DERIVADOS QUÍMICOS Y SU APLICACIÓN COMO AGENTE ANTITELOMERASA
La presente invención se refiere a la terapia del cáncer y se refiere a agentes anti-cáncer novedosos que tienen un mecanismo de acción muy particular. Se refiere también a nuevos compuestos químicos así como a su aplicación terapéutica en el hombre. La presente invención se refiere a la utilización de nuevos compuestos químicos no nucleotídicos que interactúan con estructuras específicas del ácido desoxiribonucleico (ADN) . Estos nuevos compuestos están formados por un agente repartidor ligado a un grupo aminoaromático. Estos nuevos compuestos son útiles para el tratamiento de cánceres y actúan en particular como agentes inhibidores de la telomerasa. Son especialmente útiles para estabilizar el ADN en estructura de cuadruplex de G (tétradas de guaninas) . La aplicación terapéutica de la inhibición de la telomerasa a través de la estabilización de estos cuadruplexes de G es la detención de la mitosis celular y la muerte de las células que se dividen rápidamente tales como las células cancerosas y eventualmente la inducción de la senescencia de las células cancerosas . Los compuestos de la presente invención presentan la ventaja desde una perspectiva terapéutica de bloquear la telomerasa. Desde una perspectiva biológica, la telomerasa permite agregar secuencias de ADN repetidas de tipo TTAGGG, que se conocen como secuencias teloméricas, en el extremo del telómero, durante la división celular. A través de esta acción, la telomerasa hace que la célula sea inmortal. De hecho, en ausencia de esta actividad enzimática, la célula pierde en cada división de 100 a 150 bases, lo que la vuelve rápidamente senescente. Durante la aparición de células cancerosas de división rápida, se observó que estas células presentaban telómeros mantenidos a una longitud estable en el transcurso de la división celular. En estas células cancerosas, se observó que la telomerasa era fuertemente activada y que permitía la adición de motivos repetidos de secuencias teloméricas al final del telómero y permitían por consiguiente la conservación de la longitud del telómero en las células cancerosas. Se ha observado desde hace algún tiempo que más del 85% de las células cancerosas presentaban resultados positivos en cuando a la presencia de telomerasa mientras que las células somáticas no presentaban esta característica. Por consiguiente, la telomerasa es un objetivo muy codiciado para tratar las células cancerosas. El primer enfoque evidente para bloquear la telomerasa ha sido la utilización de estructuras nucleotídicas (Chen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93(7), 2635-2639). Entre los compuestos no nucleótidos utilizados en la técnica anterior podemos mencionar las diaminoantraquinonas (Sun y colaboradores, J.
Med. Chem. 40(14), 2113-6) o bien las dietiloxadicarbocianinas (Wheelhouse R.T. y colaboradores, J. Rm. Chem. Soc. 1998 (120) 3261-2) . La patente WO 99/40087 describe la utilización de compuestos que interactúan con las estructuras de cuadruplexes de G que consisten de perilenos y carbocianinas que contienen por lo menos siete ciclos entre los cuales dos heterociclos . Se observó de manera totalmente sorprendente que estructuras sencillas permitían obtener un resultado por lo menos equivalente con estructuras mucho menos complicadas desde una perspectiva química. Los compuestos de la presente invención que responden al objetivo contemplado, es decir que fijan la estructura de cuadruplex de G y por este hecho presentan una actividad inhibidora de las telomerasas responden a la fórmula general siguiente: Ciclo aromático nitrogenado - R3 - repartidor - NR' 3 -cadena hidrocarbonada no aromática en donde • el ciclo aromático nitrogenado representa: o una quinoleína eventualmente sustituida al menos por ¦ un grupo N (Ra) (Rb) en donde Ra y Rb, idénticos o diferentes, representan hidrógeno o un radical alquilo C1-C4 o bien ¦ un grupo ORa en donde Ra es definido como arriba o una quinoleina que posee un átomo de nitrógeno bajo forma cuaternaria o o una benzamidina o o una piridina • R3 y R'3, idénticos o diferentes, representan independientemente entre ellos, hidrógeno o un radical alquilo C1-C4 • el repartidor representa: 0 un grupo triazina eventualmente sustituido por un radical alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, un radical tio, oxi o amino ellos mismos eventualmente sustituidos por una o varias cadenas alquilo de cadena corta que contiene de 1 a 4 átomos de carbono o también por un átomo de halógeno o bien 0 un grupo carbonilo o bien 0 un grupo C (=NH) - H-C (=NH) o bien 0 un grupo alquildiilo que contiene de 3 a 7 átomos de carbono o bien 0 un grupo diazina eventualmente sustituido por los mismos grupos que la triazina o bien una de sus sales. Dentro del marco de la fórmula antes mencionada por cadena hidrocarbonada no aromática se entiende una cadena alquilo (C1-C4) , alquenilo (C2-C4) , lineal o ramificada, cicloalquilo (C3-C18) , cicloalquenilo (C3-C18) , heterocicloalquilo (C3-C18) . El grupo heterocicloalquilo incluye eventualmente el átomo de nitrógeno-Es evidente que la cadena hidrocarbonada no aromática puede estar eventualmente sustituida por uno o varios átomos o radicales seleccionados entre átomos de halógeno, radicales hidroxi, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, tío, alquiltio, ariltio, amino, alquilamino y/o arilamino, dialquilamino, diarilamino, amidino, guanidino, alquilcarbonilamino o bien arilcarbonilamino, carboxilo, alquiloxicarbonilo o ariloxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo y/o arilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquilcarbonilo o arilcarbonilo, ciano y trifluorometilo. Las cadenas alquilo de los sustituyentes eventuales de la cadena hidrocarbonada contienen de preferencia de 1 a 4 átomos de carbono y los grupos arilo de los sustituyentes eventuales de la cadena hidrocarbonada contienen de preferencia de 5 a 18 átomos de carbono - Dentro del conjunto de los compuestos antes mencionados se prefiere utilizar los compuestos que contienen como repartidor un grupo triazina o diazina. Entre los grupos diazina, se prefiere utilizar las pirimidinas o las guinazolinas . Entre las cadenas hidrocarbonadas se prefiere las cadenas alquilo que contienen de 2 a 3 átomos de carbono, las cadenás heterocicloalquilo o cicloalquilos que contienen de 4 a 7 átomos de carbono. Entre las triazinas, se prefiere los compuestos que corresponden a la fórmula (I) abajo:
L donde : A representa un grupo amino de fórmula NR1R2 en donde Rl y R2, idénticos o diferentes, representan hidrógeno o un grupo alquilo recto o ramificado que contiene de 1 a 4 átomos de carbono o un grupo ORI o SR1 en donde Rl tiene el mismo significado que arriba o bien un grupo alquilo que contiene de 1 a 4 átomos de carbono o un grupo trifluorometilo o bien un grupo hidrógeno o bien un grupo, halógeno seleccionado entre flúor, cloro, bromo o yodo R3 y R' 3, idénticos o diferentes, representan, independientemente entre ellos, hidrógeno o un radical alquilo C1-C . ??? representa: el ciclo aromático nitrogenado, representa: o una quinoleina eventualmente sustituida por al menos ¦ un grupo N(Ra) (Rb) en donde Ra y Rb, idénticos o diferentes, representan hidrógeno, o un radical alquilo C1-C4 o bien ¦ un grupo ORa en donde Ra es de conformidad con lo definido arriba o una quinoleina que posee un átomo de nitrógeno bajo forma cuaternaria o bien o una benzamidina o bien o una piridina unida en posición -4 o fusionada con un grupo arilo o heteroarilo eventualmente sustituido por un grupo alquilo C1-C4 alk representa o un motivo alquilo que contiene dos a tres átomos de carbono lineal o ramificado sustituido por un radical amino, alquilamino y/o arilamino, dialquilamino o diarilamino o un motivo alquenilo que contiene 2 a 3 átomos de carbono. sustituido por un radical auno, alquilamino y/o arilamino, dialqui1amino o diarilamino o un motivo heterociclilo que contiene de 4 a 7 átomos de carbono o una de sus sales. Es evidente que los motivos quinoleina pueden estar sustituidos por cualquier otro grupo que no intervenga en la aplicación contemplada, asi como grupos acridinas o isoquinoleinas o quinazolina o quinoxalinas o ftalazinas o benzotiazinas o benzoxazinas o fenoxazinas o fenotiazinas están incluidos en la definición de los grupos quinoleinas. Entre los compuestos de la fórmula (I) arriba se prefieren los compuestos que contienen un heterociclo seleccionado entre los grupos 4-aminoquinolilo, 4-alquil- o 4-dialquilamino-quinolilo, 4-aminoquinolinio o quinolinio cuyo núcleo quinolinio está eventualmente sustituido por un grupo metilo. En cuanto a los grupos A, representan de preferencia el radical metiltio, amino, alquilamino o dialquilamino en donde los grupos alquilo poseen de 1 a 4 átomos de carbono. En cuando a la cadena hidrocarbonada no aromática, representa de preferencia una cadena 2- (dialquilamino) etilo, 3-(dialquilamino) propilo, 2- (N-alquilo-N-arilamino) etilo o 3- (N-alquil-N-arilamino) propilo en donde los grupos alquilo contienen de preferencia de 1 a 4 átomos de carbono, con preferencia aún mayor de 1 a 2_ átomos de carbono y los grupos arilo contienen de preferencia de 5 a 18 átomos de carbono y con mayor preferencia 6 átomos de carbono. Otro objeto de la presente invención se refiere a los compuestos de la fórmula (I) como productos químicos nuevos. Se refiere por consiguiente a productos nuevos que responden a la fórmula (I) siguiente:
en donde: - A representa « un grupo amino de fórmula NR1R2 en donde Rl y R2 idénticos o diferentes, representan un grupo alquilo recto o ramificado que contiene de 1 a 4 átomos carbono o bien • un grupo ORI o SR1 en donde Rl representa hidrógeno o tiene el mismo significado que arriba o bien • un grupo alquilo que contiene de 1 a 4 átomos de carbono o un grupo trifluorometilo o bien · • un átomo de hidrógeno o bien • un átomo de halógeno seleccionado entre flúor, cloro, bromo o yodo R3 y R'3f idénticos o diferentes, representan independientemente entre ellos un átomos de hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4 - Ari representa: • el ciclo aromático nitrogenado, representa: o una quinoleinas eventualmente sustituida por al menos ¦ un grupo N(Ra) (Rb) en donde Ra y Rb, idénticos o diferentes representan hidrógeno o un radical alquilo C1-C4 o bien
¦ un grupo ORI en donde Rl es definido como arriba o una guinoleina que posee un átomo de nitrógeno bajo forma cuaternaria o bien o una benzamida o bien o una piridina unida en posición -4 o fusionada con un grupo arilo o heteroarilo eventualmente sustituida por un grupo alquilo C1-C4 alk representa o un motivo alquilo que contiene de 2 a 3 átomos de carbono lineal o ramificado sustituido por un radical amino, alquilamino y/o arilamino, dialquilamino o diarilamino o un motivo alquenilo que contiene 2 a 3 átomos de carbono, sustituido por un radical amino, alquilamino y/o arilamino, dialquilamino o diarilamino o un motivo heterociclo que contiene de 5 a 7 átomos de carbono o una de sus sales. Los compuestos de la fórmula (I) que se prefieren son los compuestos para los cuales ?t? representa un grupo seleccionado dentro de los archivos siguientes: 4-amino- ó 4-metilamino- ó 4-dimetilamino-quinolilo o quinolinio cuyo núcleo de quinolinio está eventualmente sustituido por un grupo metilo. Los compuestos de la fórmula general (I) que se prefieren son los compuestos para los cuales A representa un grupo amino o dimetilamino o con mayor preferencia metiltio. Compuestos de la fórmula general (I) preferidos son los compuestos para los cuales la cadena hidrocarbonada no aromática representa una cadena 2- (dialquilamino) etilo, 3-(dialquilamino) ropilo, 2- (N-alquil-N-arilamino) etilo, o bien 3- (N-alquil-N-arilamino) propilo para los cuales los grupos alquilo contienen de a 4 átomos de carbono, especialmente 1 a 2 átomos de carbono y los grupos arilo contienen de 5 18 átomos de carbono, especialmente 6 átomos de carbono.
Se prefiere particularmente los compuestos de la fórmula general (I) para los cuales la cadena hidrocarbonada no aromática representa una cadena 2- (N-alquil-N-arilamino) etilo tal como la cadena 2- (N-m. tolil-N-etil-amino) etilo . Otro objeto de la presente invención se refiere a la utilización de compuestos de la fórmula (I) como producto farmacéutico para uso humano. Los procedimientos de preparación de los compuestos en la fórmula (I)
se describen a continuación. En el caso en el cuál Ari y Alk están presentes, la triazina de la - fórmula general (A) puede ser obtenida por desplazamiento secuencial de los átomos de halógeno, muy generalmente de los átomos de cloro, de los productos de la fórmula general (B) por las aminas ra y después Alk de la fórmula general (C) de conformidad con el esquema 1:
X = Cl (C)
(A)
Esquema 1 En general, se ópera con 1 mol de dihalógeno-s-triazina, o bien trihalógeno-s-triazina y 1 mol de amina Ari . Se prefiere operar en un solvente inerte, por ejemplo acetona eventualmente acuoso o un alcohol eventualmente acuoso, por ejemplo etanol o un solvente halogenado, por ejemplo diclorometano, o un éter, por ejemplo óxido de dietilo o dioxano, o un solvente aprótico polar, por ejemplo DMF, DMSO ó MP. De conformidad con una modalidad preferida de la invención, se opera a una temperatura comprendida entre 20° C y 50° C. Después se agregan 1 mol de amina Alk al producto de la fórmula general (D) , que puede eventualmente aislarse. Se opera especialmente a una temperatura comprendida entre 50° C y temperatura de reflujo. De manera provechosa/ se puede operar en las condiciones descritas en J. Fluor. Chem. , 1988, 39(1), 117-123. Método general 2 De conformidad con un segundo método, los productos de la fórmula general (A) en los cuales Ar son definidos como arriba y R representa un grupo R1R2 ó ORI ó SR1 pueden también prepararse a través de desplazamiento nucleofilico de un átomo de halógeno, generalmente un átomo de cloro, de un producto de la fórmula general (A) , en donde R representa un átomo de halógeno de conformidad con el esquema 2:
(A) (A) R = Cl (ó F ó Br ó 1) R = NRiR2 ó ORi ó SRi
Esquema 2 Se opera generalmente condensado 1 mol del compuesto de la fórmula general (£.) en donde R representa un átomo de halógeno, de preferencia un átomo de cloro, con 1 mol de amina R1R2 H o alcoolato RIO" o de tioalcoolato R1S. La reacción se lleva a cabo en un medio inerte en las condiciones de la reacción. Podemos mencionar entre los solventes inertes acetona, eventualmente acuosa o un alcohol eventualmente acuoso como etanol, o un solvente halogenado, por ejemplo diclorometano, o un éter, por ejemplo óxido de dietilo o dioxano, o un solvente aprótico polar, por ejemplo DMF, DMSO ó NMP. Cuando el grupo que entra representa un grupo R1R2 H, se opera de preferencia a una temperatura comprendida entre 20° C y la temperatura de reflujo, en presencia especialmente de una base orgánica, por ejemplo trietilamina, o mineral, por ejemplo sosa o carbonato de sodio o de potasio. Es también posible no utilizar base durante la reacción aminación, y aislar un clorohidrato del producto de la fórmula general (A) , cuya base pueden ser entonces liberada. Cuando el grupo que entra representa un grupo RIO" o bien R1S", se opera de preferencia con un alcoolato o un tioalcoolato alcalino o alcalino térreo, por ejemplo una sal de sodio o de potasio o de litio o de amonio o de cesio o de bario, en un solvente aprótico polar, por ejemplo DMF o DMSO o NMP, a una temperatura comprendida entre 50° C y la temperatura de reflujo. Método general 3 De conformidad con un tercer procedimiento de preparación, los compuestos para los cuales R representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, ramificado que contiene de 1 a 4 átomos de carbono, pueden también prepararse por condensación de una biguanida de fórmula general (E) , con un derivado de ácido, de preferencia un cloruro de ácido o un éster de metilo de fórmula general (F) de conformidad con el esquema 3:
(E) (F) (A)
Esquema 3 La condensación entre la biguanida de fórmula general (E) y el derivado de ácido de fórmula general (F) se efectúa generalmente en un alcohol, por ejemplo metanol o etanol. SE prefiere operar a una temperatura comprendida entre 0o C y la temperatura de reflujo. Las biguanidas de fórmula general (E) simétricos o asimétricos, pueden ser obtenidos operando en las condiciones descritas en la literatura y especialmente de conformidad con la patente J.P. 94-4993. Método general 4 Se contempla que las s-triazinas de fórmula general pueden ser obtenidas bajo forma de bibliotecas, aplicando los métodos descritos en los esquemas 1, 2, 3 en química paralela y/o de combinación en fase liquida o en fase sólida, entendiéndose que cuando se trabaja en fase sólida, cualquiera de los reactivos se fija previamente sobre un soporte sólido, seleccionado en función de la reacción química en juego, y que dicha reacción química es seguida por una operación de disociación del producto de la reacción del soporte sólido. La presente invención se refiere también a las composiciones terapéuticas que contienen un compuesto de conformidad con la presente invención, en asociación con un soporte farmacéuticamente aceptable según el modo de administración seleccionado. La composición farmacéutica puede estar presente en forma sólida, líquida o de liposomas. Entra las composiciones sólidas podemos mencionar polvos, cápsulas, comprimidos. Entre las formas orales podemos mencionar también las formas sólidas protegidas con relación al medio ácido del estómago. Los soportes utilizados para las formas sólidas son constituidos especialmente por soportes minerales tales como fosfatos, carbonatos o por soportes orgánicos tales como lactosa, celulosas, almidón o polímeros.
Las formas líquidas consisten de soluciones, suspensiones o dispersiones. Contienen como soporte de dispersión ya sea agua, ya sea un solvente orgánico (etanol, NMP u otros) o mezclas de agentes tensoactivos y de solventes o de agentes que forman complejos y de solventes. La dosis administrada de los compuestos de la invención será adaptada por el médico en función en de la vía de administración del paciente y del estado de éste último. Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados solos o bien en mezcla con otros agentes anticáncer. Entre las asociaciones posibles podemos mencionar • los agentes alquilantes y especialmente la ciclofosfamida, el melfalano, la ifosfamida, el clorambucilo, el busulfano, la tiotepa, la prednimustina, la carmustina, la lomustina , la semustina, la estreptozotocina, la decarbazina, la temozolomida, la procarbazina y la hexametilmelamina • los derivados del platino especialmente cisplatino, carboplatino u oxoplatino • los agentes antibióticos especialmente la bleomicina, mitomicina, dactinomicina, • los agentes antimicrotúbulos, especialmente la vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, los taxoides (paclitaxel y docetaxel) • las antraciclinas, especialmente la doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, epirubicina, mitoxantrona, losoxantrona • las topoisomerasas de los grupos I y II tales como el etopósido, tenipósido, amsacrina, irinotecano, topotecano y tomudex, • las fluoropirimidinas tales como 5-fluorouracilo, UFT, floxuridina, • los análogos de citidina tales como la 5-azacitidina, citarabina, gemcitabina, 6-mercaptomurina, 6- tioguanina • los análogos de la adenosina tales como la pentostatina, citarabina o fosfato de fludarabina • el metotrexato y el ácido folinico • las enzimas y compuestos diversos tales como L- asparaginasa, hidroxiurea, ácido trans-retinoico, suramina, dexrazoxano, amifostina, herceptina asi como las hormonas estrogénicas, androgénicas . Es también posible asociar a los compuestos de la presente invención un tratamiento por radiaciones. Estos tratamientos pueden ser administrados simultánea, separada o secuencialmente. El tratamiento será adaptado al enfermo a tratar por el médico. La actividad de estabilización de cuadruplexes de G puede ser determinada por un método que utiliza la formación de un complejo con la fluoresceina cuyo protocolo experimental se describe a continuación. Oligonucleótidos Todos los oligonucleótidos, modificados o no, han sido sintetizados por Eurogentec SA, Seraing, Bélgica. El oligo úcleotido FAM+DABCYL lleva la referencia de catálogo, OL-0371-0802. Posee la secuencia: GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG que corresponde a 3.5 repeticiones del motivo telomérico humano (hebra rica en G) . La fluoresceína está unida al extremo 5', el DABCYL al extremo 3' , a través de brazos químicos descritos por Eurogentec. La concentración de las muestras se verifica mediante espectrofotometria, registrando el espectro de absorbencia entre 220 y 700 nm y utilizando el coeficiente de extinción molar proporcionado por el fabricante . Tampones Todos los experimentos fueron realizados en un tampón de cacodilato de sodio 10 mM pH 7.6 que contenía cloruro de litio 0.1 M (o bien cloruro de sodio) . Se verificó previamente la ausencia de contaminación fluorescente en el tampón. El oligonucleótido fluorescente es agregado a una concentración final de 0.2 uM. Estudio de Fluorescencia Todas las mediciones de fluorescencia fueron efectuadas en un aparato Spex Fluorolog DM1B, utilizando un ancho de rayo de excitación de 1.8 nm y un ancho de raya de emisión de 4.5 nm. Las muestras se colocan en una cubeta de cuarzo micro de 0.2 x 1 cm. La temperatura de la muestra es controlada a través de un baño maria exterior. El oligonucleótido solo ha sido analizado a una temperatura de 20, 30, 40, 50, 60, 70 y 80°C. Los espectros de emisión se registran utilizando una longitud de onda de excitación de 470 nm. Los espectros de excitación se registran utilizando ya sea 515 nm o bien 588 nm como longitud de onda de emisión. Los espectros son corregidos de la respuesta del instrumento por unas curvas de referencia. Una extinción importante (80-90%) de la fluorescencia de la fluoresceina a temperatura ambiente se observa, de conformidad con un repliegue intramolecular del oligonucleótido a 20°C bajo la forma de un cuadruplex de G, lo que induce una yuxtaposición de sus extremos 5f y 3' , respectivamente, ligados a la fluoresceina y al DABCYL. Esta yuxtaposición provoca un fenómeno ya descrito de extinción de fluorescencia, utilizado por los "marcadores moleculares". Tm en fluorescencia: Una solución madre de oligonucleótido en la concentración en hebra de 0.2 uM en un tampón LiCl 0.1 M 10 mM cacodilato pH 7.6 se prepara previamente, se calienta brevemente a una temperatura de 90°C y se enfria lentamente a 20°C, y después se distribuye por alícuotas de 600 µ? en los recipientes de fluorescencia. Se agregan y mezclan entonces 3 µ? de agua (para el control) o bien 3 ul de producto a probar (solución madre a 200 uM, concentración final 1 uM), . Las muestras se dejan entonces incubar durante por lo menos 1 hora a una temperatura de 20°C antes de cada medición. La utilización de tiempos de incubación más largos (hasta 24 horas) no tienen ninguna influencia sobre el resultado obtenido. Cada experiencia no permite más que la medición de una sola muestra. Esta muestra es primero incubada a una temperatura inicial de 20°C, llevada a 80°C en 38 minutos, se deja durante 5 minutos a 80°C, y después se enfria a 20°C en 62 minutos. Durante este tiempo, la fluorescencia es medida simultáneamente en dos longitudes de onda de emisión (515 nm y 588 nm) utilizando 470 nm como longitud de onda de excitación. Se efectúa una medición cada 30 segundos. La temperatura de baño maria es registrada en paralelo, y el perfil de fluorescencia en función de la temperatura es reconstituido a partir de estos valores. Los perfiles de fluorescencia son después normalizados entre 20°C y 80°C, y la temperatura para la cual la intensidad de emisión a 515 nm es la media de las intensidades a alta y baja temperatura se conoce como Tm. En estas condiciones, la Tm de la muestra de referencia sin adición de producto es de 44°C en un tampón de cloruro de litio. Esta temperatura es llevada a más de 55°C en un tampón de cloruro de sodio. La adición de un compuesto que estabiliza el cuadruplex de G induce un incremento de la Tm. Este incremento es considerado significativo si es mayor a 3o.
La actividad biológica anti telomerasa es determinada a través del siguiente protocolo experimental: Preparación del extracto enriquecido en actividad telomerasa humana La linea de leucemia HL60 es obtenida ante la ATCC (American Type Culture Collection, Rockville EUA) . Las células son cultivadas en suspensión en medio RPMI 1640 que contiene, L-Glutamina a 2 mM, Penicilina 200 U/ml, estreptomicina 200 g/ml, gentamicina 50 pg/ml y acondicionado de 10% de suero fetal de becerro desactivado por calor. Una alícuota de 10a células es centrifugada a 3000xG y el sobrenadante desechado. El residuo de células es resuspendido a través de varios manejos con piquetas sucesivos en 200 µ? de ampón lisis que contiene CHAPS 0.5%, Tris-HCl pH 7,5 10 mM, MgCl2 ImM, EGTA 1 mM, ß-merca toetanol 5 mM, PMSF 0.1 mM y glicerol 10% y se conserva en hielo durante 30 minutos. El lisado es centrifugado a 16,000 xG durante 20 minutos a una temperatura de 4°C y se recupera 160 µ? de sobrenadante. La dosificación de las proteínas del extracto se efectúa a través del método Bradford. El extracto es conservado a una temperatura de -80°C. Dosificación de la actividad telomerasa La inhibición de la actividad telomerasa es determinada por un protocolo de extensión del oligonucleótido TS (5'AATCGTTCGAGCAGAGTT3') , en presencia de un extracto celular enriquecido en actividad telomerasa y de compuestos que son agregados a concentraciones diferentes (10, 1, 0.1 y 0.01 Ug/ml) . La reacción de extensión es seguida por amplificación por reacción en cadena de polimerasa de los productos de extensión gracias a los oligonucleótidos TS y CXext (S'GTGCCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA3' ) . El medio de la reacción es preparado de conformidad con la composición siguiente: Tris HC1 pH 8,3 20 mM MgC12 1,5 mM Tween 20 0,005% (P/V) EGTA 1 mM dATP 50 uM dGTP 50 µ? dCTP 50 uM dTTP 50 uM Oligonucleótido TS 2 pg/ml Oligonucleótido CXext 2 pg/ml Albúmina sérica bovina 0, 1 mg/ml Taq DNA polymerase 1 U/ml alfa 32P dCTP (3000 Ci/mmol) 0.5 µ? Extracto de telomerasa 200 ng en volumen de 10 µ?
Producto a probar con solvente en un volumen de 5 µ? Agua bi-destilada QS 50 µ? Los oligonucleótidos son obtenidos ante Eurognetec (Bélgica) y son conservados a una temperatura de -20°C a una concentración madre de 1 mg/ml en agua destilada. Las muestras de reacción son ensambladas en tubos para reacción en cadena de polimerasa de 0.2 mi y se coloca una gota de aceite de parafina en cada una de las reacciones del experimento antes de cerrar los tubos. Las muestras de reacción son incubadas después en un aparato para reacción en cadena de polimerasa de tipo Cetus 4800 de conformidad con las condiciones de temperatura siguientes: 15 minutos a 30°C, 1 minuto a 90°C, seguido por 30 ciclos de, 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 50°C, y 1 minuto 30 segundos a 72 °C, seguido por un ciclo final de 2 minutos a 72°C. Para cada una de las muestras, una alícuota de 10 µ? es colocada con pipeta debajo de la capa de aceite y mezclada con 5 µ? de un tampón de depósito que contiene: TBE 3X glicerol 32% (P/V) Azul de bromofenol 0.03% Xileno cianol 0.03% Las muestras son analizadas entonces por electroforesis en gel de acrilamida al 12% en un tampón de TBE IX durante 1 hora bajo una tensión de 200 volts, gracias a un sistema de electroforesis Nove . Los geles de acrilamidas son secados entonces en una hoja de papel Whatmann 3MM a 80°C durante 1 hora. El análisis y la cuantificación de los productos de la reacción se efectúan gracias a un aparato Instantlmager (Pacard) . Para cada concentración de compuesto probada, los resultados son expresados en porcentaje de inhibición de la reacción y son calculados a partir del control enzimático no tratado y de la muestra sin enzima (blanco) según la fórmula siguiente: (Valor compuesto - valor blanco/valor de control enzimático -valor blanco) x 100. La concentración de compuesto que induce una inhibición de 50% de la reacción de telomerasa (IC50) es determinada gracias a una representación gráfica semi logarítmica de los valores de inhibición obtenidos en función de cada una de las concentraciones de compuesto probada. Se considera que un compuesto es activo como agente anti telomerasa cuando la cantidad que inhibe el 50% de la reacción de telomerasa es notablemente inferior a 5 uM. La actividad biológica citotóxica en lineas de tumores humanos es determinada según el protocolo experimental siguiente: Las lineas de células humanas KB y A549 son originarias de ATCC (American Type Culture Collection, Rockville EUA) . Las células A549 son cultivadas en capa en frasco de cultivo en un medio RPMI 1640, L-glutamina a 2 mM, penicilina 200 U/ml, estreptomicina 200 µg/ml y se le agrega 10% de suero fetal de becerro desactivado por calor, las células KB son cultivadas en capas en frasco de cultivo en un medio de Dulbelco que contiene l-glutamina a 2 mM, penicilina 200 U/ml, estreptomicina 200 µg/ml y al cual se le agrega 10% de suero fetal de becerro desactivado por calor. Las células en fase exponenciales de crecimiento son tripsinadas, lavadas con PBS 1 X y son sembradas en micro placas de 96 pozos (Costar) a razón de 4 x 104 células/ml en el caso de A549 y de 1,5 x 104 células/ml (0.2 ml/pozo) y después incubadas durante 96 horas en presencia de concentraciones variables de producto a estudiar (10, 1, 0.1 y 0.01 um/ml, para cada punto por cuadruplicado. 16 horas antes del final de la incubación, se agrega 0.02% final de neutro rojo a cada pozo. Al final de la incubación, las células son lavadas con PBS 1C y Usadas por 1% de sulfato de laurilo de sodio. La incorporación celular de colorante, que refleja el crecimiento celular, es evaluada por espectrofotometria a una longitud de onda de 540 nm para cada muestra a través de un aparato de lectura Dynatech MR5000. Para cada concentración de compuesto probado, los resultados son expresados en porcentaje de inhibición del crecimiento celular y calculados a partir del control no tratado y del medio de cultivo sin células (blanco) según la fórmula siguiente : (Valor compuesto - valor blanco/valor de control de células -valor blanco) x 100. La concentración de compuesto que induce una inhibición del 50% del crecimiento (IC50) es determinada gracias a una representación gráfica semi logarítmica de los valores de inhibición obtenidos en función de cada una de las concentraciones de compuesto probado. Se considera que un compuesto es activo como agente citotóxico si la concentración inhibidora del 50% del crecimiento de las células tumorales probadas es notablemente inferior a 10 uM. Los ejemplos siguientes no limitativos se proporcionan para ilustrar la invención. EJEMPLO 1: Síntesis en paralelo de derivados sustituidos de N6- [6-amino-4-metilsulfanil- [1, 3, 5]triazin-2-il] -2-metil-quinolin-4, 6-diamina ^
Preparación de la N6- (6-cloro-4-metils lfanil- [1, 3, 5] triazin- 2-il) -2-metil-quinolin-4/ 6-diamina En un matraz de 1 litro, a una solución de 5 g (25 mmoles) de 2, 6-dicloro-6~metilsulfañil- [1, 3, 5] triacina, que puede prepararse de conformidad con J. Amer. Chem. Soc. 1945, 67, 662, en 400 mi de tetrahidrofurano, se agrega sucesivamente 4.4 g (25 mmoles) de 2-metil-quinolin-4, 6-diamina, que puede prepararse de conformidad con J. Med. Chem. 1992, 35, 252, y 2.8 g (25 mmoles) de carbonato de sodio. La mezcla de la reacción es calentada a reflujo durante 16 horas. Después de la evaporación de tetrahidrofurano, el residuo es recogido por 400 mi de una mezcla de agua y de diclorometano (50-50 en volúmenes) . La fase orgánica es decantada, secada en sulfato de sodio y concentrada en seco bajo presión reducida. Se obtiene entonces 7.5 g (88%) de N6- ( 6-cloro-4-metilsulfanil-triazin-2-il) -2-metil-quinolin-4, 6-diamina, en forma de un sólido amarillo pálido cuyas características son las siguientes : - punto de fusión = 29 °C - espectro de RM ¾ (300 MHz, (CD3) 2SO d6, d en ppm) : 2.43
(s: 3H) ; 2.52 (s: 3H) ; 6.47 (s: 1H) ; 6.61 (mf: 2H) ; 7.62 (d large, J = 9 Hz : 1H) ; 7.69 (d, J = 9 Hz : 1H) ; 8.32 (mf: 1H) ; 10.80 (mf: 1H) . Síntesis en paralelo de N6- [2-dimetilamino-etilamino) -4-metil-sulfañil- [1, 3, 5] triazin-2-il] -2-ntetil~quinolin-4, 6-diamina (ejemplo 1-1) En un reactor magnético calentado con condensador Zymark, de tipo STEM RS2050 que contiene 25 pozos en paralelo equipados, cada uno, por un tubo de vidrio de 50 mi, se introduce 50 mg (0.15 mmol) de N6- (6-amino-4-metilsulfanil- [1, 3, 5] triazin-2-il] -2-metilquinolin-4, 6-diamina. En el primer tubo (ejemplo 1-1) se agrega sucesivamente 5 mi de dioxano, 16 mg (0.15 mmol) de carbonato de sodio, 23 mg (0.15 mmol) de yoduro de sodio y 27 mg (0.3 mmol) de 2-dimetilamino-etilamina. El medio de la reacción es calentado en reflujo bajo una atmósfera de argón durante 24 horas. Después del enfriamiento, el contenido del tubo es evaporado bajo presión reducida, recogido en 5 mi de agua y 5 mi de acetato de etilo y filtrado. La fase orgánica es decantada, secada y concentrada bajo presión reducida. El producto bruto obtenido es entonces purificado por LC/MS utilizando una columna de sílice C18 Waters Xterra 3.5 uM, de un diámetro de 3 mm y de una longitud de 50 mm, eluyendo a través de un gradiente lineal de elusión constituido en el tiempo inicial (to = 0 mn) por agua que contiene ácido trifluoroacético al 0.05% y en el tiempo final (tf = 4 mn) por acetonitrilo que contiene 0.05% de ácido trifluoroacético . Se obtiene así, después de purificación, 58 mg de trifluoroacetato de N6- [ (6-)metil-quinolin-6-il-amino) -4-metiltio-triazin-2-il] -quinaldin-4, 6-diamina, cuyas características son las siguientes: - espectro de masa (DAD-TIC) =454 (MH+) - tiempo de retención = 2.69 mn (los tiempos de retención se obtienen en columnas Hypersil C18 5 µp? 50 MI, diámetro: 4.6 mm marca Purity Elite en eluyente con una mezcla de solventes A (H20/TFA 0.05 %) y B (ACN/TFA 0.05 %) con un gradiente lineal de 95% A/5% B(t = 0 mn) a 10% A/90% B a t = 3.5 mn y después meseta 2 mn) . Los ejemplos 1-1 a 1-26 fueron obtenidos operando de la manera indicada arriba en un reactor Zymark STEM RS2050. Las, estructuras, las diversas condiciones de operación utilizadas y las características de los ejemplos 1-1 a 1-26 se presentan de manera resumida en la tabla siguiente: Ejemplo Estructura Condiciones de la reacción AlkN(R' 3- Solvente calentamiento
1-1 dioxano 17 h./100°
1-2 dioxano 17 h./100°
1-3 dioxano 17 h./100° racémica trans 1-4 dioxano 3 j . /100o
1-5 dioxano 17 h./100°
1-6 dioxano 17 h./100°
1-7 dioxano 17 h./100°
racemica trans dioxano 2 j ./100o
-9 dioxano 24 h./100°
/ \ HN N- 10 ml/DMFl %
-10 dioxano 24 h./100° 10 -ml/DMFl % .
HN NH
1-11 dioxano 24 h./100°
1-12 dioxano 24 h./100° 10 ml/DMFl % ? NH
1-13 dioxano 24 h./100° 10 ml/DMFl % H
NH
1-14 dioxano 24 h./100°
1-15 aioxano ¿
-16 dioxano 24 h./100° 10 ml/DMFl % 1-17 dioxano 24 h./100°
1-1! dioxano 24 h./100°
dioxano 24 h./100°
1-20 dioxano 24 h./100°
-21 dioxano 24 h./100°
-22 dioxano 24 h./100° H 10 ml/DMFl % HO NH 1-23 dioxano 24 h./100° 10 ml/DMFl % H JH
1-24 dioxario 24 h./100°
1-25 dioxano 24 h./100°
1-26 h./100° Ejemplo Condiciones de Características reacción Masa Tiempo No. de mmoles de Retención de amina (mn) 1-1 0.3 384 2.69 1-2 0.3 410 2.91 1-3 0.15 411 2.86 1-4 0.45 422 , 2.85 1-5 0.15 396 2.84
1-6 0.15 424 2.79
1-7 0.15 410 2.72
1-8 0.3 452 2.81
1-9 0.3 425 2.43
1-10 0.3 410 2.51
1-11 0.3 424 2.50
1-12 0.3 398 2.46
1-13 0.3 398 2.48
1-14 0.3 412 2.47
1-15 0.3 384 2.48
1-16 0.3 396 2.49
1-17 0.3 511 2.38
1-18 0.3 459 2.62
1-19 0.3 410 2.44
1-20 0.3 410 2.52
1-21 0.3 422 2.55
1-22 0.3 400 2.36
1-23 0.3 384 2.40
1-24 0.3 440 2.58
1-25 0.3 410 2.48
1-26 0.3 474 2.86
Ejemplo 2: Síntesis en paralelo de derivados sustituidos
N6- [6-amino -4-dietilamino- [1,3,5] triazin-2-il] -2-metil-quinolin-4/ 6-diamina
Preparación de la N6- ( 6-cloro-4-dietilamino- [1, 3, 5] triazin-2- il) -2-iaetil-qpjinolin-4/ 6-diamina En un matraz de un litro, a una solución de 5 g (22.5 mmoles) de 2, 6-dicloro-4-dietilamino- [1, 3, 5] triazina comercial en 300 mi de tetrahidrofurano, se agrega sucesivamente 3.91 g (22.5 mmoles) de 2-metil-quinolin-4, 6-diamina, que puede prepararse de conformidad con J. Med. Chem. 1992, 35, 252, y 2.4 g (22.5 -mmoles) de carbonato de sodio. La mezcla de la reacción es calentada a reflujo durante 20 horas. Después de la evaporación del . tetrahidrofurano, el residuo es recogido en 400 mi de una mezcla de agua y de diclorometano (50-50 en volúmenes) . La fase orgánica es decantada, secada 'en sulfato de sodio y concentrada en seco bajo presión reducida. Se Obtienen entonces 7.4 g (92 %) de N6- ( 6-cloro-4-dietilamino- triazin-2-il) -2-metil-quinolin-4, 6-diamina, en forma de un sólido de color amarillo cuyas características son las siguientes: - punto de fusión = 120°C - espectro de RMN ^(300 MHz, (CD3)2SO d6, d en ppm) : 1.14 (mt: 6H) ; 2.42 (s: 3H) ; de 3.50 a 3.70 (mt: 4H) ; 6.47 (s y mf: 3H en su totalidad); 7.54 (d grande, J = 9Hz: 1H) ; 7.67 (dd, J = 9 y 2 Hz: 1H) ; 8.27 (mf: 1H) ; 10.09(mf: 1H) . Síntesis en paralelo de N6- [ ( 6- (3-dimetilamino-propilamino) -4-dietilamino- [1, 3, 5] triazin-2-il] -2-metil-quinolin-4/ 6-diamina (ejemplo 2-1) En un reactor magnético calentando con condensador Zymark, de tipo STEM RS2050 que contiene 25 pozos en paralelo equipados cada uno con un tubo de vidrio de 50 mi, se introducen 50 mg (0.13 mmol) de N6- (6-cloro-4-dietilamino- [1, 3, 5] triazin-2-il) -2-metil-quinolin-4, 6-diamina. En el primer tubo (ejemplo 2-1), se agrega sucesivamente 5 mi de DMF, 19 mg (0.14 mmol) de carbonato de potasio, 21 mg (0.14 mmol) de yoduro de sodio y 14 mg (0.14 mmol) de 3-dimetilamino-propilamina. El medio de la reacción es calentada a una temperatura de 120°C bajo una atmósfera de argón durante 16 horas. Después de enfriamiento, el contenido del tubo es evaporado bajo presión reducida, retomado en 5 mi de agua, filtrado y lavado con óxido de dietil. El producto bruto obtenido es entonces purificado con LC/MS utilizando una columna de sílice C18 Waters Xterra 3.5 µ?, de diámetro 3 mm y de longitud 50 mm, eluyendo a través de un gradiente lineal de elución que consiste en el tiempo inicial (t0 = 0 mn) por agua que contiene 0.05 % de ácido trifluoroacético y en el tiempo final (tf = 4 mn) por acetonitrilo que contiene 0.05 % de ácido trifluoroacético. Se obtiene así, después de purificación, 12 mg de N6- [ ( 6- (3-dimetilamino-propilamino) -4-dietilamino- [1,3,5] triazin-2-il] -2-metil quinolin-4, 6-diamina, cuyas características son las siguientes: - espectro de masa (DAD-TIC) = 423 (MH+) - tiempo de retención = 0.79mn (los tiempos de retención son obtenidos en columna Hypersil C18 5 50 mm diámetro 4.6 mn marca Purity Elite en eluyente con una mezcla de solventes A (H20/TFA 0.05 %) y B (ACN/TFA 0.05 %) con un gradiente lineal de 95 % A/5 % B(t = 0 mn) a 10 % a/90 % B a t = 3.5 mn y después meseta 2 mn) . Los ejemplos 2-1 a 2-2 han sido obtenidos operando de conformidad con lo indicado arriba en un reactor Zymark STEM RS2050. Las diversas condiciones de operación utilizadas y las características de los ejemplos 2-1 y 2-2 se presentan de manera resumida en la tabla siguiente: Ejemplo Estructura Condiciones de la reacción Alk (Resolvente calentamiento
2-1 DMF 16 h./120° 2-2 . DMF 16 h./120°
Ejemplo Condiciones de la Características reacción Masa Tiempo No . de inmoles MH+ de Retención de amina 2-1 0.14 423 0.79
2-2 0.14 421 ' 0.79 Tabla de resultados biológicos Ejemplo- TR7AP' ¦ G-4 Citotoxicidad telomerasa ATm ?549 IC50 µ? °C IC50 µ 1-1 0.79 6 1-2 0.5 5.6 7.5 1-3 4.4 3.1 1-4 0.1 5.6 1-5 _ 1.6 2.8 1-6 1.36 1-7 0.47 1-8 0.98 8.5 1-9 0.64 · 7 1-10 0.94 7 1-11 1.1 4.5 1-12 3.1 1-13 2.9 1-14 3.2 1-15 4.6 1-16 1.29 1-17 1.6 1-19 1 1-20 3.1 1-21 0.7 1-22 3.2 1-23 3.8 1-24 3.9 1-25 1.5 10
1- 26 0.86 33 <0.
2- 1 0.90 7.9 2-2 5.4 2.4