WO2002012194A1 - Derives de phenanthridine et leur application comme agents antitelomerases - Google Patents

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WO2002012194A1
WO2002012194A1 PCT/FR2001/002560 FR0102560W WO0212194A1 WO 2002012194 A1 WO2002012194 A1 WO 2002012194A1 FR 0102560 W FR0102560 W FR 0102560W WO 0212194 A1 WO0212194 A1 WO 0212194A1
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amino
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alkyl
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PCT/FR2001/002560
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Patrick Mailliet
Jean-François RIOU
Jean-Louis Mergny
Abdelazize Laoui
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Aventis Pharma S.A.
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    • C07D221/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D221/04—Ortho- or peri-condensed ring systems
    • C07D221/06—Ring systems of three rings
    • C07D221/10—Aza-phenanthrenes
    • C07D221/12—Phenanthridines

Definitions

  • the present invention relates to cancer therapy and relates to new anticancer agents having a very specific mechanism of action. It also relates to new chemical compounds as well as their therapeutic application in humans.
  • the present invention relates to the use of new non-nucleotide chemical compounds which interact with specific structures of deoxyribonucleic acid (DNA). These new compounds are made up of phenanthridine derivatives. These new compounds are useful in the treatment of cancer and act in particular as telomerase inhibiting agents. They are particularly useful for stabilizing DNA in a G-quadruplex structure (guanine tetrads).
  • the therapeutic application of telomerase inhibition via the stabilization of these G-quadruplexes is the arrest of cell mitosis and the death of rapidly dividing cells such as cancer cells and possibly the induction of cell senescence cancerous.
  • telomerase makes it possible to add repeated DNA sequences of the TTAGGG type, called telomeric sequences, at the end of the telomer, during cell division.
  • telomerase makes the cell immortal. In fact, in the absence of this enzymatic activity, the cell loses 100 to 150 bases each division, which makes it rapidly sinking. When rapidly dividing cancer cells appeared, these cells appeared to have telomeres maintained at a stable length during cell division.
  • telomerase was highly activated and that it allowed the addition of repeating motifs of telomeric sequences at the end of the telomer and therefore allowed the conservation of the length of the telomer in cancer cells. It has been shown for some time that more than 85% of cancer cells have positive tests for the presence of telomerase while somatic cells do not have this characteristic. Thus telomerase is a highly wished target for treating cancer cells.
  • the first obvious approach to blocking telomerase was the use of nucleotide structures (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (7), 2635-2639).
  • WO 99/40087 describes the use of compounds which interact with G-quadruplex structures which are perylenes and carbocyanines containing at least seven rings including two heterocycles.
  • A represents a basic nitrogen bond chosen from the amino, azo or hydrazo radicals
  • Ar represents a carbocyclic or heterocyclic mono or polycyclic aromatic radical containing 4 to 10 carbon atoms optionally substituted by one or more C1-C4 alkyl groups
  • n 0 or 1
  • R1 represents a C1-C4 alkyl radical
  • R2 represents hydrogen or a substituent chosen from C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 alkylthio, an amino group
  • R3 represents hydrogen or a substituent chosen from C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 alkylthio, an amino group
  • nitrogen heterocycles comprising one or more nitrogen atoms such as, for example, a pyridine or pyrimidine or pyrazine group.
  • nitrogen heterocycles comprising one or more nitrogen atoms such as, for example, a pyridine or pyrimidine or pyrazine group.
  • Particularly preferred are compounds containing in their general formula 7 nitrogen atoms.
  • Preferred among the compounds of the above formula are those for which R 2 represents hydrogen or an amino group.
  • R1 represents a methyl group or an ethyl group.
  • the present invention also relates, as new products, to the compounds of the following formula:
  • R1 represents a C1-C2 alkyl group
  • R2 represents hydrogen or an amino group
  • R3 represents hydrogen or an amino group
  • A represents an azo or hydrazo or amino group.
  • the new compounds are prepared by coupling a 3-benzamido-diazonium salt with a 7-amino-phenanthridinium salt, according to the scheme below.
  • the present invention also relates to therapeutic compositions containing a compound according to the invention, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier according to the mode of administration chosen.
  • the pharmaceutical composition can be in solid, liquid or liposome form.
  • solid compositions mention may be made of powders, capsules, tablets.
  • oral forms it is also possible to include the solid forms protected from the acid environment of the stomach.
  • the supports used for the solid forms consist in particular of mineral supports such as phosphates, carbonates or organic supports such as lactose, celluloses, starch or polymers.
  • Liquid forms are made up of solutions of suspensions or dispersions. They contain as dispersive support either water or an organic solvent (ethanol, NMP or others) or mixtures of surfactants and solvents or complexing agents and solvents.
  • the administered dose of the compounds of the invention will be adapted by the practitioner according to the route of administration of the patient and the state of the latter.
  • the compounds of the present invention can be administered alone or in admixture with other anticancer agents. Among the possible associations one can cite
  • alkylating agents and in particular cyclophosphamide, melphalan, ifosfamide, chlorambucil, busulfan, thiotepa, prednimustine, carmustine, lomustine, semustine, steptozotocine, decarbazine, temozolomide, procarbazine and l 'hexamethylmelamine
  • platinum derivatives such as cisplatin, carboplatin or oxaliplatin • antibiotic agents such as bleomycin, mitomycin, dactinomycin,
  • antimicrotubule agents such as vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine, taxoides (paclitaxel and docetaxel) • anthracyclines such as doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, epirubicin, mitoxantrone, los
  • topoisomerases such as etoposide, teniposide, amsacrine, irinotecan, topotecan and • fluoropyrimidines such as 5-fluorouracil, UFT, floxuridine, and tomudex • cytidine analogues such as 5-azacytidine, cytarabine, gemcitabine,
  • adenosine analogs such as 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, pentostatin, or fludarabine phosphate "methotrexate and folinic acid
  • the stabilization activity of the G-quadruplexes can be determined by a method using the formation of a complex with fluorescein, the experimental protocol of which is described below. They can thus be used as a fluorescent probe to determine the presence of
  • Oligonucleotides All the olignucleotides, modified or not, were synthesized by
  • the oligonucleotide FAM + DABCYL carries the catalog reference, OL-0371-0802. It has the sequence: GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG corresponding to 3.5 repeats of the human telomeric motif (strand rich in G). Fluorescein is attached to the 5 'end, DABCYL to the 3' end, by the chemical arms described by Eurogentec. The concentration of the samples is verified by spectrophotometry, recording the absorbance spectrum between 220 and 700 nm and using the molar extinction coefficient provided by the supplier.
  • Fluorescence study All the fluorescence measurements were carried out on a Spex Fluorolog DM1 B device, using an excitation line width of 1.8 nm and an emission line width of 4.5 nm.
  • the samples are placed in a 0.2 x 1 cm micro quartz cuvette. The temperature of the sample is controlled by an external water bath.
  • the oligonucleotide alone was analyzed at 20, 30, 40, 50, 60, 70 and 80 ° C.
  • the emission spectra are recorded using an excitation wavelength of 470 nm.
  • the excitation spectra are recorded using either 515 nm or 588 nm as the emission wavelength.
  • the spectra are corrected for the response of the instrument by reference curves.
  • a stock solution of oligonucleotide at the strand concentration of 0.2 ⁇ M in a 0.1 M LiCl 10 mM cacodylate buffer pH 7.6 is previously prepared, briefly heated to 90 ° C and slowly cooled to 20 ° C, then distributed in aliquots of 600 ⁇ l in fluorescence cells. 3 ⁇ l of water (for control) or 3 ⁇ l of the product to be tested (stock at 200 ⁇ M, final concentration 1 ⁇ M) are then added and mixed. The samples are then left to incubate for at least 1 hour at 20 ° C before each measurement. The use of longer incubation times (up to 24 hours) has no influence on the result obtained.
  • the Tm of the reference sample without addition of product is 44 ° C. in a Lithium Chloride buffer. This temperature is brought to more than 55 ° C. in a sodium chloride buffer.
  • the addition of a G-quadruplex stabilizing compound induces an increase in Tm. This increase is considered significant if it is greater than 3 °.
  • the biological anti -lomerase activity is determined by the following experimental protocol:
  • the HL60 leukemia line is obtained from ATCC
  • the cells are cultured in suspension in RPMI 1640 medium containing, 2 mM L-Glutamine, Penicillin 200 U / ml, streptomycin 200 ⁇ g / ml, gentamycin 50 ⁇ g / ml and supplemented with 10% fetal calf serum inactivated by heat.
  • telomerase activity is determined by a protocol for extending the oligonucleotide TS AATCGTTCGAGCAGAGTTTT ' ), in the presence of a cellular extract enriched in telomerase activity and compounds which are added at different concentrations (10, 1, 0.1 and 0.01 ⁇ g / ml).
  • the extension reaction is followed by a PCR amplification of the extension products using the oligonucleotides TS and CXext GTGCCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA 3 ' ).
  • the reaction medium is prepared according to the following composition:
  • Bovine albumin serum 0.1 mg / ml
  • the oligonucleotides are obtained from Eurogentec (Belgium) and are stored at -20 ° C at a stock concentration of 1 mg / ml in distilled water.
  • the reaction samples are assembled in 0.2 ml PCR tubes and a drop of paraffin oil is placed on each of the reactions of the experiment before the tubes are closed.
  • reaction samples are then incubated in a Cetus 4800 type PCR apparatus under the following temperature conditions: 15 minutes at 30 ° C, 1 minute at 90 ° C, followed by 30 cycles of, 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 50 ° C, and 1 minute 30 seconds at 72 ° C, followed by a final cycle 2 minutes at 72 ° C.
  • the samples are then analyzed by electrophoresis in 12% acrylamide gel in 1 ⁇ TBE buffer for 1 hour at a voltage of 200 volts, using a Novex electrophoresis system.
  • the acrylamide gels are then dried on a sheet of 3MMM Whatmann paper at 80 ° C for 1 hour.
  • the concentration of compound inducing a 50% inhibition of the telomerase reaction is determined using a representation semi logarithmic graph of the inhibition values obtained as a function of each of the concentrations of compound tested.
  • a compound is active as an antelomerase agent when the amount inhibiting 50% of the telomerase reaction is notably less than 5 ⁇ M.
  • the cytotoxic biological activity on human tumor lines is determined according to the following experimental protocol:
  • A549 human cell lines originate from ATCC
  • the A549 cells are cultured in a layer in a culture flask in RPMI 1640 medium, L-
  • Glutamine at 2 mM Penicillin 200 U / ml, streptomycin 200 ⁇ g / ml and supplemented with 10% fetal calf serum inactivated by heat.
  • the cells in the exponential growth phase are trypsinized, washed in 1 ⁇ PBS and are seeded in 96-well microplates (Costar) at the rate of 4 ⁇ 10 4 cells / ml ml (0.2 ml / well) and then incubated for 96 hours in the presence of varying concentrations. of product to be studied (10, 1, 0.1 and 0.01 ⁇ g / ml, each point in quadruplicate). 16 hours before the end of the incubation, 0.02% final neutral red is added to each well. At the end of the incubation, the cells are washed with 1 ⁇ PBS and lysed with 1% of sodium lauryl sulfate. The cellular incorporation of the dye, which reflects cell growth, is evaluated by spectrophotometry at a wavelength of 540 nm for each sample using a Dynatech MR5000 reading device.
  • a compound is considered to be active as a cytotoxic agent if the inhibitory concentration of 50% of the growth of the tumor cells tested is in particular less than 20 ⁇ M.
  • Example 1 Isomeethamidium or hydrochloride of 7- (3-amidinophenyl) diazoamino-2-amino-10-ethyl-9-phenyl-phenanthidiium chloride
  • Example 4 The G-quartet, antitelomerase and cytotoxic activities of the various compounds exemplified are determined according to the operating protocols described above.

Abstract

La présente invention est relative ô la thérapie du cancer et concerne de nouveaux agents anticancéreux de la classe des phénanthridines ayant un mécanisme d'action bien particulier. Elle concerne aussi de nouveaux composés chimiques ainsi que leur application thérapeutique chez l'homme.

Description

DERIVES CHIMIQUES ET LEUR APPLICATION COMME AGENT ANTITELOMERASE
La présente invention est relative à la thérapie du cancer et concerne de nouveaux agents anticancéreux ayant un mécanisme d'action bien particulier. Elle concerne aussi de nouveaux composés chimiques ainsi que leur application thérapeutique chez l'homme.
La présente invention concerne l'utilisation de nouveaux composés chimiques non nucléotidiques qui interagissent avec des structures spécifiques de l'acide désoxyribonucléique (ADN). Ces nouveaux composés sont constitués de dérivés de la phénanthridine. Ces nouveaux composés sont utiles dans le traitement des cancers et agissent en particulier en tant qu'agents inhibiteurs de la télomérase. Ils sont particulièrement utiles pour stabiliser l'ADN en structure G-quadruplexe (tétrades de guanines). L'application thérapeutique de l'inhibition de la télomérase via la stabilisation de ces G-quadruplexes est l'arrêt de la mitose cellulaire et la mort des cellules à division rapide telles que les cellules cancéreuses et éventuellement l'induction de la sénescence des cellules cancéreuses.
Les composés de la présente invention présentent l'avantage du point de vue thérapeutique de bloquer la télomérase. Du point de vue biologique, la télomérase permet l'ajout de séquences d'ADN répétées du type T T A G G G, dites séquences télomériques, à l'extrémité du télomère, lors de la division cellulaire. Par cette action la télomérase rend la cellule immortelle. En effet, en l'absence de cette activité enzymatique, la cellule perd à chaque division 100 à 150 bases, ce qui la rend rapidement senescente. Lors de l'apparition de cellules cancéreuses à division rapide, il est apparu que ces cellules présentaient des télomères maintenus à une longueur stable au cours de la division cellulaire. Dans ces cellules cancéreuses il est apparu que la télomérase était fortement activée et qu'elle permettait l'addition de motifs répétés de séquences télomériques à la fin du télomère et permettait donc la conservation de la longueur du télomère dans les cellules cancéreuses. Il est apparu depuis quelques temps que plus de 85 % des cellules cancéreuses présentaient des tests positifs à la présence de télomérase alors que les cellules somatiques ne présentent pas cette caractéristique. Ainsi la télomérase est une cible très convoitée pour traiter les cellules cancéreuses. La première approche évidente pour bloquer la télomérase a été l'utilisation de structures nucleotidiques (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(7), 2635-2639). Parmi les composés non nucleotidiques qui ont été utilisés dans l'art antérieur on peut citer les diaminoanthraquinones (Sun et al. J. Med. Chem. 40(14), 2113-6) ou les diethyloxadicarbocyanines (Wheelhouse R. T. Et al. J. Am. Chem. Soc. 1998(120) 3261-2).
Le brevet WO 99/40087 décrit l'utilisation de composés qui interagissent avec les structures G-quadruplexes qui sont des composés perylenes et des carbocyanines contenant au moins sept cycles dont deux heterocycles.
Il est apparu de façon tout à fait surprenante que des structures simples permettaient d'obtenir un résultat au moins équivalent avec des structures beaucoup moins compliquées du point de vue chimique. Les composés de la présente invention qui répondent à l'objectif visé c'est-à-dire qui fixent la structure G-quadruplexe et par ce fait présentent une activité inhibitrice des télomérases répondent à la formule générale suivante :
Figure imgf000003_0001
dans laquelle
• A représente un lien azoté basique choisi parmi les radicaux amino, azo ou hydrazo
• Ar représente un radical aromatique carbocyclique ou hétérocyclique mono ou polycyclique contenant 4 à 10 atomes de carbone éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes alkyle en C1-C4
• n représente 0 ou 1
• R1 représente un radical alkyle en C1-C4 • R2 représente l'hydrogène ou un substituant choisi parmi les radicaux alkyle en C1-C4, alkoxy en C1-C4, alkylthio en C1-C4, un groupe amino
• R3 représente l'hydrogène ou un substituant choisi parmi les radicaux alkyle en C1-C4, alkoxy en C1-C4, alkylthio en C1-C4, un groupe amino
On préfère au sens de la formule ci-dessus parmi les heterocycles aromatiques utiliser les heterocycles azoté comportant un ou plusieurs atomes d'azote comme par exemple un groupe pyridine ou pyrimidine ou pyrazine. On préfère tout particulièrement les composés contenant dans leur formule générale 7 atomes d'azote.
On préfère parmi les composés de formule ci-dessus ceux pour lesquels R2 représente l'hydrogène ou un groupe amino.
On préfère aussi les composés de formule ci-dessus R1 représente un groupe méthyle ou un groupe éthyle.
On préfère aussi les composés de formule ci-dessus où n est égal à 1 et qui donc portent un groupe guanyl sur le motif Ar.
On peut citer à titre de composés représentatifs de la formule (I) les composés suivants : - l'isomethamidium ou chorhydrate du chlorure de 7-(3-amidino- phényl)diazoamino-2-amino-10-éthyl-9-phényl-phénanthridiium (exemple 1 ),
- le bromhydrate du bromure de 8-(3-amidinophényl)diazo-2,7- diamino-10-éthyl-9-phényl-phénanthridiium (exemple 2),
- le bromure de 7-amino-2-(2-amino-1 ,6-diméthyI-pyrimidinio-4-yl)-(4- amino-phényl)-10-éthyl-phénanthridinium (exemple 3).
La présente invention concerne aussi à titre de produits nouveaux les composés de formule suivante :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle
• R1 représente un groupe alkyle en C1-C2
• R2 représente l'hydrogène ou un groupe amino
• R3 représente l'hydrogène ou un groupe amino
• A représente un groupe azo ou hydrazo ou amino.
Le procédé de préparation des composés de formule (I) ci-dessus dans lequel A représente un groupement hydrazo est par exemple décrit par S. S. Berg dans Nature, 1960, 188, 1106-1107 pour la synthèse de l'isométhamidium (exemple 1).
Les composés nouveaux sont préparés par couplage d'un sel du 3- benzamido-diazonium avec un sel de 7-amino-phénanthridinium, selon le schéma ci-dessous.
Figure imgf000005_0002
Selon les substituants présents sur le sel de 7-amino- phénanthridinium le couplage avec le sel du 3-benzamido-diazonium peut également se faire en position ortho (ou para) de la fonction 7-amino, conduisant ainsi aux composés de formule générale (I) ci dessus dans lequel A représente un groupement azo. Par exemple, le composé de l'exemple 2 peut être obtenu en utilisant un tel couplage azoique en ortho d'une fonction aminé selon schéma ci-dessus :
Figure imgf000006_0001
R1= B ; R2 = M-^ produit de l'exemple 3 proihidium
Les produits de formule générale I dans lequel A représente un groupe amino sont obtenus en opérant par couplage d'une aminé aromatique avec la 2-amino-4-chloro-6-méthyle-pyrimidine, suivi de la N-méthylation de l'azote en 1 de la pyrimidine, en opérant comme par exemple dans les conditions décrites par Bukrinsky et coll W.O. 9620932. Ainsi, plus spécifiquement, le produit de l'exemple 3 est-il obtenu comme produit secondaire de la synthèse du prothidium, dont il est séparé par cristallisation, en opérant comme décrit dans le brevet GB 816236 :
La présente invention concerne aussi les compositions thérapeutiques contenant un composé selon l'invention, en association avec un support pharmaceutiquement acceptable selon le mode d'administration choisi. La composition pharmaceutique peut se présenter sous forme solide, liquide ou de liposomes.
Parmi les compositions solides on peut citer les poudres, les gélules, les comprimés. Parmi les formes orales on peut aussi inclure les formes solides protégées vis-à-vis du milieu acide de l'estomac. Les supports utilisés pour les formes solides sont constitués notamment de supports minéraux comme les phosphates, les carbonates ou de supports organiques comme le lactose, les celluloses, l'amidon ou les polymères. Les formes liquides sont constituées de solutions de suspensions ou de dispersions. Elles contiennent comme support dispersif soit l'eau, soit un solvant organique (éthanol, NMP ou autres) ou de mélanges d'agents tensioactifs et de solvants ou d'agents complexants et de solvants.
La dose administrée des composés de l'invention sera adaptée par le praticien en fonction de la voie d'administration du patient et de l'état de ce dernier. Les composés de la présente invention peuvent être administrés seuls ou en mélange avec d'autres anticancéreux. Parmi les associations possibles on peut citer
• les agents alkylants et notamment le cyclophosphamide, le melphalan, l'ifosfamide, le chlorambucil, le busulfan, le thiotepa, la prednimustine, la carmustine, la lomustine, la semustine, la steptozotocine, la decarbazine, la témozolomide, la procarbazine et l'hexamethylmélamine
• les dérivés du platine comme notamment le cisplatine, le carboplatine ou l'oxaliplatine • les agents antibiotiques comme notamment la bléomycine, la mitomycine, la dactinomycine,
• les agents antimicrotubules comme notamment la vinblastine, la vincristine, la vindésine, la vinorelbine, les taxoides (paclitaxel et docétaxel) • les anthracyclines comme notamment la doxorubicine, la daunorubicine, l'idarubicine, l'épirubicine, la mitoxantrone, la losoxantrone
• les topoisomérases des groupes I et II telles.que l'étoposide, le teniposide, l'amsacrine, l'irinotecan, le topotecan et le • les fluoropyrimidines telles que le 5-fluorouracile, l'UFT, la floxuridine, et le tomudex • les analogues de cytidine telles que la 5-azacytidine, la cytarabine, la gemcitabine,
• les analogues d'adénosine telles que la 6-mercaptopurine, la 6-thioguanine, la pentostatine, ou le phosphate de fludarabine « le methotrexate et l'acide folinique
• les enzymes et composés divers tels que la L-asparaginase, l'hydroxyurée, l'acide trans-rétinoique, la suramine, la dexrazoxane, l'amifostine, l'herceptin ainsi que les hormones oetrogéniques, androgéniques. II est également possible d'associer aux composés de la présente invention un traitement par les radiations. Ces traitements peuvent être administrés simultanément, séparément, séquentiellement. Le traitement sera adapté au malade à traiter par le praticien.
L'activité de stabilisation des G-quadruplexes peut être déterminée par une méthode utilisant la formation d'un complexe avec la fluoresceine dont le protocole expérimental est décrit ci-après. Ils peuvent ainsi être utilisés comme sonde fluorescente pour déterminer la présence de
G-quadruplexes.
Oligonucléotides Tous les olignucléotides, modifiés ou non, ont été synthétisés par
Eurogentec SA, Seraing, Belgique. L'oligoncléotide FAM + DABCYL porte la référence catalogue, OL-0371-0802. Il possède la séquence: GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG correspondant à 3.5 répétitions du motif télomérique humain (brin riche en G). La fluoresceine est attaché à l'extrémité 5', le DABCYL à l'extrémité 3', par les bras chimiques décrit par Eurogentec. La concentration des échantillons est vérifiée par spectrophotométrie, en enregistrant le spectre d'absorbance entre 220 et 700 nm et en utilisant le coefficient d'extinction molaire fourni par le fournisseur.
Tampons
Toutes les expériences ont été réalisées dans un tampon cacodylate de sodium 10 mM pH 7.6 contenant 0.1 M de Chlorure de Lithium (ou de Chlorure de Sodium). L'absence de contamination fluorescente dans le tampon a été préalablement vérifiée. L'oligonucléotide fluorescent est ajouté à la concentration finale de 0.2 μM.
Etude de Fluorescence Toutes les mesures de fluorescence ont été effectuées sur un appareil Spex Fluorolog DM1 B, en utilisant une largeur de raie d'excitation de 1.8 nm et une largeur de raie d'émission de 4.5 nm. Les échantillons sont placés dans une cuvette en quartz micro de 0.2 x 1 cm. La température de l'échantillon est contrôlée par un bain-marie extérieur. L'oligonucléotide seul a été analysé à 20, 30, 40, 50, 60, 70 et 80°C. Les spectres d'émission sont enregistrés en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 470 nm. Les spectres d'excitation sont enregistrés en utilisant soit 515 nm soit 588 nm comme longueur d'onde d'émission. Les spectres sont corrigés de la réponse de l'instrument par des courbes de référence. Une extinction importante (80- 90 %) de la fluorescence de la fluoresceine à température ambiante est observée, en accord avec un repli intramoléculaire de l'oligonucléotide à 20°C sous forme d'un G-quadruplex, ce qui induit une juxtaposition de ses extrémités 5" et 3', respectivement liées à la fluoresceine et au DABCYL. Cette juxtaposition entraîne un phénomène déjà décrit d'extinction de fluorescence, utilisé pour les "Molecular Beacons".
Tm en fluorescence :
Une solution stock d'oligonucléotide à la concentration en brin de 0.2 μM dans un tampon 0.1 M LiCI 10 mM cacodylate pH 7.6 est préalablement préparée, chauffée brièvement à 90°C et refroidie lentement à 20°C, puis distribuée par aliquots de 600 μl dans les cuves de fluorescence. 3 μl d' eau (pour le contrôle) ou 3 μl du produit à tester (stock à 200 μM, concentration finale 1 μM) sont alors ajoutés et mélangés. Les échantillons sont alors laissés à incuber pendant au moins 1 heure à 20°C avant chaque mesure. L'utilisation de temps d'incubation plus longs (jusqu'à 24 heures) n'a pas d'influence sur le résultat obtenu.
Chaque expérience ne permet que la mesure d'un seul échantillon. Celui ci est d'abord incubé à une température initiale de 20°C, porté à 80°C en 38 minutes, laissé 5 minutes à 80°C, puis refroidi à 20°C en 62 minutes. Durant ce temps, la fluorescence est mesurée simultanément à deux longueurs d'onde d'émission (515 nm et 588 nm) en utilisant 470 nm comme longueur d'onde d'excitation. Une mesure est effectuée toutes les 30 secondes. La température du bain-marie est enregistrée en parallèle, et le profil de fluorescence en fonction de la température est reconstitué à partir de ces valeurs. Les profils de fluorescence sont ensuite normalisés entre 20°C et 80°C, et la température pour laquelle l'intensité d'émission à 515 nm est la moyenne de celles à haute et basse température est appelée Tm. Dans ces conditions, le Tm de l'échantillon de référence sans addition de produit est de 44°C dans un tampon Chlorure de Lithium. Cette température est portée à plus de 55°C dans un tampon Chlorure de Sodium. L'addition d'un composé stabilisant le G-quadruplex induit une augmentation du Tm. Cette augmentation est jugée significative si elle est supérieure à 3°.
L'activité biologique antitélomérase est déterminée par le protocole expérimental suivant :
Préparation de l'extrait enrichi en activité télomérase humaine
La lignée de leucémie HL60 est obtenue auprès de l'ATCC
(Americam Type Culture Collection, Rockville USA). Les cellules sont cultivées en suspension dans du milieu RPMI 1640 contenant, L-Glutamine à 2 mM, Pénicilline 200 U/ml, streptomycine 200 μg/ml, gentamycine 50 μg/ml et additionné de 10 % de sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur.
Une aliquote de 105 cellules est centrifugée à 3000xG et le surnageant écarté. Le culot de cellules est resuspendu par plusieurs pipettages successifs dans 200 μl de tampon de lyse contenant CHAPS 0.5 %, Tris-HCI pH 7,5 10 mM, MgCI2 1mM, EGTA 1 mM, β-mercaptoethanol 5 mM, PMSF 0.1 mM et glycérol 10 % et est conservé dans la glace pendant 30 minutes. Le lysat est centrifugé à 16 OOOOxG pendant 20 minutes à 4°C et 160 μl du surnageant est récupéré. Le dosage des protéines de l'extrait est effectué par la méthode de Bradford. L'extrait est conservé à -80°C.
Dosage de l'activité télomérase
L'inhibition de l'activité télomérase est déterminée par un protocole d'extension de l'oligonucléotide TS AATCGTTCGAGCAGAGTT3'), en présence d'un extrait cellulaire enrichi en activité télomérase et des composés qui sont ajoutés à différentes concentrations (10, 1 , 0.1 et 0,01 μg/ml). La réaction d'extension est suivie d'une amplification PCR des produits d'extension à l'aide des oligonucléotides TS et CXext GTGCCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA3'). Le milieu réactionnel est préparé selon la composition suivante :
Tris HCI pH 8,3 20 mM
MgCI2 1 ,5 mM
Tween 20 0,005 % (P/V)
EGTA 1 mM dATP 50 μM dGTP 50 μM dCTP 50 μM dTTP 50 μM
Oligonucléotide TS 2 μg/ml Oligonucléotide CXext 2 μg/ml
Sérum Albumine bovine 0,1 mg/ml
Taq DNA polymérase 1 U/ml alpha 32P dCTP (3000 Ci/mmole) 0.5 μl
Extrait télomérase 200 ng sous un volume de 10 μl Produit à tester ou solvant sous un volume de 5 μl
Eau bi-distillée QS 50 μl
Les oligonucléotides sont obtenus auprès d'Eurogentec (Belgique) et sont conservés à -20°C à une concentration stock de 1 mg/ml dans de l'eau distillée. Les échantillons réactionnels sont assemblés dans des tubes à PCR de 0.2 ml et une goutte d'huile de paraffine est déposée sur chacune des réactions de l'expérience avant la fermeture des tubes.
Les échantillons réactionnels sont ensuite incubés dans un appareil à PCR de type Cetus 4800 selon les conditions de températures suivantes : 15 minutes à 30°C, 1 minute à 90°C, suivis de 30 cycles de, 30 secondes à 94°C, 30 secondes à 50°C, et 1 minute 30 secondes à 72°C, suivis d'un cycle final de 2 minutes à 72°C.
Pour chacun des échantillons, une aliquote de 10 μl est pipettée sous la couche d'huile et mélangée avec 5 μl d'un tampon de dépôt contenant : TBE 3X glycérol 32 % (P/V)
Bleu de bromophénol 0.03 %
Xylène cyanol 0.03 %
Les échantillons sont ensuite analysés par électrophorèse en gel d'acrylamide 12 % dans un tampon TBE 1X pendant 1 heure sous une tension de 200 volts, à l'aide d'un système d'électrophorèse Novex.
Les gels d'acrylamides sont ensuite séchés sur une feuille de papier whatmann 3MM à 80°C pendant 1 heure.
L'analyse et la quantification des produits de la réaction sont effectuées à l'aide d'un appareil Instantlmager (Pacard).
Pour chaque concentration de composé testée, les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la réaction et calculés à partir du contrôle enzymatique non traité et de l'échantillon sans enzyme (blanc) selon la formule suivante : (Valeur Composé - valeur blanc/ Valeur contrôle enzymatique -valeur blanc) x 100.
La concentration de composé induisant une inhibition de 50 % de la réaction télomérase (IC50) est déterminée à l'aide d'une représentation graphique semi logarithmique des valeurs d'inhibition obtenues en fonction de chacune des concentrations de composé testée.
On considère qu'un composé est actif en tant qu'agent antitélomérase lorsque la quantité inhibant 50 % de la réaction télomérase est notamment inférieure à 5 μM.
L'activité biologique cytotoxique sur des lignées de tumeur humaines est déterminée selon le protocole expérimental suivant :
Les lignées de cellules humaines A549 sont originaires de l'ATCC
(Americam Type Culture Collection, Rockville USA). Les cellules A549 sont cultivées en couche en flacon de culture dans du milieu RPMI 1640, L-
Glutamine à 2 mM, Pénicilline 200 U/ml, streptomycine 200 μg/ml et additionné de 10 % de sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur.
Les cellules en phase exponentielles de croissances sont trypsinées, lavées dans du PBS 1X et sont ensemencées en microplaques 96 puits (Costar) à raison de 4x104 cellules/ml ml (0.2 ml/puit) puis incubées pendant 96 heures en présence de concentrations variables de produit à étudier (10, 1 , 0.1 et 0.01 μg/ml, chaque point en quadruplicata). 16 heures avant la fin de l'incubation, 0.02 % final de rouge neutre est ajouté dans chaque puits. A la fin de l'incubation, les cellules sont lavées par du PBS 1X et lysées par 1 % de lauryl sulfate de sodium. L'incorporation cellulaire du colorant, qui reflète la croissance cellulaire, est évaluée par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 540 nm pour chaque échantillon à l'aide d'un appareil de lecture Dynatech MR5000.
Pour chaque concentration de composé testée, les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de croissance cellulaire et calculés à partir du contrôle non traité et du milieu de culture sans cellules (blanc) selon la formule suivante :
(Valeur Composé - valeur blanc/ Valeur contrôle cellules -valeur blanc) x 100. La concentration de composé induisant une inhibition de 50 % de la croissance (IC50) est déterminée à l'aide d'une représentation graphique semi logarithmique des valeurs d'inhibition obtenues en fonction de chacune des concentrations de composé testée.
On considère qu'un composé est actif comme agent cytotoxique si la concentration inhibitrice de 50 % de la croissance des cellules tumorales testées est notamment inférieure à 20 μM.
Les exemples suivants et non limitatifs sont donnés pour illustrer l'invention.
Exemple 1 : Isoméethamidium ou chorhydrate du chlorure de 7-(3- amidinophényl)diazoamino-2-amino-10-éthyl-9-phényl-phénanthridiium
Exemple 2 : Bromhydrate du bromure de 8-(3-amidinophényl)diazo-2,7- diamino-10-éthyl-9-phényl-phénanthridiium
Exemple 3 : Bromure de 7-amino-2-(2-amino-1 ,6-diméthyl-pyrimidinio-4-yl)- (4-amino-phényl)-10-éthyl-phénanthridinium
Exemple 4 : Les activités G-quartet, antitélomérase et cytotoxiques des différents composés exemplifies sont déterminés selon les protocoles opératoires décrits ci-avant.
Figure imgf000014_0001

Claims

REVENDICATIONS
1 - Utilisation de composés comme agents inhibiteurs de la télomérase caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale suivante :
Figure imgf000015_0001
dans laquelle
• A représente un lien azoté basique choisi parmi les radicaux amino, azo ou hydrazo
• Ar représente un radical aromatique carbocyclique ou hétérocyclique mono ou polycyclique contenant 4 à 10 atomes de carbone éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes alkyle en C1-C4
• n représente 0 ou 1
• R1 représente un radical alkyle en C1-C4
• R2 représente l'hydrogène ou un substituant choisi parmi les radicaux alkyle en C1-C4, alkoxy en C1-C4, alkylthio en C1-C4, un groupe amino
• R3 représente l'hydrogène ou un substituant choisi parmi les radicaux alkyle en C1-C4, alkoxy en C1-C4, alkylthio en C1-C4, un groupe amino.
2 - Utilisation selon la revendication 1 caractérisés en que parmi les heterocycles aromatiques sont choisis parmi les heterocycles azotés comportant un ou plusieurs atomes d'azote tels que les groupes pyridine ou pyrimidine ou pyrazine. 3 - Utilisation selon la revendication 1 caractérisés en ce que ils contiennent 7 atomes d'azote.
4 - Utilisation selon la revendication 1 caractérisés en ce que R2 représene l'hydrogène ou un groupe amino.
5 - Utilisation selon la revendication 1 caractérisés R1 représente un groupe méthyle ou un groupe éthyle.
6 - Utilisation selon la revendication 1 caractérisés n est égal à 1.
7 - Utilisation selon la revendication 1 de composés choisis parmi la liste suivante :
- l'isomethamidium ou chorhydrate du chlorure de 7-(3- amidinophényl)diazoamino-2-amino-10-éthyl-9-phényl-phénanthridiium,
- le bromhydrate du bromure de 8-(3-amidinophényl)diazo-2,7- diamino-10-éthyl-9-phényl-phénanthridiium,
- le bromure de 7-amino-2-(2-amino-1 ,6-diméthyl-pyrimidinio-4- yl)-(4-amino-phényl)-10-éthyl-phénanthridinium.
8 - Utilisation des composés selon l'une quelconque des revendications précédentes comme agent anticancéreux
9 - Nouveaux composés de formule suivante :
Figure imgf000016_0001
dans laquelle
• R1 représente un groupe alkyle en C1-C2
• R2 représente l'hydrogène ou un groupe amino • R3 représente l'hydrogène ou un groupe amino
• A représente un groupe azo ou hydrazo.
10 - Associations thérapeutiques constituées d'un composé selon la revendication 1 et d'un autre composé anticancéreux.
11 - Associations selon la revendication 16 caractérisées en ce que le composé anticancéreux est choisi parmi les agents alkylants, les dérivés du platine, les agents antibiotiques, les agents antimicrotubules, les anthracyclines, les topoisomérases des groupes I et II, les fluoropyrimidines, les analogues de cytidine, les analogues d'adenosine, les enzymes et composés divers tels que la L-asparaginase, l'hydroxyurée, l'acide trans- rétinoique, la suramine, l'irinotecan, le topotecan, la dexrazoxane, l'amifostine, l'herceptin ainsi que les hormones oetrogéniques, androgéniques.
12 - Association thérapeutique constituée d'un composé selon la revendication 1 et de radiations.
13 - Associations selon l'une quelconque des revendications 16 à 18 caractérisées en ce que chacun des composés ou des traitements est administré simultanément, séparément ou séquentiellement.
14 - Utilisation des composés selon la revendication 1 comme sonde fluorescente pour déterminer la présence de G-quadruplexes.
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