WO2002048711A1 - Reactifs d'analyse immunologique et procede d'analyse - Google Patents

Reactifs d'analyse immunologique et procede d'analyse Download PDF

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avidin
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biotin
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Kunihiko Nakahara
Tokio Sawai
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Iatron Laboratories, Inc.
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    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction

Definitions

  • the present invention relates to an immunological analysis reagent and an analysis method. More specifically, the present invention relates to an analysis reagent and an analysis method based on an agglutination reaction utilizing an immune reaction.
  • analysis used in the present specification includes “measurement” for quantitatively or semi-quantitatively determining the amount of an analyte, and “detection” for determining the presence or absence of an analyte. Both are included.
  • an immunological measurement method using an antibody or an antigen against a substance to be analyzed is often used.
  • the immunological measurement means include an immunoturbidimetric method and an immunoturbidimetric method, which optically measure an immune complex formed by an antigen-antibody reaction, and a radioimmunoassay using a radioactive substance or enzyme as a label. Seizennoatssey has been used. In recent years, automatic analyzers for processing a large number of test samples in a short period of time have become widespread, and in addition to the need for higher sensitivity, in particular, latex particles bound with antibodies (or antigens) have been used.
  • a latex agglutination method utilizing the above reaction is widely used.
  • the so-called latex agglutination method is a method of measuring the substance to be analyzed by detecting the degree of aggregation of latex particles generated by the reaction between the substance to be analyzed and the antibody (or antigen) bound to the latex particles.
  • As a method for detecting the degree of aggregation there is a method of visually observing or a method of irradiating the reaction solution with light and measuring scattered light or transmitted light.
  • Optical analysis methods have been used to quantify antigens or antibodies in a sample.
  • the latex particles carry an antibody (or antigen) against the substance to be analyzed.
  • the method include a physical adsorption method in which an antibody (or antigen) and latex particles are mixed and bonded, and a chemical bonding method in which an antibody (or antigen) and latex particles are covalently bonded.
  • a major problem with the latex agglutination method is that when an antibody (or antigen) is carried on latex particles as described above, the balance of the electric double layer that maintains the dispersibility of the latex particles themselves in a solution is lost. Therefore, latex particles self-aggregate independently of the antigen-antibody reaction. As a result, not only the accuracy of the measurement is lost, but also the storage stability of the latex particles themselves becomes unstable, so that the sensitivity may increase or decrease over time.
  • the antibody (or antigen) as a protein may be denatured by the adsorption of the antibody (or antigen) to the latex particle surface. is there.
  • the reactivity of the antibody (or antigen) to the analyte is changed, and the desired immunological response is not expressed or a reaction other than the target occurs. Also in this case, the reliability of the measurement result is significantly reduced.
  • an antibody or antigen
  • various methods for suppressing self-aggregation Has been studied.
  • this approach may be beneficial to latex particle manufacturers and suppliers, there is no room for latex particle suppliers to participate. So the antibody
  • Or antigen has been devised by coexisting a surfactant or a stabilizing agent composed of polysaccharides in the preservation solution of latex particles after carrying the (or antigen). The fact is that it has not been reached.
  • the present inventors have conducted intensive studies to overcome the above-mentioned problems in the latex agglutination reaction.
  • the latex particles were agglutinated without directly carrying the antibody (or antigen) against the analyte to the latex particles.
  • the present invention is a.
  • a set containing a conjugate in which biotin is bound to an antigen or antibody to the analyte A composition (hereinafter, sometimes referred to as a first composition);
  • composition containing avidin-bound microparticles (hereinafter sometimes referred to as a second composition) and
  • the amount of biotin that binds to an antigen or an antibody in the conjugate is an amount that does not substantially aggregate with the avidin-bound microparticles in the absence of a substance to be analyzed.
  • the conjugate contained in the first composition is a conjugate obtained by binding one molecule of biotin to an antigen or an antibody.
  • the avidin-bound fine particles contained in the second composition are avidin-bound latex particles.
  • the present invention is a preferred embodiment of the immunological analysis reagent of the present invention.
  • a test sample that may contain the analyte, and a conjugate of biotin bound to an antigen or antibody to the analyte (however, the amount of biotin that binds to the antigen or antibody is limited to the analyte) And a step of contacting the avidin-bound microparticles with the avidin-bound microparticles in an amount that does not substantially agglutinate with the avidin-bound microparticles in the absence of the avidin-bound microparticles.
  • An immunological analysis method including a step of analyzing an analyte by detecting the degree of aggregation generated from an avidin-bound microparticle and an immune complex formed between the analyte and the conjugate.
  • the conjugate is a conjugate obtained by binding one molecule of biotin to an antigen or an antibody.
  • a test sample which may contain a substance to be analyzed and a conjugate obtained by binding one molecule of biotin to an antigen or an antibody to the substance to be analyzed Or first contacted with avidin-bound microparticles, or one molecule of biotin bound to a test sample that may contain the analyte and an antigen or antibody to the analyte The conjugate and the avidin-bound microparticles are contacted simultaneously.
  • the avidin-bound fine particles are avidin-bound latex particles.
  • Fig. 1 shows the comparison of the change in absorbance between the case where the two-component analysis reagent according to the present invention prepared in Example 1 was used and the case where the SF antibody-sensitized latex prepared in Comparative Examples 1 and 2 was used.
  • the conjugate contained in the first composition used in the present invention is a conjugate in which a specific amount of biotin is bound to an antigen or an antibody against the substance to be analyzed.
  • an amount of biotin preferably, one molecule of biotin
  • an amount of biotin that does not substantially aggregate with the avidin-bound microparticles is bound to the antigen or antibody in the absence of the substance to be analyzed.
  • conjugate a conjugate in which two molecules of biotin are bound to an antigen or an antibody to the substance to be analyzed is prepared, and when this conjugate and avidin-bound fine particles coexist, the substance to be analyzed does not exist. Also, since avidin and biotin can be specifically bound, a complex in which avidin-bound fine particles, a conjugate and avidin-bound particles are connected in this order is formed, and self-aggregation occurs.
  • the term “amount of the substance that does not substantially aggregate with the avidin-bound fine particles in the absence of the analyte” is defined as a conjugate obtained by binding biotin to an antigen or an antibody against the analyte, and avidin. It means an amount of biotin that does not substantially cause self-aggregation when co-existing with bound fine particles in the absence of the substance to be analyzed. Note that “substantially no aggregation” means that the analysis result is not affected when this method is performed.
  • the amount of biotin bound to the antigen or antibody does not exceed two molecules, and is preferably one molecule.
  • the conjugate used in the present invention can be prepared by a known method.
  • one or more biotin molecules can be added to an antigen or an antibody.
  • one molecule is chemically bound, or one or more molecules of biotin (preferably one molecule) is physically adsorbed to the antigen or antibody, and then is bound or adsorbed to the biotin molecule. It can be obtained by diluting the remaining biotin to an optimal concentration with a buffer solution.
  • the amount of the antigen or biotin bound to the antigen is determined by coexisting the obtained conjugate with avidin-bound fine particles in the absence of the substance to be analyzed, and analyzing whether self-aggregation substantially occurs. However, it can be determined whether or not the amount is “an amount that does not substantially aggregate with the avidin-bound fine particles in the absence of the analyte”.
  • the diluent can be used as it is or as a first composition after adding an appropriate additive (for example, a well-known stabilizer).
  • an appropriate additive for example, a well-known stabilizer
  • the diluent described above can be used as it is, or after adding an appropriate additive (for example, a well-known stabilizer) and then freeze-dried to obtain a powdery first composition.
  • the stabilizer include inorganic salts
  • the antigen or antibody that binds to biotin is not particularly limited as long as it is an antigen or antibody that causes an antigen-antibody reaction with the analyte, and the antibody (including both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody) Can use the immunoglobulin molecule itself or an antibody fragment [eg, Fab, Fab ', F (ab') 2 , or Fv].
  • the antibody including both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody
  • the antibody can use the immunoglobulin molecule itself or an antibody fragment [eg, Fab, Fab ', F (ab') 2 , or Fv].
  • 1 is used when two or more types of monoclonal antibodies bind at different sites to the antigen to be analyzed and 1 when two or more antigen recognition sites exist. Different types of monoclonal antibodies may be used.
  • the avidin-bound fine particles contained in the second composition used in the present invention are fine particles prepared by bonding a large number of avidin molecules to inorganic or organic fine particles.
  • the fine particles include organic polymer fine particles, for example, fine particles such as polystyrene, latex such as styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylate copolymer, or styrene-styrene sulfonate copolymer. Latex particles can be used.
  • the average particle size of the fine particles is not particularly limited, either, but is not limited to 0.01 to 1.0. m, especially in the case of latex particles, depending on the detection concentration of the substance to be analyzed and the measuring instrument used, it is preferably in the range of 0.05 to 1.0 Om (preferably in the range of 0.05 to 0. It can be selected as appropriate.
  • any avidin capable of specifically and strongly binding to piotin for example, egg white avidin, streptavidin, or avidin obtained by genetic manipulation (that is, recombinant avidin) and the like can be used.
  • a peptide synthesis reagent for example, water-soluble carbopimide
  • fine particles for example, latex particles
  • avidin is added and stirred.
  • the avidin-bound fine particles (particularly, avidin-bound latex particles) thus obtained can be diluted with a buffer that maintains the dispersibility.
  • This diluted solution can be used as it is or with an appropriate additive (for example, a well-known stabilizing agent).
  • an appropriate additive for example, a well-known stabilizing agent
  • the above-mentioned diluent may be used as it is, or after adding an appropriate additive (for example, a well-known stabilizer) and then freeze-dried to obtain a powdery second composition.
  • Buffers that can maintain the dispersibility of avidin-bound microparticles (particularly, avidin-bound latex particles) are ordinary buffers [eg, 1 Ommo IZL phosphate buffer.
  • the stabilizer for the second composition the stabilizers listed for the first composition can be used.
  • the first composition and the second composition prepared by the above-described method are combined with a liquid or powdery first reagent containing the conjugate and a liquid or powdery second reagent containing the avidin-bound fine particles. It can be a two-reagent system.
  • the powdery composition is used after being liquefied with an appropriate buffer before use.
  • a test sample that may contain the analyte, and (mouth) a conjugate in which biotin is bound to an antigen or an antibody against the analyte [where the antigen or The amount of biotin that binds to the antibody is an amount (preferably one molecule) that does not substantially aggregate with the avidin-bound microparticles in the absence of the analyte substance.
  • the immunological analysis reagent according to the present invention is a reagent suitable for performing the immunological analysis method according to the present invention.
  • the contact between the test sample (a), the conjugate (mouth) and the avidin-bound fine particles (c) can be performed simultaneously, or alternatively, the test sample (a) and the conjugate (mouth) can be The contact can be made first, followed by the avidin-bound microparticles (c).
  • the contact between the test sample (i) and the conjugate (mouth) causes an antigen-antibody reaction to form an immune complex, and
  • a biotin-avidin complex is formed by a biotin-avidin reaction by contact between the conjugate (mouth) and avidin-bound fine particles (c).
  • the contact between the test sample (a) and the conjugate (mouth) causes an antigen-antibody reaction to form an immune complex, followed by biotin of the immune complex and avidin-bound microparticles.
  • Avidin is bound by a biotin-avidin reaction.
  • the analyte having formed the immune complex forms another immune complex by contact with another conjugate (mouth), and the immune complex further binds to avidin-bound fine particles. Occurs.
  • avidin-bound fine particles a large number of avidin molecules are present, and the avidin causes a biotin-avidin reaction and an antigen-antibody reaction as described above, so that aggregation proceeds from this point.
  • a conventionally known slide agglutination method or microplate agglutination method can be used as a method for detecting the degree of agglutination.
  • the degree of agglutination of latex particles is optically detected, for example, scattered light is used.
  • Conventionally known optical instruments for measuring the intensity, absorbance or transmitted light intensity can be used, and the preferred measurement wavelength is from 300 to 800 nm.
  • the method of detecting the degree of aggregation can be determined according to known methods by setting the size of the latex particles to be used, the latex concentration, the reaction time of the antigen-antibody reaction, the reaction time of the biotin-avidin reaction, and the like.
  • the increase or decrease of the transmitted light intensity can be measured or a combination thereof.
  • the antibody to be present in the reaction system of the antigen-antibody reaction the concentration of the antigen, the amount of biotin contained in the conjugate, or the amount of avidin-bound fine particles can be appropriately changed depending on the type of the test sample and the type of the analyte.
  • concentration of IgG (analyte) in serum (test sample) requires a measurement range of up to 50 mg ZmL
  • the amount used should be set according to the measurement range.
  • the measurement range of elastase 1 (analyte) is up to 50 ng ZmL, the amount used should be set according to the measurement range.
  • the conditions for the antigen-antibody reaction by bringing the test sample into contact with the conjugate to which biotin has been bound are the same as those in the usual immunological analysis method.
  • the biotin-avidin reaction is carried out by bringing the biotin conjugate and the avidin-bound fine particles into contact with each other in the same system as that for performing the antigen-antibody reaction.
  • the conditions must be suitable for the avidin reaction.
  • the buffer may be any buffer that does not deactivate the substance to be analyzed and has an ion concentration or pH that does not inhibit the antigen-antibody reaction and the biotin-avidin reaction.
  • Good buffer, glycine buffer, or Tris buffer can be used.
  • the pH of the antigen antibody reaction and the biotin-avidin reaction is preferably 5 to 10, more preferably 6 to 8.
  • the reaction temperature is preferably 0 to 50 ° C, more preferably 20 to 40 ° C. The reaction time can be appropriately selected.
  • test sample to be subjected to the analysis method according to the present invention is not particularly limited as long as it is a sample that may contain an antigen or an antibody to be analyzed, and is, for example, generally used for clinical diagnosis.
  • examples include biological fluids obtained, for example, blood, serum, plasma, or urine, and experimental samples.
  • the substance to be analyzed in the analysis method according to the present invention is not particularly limited as long as it can be generally analyzed using an antigen-antibody reaction (particularly, a physiologically active substance).
  • Representative examples of the substance to be analyzed include proteins and lipids, and more specifically, for example, various antigens, antibodies, receptors, enzymes, and the like.
  • CRP C-reactive protein
  • AFP rheumatoid factor
  • ferritin ferritin
  • ⁇ - 2 microglobulin One Hue preparative protein AFP
  • anti-stress but-lysine O antibody I g E
  • syphilis Torepone Ichima antibodies antibodies to syphilis lipid antigens
  • B hepatitis virus HBS antibody, HBS antigen, HBc antibody, HB e-antibody
  • FDP fibrin fibrinogen degradation product
  • FDP fibrin fibrinogen degradation product
  • SoIubIefibrin: SF plasmin'2-plasmin inhibitor complex
  • PSA prostate specific antigen
  • PSA elastase 1, elastase XDP
  • thrombomodulin anti-DNA antibody and the like.
  • the monoclonal antibody FM No. 43-1 secreted from the hybridoma FM No. 43-1 described in W095Z12261 was used.
  • the Hypri-Dorma is a patented biological depository center of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology [formerly known as the Institute of Life Science and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (address: 305--8566, Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan) No. 1 Chuo No. 6)] was deposited in Japan on October 27, 1999 and transferred to an international deposit on October 27, 1999.
  • the international deposit number (the oral deposit following the international deposit number is the domestic deposit number) is FERM BP-4846 [FER P-13925].
  • a monoclonal antibody ascites to soluble fibrin (SF) was prepared by a method similar to the method described in Example 2 (b) of the above-mentioned W095 1267-17, and was roughly purified by ammonium sulfate.
  • the resultant was treated with an ion exchange resin (DEAE), and 2 -mercaptoethylamine was added to F (ab ') 2 obtained by digestion with pepsin to prepare a Fab' antibody fragment.
  • To a solution obtained by dissolving the antibody thus obtained at a concentration of 2.5 mg / mL in 50 mM I ZL phosphate buffer (pH 7.1) was added 0.6 mg of maleimidobiotin (Funakoshi).
  • the reagent for analyzing human SF antigen of this example is composed of the first reagent composed of the SF antibody-bound biotin solution of the above item (1) and the second reagent composed of the avidin latex suspension of the above item (2). This is a two-part reagent.
  • Thrombin was allowed to act on commercially available fibrinogen (factor XIII-free; manufactured by Mold), the resulting clot was solubilized with acetic acid, and added to plasma to prepare an SF antigen.
  • Example 1 (2) The SF antibody-bound biotin solution prepared in Example 1 (1) was dissolved at a concentration of 0.5 mg ZmL in 1 Ommo I-MoPS buffer (pH 7.0). The avidin latex used in 1) was added at a concentration of 1% and stirred at room temperature for 30 minutes to prepare an SF antibody-sensitized latex. The SF antibody-sensitized latex thus obtained was diluted with 1 Ommo IL-MOPS suspension (pH 7.0) to give a 0.5% SF antibody-sensitized latex suspension, and the anti-SF antibody for comparison was used. The antibody-sensitized rack reagent was used.
  • ⁇ shows the results when the anti-SF antibody-sensitized latex reagent prepared in Comparative Example 1 was used, and ⁇ shows the results when the anti-SF antibody-sensitized latex reagent prepared in Comparative Example 2 was used.
  • ⁇ and ⁇ are the results when the two-component analysis reagent according to the present invention was used in the operation of Example 1 (5), respectively.
  • the concentration of SF antibody-bound biotin was 0.025 O mg.
  • the results in the case of Zml and the results in the case of the SF antibody-bound biotin concentration of 0.05 mg Zml were shown.
  • a two-component analysis reagent according to the present invention comprising a first reagent comprising a SF antibody-bound biotin solution and a second reagent comprising an avidin latex suspension is used. And a reactivity equivalent to or higher than that of the method using a conventional latex according to the conventional method (Comparative Example 1). Furthermore, in the analytical reagent according to the present invention, since no self-aggregation was observed as compared with the method in which a biotinylated antibody was previously bound to avidin latex (Comparative Example 2), the absorbance change in the absence of SF antigen (0 concentration) was observed. The amount showed a low value. This is a very important effect in increasing the measurement sensitivity. Industrial applicability
  • the present invention a complicated operation for supporting an antibody or an antigen on fine particles such as latex particles becomes unnecessary. In addition, no self-aggregation of latex particles is observed, and storage stability is improved. Furthermore, unlike the conventional technology, when the latex is loaded with an antibody or antigen against the analyte, the protein is not denatured by adsorption to the latex surface, so the reactivity to the analyte changes. Accurate measurement of the substance to be analyzed can be performed without occurrence of odor. Furthermore, in the measurement of the analyte based on the immunoagglutination reaction, the usual antibody (or antigen) -sensitized latex
  • the method of the present invention has a low blank value, improves the accuracy at low values, and improves the method of the present invention even at high values. Is more reactive than the comparative examples.
  • the analysis reagent of the present invention is suitable as an analysis reagent for an automatic analyzer.

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Description

明 細 書 免疫学的分析試薬及び分析方法 技術分野
本発明は、 免疫学的分析試薬及び分析方法に関する。 より詳細には、 免疫反応 を利用した凝集反応による分析試薬及び分析方法に関する。 なお、 本明細書にお ける前記 「分析」 には、 分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する 「測 定」 と、 分析対象物の存在の有無を判定する 「検出」 との両方が含まれる。 背景技術
生体液中の微量成分を定量的に分析する方法のひとつとして、 分析対象物質に 対する抗体又は抗原を利用する免疫学的測定方法が多用されている。 その免疫学 的測定手段としては、 抗原抗体反応により形成される免疫複合体を光学的に測定 する免疫比ろう法及び免疫比濁法や、 放射性物質や酵素を標識体として利用する ラジオィムノアツセィゃェンザィムノアツセィが用いられてきた。 また、 近年、 多数の被検試料を短時間に処理するための自動分析装置が普及し、 更に高感度化 が要求されることと相まって、 特に、 抗体 （又は抗原） を結合したラテックス粒 子との反応を利用するラテックス凝集法が汎用されている。 いわゆるラテックス 凝集法とは、 分析対象物質と、 ラテックス粒子に結合した抗体 （又は抗原） との 反応により生じるラテックス粒子の凝集の程度を検出することにより、 分析対象 物質を測定する方法である。 この凝集の程度を検出する方法としては、 目視的に 観察するか、 あるいは反応液に光を照射して散乱光あるいは透過光を測定する方 法がある。 光学的な分析方法は試料中の抗原又は抗体の定量に用いられている。 しかし、 上記のようなラテックス凝集法を実施するには、 分析対象物質に対す る抗体 （又は抗原） をラテックス粒子に担持させることが必須である。 その方法 としては、 例えば、 抗体 （又は抗原） とラテックス粒子とを混合して結合させる 物理吸着法、 あるいは抗体 （又は抗原） とラテックス粒子とを共有結合させる化 学結合法がある。 これらの操作はいずれも煩雑であり、 ラテックス凝集法の問題 点の 1つである。 また、 ラテックス凝集法の大きな問題点は、 上記のようにラテ ックス粒子に抗体 （又は抗原） を担持させると、 ラテックス粒子自体の溶液中で の分散性を維持する電気二重層のバランスが崩れてしまうので、 抗原抗体反応と は関係なく、 ラテックス粒子が自己凝集してしまうという点がある。 このことに より、 測定の正確性が失われるだけでなく、 ラテックス粒子自体の保存安定性が 不安定となるため、 経時的な感度上昇や感度低下がみられることがある。
更に、 分析対象物質に対する抗体 （又は抗原） をラテックス粒子に担持させる 際に、 抗体 （又は抗原） がラテックス粒子表面へ吸着することによってタンパク 質としての抗体 （又は抗原） が変性してしまうことがある。 このような変性が起 きると、 分析対象物質に対する抗体 （又は抗原） の反応性に変化が生じ、 目的と する免疫学的反応が発現しないか、 あるいは目的以外の反応が生じるので、 いず れの場合も測定結果の信頼性を著しく低下させてしまう。
従来法では、 上記問題点を解消するために、 例えば、 ラテックス粒子の成分や 製造法を改良することにより、 抗体 （又は抗原） を容易に担持することができ、 自己凝集を抑制する手段に関する種々の検討が行われてきた。 しかしながら、 こ のアプローチは、 ラテックス粒子の製造業者や供給業者には有益であっても、 ラ テックス粒子の供給を受ける者にとっては参加する余地がない。 そこで、 抗体
(又は抗原） を担持させた後のラテックス粒子の保存液中に、 界面活性剤や多糖 類からなる安定化剤を共存させる等の工夫が行われきたが、 上記問題点を一挙に 解決するには至つていないのが実情である。
本発明者は、 ラテックス凝集反応における上記の問題点を克服するために鋭意 研究を重ねた結果、 分析対象物質に対する抗体 （又は抗原） をラテックス粒子に 直接には担持させずに、 ラテックス粒子を凝集させ、 その凝集の程度を分析する ことができる方法を開発した。
本発明はこうした知見に基づくものである。 発明の開示
本発明は、
( 1 ) 分析対象物質に対する抗原又は抗体にビォチンを結合した結合体を含む組 成物 （以下、 第 1組成物と称することがある） と、
( 2 ) アビジンを結合した微粒子を含む組成物 （以下、 第 2組成物と称すること がある） と
を含み、 前記結合体において、 抗原又は抗体に結合するビォチン量が、 分析対象 物質が存在しない状況下、 前記アビジン結合微粒子とは実質的に凝集しない量で ある、 免疫学的分析試薬に関する。
本発明の免疫学的分析試薬の好ましい態様によれば、 前記第 1組成物に含まれ る結合体が、 抗原又は抗体に 1分子のビォチンを結合した結合体である。
本発明の免疫学的分析試薬の別の好ましい態様によれば、 前記第 2組成物に含 まれるァビジン結合微粒子が、 アビジンを結合したラテックス粒子である。 また、 本発明は、
( 1 ) 分析対象物質を含有する可能性の有る被検試料と、 分析対象物質に対する 抗原又は抗体にビォチンを結合した結合体 （但し、 抗原又は抗体に結合するビォ チン量が、 分析対象物質が存在しない状況下、 前記アビジン結合微粒子とは実質 的に凝集しない量であるものとする） と、 アビジンを結合した微粒子とを接触さ せる工程：及び
( 2 ) 分析対象物質と結合体との間で形成される免疫複合体、 及びアビジン結合 微粒子から生じる凝集の程度を検出することにより分析対象物質を分析する工程 を含む、 免疫学的分析方法に関する。
本発明の免疫学的分析試薬の好ましい態様によれば、 結合体が、 抗原又は抗体 に 1分子のビォチンを結合した結合体である。
本発明の免疫学的分析方法の別の好ましい態様によれば、 分析対象物質を含有 する可能性の有る被検試料と、 分析対象物質に対する抗原又は抗体に 1分子のビ ォチンを結合した結合体とを最初に接触させ、 続いてアビジン結合微粒子と接触 させるか、 あるいは、 分析対象物質を含有する可能性の有る被検試料と、 分析対 象物質に対する抗原又は抗体に 1分子のビォチンを結合した結合体と、 アビジン 結合微粒子とを同時に接触させる。
本発明の免疫学的分析方法の更に別の好ましい態様によれば、 アビジン結合微 粒子が、 アビジンを結合したラテックス粒子である。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1で調製した本発明による 2液系分析用試薬を使用した場合と、 比較例 1及び 2で調製した S F抗体感作ラテックスを使用した場合との吸光度変 化量の比較を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いる第 1組成物に含有させる結合体は、 分析対象物質に対する抗原 又は抗体に特定量のビォチンを結合した結合体である。 本発明では、 前記結合体 として、 分析対象物質が存在しない状況下、 前記アビジン結合微粒子とは実質的 に凝集しない量のビォチン （好ましくは、 ビォチン 1分子） を、 前記抗原又は抗 体に結合した結合体を使用する。
例えば、 前記結合体として、 分析対象物質に対する抗原又は抗体にビォチン 2 分子を結合した結合体を調製し、 この結合体と、 アビジン結合微粒子とを共存さ せると、 分析対象物質が存在しなくても、 アビジンとビォチンとが特異的に結合 可能であるため、 ァビジン結合微粒子と結合体とァビジン結合粒子とがこの順に 連結した複合体が形成され、 自己凝集が発生する。
本明細書において、 「分析対象物質が存在しない状況下、 アビジン結合微粒子 とは実質的に凝集しない量」 のピオチンとは、 分析対象物質に対する抗原又は抗 体にピオチンを結合した結合体と、 アビジン結合微粒子とを、 分析対象物質の不 在下で共存させた場合に、 実質的に自己凝集が発生しない量のビォチンを意味す る。 なお、 「実質的に凝集しない」 とは、 この方法の実施にあたり、 分析結果に 影響を与えないことを意味する。
先に述べたように、 抗原又は抗体にビォチン 2分子を結合した結合体では、 前 記条件下で自己凝集が発生する。 従って、 本発明で用いる結合体では、 抗原又は 抗体に結合させるビォチン量は、 2分子を越えることはなく、 好ましくは 1分子 である。
本発明で用いる結合体は、 公知の方法により調製することができ、 例えば、 ビ ォチン化試薬を用いることにより、 抗原又は抗体にビォチン 1分子又はそれ以上 (好ましくは 1分子） を化学的に結合させるか、 あるいは抗原又は抗体にビォチ ン 1分子又はそれ以上 （好ましくは 1分子） を物理的に吸着させ、 続いてビォチ ン分子と結合又は吸着していない残存ビォチンを取り除く処理を行った後、 緩衝 液で最適濃度に希釈することによって得ることができる。 得られた結合体を、 分 析対象物質の不在下で、 アビジン結合微粒子と共存させ、 実質的に自己凝集が発 生するか否かを分析することにより、 抗原又は抗原に結合させたビォチン量が、 「分析対象物質が存在しない状況下、 ァビジン結合微粒子とは実質的に凝集しな い量」 であるか否かを判定することができる。
前記希釈液をそのまま、 又は適当な添加剤 （例えば、 周知の安定化剤） を加え て、 第 1組成物として用いることができる。 あるいは、 前記の希釈液をそのまま, 又は適当な添加剤 （例えば、 周知の安定化剤） を加えてから凍結乾燥して、 粉末 状の第 1組成物とすることもできる。 前記安定化剤としては、 例えば、 無機塩
(例えば、 塩化ナトリウム又はアジ化ナトリウム） 、 タンパク質 （例えば、 ゥシ 血清アルブミン） 、 又は塩化コリン等を挙げることができる。
前記結合体において、 ピオチンと結合させる抗原又は抗体は、 それぞれ分析対 象物質と抗原抗体反応を起こす抗原又は抗体であれば特に限定されず、 抗体 （モ ノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を含む） としては、 免疫グロブ リン分子それ自体、 あるいは抗体フラグメント [例えば、 F a b、 F a b ' 、 F ( a b ' ) 2、 又は F v ] を用いることができる。 なお、 モノクローナル抗体を ビォチンと結合させる場合には、 分析対象物質である抗原に対して異なる部位で 結合する 2種類以上のモノクローナル抗体を用いる場合と抗原の認識部位が 2つ 以上存在するときは 1種類のモノクローナル抗体を用いる場合がある。
本発明で用いる第 2組成物に含有させるアビジン結合微粒子は、 無機物又は有 機物の微粒子に多数のアビジン分子を結合させて調製した微粒子である。 微粒子 としては、 有機高分子微粒子、 例えば、 ポリスチレン、 スチレン一メタクリル酸 共重合体、 スチレン一グリシジル （メタ） ァクリレート共重合体、 又はスチレン —スチレンスルホン酸塩共重合体などのラテックス等の微粒子であるラテックス 粒子を使用することができる。
前記微粒子の平均粒径も、 特に限定されるものではないが、 0 . 0 1〜1 . 0 mであることが好ましく、 特にラテックス粒子の場合には、 分析対象物質の検 出濃度や使用する測定機器によって 0 . 0 5〜 1 . O m (好ましくは 0 . 0 5 〜0 . の範囲で適宜選択することができる。
アビジンとしては、 ピオチンに特異的に強く結合することのできる任意のアビ ジン、 例えば、 卵白アビジン、 ストレプトアビジン、 又は遺伝子操作で得られた アビジン （すなわち、 リコンビナントアビジン） 等を用いることができる。
前記のアビジン結合微粒子を調製する方法としては、 例えば、 微粒子 （例えば、 ラテックス粒子） にペプチド合成試薬 （例えば、 水溶性カルポジミド） を添加し た後にアビジンを加えて撹拌し、 遠心分離してから水中に分散させる方法を用い ることができる。 こうして得られたアビジン結合微粒子 （特には、 アビジン結合 ラテックス粒子） の分散性が保たれる緩衝液で希釈することができ、 この希釈液 をそのまま、 又は適当な添加剤 （例えば、 周知の安定化剤） を加えて、 第 2組成 物として用いることができる。 あるいは、 前記の希釈液をそのまま、 又は適当な 添加剤 （例えば、 周知の安定化剤） を加えてから凍結乾燥して、 粉末状の第 2組 成物とすることもできる。
アビジン結合微粒子 （特には、 アビジン結合ラテックス粒子） の分散性を保つ ことのできる緩衝液は、 通常の緩衝液 〔例えば、 1 O mm o I Z L燐酸緩衝液
( p H 7 . 0 ) 〕 に分散剤 （例えば、 T W E E N 2 0など） を添加して調製する ことができる。 第 2組成物用の前記安定化剤としては、 第 1組成物で列挙した安 定化剤を用いることができる。
前記の方法で調整した第 1組成物及び第 2組成物を、 例えば、 前記結合体を含 有する液状又は粉末状第 1試薬と、 前記アビジン結合微粒子を含有する液状又は 粉末状第 2試薬との 2試薬系とすることができる。 なお、 粉末状組成物は、 使用 前に適当な緩衝液によって液状化してから使用する。
本発明の免疫学的分析方法では、 （ィ） 分析対象物質を含有する可能性の有る 被検試料と、 （口） 分析対象物質に対する抗原又は抗体にビォチンを結合した結 合体 [但し、 抗原又は抗体に結合するビォチン量が、 分析対象物質が存在しない 状況下、 前記アビジン結合微粒子とは実質的に凝集しない量 （好ましくは 1分 子） であるものとする] と、 （ハ） アビジン結合微粒子とを接触させ、 分析対象 物質と結合体との間で形成される免疫複合体、 及びアビジン結合微粒子から生じ る凝集の程度を検出することにより、 被検試料中の分析対象物質を分析すること ができる。 本発明による前記の免疫学的分析試薬は、 本発明によるこの免疫学的 分析方法を実施するのに適した試薬である。
前記の被検試料 （ィ） と結合体 （口） とアビジン結合微粒子 （ハ） との接触は 同時に行うこともできるし、 あるいは、 前記の被検試料 （ィ） と結合体 （口） と を最初に接触させ、 続いて、 アビジン結合微粒子 （ハ） を接触させることもでき る。 被検試料中に分析対象物質が含まれている場合には、 前記の被検試料 （ィ） と結合体 （口） との接触により、 抗原抗体反応が起きて免疫複合体が形成され、 もう一方で、 結合体 （口） とアビジン結合微粒子 （ハ） との接触により、 ビォチ ン一アビジン反応によって、 ビォチン一アビジン複合体が形成される。 例えば、 前記の被検試料 （ィ） と結合体 （口） との接触により、 抗原抗体反応が起きて免 疫複合体が形成され、 続いて、 その免疫複合体のビォチンと、 アビジン結合微粒 子のアビジンとがビォチン一アビジン反応によって結合する。 前記の免疫複合体 を形成した分析対象物質は、 別の結合体 （口） との接触により、 もう一方の免疫 複合体を形成し、 その免疫複合体が更にアビジン結合微粒子とも結合するので、 凝集が発生する。 更に、 前記のアビジン結合微粒子においても、 多数のアビジン 分子が存在し、 それらのアビジンが、 前記と同様のビォチン一アビジン反応及び 抗原抗体反応を起こすので、 この点からも凝集が進行する。
凝集の程度を検出する方法としては、 従来公知のスライド凝集法やマイクロプ レー卜凝集法を利用することができ、 ラテックス粒子の凝集の程度を光学的に検 出する場合には、 例えば、 散乱光強度、 吸光度又は透過光強度を測定する従来公 知の光学機器を用いることができ、 好ましい測定波長は 3 0 0〜 8 0 0 n mであ る。 凝集の程度を検出する方法は、 公知の方法に従い、 用いるラテックス粒子の 大きさ、 ラテックス濃度の選択、 抗原抗体反応の反応時間、 ビォチン一アビジン 反応の反応時間などの設定により、 散乱光強度、 吸光度又は透過光強度の増加若 しくは減少を測定するか、 あるいはこれらを組合せることにより行うことができ る。
本発明の免疫学的分析方法において、 抗原抗体反応の反応系に存在させる抗体 又は抗原の濃度、 結合体に含まれるビォチンの量、 あるいはアビジン結合微粒子 の量は、 被検試料の種類や分析対象物質の種類によって適宜変更することができ る。 例えば、 血清 （被検試料） 中の I g G (分析対象物質） 濃度は 5 0 m g Zm Lまでの測定範囲が必要となるので、 その測定範囲に応じて使用量を設定し、 あ るいはエラスターゼ 1 (分析対象物質） などは測定範囲は 5 0 n g Zm Lまでな ので、 その測定範囲に応じて使用量を設定する。
本発明の免疫学的分析方法において、 被検試料と、 ビォチンを結合した結合体 とを接触させることによる抗原抗体反応の条件は、 通常の免疫学的分析方法にお ける条件と同様である。 本発明の免疫学的分析方法においては、 前記の抗原抗体 反応を実施する系と同じ系内で、 ビォチン結合体とアビジン結合微粒子とを接触 させることによるビォチン一アビジン反応を実施するので、 ビォチン一アビジン 反応に適した条件にする必要がある。
抗原抗体反応及びビォチン一アビジン反応の反応媒体としては、 分析対象物質 の種類に応じて適切な各種緩衝液を選択することができる。 この緩衝液は、 分析 対象物質を失活させることがなく、 しかも抗原抗体反応及びビォチン一アビジン 反応を阻害しないようなイオン濃度や P Hを有するものであればよい。 例えば、 グッド緩衝液、 グリシン緩衝液、 又は卜リス緩衝液を使用することができる。 抗 原抗体反応及びピオチン一アビジン反応の P Hは、 好ましくは 5〜 1 0、 より好 ましくは 6〜8である。 反応温度は、 好ましくは 0〜5 0 °C、 より好ましくは 2 0〜 4 0 °Cである。 反応時間は適宜選択することができる。
本発明による分析方法の対象となる被検試料は、 分析対象物質である抗原又は 抗体を含む可能性のある試料である限り、 特に限定されるものではなく、 例えば, 臨床診断に一般的に用いられる生体由来液、 例えば、 血液、 血清、 血漿、 又は尿、 あるいは実験サンプルなどを挙げることができる。
本発明による分析方法の分析対象物質も、 一般に抗原抗体反応を利用して分析 することのできる物質 （特に生理活性物質） であれば特に限定されない。 分析対 象物質の代表例としては、 タンパク質や脂質等を挙げることができ、 より詳しく は、 例えば、 各種抗原、 抗体、 レセプター、 又は酵素等を挙げることができる。 具体的には、 C反応性タンパク質 （C R P ) 、 リウマチ因子、 フェリチン、 β - 2マイクログロブリン、 一フエトプロテイン （AFP) 、 抗ストレブトリジン O抗体、 I g E、 梅毒トレポネ一マ抗体、 梅毒脂質抗原に対する抗体、 B型肝炎 ウィルス （HBS抗体、 HBS抗原、 HBc抗体、 H B e抗体） Dダイマー、 フ ィプリン■ フイブリノゲン分解産物 （FDP) 、 可溶性フイブリン （S o I u b I e f i b r i n : S F) 、 プラスミン ' 2—プラスミンインヒビター複合 体 （PP I ) 、 前立腺特異抗原 （PSA) 、 エラスターゼ 1、 エラスターゼ XD P、 トロンボモジュリン、 抗 DNA抗体等を挙げることができる。 実施例
以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の範囲を 限定するものではない。
実施例 1 ：可溶性フィブリンの測定
( 1 ) 可溶性フィプリン抗体結合ピオチン溶液の調製
可溶性フイブリン （S F) に対するモノクローナル抗体として、 W095Z1 261 7号公報に記載のハイプリ ドーマ FM N o. 43— 1から分泌されるモ ノクローナル抗体 FM No. 43— 1を使用した。 前記ハイプリ ドーマは、 独 立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター [ (旧） 工業技術院生命ェ 学工業技術研究所 （あて名 ： 〒 305— 8566 日本国茨城県つくぱ市東 1丁 目 1番地 1 中央第 6) ] に 1 993年 1 0月 27日から国内寄託され、 1 99 4年 1 0月 27日から国際寄託に移管されている。 国際寄託番号 （国際寄託番号 に続く 口 内は国内寄託番号） は、 FERM BP-4846 [FER P- 1 3925] である。
具体的には、 前記 W095 1 261 7号公報の実施例 2 (b) に記載の方法 と同様の方法により、 可溶性フイブリン （S F) に対するモノクローナル抗体腹 水を調製し、 硫酸アンモニゥムによって粗精製した後、 イオン交換樹脂 （DEA E) で処理し、 更にペプシン消化によって得られた F (a b' ) 2に 2—メルカ プ卜ェチルァミンを加え、 F a b' 抗体フラグメントを作製した。 こうして得ら れた抗体を 2. 5mg /m Lの濃度で 50mmo I ZLリン酸緩衝液 （ p H 7. 1 ) に溶解した液に、 マレイミドビォチン （フナコシ社製） 0. 6mgを添加し， 室温にて一昼夜感作した。 次いで、 G 25スーパーファインでゲル濾過を行うこ とにより、 F a 抗体とビォチンとの結合体を回収し、 その結合体を、 0. 1 mo I ZLリン酸緩衝液 （p H 6. 5) に 0. 05 m g Lの量で添加し、 S F抗体結合ビォチン溶液とした。
(2) アビジンラテックス懸濁液の調製
1 Oo/o化学結合ラテックス 0. 1 mL (粒径： 0. 3 m) に最終濃度が 2. 5 mgZmLになるように水溶性カルポジミ ド （Wa t e r— s o l u b l e c a r b o d i m i d e ; WS C) を添加し、 1 0分間静置した後、 ストレプト アビジン 0. 8mgZmLを添加し、 1時間攪拌した。 この混合物を遠心し、 得 られた沈殿に蒸留水 0. 5m Lを加えて攪拌し、 2%アビジンラテックス分散液 を得た。 この分散液を 1 0 mm o 1 1_ー1\10 3懸濁液 （p H 7. 0) で希釈 して 0. 5%アビジンラテックス懸濁液とした。
(3) S F抗原分析用試薬
本実施例のヒト S F抗原分析用試薬は、 前項 （1 ) の S F抗体結合ビォチン溶 液からなる第 1試薬と、 前項 （2) のアビジンラテックス懸濁液からなる第 2試 薬とから構成される 2液系の試薬である。
(4) 標準 S F抗原液
市販のフイブリノゲン （XIII因子フリー： カビ社製） にトロンビンを作用さ せ、 得られたクロットを酢酸で可溶化し、 血漿に添加して S F抗原を作製した。 この抗原を 0 g m L、 1 0 g/mL、 20 / gZmL、 40 μ /m L 60 μ g/mL, 又は 80 g/mL濃度で含むヒ卜血漿を使用した。
(5) 分析方法
前項 （4) の標準 S F抗原液 3 Lに、 前項 （1 ) の S F抗体結合ビォチン溶 液 1 30 j« Lを混合し、 37 °Cで 5分間保持した後、 前項 （2) のアビジンラテ ックス懸濁液 1 30 j« Lを添加して攪拌し、 この添加から 1 0分間経過後までの 波長 600 n mでの吸光度を測定した。 この 1 0分間の吸光度の変化量を吸光度 変化量 （AA b s) とする。 測定は自動分析装置 LP I A— S 500を用いて行 つた。 結果を図 1に示す。
比較例 1 ( 1 ) 抗体のラテックスへの物理的吸着
実施例 1 (1 ) で調製した抗 S Fモノクローナル抗体の F (a b' ) 2フラグ メン卜を 0. 5mgZmLの濃度で 1 0mmo l ZL—T r i s—HC I緩衝液 (p H8. 0) に溶解して調製した抗体液 5 m Lに、 平均粒径 0. 3 /mのポリ スチレンラテックス [固形分 =5% (wZv) ； 日本合成ゴム社] 5m Lを添加 して、 室温にて 30分間攪拌した。
前記混合物に、 0. 3% (w/v) ゥシ血清アルブミン （BSA) を含有する 1 0 Ommo I ZL— T r i s— HC I緩衝液 （ p H 8. 0 ) を添加し、 室温に て 60分間撹拌した後、 前記混合物を 20， 000 r p mで遠心分離した。
得られた沈殿物に、 0. 05%N a N3含有の 1 Ommo I /し一 T r i s— H C I緩衝液 （ p H 8. 0 ) 1 0 mしを添加して撹拌し、 比較用抗 S F抗体感作 ラテックス試薬を調製した。
(2) S Fの測定
実施例 1 (4) で調製した標準 S F抗原液 3 Lに、 0. I mo l ZLリン酸 緩衝液 （p H 6. 5) 1 30 1_を混合し、 37 °Cで 5分間保持した後、 比較例 1 (1 ) で調製した抗 S F抗体感作ラテックス試薬 1 30 Lを添加して攪拌し、 この添加から 1 0分間経過後までの波長 600 nmでの吸光度を測定した。 結果 を図 1に示す。
比較例 2
(1 ) 実施例 1 (1 ) で調製した S F抗体結合ビォチン溶液を 0. 5mgZm Lの濃度で 1 Ommo I しー MOPS緩衝液 （p H7. 0) に溶解した液に、 実施例 1 ( 2 ) で用いたアビジンラテックスを 1 %濃度で加えて室温にて 30分 間攪袢し、 S F抗体感作ラテックスを調製した。 こうして得られた S F抗体感作 ラテックスを 1 Ommo I L— MO PS懸濁液 （p H 7. 0) で希釈して 0. 5 % S F抗体感作ラ亍ックス懸濁液とし、 比較用抗 S F抗体感作ラ亍ックス試薬 とした。
(2) 実施例 1 (4) で調製した標準 S F抗原液 3 しに、 0. 1 mo I ZLリ ン酸緩衝液 （p H6. 5) 1 3 OjU Lを混合し、 5分間経過後、 比較例 2 (1 ) で調製した抗 S F抗体感作ラテックス試薬 1 30〃 Lを添加して攪拌し、 この添 加から 1 0分間経過後までの波長 6 0 0 n mでの吸光度を測定した。 結果を図 1 に示す。
図 1において、 讕は比較例 1で調製した抗 S F抗体感作ラテックス試薬を、 ♦ は比較例 2で調製した抗 S F抗体感作ラテックス試薬を使用した場合の結果であ る。 ·及び〇は、 前記実施例 1 ( 5 ) の操作においてそれぞれ本発明による 2液 系分析用試薬を使用した場合の結果であり、 暴は、 S F抗体結合ビォチン濃度が 0 . 0 2 5 O m g Zm Lの場合、 そして〇は、 S F抗体結合ビォチン濃度が 0 . 0 5 m g Zm Lの場合の結果である。 また、 ▲は、 前記実施例 1 ( 5 ) の操作に おいて、 S F抗体結合ピオチン不在下 （すなわち、 S F抗体結合ビォチン濃度 = 0 . 0 O m g /m L ) の場合の結果である。
図 1から明らかなように、 S F抗体結合ピオチン溶液からなる第 1試薬と、 ァ ビジンラテックス懸濁液からなる第 2試薬とから構成される 2液系の本発明によ る分析用試薬を用いると、 従来法による通常のラテックスを用いる方法 （比較例 1 ) と同等若しくはそれ以上の反応性が得られた。 更に、 本発明による分析用試 薬では、 予めピオチン化抗体をアビジンラテックスに結合した方法 （比較例 2 ) と比べ、 自己凝集がみられないため、 S F抗原不在下 （0濃度） での吸光度変化 量が低い値を示した。 これは、 測定感度を高める上でも極めて重要な効果である。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 抗体又は抗原をラテックス粒子等の微粒子に担持させるため の煩雑な操作が不必要となる。 また、 ラテックス粒子の自己凝集の発生がみられ なくなり保存安定性が向上する。 更に、 従来技術と異なり、 分析対象物質に対す る抗体又は抗原をラテックスに担持させる際に、 ラテックス表面への吸着によつ てタンパク質が変性することがないので、 分析対象物質に対する反応性に変化が 生ずることなく分析対象物質の正確な測定が可能となる。 更に、 免疫凝集反応に 基づく分析対象物質の測定において、 通常の抗体 （又は抗原） 感作ラテックス
(物理吸着法） を用いる方法より吸光度の値が上昇して感度が向上した。 また、 予めビォチン化抗体をアビジンラテックスに結合した方法と比べ、 本発明方法は ブランク値が低くなリ、 低値における精度が向上し、 高値においても本発明方法 は比較例以上の反応性が得られる。 本発明の分析試薬は、 自動分析機用の分析試 薬として適している。 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 分析対象物質に対する抗原又は抗体にビォチンを結合した結合体を含む組成 物と、 アビジンを結合した微粒子を含む組成物とを含み、 前記結合体において、 抗原又は抗体に結合するビォチン量が、 分析対象物質が存在しない状況下、 前記 ァビジン結合微粒子とは実質的に凝集しない量である、 免疫学的分析試薬。
2 . 前記結合体が、 抗原又は抗体に 1分子のビォチンを結合した結合体である、 請求項 1に記載の分析試薬。
3 . アビジン結合微粒子が、 アビジンを結合したラテックス粒子である、 請求項 1又は 2に記載の分析試薬。
4 . ( 1 ) 分析対象物質を含有する可能性の有る被検試料と、 分析対象物質に対 する抗原又は抗体にビォチンを結合した結合体 （但し、 抗原又は抗体に結合する ビォチン量が、 分析対象物質が存在しない状況下、 前記アビジン結合微粒子とは 実質的に凝集しない量であるものとする） と、 アビジンを結合した微粒子とを接 触させる工程；及び
( 2 ) 分析対象物質と結合体との間で形成される免疫複合体、 及びアビジン結合 微粒子から生じる凝集の程度を検出することにより分析対象物質を分析する工程 を含む、 免疫学的分析方法。
5 . 前記結合体が、 抗原又は抗体に 1分子のピオチンを結合した結合体である、 請求項 4に記載の分析方法。
6 . 分析対象物質を含有する可能性の有る被検試料と、 分析対象物質に対する抗 原又は抗体に 1分子のビォチンを結合した結合体とを最初に接触させ、 続いてァ ビジン結合微粒子と接触させる、 請求項 4又は 5に記載の分析方法。
7 . 分析対象物質を含有する可能性の有る被検試料と、 分析対象物質に対する抗 原又は抗体に 1分子のビォチンを結合した結合体と、 アビジン結合微粒子とを同 時に接触させる、 請求項 4〜 6のいずれか一項に記載の分析方法。
8 . アビジン結合微粒子が、 アビジンを結合したラテックス粒子である請求項 4 〜 7のいずれか一項に記載の分析方法。
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