm diamètre 4.6 mm marque Purity Elite en éluant avec un mélange de solvants A (H2O/TFA 0.05 %) et B (ACN/TFA 0.05 %) avec un gradiant linéaire allant de 95 % A/5 % B (t = 0 mn) à 10 % A/90 % B à t= 3,5 mn puis palier 2 mn).
Les exemples 2-1 à 2-2 ont été obtenus en opérant comme ci-dessus dans un réacteur Zymark STEM RS2050. Les structures, les diverses conditions opératoires utilisées et les caractéristiques des exemples 2-1 et 2-2 sont résumées dans le tableau ci-dessous :
Figure imgf000026_0001
Tableau de résultats biologiques
Figure imgf000027_0001

Claims

REVENDICATIONS
1 - Composés fixant la structure G-quadruplex des télomères caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale suivante : cycle aromatique azoté - NR3 - répartiteur - NR'3 - chaîne hydrocarbonée non aromatique dans laquelle
• le cycle aromatique azoté, représente : o une quinoléine éventuellement substituée par au moins o un groupe N(Ra)(Rb) dans lequel Ra et Rb, identiques ou différents représentent l'hydrogène ou un radical alkyle en C1-C4 ou o un groupe ORa dans lequel Ra est défini comme précédemment o une quinoléine possédant un atome d'azote sous forme quaternaire ou o une benzamidine ou o une pyridine
• R3 et R'3, identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre l'hydrogène ou un radical alkyle en C1-C4
• le répartiteur représente :
0 un groupe triazine éventuellement substitué par un radical alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, un radical thio, oxy ou amino eux même éventuellement substitués par un ou plusieurs chaînes alkyle à chaîne courte contenant 1 à 4 atomes de carbone ou un atome d'halogène ou
0 un groupe carbonyle ou
0 un groupe C(=NH)-NH-C(=NH) ou 0 un groupe alkylediyle contenant 3 à 7 atomes de carbone ou
0 un groupe diazine éventuellement substitué par les mêmes groupes que la triazine ou un de ses sels.
2 - Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce que le répartiteur est choisi parmi les groupes triazine ou diazine.
3 - Composés selon la revendication 2 caractérisés en ce que les groupes diazines sont des pyrimidines ou des quinazolines.
4 - Composés selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que la chaîne hydrocarbonée non aromatique est choisie parmi les chaîne alkyle (C1-C4), alkényle (C2-C4), linéaires ou ramifiées, cycloalkyle (C3-C18), cycloalkényle (C3-C18), hétérocycloalkyle (C3-C18) incluant éventuellement l'atome d'azote du groupe NR'3.
5 - Composés selon la revendication 4 caractérisés en ce que la chaîne hydrocarbonée non aromatique est éventuellement substituée par un ou plusieurs atomes ou radicaux choisis parmi les atomes d'halogène, les radicaux hydroxy, aryle, hétéroaryle, alkyloxy, aryloxy, thio, alkylthio, arylthio, amino, alkylamino et/ou arylamino, dialkylamino, diarylamino, amidino, guanidino, alkylcarbonylamino, ou arylcarbonylamino, carboxyle, alkyloxycarbonyle ou aryloxycarbonyle, aminocarbonyle ; alkylaminocarbonyle et/ou arylaminocarbonyle, dialkylaminocarbonyle, alkylcarbonyl ou arylcarbonyl, cyano et trifluorométhyle.
6 - Composés selon la revendication 5 caractérisés en ce que les chaînes alkyle des substituants éventuels de la chaîne hydrocarbonée contiennent 1 à 4 atomes de carbone et les groupes aryles des substituants éventuels de la chaîne hydrocarbonée contiennent 5 à 18 atomes de carbone.
7 - Composés selon la revendication 4 caractérisés en ce que parmi les chaînes hydrocarbonées on préfère les chaînes alkyle contenant 2 à 3 atomes de carbone, les chaînes heterocycloalkyles ou cycloalkyles contenant 5 à 7 atomes de carbone.
8 - Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (I) ci-dessous :
Figure imgf000030_0001
dans laquelle :
- A représente
• un groupe amino de formule NR1 R2 dans lequel R1 et R2 identiques ou différents représentent l'hydrogène ou un groupe alkyle droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone ou
• un groupe OR1 ou SR1 dans lequel R1 a la même signification que précédemment ou
• un groupe alkyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou ou un groupe trifluorométhyle ou
• un atome d'hydrogène ou
• un atome d'halogène choisi parmi le fluor, le chlore, le brome ou l'iode
- R3 et R'3, identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre l'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C4
- Ar, représente
• le cycle aromatique azoté, représente : o une quinoléine éventuellement substituée par au moins o un groupe N(Ra)(Rb) dans lequel Ra et Rb, identiques ou différents représentent l'hydrogène ou un radical alkyle en C1-C4 ou o un groupe ORa dans lequel Ra est défini comme précédemment o une quinoléine possédant un atome d'azote sous forme quaternaire ou o une benzamidine ou o une pyridine attachée en position -4 ou fusionnée avec un groupe aryle ou hétéroaryle éventuellement substituée par un groupe alkyle en C1-C4
- alk représente une chaîne hydrocarbonée, éventuellement substituée, non aromatique choisie parmi les chaîne alkyle (C1-C4), alkényle (C2-C4), linéaires ou ramifiées, cycloalkyle (C3-C18), cycloalkényle (C3-C18), hétérocycloalkyle (C3-C18) incluant éventuellement l'atome d'azote du groupe NR'3 ou un de ses sels.
9 - Composés selon la revendication 8 caractérisés en ce que la chaîne hydrocarbonée non aromatique est éventuellement substituée par un ou plusieurs atomes ou radicaux choisis parmi les atomes d'halogène, les radicaux hydroxy, aryle, hétéroaryle, alkyloxy, aryloxy, thio, alkylthio, arylthio, amino, alkylamino et/ou arylamino, dialkylamino, diarylamino, amidino, guanidino, alkylcarbonylamino, ou arylcarbonylamino, carboxyle, alkyloxycarbonyle ou aryloxycarbonyle, aminocarbonyle ; alkylaminocarbonyle et/ou arylaminocarbonyle, dialkylaminocarbonyle, alkylcarbonyl ou arylcarbonyl, cyano et trifluorométhyle.
10 - Composés selon la revendication 8 caractérisés en ce que A représente un groupe choisi parmi les groupes suivants : 4-amino- ou 4- méthylamino- ou 4-diméthylamino- quinolyl ou quinolinium dont le noyau quinolinium est éventuellement substitué par un goupe méthyle.
11 - Composés selon la revendication 8 caractérisé en ce que les groupes A représentent le radical thiomethyl, amino, alkylamino ou dialkylamino radicaux dans lesquels les groupes alkyle possèdent 1 à 4 atomes de carbone. 12 - Composés selon la revendication 8 caractérisés en ce que A représente un groupe méthylthio.
13 - Composés selon la revendication 8 caractérisés en ce que alk représente un motif alkyle contenant 2 à 3 atomes de carbone linéaire ou ramifié substitué par un radical amino, alkylamino et/ou arylamino, dialkylamino, diarylamino, un motif alkényle contenant 2 à 3 atomes de carbone, substitué par un radical amino, alkylamino et/ou arylamino, dialkylamino ou diarylamino, ou un motif hétérocyclyle contenant de 4 à 7 atomes de carbone
14 - Composés selon la revendication 8 caractérisés en ce que alk représente une chaîne 2-(dialkyIamino)éthyl, 3-(dialkylamino)propyl, 2-(N- alkyl-N-arylamino)éthyl ou 3-(N-alkyl-N-arylamino)propyl dans lesquels les groupes alkyle contiennent 1 à 4 atomes de carbone et les groupes aryle contiennent 5 à 18 atomes de carbone.
15 - Composés selon la revendication 8 caractérisés en ce que alk représente une chaîne 2-(N-m.tolyl-N-éthyl-amino)éthyl.
16 - Composés de la revendication 1 pour une utilisation comme agent inhibiteur des télomérases.
17- Composés selon l'une quelconque des revendications précédentes pour une utilisation anticancéreuse.
18 - Composés nouveaux répondant à la formule (I) suivante :
Figure imgf000032_0001
dans laquelle : - A représente un groupe amino de formule NR1 R2 dans lequel R1 et R2 identiques ou différents représentent un groupe alkyle droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone ou un groupe OR1 ou SR1 dans lequel R1 représente l'hydrogène ou a la même signification que précédemment ou
• un groupe alkyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou un groupe trifluorométhyle ou
• un atome d'hydrogène ou « un atome d'halogène choisi parmi le fluor, le chlore, le brome ou l'iode
- R3 et R'3, identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C4
- Ar, représente o une quinoléine éventuellement substituée par au moins o un groupe N(Ra)(Rb) dans lequel Ra et Rb, identiques ou différents représentent l'hydrogène ou un radical alkyle en C1-C4 ou o un groupe ORa dans lequel Ra est défini comme précédemment o une quinoléine possédant un atome d'azote sous forme quaternaire ou o une benzamidine ou o une pyridine attachée en position -4 ou fusionnée avec un groupe aryle ou hétéroaryle éventuellement substituée par un groupe alkyle en C1-C4
- alk représente une chaîne hydrocarbonée, éventuellement substituée, non aromatique, choisie parmi les chaîne alkyle (C1-C4), alkényle (C2-C4), linéaires ou ramifiées, cycloalkyle (C3-C18), cycloalkényle (C3-C18), hétérocycloalkyle (C3-C18) incluant éventuellement l'atome d'azote du groupe NR'3 ou un de ses sels.
19 - Composés selon la revendication 18 caractérisés en ce que la chaîne hydrocarbonée non aromatique est éventuellement substituée par un ou plusieurs atomes ou radicaux choisis parmi les atomes d'halogène, les radicaux hydroxy, aryle, hétéroaryle, alkyloxy, aryloxy, thio, alkylthio, arylthio, amino, alkylamino et/ou arylamino, dialkylamino, diarylamino, amidino, guanidino, alkylcarbonylamino, ou arylcarbonylamino, carboxyle, alkyloxycarbonyle ou aryloxycarbonyle, aminocarbonyle , alkylaminocarbonyle et/ou arylaminocarbonyle, dialkylaminocarbonyle, alkylcarbonyl ou arylcarbonyl, cyano et trifluorométhyle.
20 - Composés selon la revendication 18 caractérisés en ce que Ar, représente un groupe choisi parmi les groupes suivants : 4-amino- ou 4-méthylamino- ou 4-diméthylamino-quinolyl ou quinolinium dont le noyau quinolinium est éventuellement substitué par un groupe méthyle.
21 - Composés selon la revendication 18 caractérisé en ce que les groupes A représentent le radical thiomethyl, amino, alkylamino ou dialkylamino radicaux dans lesquels les groupes alkyle possèdent 1 à 4 atomes de carbone.
22 - Composés selon la revendication 18 caractérisés en ce que R1 et R2 représentent l'hydrogène.
23 - Composés selon la revendication 21 caractérisés en ce que A représente un groupe méthylthio.
24 - Composés selon la revendication 18 caractérisés en ce que alk représente un motif alkyle contenant 2 à 3 atomes de carbone linéaire ou ramifié substitué par un radical amino, alkylamino et/ou arylamino, dialkylamino, diarylamino, un motif alkényle contenant 2 à 3 atomes de carbone, substitué par un radical amino, alkylamino et/ou arylamino, dialkylamino, diarylamino, ou un motif heterocyclyle contenant de 4 à 7 atomes de carbone 25 - Composés selon la revendication 18 caractérisés en ce que alk représente une chaîne 2-(dialkylamino)éthyl, 3-(dialkylamino)propyl, 2-(N- alkyl-N-arylamino)éthyl ou 3-(N-alkyl-N-arylamino)propyl dans lesquels les groupes alkyle contiennent 1 à 4 atomes de carbone et les groupes aryle contiennent 5 à 18 atomes de carbone.
26 - Composés selon la revendication 24 caractérisés en ce que alk représente une chaîne 2-(N-m.tolyl-N-éthyl-amino)éthyl.
27 - Utilisation des composés de la revendication 18 comme produit pharmaceutique à usage humain.
28 - Associations thérapeutiques constituées d'un composé selon la revendication 1 et d'un autre composé anticancéreux.
29 - Associations selon la revendication 28 caractérisées en ce que le composé anticancéreux est choisi parmi les agents alkylants, les dérivés du platine, les agents antibiotiques, les agents antimicrotubules, les anthracyclines, les topoisomérases des groupes I et II, les fluoropyrimidines, les analogues de cytidine, les analogues d'adénosine, les enzymes et composés divers tels que la L-asparaginase, l'hydroxyurée, l'acide trans- rétinoique, la suramine, l'irinotecan, le topotecan, la dexrazoxane, l'amifostine, l'herceptin ainsi que les hormones oetrogéniques, androgéniques.
30 - Association thérapeutique constituée d'un composé selon la revendication 1 et de radiations.
31 - Associations selon l'une quelconque des revendications 29 à 30 caractérisées en ce que chacun des composés ou des traitements est administré simultanément, séparément ou séquentiellement.
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