WO2002041000A1 - Immunoessai pour metalloprotease a matrice liee a la membrane - Google Patents

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Kayoko Yonezawa
Noboru Fijimoto
Miwa Ogawa
Kazushi Iwata
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    • G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)

Definitions

  • the present invention relates to an immunological method using an antibody ( ⁇ 1 ⁇ -MMP antibody) against swelling-linked matrix meta-oral protease (MT solid P) and its use.
  • the present invention relates to a group power comprising (0) a MT-MMP solubilized and / or solubilized from a cell membrane using a surfactant and Z or a reducing agent, and (ii) an autonomously solubilized MT-MMP,
  • the present invention relates to (a) a method of releasing from a cell membrane using a substance selected from the group consisting of a surfactant and a reducing agent.
  • the present invention relates to (A) a method for searching for a factor that changes the expression of MT-MMP, and (B) a method for searching for a factor that changes the enzymatic activity of MT-A and a drug containing the factor.
  • the present invention provides a method for transferring MT-resistant Ps such as MT1-banded P from a cell membrane using a surfactant and / or a reducing agent.
  • the present invention also relates to a method for measuring the enzymatic activity of MT-MMP and
  • Matrix meta-oral proteases are soluble enzymes having a structure including a propeptide, an enzyme active site, Hinge and a hemopoxin-like site as basic domains.
  • MT-solid Ps membrane-bound matrix meta-oral protease
  • MT-solid Ps membrane-bound matrix meta-oral protease
  • MMP-1 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 18, 19, 20, 21, 2, 23, and 26 are available as soluble M, -Genes of 14, 15, 16, 17, 24, 25 (T1-, MT2-, MT3-, MT4-, MT5-, MT6-MMP, respectively) have been cloned and identified.
  • MMP-2 is an enzyme that degrades gelatin and type IV collagen, which is a component of the matrix. It is well known that its activity correlates well with the invasion 'metastasis of many silk tumors.
  • Pro MPs other than MMP-2 (MMP-1, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 13) have cascades that are activated by endogenous serine protease activity 'S MMPs
  • Mouth MMP-2 is a novel protein in that it has a different activation mechanism. That is, pro-MP-2 binds to MT1-MMP via TIMP-2 in cells ⁇ , and another adjacent molecule, MT1-MMP, cleaves the pro-MMP-2 propeptide and is converted to active ttS. You.
  • MT1-MMP is deeply involved in the activation mechanism of MMP-2, which is highly correlated with invasive metastasis of human cancer thread, and MT1-MMP itself has the extracellular matrix angle-separating ability. It is thought to have an important role in cancer invasion and metastasis.
  • MT1-MP is strongly reported to be widely expressed in many cancer cells such as breast, colorectal, stomach, and head and neck cancers, and the relationship between the presence of MT1-MMP and the malignancy of the cancer, that is, its invasiveness and metastatic potential Sex is drawing attention.
  • RA rheumatoid arthritis
  • Hyperplastic synovial cells produce secreted-1,3, MT1-MP and ⁇ -1, and underlying fibroblasts produce ⁇ -2 and ⁇ -2.
  • Neutrophils infiltrating the synovium and joint space produce 8-8, 9, and these Ps and TIMPs are secreted into synovial fluid.
  • the levels of concealed-1, 2, 3, 8, and 9 in RA synovial fluid are significantly higher than those of osteoarthritis (OA) synovial fluid, exceeding the level of TIMPs and predominantly in MMPs.
  • OA osteoarthritis
  • chondrocytes themselves express MMP-1, 1, 3, 7, 8, and 13, which leads to the destruction of RA articular cartilage.
  • MMP-1 1, 3, 7, 8, and 13
  • the relationship between the onset and progression of RA and MT-MMP is unknown, but the activation of pro-MMP-2 and the destruction of articular cartilage due to ectopic dissociation of ECM are involved in the onset and progression of RA Possibilities increase.
  • MT-MPs are insoluble, unlike other soluble Ps, because they have a hydrophobic transmembrane domain on the C-terminal side and are embedded in cells via this.
  • MT1-MMP has been strongly reported to be localized at the cell membrane. ⁇
  • Concanavalin A Con A
  • the culture supernatant contains hydrophobic C-terminal
  • the MT1-MMP force that has lost the transmembrane domain is present as a shedding. It is said that it is cleaved at the C-terminal side by some mechanism during membrane conjugation during the apoptosis induced by concanapalin A, and it is said that it is converted from the membrane.
  • soluble bMll-MMPs The physiological functions of soluble bMll-MMPs are unknown, and various physiological functions are expected, as are soluble MPs.
  • a method applicable to both these membrane-bound T 1-MMP and soluble MT1-MMP is appropriate.
  • Human cancer tissue infiltration '' Metastasis the role of MT1-MMP in the pathology of rheumatoid arthritis (RA), to determine the human body fluids, e.g. blood, joint fluid, ascites, pleural effusion, urine It is important to know the amount and elemental activity of MT1-MMP in human tissues and cultured cells.
  • RA rheumatoid arthritis
  • MT1-MMP can be measured by a method that detects mRNA expression partially by Northern blotting, or a method that detects RT-PCR half-way by RT-PCR. It does not indicate the amount of functional yeast. In addition, these methods limit the number of test samples and are technically complicated, such as the extraction of fflRNA, and it is difficult to ensure I-activity.
  • MT1-MMP For the detection of MT1-MMP, there is a method of consulting with the activation of pro-MMP-2 as an index. By analyzing the test sample with gelatin zymography, activated MMP-2 can be detected and the activation factor MT1-layer can be assumed. This method only indirectly observes the presence of MT1-MMP, and samples such as blood with high tanno and protein concentration are directly subjected to gelatin zymography. It is impossible.
  • Gelatin zymography is an excellent method for detecting the activity of MT1- ⁇ in non-purified samples because it can simultaneously perform fractionation and activity detection of MT1- ⁇ on electrophoresis. The operation is complicated, and the measurement result is a semi-simple judgment.
  • An object of the present invention is to provide a method for quickly and quickly performing MT-MP such as MT1-MMP with simple operation and leaves, with high sensitivity and accuracy, and to measure the activity of each MT-band P enzyme including MT1-MMP.
  • the present invention is a.
  • the immunological method is used to selectively immobilize ⁇ -screen, and the immobilized ⁇ -banded ⁇ Measuring enzyme activity specifically (MT-layer enzyme activity measurement method); and
  • the present invention is a.
  • MT-MMPs immunological method for MT-MMPs which comprises using an antibody against MT MMP selected from the group consisting of:
  • the antibody is capable of maintaining immunoreactivity in the presence of (i) those selected from the group consisting of surfactants and reducing agents, and (ii) artificially denatured to expose the epitope.
  • the immunological substance has at least one selected from the group consisting of obtaining an MT-MMP as an immunity; ⁇ ⁇ ;
  • the MT-solid P that can be immunologically obtained is obtained by using (i) a molecule selected from the group consisting of a surfactant and a reducing agent, and a molecule released and / or solubilized from the cell membrane. (ii) autonomously avoiding from the cell membrane! any of the above-mentioned [8], wherein the number of glues is at least one of molecular species selected from the group consisting of 3 ⁇ 4 ⁇ or solubilized ⁇ ?
  • An antibody linked to the group consisting of an antibody against MT1-MMP, an antibody against MT2-MMP, an antibody against MT3-MMP, an antibody against MT4-MP, an antibody against MT5-MP, and an antibody against ⁇ ⁇ 6-MMP The content of the above (15) is defined as containing
  • a screening method which comprises using a compound selected from the group consisting of, and screening for a compound that promotes or inhibits the expression of a compound selected from the group consisting of MT-MPs;
  • a measurement method characterized by measuring the enzyme activity of MT-substituted P immobilized by an immunological method
  • MT-MMP power (i) Good or solubilized from the cell membrane using a substance selected from the group consisting of surfactants and reducing agents; and (ii) Autonomous cell membrane power, etc.
  • MT-MMP is selected from the group consisting of MT1-MMP, MT2-MMP, T3-MP, MT4-MP, T5-MMP and 1WT6-MMP 48]
  • the solid-phased MT-MMP according to any one of [50] to [50];
  • a screening kit for a compound that promotes or inhibits the enzyme activity of MT-MMP for use in the method according to any one of the above [41] to [47];
  • (57) (a) a compound obtained by the method according to any one of (33) to (36) and promoting or inhibiting the expression of one selected from the group consisting of MT-Ps; 37] From the group consisting of MT-MMPs obtained by using the kit of any one of [40] :! (C) a compound that promotes or inhibits the enzyme activity of MT-band P obtained by the method according to the above (53) or (54); and (d) a compound that promotes or inhibits the expression of the enzyme. Or a medicament characterized by containing a substance derived from the group consisting of compounds that promote or inhibit the enzyme activity of MT-MP obtained using the kit of [56];
  • MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MP, MT5-Edit P and ⁇ ⁇ 6-Marauder P promote or inhibit the expression of ⁇ - ⁇ carried from the group consisting of The above-mentioned [57], wherein the compound contains a compound that promotes or inhibits the enzyme activity of the zirconium sulfate.
  • the amount of MT- ⁇ P at least one of the preferred species evacuated from the group consisting of lost and / or solubilized liver, as an indicator, the ability to face cancer sickles or to metastasize cancer Face Or the ability to address the degree of progression of rheumatoid arthritis or Alzheimer's disease, or (B) (iii) propelled out of the cell membrane using cells that were weekly from the group consisting of surfactants and reducing agents And Z or solubilized molecules and (iv) autonomously from fine fiber: ⁇ -// at least one of the molecular species from the group consisting of solubilized ⁇ - ⁇ MP
  • the above-mentioned [(1) is characterized by evaluating the ability of cancer to evolve or to metastasize cancer or to appreciate the progress of rheumatoid arthritis or Alheimer's disease. 60] Test agent as described;
  • an antibody selected from the group consisting of: an antibody against MT1-P, an antibody against T2-MMP, an antibody against MT3-MMP, an antibody against MT4-MMP, an antibody against MT5-MMP, and an antibody against M6-MMP.
  • test agent of any one of the above-mentioned [60] to [65], which is characterized by measuring the enzymatic activity of ⁇ -band P;
  • an immunological method wherein in any one of the above (1) to (66), the antibody recognizes a hexoxin-like domain of MT-MMP;
  • the MT immobilized by the immunological quantification method, the immunological measurement method, the screening method, the screening kit, the enzyme activity measurement method, and the immunological method for the soluble SMI-MMP are preferably used. -Hidden, medicinal, medicine, etc. are shared.
  • the present invention is a.
  • an antibody against MT-MMP selected from the group consisting of MT-MMPs One that is selected from the group consisting of ⁇ -surfactants and heavy-absorbing reducing agents, is capable of excelling in immunoreactivity under the conditions and (ii) immunizing MT-MMP, which has been artificially modified to expose the epitope $,
  • Antibody against MT1-MMP, antibody against MT2-MMP, antibody against MT3-secreted, antibody against MT4-MP, antibody against MT5-MMP, and antibody against ⁇ 6-banded P The antibody of the above-mentioned [68], wherein the antibody is a fiber.
  • Figure 1 shows that the monoclonal antibody against MT1-MP of the present invention was ⁇ ffl-treated, and the AMH-MMP (58 kDa) and hemopoxin domains (30 kDa, 34 kDa), The results of epitope mapping using a fragment of the medium domain (21 kDa) as an antigen are schematically shown.
  • FIG. 2 shows that the monoclonal antibody against MTl-MMP of the present invention was used to prepare COS-7 expressing each of Ml-MMP, MT2-MMP (mouse) and 3-MMP prepared in Example 1- (2).
  • the results of a cross-reactivity test by western blotting using the cell lysate as an antigen are shown in a schematic diagram.
  • FIG. 3 shows an example of a standard curve obtained by the MT1-fixed sandwich.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the activity of MTl-band P using various solid-phase monoclonal antibodies.
  • FIG. 5 shows, for each sample, the amount of MTl MMP in the extract prepared from the cancer thread and the normal thread near the cancer thread, which was determined for each sample.
  • FIG. 6 shows the correlation between the amount of MTl-MMP in the extract prepared from the cancer thread and the index of the presence or absence of lymph node metastasis of the cancer thread. .
  • FIG. 7 shows the dilution curve obtained by measuring the amount of MT1-banded P in culture supernatants prepared from human, mouse, rat and rabbit cultured cell lines.
  • FIG. 8 shows the results of testing the immunoreactivity of MT1-band P monoclonal antibody against MT1 band P in the presence and under the presence of a surfactant and a reducing agent. ⁇ -MMP was subjected to SDS-PAGE and then reacted with each antibody after being transferred to a membrane.
  • FIG. 9 shows the comparison of the amino acid sequences of the hemopoxin domain of human, mouse, rat and rabbit-derived * MT1-fraction P. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention provides an immunological method using an antibody against each of 8MT-solid P, including an immunological method using an antibody against ⁇ -MMP.
  • an immunological method of MT-MMP using a surfactant and Z or a reducing agent is used.
  • the present invention comprises a step of using at least one selected from the group consisting of a surfactant and a reducing agent to cause MT- ⁇ P to enter or Z or solubilize MT- ⁇ P from the cell membrane.
  • MT-fresh immunological method is used.
  • ⁇ -MMPs such as MT1-, ⁇ 2-, ⁇ 3-, ⁇ 4-, ⁇ 5-, ⁇ 6- ⁇ , etc. are taken as the images.
  • the immunological fM method is used for fj.
  • Antibodies that specifically react with the MT-MP include (i) immunoreactivity in the presence of a surfactant and / or a reducing agent, and (ii) artificially denatured epitope. From the group consisting of obtaining immunized MT-MMPs, such as exposed ⁇ -MMPs: having illuminated trees.
  • MT-MMP includes ⁇ -band P.
  • the immunologically capable protein is one of the following:
  • a screening method and a screening kit for a compound that promotes or inhibits the expression of ⁇ -education P can be used.
  • a medicament characterized by containing a compound that promotes or inhibits the expression of MT1-MMP obtained by the screening method or the screening kit can also be used.
  • a drug for cancer or cancer metastasis, and a drug for progression of rheumatoid arthritis or Alzheimer's disease can be obtained.
  • the present invention provides a method for measuring the enzymatic activity of MT1- ⁇ , which comprises performing ⁇ -fl on ⁇ ⁇ - ⁇ ⁇ immobilized on a reaction vessel by an immunological method, and You can also share trees.
  • a method for measuring the enzymatic activity of MT1-MMP based on the number of trees by inverting MT1-1 which has been selectively immobilized on a reaction vessel via a monoclonal antibody, and a method for measuring the same are described below. it can.
  • the present invention further provides a method for measuring the enzyme activity of the MT1-MMP. Or a method for screening a compound that promotes or inhibits the enzyme activity of MT1-MMP.
  • a drug named Fiber contains a compound that promotes or inhibits the enzyme activity of the MT1-fraction P. It is.
  • the method, reagents, kits, etc. described above can be used for other MT-MMPs instead of MT1-MMP.
  • “membrane-type 1 matrix metalloprotease-1"("membrane-type 1 matrix metalloproteii se") or “MT1-MMP” is a (MEROPS ID: M10.014), a gene occupying its chromosomal locus 14qll-ql2 in humans (C. Mi non et al., Gemomi cs, 28: pp.
  • D26512, E097 20k E 10297; SWISS-PR0T: P50281), and its structure is the peptide domain following the signal peptide, stromelysin- 3 (stromelysin-3) -like insertion sequence consisting of 10 unique amino acid residues (a sequence that may be a furin-like enzyme recognition site) and a site that has the potential for a zinc-binding site. It has a core enzyme domain, a hinge domain, a hemopekin-like domain containing a transmembrane domain, and a C-terminal hydrophobic transmembrane domain.
  • the ⁇ -fraction P is cleaved at the C-terminal side by some mechanism and recovered from the membrane (released), that is, the solubilized MT1-P (soluble ⁇ -P) ⁇ ) can also exist.
  • the solubilized MT1-P soluble ⁇ -P
  • MT2-, MT3-, MT4-, MT5-, MT6-MMP, etc. they are well known, and will be apparent to those skilled in the art by referring to the literature and literature.
  • the term "antibody” is in the broadest sense, and in particular, as long as they exhibit the desired biological activity, single monoclonal antibodies, antibody compositions having multiple epitopes, and It may include antibody fragments (eg, Fv, etc.), diabody antibodies, and the like. As antibodies, monoclonal antibodies are particularly preferred.
  • the ⁇ 1-1 ⁇ -MP monoclonal antibody can be used for E. coli. It is clear that other anti-III-II monoclon
  • the term “monoclonal antibody” may be used in a broad sense, and may include a single monoclonal antibody against a desired protein fragment such as MT1-banded antibody or specificity against various epitopes.
  • a monoclonal antibody composition that is capable of neutralizing and includes monovalent or polyvalent antibodies, and also represents native (intact) ⁇ and fragments and fragments thereof, F (ab ') 2 , Fab' and Fab fragments and chimeric or hybrid antibodies having at least two antigens or epitopes, or for example, quadromes, trios Bispecific antibodies such as tri ome, interspecies hybrid antibodies, anti-idiotype antibodies, and even those that have been chemically modified or processed.
  • antibodies obtained by applying known cell fusion or hybridoma technology or antibody engineering, or obtained using synthetic or semi-syringe surgery, and known from the viewpoint of antibody production Antibodies prepared by applying certain conventional techniques or using DNA recombination techniques, such as the target antigenic substances described and defined herein, have neutralizing features with respect to the target epitope. Or antibodies having binding properties. Monoclonal antibodies produced against the antigenic substance can be produced using any method that allows the production of antibody molecules to be controlled by the cell lines in culture. Shushoku Go Monoclonal refers to the characteristics of a lie antibody when it is obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and indicates that the antibody must be produced by some specific method. Do not consider it.
  • An individual monoclonal antibody contains a population of antibodies that are identical except that small amounts of variants may be present, which may occur naturally.
  • Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a site of a single sex.
  • Each monoclonal antibody when compared to a conventional (polyclonal) antibody preparation, typically containing various antibodies directed against different i3 ⁇ 4i tops (epitopes), has a single monoclonal antibody on the antigen.
  • monoclonal antibodies are synthesized by hybridoma culture and are superior in that there are no or few male iminoglobulins.
  • Monoclonal antibodies include hybrid antibodies and recombinant antibodies.
  • variable domains with constant region domains (eg, humanized antibodies) or replace light chains, regardless of their origin or immunoglobulin class I subclass, as long as they exhibit the desired biological activity. It can be obtained by replacing it with a heavy chain, replacing one type of chain with another type of chain, or fusing it with a heterogeneous protein (for example, US Pat. No. 4,816,567; Monoclonal Antibody Production Techniques). and Appli cat ions, pp. 79-97, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, etc.).
  • Suitable methods for producing monoclonal antibodies include the Hypridoma method (G. ohler and C. Milstein, Nature, 256, pp. 495-497 (1975)); the human B-cell Neubridoma method (Kozbor et al. al., Immunology Today, 4, pp. 72-79 (1983); Kozbor,
  • Monoclonal antibodies according to the present invention are partially derived from certain species of the heavy and / or light chains or belong to a particular antibody class or subclass, as long as they exhibit the desired biological activity.
  • a "chimera” which is identical or homologous to the corresponding sequence of the antibody, while the remainder of the chain is identical or homologous to the corresponding sequence of the antibody derived from another species or belonging to another antibody class or subclass.
  • Antibodies immunoglobulins
  • the monoclonal antibody of the present invention can be prepared by using a cell fusion technique using a Mycella cell (Kohler, G. k. Milstein, C., Nature, 256: 495 (1975)). Monoclonal antibody obtained by using a fusion technique), and can be produced, for example, by the following steps.
  • MT-MMPs for example, soluble protein fragments of ⁇ T1-MMP or fragments derived therefrom can be used.
  • MTl-MMP protein sequence 1f3 ⁇ 4 It can be synthesized and used as ⁇ 3 ⁇ 43 ⁇ 4.
  • a suitable artificial library is constructed, or a known or available gene library is selected, and genetic engineering operations including recombinant DNA technology are applied, for example, The ability to acquire and utilize the core enzyme domain, which has a potential binding site for hemopoxin domease zinc in MT1-MMP, and soluble recombinant ⁇ - ⁇ .
  • ⁇ -MMP which is artificially denatured and exposes an epitope can be preferably used. The above method is similarly performed and obtained for other MT-MMPs.
  • the antigen may be mixed with an appropriate adjuvant as it is to form a power-insensitive conjugate that can be used to immunize animals.
  • the antigen used as the immunity ⁇ is obtained by fragmenting ⁇ - ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (for example, ⁇ - ⁇ ⁇ ), or selecting a characteristic sequence region based on the amino acid sequence, and designing the polypeptide. It may be a synthetic polypeptide fragment obtained by chemical synthesis.
  • the fragment is bound to various carrier proteins via a suitable condensing agent to form an immunogenic conjugate such as a hapten-protein, which can be used to react with only a specific sequence (or a specific sequence). (It can only recognize the sequence.) It can also be used to design monoclonal antibodies.
  • a cysteine residue or the like can be added to the designed polypeptide in advance so that the preparation of the insoluble conjugate can be performed.
  • the carrier proteins can first be activated. For such activation, introduction of an activation bonding group may be mentioned.
  • the activated linking group examples include (1) an activated ester or an activated carboxyl group, for example, a nitrophenyl ester group, a pentafluorophenyl ester group, a 1-benzotriazo-monoester group, and an N-succinimide ester group. 2) An activated dithio group, such as a 2-pyridyldithio group.
  • the carrier proteins include keyhole 'limpet' hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, polypeptides such as glopurine and polylysine, and bacterial cell components such as BCG.
  • Immunization can be performed by methods known to those skilled in the art. Shizenza 14, Encyclopedia of Physics, Maruzen Co., Ltd., 1985, Chemistry Experiment Lecture 5, edited by The Biochemical Society of Japan 5, Immunization Research Methods, Tokyo Kagaku Dojin, 1986, Ed. Lecture 12, Molecular Immunology III, Kan. Antibodies ⁇ Complement, Tokyo, Dojin, 1992, etc.
  • the immunizing agent is immunized by measuring the mammal one or more times (with an adjuvant, if necessary). Typically, multiple immunizing agents and / or adjuvants are administered to a mammal. It is performed by subcutaneous measurement or in-vivo measurement.
  • the immunizing agent examples include those containing a ⁇ im peptide or a secretory protein, for example, a ⁇ ⁇ - ⁇ protein or a fragment thereof.
  • the immunizing agent may be used after forming a conjugate with a protein known to be immune in the mammal to be immunized (eg, the above-mentioned carrier proteins).
  • a protein known to be immune in the mammal to be immunized eg, the above-mentioned carrier proteins.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant, Ribi adjuvant, pertussis vaccine, BCG, lipid A, liposomal, aluminum hydroxide, silica and the like. Immunization is performed using, for example, mice such as BALB / c, hamsters, and other suitable animals.
  • the dose of the antigen is, for example, about 1 to 400 ⁇ g / animal for the mouse, and is transduced into the host animal or subcutaneously, and thereafter every 1 to 4 weeks, preferably for 1 to 2 weeks In each case, booster immunization is repeated 2 to 10 times in the whole body, subcutaneously, intravenously or intramuscularly.
  • Immunity As gffl mice, in addition to BALB / c mice, F1 mice of BALB / c mice and other mice can also be used. If necessary, an antibody titer measurement system can be prepared, and the antibody titer can be measured to confirm the animal immunity.
  • the antibodies of the present invention may be those obtained from the thus obtained and immunized animals, and include, for example, Ml purified, polyclonal antibodies and the like.
  • the 8-azaguanine-resistant mouse myeloma cell line is prepared by adding a cell culture medium such as Dulbecco's MEM medium (Thigh EM medium), RPMI-1640 medium, and other substances such as penicillin and amikacin, and bovine calcining (FCS).
  • a cell culture medium such as Dulbecco's MEM medium (Thigh EM medium), RPMI-1640 medium, and other substances such as penicillin and amikacin, and bovine calcining (FCS).
  • the cells are passaged in a medium supplemented with 8-azaguanine (for example, 5-45 zg / ml), but pass the cells in a normal medium 2-5 days before cell fusion to prepare the required number of cell lines. I can force.
  • the cell line is The thawed strain was completely thawed at about 37 ° C, washed at least three times with a normal medium such as RPMI-1640 ⁇ ground, and cultured in a normal medium to prepare the required number of cell lines. You may.
  • the immunized animal for example, a mouse
  • lymph node cells from various parts of the body can be obtained and used for cell fusion.
  • the spleen cell suspension thus obtained and the myeloma cell line obtained according to the above-mentioned step 3 are transferred to a cell medium such as a minimum essential medium (MEM medium), a DMEM medium, and an RPMI-1640 medium.
  • a cell fusion agent such as polyethylene glycol.
  • Other cell fusion agents known in the art can also be used.
  • Examples of such a cell fusion agent include inactivated Sendai virus (HVJ: Hemagglutinating Virus of Japan).
  • HVJ Hemagglutinating Virus of Japan
  • polyethylene glycol having a molecular weight of 1,000 to 8,000 can be used.
  • 000-4,000 polyethylene glycol can more preferably be used.
  • concentration of polyethylene glycol in the fusion medium be, for example, 30-60%.
  • fusion can be promoted by reducing the amount of dimethyl sulfoxide, for example.
  • the ratio of the spleen cells (lymphocytes) to be fused: myeloma cell line is, for example, 1: 1 to 20: 1, but is more preferably 4: 1 to 7: 1. I can be powerful.
  • a cell culture medium such as RPMI-1640 medium.
  • the fusion reaction treatment can be performed in a number of times. After the fusion reaction, the cells are separated by centrifugation and transferred to a selection medium.
  • the selection medium examples include a MEM medium containing FCS containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine, a medium such as RPMI-1640 medium, and a so-called HAT medium.
  • the method for replacing the selective medium is generally to use an equal volume as the volume dispensed to the culture plate. Add the next day, and then change the medium by half each time with MT medium every 1 to 3 days. On the 8th to 16th days after the fusion, it is possible to remove the aminopterin and to exchange the medium every 1 to 4 days in a so-called HT ⁇ ground.
  • a feeder for example, mouse thymocytes can be selected, which is preferred: ti ⁇ .
  • radioimmunoassay RIA
  • enzyme-linked immunosorbent assay ELISA
  • fluorescent immunoassay FIA
  • luminescent immunoassay U
  • Cloning hybridomas producing the desired antibody can be done by the ability to pick up colonies in an agar medium, or by limiting dilution. It can be more preferably performed by a limiting dilution method. Cloning can be performed multiple times.
  • the obtained hybridoma strain is cultured in a suitable growth medium such as a MEM medium containing FCS or RPMI-1640 medium, and the desired monoclonal antibody is obtained from the culture.
  • a suitable growth medium such as a MEM medium containing FCS or RPMI-1640 medium
  • the desired monoclonal antibody is obtained from the culture.
  • Monoclonal antibodies produced in the ascites of the product can be recovered and obtained.
  • Animals can receive a mineral oil such as pristane (2,6,10,14-tetramethylpentyldecane) in the air after transplantation of the hybridoma, and after the treatment, the hybridoma can be propagated.
  • ascites can be collected.
  • the ascites fluid may be used as it is or by a known method, for example, salting-out such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration using Sephadex, etc., ion exchange chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, affinity '' Purified by chromatography, high-performance liquid chromatography, etc. Can be used as an internal antibody.
  • the ascites containing the monoclonal antibody can be purified and separated after sulfuration, followed by treatment with an anion exchange gel such as DEAE-Sepharose and an affinity column such as a protein A column.
  • an anion exchange gel such as DEAE-Sepharose
  • an affinity column such as a protein A column.
  • affinity chromatography in which an antigen or an antigen fragment (for example, a site specifically recognized by a synthetic peptide, a recombinant antigen protein, a protein or peptide, or an antibody) is immobilized, and protein A is immobilized.
  • transgenic mice or other organisms, for example, other mammals can be used as the polypeptide products of the present invention.
  • the nucleic acid encoding the monoclonal antibody is isolated and sequenced by a conventional method, for example, by inverting a mouse antibody or by using an oligonucleotide probe capable of specifically binding to the residue encoding the light chain ⁇ ⁇ . be able to.
  • the DNA can be placed in an expression vector as described above and placed in host cells such as CH0 and COS.
  • the DNA can be modified, for example, by substituting a human heavy chain or light chain constant region domain with a rooster instead of a homogenous mouse sequence (Morrison et al. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6581, 1984). It is also possible to prepare chimeric antibodies hybrid antibodies having the desired binding specificity. Antibodies can also be decorated, for example, by preparing chimeric antibodies or hybrid antibodies, by applying protein-specific protein synthesis techniques including the use of condensed asymmetric ij as described below. is there.
  • Humanized antibodies can be performed by techniques known in the art (eg, Jones et al., Ature, 321: pp. 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: pp. 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: pp. 1534-1536 (1988)).
  • Human monoclonal antibodies can also be produced by techniques known in the art, and can be used to produce human monoclonal antibodies.
  • Mouse heteromyelo cells are known in the art (Kozbor, J. Immunol., 133, ⁇ ⁇ 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Technologies and Applications, pp. 51-63, Marcel.
  • an antibody fragment such as Fab Fab'F (ab ') 2 obtained by treating with an enzyme such as quinone or pepsin and reducing with an enzyme may be used.
  • Antibodies can be used in any known assay, for example, competitive binding assays, direct and indirect sandwiches; ⁇ , and immunoprecipitation P-inclination (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc., 1987).
  • any method known in the art for conjugating antibodies to detectable groups can be used, for example, by David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974). ); Pain et al, J. Immunol. Meth., 40: pp. 219-231 (1981); and "Methods in Enzymology", Vol. 184, pp. 138-163 (1990).
  • Can be As the antibody to be labeled an IgG fraction, and further, a specific binding obtained by reducing after reducing pepsin can be used. Examples of labeled substances of these ages include enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase or 3-D-galactosidase, etc.), diligent substances, and fluorescent substances as described below.
  • the measurement of an arrow using the antibody of the present invention, in particular, the monoclonal antibody can be carried out by using an immuno stain, for example, a thread fiber or cell stain, an immunoassay, such as a competitive immunoassay or a non-competitive immunoassay. , LIA, RIA, ELISA, etc. can be used, and BF separation can be performed or the measurement can be performed without performing BF separation.
  • a self-assessment assay or an enzyme immunoassay can be employed, and a sandwich type assay can be preferably applied.
  • Sun In the Ditch-type assay one is an antibody against MT-MMP such as the antibody against MT1-MMP of the present invention, and the other is a KMT-antibody such as an antibody against MT1-MP.
  • An MMP antibody is used, and one is detectably labeled.
  • Another antibody that can recognize the same antigen is immobilized on a solid phase. Incubation treatment is performed to react the sample with the labeled antibody and the solid-phased antibody sequentially as necessary. After separating the unbound antibody, the labeled substance is measured. The amount of label measured is proportional to the amount of antigen, ie, soluble ttMT-IIP antigen (the amount of soluble ttMTl-MP antigen).
  • a simultaneous sandwich type assay, a forward sandwich type assay, or a reverse sandwich type assay is called according to the amount of added insolubilized antibody or labeled antibody.
  • washing, ⁇ »-, filtration, or pre-extraction of antigens, etc. are used in these measurements under specific circumstances.
  • Other measurement conditions such as the concentration of a particular buffer, temperature, or incubation time, can be varied according to factors such as the concentration of antigen in the sample and the nature of the sample.
  • a person skilled in the art is capable of performing the measurement by appropriately selecting the optimum conditions effective for each measurement while using a usual experimental method.
  • carrier various types of carriers, such as those used in antigen-antibody reactions, are known, and in the present invention, it is of course possible to select from these known carriers.
  • particularly preferable materials include inorganic materials such as glass, for example, activated glass, porous glass, silica gel, silica monoalumina, anoremina, magnetized iron, and magnetized alloy, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, and the like.
  • Polyvinylidene polyfluoride Polyvinyl acetate, Polymethacrylate, Polystyrene Styrene butadiene copolymer, Polyacrylamide, Cross-linked polyacrylamide, Styrene-methacrylate copolymer, Polyglycidyl methacrylate, Acrolein-Ethylene glycol mono-methyl methacrylate
  • cross-linked albumin collagen, gelatin, dextran, agarose, cross-linked agarose, cellulose; ⁇ -crystalline cellulose, carboxymethyl cellulose, cellulose acetate, etc.
  • filter paper, beads, the inner wall of the test container for example, test tubes, cells made of synthetic materials such as titer plates, titer cells, glass cells, plastic cells, glass rods, rods made of synthetic material, and ends
  • a solid material such as a stick that is thickened or thinned, a stick with a round or protrusion at the end, or a stick with a flat protrusion, or a bar that is turned into a firewood shape.
  • An antibody can be bound to these carriers, and preferably an antibody that specifically reacts with the antigen obtained in the present invention, in particular, a monoclonal antibody can be bound.
  • the binding between the carrier and those involved in the antigen-antibody reaction is performed by physical methods such as adsorption, chemical methods using a condensing agent, activated substances, etc. It can be performed by a method using the chemical bonding reaction of
  • Labels include enzymes, enzyme substrates, enzyme inhibitors, prosthetic components, coenzymes, enzyme precursors, apoenzymes, fluorescent substances, coloring substances, iridescent luminescent compounds, luminescent substances, coloring substances, magnetic substances, metals
  • Examples include particles, for example, radioactive substances such as colloidal gold.
  • Enzymes include oxidoreductases such as IfcK enzyme, reductase, and oxidase; transferases that transfer amino, carboxyl, methyl, acyl, and phosphate groups, such as esters. Examples include hydrolases, lyases, isomerases, ligases, and the like that hydrolyze bonds, glycosidic bonds, aethnole bonds, peptide bonds, and the like. Enzymes can be used in combination with a plurality of enzymes; For example, you can use elementary cycling.
  • the target I ⁇ isotopes of a typical person id dimensions substance, [3 2 P], [ 1 25 ⁇ ], [1 3 ' ⁇ ], [], [ "c], [35 s] , etc. Is mentioned.
  • Representative enzyme labels include peroxidases such as horseradish peroxidase.
  • Galactosidases such as 3-D-galactosidase, maleate dehydrogenase, glucose-6-phospho-dehydrogenase, gnoreco-soxidase, glucoamylase, acetylcholinesterase, and hydralase And small intestine alpholipophosphatase, and fungal alpholipophosphatase and the like.
  • Alkali phosphatase was used: f ⁇ ⁇ , 4-methylbenzene phosphite and other phosphorylation phenophosphates, and ditrophenylphosphophosphate and other phosphorylated phenols. It can be measured by using ai-light, luminescence, etc., generated by using substrates such as DNA attractants, enzymatic cycling systems using NADP, luciferin derivatives, and dioxetane attractants. It is also possible to use the noresifulin and luciferase systems. Since it reacts with hydrogen peroxide using hydrogen peroxide to generate oxygen, the oxygen can be exhausted with an electrode.
  • the electrode may be a glass electrode, an ion electrode using a poorly soluble resin, a MM electrode, a polymer membrane electrode, or the like. Enzyme labeling can be replaced with biotin-labeled enzyme and enzyme-labeled avidin (streptavidin). The sign may use several different orchid signs. In this way, it can be possible to measure the fiber in a fiber-like or non-continuous manner, and simultaneously or separately.
  • signal formation is performed using 4-hydroxyphenylacetic acid, 1,2-phenylenediamine, tetramethylbenzidine and the like, and horseradish peroxidase, umbelliferyl galactoside, nitrophenyl galactoside and the like.
  • enzyme reagents such as D-galactosidase and glucose-6-phosphate 'dehydrogenase are also available, quinol compounds such as hydroquinone, hydroxybenzoquinone and hydroxyanthraquinone, and thiols such as lipoic acid and glutathione.
  • quinol compounds such as hydroquinone, hydroxybenzoquinone and hydroxyanthraquinone
  • thiols such as lipoic acid and glutathione.
  • Compounds, phenol derivatives, and ferrocene destruction products that can be formed by the action of enzymes and the like can be used strongly.
  • rhoamine compounds such as rhoamine B-isothiocyanate and tetramethylrhodamine isothiocyanate, dansyl chloride and dansyl fluoride.
  • the reaction between the thiol group and maleimide group, and the pyridyl disulfide group can be carried out by utilizing the reaction of a thiol group, the reaction of an amino group and an aldehyde group, etc., and can be carried out by a known method or a method which can be easily carried out by those skilled in the art, or by modifying them. It can be selected and applied as appropriate.
  • a condensing agent that can be used for producing the above-described insoluble complex, a condensing agent that can be used for binding to a carrier, and the like.
  • condensing agent examples include formaldehyde, glutaraldehyde, hexamethylene diisocyanate, hexamethylene diisothiocyanate, ⁇ , ⁇ '-polymethyl benzoyl acetoamide, ⁇ , ⁇ '-ethylene bismaleimide, ethylene glycol —Rubis succinimidyl succinate, bisdiazobenzidine, tolethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), N-succinimidyl 4- (N -Maleimide methyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), N-sulfosuccinimidyl 4- (N-maleidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, N-succinimidyl Deacetyl) aminobenzoate, N-succinimi
  • an antibody in which a substance to be measured is labeled with an enzyme or the like, particularly a labeled antibody such as a labeled monoclonal antibody, and an antibody bound to a carrier can be sequentially reacted with each other. It can also be reacted.
  • the river yeast to which is added depends on the type of carrier system chosen.
  • an immunoassay is used.
  • the body is made of various materials and forms, such as polystyrene, polycarbonate, polypropylene or polyvinyl balls, microphone opening plates, sticks, sticks, fine particles, and test tubes that absorb proteins such as antibodies well. You can arbitrarily choose
  • the measurement can be performed in an appropriate buffer system so as to maintain an optimum pH, for example, a pH of about 4 to 9.
  • buffers include, for example, acetate buffer, citrate buffer, phosphate buffer, tris buffer [J, triethanolamine buffer, borate buffer, glycine buffer, carbonate buffer. Agents, Tris-HCl buffer, and the like. Buffers can be used by mixing them at any ratio. Antigen antibody reactions should be performed at temperatures between about 0 ° C and 60 ° C.
  • Antibodies such as monoclonal antibodies labeled with enzymes etc. and antibodies conjugated to carriers are recommended, and the incubation of the substance to be measured should be strong enough to reach ⁇ fi.
  • the solid phase and the liquid phase can be separated at an earlier point in time before the antigen-antibody reaction is achieved, and can be stopped after a limited incubation treatment.
  • the measurement operation can be powerfully performed using an automated measurement device, and the display signal generated when the substrate is converted by the action of an enzyme using a luminescence detector or a photodetector can be used. It can also be detected and measured.
  • antigen-antibody reaction appropriate measures can be taken to stabilize the label to be used, the substance to be measured, and the enzyme and the like, and to stabilize the antigen-antibody reaction itself.
  • proteins, stabilizing agents, surfactants, etc. are added during incubation to remove extraneous reactions and reduce inhibitory effects, or to activate Measurement®S. You can also.
  • Blocking treatment to prevent non-specific binding reaction commonly used in the art or known to those skilled in the art may be performed, for example, normal serum tanno such as mammals, protein, albumin, etc. It can be processed with skim milk, fermented milk, collagen, and gelatin. # These methods are not particularly limited and can be used as long as the purpose is to prevent the heterogeneous binding reaction.
  • an enzyme immunoassay technique widely known in the art can be applied without limitation.
  • the method described in Eiji Ishikawa, translated by P. TIJSSEN, Biochemistry Experiment Method, Enzymim Noatse, 1989, Nippon Kagaku Dojin, Ltd., etc. may be mentioned.
  • the sample to be measured by the measurement method of the present invention may be any form of sickle colloid, packed sample, and the like, but is preferably a biological sample, such as thymus, testis, intestine, kidney, brain, and breast. , Ovary, uterus, lung, liver, stomach, ⁇ , skin, esophagus and other organs, organs, s «, for example, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, uterine cancer, m-mm, various sarcomas, blood, serum, plasma , Synovial fluid, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, urine, other bodily fluids, cell culture medium, paper culture medium, itoshimo-homodunate, biopsy sample, ⁇ cells, and the like.
  • a biological sample such as thymus, testis, intestine, kidney, brain, and breast.
  • MT-MMP (e.g., MT1-MMP) is immunologically analyzed to remove MT-MMP (e.g., MT1-MMP) from a membrane and / or solubilized molecular species (e.g., MT-MMP). It was found that it could be measured as a fusible-painting P). Then, when the sample is appropriately treated, for example, with a material selected from the group consisting of a surfactant and a reducing agent, the material observed (released) and / or solubilized from the membrane is reduced by some mechanism. Once obtained, measurements such as MT1-MMP and MT-MMP can be performed effectively.
  • MT-MMP e.g., MT1-MMP
  • MT-M MPs for example, MT1-MT2-, MT3-, MT4-, MT5-, MT6-MMP, etc., are removed from the membrane using a substance selected from the group consisting of a surfactant and a reducing agent.
  • MT-solid P antibodies against MT-solid P, especially monoclonal antibodies (for example, tCMTl-MMP antibody, MT2-MMP antibody, MT3-MMP antibody, MT4-MMP antibody, MT5-MMP antibody, MT6-MMP antibody, etc.) MT-MMP.
  • monoclonal antibodies for example, tCMTl-MMP antibody, MT2-MMP antibody, MT3-MMP antibody, MT4-MMP antibody, MT5-MMP antibody, MT6-MMP antibody, etc.
  • free and / or solubilized MT-solid P can be immunologically attached.
  • any surfactant can be used as long as it has a function of soaking or solubilizing MT-band P from the membrane, and preferably has an adverse effect on the immunological properties of MT-MMP. There is no power.
  • the surfactant include an anionic surfactant, and a typical example thereof is an alkali metal salt of higher alkyl sulfate.
  • Preferred surfactants include, for example, sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • the reducing agent examples include a substance having a function of releasing and / or solubilizing MT-P from the membrane or a group which is susceptible to a redox reaction in MT-M P; ⁇ (eg, an -SS- bond or the like). )), But preferably those which do not adversely affect the immunological properties of ⁇ - ⁇ .
  • the reducing agent examples include thioalcohols such as 2-mercaptoethanol and dithiolatel, and sulfur-containing arsenic compounds such as glutathione.
  • both the surfactant and the reducing agent are used to allow the immobilization of the ⁇ -solids from the membrane!
  • 3 ⁇ 4 or / and can be solubilized, using antibodies against ⁇ - ⁇ , etc. It can be used to immunologically measure (including) ⁇ - ⁇ ⁇ , especially free and / or solubilized ⁇ -band ⁇ . It is possible to distinguish between free and / or solubilized MT-II and MT-II bound to the membrane, or to the age at which detection or measurement is difficult due to binding to the membrane. In addition, the ability to measure or measure ⁇ ⁇ - ⁇ is very useful. In particular, using SDS as a surfactant and 2-mercaptoethanol as a reducing agent, MT1-MMP can be evacuated or solubilized. In addition, an antibody against MT1-MMP, in particular, a monoclonal antibody against ⁇ - ⁇ , can be narrowed to immunologically convert the free or solubilized MT1-MMP.
  • the present invention relates to a substance having a substantially equivalent activity. What is necessary is just to construct a measurement system.
  • the present invention utilizes an immunological method for MT-band P, such as ⁇ -MP, to screen for compounds that promote or inhibit the expression of MT-solid P, such as ⁇ - ⁇ ⁇ .
  • MT-band P such as ⁇ -MP
  • a special screening method is used.
  • a cultured cell expressing MT-MMP for example, MT1-MMP
  • MT1-MMP for example, MT1-MMP
  • a transformed MT-hen P for example, MT1-MMP
  • transgenic mouse or other transgenic mouse can be used.
  • MT-MMP e.g., MT1-MMP
  • Additives to be applied to the screening method are not particularly limited and may be any of those having a function of promoting or inhibiting the expression of MT-MMP (for example, MTl-MMP). And they may be known or new.
  • the additive include those related to gene expression control, antisense nucleic acids such as MT-MMP (e.g., MT1-MMP) antisense RNA, and MT-MMP (e.g., MT1-MMP) mRNA sequence-dependent.
  • a ribozyme that cleaves in a certain manner can be considered.
  • the additives may be added directly or in the form of a neptin to the nutrient solution, or the genes expressing each may be introduced into cells.
  • MT-MMP e.g., MT1-MMP
  • MT1-MMP can be used to design and select nucleic acids such as antisense RNA and ribozymes that strongly and specifically suppress the expression of MT-MMP (e.g., MT1-MMP).
  • the method is useful.
  • An MT-MMP (eg, MT 1 -band P) expression inhibitor is useful as a drug for suppressing cancer metastasis.
  • the immunoassay of MT-cells (for example, MT1-MMP) of the present invention is useful for a cancer test or a cancer metastasis test, and also for a rheumatoid arthritis or Algheimer's disease progression test. It is also associated with cancer transfer tests, and also the degree of rheumatoid arthritis or Alzheimer's disease.
  • MT-MMP eg, MT1-MMP
  • immunological dysfunction is useful as a drug for examining cancer or metastasis, and also as a drug for evaluating the progress of rheumatoid arthritis or Alzheimer's disease.
  • a solid-phased $ 3 ⁇ 4T-substituted P antibody such as a solid-phased T1-fraction P antibody, in particular, a solid-phased antibody such as a solid-phased monoclonal mono ⁇ 3 ⁇ 41 ⁇ 1--antibody, etc.
  • Monochrome nanore ⁇ T-country P antibody is shared.
  • the immobilized antibody such as the immobilized LakeTokuni P antibody (for example, immobilized monoclonal ⁇ -fraction P antibody)
  • the MT1 -II antibody in the sample was used. It is possible to screen for enzymatic activity.
  • an MT1-antibody which is immobilized on a reaction vessel or the like for example, a monoclonal antibody T1--antibody which is immobilized on a solid
  • a sample containing ⁇ -band ⁇ is brought into contact with a sample containing ⁇ -band ⁇ , and the immobilized ⁇ CMT1- ⁇ antibody is deprived of the MT1- ⁇ ⁇ via the carried antibody reaction.
  • Enzyme activity can be measured, for example, by detecting the substrate of MT-band P, such as l-solid P substrate, and detecting or measuring a signal resulting from the enzymatic reaction.
  • a soluble MT-P can be obtained, and it becomes possible to determine the correlation between the amount of the soluble MT-P and the metastasis of wisteria and cancer.
  • the present invention relates to an immobilized MT-Zono-P such as MT1- ⁇ P which is immobilized.
  • M-phase is immobilized by immunological methods.
  • MT- ⁇ ⁇ P such as MT1- -P immobilized on the solid phase
  • MT1- MMP in the presence or absence of a sample such as Ml-band P activity inhibitor or other MT- ⁇ P activity inhibitor. It can be screened by contacting it with an MT-MMP substrate, such as a substrate, and detecting or measuring the signal resulting from the enzymatic reaction.
  • an MT-MMP substrate such as a substrate
  • detecting or measuring the signal resulting from the enzymatic reaction As a typical solid phase hMT-mask, for example, those solidified in a reaction vessel or the like can be mentioned.
  • MT-MMPs such as MT2-MMP, MT3-MP, MT4-MMP, MT5-MMP, and MT6-MMP can be performed instead of MT1-MMP.
  • the present invention it is possible to measure the activity of MT band P and search for a ⁇ ⁇ - ⁇ P activity inhibitor.
  • MT-MMP such as ⁇ -MMP of a sample can be specifically immobilized on a solid phase, its activity can be detected, and screening ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ for that purpose can be performed.
  • the obtained ⁇ -MMP activity such as ⁇ -MMP activity can be used to describe the ability of cancer to infiltrate or metastasize. Therefore, it is possible to assume the infiltration ability of the sample cancer fiber, and the information for that is shared.
  • MT-MMPs such as MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-solid P, MT5-MMP, MT6-MMP, etc. can be performed in a similar manner. It is. Enzyme activity or enzyme inhibitory activity can be measured strongly according to the usual assay method. Also, various labels, buffer systems, and the like can be used. In carrying out the method, MT-MPs can be treated with an activator such as mercury aminophenylacetate, or its precursor, or its latent form, can be converted into active ttS in advance.
  • an activator such as mercury aminophenylacetate, or its precursor, or its latent form
  • an appropriate measurement system may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method.
  • reviews, written documents, etc. for example, Methods in Enzymology, Vol. 1 k 2 (Preparation and Assay of Enzymes), Academic Press, New York (1955); Methods in Enzymology, Vol. 5 (Preparation and Assay of Enzymes), Academic Press, New York (1962); Methods in Enzymology, Vol. 6 (Preparation and Assay of Enzymes), Academic Press, New York (1963); Methods in Enzymology, Vol.
  • kits such as screening kits
  • the kit is a pack and a kit containing one or more containers filled with one or more active ingredients for the composition, for example, in the field of measurement such as immunoassay or in the field of medicine.
  • active ingredients for the composition, for example, in the field of measurement such as immunoassay or in the field of medicine.
  • cautions in the form indicated by governmental agencies that regulate the manufacture, use or sale of clinical or pharmaceutical or biological products A letter (document) that may be accompanied by a notice (package) that indicates the approval of the government agency for the manufacture, sale, or sale of human-related products.
  • the activity obtained by the screening method of the present invention eg, (a) a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of MT-band P such as MT1-MP, (b) MT1-MMP, etc.
  • compositions are formulated according to the usual methods.
  • a physiologically acceptable carrier, a pharmaceutically acceptable carrier, an adjuvant, an excipient, a diluent, an incense, etc. may be used in combination with the worm or the combination of the present invention and the present invention.
  • the activity of the present invention is such that the dosage can be selected and administered over a wide range.
  • the administration and the number of administrations depend on the sex, age, weight, general health, diet, and administration time of the treated patient. It will be determined according to these and other factors, depending on the method of administration, severity, combination of drugs, and the extent of the condition of the patient being treated at the time.
  • IPTG isopropyl-1-thio— ⁇ -D-galactopyranoside
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • BSA bovine serum albumin
  • MT1- ⁇ Ps were prepared and used for immunization, screening for monoclonal antibodies, western blotting, ELISA, etc.
  • the pUC18 was excised with BglH, digested with restriction enzymes Smal and BamHI, and inserted in-frame with pUC18 ⁇ -galactosidase to construct an expression vector pUCAM-locus.
  • Escherichia coli DH5 containing pUCAMTl-MMP was inoculated into an LB medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin in 1 ⁇ 2L, and cultured at 37 ° C. for 16 hours to prepare a primary lucifer. This was re-inoculated into a ⁇ field containing 400 mL of 50 Mg / mL Ampicillin, and cultured at 37 ° C for about 3 hours until the middle of the culture growth phase. IPTG (final concentration O. lmM) was added, and the culture was further surrounded for 4 hours to induce the expression of the recombinant fusion protein.
  • IPTG final concentration O. lmM
  • Inclusion body contains 0.1mL of lmL 10M Resuspend in mM phosphate buffer (pH 7.0), wash, centrifuge (15, OOOrpnulOmin) to collect the precipitate, and add 1 mL of 8 M urea, 0.1 M NaCl. pH 7.0). d) Recombinant purification-2 (preparative SDS-PAGE and electroelution)
  • the MTl-MMP cDNA introduced into pSG5 was introduced into COS-7 by the calcium phosphate method, and after 48 hours of expression, the cells were collected. After washing the cells with PBS, they were resuspended in 0.5 mL of PBS and sonicated. To the obtained cell insult, 1/5 of ⁇ X SDS-PAGE Sample buffer (containing a reducing agent) was added to obtain an antigen sample for SDS-PAGE and Western blotting. Similarly, using the cDNA of MT2-banded P (mouse) inserted into pSG5 and the cDNA of MT3-solid P inserted into pSG5, the same treatment was performed to obtain an antigen sample. These were used to study the ⁇ X reactivity of the monoclonal antibody.
  • AMT1-MMPRF Recombinant AMT1-MMP derived from E. coli
  • the ⁇ - ⁇ gene was excised from the pUCAMTl-band P constructed in Example 1 with the restriction enzymes Kpnl and Hindlll and ligated to pTrcHis by inflation. isAMH-MMP was constructed. The expression vector was used to transform ⁇ ! Easy bacteria to express the recombinant protein.
  • the insoluble inclusion bodies prepared from the above recombinant Escherichia coli (cultured in 400 mL) were solubilized with 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 8 M urea ⁇ 0.5 M NaCU and 10 mM imidazole, and Ni ++ Chelating Sepharose (Pharmacia) gel column. After washing, elution was performed with 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 8 M urea, 0.5 M NaCl and 0.5 M imidazole, and the obtained purified fraction was added with 8 M urea, 0.3 M NaCl.
  • the mixture was diluted with DTT-containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.6) so that A280 was 0.1.
  • 20 mM cysteamin was added to prepare a refolding sample (50 mL). This was treated with 5 L of 0.15 M NaC 5 mM CaCl 2 , 100 juM ZnSO *, 5 mM 2-mercaptoe thanoU 1 mM hydroxyethyl disulfide, 50 mM Tris-HCl (pH 8.6) containing 0.02% NaN 3 . 16 hours dialysis, further 0. 15 M NaCl, 5 mM CaCl 2, 50 // ZnS0 4, and dialyzed against 0. 02% N aN 3 containing 50 mM Tri s-HCl (pH8 . 6) (4 hours, 3 times ), Refno reading.
  • the purified ⁇ 1- ⁇ P antigen (58 ⁇ g / 2901) was injected into a 6-week-old BALB / c female mouse together with complete Freund's adjuvant in the air, and immunized for the first time.
  • mice that had been initially immunized with ⁇ dummiccug / md) were administered ⁇ and boosted.
  • a further 35-day purified (54 zg / 160 zl) intravenous administration of booster immunization was performed, followed by booster immunization.
  • a 69-day purified antigen (73.3 ⁇ g / 160-1) was intravenously administered for final immunization.
  • O The spleen was excised from the immunized mouse after the third (72 days in total) to prepare a spleen cell suspension.
  • RPMI-1640 medium RPMI-1640 (Flow Lab.) Supplemented with sodium bicarbonate (24 mM), sodium pyruvate (lmM), potassium penicillin G (50 U / ml), and amikacin sulfate (100 / zg / ml) Then, the pH was adjusted to 7.2 with dry ice, and sterilized and filtered with a 0.2 / m Toyo membrane filter.
  • NS-1 medium Fetal serum (FCS, M.A. Bioproducts), sterilized and filtered, was added to the above RPM1 1640 ⁇ ground to a concentration of 15% (v / v).
  • PEG-4000 solution A serum-free medium was prepared by adding polyethylene glycol-4000 (PEG-4000, Merck & Co.) to RPMI-1640 medium to a concentration of 50% (w / w).
  • a 7-fold volume of RPM1-1640 medium which was 7 times the volume of the added RPMI-1640 medium containing 50% PEG-4000, was added dropwise over a period of 2 to 3 minutes to disperse the cells. This was centrifuged, and the supernatant was completely removed by suction.
  • NS-1 medium heated to 37 ° C. was quickly added to the precipitated cells so that the number of myeoma cells was approximately 10 6 ⁇ , and the large cell mass was carefully dispersed by pipetting.
  • the same medium was further added for dilution, and the cells were inoculated into polystyrene 96-well microwells by adjusting the number of myeloma cells per well.
  • the microwells containing the cells were cultured in 7% carbon dioxide / 93% air at 37 ° C and 100% humidity.
  • the hybridoma was selectively grown on a selective medium.
  • the culture media to be used are as follows.
  • HAT medium hypoxanthine (100 M), aminopterin (0.4 M) and thymidine (16 M) were further added to the NS-1 medium described above.
  • 1113 ⁇ 4 ⁇ ground Same as HAT ⁇ ⁇ ground except that aminobuterin was removed.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Cappel horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse immunoglobulin
  • TMB 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • the hybridomas in the wells positive for the immunizing antigen obtained above were monocloned using the limiting dilution method. That is, prepare a cloning medium containing mouse thymocytes as a feeder in NS-1 medium, and set the number of hybridomas in 96-well microwells to 5, 1, and 0.5 per well. It was diluted and added to 36, 36, and 24 wells, respectively. NS-land was added to all wells on days 3-7 and 8-15. Approximately 1 to 3 weeks after the start of cloning, if macroscopically sufficient growth of the hybridoma is confirmed, the above screening method (ELISA) is performed for the group with 50% or more of colony negative cells. Was.
  • ELISA ELISA
  • Subclasses were determined for 15 clones. According to the above-mentioned ELISA, the supernatant of the hybridoma obtained above was added to a 96-well polystyrene plate coated with each immunizing antigen. Next, after washing with PBS, an isotype-specific mouse heron anti-mouse IgG antibody (Zymed Lab.) was added. After washing with PBS, horseradish peroxidase-labeled goat anti-magpie IgG (H + L) was added, and hydrogen peroxide and 2,2'-azidino-di (3-ethylbenzothiazolic acid) were used as substrates. To determine the class and subclass
  • the 8 clones determined to be positive in the previous section were further selected by Western blotting using the cytosolic Ml of COS-7 expressing recombinant MT1-band P as an antigen, and 3 clones with low reactivity (Table 1) (+)) was excluded. These were all IgM. Five clones were finally obtained, with 4 subclasses of IgGl / and 1 subclass of IgG3 /.
  • mice of the High Priestess dough Ma 10 7 pristane beforehand to 1 week before the obtained was administered intraperitoneally (Balb / c system, female, 6 weeks old) was administered likewise Koboshisora, after 1-2 weeks, Ascites containing 4-7 mg / ml of monoclonal antibody can also be obtained from ascites.
  • the ascites obtained was salted out with 40% saturated ammonium sulfate, and IgG-class antibodies were adsorbed on Protein A Affigel (Bio-Rad) and eluted with 0.1 M citrate buffer (pH 5.0). Purify.
  • the hybridoma cells (5 clones) producing the monoclonal antibodies obtained above were administered to mice in flight, and ascites fluid containing each antibody was prepared.
  • the ascites fluid obtained was subjected to sulfuric acid and an Affigel protein A gel column to obtain a purified monoclonal antibody.
  • Table 1 summarizes the results of Subclass Atsushi and Reaction Test-1 and 2.
  • Example 2 Epitope mapping by Western blotting using the fragments of mum MT1-P (58 kDa), hemopoxin domain (3 (M) a, 34 kDa) and i3 ⁇ 4 domain (21 kDa) prepared in Example 1-3 as antigens Starved.
  • Five clones selected in Example 2 were used as primary antibodies and stained using anti-mouse Ig (G + A + M) -HRP as secondary antibodies. All clones were strongly associated with the hemopoxin domain, confirming that these epitopes were present in the hemopoxin (see Figure 1).
  • a cross-reaction test was performed by Western blotting using as an antigen. Five clones selected in Example 2 were added as primary antibodies, and stained using anti-mouse Ig (G + A + M) -HRP as secondary antibodies. All clones reacted only with MT1-MP, did not react with MT2-MMP (mouse) or 1 MT3-MMP, and were strongly confirmed to have specificity for MT1-MMP (see Figure 2). .
  • Example 4 MT1-MMP setting
  • a standard antigen (recombinant Affl! -MMP) was reacted in a 96-well microwell in which each antibody was solid-phased. After washing, each antibody was reacted with IgG-HRP, and then unreacted IgG-HRP was washed away. The residual activity of IgG-HRP bound via the antigen was measured using TMB as a substrate. A combination of the solid-phase antibody 222-2D12 and the labeled antibody 222-1D8 that detected the antigen best was found, and further details such as the antibody concentration, reaction time, reaction, and quenching of the reaction buffer were examined. Fab'-HRP was newly prepared and used instead of IgG-HRP as the labeled antibody. As a result, the method described below was able to determine the ⁇ -picture P power most efficiently.
  • the labeled antibody Fab'-HRP can be prepared as follows. For example, add monoclonal antibody (O / lM NaCl) to 0.1M sodium acetate buffer ( ⁇ 4.2), add antibody amount (W / W) of pepsin, and digest at 37 ° C for 20 hours did. The reaction was stopped by adding 3M Tris-HCl buffer (pH 7.5) to the dish. Two fractions of F (al) ') were collected by gel filtration using an Ultrogel AcA54 column prepared with 0.1 M phosphate buffer (PH 7.0).
  • HRP was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (PH 7.0), and EMCS, 25 times higher than HRP, was added as DMF overnight, and reacted at 30 ° C for 30 minutes. This was gel-filtered through a NICK-5 column (Pharmacia) that had been purified with a 0.1 M phosphate buffer (PH 6.0) to collect a maleimide-labeled HRP fraction.
  • PH 7.0 0.1 M phosphate buffer
  • EMCS 25 times higher than HRP
  • the Fab 'fraction and the maleimide-labeled HRP were mixed at equimolar amounts and allowed to react at 4 ° C for 20 hours, and then reacted unreacted with 10-fold mono-N-ethylmaleimide of Fab'. Blocked the group. This was subjected to gel filtration with a wurt-mouth gel AcA54 column prepared with a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5), and Fab'-HRP-labeled antibody was collected. To this was added 0.1% BSA and 0.001% chlorhexidine, and the cells were observed at 4 ° C.
  • a monoclonal antibody for example, 222-2D12 (IgG) was added to a 0.1 M phosphate buffer (pH 7. The solution was adjusted to 25 g / mL by 0), added at 100 fil per 96-well microwell (MAXISORP, NUNC-I MUNO MODULE), and allowed to stand at 4 ° C for 24 hours. Next, the antibody pool was removed, and the plate was washed three times with a washing solution (0.1 mM Tween 20, 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 M NaCl). BSA, 10 mM EDTA, and 30 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 M NaCl were added in an amount of 0.3 mL per 96-well microwell and stored at 4 ° C.
  • a washing solution 0.1 mM Tween 20, 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 M NaCl.
  • test sample was diluted with a dilution buffer as needed.
  • a standard antigen or a test sample was added to a 96-well vinyl plate in an amount of 25 L each. To this was added 100 zL of a buffer for dilution, mixed, and the mixture was taken at 100 / L. The plate was placed on a plate on which the blocking solution had been removed and washed beforehand, and allowed to stand at 4 ° C for 16 hours.
  • Labeled antibody 222-1D8 (Fab'-HRP) was prepared at 0.4 / ⁇ with a blocking solution. The reaction solution was removed from the antibody solid phase plate on which the primary reaction was completed, and the plate was washed three times with a washing solution. Then, a labeling antibody solution was added at 100 / L per well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • a sample prepared by adding an antigen to each of serum and synovial fluid was diluted and measured according to the method described in Example 4. Serum samples were diluted and measured at 10, 20, and 30 // L / well. The sample volume was set to 20 L / well or less, and since 90% or more of the added ⁇ ⁇ antigen was recovered, the serum sample measurement was set at 20 L / well. The joint fluid samples were diluted to 0.625, 1.25, 2.5, and 5 ⁇ L / well and measured. The sample volume was reduced to 2.5 l / well or less. Since more than 80% of the added specimens were collected, the measurement of the synovial fluid specimen was performed with 2.5 ⁇ 1611
  • Serum 3 (2.5 ng / mL) 10 2.7 108.0
  • Synovial fluid 2 (142n g / mL) 0.625 154.2 108.6
  • MMP-1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 19, 20 was lg / mU this preparation, respectively, 5 subjected to MT1- MMP sub sandwiches EIA.
  • Table 8 shows the measurement results.
  • the MT1-MMP was subjected to sandwich EIA at 0.16 g / mL ⁇ , and the absorbance of 2.206 was shown, whereas these ⁇ Ps were between 0.024 and 0.071 3 ⁇ 413 ⁇ 4. , Did not show. Therefore, ⁇ - ⁇ P sandwich EIA was confirmed to be capable of specifically reacting with MT1-MMP.
  • Table 8 shows the measurement results.
  • the MT1-MMP was subjected to sandwich EIA at 0.16 g / mL ⁇ , and the absorbance of 2.206 was shown, whereas these ⁇ Ps were between 0.024 and 0.071 3 ⁇ 413 ⁇ 4. , Did not show. Therefore, ⁇ - ⁇ P sandwich EIA was confirmed to be capable of specifically reacting with MT1-
  • a sandwich EIA system for specifically detecting and measuring MT1-MMP can be constituted by a combination of antibodies containing at least one monoclonal antibody of the present invention.
  • the EIA system can use either the one-step method or the two-step method, and the labeled antibody is not limited to Fab'-HRP.
  • the quenching and reaction conditions of each reaction buffer can be adjusted, such as shortened or extended, according to the purpose of the measurement.
  • ⁇ - ⁇ which is a standard product, can be purified from paper tissue ⁇ culture supernatant, cell culture supernatant, or the method described in Example 1, or the recombinant power expressed by other methods. . Purification can be achieved by ion exchange, gel filtration, affinity chromatography using a monoclonal antibody, or any other combination of affinity chromatography.
  • the samples to be measured are human blood, serum, «, synovial fluid, urine, saliva, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, and other human-derived human tissues (including each Shigeura's cancer paper), human extracts It is prepared from cell extracts, culture supernatants, etc. of various types of cultures such as derived or recombinant.
  • Example 6 Significance of Surfactant and Reducing Agent in MT1-M P-Sandwich ⁇ - ⁇ Gene-Introduced ⁇ - ⁇ Expression COS-7 by the Method described in Example 1 Prepared. The COS 7 cells were cultured, and the culture medium was collected 48 hours later.
  • the culture supernatant cells were subjected to SDS-PAGE and Western plotting, and it was confirmed that ⁇ 1-band P was used as a soluble molecule.
  • was subjected to this culture supernatant ⁇ - knitting P sandwich EIA, sufficient signal (A 4 5. 1. 807) forces rather were detected.
  • Cell lines include Burkitt's lymph node weight (Daudi, Namalwa, Raj i), acute lymphoblastic leukemia (T-cell) (MOLT-4), chronic myeloid white bell (K-562), promyelocytic White (HL 60), Fibrosarcoma (HT-1080), Breast cancer (MDA-MB-231, SK-BR-3, MCF 7), Lung cancer (A549), Lung cancer (SW 837), Osteosarcoma (MG -63), tongue, squamous cell carcinoma (SSC-25), cervical cancer (HeL a), cervical surface ⁇ I (CaSki), previous 3 ⁇ spring cancer (PC-3), malignant black fel weight (A-375).
  • Burkitt's lymph node weight Dermat's lymph node weight
  • MOLT-4 acute lymphoblastic leukemia
  • K-562 chronic myeloid white bell
  • HL 60 promyelocytic White
  • HT-1080 Fibrosarcoma
  • Various cancer cell lines were cultured to confluence on a plate having a diameter of 10 cm, and replaced with a serum-free medium or a serum-free medium containing Con A. After 48 hours, the culture supernatant and cells were collected. The cells were sonicated in 0.5 mL of dilution buffer, and the supernatant obtained by centrifugation was subjected to EIA as a cell extract fraction. The ⁇ culture supernatant was directly used for EIA.
  • Table 10 shows examples of the measurement results.
  • Tl-IW P is for fibrosarcoma (HT1080), part of breast cancer (MDA-MB-231), osteosarcoma (SW- 837), osteosarcoma (MG-63), tongue, squamous cell carcinoma (SSC-25) ), Cervical epidermoid carcinoma (CaSki), etc.
  • Additives include those involved in the expression control, T1-MMP antisense RNA, and ribozymes that cut the mRM of MT1-MMP in a sequence-dependent manner. available.
  • the additives may be added directly to the culture solution or after adding them, or the genes expressing each may be introduced into cells.
  • the MT1-MMP sandwich EIA is useful for the design and selection of antisense RNA and ribozymes that potently and specifically suppress the expression of MT1-MP.
  • the MT1-MMP expression inhibitor is useful as a drug for suppressing cancer metastasis.
  • irCMTl-MMP monoclonal antibody at 25 zg / mL with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), add 100 L per 96-well microwell, and allow to stand at 4 ° C for 24 hours.
  • the antibody ⁇ is removed, and washed three times with a washing solution (0.1 mM Tween 20, 0.1 M NaCl containing 10 mM phosphate buffer (pH 7.0)), and then a blocking solution (1% BSA, 10% 3.
  • the sample to be added has a certain level of activity; if MMP is used and various enzyme inhibitors ij, MMPs inhibitors or arbitrary compounds are added thereto, each ffll -The ability to measure inhibitory activity against MMPs can be enhanced.
  • the standard ⁇ - ⁇ is a recombinant protein expressed from E. coli into which PUCAMTI-change or pTrcHis-ms- ⁇ P described in mni has been introduced, and COS-1, COS-7 and CH0 cells into which pSGAMTl-MMP has been introduced.
  • the ability to use recombinant proteins expressed from E. coli into which PUCAMTI-change or pTrcHis-ms- ⁇ P described in mni has been introduced and COS-1, COS-7 and CH0 cells into which pSGAMTl-MMP has been introduced.
  • pUCAMTl-MMP and pTrcHisAMTl-MP contain the pro-domain of the MT cell layer, and when used as »MT1-P for activity measurement, the prodomain is cleaved and removed with fuirin, and the active tt Must be converted to MTl- ⁇ P.
  • the following recombinants were prepared to express active tt ffll-MP directly in E. coli expression.
  • the MT1-MP cDNA was made to be a prominent type.
  • MT1ACTF1 GAAGATCTACGCCATCCAGGG [SEQ ID NO: 1]
  • T1ACTR1 The fragment amplified by GAGGTACCTCAGCCCATCCAGTCCC [Rod number: 2] was digested with restriction enzymes BglII and Kpnl, and pQE-32 (Qiagen), which had been digested with BamHI and Kpnl beforehand, to create pQEMT1ACTR1.
  • MT1ACTF1 GAAGATCTACGCCATCCAGGG [SEQ ID NO: 1]
  • MT1ACTR2 The gene amplified by TAGGTACCTACCCGCCGCCCTCC [Rooster No .: 3] was cut with restriction enzymes BglII and Kpnl, and blocked with pQE-32 (Qiagen) previously cut with BamHI and Kpnl to prepare pQBMT1ACTR2.
  • the MT code P encoded by pQE MT1ACTR1 and pQE MT1ACTR2 is Y 1 12- G 5 0 7 and ⁇ 1 1 2 - a G 5 3 5, both lacks the prodomain, active ' ⁇ MT1 - expressing MMP.
  • QE MT1ACTR1 lacks the entire hydrophobic transmembrane domain
  • pQE MT1ACTR2 lacks a part of the transmembrane domain, improving the solubility of the expressed recombinant protein and making it more useful as a standard MT1- ⁇ P for activity measurement. Has favorable properties.
  • Activated recombinant MT protein P can be purified by the method described in section 3 of Example 1 and used as standard MT1-MMP for activity measurement.
  • pQE MT1ACTR1 was transfected with recombinant insoluble bacteria (cultured in 400 mL), and the insoluble insert was treated with 8 8 urea, 0.5 M NaCl, 10 mM imidazoichinohayu 50 mM phosphate buffer (pH7 .5) and applied to a Ni ++ Chelating S-marked harose gel column.
  • the reaction solution was placed in a test tube into which 500 ill of 0.1 M sodium acetate buffer ( ⁇ 4.0) was dispensed, and the reaction was stopped.
  • the fluorescence substrate separation property of MT1-MMP was measured as fluorescence intensity (FI, Ex: 328 nm, Em: 393 nm) using a Shimadzu spectrofluorometer RF-5000.
  • the obtained fluorescence intensities were 121.6 and 6.3, respectively, and it was confirmed that they had a meta-oral protease activity that was inhibited by the prepared active T1- ⁇ PTA.
  • the enzyme concentration, the conversion and the concentration of the fluorescent substrate, the ligature of the various reaction solutions, the reaction time, the reaction, and the reactant can be appropriately changed as necessary.
  • an antibody solid-phase plate was prepared.
  • the concentrations of various antibodies used were changed to 50 / g / mL, and the blocking solution was changed to 1% skim milk and 30 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 M NaC1.
  • the blocking solution was removed in advance, and the antibody-immobilized plate, which had been washed three times with a washing solution (50 mM Tris-HCl buffer containing 0.15 M NaCl ( ⁇ 7.4)), was added to 0.15 M NaCl and 10 mM CaCh.
  • the separation of the fluorescent substrate was measured: ti ⁇ , commercially available Ml -MMP Luminescence intensity was obtained from 9.2 to 17.1 times that of the age using the monoclonal antibody against Ndmein (113-5B7, No. 1 Fine Chemistry) (Fig. 4). No enzyme activity was detected in the same preparation without the addition of the antibody. From this, it was confirmed that by using microwells on which T1-band P antibody was immobilized, MT1-band P could be selectively withdrawn and its activity level could be detected effectively.
  • Antibodies to be immobilized are antibodies whose recognition region is in the hemopoxin domain, for example, 22 2-1D8, 222-2D12, 222-3E12, 222-4G5 and 222-9A3. While other antibodies are possible, inappropriate antibodies such as 113-5B7 also exist. Antibodies whose recognition region is in the corner butterfly domain may inhibit MT1-MMP activity and are unsuitable for this use. Antibodies in which the recognition region is in the propeptide domain may be unsuitable for this use, because the active peptide lacking the propeptide cannot be withdrawn.
  • Both inactive MMT1-MMP having a propeptide domain and active MT1-bandanse P which has lost the propeptide are withdrawn from the microwell obtained by immobilizing an antibody whose recognition region is in the hemodoxin domain. .
  • the activity ⁇ - ⁇ in the sample can be measured selectively, or after the activation treatment with furin or other appropriate protease or surfactant, etc.
  • the inactive 'f ⁇ MTlP in the sample can be selectively measured.
  • the synovial fiber was homogenized and centrifuged in a 50 mM Tris-HC1 buffer solution (pH 7.5) containing 0.15 M NaCl, 10 mM CaCl 2 and 0.05% Bri j35 to prepare a fiber extract fraction. .
  • the ⁇ -MMP concentration of these samples was measured according to the method described in Column 4. As a result of measuring 63 samples, the MT1-MMP concentration ranged from less than 1.3 ng / mL (practical detection limit) to 118.9 ng / mL, and the average (directly 23.9 ng / mL) .
  • the mean and deviation were obtained for 51 samples.
  • the amount of ⁇ -enzyme in the normal tissue and cancer tissue was 0.41 ⁇ 0.76 ng / mg. 2.43 ⁇ 1.85 ng / mg, respectively, which is a significant difference between the cancer fiber and the normal tissue (P 0.001) (Student's significance test, Fig. 5).
  • the M-MP amount of normal fiber and cancer fiber was measured.
  • Oral cancer thread! / Woven had an MT1-painting force about 3.6 times that of the adjacent normal tissue, and Oshiori Kaoru about 2.4 times that of the adjacent normal thread.
  • MT1-fresh amount was confirmed between normal thread tissue and cancer tissue.
  • the cancer paper wovens measured in the previous section were classified using the presence or absence of lymphatic migration as an index, and the correlation between the presence or absence of metastasis and the amount of MT1-solid P was examined.
  • the MT1-MMP amount (mean soil standard deviation) of the cancer fiber which is not recognized as having lymph node metastasis is 1.63 ⁇ 1.77 ng / mg.
  • the result was ⁇ 1.78 ng / mg, and a significant difference (p ⁇ 0.05) was confirmed between the two groups (Student's significant difference test, FIG. 6).
  • Mouse, rat, and rabbit culture strains producing MT1-MP were searched. In the same manner as in Example 7 for each of eight mouse strains, four rat strains, and one rabbit strain, each culture was prepared. The obtained culture supernatant was concentrated 20 times and subjected to EIA. Among the animal cell lines examined, high production of MT1- ⁇ P was observed in mouse C127, rat FR, and rabbit HIG-82. The concentrated culture supernatant was serially diluted, and the MT1-MMP-producing human cell strain MDA-MB-231 was compared with its S-property. Dilution curves with similar slopes (Table 11 and Fig. 7) were obtained for all species, indicating that human and mouse, rat, and rabbit cell lines have the same immunoreactivity as each other. Not shown strongly. Table 11
  • this EIA system can measure Ml-substitute P derived from mice, rats, and various animals in addition to humans.
  • the amino acid sequence of the hemopoxin domain of Mil-MMP recognized by this EIA system is human [SEQ ID NO: 4], mouse [SEQ ID NO: 5], rat [Rooster column number: 6] and rabbit [Rooster Column number: 7] (Fig. 9).
  • Fig. 9 The amino acid residues, only one residue was found between human / mouse, one residue between human / rat, and three residues between human / rabbit. The power was confirmed to be well preserved among species.
  • Example 13 Variation in Immunoreactivity of Antibody in the Presence of Surfactant and Reducing Agent
  • the reactivity of the antibody in the presence of a surfactant and a reducing agent was examined by Western blotting.
  • MT of the MT1-MMP sandwich EIA described herein was subjected to SDS-PAGE at 500 ⁇ g / lane, and was transferred to a nitrocellulose membrane.
  • the H- ⁇ P monoclonal antibody 222 2D12 used as the solid phase antibody of the P sandwich EIA described in the self-published version of this specification is capable of containing or not containing SDS and 2-mercaptoethanol.
  • 222-9A3 showed equivalent reactivity to 222-2D12 without SDS and 2-mercaptoethanol.
  • 222-1D8 and other antibodies also showed a tendency to lose specificity, such as significantly reducing the reactivity with ⁇ -MMP and coloring the entire membrane.
  • a surfactant such as 2-mercaptoethanol, and a reducing agent
  • IgG3 has 15 SS bonds between heavy chains.
  • the strength of the SS bond between the intrachains is increased, and the immunoreactivity is lost together with the higher order of the antibody.
  • IgG3, which has a large amount of SS bonds has a large amount of change due to the reducing agent as compared with IgGl, and the immunoreactivity is significantly reduced.
  • PCR primer for amplifying the - (c 5 5 5 ⁇ 2 8) ⁇ domain, hinge Domein and the mode Bae Kishindomein; MT2-MMP (mouse SwissProt Accession No. 054732).
  • a Smal site was added to the 5 'primer, and a termination codon and a Bglll site were added to the 3' primer.
  • the Smal site was designed to allow 3 $ in frame with the ⁇ -force lactosidase of pUC18.
  • PSGMT2- ⁇ ⁇ obtained by closing the remains including the full length of ⁇ 2- ⁇
  • PCR was performed for 30 cycles at 93 ° C for 30 seconds, 45 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 60 seconds.
  • Both ends of the obtained PCR product were digested with Smal and BglII, and the resulting fragment was inserted into pUC18 previously digested with Smal iBamHI.
  • 3 ⁇ 4 ⁇ domain of MT3-MMP (SwissProt Accession No. P51512 ), a PCR primer one for amplifying the hinge domain and the mode Bae relaxin domain (Y 1 2 D -C 5 3 2) was created made.
  • the 5 'primer had a small site and the 3' primer had a stop codon and a BglII site.
  • the Smal site was designed to be able to access the ⁇ _galactosidase of pUC18 in frame.
  • the PSGMT3-bandon which cloned the gene containing the full length of ⁇ 3-bandon ⁇ , was type III, and PCR was performed for 30 cycles at 93 ° C for 30 seconds, 45 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 60 seconds. Cleaved both ends of the obtained PCR product with Smal and BglII. We had pUC18 cut with mHI.
  • MT4-MMP (SwissProt Accession No. Q9ULZ9 ) angular butterflies domain, a hinge domain and the mode Bae relaxin domain (Q 1 2 9 - C 5 2 5) can PCR primers designed to amplify. 5, side primer has Smal site, and 3 side primer has stop codon and Bg III site. The Smal site is designed so that it can be linked to pUC18 3-galactosidase in frame.
  • MT5- MP (SwissProt Accession No. Q9Y5R2) Butterfly domain Hinjidomein and the mode Bae connexin domain of (Y 1 5 6 - C 5 6 9) the PCR primer one to amplify the work made of.
  • the Smal site was added to the 5'-side primer, and a stop codon and a BglII site were added to the 3'-side primer.
  • Smal site was designed so that it can be sintered at inflation one-time 3-galactosidase Ichize of P UC18. Perform 30 cycles of PCR at 93 ° C for 30 seconds, 45 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 60 seconds using the brain cDNA library as type III.
  • the Smal site is designed so that it can be linked in frame to the ⁇ -ii lactosidase of pUC18. 30 cycles at 93 ° C for 30 seconds, 45 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 60 seconds, using a vector from which a gene containing the full length of MT6-MMP was cloned or a leukocyte, lung, spleen cDNA library, etc. as type III Perform PCR.
  • Both ends of the obtained PCR product are cut with Smal and Bglll, and inserted into pUC18 previously cut with Smal and BamHI.
  • Recombinant protein MT2- ⁇ P, ⁇ 3- ⁇ , rat MT4-MP, ⁇ 5- ⁇ and ⁇ 6-MMP consisting of domain, hinge domain and hemodin domain were included in the same manner as in Example 1. It can be recovered as a body, solubilized in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 8 M urea, 0.1 M NaCl, and purified and fractionated by preparative SDS-PAGE and electroelution. Alternatively, a gentle refolding can be used to create ⁇ - ⁇ with ⁇ ⁇ ⁇ activity.
  • the production of polyclonal and monoclonal antibodies can be enhanced.
  • a combination of the obtained monoclonal antibody and each recombinant protein can be used to specifically measure ⁇ 2- ⁇ , ⁇ 3- ⁇ , ⁇ 4- ⁇ , ⁇ 5-screen ⁇ , and ⁇ ⁇ 6- ⁇ .
  • Deutsche ⁇ system power is obtained. Measure membrane-bound ⁇ 2- ⁇ , ⁇ 3- ⁇ , ⁇ 4- ⁇ , -5-bandage and ⁇ ⁇ 6-solids.
  • For ⁇ ⁇ solid phase select an antibody that is resistant to surfactants and reducing agents. Powerful and desirable.
  • the membrane-bound ⁇ 2--, ⁇ 3- ⁇ , ⁇ 4- ⁇ , ⁇ 5- ⁇ and “ ⁇ 6- ⁇ ” of the image can be extracted in a buffer containing a surfactant and a reducing agent. .
  • MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP, MT5-MMP and MT6-Mandarin P sandwich EIA ⁇ activity measurement system is used to detect cancer ttg, identify cancer type, detect organ-specific cancer, Rheumatism In addition to being applicable to various clinical fields, such as estimating the degree of progression of osteoarthritis D. Alzheimer's disease, it can be used as a drug such as an MT-MP activity inhibitor, or as a means of studying its development.
  • the sensitivity and precision can be quickly and quickly determined using simple operations and.
  • soluble T1-banded P in a test sample can be obtained.
  • MT-MMPs can be freed or solubilized from fine SM and the MT-encapsulated Ps can be obtained.
  • the development and research means are shared.

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Description

明 細 書
膨結合型マトリックスメタ口プロテアーゼの免、疫学的測定法 技術分野
本発明は、膨結合型マトリックスメタ口プロテアーゼ (MT固 P)に対する抗体 ( ί¾1Τ- MMP抗体） を用いた免疫学的 法およびそれに用いる,に関する。 また 、 本発明は、 （0界面活性剤及び Z又は還元剤を用いて細胞膜から »し及び/ 又は可溶化した MT-MMPおよび (i i)自律的に可溶化した MT-MMPから成る群力、ら選ば れたものを免疫学的に する方法およびそれに用いる,に関する。特には、 本発明は、 （a)界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて細胞 膜から遊離し及び Z又は可溶化した MT-匪 Pある 、は (b) 自律的に可溶ィ匕した MT- M MPを、 MT- MMPに対する抗体（例えば、 i CMTl-MMP抗体） を用いて免疫学的に する方法に関する。 そして、本発明は、 （A) MT- MMPの発現を変化させる因子及び (B) MT-應 Pの酵素活性を変化させる因子の検索方法およびその因子を含有する医 薬に関する。一方では、 本発明は、 界面活性剤及び/又は還元剤を用いて MT1 -匪 Pなどの MT-應 Psを細胞膜から遊離し可溶化する方法に関する。 また、本発明は 、 MT- MMPの酵素活性を測定する方法およびそれに用いる |¾に関する。 景技術
マトリックスメタ口プロテアーゼ (MMPs)は、 プロペプチド、 酵素活性部位、 ヒ ンジおよびへモぺキシン様部位を基本ドメインとした構造を有する可溶型酵素で ある。一方、 MMPsの中で一群のサブファミリ一を形成する膜結合型マトリックス メタ口プロテア一ゼ (MT-固 Ps) は、 顧通ドメインを C-末端側に有し、細胞 J3肚 に埋め込まれた形で局在する膜結合型酵素である。現在、可溶薩 P として MMP- 1, 2， 3, 7, 8， 9， 10, 11, 12, 13, 18, 19， 20， 21, 2, 23， 26が、膜結合型 MMP として靜 - 14, 15, 16， 17， 24, 25 (それぞれ T1-, MT2-, MT3-, MT4-, M T5-， MT6-MMP) の遺伝子がクローニング、 同定されている。
[MT1-MMP によるプロ固 P- 2の活性化〕
MMP-2は、 ゼラチンや基纏の ¾¾¾分である IV型コラーゲンなどを分解する酵 素で、 その活性は多くのヒ十癌糸職の浸潤 '転移とよく相関すること力知られて いる。 MMP - 2以外のプロ MPs(MMP- 1， 3, 7， 8, 9, 10， 11， 13) は、 内因性のセ リンプロテア一ゼゃ活 'S MMPs相互によって活性化するカスケ一ドを持つが、 プ 口 MMP-2 はこれらとは異なる活性化機構を有する点で |½勺である。即ち、 プロ MP-2 は、 細胞 ±で TIMP-2を介して MT1- MMP と結合、 近接するもう一分子の MT 1-MMPがプロ MMP- 2のプロペプチドを切断し、 活 ttSに変換される。
CMT1-MMP とヒト癌糸織の浸潤 .転移〕
MT1-MMP は、 ヒト癌糸職の浸潤'転移とよく相関して発現する MMP- 2の活性化 機構に深く関与し、 また MT1 - MMP 自身も細胞外マトリックス分角離性を有するこ と力、ら、 癌の浸潤'転移において重要な働きを持つと考えられている。 MT1-M P は、 乳癌、 大腸癌、 胃癌、 頭頸部癌など多くの癌細胞で広く発現すること力く報告 されており、 MT1-MMPの存在と癌の悪性度即ち浸潤 ·転移能の関連性が注目され ている。
CMT1-MMP と慢性関節リゥマチ〕
慢性関節リゥマチ (RA)の琴湖病理像として、 血管新生と滑膜組織の増生が観察 される。過形成となった滑膜麵細胞は、匿 - 1， 3, MT1-MPおよび ΜΡ- 1を、 下層の線锥芽細胞は删 Ρ- 2 と ΤΙΜΡ-2を産生する。 また滑膜や関節腔に浸潤した好 中球は ΜΜΡ- 8， 9を産生、 これらの議 Psと TIMPs は関節液中に分泌する。 RA関節液 中の匿- 1， 2， 3， 8, 9 レベルは、 »性関節症 (OA)関節液より有意に高値で、 TIMPsの分 を上回り MMPs優位の状態にある。 これらに加えて、 軟骨細胞自身 力発現する MMP- 1， , 3， 7， 8， 13によって RAの関節軟骨破壊が進行する。 RAの 発症、 進行と MT卜 MMPの関連は知られていないが、 プロ MMP - 2の活性化や ΜΉ-讓 P 自身の ECM分角離性による関節軟骨破壊が RAの発症と進行に関与する可能性が める。
[MT1-MMP の分子種〕
MT- MPs は、疎水性の膜貫通ドメインを C-末端側に有しこれを介して細胞 に埋め込まれた形で するため、 他の可溶議 Psとは異なり不溶性を示す。実 際、 MT1-MMPは、 細胞膜に局在すること力く報告されている。 ¾ コンカナバリ ン A(Con A)で処理した乳癌細胞株において、 その培養上清に、 C-末端側の疎水性 膜貫通ドメィンを失った MT1- MMP力可溶ィ匕 (shedding)して存在すること力見出さ れた。 これは、 コンカナパリン Aで誘導されたアポト一シスの過程で膜結合翻 T 1 -匪 P力く何らかの機構により、 C-末端側で切断され、 膜から离髓兌したものとされ ている。 可溶ィ bMll - MMPの生理的機能は未知である力、 可溶型 MPsと同様、 種々 の生理的機能が予想される。 力、くして、 MT1-MMPの測定には、 これら膜結合薩 T 1-MMP と可溶型 MT1-MMPの両方に適応できる方法が適当であると考えられる。 ヒト癌組織の浸潤 '転移、 慢性関節リウマチ (RA)の病態に MT1- MMPがどの様に 関与している力、調べるためには、 ヒト体液、 例えば血中、 関節液、 腹水、 胸水、 尿など、 またはヒト組織、 培養細胞などに含まれる MT1- MMP量および 素活性を 知ることは重要である。 ところで、 MT1-MMPの測定には、 mRNAの発現をノーザン ブロット法で半 的に検出する方法、 RT- PCRで半 ¾*0勺に検出する方法などが ある力く、 いずれも遺伝子の発現レベルを反映する方法であり、 機能的な ΜΤ卜酵 の量を示すものではない。 またこれらの方法は、 被検試料が限定されるうえ、 fflR NAの抽出など技術的に繁雑であり、 I 性の確保は困難である。
また、 MT1-MMPの検出には、 プロ MMP - 2の活性化を指標にして諮面する方法が ある。 被検試料をゼラチンザィモグラフィ一で分析することで、 活性化した MMP - 2 を検出し、 その活性化因子である MT1 -層の雜を想定することができる。 し 力、し、 この方法は、 MT1- MMPの存在を間接的に観察しているにすぎないうえ、 血 などの高タンノ、°ク質濃度の検体は、 直接ゼラチンザィモグラフィ一に供す ることは不可能である。
また、 ί¾ΠΊ - ΜΜΡ抗体を用いたウェスタンブロット法でも ΜΉ -匪 Ρの検出力く可
^■ J i =1 ^/'V 1 Ά τ S& ¾I=fe^+ w/-^ 限界が高いため、 に雜する可溶' ¾ΜΊ1-ΜΜΡを測定するのは困難である。
MT1-MMPの酵素活性を測定する方法としては、 ゼラチンザィモグラフィ一カ 口 られている。 ゼラチンザィモグラフィ一は、 電気泳動上で MT1- ΜΜΡの分画と活性 検出を同時に行うこと力《できる点で、 非精製検体に含まれる MT1- ΜΜΡの活性検出 に優れた方法であるが、操作が繁雑である上、 測定結果は半錢的な判定にとど まる。
以上のように、 ノ一ザンブロット法、 RT - PCR、 ザィモグラフィ一およびウェス タンブロット法などで MT1 - MMPの検出や半 的な測定は可能ではある力《、 いず れも操作が複雑で、 翻' f生に乏しく、 簡便な Ml-删 Pの 法および活性測定 方法は得られていない。 発明の開示
本発明の目的は、 簡単な操作および 葉を用い、 感度並びに精度良く、 迅速に MT1-MMPなどの MT- MPを する方法、 MT1-MMPを含めた各 MT-匪 P酵素活性を測 定する方法およびそのための試薬キット、 さらにはそうした方法や試薬などを使 用することにより、 同定された活性物質などを含有する、 MT1-MMPなどの各 MT - M MPの発現や酵素活性を抑制する医薬を樹共することにある。
本発明は、
(1) 免疫学的方法を用いて、被検試料中の MT- MMP、 例えば ΜΉ-匪 P、 を する こと （免疫学的 MT- MMP¾* ^法）、 特には被検試料中の可溶薩 T-丽 Pを趕する こと；
(2)被検試料中の膜結合型 MT卜匪 Pなどの膜結合翻 T -固 Pを可溶化し、 免疫学的 測定法に適応する検体の調製方法を樹共すること；
(3)上記 (2) の方法で可溶型 MT- MMPに変換させた被検試料中の膜結合型 MT- MMPを 免疫学的方法で すること、 あるいは上記 (1) の方法において、 可溶 SMT- ΜΡ に変換させた被検試料中の膨吉合型 ΜΤ-ΜΜΡを免疫学的方法で すること；
(4) ΜΤ - ΜΜΡの免疫学的測定法を用いて、 MT- ΜΜΡの発糧を変化させる因子 ·薬剤 などを検索する方法、 およびそれらの因子 ·薬剤を含有する医薬；
(5) 免疫学的方法を用いて、 ΜΤ -画 Ρを選択的に固定化し、 固定化された ΜΤ -匪 Ρの 酵素活性を特異的に測定すること （MT -層酵素活性測定法） ； 及び
(6)上記 (5) の MT-匪 P酵素活性測定法を用いて、 MT-層の酵素活性を変化させる 因子 ·薬剤などを検索する方法、 およびそれらの因子 ·薬剤を含有する医薬を提 供する。
本発明は、
〔1〕 MT-MMPs力、ら成る群から選ばれた MT MMPに対する抗体を用いること を 1：とする MT- MMPの免疫学的 法；
〔2〕 MP-14 (MT1-画 P)に対する抗体， MMP-15 (MT2- MMP)に対する抗体， MMP-16 (MT3— MMP)に対する抗体， 匿- 17 (MT4- MMP)に対する抗体， MMP-24 (MT5 - 删 P)に対する抗体及び M1P- 25 (MT6-MMP)に対する抗体力、ら成る群から選ばれた抗 体を用いることを特徴とする上記 〔1〕 記載の免疫学的 法；
〔 3〕 MT1-MMPに対する抗体を用い且つ ffll- MMPの免疫学的錢をするこ とを特徵とする上言己 〔1〕 又は 〔2〕 記載の免疫学的 法；
〔4〕 界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いることを 特徵とする上記 〔1〕 〜 〔3〕 のいずれか一記載の免疫学的 法；
〔5〕 抗体が、 (i)界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものの 存在下で免疫反応性を維持できること及び (i i)人為的に変性してェピト一プを露 出させた MT- MMPを免疫 として得られることから成る群から選ばれた の少 なくとも一つを持つものであることを ：とする上記 〔1〕 〜 〔4〕 のいずれ力、 一記載の免疫学的趕法；
〔 6〕 免疫抗原力く、 MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4 -画 P, MT5-MMP及び MT6-MMPカヽら成る群から遷ま'れたものであることを纖とする上記 〔5〕 記載の
〔7〕 免疫 力 MT1-MMPであることを特徴とする上記 〔5〕 記載の免
〔8〕 抗体がモノクローナル抗体であることを樹 Iとする上記 〔1〕 〜 〔 7 ) のいずれか一記載の免疫学的趕法；
〔 9〕 免疫学的に できる MT -固 Pが、 （i)界面活性剤及び還元剤から成 る群力ヽら選ばれたものを用 、て細胞膜から遊離び/又は可溶化させた分子及び (i i)自律的に細胞膜から避! ¾ぴゾ又は可溶化した^?から成る群から選ばれた 分子種の少なくとも一つであることを糊数とする上記 〕 〜 〔8〕 のいずれ力、
—記載の免疫学的 法；
〔10〕 （a)界面活性剤及び還元剤から成る群から週ま'れたものを用いて、 MT -固 Pを細胞膜から邇鼠び/又は可溶化させる工禾級び （b) MT- MMPを免疫学 的に する工程を含むことを とする上記 〔1〕 〜 〔9〕 のいずれか一記載 の免疫学的 法；
〔11〕 MT -議 P力 MT1-MMP, MT2-MMP, MT3- MP, MT4-MMP, MT5-MMP及び ¥Γ 6-ΜΜΡ力、ら成る群から；！ばれたものであることを特徴とする上記 〔1〕 、 〔2〕 、 〔4〕 〜 〔6〕 及び 〔8〕 〜 〔10〕 のいずれか一記載の免疫学的 法；
[12] ΜΤ - ΜΜΡカ^ MT1-MMPであることを 1：とする上記 〔1〕 〜 〔11〕 の 、ずれか一記載の免疫学的趕法；
〔13〕 界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム (SDS) であることを樹敫とす る上記 〔4〕 〜 〔12〕 のいずれか一記載の免疫学的 ¾Μ法；
〔14〕 還元剤力 -メルカプトエタノールであることを樹数とする上記 [ 4 〕 〜 〔12〕 のいずれか一記載の免疫学的 法；
〔15〕 上記 〔1〕 〜 〔14〕 のいずれか一記載の免疫学的 法にィ ®¾する ための MT- ΜΜΡの免疫学的測定用 Μ¾；
〔16〕 MT-MMPs力、ら成る群から運ま'れた MT - MMPに対する抗体を含有してい ることを特徴とする上記 〔15〕 記載の
〔17〕 MT- MMP力 MT1-MMP, MT2-MMP, MT3 -匪 P, MT4-固 P， MT5-MMP及び "MT 6-MMPカヽら成る群から選ばれたものであることを'樹数とする上記 〔15〕 記載の試 薬；
〔18〕 MT1-MMPに対する抗体， MT2-MMP に対する抗体， MT3-MMPに対する 抗体， MT4- MP に対する抗体， MT5- MPに対する抗体及び ¥Γ6- MMP に対する抗体 から成る群から連ま'れた抗体を含有していることを'碰とする上記 〔15〕 記載の
〔19〕 ΜΤ-匪 Ρが、 MT1-MMPであることを特徴とする上記 〔15〕 記載の纖; 〔20〕 ΜΤ卜 ΜΜΡに対する抗体を含有していることを特徴とする上記 〔15〕 記 載の,；
〔21〕 界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを含有して 、る ことを特徵とする上記 〔15〕 〜 〔20〕 のいずれか一記載の
〔22〕 界面活性剤及び還元剤から成る群から遷ま'れたものを用いて、 MT-M MPs力、ら成る群から選ばれたものを、細胞膜から遊离級び Z又は可溶化させるこ とを樹敫とする MT - MMPの び/又は可溶化方法；
〔23〕 界面活性剤力く SDSであることを特徴とする上記 〔22〕 記載の方法；
〔24〕 還元剤が 2-メルカプトェタノ一ルであることを樹 とする上記 〔22 ] 記載の方法 ί
〔25〕 ΜΤ -匪 Ρ力く、 MTl-MMP, ΜΤ2 -匪 Ρ， ΜΤ3-ΜΜΡ, ΜΤ4-ΜΜΡ, ΜΤ5 -固 Ρ及び" Τ 6-酵カヽら成る群から還 れたものであることを特徵とする上記 〔22〕 〜 〔24〕 の 、ずれ力、一記載の方法；
〔26〕 ΜΤ-ΜΜΡ力く、 MT1-MMPであることを特徵とする上記 〔22〕 〜 〔24〕 の いずれか一記載の方法；
〔27〕 （a)上記 〔1〕 〜 〔14〕 のいずれか一記載の免疫学的 法あるいは (b)上記 〔22〕 〜 〔26〕 のいずれか一記載の方法に使用するためのものであるこ とを特徵とする MT-固 Pを遊离! ¾ぴン又は可溶化する
〔28〕 界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを含有している ことを とする上記 〔27〕 記載の,；
〔29〕 界面活性剤力 ¾DSであることを特徵とすることを特徴とする上記 〔 28〕 記載の難；
〔30〕 還元剤が 2 -メルカプトェタノ一ルであることを 1：とすることを特 徵とする上記 〔28〕 記載の
〔31〕 MT-MMP力 MTl-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP, MT5-MMP及び ΪΓ 6-MMP力ヽら成る群から週ま'れたものであることを撤とする上記 〔27〕 〜 〔30〕 の 、ずれ力、一記載の ；
〔32〕 MT-MMPが、 T1-MMPであることを特徵とする上記 〔27〕 〜 〔30〕 の いずれ力、一記載の觀；
〔33〕 （a)上記 〔1〕 〜 〔14〕 のいずれか一記載の免疫学的 法、 （b)上 記 〔15〕 〜 〔21〕 のいずれか一記載の!^、 （c)上記 〔22〕 〜 〔26〕 のいずれ力、 一記載の方法及び（d)上記 (27) 〜 〔32〕 のいずれか一記載の から成る群力、 ら選ばれたものを用い、且つ MT- MPsから成る群から選ばれたものの発現を促進 または阻害する化合物をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方 法；
〔34〕 被検化合物の存在下及び非 下にスクリ一二ングを行い、 被検化 合物の存在下及び非 下での各結果を比較することを特徵とする上記 〔33〕 記 載のスクリーニング方法；
〔35〕 MT1-MMP, MT2-删 P， MT3-MMP, MT4-MMP, MT5-MMP及び "MT6- MMPから 成る群から選ばれた MT-MMPの発現を促進または阻害する化合物をスクリ一ニング することを特徵とする上記 〔33〕 又は 〔34〕 記載のスクリーニング方法；
〔36〕 MT1-MMPの発現を促進または阻害する化合物をスクリ—ニングする ことを特徴とする上記 〔33〕 又は 〔34〕 記載のスクリーニング方法；
〔37〕 上記 〔33〕 〜 〔36〕 のいずれか一記載のスクリーニング方法に使用 するための、 MT- MMPsカヽら成る群から遷ま'れたものの発現を促進または阻害する ィ匕合物のスクリ一ニングキット；
〔38〕 （a) MT-MMPsカヽら成る群から選ばれた MT-MMPに対する抗体、 (b) 界 面活性剤及び還元剤から成る群から； ¾ばれたもの及び（c)免疫学的方法で固相ィ匕 された MT- MMPから成る群から選ばれたものを含有することを特徴とする上記 [37 〕 記載のキット；
〔39〕 MT1-MMP, MT2-MMP, MT3 -顯 P, MT4-MMP, MT5-MMP及び " T6 -匪 P力、ら成 る群から選ばれた MT-匪 Pの発現を促進または阻害する化合物のスクリ一ニングの ためのものであることを樹敫とする上記 〔37〕 又は 〔38〕 記載のキット；
〔40〕 ¾fn-醫の発現を促進または阻害する化合物のスクリ一二ングのため のものであることを樹敫とする上記 〔37〕 又は 〔38〕 記載のキット；
〔41〕 免疫学的方法で固相化された MT -讓 Pの酵素活性を測定することを特 徵とする測定方法； ·
〔42〕 MT-MMPの酵素活性を趕的に測定することを とする上記 〔41〕 記載の方法； 〔43〕 固相ィヒされた MT-MMP力 ί¾1Τ- MMP抗体を介して選択的に固相化され たものであることを特徴とする上記 〔41〕 又は 〔42〕 記載の方法；
〔44〕 MT-MMP力 MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, T4-MMP, MT5-MMP及び" MT 6 -匪 P力、ら成る群から週ま'れたものであることを特徴とする上記 〔41〕 〜 〔43〕 の 、ずれ力、一記載の方法；
[45] MT-MMP力く、 MT1-MMPであることを特徵とする上記 〔41〕 〜 〔43〕 の いずれか一記載の方法；
〔46〕 MT-MMP力 (i)界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたもの を用いて細胞膜から遊淑ぴノ又は可溶化させた好及び (i i)自律的に細胞膜力、 ら禪扱び Z又は可溶化した分子から成る群から週 れた好種の少なくとも一 つであることを特徴とする上記 〔41〕 〜 〔45〕 のいずれか一記載の方法；
〔47〕 （a)界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用 、て MT- Μ MPを細胞膜から遊离! ¾び/又は可溶化させるェ禾! ¾び（b) MT-MMPの酵素活性を 測定する工程を含むことを特徵とする上記 〔41〕 〜 〔46〕 のいずれか一記載の方 法；
〔48〕 免疫学的方法で固相化された MT匪 P；
〔49〕 画 P抗体を介して選択的に固相化されたものであることを特徴 とする上記 〔48〕 記載の固相化された MT-画 P;
〔50〕 御 T-匪 P抗体が、 MT-應 Pのへモぺキシン様ドメィンを認識する抗体 であることを樹敫とする上記 〔49〕 記載の固相化された MT- MMP;
〔51〕 MT- MMPが、 MT1-MMP, MT2-MMP, T3- MP, MT4- MP, T5-MMP及び 1WT 6- MMPカヽら成る群から選ばれたものであることを特徴とする上記 〔48〕 〜 〔50〕 の 、ずれか一記載の固相化された MT - MMP；
〔52〕 MT- MMP力、 MT1- MPであることを特徵とする上記 〔48〕 〜 〔50〕 の 、ずれか一記載の固相化された MT—画 P；
〔53〕 （i)上記 〔41〕 ~ 〔47〕 のいずれか一記載の方法あるいは (Π)上記 [48] 〜 〔52〕 のいずれか一記載の固相ィ匕された ΜΤ-固 Ρを用いた、 MT-MMPの酵素 活性を促進または阻害する化合物のスクリ一ニング方法；
〔54〕 被検化合物の存在下及び非存在下にスクリ一ニングを行い、 被検化 合物の 下及び非存在下での各結果を比較することを樹敫とする上記 〔53〕 記 載のスクリーニング方法；
〔55〕 上記 〔41〕 〜 〔47〕 のいずれか一記載の方法に使用するための、 MT - MMPの酵素活性を促進または阻害する化合物のスクリ一ニングキット；
' 〔56〕 上記 〔48〕 〜 〔52〕 のいずれか一記載の固相化された MT-丽 Pを含有 していることを特徵とする上記 〔55〕 記載のキット；
〔57〕 (a)上記 〔33〕 〜 〔36〕 のいずれか一記載の方法で得られ且つ MT - 國 Psから成る群から選ばれたものの発現を促進または阻害する化合物、 (b)上記 〔37〕 〜 〔40〕 のいずれか一記載のキットをィ して得られ且つ MT-MMPsから成 る群から:！ばれたものの発現を促進または阻害する化合物、 （c)上記 〔53〕 又は 〔54〕 記載の方法で得られた MT-匪 Pの酵素活性を促進または阻害する化合物及び (d)上記 〔55〕 又は 〔56〕 記載のキットを使用して得られた MT- MPの酵素活性を 促進または阻害する化合物から成る群から遷ま'れたものを含有していることを特 徵とする医薬；
〔58〕 MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4- MP, MT5 -編 P及び ¥Γ6 -匪 P力、ら成 る群から運ま'れた ΜΤ-ΜΜΡの発現を促進または阻害する化合物又は該 ΜΤ-固 Ρの酵素 活性を促進または阻害する化合物を含有していることを特徵とする上記 〔57〕 記
〔59〕 ΜΠ- ΜΜΡの発現を促進または阻害する化合物又は MTl-MMPの酵素活性 を促進または阻害する化合物を含有していることを ϋとする上記 〔57〕 記載の
〔60〕 （i)上記 〔1〕 〜 〔14〕 のいずれか一記載の免疫学的 ¾4法又は (i i) 上記 〔41〕 〜 〔47〕 のいずれか一記載の方法により、 MT-固 Ps力、ら成る群から選 ばれたものを測定するものであることを特徵とする癌 ί食査または癌転移 薬あ るいはリウマチ'性関節炎またはアルツハイマーの進亍度検査薬；
〔61〕 (A) G)界面活性剤及び還元剤から成る群から遷ま'れたものを用 、て 細胞膜から; び Ζ又は可溶化させた分子及び (i i)自律的に細胞膜から遊离敗 び/又は可溶化した肝から成る群から避ま'れた好種の少なくとも一つである MT-删 Pの量を指標として使用し、 癌の悪艘を 面する又は癌転移能を I ^面する かあるいはリゥマチ性関節炎またはアルツハイマーの進行度を言 面する力、、 ある いは （B) (i i i)界面活性剤及び還元剤から成る群から週ま'れたものを用いて細胞 膜から遊腹び Z又は可溶化させた分子及び (iv)自律的に細 8纖から: β¾び/ 又は可溶化した好から成る群から遷ま'れた分子種の少なくとも一つである ΜΤ- Μ MPの酵素活性の量を指標として麵し、 癌の悪' f艘を龍する又は癌転移能を評 価するかあるいはリウマチ性関節炎またはアルッハイマーの進行度を謝面するこ とを特徵とする上記 〔60〕 記載の検査薬；
〔62〕 MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP, MT5- MMP及び ¥Γ6 -固 P力、ら成 る群から選ばれた ΜΤ-固 Ρを測定するものであることを特徵とする上記 〔60〕 又は 〔61〕 記載の検纏；
〔63〕 Μ -ΜΜΡを測定するものであることを特徵とする上記 〔60〕 又は 〔61 〕 記載の
〔64〕 MT1-應 Pに対する抗体， T2-MMPに対する抗体， MT3-MMPに対する抗 体， MT4-MMPに対する抗体， MT5-MMP に対する抗体及び M6- MMPに対する抗体力、 ら成る群から選ばれた抗体を含有していることを特徵とする上記 〔60〕 〜 〔62〕 の 、ずれか一記載の検査薬；
〔65〕 ΜΊΊ-固 Pに対する抗体を含有していることを特徵とする上記 〔60〕 〜 〔64〕 のいずれか一記載の i ¾薬；
〔66〕 ΜΉ-匪 Pの酵素活性を測定するものであることを特徵とする上記 〔60 〕 〜 〔65〕 のいずれか一記載の検査薬； 及び
〔67〕 上記 〔1〕 〜 〔66〕 のいずれか一記載の中で抗体が、 MT- MMPのへモ ぺキシン様ドメィンを認識するものであることを4 敫とする、 免疫学的 法、 免疫学的測定用 «、 スクリーニング方法、 スクリーニングキット、 酵素活性測 定方法、 免疫学的方法で固相化された ΜΤ-爾、 医薬、 検査薬などを樹共する。 本発明では、 好適に、 可溶 SMI- MMPについての免疫学的定量法、 免疫学的測 定用 ¾¾、 スクリーニング方法、 スクリーニングキット、酵素活性測定方法、 免 疫学的方法で固相化された MT-隱、 医薬、 ネ錢薬などが樹共される。
本発明は、
〔68〕 MT-MMPsカヽら成る群から選ばれた MT - MMPに対する抗体であって、 且 つ ω界面活'酷吸び還元剤から成る群から選ばれたものの被下で免疫反応性 を勝できること及び (i i)人為的に変性してェピト一プを露出させた MT - MMPを免 疫 $ 、として得られることから成る群から選ばれた糊敷の少なくとも一つを持つ ものであることを特徵とする抗体；
〔69〕 MT1-MMP に対する抗体， MT2-MMPに¾^ "る抗体， MT3-匿 に対する 抗体， MT4- MP に対する抗体， MT5-MMPに対する抗体及び ¥Γ6 -匪 P に対する抗体 力、ら成る群から運ま'れたものであることを纖とする上記 〔68〕 記載の抗体；
〔70〕 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする上記 〔68〕 又は 〔69〕 記載の抗体；
〔71〕 抗体が ¥Γ-画 Ρのへモぺキシン様ドメインを認識するものであること を特徴とする上記 〔68〕 〜 〔70〕 のいずれか一記載の抗体；
〔72〕 抗体が固相化抗体であることを樹敫とする上記 〔68〕 〜 〔71〕 のい ずれか一記載の抗体； 及び
〔73〕 抗体が標識抗体であることを 徵とする上記 〔68〕 〜 〔71〕 のいず れか一記載の抗体を樹共する。 本発明のその他の目的、 特徵、優秀隨びその有する観点は、 以下の記載より 当業者にとっては明白であろう。 しカヽしな力《ら、以下の記 び具体的な^例 等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、 説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示 した本発明の意図及び範囲内で、 種々の変化及び Z又は改変 （あるいは修飾） を なすことは、 以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、 当業者 には に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての文献は、説明の目 的で弓 I用されて 、るもので、 それらは本明細書の一部としてその内容はここに含 めて角军釈されるべきものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の MT1- MPに対するモノクロ一ナル抗体を^ fflし、 難例 1 - ③で調製した AMH-MMP(58kDa)およびへモぺキシンドメイン (30kDa， 34kDa), 触 媒ドメィン (21kDa) の断片を抗原としたェピトープマッビングの結果を模式的に 示す。
図 2は、 本発明の MTl- MMPに対するモノクローナル抗体を使用し、 ¾5包例 1 - ②で調製した Ml- MMP， MT2-MMP (マウス）及び 3- MMPのそれぞれを発現する CO S-7の細胞破碎物を抗原としたウェスタンブロッティングによる交叉反応性試験 の結果を模式 0勺に示す。
図 3は、 MT1-固 Ρサンドイッチ ΕΙΑにより得られた標準曲線の例を示す。 図 4は、 各種固相ィ匕 ΜΜΡ モノクローナル抗体を用いた MTl -匪 Pの活性測 定の結果を示す。
図 5は、癌糸 びその近傍正常糸且織につき、 それらから調製された抽出液中 の MTl MMP量を彻 J定した糸吉果を各試料每に示したものである。
図 6は、癌糸且織から調製された抽出液中の MTl- MMP量と当該癌糸 !«のリンパ節 転移の有無を指標として;^されたものとの間の相関を示すものである。
図 7は、 ヒト、 マウス、 ラット及びラビット培養細胞株より調製された培養上 清について、 その中の MT1-匪 P量を測定し、 その結果得られた希釈曲線を示す。 図 8は、 界面活性剤及び還元剤存在下及び 下における ¾MT1-匪 P モノク 口一ナル抗体の MT1匪 Pに対する免疫反応性を試験した結果を示している。 ΜΉ- MMP は、 SDS - PAGEにかけられた後、膜に転 各抗体と反応せしめられた。 図 9は、 ヒト、 マウス、 ラット及びラビット由 *MT1 -画 Pのへモぺキシンドメ ィンのァミノ酸配列をそれぞれ比較して示したものである。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 ΜΉ- MMPに対する抗体を用いた免疫学的 法を含めた各 8MT-固 P に対する抗体を用いた免疫学的 法を樹共している。 そして、特には、 界面活 性剤及び Z又は還元剤を用いることを糊敫とする MT- MMPの免疫学的 法を樹共 する。 また、 本発明では、 界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを 少なくとも用いて、 MT-删 Pを細胞膜から遊嫩び Z又は可溶化させる工程を含む ことを ii [とする該 MT-鮮の免疫学的 法が樹共される。特には、 本発明では 、 MT1-, ΜΤ2-, ΜΤ3-， ΜΤ4-, ΜΤ5-， ΜΤ6-ΜΜΡなどの ΜΤ - MMPsをその測 像とす る免疫学的 ¾M法が f j共される。該 MT- MPに対し特異的に反応する抗体としては 、 （i)界面活性剤及び/又は還元剤の存在下で免疫反応性を »できること、 （ i i)人為的に変性し、 ェピト一プを露出させた ΜΊΊ- MMPなどの MT- MMPを免疫 として得られることから成る群から： ilばれた樹敫を有している。好適には、 MT- M MPとしては、 ΜΉ -匪 Pが挙げられる。以下、 MT1-, MT2 -， MT3 -， MT4 -， MT5 -， MT 6-MMPなどの MT-固 Psのうち、 ΜΊΊ-固 Pについてより詳しくその態様を説明する 力、 他の MT- MMP、 例えは ¥Γ2 -， ΜΤ3-, ΜΤ4-, ΜΤ5-, Τ6-ΜΜΡなどについても同様 にしてそれを適用できることは理解できょう。
一つの態様では、 本発明では、 免疫学的に できる ΜΤ卜 ΜΜΡが以下のいずれ 力、一つの^?種：
(0界面活性剤及び/又は還元剤を用いて、 細胞膜から遊離.可溶化させた分 子
(i i)自律的に細胞膜から遊離 ·可溶化した好
であることを樹敫とする ΜΤΊ-匪 Pの免疫学的 法が樹共できる。
本発明の該 MT1-固 Pの免疫学的 を用いると、 ΜΊΊ-編 Pの発現を促進または 阻害する化合物のスクリ一ニング方法およびスクリ一ニングキットカ 共できる 。 かくして、 本発明に従 、、 該スクリ一ニング方法あるいはスクリ一ニングキッ トにより得られた MT1 - MMPの発現を促進または阻害する化合物を含有しているこ とを特徴とする医薬も 共できる。 また、 本発明の該 MT1-丽 Pの免疫学的 法 により、癌または癌転移ネ錢薬、 さらにはリゥマチ性関節炎またはアルッハイマ —の進行度 ί娃薬が樹共できる。一つの具体的態様では、本発明では、免疫学的 方法で反応容器に固相ィ匕された ΜΊΊ - ΜΜΡを^ fflすることを樹敫とした MT1 - Μ Ρの 酵素活性の測定方法及びそのための も樹共できる。特には、 ί¾ΜΤ卜匿抗体 を介して選択的に反応容器に固相ィ匕された MT1 - ΜΜΡを翻することを樹数とした MT1-MMPの酵素活性を測定する方法及びそのための が i共できる。 こうして 、 本発明では、 さらに、 該 MT1-MMP.の酵素活性を測定する方法あるいはそのため の を用いた、 MT1-議 Pの酵素活性を促進または阻害する化合物のスクリー二 ング方法およびスクリーニングキットカ »でき、 さらには、 該 MT1-画 Pの酵素 活性を促進または阻害する化合物を含有していることを纖とする医薬が樹共さ れる。 同様に、 MT1- MMP に置き換えて、 他の MT-MMPについても上記した方法、 試 薬、 キットなどがま 共できる。 本明細書中、 「膜型マトリックスメタロプロテア一ゼ- 1」 ("membrane-type 1 matrix metal loproteii se")あるいは 「MT1- MMP」 は、 マトリックスメタ口プロ テア一ゼ- 14 (匪 P- 14)とも呼ばれる酵素 (MEROPS ID: M10. 014) で、 ヒトにおい てはその染色体遺伝子座 14qll- ql2 を占める遺伝子 (C. Mi non et al. , Gemomi cs, 28 : pp. 360-361 (1995))の産物であると報告されているものであり、 DNA ク 口一ニング並びに糸且換えタンパク質の発現に成功して、 その が確認されると ともに詳細なネ fi 及び特性が明らかにされたものである （H. Sato et al. , Natu re, 370 : pp. 61-65 (1994)； T. Takino et al. , Gene, 155 : pp. 293-298 (1995) ； GenBank™ accession number : 026512)。 Mil-固 P は、 ヒ卜の他、 ィヌ、 ャギ 、 ゥサギ、 イノシシ、 ネズミなどでもその存在が確認されている。 ヒト -層 の cDNAは、 582個のアミノ酸残基をコードし（EMBL accession No. D26512, E097 20 k E 10297 ; SWISS- PR0T: P50281) 、 その構造はシグナルペプチドに続くプロ ぺプチドドメイン、 ストロメリシン- 3 (stromelysin- 3)に類似した特異な 10個の アミノ酸残基からなる挿入配列 （フューリン (furin)-様酵素認識部位の可能性の ある配列） 、 亜鉛結合サイ卜の可能性を持つ部位を有するコア酵素ドメイン、 ヒ ンジドメイン、 そしてトランスメンブレンドメィンを抱えるへモペキンン様ドメ イン、 そして C-末端側の疎水 貫通ドメインからなっている。 ΜΉ-画 P は、 何 らかの機構により、 C -末端側で切断され、 膜から离健兑したもの （遊離したもの） 、 すなわち、 可溶化された MT1-應 P (可溶薩 Ή-ΜΜΡ)としても存在しうる。 同様 に、 他の MT2- , MT3-, MT4-, MT5-， MT6-MMP などについても、 それらは公知であ り、 遊、 文献を参照することで、 当業者には明らカヽである。 本明細書中、 用語 「抗体」 は最も広い意味で删さ^ そして特に、 それらが 所望の生物学的活性を示す限りは、 単一のモノクローナル抗体、 多ェピトープ特 異性を有する抗体組成物、 並びに抗体フラグメント （例えば、 Fvなど） 、 ダイァ ボディ型抗体などを含んでよい。 抗体としては、 特にモノクローナル抗体が'好ま しい。 本発明では、 ί¾1Ί1- MPモノクロ一ナル抗体を に利用できる。 他の抗 ΜΤ-ΜΜΡモノク口一ナル抗体も利用できることは明ら力、である。
本明細書中、 「モノクローナル抗体」 との用語は、 広義の意味で使用されるも のであってよく、 所望の MT1-匪 Ρなどのタンパク質断片に対するモノクローナル 抗体の単一のものや各種ェピトープに対する特異性を持つモノクローナル抗体組 成物であつてよく、 また 1価抗体または多価抗体を含むものであり、 さらに天然 型（intact) ^並びにそれらのフラグメント及び誘 本も表すものであり、 F(ab ' ) 2， Fab' 及び Fab といったフラグメントを包含し、 さらに少なくとも二つの抗 原又はェピトープ （印 i tope)結 ^^立を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、 又 は、 例えば、 クヮドローム（quadrome)， トリオ一ム（ t r i ome)などの二重特異' 祖 換え抗体、 種間雑種抗体、 抗イディォタイプ抗体、 さらには化学的に修飾あるい は加工などされてこれらの誘稱と考えられるもの、 公知の細胞融合又はハイブ リ ドーマ技術や抗体工学を適用したり、 合成あるいは半合雌術を使用して得ら れた抗体、 抗体生成の観点から公知である従来技術を適用したり、 DNA組換え技 術を用 、て調製される抗体、 本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質ある 、 は標的ェピト一プに関して中和特 f生を有したりする抗体又は結合特性を有する抗 体を包含していてよい。 抗原物質に対して作製されるモノクロ一ナル抗体は、 培養中の^ のセルライ ンにより抗体分子の産生を樹共することのできる任意の方法を用いて産生される 。 修食 吾 「モノクローナル」 とは、 実質上均質な抗体の集団から得られていると 、うその抗体の性格を示すものであつて、 何らかの特定の方法によりその抗体が 産生される必要があるとみなしてはならない。 個々のモノクローナル抗体は、 自 然に生ずるかもしれな 、変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという 以外は、 同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。 モノクローナル 抗体は、 高い特異性を持ち、 それは単一の 性をもつサイトに対して向けられ ているものである。 異なった i¾i決 (ェピトープ） に対して向けられた種々 の抗体を典型的には含んでいる通常の （ポリクロ一ナル） 抗体調製物と対比する と、 それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向 けられているものである。 その特異' f生にカロえて、 モノクローナル抗体は、 ハイブ リ ドーマ培養により合成され、 他のィムノグロブリン類の雄がないあるいは少 ない点でも優れている。 モノクローナル抗体は、 ハイブリツド抗体及びリコンビ ナント抗体を含むものである。 それらは、 所望の生物活性を示す限り、 その由来 やィムノグロブリンクラスゃサブクラスの に関わりなく、 可変令;!域ドメィン を定常領域ドメインで置き換えたり （例えば、 ヒト化抗体） 、 あるいは軽鎖を重 鎖で置き換えたり、 ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、 あるいはへ テロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ること力できる （例えば、 米国特許第 4816567号； Monoclonal Antibody Production Techniques and Appl i cat ions, pp. 79-97, Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987 など） 。
モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、 ハイプリ ドーマ法 （G. ohler and C. Milstein, Nature, 256, pp. 495-497 (1975)) ; ヒト B細胞ノヽイブ リ ドーマ法 (Kozbor et al. , Immunology Today, 4， pp. 72-79 (1983) ; Kozbor,
J. Immunol. , 133, pp. 3001 (1984)； Brodeur et al. , Monoclonal Antibody P roduction Techniques and Appl ications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc. , Ne w York (1987)；トリオ一マ法； EBV-ハイブリ ドーマ法 (Cole et al. , Monoclona 1 Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96 (1985)) (ヒ トモノクローナル抗体を産生するための方法）;米国特許第 4946778号（単鎖抗体 の産生のための技術） 力挙げられる他、 抗体に関して以下の文献力零げられる： S. Biocca et al. , EMBO J， 9， pp. 101-108 (1990)； R. E. Bird et al. , Scienc e， 242, pp. 423-426 (1988)； M. A. Boss et al. , Nucl. Acids Res. , 12, pp. 37 91-3806 (1984)； J. Bukovsky et al. , Hybrid隠， 6, pp. 219-228 (1987)； M. DAIN0 et al. , Anal. Biochem. , 166， pp. 223-229 (1987) ; J. S. Huston et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5879-5883 (1988) ; P. T. Jones et al. , Nature, 321, pp. 522-525 (1986)； J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in
Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical Techniques, Part I : Hybridoma Tec hnology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986)； S. Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, p. 6851-6855 (1984)； V. T. Oi et al. , BioTechniques, 4, pp. 214-221 (1986)； L. Riechmann et al. , Nature, 332, pp. 323-327 (1988)； A. Tramontano et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp. 6736-6740 (1986)； C. Wood et al. , Nature, 314, pp. 446-4 49 (1985) ; Nature, 314, pp. 452-454 (1985) あるいはそこで引用された文献 ( それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる
) o 本発明に係るモノクローナル抗体は、 それらが所望の生物活性を示す限り、 重 鎖及び/又は軽鎖の一部力く特定の種から誘導される又は特定の抗体クラス若しく はサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又はホモローガスであるが、 一方、 鎖の残部は、 別の種から誘導される又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属 する抗体の対応配列と同一又はホモローガスである、 「キメラ」 抗体（免疫グロ ブリン） を包含するものであってもよい （米国特許第 4816567号明細書； Morris on et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, p. 6851-6855 (1984)) 。
以下、 モノクローナル抗体の作製につき詳しく説明する。
本発明のモノク口一ナル抗体は、 ミェ口一マ細胞を用 、ての細胞融合技術 (Koh ler, G. k Mi lstein, C.， Nature, 256 : 495 (1975) などにより開示された細胞 融合技術） を利用して得られたモノク口一ナル抗体であってよく、 例えば次のよ うな工程で作製できる。
1 . 免疫原性抗原の調製
2 . 免疫原性抗原による動物の免疫
3 . ミエローマ細胞 （骨髄 ffiffl胞） の調製
4 . 抗体産^!田胞とミエロ一マ細胞との細胞融合
5 . ハイプリ ドーマ （融合細胞） の選嫩びモノクローンィ匕
6 . モノクローナル抗体の製造
1 . 免麵生碰の調製
としては、 上記で記載してあるように、 MT - MMPs、 例えば ¥T1- MMPの可溶 性タンパク質断片又はそれから誘導された断片を用いることができる。例えば、 決定された MTl- MMP タンパク質の配列 1f¾を基に、 適当なオリゴペプチドを化学 合成しそれを ί¾¾として利用することもできる。 あるいは、該 を基に、 適切 な遺 fe?ライブラリーを構築したり、 あるいは公知又は に入手できる遺伝子 ライブラリ一を選択删し、 組換え DNA技術を含む遺 工学的操作を適用して 、 例えば、 MT1-MMP のへモぺキシンドメイス亜鉛結合サイトの可能性を持つ部 位を有するコア酵素ドメイン、 組換え ΜΤΊ-ΜΜΡの可溶性タンパク質などを取得し てそれを利用すること力《できる。抗原としては、 好ましくは、 人為的に変性し、 ェピト一プを露出させた ΜΊΊ- MMPを用いることが出来る。上記手法は、他の MT- M MPにつ 、ても同様に行 、得る。
遺伝 換え技術（組換え DM技術を含む） は、 例えば J. Sambrook, E. F. Fri tsch k T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edi t ion)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
(1989)； D. M. Glover et al. ed.， "DNA Cloning", 2nd ed.， Vol. 1 to 4, ( The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford Universi ty Press (1995 ) ;日本生化学会編、 「続生化学実編座 1、 遺伝子研究法 I I」 、東京化学同人（ 1986) ;日本生化学会編、 「新生化学実験講座 2ヽ 核酸 I I I (組換え匪技術） 」 、 東京化学同人 (1992)； R. Wu ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Reco mbinant DNA), Academic Press, New York (1980) ; R. Wu et al. ed.， "Method s in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) k 101 (Recombinant DNA, Part C)， Academic Press, New York (1983)； R. Wu et al. ed. , "Method s in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D)， 154 (Recombinant D NA， Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1 987) ; J. H. Miller ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 204, Academic Pres s, New York (1991) ; R. Wu et al. ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 218,
Academic Press, New York (1993)； S. Weissman (ed. ), "Methods in Enzymol ogy", Vol. 303, Academic Press, New York (1999) ; J. C. Glorioso et al. ( ed. )， "Methods in Enzymology", Vol. 306， Academic Press, New York (1999) などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法ある ヽはそれらと実 質的に同様な方法や改変法により行うこと力できる （それらの中にある記載はそ れを参照することにより本明細書の開示に含められる）。 抗原は、 そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免疫するのに ί¾¾でき る力^ 免 ¾ϋ性コンジュゲートなどにしてもよい。 例えば、 免 ¾ ^として用いる 抗原は、 ΜΤ-丽 Ρ (例えば Ί-删 Ρ ) を断片ィ匕したもの、 あるいはそのアミノ酸配 列に基づき特徴的な配列領域を選び、 ポリぺプチドをデザィンして化学合成して 得られた合成ポリペプチド断片であってもよい。 また、 その断片を適当な縮合剤 を介して種々の担体夕ンパク質類と結合させてハプテン一タンパク質の如き免疫 原性コンジュゲートとし、 これを用いて特定の配列のみと反応できる （あるいは 特定の配列のみを認識できる） モノクローナル抗体をデザィンするのに用いるこ ともできる。 デザィンされるポリぺプチドには予めシスティン残基などを付加し 、 免 生コンジュゲ一トの調製を ^にできるようにしておくことができる。 担体タンパク質類と結合させるにあたっては、 担体タンパク質類はまず活性化さ れることができる。 こうした活性化にあたり活性化結合基を導入することが挙げ られる。
活性化結合基としては、 (1) 活性化エステルあるいは活性化カルボキシル基、 例えばニトロフヱニルエステル基、 ペンタフルオロフェニルエステノレ基、 1 -ベン ゾトリァゾ一ノレエステノレ基、 N -スクシンイミ ドエステル基など、 (2) 活性化ジチ ォ基、 例えば 2-ピリジルジチォ基などが挙げられる。 担体タンパク質類としては 、 キーホール' リンペッ ト 'へモシァニン （KLH)、 牛血清アルブミン （BSA)、 卵 白アルブミン、 グロプリン、 ポリリジンなどのポリぺプタイド、 細菌菌体成分、 例えば BCGなどが挙げられる。
2 . 免疫原性抗原による動物の免疫
免疫は、 当業者に知られた方法により行うこと力くでき、 例えば 繁、 他編、 実験生物^！冓座 14、 免数物学、 丸善株式会社、 昭和 60年、 日本生化学会編、 化学実験講座 5、 免«化 究法、 東京化学同人、 1986年、 日本生化学会 編、 新生化^^験講座 12、 分子免疫学 I I I、 観.抗体 ·補体、 東京ィ 同人 、 1992年などに記載の方法に準じて行うこと力できる。 免疫化剤を （必要に応じ アジュバントと共に） 一回又はそれ以上の回数哺乳動物に測することにより免 疫化される。 代表的には、 該免疫化剤及び/又はアジュバントを哺乳動物に複数 回皮下測あるいは臓空内測することによりなされる。 免疫化剤は、 ± im ペプチドあるいは匿 s、 例えば ¥Π-ΜΜΡ タンパク質あるいはその断片を含むもの が挙げられる。 免疫化剤は、 免疫処理される哺乳動物において免麵性であるこ との知られているタンパク質 （例えば上記担体タンパク質類など） とコンジュゲ —トを形成せしめて使用してもよい。 アジュバントとしては、 例えばフロイント 完全アジュバント、 リビ (Ribi)アジュバント、 百日咳ワクチン、 BCG 、 リピッ ド A、 リポソ一ム、 水酸化アルミニウム、 シリカなどが挙げられる。 免疫は、 例え ば BALB/cなどのマウス、 ハムスター、 その他の適当な動物を使用して行われる。 抗原の投与量は、 例えばマウスに対して約 1〜400 〃g /動物で、 には宿主 動物の駟空内や皮下に翻寸し、 以後 1〜4週間おきに、 好ましくは 1〜2週間ご とに臟空内、 皮下、 静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を 2〜10回禾雖反復して行 う。 免; gfflのマウスとしては BALB/c系マウスの他、 BALB/c系マウスと他系マウス との F1マウスなどを用いることもできる。 必要に応じ、 抗体価測定系を調製し、 抗体価を測定して動物免疫の禾雖を確認できる。 本発明の抗体は、 こうして得ら れ免疫された動物から得られたものであつてよく、 例えば、 Ml清、 ポリクロ一 ナル抗体等を包含する。
3 . ミエローマ細胞 （骨髄 M胞） の調製
細胞融合に使用される無限増殖可能株 （腫瘍細胞株） としては免疫グロブリン を産生しない細胞株から選ぶこと力《でき、 例えば P3 - NS-卜 Ag4- 1 (NS-1, Bur. J. Immunol. , 6 : 511-519, 1976)、 SP-2/0-Agl4 (SP-2, Nature, 276 : 269 〜27 0, 1978 )、 マウスミエ口一マ MOPC- 21セルライン由来の P3- X63- Ag8- Ul (P3U1, Curr. topi cs Microbiol. Immunol. , 81 : 1-7, 1978 ) 、 P3-X63-Ag8 (X63, Nature, 256 : 495-497, 1975 )、 P3- X63 - Ag8- 653 (653, J. Immunol. , 123 : 1548-1550, 1979)などを用いること力くできる。 8 -ァザグァニン耐性のマウスミェ ローマ細胞株はダルベッコ MEM培地（腿 EM培地） 、 RPMI-1640培地などの細胞培 地に、 例えばペニシリン、 アミカシンなどの ½物質、 牛胎勉清 (FCS) などを 加え、 さらに 8—ァザグァニン （例えば 5〜45 zg/ml) を加えた培地で継代され るが、 細胞融合の 2〜 5日前に正常培地で継代して所要数の細胞株を用意するこ と力できる。 また翻細胞株は、 ？柬锆保存株を約 37°Cで完全に解凍したのち RPM I- 1640±咅地などの正常培地で 3回以上洗浄後、 正常培地で培養して所要数の細胞 株を用意したものであってもよい。
4 . 抗体産生細胞とミエロ一マ細胞との細胞融合
上記 2 . の工程に従 、免疫された動物、 例えばマゥスは最終免疫後、 2〜 5日 後にその脾臓が摘出され、 それから脾細胞懸濁液を得る。 脾細胞の他、 生体各所 のリンパ節細胞を得て、 それを細胞融合に使用することもできる。 こうして得ら れた脾細胞懸濁液と上記 3 . の工程に従 、得られたミエロ一マ細胞株を、 例えば 最小必須培地 (MEM培地） 、 DMEM培地、 RPMI-1640培地などの細胞培地中に置き、 細胞融合剤、 例えばポリェチレングリコ一ルを添加する。 細胞融合剤としては、 この他各種当該分野で知られたものを用いること力でき、 この様なものとしては 不活性化したセンダイウィルス（HVJ : Hemagglutinating Virus of Japan)なども 挙げられる。 好ましくは、 例えば 30〜60%のポリエチレングリコールを 0. 5〜2 ml加えること力くでき、 分子量が 1，000〜8，000のポリエチレングリコールを用い ることができ、 さらに^ ί量が 1, 000-4, 000 のポリエチレングリコ一ノレがより 好ましく使用できる。 融合培地中でのポリェチレングリコ一ルの濃度は、 例えば 30〜60%となるようにすること力く好ましい。 必要に応じ、 例えばジメチルスルホ キシドなどを少 ロえ、 融合を促進することもできる。 融合に删する脾細胞' ( リンパ球） ： ミエローマ細胞株の割合は、 例えば 1： 1〜20： 1とすること力く挙げら れるが、 より好ましくは 4 : 1〜7 : 1 とすること力くできる。
融合反応を 1〜10分間行い、 次に RPMI- 1640培地などの細胞培地を加える。 融 合反応処理はネ纖回行うこともできる。 融合反応処理後、 遠心などにより細胞を 分離した後選択用培地に移す。
5 . ハイプリ ドーマ （融 田胞） の選嫩びモノクロ一ンィ匕
選択用 ±咅地としては、 例えばヒポキサンチン、 アミノプテリン及びチミジンを 含む、 FCS含有 MEM培地、 RPMI-1640 ±咅地などの培地、 所謂 HAT±咅地が挙げられ る。 選択培地交換の方法は、 一般的には培養プレートに分注した容量と等容量を 翌日加え、 その後 1〜 3日ごとに MT培地で半量ずつ交換するというように処理 すること力くできる力 適宜これに ¾ を加えて行うこともできる。 また融合後 8 〜16日目には、 ァミノプテリンを除 、た、 所謂 HT±咅地で 1〜 4日ごとに培地交換 をすること力くできる。 フィーダ一として、 例えばマウス胸腺細胞をィ麵すること もでき、 それが好ましい: ti^がある。
ハイプリ ドーマの増殖のさ力、んな培養ゥエルの培養上清を、 例えば放射免疫分 析 (RIA) 、 酵素免疫分析 (ELISA) 、 蛍光免疫分析 (FIA) 、 発光免疫分析 (UA)、 ウェスタンブロティングなどの測定系、 あるいは蛍光惹起細胞分离|¾置 (FACS)な どで、 所定の断片ペプチドを抗原として用いたり、 あるいは標識抗マウス抗体を 用いて目的抗体を測定するなどして、 スクリ一ニングしたりする。
目的抗体を産生しているハイプリ ドーマをクロ一ニングする。 クロ一ニングは 、 寒天培地中でコロニーをピック 'アップする力、、 あるいは限界希釈法によりな されうる。 限界希釈法でより好ましく行うことができる。 クロ一ニングは複数回 ί亍うこと力 子ましい。
6. モノクローナル抗体の製造
得られたハイプリ ドーマ株は、 FCS含有 MEM培地、 RPMI-1640培地などの適当 な増殖用培地中で培養し、 その培: ¾ ι清から所望のモノクローナル抗体を得るこ とカ诎来る。 ： の抗体を得るためには、 ハイプリ ドーマを腹水化することカ げられる。 この ミエローマ細胞由来の動物と同系の糸纖適合性動物の翻空内 に各ハイブリ ドーマを移植し、 増殖させる力、、 あるいは例えばヌード ·マウスな どに各ハイプリ ドーマを移植し、 増殖させ、 睡物の腹水中に産生されたモノク 口一ナル抗体を回収して得ることが出来る。 動物はハイプリ ドーマの移植に ち、 プリスタン （2， 6， 10， 14-テトラメチルペン夕デカン） などの鉱物油を翻空内 投与しておくことができ、 その処理後、 ハイプリ ドーマを増殖させ、 腹水を採取 することもできる。 腹水液はそのまま、 あるいは 公知の方法、 例えば硫酸ァ ンモニゥム沈殿法などの塩析、 セフアデックスなどによるゲルろ過法、 イオン交 換クロマトグラフィ一法、 電気泳動法、 透析、 限外ろ過法、 ァフィ二ティ 'クロ マトダラフィ一法、 高速液体ク口マトグラフィ一法などにより精製してモノクロ ーナル抗体として用いること力《できる。好ましくは、 モノクローナル抗体を含有 する腹水は、 硫^画した後、 DEAE—セファロ一スの如き、 陰イオン交換ゲル及 びプロテイン Aカラムの如きァフィ二ティ ·カラムなどで処理し精製分離処理で きる。 特に好ましくは抗原又は抗原断片 （例えば合成ペプチド、 組換え抗原タン ノ、。ク質あるいはペプチド、 抗体が特異的に認識する部位など） を固定ィヒしたァフ ィニティ 'クロマトグラフィー、 プロテイン Aを固定ィヒしたァフィ二ティ 'クロ マトグラフィ一、 ヒドロキシァパタイト ·クロマトグラフィーなど力寧げられる また、 トランスジェニックマウス又はその他の生物、 例えば、 その他の哺乳動 物は、 本発明の免麵ポリペプチド産物に対するヒト化抗体等の抗体を発現する のに用いること力できる。
またこうして^に得られた抗体の配列を決定したり、 ハイブリ ドーマ株から 得られた抗体をコ一ドする核酸配列を利用して、 遺 ^¾且換え技術により抗体を 作製することも可能である。 当該モノクローナル抗体をコードする核酸は、 例え ばマウス抗体の翻や軽鎖をコードしている遺ィ≤^に特異的に結合できるオリゴ ヌクレオチドプローブを ί¾ιするなどの慣用の手法で単離し配列決定することが できる。 一旦単離された DNA は、 上記したようにして発現べクタ一に入れ、 CH0, COSなどの宿主細胞に入れること力できる。 該 DNAは、 例えばホモジーニアスな マウスの配列に代えて、 ヒトの重鎖や軽鎖の定常領域ドメィンをコ一ドする酉 』 に置換するなどして修飾することが可能である （Morrison et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 6581, 1984)。 力、くして所望の結合特異性を有するキメラ 抗体ゃハイブリツド抗体も調製することが可能である。 また、 抗体は、 下記する ような縮合斉 ijを用いることを含めたィ匕学的なタンパク合成技術を適用して、 キメ ラ抗体やハイプリッド抗体を調製するなどのィ 飾をすることも可能である。
ヒト化抗体は、 当該分野で知られた技術により行うこと力河能である （例えば 、 Jones et al. , ature, 321 : pp. 522-525 (1986) ; Riechmann et al. , Nature ， 332: pp. 323-327 (1988)； Verhoeyen et al. , Science, 239 : pp. 1534-1536 ( 1988))。 ヒトモノクローナル抗体も、 当該分野で知られた技術により行うことが 可能で、 ヒトモノクローナル抗体を生産するためのヒトミエローマ細胞ゃヒト · マウスへテロミエロ 細胞は当該分野で知られている （Kozbor, J. Immunol. , 133, ρρ· 3001 (1984)； Brodeur et al. , Monoclonal Antibody Production Tec hniques and Appl ications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc. , New York (1987) ) o イスぺシフィックな抗体を製造する方法も当該分野で知られている （Mi ll stein et al. , Nature, 305: pp. 537-539 (1983)； W093/08829; Traunecker et al. , E B0 J. 10: pp. 3655-3659 (1991) ; Suresh et al. , "Methods in Enzymo logy", Vol. 121, pp. 210 (1986))
さらにこれら抗体をトリプシン、 、。ィン、 ぺプシンなどの酵素により処理し て、 により還元して得られる Fab Fab' F(ab' ) 2 といった抗体フラグメン トにして使用してもよい。
抗体は、 既知の任意の検定法、 例えば競合的結合検定、 直接及び間接サンドィ ツチ;^、 及び免疫沈 P斜食定に することができる （Zola, Monoclonal Antib odies : A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc. , 1987) 。
抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジユゲー卜するには、 当分野で知られ る任意の方法を使用すること力くでき、 例えば、 David et al. , Biochemistry, 13 巻， 1014-1021 頁 (1974)； Pain et al, J. Immunol. Meth. , 40: pp. 219-231 ( 1981) ;及び "Methods in Enzymology", Vol. 184, pp. 138-163 (1990) により記 載の方法が挙げられる。標識物を付与する抗体としては、 IgG画分、 更にはぺプ シン消ィ匕後還元して得られる特異的結 'を用いること力できる。 これらの 齢の標識物の例としては、 下記するように酵素 （ペルォキシダ一ゼ、 アルカリ ホスファタ一ゼあるいは 3-D-ガラクトシダ一ゼなど） 、 ィ匕学物質、 蛍光物質あ るし、は方 M寸性同位元素などがある。 本発明の抗体、 特にはモノクローナル抗体を使用しての検矢ロ ·測定は、 ィムノ 染色、 例えば糸纖あるいは細胞染色、 ィムノアツセィ、 例えば競合型ィムノアツ セィまたは非競合型ィムノアツセィで行うこともでき、 FIA, LIA, RIA, ELISAな どを用いることもでき、 B-F分離を行ってもよいし、 あるいは行わないでその測 定を行うこともできる。 好ましくは放身挽疫測定法や酵素免疫測定法を採用する こと力くでき、 さらにサンドイッチ型アツセィを好ましく適用できる。 例えばサン ドィッチ型ァッセィでは、 一方を本発明の MT1 - MMPのへモぺキシンドメィンに対 する抗体などの MT-匪 Pのへモぺキシンドメィンに対する抗体とし、 他方を通常の MT1- MP に対する抗体などの KMT - MMP抗体とし、 そして一方を検出可能に標識化 する。 同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と標識化抗体及 び固相化抗体を必要に応じ順次反応させるためィンキュベ一ション処理し、 ここ で非結合抗体を分離後、 標識物を測定する。 測定された標識の量は抗原、 すなわ ち可溶 ttMT-丽 P抗原の量 （可溶 ttMTl- MP抗原の量） と比例する。 このアツセィ では、 不溶化抗体や、 標識化抗体の添加の )11醇に応じて同時サンドイッチ型アツ セィ、 フォワード （forward)サンドィッチ型ァッセィあるいは逆サンドィッチ型 アツセィなどと呼ばれる。 例えば洗浄、 ί»、 -、 ろ過あるいは抗原の予備抽 出等は、 特定の状況のもとでそれら測^:程の中で Μ:採用される。 特定の 、 緩衝液等の濃度、 温度あるいはインキュベーション処理時間などのその他の測 定条件は、 検体中の抗原の濃度、 検体試料の性質等の要素に従い変えること力くで きる。 当業者は通常の実験法を用 ゝながら各測定に対して有効な最適の条件を適 宜選定して測定を行うこと力く出来る。
観あるいは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、 本発明ではそれ らから適宜選んで用いること力できる。 担体としては、 抗原抗体反応などに麵 されるもの力種々知られており、 本発明にお 、ても勿論これらの公知のものの中 から選んでィ顿できる。 特に好適に細されるものとしては、 例えばガラス、 例 えば活性化ガラス、 多孔質ガラス、 シリカゲル、 シリカ一アルミナ、 ァノレミナ、 磁化鉄、 磁化合金などの無機材料、 ポリエチレン、 ポリプロピレン、 ポリ塩化ビ ニル、 ボリフッ化ビニリデス ポリ酢酸ビニル、 ポリメタクリレート、 ポリスチ レス スチレンーブタジェン共重合体、 ポリアクリルァミ ド、 架橋ポリアクリル アミ ド、 スチレンーメタクリレート共重合体、 ポリグリシジルメタクリレート、 ァクロレイン一エチレングリコ一ノレジメタクリレート共重合体など、 架橋化アル ブミン、 コラーゲン、 ゼラチン、 デキストラン、 ァガロース、 架橋ァガロース、 セルロース、 ； ί敞結晶セルロース、 カルボキシメチルセルロース、 セルロースァセ テ一トなどの天然または変成セルロース、 架橋デキストラン、 ナイ口ンなどのポ リアミ ド、 ポリウレタン、 ポリエポキシ ί脂などの有機高分 質、 さらにそれ らを乳化重合して得られたもの、 細胞、 赤血球などで、 必要に応じ、 シランカツ プリング剤などで官能性基を導人してあるもの力挙げられる。
さらに、 ろ紙、 ビーズ、 試験容器の内壁、 例えば試験管、 タイタ一プレート、 タイタ一ゥヱル、 ガラスセル、 合 脂製セルなどの合成材料からなるセル、 ガ ラス棒、 合成材料からなる棒、 末端を太くしたりあるいは細くしたりした棒、 末 端に丸 、突起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、 薪反状にした棒などの 固体物質 （物体） の表面などが挙げられる。
これら担体へは、 抗体を結合させること力でき、 好ましくは本発明で得られる 抗原に対し特異的に反応する抗体、 特にはモノクロ一ナル抗体を結合させること 力くできる。 担体とこれら抗原抗体反応に関与するものとの結合は、 吸着などの物 理的な手法、 あるいは縮合剤などを用いたり、 活性化されたものなどを用いたり する化学的な方法、 さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法などにより 行うこと力出来る。
標識としては、 酵素、 酵素基質、 酵素インヒビタ一、 補欠分 、 補酵素、 酵 素前駆体、 アポ酵素、 蛍光物質、 色素物質、 ィ匕学ルミネッセンス化合物、 発光物 質、 発色物質、 磁気物質、 金属粒子、 例えば金コロイドなど、 放射性物質などを 挙げることができる。 酵素としては、 IfcK素酵素、 還元酵素、 酸化酵素などの酸 化還元酵素、 例えばアミノ基、 カルボキシル基、 メチル基、 ァシル基、 リン酸基 などを転移するのを角 ¾する転移酵素、 例えばエステル結合、 グリコシド結合、 エーテノレ結合、 ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、 リアーゼ、 イソ メラーゼ、 リガ一ゼなどを挙げること力できる。酵素は複数の酵素を複合的に用 、て； ^口に利用することもできる。 例えば ¾素的サイクリングを利用することも できる。
代表的な方 id寸性物質の標 I ^同位体元素としては、 [3 2P]， [1 25 ι]， [1 3 ' ι]， [ ]，[" c], [35s] などが挙げられる。
代表的な酵素標識としては、 西洋ヮサビペルォキシダ一ゼなどのペルォキシダ
—ゼ、 昜菌 3 - D- ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、 マレエート ·デ ヒドロゲナ一ゼ、 グルコース- 6- フォスフヱ一ト ·デヒドロゲナ一ゼ、 グノレコ一 スォキシダーゼ、 グルコアミラ一ゼ、 アセチルコリンエステラーゼ、 力タラ一ゼ 、 ゥシ小腸アル力リホスファタ一ゼ、 昜菌アル力リホスファタ一ゼなどのァノレ カリフォスファタ一ゼなどが挙げられる。
アル力リホスファタ一ゼを用いた: f§^、 4-メチルゥンベリフヱリルフォスフェ 一トなどのゥンべリフエ口ン誘割本、 二トロフエニルホスフエ一トなどのリン酸 化フェノ一ル誘 本、 NADPを利用した酵素的サイクリング系、 ルシフェリン誘導 体、 ジォキセタン誘 本などの基質を使用したりして、 生ずる愛光、 発光などに より測定できる。 ノレシフヱリン、 ルシフェラ一ゼ系を利用したりすることもでき る。 力タラ一ゼを用いた ϋ^、 過酸化水素と反応して酸素を生成するので、 その 酸素を電極などで徹ロすることもできる。 電極としてはガラス電極、 難溶性翻莫 を用いるイオン電極、 MM電極、 高分子膜電極などであることもできる。 酵素標識は、 ビォチン標識体と酵素標識ァビジン （ストレブトァビジン） に置 き換えることも可能である。 標識は、 複数の異なった蘭の標識を使用すること もできる。 こうした:^、 ネ纖の測定を纖的に、 あるいは非連続的に、 そして 同時にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。
本発明においては、 信号の形成に 4-ヒドロキシフヱニル酢酸、 1， 2-フエ二レン ジァミン、 テトラメチルベンジジンなどと西洋ヮサビ ·ペルォキシダ一ゼ、 ゥン ベリフェリルガラクトシド、 ニトロフ ニルガラクトシドなどと 3 - D-ガラクト シダ一ゼ、 グルコース- 6- リン酸 'デヒドロゲナ一ゼなどの酵素試薬の組合わせ も利用でき、 ヒドロキノン、 ヒドロキシベンゾキノン、 ヒドロキシアントラキノ ンなどのキノール化合物、 リポ酸、 グルタチオンなどのチオール化合物、 フエノ ール誘 本、 フエロセン誘壞本などを酵素などの働きで形成しうるもの力く使用で きる。
愛光物質ある 、は化学ルミネッセンスィ匕合物としては、 フノレオレセィンィソチ オシァネート、 例えばローダミン Bイソチオシァネート、 テトラメチルローダミ ンイソチォシァネートなどのローダミン誘 本、 ダンシルクロリ ド、 ダンシルフ ルオリ ド、 フルォレスカミン、 フィコピリプロテイン、 アタリジニゥム塩、 ルミ フヱリン、 ノレシフヱラ一ゼ、 ェクオリンなどのルミノ一ル、 ィミダゾ一ル、 シュ ゥ酸エステル、 希 ± キレート化合物、 クマリン誘 本などが挙げられる。 標識するには、 チオール基とマレイミ ド基の反応、 ピリジルジスルフィ ド基と チオール基の反応、 ァミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うこと力で き、 公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、 さらにはそれ らを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。 また上記免 性複合体作 製に使用されることのできる縮合剤、 担体との結合に使用されることのできる縮 合剤などを用いること力くできる。 '
縮合剤としては、 例えばホルムアルデヒド、 グルタルアルデヒド、 へキサメチ レンジイソシァネート、 へキサメチレンジイソチオシァネート、 Ν，Ν' - ポリメチ レンビスョ一ドアセトアミ ド、 Ν, Ν' - エチレンビスマレイミ ド、 エチレングリコ —ルビススクシ二ミジルスクシネ一ト、 ビスジァゾベンジジン、 卜ェチル -3 -（3- ジメチルァミノプロピル） カルボジィミ ド、 スクシンィミジル 3 - (2- ピリジル ジチォ） プロピオネート（SPDP)、 N-スクシンィミジル 4 - (N- マレイミ ドメチル ) シクロへキサン- 1- カルボキシレート（SMCC)、 N-スルホスクシンィミジル 4- (N - マレイミ ドメチル) シクロへキサン- 1- カルボキシレート、 N -スクシンイミ ジル （4 - ョ一ドアセチル） ァミノベンゾェ一ト、 N-スクシンィミジル 4 - α- マレイミ ドフヱニル） ブチレート、 Ν- ( ε—マレイミ ドカプロィルォキシ） コハ ク酸イミ ド (EMCS), イミノチオラン、 S-ァセチルメル力プトコハク酸無水物、 メ チル- 3- (4' - ジチォピリジル） プロピオンィミデート、 メチル- 4 - メルカプトブ チリルイミデート、 メチル -3 - メルカプトプロピオンィミデート、 Ν-スクシンィ ミジル- S- ァセチルメルカプトァセテ一トなどが挙げられる。 本発明の測定法によれば、 測定すべき物質を酵素などで標識した抗体、 特には 標識モノクローナル抗体などの標識抗体 と、 担体に結合された抗体とを順次 反応させること力くできるし、 同時に反応させることもできる。 を加える川酵 は選ばれた担体系の型により異なる。 感作されたブラスチックなどのビーズを用 いた には、 酵素などで標識した抗体、 特には標識モノクローナル抗体などの 標識抗体 «を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験管中に一緒 に入れ、 その後該感作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより測定 を行うことができる。
本発明の趕法においては、 免疫学的測定法が用いられるが、 その際の固相担 体としては、 抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン製、 ポリ力一ボネ ィト製、 ポリプロピレン製あるいはポリビニル製のボール、 マイク口プレート、 スティック、 微粒子あるレ、は試験管などの種々の材料および形態を任意に選択し 、 ィ すること力できる。
測定にあたつては至適 pH、 例えば pH約 4〜 9に保つように適当な緩衝液系中で 行うことができる。 特に適切な緩衝剤としては、 例えばアセテート緩衝剤、 クェ ン酸塩緩衝剤、 フォスフヱ一ト緩衝剤、 トリス緩衝斉【J、 トリエタノールアミン緩 衝剤、 ボレート緩衝剤、 グリシン緩衝剤、 炭酸塩緩衝剤、 トリスー塩酸緩衝剤な どが挙げられる。 緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いること力できる。 抗 原抗体反応は約 0 °C〜60°Cの間の で行うこと力 子ましい。
酵素などで標識されたモノク口一ナル抗体などの抗体 及び担体に結合せし められた抗体薦、 さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、 ¥fi に達するまで亍うこと力くできる力く、 抗原抗体反応の が達成されるよりもずつ と早い時点で固相と液相とを分離して限定されたィンキュベ一シヨン処理の後に を止めること力くでき、 液相又は固相のいずれかにおける酵素などの標識の存 在の禾 ISを測ること力できる。 測定操作は、 自動化された測錢置を用いて行う こと力く可能であり、 ルミネセンス 'ディテクタ一、 ホト ·ディテクタ一などを使 用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定するこ ともできる。
抗原抗体反応においては、 それぞれ用いられる觀、 測定すべき物質、 さらに は酵素などの標識を安定化したり、 抗原抗体反応自体を安定化するように適切な 手段を講ずること力くできる。 さらに、 異的な反応を除去し、 阻害的に働く影 響を減らしたり、 あるいは測定 ®Sを活性化したりするため、 タンパク質、 安定 化剤、 界面活性化剤などをィンキュベ一ション溜夜中に加えることもできる。 当該分野で普通に採用されて こりあるいは当業者に知られた非特異的結合反 応を防ぐためのプロッキング処理を施してもよく、 例えば、 哺乳動物などの正常 血清タンノ、°ク質、 アルブミン、 スキムミルク、 乳発酵物質、 コラーゲン、 ゼラチ ンなどで処理すること力《できる。 # 異的結合反応を防ぐ目的である限り、 それ らの方法は特に限定されず用いること力く出来る。 特に、 本発明の ί¾ΜΤ卜 MMP抗体を使用しての酵素免疫測定法においては、 例え ば、 当該分野で広く知られた酵素免疫測定技術を制限すること無く適用できるが 、 該酵素免疫測定法としては、例えば、 石川栄治監訳、 P. TIJSSEN著、生化学実 験法 ·ェンザィムィムノアツセィ、 1989年、 株式会ネ 京化学同人などに記載の 方法などが挙げられる。例えば、 第一抗体固相法、二抗体法、 エミット法（Enzy me mul tipl ied immunoassay technique; EMIT)、 ェンザィムチャンネリングイム ノアッセィ法、 酵素活性修飾物質ィムノアッセィ法、 リボソーム膜一酵素ィムノ アツセィ法、 サンドイッチ法、 ィムノエンザィムメトリックアツセィ法、 酵素活 性増強ィムノアッセィ法などが挙げられ、 それらは競合法であっても、非競合法 でめってもよい。
本発明の測定方法で測定される試料としては、 あらゆる形態の鎌ゃコロイド 赚、 充体試料などが麵しうるが、好ましくは生物由来の試料、 例えば胸腺 、 睾丸、 腸、 腎臓、 脳、 乳房、 卵巣、 子宮、 肺、 肝、 胃、脖、 皮膚、食道などの 臓器、 器官、 それらの s«、 例えば乳癌、 卵巣癌、 肺癌、子宮癌、 m - mm 、 各種肉腫、 血液、 血清、 血漿、 関節液、 脳脊髄液、 唾液、 羊水、 尿、 その他の 体液、 細胞培養液、 紙織培養液、糸且織ホモジュネート、 生検試料、 Ά 細胞な どが挙げられる。 本発明に従って、 MT-MMP (例えば、 MT1-MMP ) の免疫学的 を行うことによ り、 MT- MMP (例えば、 MT1-MMP ) を膜から避鼠び/又は可溶化された分子種 ( 可溶薩 -画 P) として測定できることを見いだした。 そして、試料を、例えば界 面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたもので適切に処理すると、何らかの 機構により、 膜から离観したもの （遊離したもの）及び/又は可溶化したものが 得られ、 MT1 -MMP といつた MT- MMPの などの測定が効果的に行うことができる 。 力、くして、 界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて、 MT1- MP、 その他の MT-層を細胞膜から遊誕び/又は可溶化させる技術が樹共され る。 さらに、 界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて、 MT-M MPs、 例えば、 MT1- MT2-, MT3-, MT4-, MT5 -， MT6-MMPなどを、 膜から遊离! ¾ び/又は可溶化せしめる技術が樹共できる。該遊离 1¾び/又は可溶化技術を利用 すれば、 MT-固 Pに対する抗体、 特にはモノクロ一ナノレ抗体（例えば、 tCMTl-MMP 抗体， MT2-MMP抗体， MT3-MMP抗体， MT4-MMP抗体， MT5-MMP抗体， MT6-MMP抗 体など） などを用いて、 MT-MMP. 特には遊離び/又は可溶化された MT-固 Pを免 疫学的 に付すことができる。
該界面活性剤としては、膜から MT-匪 Pを遊嫩び Z又は可溶化せしめる働きを 有するものであれば如何なるものも使用できる力、 好ましくは MT- MMPの免疫学的 な に悪影響を及ぼさないもの力挙げられる。該界面活性剤としては、 例えば 陰イオン界面活性剤などが挙げられ、 代表的なものとしては、 高級アルキル硫酸 のアルカリ金属塩などである。好ましい界面活性剤としては、 例えばドデシル硫 酸ナトリウム (SDS) などが挙げられる。該還元剤としては、 膜から MT-國 Pを遊離 及び/又は可溶化せしめる働きを有するものあるいは MT-M P;^中にある酸化還 元反応に感受性の基（例えば、 -S-S-結合など） に作用するもの;^挙げられるが 、 好ましくは ΜΤ-ΜΜΡの免疫学的な に悪影響を及ぼさないもの力挙げられる。 該還元剤としては、 例えば 2-メルカプトェタノ—ル、 ジチォスレイト一ルなどの チォアルコール類、 グルタチォンなどの硫黄含有有樹ヒ合物などが挙げられる。 好ましくは、 界面活性剤及び還元剤の両方を使用して、膜から ΜΤ-固 Ρを遊离! ¾ ぴ: /又は可溶化せしめること力くできるし、 ΜΤ - ΜΜΡに対する抗体などを用いて、 ΜΤ -ΜΜΡ,特には遊离极び/又は可溶化された ΜΤ-匪 Ρを免疫学的に測定（ を含む ) すること力くできる。 カヽくして、 遊离 |¾び/又は可溶化 MT- ΜΡと膜に結合してい る MT- ΜΜΡとを区別すること力可能となったり、 膜に結合して検知あるいは測定が 困難である齢にも ΜΤ-ΜΜΡを嫩ロあるいは測定すること力何能となる。特に、 界 面活性剤として SDS、 還元剤として 2-メルカプトエタノールを用いて、 MT1-MMP を避鼠び Ζ又は可溶化せしめること力できる。 また、 MT1-MMPに対する抗体、 特にはモノク口一ナル御 ΊΊ-ΜΜΡ抗体を細して該遊离 |¾ぴン又は可溶化された MT1-MMPを免疫学的に できる。
これら個々の免疫学的測定法を含めた各種の分析 . 法を本発明の測定方法 に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の Ιδ¾は必要とされない。 それぞ れの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、 本 発明の当慰像物質あるレ、はそれと実質的に同等な活性を有する物質に関連した 測定系を構築すればよい。
これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照すること 力くできる 〔例えば、 入江 寛編， 「ラジオィムノアツセィ」 ， 講談社， 昭和 49年 発行；人江 寛編， 「続ラジオイムノアツセィ」， 講談社， 昭和 54年発行；石川 栄治ら鼴 「酵素免疫測定法」 ， 医学書院， 昭和 53年発行；石川栄治ら編， 「酵 素免疫測定法」 （第 2版） ， 医特院， 昭和 57年発行；石川栄治ら編， 「酵素免 疫測定法」 （第 3版）， 医^ »院， 昭和 62年発行；石川栄治著、 「超高感度酵素 免疫測定法」 ， 学会出版センタ一， 1993年 12月発行； H. V. Vunakis et al. (ed . ), "Methods in Enzymology", Vol. 70 (Immunochemical Techniques, Part A) ， Academic Press, New York (1980)； J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in Enzymology", Vol. 73 (Immunochemical Techniques, Part B), Academic Pr ess, New York (1981)； J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in Enzymology ", Vol. 74 (Immunochemical Techniques, Part C)， Academic Press, New York
(1981) ; J. J. Langone et al. (ed. )， "Methods in Enzymology", Vol. 84 (I 誦廳 chemical Techniques, Part D: Selected Immunoassays), Academic Press ， New York (1982)； J. J. Langone et al. (ed. )， "Methods in Enzymology", Vol. 92 (Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and Ge neral Immunoassay Methods), Academic Press, New York (1983)； J. J. Lango ne et al. (ed. ), "Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical Techn iques, Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic
Press, New York (1986)； J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in Enzymol ogy", Vol. 178 (Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry), Academic P ress, New York (1989)； M. Wilchek et al. (ed. ), "Methods in Enzymology",
Vol. 184 (Avidin - Biotin Technology), Academic Press, New York (1990)； J • J. Langone et al. (ed. )， "Methods in Enzymology", Vol. 203 (Molecular Design and Model ing: Concepts and Appl ications, Part B: Anibodies and An tigens, Nucleic Acids, Polysaccharides, and Drugs), Academic Press, New York (1991) などあるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれ を参照することにより本明細書の開示に含められる） 〕 。 本発明では、 ΜΉ- MPなどの MT-匪 Pの免疫学的 法を利用して、 ΜΉ-ΜΜΡの 発現などの MT-固 Pの発現を促進または阻害する化合物をスクリ一二ングすること を特徵とするスクリーニング方法が樹共される。該スクリーニング方法では、 例 えば、 MT-MMP (例えば、 MT1-MMP ) を発現する培養細胞、 形質転換された MT-編 P (例えば、 MT1-MMP )発現細胞、 あるいはトランスジエニックマウスなどのトラ ンスジエニック動物を、 任意の生理活性因子、 薬剤、 ィ匕合物などの存在下に » し、 無処理の; 1¾と対照、させ、 該 MT- MMP (例えば、 MT1-MMP) の免疫学的 法 により試料中の MT- MMP (例えば、 MT1-MMP ) の量につき測定を行うことにより、 MT-MMP (例えば、 MT1-MMP )産 などの増減を比較して各添加物の効果を諮面 する。該スクリ一二ング方法に付される添加物としては、 MT-MMP (例えば、 MTl- MMP ) の発現を促進または阻害する機能をもつ樹甫のものであれば何らの制限も なくいかなるものであってもよく、 それらは公知のものでも新規のものでもよい 。該添加物としては、 遺伝子の発現制御に関わるもの、 MT-MMP (例えば、 MT1-MM P ) のアンチセンス RNA などのアンチセンス核酸、 MT-MMP (例えば、 MT1-MMP ) の mRNAを配列依存的に切断するリボザィムなどが考えられる。添加物は、 ±咅養液 中に直接あるいはノヽプテン化して添加しても良 、し、 それぞれを発現する遺伝子 を細胞内に導入しても良い。 MT-MMP (例えば、 MT1-MMP ) の発現を強力に、 力、つ 特異的に抑制するァンチセンス RNAなどの核酸やリボザィムの設計および選択に MT-MMP (例えば、 MT1-MMP )免疫学的趕法は有用である。 MT-MMP (例えば、 MT 1 -匪 P)発現抑制剤は、 癌転移抑制に対する医薬として有用である。
また、 本発明の MT-爾 （例えば、 MT1-MMP ) の免疫学的趕法は、癌検査また は癌転移検査、 さらにはリウマチ性関節炎またはアルッハイマ一の進行度検査に 有用であり、 癌 «または癌車云移検査用薬、 さらにはリウマチ性関節炎またはァ ルツハイマーの進行度 も 共される。特に、 MT-MMP (例えば、 MT1-MMP ) 免疫学的鍾難は、 癌難または癌転移検査用薬、 さらにはリウマチ性関節炎 またはアルツハイマーの進行度検査薬として有用である。
本発明では、 固相化された撫 T1-画 P抗体などの固相化 $¾T-讓 P抗体、 特には 固相化されたモノク口一ナル ί¾1Τ1 - ΜΜΡ抗体などの固相ィ匕されたモノクローナノレ 挪 T-國 P抗体が '樹共される。該固相化された湖 T卜國 P抗体（例えば、 固相化さ れたモノクローナル ΦΐΜΤΙ -画 P抗体） などの固相化 ί¾ίΤ-圖 Ρ抗体を使用して、 試 料中の MT1 - ΜΜΡの酵素活性をスクリーニングすること力く可能である。該スクリ一 ニング法では、 例えば反応容器などに固相ィ匕された ΚΜΤ卜匿抗体（例えば、 固 相ィ匕されたモノクロ一ナル御 T1 - ΜΜΡ抗体） などの ί¾ΜΤ - ΜΜΡ抗体に、 MT1-匪 Ρを 含む試料などの ΜΤ-匪 Ρを含む試料を接触せしめ、 搬抗体反応を介して、該固相 化された^ CMT1- ΜΜΡ抗体に MT1- ΜΜΡを撤足させるなど固相化 画 Ρ抗体に ΜΤ - Μ MPを撤足させ、 次に ΜΊΊ-固 Pの酵素活性など MT-MMPの酵素活性を測定することな どにより行われる。酵素活性の測定には、 例えば l-固 Pの基質など MT-匪 Pの基 質を删し、 酵素反応の結¾ずるシグナルを検知あるいは測定することなどに より行うこと力できる。特に、 可溶型 MT -画 Pを でき、 その量と藤の悪'隨 及び癌の転移能との相関関係を求めることを可能にする。別の面では、本発明で は、 固相化された MT1-删 Pなどの固相化された MT-園 P力樹共される。特には、 免 疫学的方法で固相化された M -應 P力 共される。該固相化された MT1 -國 Pなど の MT-删 Pは、 例えば Ml-匪 P活性阻害剤、 その他の MT-删 P活性阻害剤などの試料 の存在下あるいは非存在下に MT1- MMPの基質などの MT- MMPの基質と接触せしめ、 酵素反応の結果生ずるシグナルを検知あるいは測定することなどによりスクリー 二ングに ί¾1できる。代表的な固相ィ hMT-匿としては、 例えば反応容器などに固 相ィ匕されたもの力く挙げられる。
MT1-MMPに代えて、 MT2-MMP, MT3- MP, MT4-MMP, MT5-MMP, MT6-MMPなどの MT -MMPについても、 同様に、行うこと力できることは明ら力、である。
力、くして、 本発明では、 MT匪 Pの活性測定および ¥Γ -删 P活性阻害剤の検索が可 能である。特に、 本発明では、 ΜΊΊ-應 Ρの活性測定および Ί-爾活性阻割 Uの 検索力可能である。上記の方法において、 試料の Μ - MMPなどの MT - MMPを特異的 に固相ィヒし、 その活性を検出すること力くでき、 さらにそのためのスクリーニング ¾が樹共される。 また、 得られた ΜΤΊ- MMP活性などの ΜΤ -匪 Ρ活性から癌の浸潤 能あるいは転移能を言 面できる。 したがって、 検体癌糸纖の浸潤能を想定するこ と力でき、 またそのための が樹共される。 また、 治療を施した癌組織の浸潤 能の変動を想定したり、 ΜΉ- Μ Ρの産生を抑制し浸潤能を低下あるいは消失させ る医薬の選択や薬剤の検索などに有用である。 また、一方では、上記の方法にお いて、 一定の活性レベルを有する標準 MT1-酵を用い、 これに対して各種の酵素 活性阻豁 lj、 MMPs阻害剤あるいは任意の化合物を添加せしめ、 MT1-MMPに対する 阻害活性を測定すること力《できる。 この方法を用いれば、 未知の MH -蕭阻割 IJ の検索や Batimastat、 Marimastat, Ro32-3555、 AG3340. Bayl2-9566, CGS27023 Aなど！ ¾存の丽 P活性阻害剤 （ヒドロキサム酸、 カルボン酸、 ホスホン酸、 チォ —ルの誘 本などを包含していてよく、 例えば、 国際公開第 W0 97/27174号（W0
97/27174), W0 97/20824,英国特許公開明細書第 2268934号（GB 2268934 A又は 米国特許明細書第 5310763号 (US 5310763))， US 5268384, US 5455258, WO 96/ 11209, WO 97/18207, WO 97/32846, WO 98/17643, 特開平 7- 101925号公報， US 5 614625, W0 98/30551, W0 98/43963, W0 96/15096, W0 96/33174, W0 96/33968,
W0 99/31052, 国際出願 PCT/JP00/03166号などに開示されている） 力く持つ ΜΉ - MMP阻害剤能を知ること力くできる。 ΜΊΊ -變に代えて、 MT2 - MMP， MT3-MMP, MT4- 固 P， MT5-MMP, MT6-MMPなどの MT - MMPについても、 同様に、 行うこと力くできるこ とは明ら力、である。 酵素活性あるいは酵素阻害活性の測定は、 通常の測定法に準じて実施すること 力くできる。 また、 各種標識、 緩衝液系そのィ 当な 等をィ したりすること もできる。方法を行うにあたっては、 MT- MPsをァミノフエニル酢酸水銀などの 活性化剤で処理したり、 その前駆体ある 、は潜在型のものを活 ttSのものに予め 変換しておくこともできる。個々の測定にあたつては、 それぞれの方法における 通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、適切な測定系を構築 すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参 照すること力くできる 〔例えば、 Methods in Enzymology, Vol. 1 k 2 (Preparati on and Assay of Enzymes), Academic Press, New York (1955)； Methods in En zymology, Vol. 5 (Preparation and Assay of Enzymes), Academic Press, New York (1962)； Methods in Enzymology, Vol. 6 (Preparation and Assay of En zymes), Academic Press, New York (1963)； Methods in Enzymology, Vol. 3 ( Preparation and Assay of Substrates), Academic Press, New York (1957)； M ethods in Enzymology, Vol. 4 (Special Techniques for the Enzymologist), Academic Press, New York (1957)； Methods in Enzymology, Vol. 19 (Proteol ytic Enzymes), Academic Press, New York (1970)； Methods in Enzymology, V ol. 45 (Proteolytic Enzymes, Part B) Academic Press, New York (1976)； Me thods in Enzymology, Vol. 80 (Proteolytic Enzymes, Part C) Academic Pres s， New York (1982)； Methods in Enzymology, Vol. 248 (Proteolytic Enzymes ： Aspartic and Metal lo Peptidases) Academic Press, New York (1995)などあ るいはそこで弓 I用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することによ り本明細書の開示に含められる）〕 。
本発明の測定法及びスクリーニング法で有用な あるいは セッ卜、 さ らにはキット （スクリーニングキットなど） も有用である。該キットは、組成物 用の有効な成分を 1又はそれ以上を充塡した 1又はそれ以上の容器を含む、 例え ば免疫測定などの測定分野あるいは医薬分野で許容されるパック及びキットであ る。代表的には、 このような （単一あるいは の）容器と一緒に、 臨床ネ«あ るいは医薬又は生物学的産物の製造、 使用又は販売を規制する政府機関により指 示された形態の注意書（文書） であって、 ヒトなどに関連した製品の製造、 m 又は販売に関する該政府機関の承認を示している注意書（添付文書） 力添付され ていてよいものである。
本発明のスクリーニング法で得られた活 'ί誠分 〔例えば、 (a) MT1- MPなどの MT -匪 Pの発現を促進または阻害する化合物あるいはその塩など、 （b) MT1-MMPな どの MT-醒 Pの酵素活性を促進または阻害する化合物あるレ、はその塩など〕 を医薬 として用いる: tf^、 それらは、 通常網虫或いは薬理的に許容される各 剤補助 剤と混合して、 医薬組成物又は医薬調製物などとして投与すること力できる。好 ましくは、 経口投与、 局所投与、 または非経口投与等の に適した製剤調製物 の形態で投与さ; T 目的に応じていずれの投与形態（¾Λ法、 あるいは劇昜投与 も包含される） によってもよい。
また、
Figure imgf000039_0001
m (抗癌剤）、 mmmumi消 u及 び/又は免疫抑制剤と配合してィ趨することもできる。掘纏剤 （抗癌剤） 、 腫 瘍転移阻豁 ϋ、 消 や免疫抑制剤としては、 有利な働きを持つものであれば制 限なく翻でき、 例えば当該分野で知られたものの中から選択すること力できる 。 医薬用の組成物は通常の方法に従って製剤化する.こと力くできる。例えば、 遊 必要に応じて、 生理学的に認められる担体、 医薬として許容される担体、 アジュ バント剤、 m 補形剤、 希釈剤、 香 などを期虫もしくは組合わせて用い 、 それとともに本発明の活' «分等を混和することによって、 一般に認められた 製剤難に要求される単位用灘態にして製造することができる。
本発明の活' f械分は、 その投与量を広範囲にわたつて選択して投与できる力 その投与 び投与回数などは、 処置患者の性別、 年齢、体重、 一般的健康状態 、 食事、 投与時間、投与方法、 お,度、 薬物の組み合わせ、 患者のその時に治 療を行なつている病状の程度に応じ、 それらあるいはその他の要因を考慮して決 められる。
医薬品製造にあたっては、 その添加剤等や調製法などは、 例えば曰本薬局方解 説書編集委員会編、 第十四 日本薬局方解説書、平成 13年 6月 27日発行、 株 式会ネ ±0川書店；一番ヶ瀬 尚 他編 医薬品の開発 12巻（製剤素剤 〔I〕 ）、 平成 2年 10月 15日発行、 株式会擴川書店；同、 医薬品の開発 12巻 （製剤素材 〔 I I〕 )平成 2年 10月 28日発行、 株式会ネ ±0川書店などの記載を参考にしてそれら のうちから必要に応じて ¾¾選択して適用することができる。
明細書及び図面において、 用語は、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical No menclatureによるか、 あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味 に基づくものである。代表的な用語の意味を以下に示す。
bp: base pair(sゾ；
IPTG: isopropyl-1-thio— β -D-galactopyranos i de；
SDS: sodium dodecyl sulfate;
LB: Luria-Bertani
TMB: 3, 3' , 5， 5' -tetramethylbenzidine
BSA: bovine serum albumin
BLISA: enzyme- l inked immunosorbent assay
HRP: horseradish peroxidase
PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis BDTA: ethylenediaminetetraacetic acid 後述の鎌例 2 (表 1 ) に記載のモノクロ一ナル棚 Ώ - MMP抗体を産生するノ、 イブリドーマ： 222- 1D8 は、 平成 12年 10月 26日 （原寄託日） 力、ら茨城県つくば巿 東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566)の独立行政法人産業技術総合 研究所特許生物寄託センタ— （National Inst i tute of Advanced Industrial Sc ience and Technology, International Patent Organism Deposi tary: I POD：旧 住所は茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305- 8566)で、 旧名称は通商 産業省ェ 術院生命工学工 «術研究所（NIBH))に寄託されており （受託番号
FERM P- 18085)、 平成 13年 11月 12日に原寄託よりブダぺスト条約に基づく寄託へ の移管請求がなされ、 受託番号 FERM BP- 7795 として IP0Dに保管されている。 同 様に、 (表 1 ) に記載のモノクローナル嫌 T1匪 P抗体を産生す るハイプリドーマ： 222 - 2D12は、平成 12年 10月 26日 （原寄託日） 力、ら IP0Dに寄託 されており （受託番号 FERM P- 18086)、平成 13年 11月 12日に原寄託よりブダぺス ト条約に基づく寄託への移管請求がなされ、 受託番号 FERM BP - 7796 として IP0D に保管されている。 麵列
以下に実施例を掲げ、 本発明を具体的に説明するが、 この実施例は単に本発明 の説明のため、 その具体的な態様の参考のために iSI共されているものである。 こ れらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるカ、 本願 で開示する発明の範囲を限定したり、 あるいは制限することを表すものではない o本発明では、 本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解 されるべきである。
全ての fe例は、 他に詳細に記載するもの以外は、 ¾的な技術を用いて実施 したもの、 又は おすることのできるものであり、 'これは当業者にとり周知で慣 用的なものである。 なお、 ベクタ一、 制限酵素などは、宝酒造（株） などから入 手したものを删した。 難例 1 組換え皿-議 Pの調製
各種袓換え MT1 -丽 Pを調製し、 免疫、 モノクロ一ナル抗体のスクリーニング、 ウェスタンブロッティング、 ELISAなどに用いた。
① 大腸菌由来組換え ΔΜΤΊ-固 P (免疫抗原）
a) 発現ベクターの構築
J. Cao et al.， J. Biol. Chem. , 270: 801-805 (1995)記載の方法により作製 した動物細胞用発現ベクター pSG厶 ΜΉ- MP より ΔΜΤ1-固 P遺伝子を制限酵素 Sm alおよび Bgl H で切り出し、 制限酵素 Smalおよび BamHI で切断した pUC18の β- ガラクトシダ一ゼにインフレームで 锆し、 発現べクタ一 pUCAM -置を構築 した。 この発現べクタ一により、 ガラクトシダ一ゼの 11アミノ酸残基とシグ ナルぺプチドおよびプロべプチド領域の一部 (47 了ミノ酸残基） を欠損した厶 MT 1- MP (G4 8- G5 3 5)の 488 アミノ酸残基、 計 499 アミノ酸残基からなる好 Λ約 55 kDaの融合タンパク質を発現せしめた。 なお、 MT1-匪 P をコードしている DM は 、 例えば J. Cao et al. , J. Biol. Chem. , 270: 801-805 (1995) ; K. Imai et al. , Cancer Research, 56: 2707-2710 (1996)などに記載があり、 それらの中に ある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる。 b) 融合タンパク質の発現
pUCAMTl-MMP を含む大腸菌 DH5 を ½Lの 50〃g/mL Ampici ll inを含む LB培 地に接種、 37°Cで 16時間培養し、 1次力ルチャ一を調製した。 これを 400mLの 50 Mg/mL Ampici ll inを含む ±咅地に再接種、 37°Cでおよそ 3時間、 文徵増殖期中 期まで培養した。 IPTG (最終濃度 O. lmM) を添加し、 さらに 4時間培養を»繞し 、 組換え融合タンパク質の発現を誘導した。 c) 糸且換え体の精製- 1 (inclusion bodyの回収と可溶化）
培養液を直ちに氷冷し、 遠心 (5，000rpm、 20min)で菌体を回収、 20mLの lmg/m L lysozyme含有 20mM Tris- HCl(pH8. 0)に懸濁し 15分間、 氷中に置いて細胞壁を破 壊した。 菌体懸濁液を氷冷下で超音波破砕 (30秒、 10回） 、 遠心 (18， OOOrpnk 10 min)して inclusion bodyを回収した。 Inclusion bodyを lmLの 0. 1M隨含有 10 mM リン酸緩衝液 (pH 7. 0)で再懸濁し、洗浄、遠心 (15， OOOrpnu lOmin)して沈殿 を回収、 これを lmLの 8M urea、 0. 1M NaCl含有 10慮 リン酸緩衝液 (pH 7. 0)に 溶解した。 d) 組換え体の精製- 2 (preparative SDS- PAGEおよび電気溶出）
前項で調製した溶解画分に 1/5体積の 6 XSDS - PAGE Sample buffer (還元） を 加え、 37。Cで 1時間置いた後、 reparative SDS- PAGEに供した。 90 X70 X 1腦の ゲルに対し 0. 6mLのサンプルを展開した。泳動終了後、 ゲルを 3M KC1に浸し、 タ ンパク質バンドを可視化し、 組換え厶 MT1-匿のバンドを切り出した。切り出し たゲルを細断、 SDS- PAGE泳動バッファ一で洗浄した後、 電気溶出用カラムに入れ 、 200V (定電圧）で 4時間通電して組換えタンパク質を回収した。 これに最終濃 度 lOmMとなるようにデォキシコール酸 (D0C) を加え、 16時間低; ^に置き、 SDS を D0Cで置換、 さらに 0. 1M NaCl含有 50mMリン酸緩衝液 (pH7. 0) に透析して it¾ の SDSおよび D0Cを除去した。透析中に発生した沈殿物を遠心で除き、上清を限 夕慮過で濃縮した。 400mLの大腸菌培養から得られた可溶性袓換え ΔΜΤ1-匪 P (L ot GV01)は 2. 6mg (2mg/mL Χ 1· 3mL)であった。
② COS- 7由來袓換え MT-丽 Ps
pSG5に揷入された MTl- MMPの cDNAをリン酸カルシウム法で COS- 7 に導人し、 48時 間の発現の後、 細胞を回収した。細胞を PBSで洗浄した後、 0. 5 mLの PBS に再懸 濁し、超音波破砕した。得られた細胞破膽に 1/5髓の β X SDS- PAGE Sample buffer (還元剤含有） を加え、 SDS- PAGEおよびウェスタンプロッティングの抗原 検体とした。 同様にして、 pSG5に挿入された MT2-匪 P (マウス） の cDNAおよび pSG5 に挿入された MT3-固 Pの cDNAを用い、 それぞれ同様に処理し、 抗原検体を得た。 これらは、 モノクローナル抗体の^ X反応生の検討に用いた。
③ 大腸菌由来リフォ一ルド組換え AMTl-MMP(AMTl-MMPRF)
fe例 1で構築した pUCAMTl-匪 Pより ΔΜ -ΜΜΡ遺伝子を制限酵素 Kpnlおよ び Hindl l l で切り出し、 pTrcHis にインフレ一ムで 結した発現べクタ一 pTrcH isAMH-MMP を構築した。 この発現べクタ一で^!昜菌を形質転換し、 組換えタン パク質を発現させた。
上記の組換え大腸菌 (400mL培養） より調製した不溶性封入体を 8 M ureaヽ 0. 5 M NaCU 10 mM imidazole含有 50mMリン酸緩衝液 (pH7. 5) で可溶化し、 Ni++ Che lating Sepharose (Pharmacia)ゲルカラムに供した。 洗浄後、 8 M urea, 0. 5 M NaCl、 0. 5 M imidazole含有 50 mM リン酸緩衝液 (pH7. 5) で溶出、 得られた精製 画分を 8 M urea, 0. 3 M NaCl含有 20 mM Tris-HCl (pH8. 6) で 化した PD- 10(Ph anmci a)ゲルカラムに供し緩衝液を交換した。 これに 50 /M ZnS04 および 1 mM D TTを添加した後、 A280を測定し、 8 M ureaヽ 0. 3 M NaCK 50 zM ZnS04 、 1 mM
DTT含有 20 mM Tris- HCl (pH8. 6)を用いて A280が 0. 1となる様に希釈した。 こ れに 20 mM cysteaminを添加し、 リフォールディング用サンプル (50 mL) とした 。 これを 5 Lの 0. 15 M NaC 5 mM CaCl 2、 100 juM ZnSO* 、 5 mM 2-mercaptoe thanoU 1 mM hydroxyethyl disulf ide、 0. 02 % NaN3 含有 50 mM Tris- HCl (pH8 . 6) で 16時間透析、 さらに 0. 15 M NaCl 、 5 mM CaCl 2、 50 // ZnS04 、 0. 02 % N aN3 含有 50 mM Tri s-HCl (pH8. 6) で透析し （4時間、 3回） 、 リフォーノレディン グした。
透析後のサンプルを遠心し、 不溶化したタンパク質を除去、 A280を測定しタン パク質量を見積った。 得られた ΔΜΤ1- MMPRFの量はおよそ 1. 6 mgであった。 さら に一部をとつて、 0. 1 /g/mLのトリプシンと 37°Cで 1時間処理した。 SDS-PAGEで 分析したところ、 ΔΜΤ1-固 P(58kDa：)、 へモぺキシンドメイン （30、 34kDa)、 fe^某 ドメィン (21kDa) のバンドが検出された。 これを? 1«しェピト一プマツビングお よび ELISA 面用抗原として使用した。 実施例 2 抗体の作製と選択
① 免疫スケジュール
免疫動物： 6週齢 BALB/c雌、 2匹
精製 i¾f ： 2 mg/ml ΔΜΤΊ- MMP (動包例 1①- d) で得られたもの） 0. 1M NaCl 含 有 50 mM リン酸緩衝液 (pH7. 0)
初回免疫： 58 g/ 290 1/マウス 院全フロイントアジュバント）腿空内投与 4.3 追加免疫： 20日後 64 jig/ 160 zl/マウス 劂空内投与
追加免疫： 35日後 54 a g/ 160〃1/マウス 騸空内投与
最終免疫： 69日後 73.3 / 160〃1/マウス 静脈内投与
最終免疫の 3日後（72日後） に細胞融合
すなわち、 上記精製 ΔΜΤ1-删 P抗原 （58〃g/ 290 1)を完全フロイントアジュ ノくントと共に 6週齢 BALB/c雌マウスに翻空内投与し、 初回免疫した。 20日 ί肚 m mi cu g/m d)を初回免疫したマウスに ^ ^内投与し、 追加免疫し た。 さらに 35日 記精製 (54 zg/ 160 zl)を S離内投与し、 追加免疫し、 次に、 69日 ί¾±記精製抗原 (73.3^g/ 160〃1)を静脈内投与し、 最終免疫とした o その 3曰後 (全体で 72日後) に免疫したマウスから脾臓を摘出し、 脾細胞懸濁 液を調製した。
② 細胞融合とハイプリドーマのスクリーニング
細胞融合には、 以下の材料および方法を用いた。
RPMI-1640培地： RPMI-1640 (Flow Lab.) に重炭酸ナトリウム （24mM)、 ピルビ ン酸ナトリウム （lmM)、 ペニシリン G カリウム （50U/ml) 、 硫酸アミカシン （10 0 /zg/ml) を加え、 ドライアイスで pHを 7.2 にし、 0.2 /m東洋メンブレンフィ ルターで除菌ろ過した。 NS - 1培地：上記 RPMト 1640±咅地に除菌ろ過したゥシ胎児 血清 (FCS, M.A. Bioproducts)を 15% (v/v)の濃度になるように加えた。
PEG- 4000溶液： RPMI-1640培地にポリエチレングリコール- 4000 (PEG- 4000， Mer k & Co. )を 50% (w/w)になるように加えた無血清培地を調製した。
8-ァザグァニン耐性ミエローマ細胞 SP - 2 (SP- 2/0- Agl4)との融合は、 Selected Method in cellular immunology p351〜372 (ed. B. B. Mi shell and S. N. Shi igi), W. H. Freeman and Company (1980)に言己載の Oi & Herzenberg らの方法を 若干改変して行った。
前記で調製した有核脾細胞 （生細胞率 100 %) とミエ口一マ細胞（4田胞率 10 0 とを 5:1〜10:1の比率で以下の手順で融合した。 それぞれの精製 ΔΜΉ -讓 P抗源免疫脾細胞懸濁液とミエローマ細胞をそれぞれ RPMI164(m地で洗浄した。 次に同じ培地に懸濁し、 融合させるために有核脾細胞とミエ口一マ細胞を混合し
/ 0 次に、 それぞれの細胞混合液を遠心分離により細胞を沈殿させ、 上清を に 吸引除去した。沈殿した細胞に 37°Cに加温した 50% PEG-4000含有 RPMI- 1640培地 (ミエ口一マ細胞がおおよそ 107 個/ Hi となるよう体積を決定する） を 1分間で 滴下し、 1分間鮮し、 細胞を再懸濁、 分散させた。 次に添加した 50% PEG- 4000 含有 RPMト 1640培地の 2倍体積の 37°Cに加温した RPMト 1640 ±咅地を 2分間で した。 さらに添加した 50% PEG- 4000含有 RPMI - 1640培地の 7倍体積の RPM 1-1640 培地を 2〜3分間で常に ίΙΤ丰しながら滴下し、 細胞を分散させた。 これを遠心分 離し、上清を完全に吸引除去した。次に、 ミエ口—マ細胞がおおよそ 106個 Μ となるように 37°Cに加温した NS- 1培地を沈殿した細胞に速やかに加え、大き 胞塊を注意深くピペッティングで分散した。 さらに同培地を加えて希釈し、 ポリ スチレン製 96穴マイクロウェルにゥエル当りのミエローマ細胞の数を調整して接 種した。 それぞれの細胞を加えた上記マイクロウェルを 7%炭酸ガス /93 %空気 中で i¾¾37°C、 湿度 100 %で培養した。
次に、 選択培地によるハイプリドーマの選択的増殖を行った。
(1) ィ細する培地は以下の通りである。
HAT培地：前記で述べた NS-1培地に更にヒポキサンチン （100 M)、 アミノプテ リン （0. 4 M)およびチミジン （16 M)を加えた。 111¾咅地：アミノブテリンを除 去した以外は上記 HAT ±咅地と同一糸滅のものである。
(2) 前記の培養開始後翌白 （1 日目）、 細胞にパスツールピぺッ卜で HAT ±咅地 2滴（約 0. 1ml)を加えた。 2、 3、 5、 8 日目に培地の半分（約 0. lnd)を新しい HAT ±咅地で置き換え、 10日目に培地の半分を新しい HT1咅地で置き換えた。 11日目 以降にノヽィブリドーマの生育が肉眼にて認められた全ゥエルにつ 、て固相-抗体 結合テスト法（ELISA)により陽性ゥエルを調べた。 まず、 100 ng/ゥエルで免疫 ί¾Ιをコ一トしたポリスチレン製 96穴プレート （0. 05% Tween 20含有 PBSを用 いて洗浄して未吸着の ί¾Ιタンパク質を除いてある） の各ゥエルにハイプリ ド一 マの生育が確認されたゥエルの培養上清を添加し、 室温で約 1時間静置した。洗 浄後、 2次抗体として西洋わさびペルォキシダ一ゼ（HRP)標識ャギ抗マウス免疫 グロブリン （Cappel) を加え、 さらに室温で約 1時間静置した。洗净後、 基質で ある過酸化水素と 3， 3'， 5， 5' -テトラメチルべンジジン (TMB) を加え、 発色の禾 をマイクロプレート用吸光度測定機 (MRP-A4. 東ソ一） を用いて 450nmの吸':) で沏_)定した。 15クローンを選択できた。
③ ハイブリ ドーマのクローニング
上記で得られた免疫抗原に対し陽性のゥエル中のハイプリ ドーマを、 限界希釈 法を用いてモノクローン化した。 すなわち、 NS-1培地中にフィーダ一としてマウ ス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し、 96穴マイクロウェルにハイプリ ド 一マを、 ゥエル当り 5個、 1個、 0. 5個になるように希釈し、 それぞれ 36穴、 36 穴、 24穴に加えた。 3 ~7 日目、 8 〜15日目に全ゥエルに NS- 咅地を追加した。 クロ一ニング開始後約 1-3週間で、 肉眼的に十分なハイプリ ドーマの生育を認 めたら、 コロニー形成陰性ゥエルが 50%以上である群について上記スクリ一ニン グ法 （EL ISA)を行った。 調べた全ゥエルが陽性でない:^、 抗体陽性ゥエル中の コロニー数が 1 個のゥエルを 4〜6個選択し、 再クロ一ニングを行った。最終的 に免疫抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマを得た。 15ク ローンを選抜した。
④ モノクローナル抗体のサブクラスアツセィ
15クローンについてサブクラスを決定した。 前述した ELISA に従い、 それぞれ 免疫抗原をコ一トしたポリスチレン製 96穴プレートに、 上記で得られたハイプリ ドーマの上清を加えた。 次に PBSで洗浄後、 アイソタイプ特異的ゥサギ抗マウス IgG抗体 (Zymed Lab. ) を加えた。 PBS により洗浄後、 西洋わさびペルォキシダ ーゼ標識ャギ抗ゥサギ IgG (H+L)を加え、 基質として過酸化水素および 2， 2' -ァ ジノ- ジ (3- ェチルベンゾチアゾリン酸） を用いてクラス、 サブクラスを決定し トし o
⑤ィムノプロッティングによる選択
反応性試験 - 1：
免疫 を 12% SDS - PAGEで展開、 ナイロンメンブレンに転写、 各ハイプリ ド一 マ培 ¾i:清を 1次抗体として添加、 抗マウス Ig(G+A+M)- HRPを 2次抗体として使 用、 染色した。 全 15クローンのうち 8クローンを陽 f生と判定し、 2次選択に供し た。 これら 8クローンのサブクラスは、 4クローンが IgGl/ /c、 1クローン力 I gG3/ 、 3クローン力く IgMであった。 反応性試験- 2：
前項で陽 f生と判定した 8クローンについて、 組換え MT1 -匪 P を発現する COS- 7 の細胞破 Mlを抗原としたウェスタンブロッティングでさらに選択を行い、 反応 性の弱い 3クローン （表 1中の （+) ) を除外した。 これらはいずれも IgMであ つた。 最終的に得られたクローンは 5種で、 サブクラスは IgGl/ が 4種、 IgG 3/ が 1種であった。
⑥ ハイブリ ドーマの i咅養とモノク口一ナル抗体の精製
得られたハイプリ ドーマ細胞を NS-1培地で培養し、 その上清から濃度 10〜； 100 /g/mlのモノクローナル抗体を得ること力くできる。 また、 得られたハイプリ ドー マ 107 個を予め 1週間前にプリスタンを腹腔内投与したマウス （Balb/c系、 雌、 6週齢） に同じく翻空内投与し、 1〜2週間後、 腹水中からも 4〜7mg/mlのモノ ク口一ナル抗体を含む腹水を得ることができる。 得られた腹水を 40%飽和硫酸ァ ンモニゥムで塩析後、 IgG クラスの抗体をプロテイン Aァフィゲル （Bio- Rad)に 吸着させ、 0. 1Mクェン酸緩衝液 （pH5. 0)で溶出することにより精製する。
本発明では、 上記で得られたモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細 胞 （5クローン） をマウス翻空に投与し、 それぞれの抗体を含有する腹水を調製 した。 得られた腹水を硫^画、 ァフィゲル プロテイン Aゲルカラムに供し、 精製モノク口一ナル抗体を得た。
サブクラスアツセィ、 反応試験- 1および 2の結果を表 1にまとめた。
クローン番号 サブクラス 反応性試験 - 1 反応性試験- 2
222-1D8 r 1/ Λ + +
222-2D12 y i/ /c + +
222-3E12 y l/ « . + +
222-4G5 + +
222-6D2 H i κ + ( + )
222-9A3 γ ^/ κ + +
222-10E6 μ.1 κ + ( + )
222-14H6 β Ι κ + ( + )
実施例 3 抗体の反応性
①ェピトープマッピング
実施例 1―③で調製した厶 MT1 - P(58kDa)およびへモぺキシンドメイン (3(M)a ， 34kDa)、 i¾ドメイン (21kDa) の断片を抗原としたウェスタンブロッテイング でェピトープマッピングを餓した。 実施例 2で選択した 5クローンを 1次抗体 として添カロ、 抗マウス Ig(G+A+M)- HRPを 2次抗体として使用、 染色した。 いずれ のクローンもへモぺキシンドメインと強く 芯し、 これらのェピト一プがへモぺ キシンにあること力確認された （図 1参照） 。
②交叉 性
実施例卜②で調製した ΜΉ-匪 P発現 COS- 7の細胞破 %、 MT2- MMP (マウス） 発 現 COS- 7の細 S包破 ¾¾ίおよび ¥Γ3- MMP発現 COS - 7 の細胞破¾¾1を抗原として用い 、 ウェスタンブロッテイングで交叉反応試験を実施した。 実施例 2で選択した 5 クローンを 1次抗体として添加、 抗マウス Ig(G+A+M)- HRPを 2次抗体として使用 、 染色した。 いずれのクローンも MT1- MP とのみ反応し、 MT2 - MMP (マウス） お よび1 MT3- MMP とは反応せず、 MT1-MMP に特異性を持つこと力く確認された （図 2参 照） 。 例 4 MT1-MMPの 定
各抗体を固相ィ匕した 96穴マイクロウェル中で、 標準抗原 （組換え Affl!-MMP)を 反応させた。 洗浄後、 各抗体の IgG-HRP と反応させ、 続いて未反応の IgG- HRPを 洗浄除去した。 抗原を介して結合した IgG- HRPの残存活性を、 TMB を基質として 測定した。 最も抗原を良く検出した固相抗体 222-2D12 と標識抗体 222- 1D8 の組 み合わせを見出し、 さらに、 删する抗体の濃度、 反応時間、 反応 、 反応緩 衝液の糸滅など詳細に検討した。 標識抗体は IgG- HRP にかえて、 Fab' - HRPを新た に作製し用いた。 その結果、 以下に示す方法において最も効率良く ΜΉ -画 Pカ則 定できた。
① 標識抗体
標識抗体 Fab' - HRPは次のようにして調製できる。 例えば、 モノクロ一ナル抗体 を O. lM NaCl を含む 0. 1M 酢酸ソ一タ ϋ衝液 （ρΗ4· 2)に抗体量の (W/W) のぺプ シンを加え、 37°Cで 20時間消化した。 消ィ匕物に 3M Tris-HCl 緩衝液 (pH7. 5) を添 加し、 反応を停止した。 0. 1M リン酸緩衝液 （PH7. 0)で 化したウルトロゲル AcA54 カラムによるゲルろ過で F(al)' ) 2 画分を分取した。 この F(ab' ) 2 画分に最 終濃度 0. 01M となるようにシステアミン塩酸塩を添加し、 37°C、 1. 5時間還元し 、 5 mM EDTA含有 0. 1 M リン酸緩衝液 （pH6. 0)で ψ ί匕したウルトロゲル AcA54 カラムによるゲノレろ過で Fab'画分を分取した。
上記の操作とは別に HRPを 0. 1 M リン酸緩衝液 （PH7. 0)に溶解、 HRPの 25倍モ ノ の EMCSを DMF溜夜として加え、 30°C、 30分間反応させた。 これを 0. 1 M リン 酸緩衝液 （PH6. 0)で∑[¾化した NICK- 5カラム （Pharmacia)でゲルろ過しマレイミ ド標識 HRP画分を分取した。 ·
Fab'画分とマレイミ ド標識 HRPを等モルとなるように ®分を混合し、 4 °C、 20時間反応させた後、 Fab'の 10倍モノ の N-ェチルマレイミ ドで未反応のチォ一 ル基をプロックした。 これを 0. 1 M リン酸緩衝液 (pH6. 5)で 化したウルト口 ゲル AcA54 カラムでゲルろ過し、 Fab' - HRP標識抗体を分取した。 これに 0. 1% BSA および 0. 001%クロルへキシジンを添加して 4 °Cで ί呆存した。
② 抗体固相化プレート ：
モノクローナル抗体 （例えば、 222-2D12 (IgG)) を 0. 1 M リン酸緩衝液 (pH 7. 0)で 25 g/mLに調製し、 96穴マイクロウェル (MAXISORP、 NUNC - I MUNO MODULE) あたり 100 filずつ加え、 4 °C、 24時間静置した。 次に抗体溜夜を除去し、 洗浄 液 (0. 1 % Tween 20、 0. 1 M NaCl含有 10 mM リン酸緩衝液 (pH 7. 0)) で 3回洗浄 後、 プロッキンク "液 (1 % BSA、 10 mM EDTA、 0. 1 M NaCl含有 30 mM リン酸緩衝液 (pH 7. 0)) を 96穴マイクロウェルあたり 0. 3 mLずつ加え、 4 °Cで保存した。
③ 標準抗原：
^Jfei列 1で精製した ΔΜΤ卜 MPを希糊緩衝液 (0. 45 % SDS, 0. 4¾ 2-メルカプ トエタノール， 3%ゥマ血清， 1% BSA, 10 mM BDTA, 0. 1M NaCl含有 30 mM リン酸 緩衝液 (PH 7. 0)) で 160 ng/mLに調製した。 これを希釈用緩衝液で段階希釈して 80, 40, 20, 10, 5および 2. 5 ng/mLの 溜夜を調製した。
④ 測定検体：
測定検体は、 必要に応じて希釈用緩衝液で希釈した。
⑤ 1次反応：
標準抗原あるいは測定検体を 96穴ビニルプレートに 25〃 Lずつ加えた。 これに 希釈用緩衝液 100 zLを加え混和、 これより 100 / L とって、 予めブロッキング 液を除去 ·洗浄した抗体固相化プレートに入れ、 4 °Cで 16時間静置した。
⑥ 2次反応：
標識抗体 222- 1D8 (Fab' - HRP)をブロッキング液で 0. 4 /ΙΛに調製した。 1次 反応力終了した抗体固相ィ匕プレー卜から反応液を除去し洗浄液で 3回洗浄後、 標 識抗体液をゥエルあたり 100 /Lずつ加え、 室温で 1時間静置した。
⑦ 発色：
反応終了後、 標識抗体液を除去、 洗浄液で 3回洗浄し、 TMB溜夜 (CALBI0CHEM) をゥエルあたり 100 zLずつ加え、 室温で 20分間反応した。 これに 2N硫酸をゥ エルあたり 100 Lずつ加え反応を停止した。 この反応混液の A4 5。をマイクロプ レ一トリ一ダ一 (MPR- A4、東ソ一） を用いて測定した。
上記の方法で得られた; »曲線の例を図 3に示した。 MT1-MMPサンドイッチ EI Aの感度は、 0. 32 ng/mL (6. 4 pg/ゥエル) 、 また 0. 63- 160 ng/mL(0. 013-3. 2 ng/ ゥエル） の範囲で直線性が認められた。 実施例 5 MT1-MMPサンドィッチ EIAの性能
① 希釈試験による検体量の決定
血清、 関節液それぞれに 抗原を添加して作成した検体を希釈、 実施例 4に 記載した方法に従って測定した。血清検体を 10、 20、 30//L/wellとなるように希 釈し測定した。検体量を 20 L/well以下にした^、加えた^ ^抗原の 90%以上 が回収されたことから、血清検体の測定は 20〃L/wellで設定した。 関節液検体を 0.625, 1.25， 2.5， 5 〃L/wellとなるように希釈し測定した。検体量を 2.5〃L/ well以下にした 、 加えた ¾観の 80%以上が回収されたことから、 関節液 検体の測定は 2.5〃1 611で|^した （表 2) 表 1 検体（ 添加標準品 検体添加量 測定値
し/ well) (ng/mL)
血清 l(40ng/mL) 10 39.4
20 37.4 ， 98.5
93.5
血清 2(10ng/mL) 10 10.3 103.0
20 9.6 96.0
血清 3(2.5ng/mL) 10 2.7 108.0
20 2.4 96.0
関節液 1は 42ng/mL) 0.625 155.8 109.7
1.25 143.6 101.1
2.5 127.2 89.6
関節液 2(142ng/mL) 0.625 154.2 108.6
1.25 138.3 97.4
2.5 123.5 87.0
② 添加回収試験
血清、 関節液、 培養上清 (Con A処理した MDA- MB- 231)、 細胞抽出画分 (Con A処理した MDA- MB- 231) のそれぞれに標準 を添加し、実施例 4に記載した方 法に従って測定し添加した標準 の回収率を調べた。測定結果例を表 3 に示し た。血清、培 ¾ii清、 細胞抽出画分では 90%以上、 関節液では 80%以上の回収率 力確保された。 表 3 検体 添加抗原量 回 J)X抗原 ¾
(ng/mL ) (ng/mし) f
培養上清 40.0 42.3 105.8
20.0 18.6 93.0
10.0 10.3 103.0
細胞抽出画分 40.0 40. 7 101.8
20.0 18.0 90.0
10.0 9.9 99.0
③ 同時翻性
a)血清に標準抗原を添加して調製した検体 (3種） について、 実施例 4に記載し た方法に従い、 同時に測定した (n=8) 。 CV値は 2. 5〜3. 4 %を示した （表 4 ) 。
検体番号 測定値 ±SD CV(%)
1 69.1±2.3 ng/mL 3.4
2 36.0±0.9 ng/mL 2.5
3 17.6±0.6 ng/mL 3.2
b) Con A処理した MDA- MB- 231の培養上清および細胞抽出画分について、 実施例 4に記載した方法に従い、 同時に測定した (n=6) 。 CV値は 6. 9%及び 9. 5 %を示 した （表 5 ) 。
検体 測定値 ±SD CV(%) 培養上清 85.5±5.9 ng/mL 6.9
細胞抽出画分 87.7±8.4 ng/mL 9.5 ④ 測定間差
a) 血清に;！^抗原を添加して調製した検体 (3種） について、 実施例 4に記載し た方法に従って、 8回沏 j定した。 CV値は 3. 1〜5. 0 %を示した （表 6 )。
検体番号 測定値 ±SD CV(%)
1 67.5±2.2 ng/mL 3.3
2 34.9±1.7 ng/mL 5.0
3 18.0±0.6 ng/mL 3.1
b) Con A処理した MDA- MB- 231の培養上清および細胞抽出画分について、 実施例 4に記載した方法に従って、 6回測定した。 CV値は 7. 1 %および 10. 2 %を示した (表 7 ) o
体 測定値 ±SD CV(%) 培養上淸 87.7±6.3 ng/mL 7.1
細胞抽出画分 92.6±9.5 ng/mL 10.2
⑤ 特異性試験
MMP-1, 2， 3， 7, 8， 9， 13, 19， 20をそれぞれ l g/mUこ調製し、 MT1- MMPサ ンドイッチ EIA に供し 5。を測定した結果を表 8に示した。 MT1- MMPを 0. 16 g/ mLでサンドイッチ EIA に供した^、 2. 206の吸光値を示したのに対しこれらの 丽 P は、 0. 024〜0. 071禾1¾の吸光値し力、示さなかった。 従って、 ΜΊΊ-删 P サン ドイッチ EIA は、 MT1-MMP と特異的に反応すること力，認された。 表 8
MT1-MMPサンドイッチ EIAの交叉反応性
MMPs 濂度 Oig mL) A45O
MMP-1 0.025
MMP-2 0.024
MMP-3 0.027
MMP-7 0.026
MMP-8 0.028
MMP-9 0.039
MMP-13 0.026
MMP-19 0.027
MMP-20 0.071
MT1-MMP 0.16 2.206
ブランク 0.027
本発明のモノクローナル抗体を少なくとも 1種含む抗体の組み合わせによって MT1-MMPを特異的に検出 ·測定するサンドィツチ EIA系が構成できる。 EIA系は 1 ステップ法、 2 ステップ法のいずれも可能であり、 標識抗体は Fab' -HRPに限定 されない。 各反応緩衝液の糸滅ゃ反応条件は測定の目的に応じて、 短縮、 延長な ど調整できる。 標準品となる ΜΏ-ΜΜΡ は、 紙織 ±咅養上清、 細胞培養上清または実 施例 1記載の方法ある 、はそれ以外の方法で発現した組換え体力、ら精製すること 力くできる。 精製にはイオン交換、 ゲルろ過、 モノクローナル抗体を用いたァフィ 二ティークロマトグラフィーまたそれ以外の各種ァフィ二ティ一クロマトグラフ ィ一の組み合わせによって達成される。
測定検体は、 ヒト血液、 血清、 «、 関節液、 尿、 唾液、 脳脊髄液および羊水 などヒトに由来する体 各種ヒト紙織 （各 ®重裏'癌紙織を含む） の抽出 液、 ヒト由来あるいは組換え体など各種培猶睡包の細胞抽出液、 培養上清などか ら調製される。 実施例 6 MT1-M Pサンドィツチ ΕΙΑ における界面活性剤と還元剤の意義 実施例 1に記載の方法で ΔΜΊΊ - ΜΜΡ遺伝子を導入した ΔΜΊΊ- ΜΜΡ発現 COS- 7 を 調製した。 この COS 7細胞を培養し、 48時間後に培 ¾±清を回収した。培養上清 細胞を SDS- PAGEおよびウェスタンプロッティングに供し、 ΔΜΤ1-匪 Pが可溶性分 子として することを確認した。 この培養上清を ΜΊΊ-編 Pサンドイッチ EIAに 供したところ、 十分なシグナル (A4 5。=1. 807)力く検出された。 一方、 同じ培養上清 を SDS と 2-メルカプトエタノールを除いた希釈用緩衝液 (3% ゥマ血清、 1 ¾ BSA 、 10 mM EDTA、 0. 1M NaCl 含有 30 mM リン酸緩衝液 (pH 7. 0)) を用いて ΜΉ-匪 P サンドイッチ EIA に供したところ、 シグナルはおよそ 1/14 (Α4 5。=0. 138、 表 9の 上段の表） に低下した。 SDS と 2 -メルカプトエタノールは検体中の抗原に作用し 、 抗原の高次構造を MT1 -應 Pサンドイッチ EIAで検出可能な構造変ィ匕をもたらし たと考えられる。 この構造変換には SDS と 2-メルカプトェタノ一ルの共存が必須 であった （表 9の下段の表） 。 表 9
EIA実施条件 A450
界面活性剤、通元剤含有
1.807
希釈緩衝液
界面活性剤、通元剤不含
0.138
希釈緩衝液
EIA実施条件
A450
界面活性剤 通元剤
含有 含有 1.163
含有 不含 0.201
不含 含有 0.027
不含 不含 0.040
実施例 7 MT1- MPを産生する培養細胞株の検索
MT1- MP を産生するヒト培養細胞株の検索を MT1 -應 P サンドィツチ EIAで行つ た。 細胞株は、 バーキットリンパ月重 (Daudi, Namalwa, Raj i) 、 急性リンパ芽球 性白赫 （T-細胞) (MOLT- 4) 、 慢性骨髄性白鐘 （K- 562)、 前骨髄性白 (HL 60)、 繊維肉腫 (HT- 1080) 、 乳癌 (MDA- MB- 231， SK- BR- 3， MCF 7)、 肺癌 (A549)、 劃昜腺癌 (SW 837)、 骨肉腫 (MG- 63) 、 舌、 扁平細胞癌 (SSC- 25)、 子宮頸部癌 (HeL a)、頸部表^ I(CaSki) 、 前 3Ϊ泉癌 (PC- 3)、 悪性黒 fel重 (A- 375) を用いた。各種 癌細胞株を直径 10 cmのプレートでコンフルェントまで培養、無血清培地あるい は Con A含有無血清培地に交換し 48時間後に培養上清および細胞を回収した。細 胞は 0. 5 mLの希釈用緩衝液中で超音波破枠し、 遠心して得られた上清を細胞抽出 画分として EIAに供した。 ±咅養上清はそのまま EIAに供した。
測定锆果例を表 10に示した。 表 10
Figure imgf000057_0001
Tl-IW P は、 繊維肉腫 (HT1080)、 乳癌の一部 (MDA- MB- 231)、 劃昜腺癌 (SW 837) 、 骨肉腫 (MG- 63) 、舌、 扁平細胞癌 (SSC-25)、 頸部表皮癌 (CaSki) などで検出さ
実施例 8 MT1-MMP の発現量を変化させる因子 ·薬剤などの検索
MT1-MMPを発現する培養細胞を任意の生理活性因子や薬剤、 化合物を添加して 培養した後、培 ¾!:清あるいは細胞抽出画分を回収し、 MT1-MMPサンドイッチ EI Aに供する。測定は、 無処理の培養細胞から調製したものを対照とし、 MT1-MP 産 の増減を比較して各添加物の効果を言怖する。添加物の濃度は、璧調製 する必要がある。添加物としては、 遺好の発現制御に関わるもの、 T1-MMPの アンチセンス RNA、 MT1-MMPの mRMを配列依存的に切断するリボザィムなどが考 えられる。添加物は、培養液中に直接あるいはノ、プテンィ匕して添加しても良 、し 、 それぞれを発現する遺伝子を細胞内に導入しても良い。 MT1- MPの発現を強力 に、 力、つ特異的に抑制する了ンチセンス RNAやリボザィムの設計および選択に MT 1-MMPサンドイッチ EIAは有用である。 MT1-MMP発現抑制剤は、癌転移抑制に対 する医薬として有用である。 実施例 9 T1-MMPの活性測定および Ml- MP活性阻 の検索
irCMTl-MMP モノクローナル抗体を 0. 1 M リン酸緩衝液 (pH 7. 0)で 25 zg/mLに調 製し、 96穴マイクロウェルあたり 100 Lずつ加え、 4 °C、 24時間静置する。 次 に抗体碰を除去し、 洗浄液 (0. 1 % Tween 20, 0. 1 M NaCl含有 10 mM リン酸緩 衝液 (pH 7. 0)) で 3回洗浄後、 ブロッキング液 (1 % BSA, 10 mM EDTA, 0. 1 M Na CI含有 30 mM リン酸緩衝液 (pH 7. 0)) を 96穴マイクロウェルあたり 0. 3 mLずつ加 え、 4。Cで 16時間以上静置し保存する。 0. 1 % Tween 20, 0. 1 M NaCl含有 10 mM リン酸緩衝液 (PH 7. 0)で洗浄後、 1 % BSA, 0. 1 M NaCl含有 30 mM リン酸緩衝液 (pH 7. 0)で希釈した111-匪卩を含む検体を加え、 4 °Cで 16時間静置する。 0. 1 ¾ Tween 20, 0. 15 M NaCl含有 20 mM Tris- HCl緩衝液 (pH 7. 4)で洗浄、 0. 15 M NaC 1， 10 M CaCh, 0. 05 % Bri j35, 0. 02 % NaN3含有 50 mM Tris - HCl緩衝液 (pH7. 5 ) で 1 /Mに調製した Mca - Pro- Leu- Gly- Leu- Dpa Ala- Arg - NH2 を 100〃L加え、 37°Cで 1時間静置する。 反応液を 500 Lの 0. 1 M酢酸ナトリウム緩衝液 (pH4. 0 ) を分注した試験管に採り、 反応を停止する。皿- MMPの蛍光基質分角離性を蛍 光強度 (FI， Ex: 328 nm, Em: 393 nm)として、 島津分光蛍光強度計 RF-5000で測 定する。上言己の抗体濃度、 蛍光基質の ¾1と濃度、 各種反応液の組成、 反応時間 、 反応 i¾¾、 反応 などは必要に応じて ¾S変更できる。
① MT1-應 P の活性測定
上記の方法において、 添加する検体として各 ®f紙織抽出画分を用いると、 各 種の膠 sを含有する組熾抽出画分から ΜΉ -固 Pを特異的に固相ィ匕し、 その活性を 検出すること力《できる。得られた MT1 -画 P活性から検体癌紙織の浸潤能を想定す ること力できる。 また、 治療を施した癌糸職の浸潤能の変動を想定したり、 MT1- MPの産生を抑制し浸潤能を低下ある 、は消失させる瞧の選択や薬剤の検索な どに有用である。
② MT1- MMP活性阻害剤の検索
上記の方法にぉレ、て、 添加する検体を一定の活性レベルを有する; MMP を用い、 これに対して各種の酵素活性阻 ij、 MMPs阻害剤あるいは任意の化合物 を添加すれば、 それぞれの ffll-MMPに対する阻害活性を測定すること力くできる。 この方法を用いれば、 未知の ΜΉ -画 P P且害剤の検索や Batimastat；、 Marimastat^ R032-3555、 AG3340. Bayl2- 9566、 CGS27023Aなど! ¾存の MMP活' 阻害剤か'持つ MT1-MMP P且 能を知ることができる。
標準 ΜΉ- ΜΜΡ としては、 mni に記載した PUCAMTI-變， pTrcHis厶 ΜΉ -删 Pを導入した大腸菌から発現される組換えタンパク質、 pSGAMTl-MMPを導入し た COS- 1， COS - 7， CH0細胞から発現される組換えタンパク質を用いること力《でき る。
pUCAMTl-MMP, pTrcHisAMTl- MPには MT卜層のプロドメイン力く含まれてお り、活性測定用の »MT1-画 P として用いる にはフユ一リンによってプロド メインを切断、 除去し、 活 tt MTl-丽 Pに変換する必要がある。活 tt ffll- MP を直接、 大腸菌発現で発現させるため、 以下の組換え体を作成した。
MT1- MPの cDNAを錚型とし、 プライマ一
MT1ACTF1： GAAGATCTACGCCATCCAGGG 〔配列番号： 1〕 と
T1ACTR1： GAGGTACCTCAGCCCATCCAGTCCC 〔酉 リ番号： 2〕 によって増幅される遺 ^を制限酵素 Bgl I I と Kpnlで切断、 予め BamHI と Kpnlで 切断した pQE- 32(Qiagen)と遍吉し、 pQE MT1ACTR1を作成した。
さらに、 Mil- MMPの cDNAを画とし、 プライマ一
MT1ACTF1： GAAGATCTACGCCATCCAGGG 〔配列番号： 1〕 と
MT1ACTR2： TAGGTACCTACCCGCCGCCCTCC 〔酉 」番号： 3〕 によって増幅される遺伝子を制限酵素 Bgl I I と Kpnlで切断、予め BamHI と Kpnlで 切断した pQE- 32(Qiagen)と遮結し、 pQB MT1ACTR2を作成した。
pQE MT1ACTR1および pQE MT1ACTR2でコ一ドされる MT卜删 P は、 それぞれ Y1 1 2 - G 5 0 7 および Ύ1 1 2 - G5 3 5 であり、 いずれもプロドメインを欠き、 活'隨 MT1 - MMP を 発現する。
また、 QE MT1ACTR1は疎水性の高い膜貫通ドメインの全体、 pQE MT1ACTR2は膜 貫通ドメィンの一部を欠くため、 発現する組換えタンパク質の可溶性が向上し、 活性測定用の標準 MT1-删 P としてより好ましい性質を有する。
活性型組換え MT卜羅 P は、 截 fe例 1の③項に記載の方法などで精製し、 活性測 定用標準 MT1- MMP として供することができる。
③ 活 ftSMTl- MPの調製と活性測定
pQE MT1ACTR1を導入した組換え^ §昜菌 (400mL培養） より調製した不溶 寸入体 を 8 Μ尿素 (urea), 0. 5 M NaCl, 10 mMイミダゾ一ノ哈有 50mMリン酸緩衝液 (pH7 . 5) で可溶化し、 Ni++ Chelating S印 haroseゲルカラムに供した。 洗浄後、 8 M 尿素， 0. 5 M NaCl, 0. 5 Mイミダゾ一ノ哈有 50 mM リン酸緩衝液 (pH7. 5) で溶出 し、 得られた精製画分を 8 M尿素， 0. 3 M NaCl含有 20 mM Tris- HCl (pH8. 6) で平 衡化した PD- 10 ゲルカラムに供し緩衝液を交換した。 これに 50〃M ZnS04 および 1 mM DTTを添加した後、 A280を測定し、 8 M尿素， 0. 3 M NaCl, 50 M ZnS04， 1 mM Οπ含有 20 mM Tris-HCl(pH8. 6) を用いて A280が 0. 1となる様に希釈した。 これに 20 mM システアミン (cyst earn in) を添加し、 リフォールディング用サンプ ル (50 mL) とした。 これを 5レの 0. 15 M NaCl, 5 mM CaCU, 100 /M ZnS04, 5 m M 2-メルカプトエタノール (2 - mercaptoethanol), 1 mM ヒドロキシェチルジスル フィ FChydroxyethyl disulf ide), 0. 02 % NaN3 含有 50 mM Tris-HCl(pH8. 6) で 16時間透析、 さらに 0. 15 M NaCl, 5 mM CaCl 2, 50 zM ZnS04, 0. 02 % NaN3含有 50 mM Tris- HCl (pH8. 6) で透析し (4時間、 3 回） 、 リフォールディングした。 透 折後のサンプルを遠心し、 不溶化したタンパク質を除去、 限夕慮過で約 1 mLに濃 縮した。 これを 0. 15 M NaCl, 10 mM CaCl2含有 50 mM Tris- H 緩衝液 (pH7. 5) で 化した S印 hacryl S-300 ゲルカラムに供した。溶出フラクションを A280でモ 二ターし、 タンパク質溶出画分を検出した。 溶出タンパク質は 2つのピークを示 し、 前半が 2量体以上の重合体、 後半がモノマ一であった。 後半のタンパク質ピ 一クを活 '瞧 !！-■精製画分としてプールし、 限夕慮過で 1 mLに纖した。 BC A(Pierce) によるタンパク質濃度は 0. 11 mg/fflLであった。 得られた活 tt MT卜 MMPの酵素活性を検討した。
酵素画分 50 Lに 0. 15 M NaCl, 10 mM CaCh, 0. 05 % Bri j35, 0. 02 % NaN3含 有 50 mM Tri s- HCl緩衝液 (pH7. 5) で 1 Mに調製したメタ口プロテア一ゼ用合成 基質 Mca- Pro- Leu- Gly- Leu- Dpa- Ala- Arg-丽 2 を 100 βΐ加え、 37°Cで 1時間静置 した。 同時に、 上記反応系に 20 mM EDTAを添加したものを調製し、 同様に 37°Cで 1時間静置した。 反応液を 500 illの 0. 1 M酢酸ナトリゥム緩衝液 (ρΗ4· 0) を分 注した試験管に採り、 反応を停止した。 MT1-MMPの蛍光基質分艇性を蛍光強度 (FI, Ex: 328 nm, Em: 393 nm)として島津分光蛍光強度計 RF- 5000で測定した。 得られた蛍光強度はそれぞれ 121. 6、 6. 3を示し、調製した活'瞧 T1-應 Pカ TAで阻害されるメタ口プロテアーゼ活性を有することを確認した。上記の酵素濃 度、 蛍光基質の翻と濃度、 各種反応液の糸城、 反応時間、 反応 、 反応體 などは必要に応じて適宜変更できる。
④ 固相化 KMT1-MMPモノクロ一ナル抗体用いた MT1 - MMPの活性測定
m の②項に記載した方法に従って、 抗体固相ィ匕プレートを作成した。使 用した各種の抗体濃度は 50 /g/mL、 プロッキング液は 1%スキムミルク、 0. 1 M Na C1含有 30 mM リン酸緩衝液 (pH 7. 0)にそれぞれ変更して用いた。予めブロッキン グ液を除去、 洗浄液 (0. 15 M NaCl含有 50 mM Tris- HCl緩衝液 (ρΗ7· 4))で 3回洗浄 した抗体固相化プレー卜に、 0. 15 M NaCl, 10 mM CaCh, 0. 05 % Bri j35, 0. 02 % NaN3含有 50 mM Tris- HCl緩衝液 (pH7. 5) で 5 〃L/100 μ,Ιに希釈した酵素画分 を人れ、 4 °Cで 16時間静置した。 反応液を除去し洗浄液で 3回洗浄後、 0. 15 M N aCl, 10 mM CaCl 2 ) 0. 05 % Bri j35, 0. 02 % NaN3含有 50 mM Tris- HCl緩衝液 (pH7 . 5) で 1 に調製したメタ口プロテア一ゼ用合成基質 Mca- Pro- Leu- Gly - Leu - Dp a-Ala-Arg-NH2 を 100 ί加え、 37°Cで 8時間静置した。 反応液を 500 βΐの 0. 1 Μ酢酸ナトリウム緩衝液 (ρΗ4. 0) を分注した試験管に採り、 反応を停止した。 固相ィ匕 Ή-画 Ρ モノクローナル抗体に撤足され、 マイクロウヱルに残存した ΜΤ 1-MMPに由来する蛍光基質分角離性を蛍光強度 (FI, Ex : 328 nm, Em: 393 nm)と して島津分光蛍光強度計 RF- 5000で測定した。
固相抗体に本明細 #1己載の抗体 222-1D8, 222-2D12, 222-3B12, 222 - 4G5および 222-9A3を用い、 蛍光基質分角離性を測定した: ti^、 市販の Ml- MMP ンドメィンに対するモノクロ一ナノレ抗体 (113 - 5B7、 第一ファインケミ力ノレ） を用 いた齢の 9. 2から 17. 1倍の货光強度を得た （図 4)。抗体を添加せず同様に調製 したものからは、 酵素活性は検出されなかった。 これより御 T1-匪 P抗体を固相 化したマイクロウェルを用いることにより、選択的に MT1-匪 Pを撤足し、 その活 性レベルを 的に、検出し得ること力確認された。翻する抗体の穩： Iや濃度 、 蛍光基質の と濃度、 各種 ®£液の組成、 反応時間、 反応；¾、 反応 «な どは必要に応じて ¾t変更できる。
固相化する抗体は、認識領域がへモぺキシンドメインにある抗体、 たとえば 22 2-1D8, 222-2D12, 222-3E12, 222- 4G5および 222 - 9A3力 子適であるが、 これら以 外の抗体でも可能である一方、 113-5B7のような不適当な抗体も存在する。認識 領域が角蝶ドメインにあるような抗体は、 MT1-MMPの活性を阻害する可能性があ り、 本用途には不適当である:^がある。認識領域がプロペプチドドメインにあ るような抗体は、 プロペプチドを失った活性薩 Ή-画 Pを撤足できないことから 、 本用途には不適当である がある。
認識領域がへモぺキシンドメィンにある抗体を固相ィ匕したマイクロウヱルには 、 プロペプチドドメインを有する不活性 MMT1- MMP、 プロペプチドを失った活性 型 MT1-匪 Pのいずれもが撤足される。 この状態で活性を測定すれば、 検体中の活 性 ΜΜΉ-ΜΜΡを選択的に測定できるし、 フユ一リンやその他の適切なプロテア一 ゼ、 界面活性剤などで活性化処理した後に測定し、 活性化処理前に存在した活性 SMT1-MMPを差し引くことで検体中の不活' f^ MTl議 Pを選択的に測定できる。 実施例 1 0 臨床検体の測定
(1)滑膜抽出画分の測定
滑膜糸纖を 0. 15 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0. 05 % Bri j35含有 50 mM Tris - HC1緩 衝液 (pH 7. 5)中でホモジヱナイズ、遠心して糸纖抽出画分を調製した。 これらの 検体の ΜΊΊ- MMP濃度を麵列 4に記載した方法に従って測定した。 63検体を測定 した結果、 MT1-MMP濃度は 1. 3 ng/mL (実用検出限界）以下から 118. 9 ng/mLまで 分布し、 その平均 {直は、 23. 9 ng/mLであった。
(2)癌»熾および癌 織近傍の正常紙織抽出画分の測定 癌糸纖および癌組織近傍の正常糸！ ϋを 0. 15 M NaCl, 10 mM CaCl 2, 0. 05 % Bri j35含有 50 mM Tris- HC1緩衝液 (pH 7. 5)中でホモジェナイズ、 遠心して組織抽出 画分を調製した。 これらの検体の MT1-固 P濃度を実施例 4に記載した方法に従つ て測定した。 44検体の癌糸職抽出画分の平均値は、 17. 2 ng/mLを示した一方、 17 検体の正常糸職抽出画分の平均値は、 1. 3 ng/mL (実用検出限界）以下を示し、 MT 1-MMPの が癌組織で多く産生されていることを本発明サンドィッチ EIAで確 ¾、し 。 難例 1 1 臨床検体の測定（肺癌誦
① 癌繊および 艇傍の正常隱由出画分の測定
およそ 50 mgの肺癌組織および癌組織近傍の正常組織を 0. 15 M NaCl, 10 mM C aCh, 0. 05 % Bri j 35含有 50 mM Tris - HC1緩衝液 (pH 7. 5)中でホモジヱナイズ、 遠心して糸 IH抽出画分を調製した。 これらの検体の MT1-MMP濃度を実施例 4に記 載した方法に従って測定した。 さらに、各組織抽出画分のタンパク質濃度を BCA( P i erce) で測定し、 MT1-MMP濃度をタンパク質濃度で除して検体タンノ、°ク質量あ たりの MT1-画 P量を算出した。
51組の検体について、 平均値と 偏差を得た。正常組織、 癌紙織の ΜΉ-酵 量は、 それぞれ 0. 41±0. 76 ng/mg. 2. 43 ±1. 85 ng/mgを示し、癌糸纖と正常組 織で有意差 (Pく 0. 001) を確認した (Studentの有意差検定、 図 5 ) 。
同様にして、 口腔癌および 昜癌についても、 正常糸纖、 癌糸職の M -M P量 を測定した。 口腔癌糸!/織からは近接する正常組織のおよそ 3· 6倍、大 紙織カヽ らは近接する正常糸職のおよそ 2. 4倍の MT1-画 P力検出された。 いずれの癌種に おいても正常糸織、 癌組織間で MT1-鮮量に有意差が確認された。
② 転移との相関関係
前項①で測定した癌紙織をリンパ僻云移の有無を指標として分類し、転移の有 無と MT1 -固 P量について相関を調べた。 リンパ節転移力く認められない癌糸纖の MT 1 - MMP量 （平均値土標準偏差） は 1. 63±1. 77 ng/mg、 リンパ節転移力く認められる 癌紙織では 2. 49±1. 78 ng/mgを示し、両群に有意差 (pく 0. 05)を確認した （Studen tの有意差検定、 図 6 ) 。 図 6にお 、てリンパ節転移カ 忍められていないにもかかわらず、 高し Ml -顧 P 値を示した特異的な検体か存在する （リンパ節転移 .なし、 最高値 7. 4 ng/mgを 示したもの） 。 この症例は、 リンパ節転移は認められなかったカ静脈に強い浸襲 があり、 悪' の高いものであった。 この検体を含め、 高い MT1-讓 P値を示した 検体のほとんどがリンパ節あるいは脈管浸襲を起こしていることから、 臨床的に 転移力見られなくても Mil- MMPレベルが高値を示した^には、 すでに微小転移 を起こしている力、 転移するリスク力高いと推定し得る。 実施例 1 動物細胞株の MT1-匿測定
MT1- MP を産生するマウス、 ラットおよびラビット培猶田胞株の検索を行った 。 マウス 8株、 ラット 4株、 ラビット 1株について実施例 7 と同様にして、 各培 ^Ji清を調製した。 得られた培養上清を 20倍に濃縮して EIA に供した。 検討した 動物細胞株のうち、 マウス C127、 ラット FR、 ラビット HIG-82で、 高い MT1-删 Pの 産生が認められた。 濃縮した培養上清を段階希釈し、 MT1-MMPを産生するヒト細 胞株 MDA- MB- 231とその ®S性について比較した。 いずれの種とも同様な傾きを有 する希釈曲線 （表 11および図 7 ) を得たことから、 ヒトとマウス、 ラットおよび ラビット細胞株に由来する各 ΜΊΊ- MMP力 同等な免疫反応性を有すること力く示さ れん。 表 1 1
Figure imgf000064_0001
これより本 EIA系は、 ヒ卜の他に、 マウス、 ラットおよびラビット各種動物由 来の Ml-讓 P も測定できること力確認された。 本 EIA系によって認識される Mil- MMP のへモぺキシンドメインのアミノ酸配列をヒト 〔配列番号： 4〕 と、 マウス 〔配列番号： 5〕 、 ラット 〔酉己列番号： 6〕 およびラビット 〔酉己列番号： 7〕 で 比較した （図 9 )。 189 アミノ酸残基のうちヒ卜/ マウス間では 1残基、 ヒ卜/ ラット間では 1残基、 ヒ卜/ ラビット間では 3残基のミスマッチカ認められたの みで、 へモぺキシンドメィンは、 種間で良く保存されていること力確認された。 実施例 1 3 界面活性剤および還元剤存在下における抗体の免疫反応性の変動 界面活性剤および還元剤存在下における抗体の反応性をウェス夕ンブロッティ ングで検討した。 本明細 己載の MT1 - MMPサンドィツチ EIAの ί¾Ιを 500 η g /レーンで SDS- PAGEに供し、 ニトロセルロース膜に転写した。 1% BSA、 0. 1 M Na CI含有 30 mM リン酸緩衝液 (pH7. 0) でブロッキングした後、 本明細截己載の ffll - 固 Pサンドイッチ EIAの希釈用緩衝液および SDS と 2 -メルカプトエタノーノレ不含 の希釈用緩衝液を用いて 10 /mLとなるように調製した御 Tl- MMPモノクロ一 ナル抗体溜夜 (222- 1D8、 222-2D12, 222- 3E12、 222-4G5および 222 - 9A3)に浸漬し 、 16時間インキュベートした。 洗浄後、 抗マウス IgG- HRPを反応させ染色した。 本明細截己載の 編 Pサンドイッチ EIAの固相抗体として用いた御 H-丽 P モノクロ一ナノレ抗体 222 2D12は、 SDS と 2-メルカプトエタノールの含有 ·不含有 に力、かわらず "MT1 -綱 P との反応性を»していた （図 8 ) 。 一方、 222-9A3 は、 SDS と 2-メルカプトエタノール不含有では 222- 2D12同等の反応性を示したにもか 力、わらず、 含有下ではほとんど反応性を失った （図 8 )。 222-1D8 やその他の抗 体も ΜΊΊ- MMP との反応性を著しく低下させたり、 膜全体が着色するなど特異性を 失う傾向力認められた。 SDS と 2-メルカプトエタノ一ノレのような界面活性剤、 還 元剤を含有する希釈用緩衝液中で搬学的反応を進行させるためには、 固相抗体 として用 こ 222 - 2D12のような安定した反応性を有する抗体の選択が必要である。 ヒト IgGの H鎖および L鎮は鎖内にそれぞれ 4ケ所、 2ケ所の S- S結合を有し 、 1ケ所の S-S結合で互いに結合している。 IgGlでは、 この二量体が 間の 2 ケ所の S- S結合で結合し 4本鎖構造を安定化している。 IgG3には H鎖間の S S結 合が 15ケ所ある。 抗体に還元剤を充分に作用させた^、 鎖内 '鎖間の S- S結合 力沏れ、 抗体の高次ネ職とともに免疫反応性が失われる。 S-S結合の多い IgG3は 、 IgGlに比べ還元剤による変 ¾ίカ果が大きく免疫反応性の低下が著しいものと予 想される。 MT1- MMP サンドイッチ EIA希釈用緩衝液中で ΜΊΊ-删 P に対する RiS性 を失った 222-9A3 は、 IgG3である。 IgGlにおいても還元剤による S- S結合の切断 は著しい免疫 Sit、性の低下をまねくが、 H鎖と L鎖は、 非^ 結合による相互作 用でも高次構造を保持しているため、 還元剤 ί下で免疫反応性を維持するク口 —ンも し得る。 実施例 1 4 可溶翻 Τ- ΜΜΡの作製とその禾翻
MT2-MMP(SwissProt Accession No. 054732; マウス） の纖ドメイン、 ヒンジ ドメィンおよびへモぺキシンドメィン (γΐ 2 8 - c5 5 5) を増幅するための PCRプライ マーを作製した。 5'側プライマーには Smalサイト、 3'側プライマーには終止コド ンと Bgl l l サイトを付加した。 Smalサイトは pUC18 の β—力'ラクトシダーゼにィ ンフレームで 3$吉できるように設計した。 ΜΤ2- ΜΜΡ の全長を含む遺^をク口一 ンィ匕した PSGMT2 - ΜΜΡを,とし、 93°C 30秒、 45°C 30秒、 72°C 60秒で 30サイ クルの PCRを行った。 得られた PCR産物の両末端を Smalと Bgl I I で切断し、 予め Smal iBamHI で切断した pUC18 に揷人した。 この発現べクタ一により; S—ガラク トシダ一ゼの 11アミノ酸残基と、 シグナルペプチド、 プロペプチド領域、 膜貫通 領域および細月包内ドメインを欠損した厶 MT2- MMP (YI 2 8-C5 5 5) の 428 アミノ酸残 基、 計 439 アミノ酸残基からなる分子量約 48kDa の融合タンパク質を発現した。
MT3-MMP(SwissProt Accession No. P51512) の ¾娜ドメイン、 ヒンジドメイン およびへモぺキシンドメイン (Y1 2 D-C5 3 2) を増幅するための PCRプライマ一を作 製した。 5'側プライマーには Smalサイト、 3'側プライマーには終止コドンと Bgl l I サイトを付カロした。 Smalサイトは pUC18 の β _ガラクトシダ一ゼにインフレ一 ムで 锆できるように設計した。 ΜΤ3-匪 Ρ の全長を含む遺伝子をクローン化した PSGMT3-匪 Ρを鍀型とし、 93°C 30秒、 45°C 30秒、 72°C 60秒で 30サイクルの PC Rを行った。 得られた PCR産物の両末端を Smalと Bgl I I で切断し、 予め Smalと Ba mHI で切断した pUC18 に揷人した。 この発現べクタ一により /3—ガラクトシダー ゼの 11ァミノ酸残基と、 シグナルべプチド、 プロべプチド領域、 膜貫通領域およ び細胞内ドメインを欠損した ΔΜΤ3- MMP (Y1 20-C5 3 2) の 413 アミノ酸残基、 計 43 9 アミノ酸残基からなる分子量約 47kDaの融合タンパク質を発現した。
MT4-MMP(SwissProt Accession No. Q9ULZ9) の角蝶ドメイン、 ヒンジドメイン およびへモぺキシンドメイン (Q1 2 9 - C5 2 5) を増幅するための PCRプライマーが設 計できる。 5，側プライマーには Smalサイト、 3，側プライマーには終止コドンと Bg I I I サイトをイ^]口する。 Smalサイトは pUC18の 3—ガラクトシダーゼにインフレ —ムで 結できるように設計する。 MT4- MMPの全長を含む遺伝子をクロ一ンィ匕し たベクターあるいは孚し癌 cDNAライブラリ一などを鋅型とし、 93°C 30秒、 45°C 3 0秒、 72°C 60秒で 30サイクルの PCRを行う。 得られた PCR産物の両末端を Smal と Bgl l l で切断し、 予め Smalと BamHI で切断した pUC18 に揷入する。 この発現べ クタ一により βーガラクトシダ一ゼの 11ァミノ酸残基と、 シグナルぺプチド、 プ 口ペプチド領域、 膜貫通領域および細胞内ドメインを欠損した ΔΜΤ4-删 P (Q1 2 9- C5 2 5) の 397 アミノ酸歹 、 計 408 アミノ酸残基からなる ^?»¾45kDa の融合 タンパク質を発現する。
MT5- MP(SwissProt Accession No. Q9Y5R2) の蝶ドメイン、 ヒンジドメィン およびへモぺキシンドメイン (Y1 5 6- C5 6 9) を増幅するための PCRプライマ一を作 製した。 5'側プライマーには Smalサイト、 3，側プライマ一には終止コドンと Bgl l I サイトを付加した。 Smalサイトは PUC18 の 3—ガラクトシダ一ゼにインフレ一 ムで 結できるように設計した。 脳 cDNAラィブラリーを铸型とし、 93°C 30秒、 45°C 30秒、 72°C 60秒で 30サイクルの PCRを行う。 得られた PCR産物の両末端 を Smalと Bgl l l で切断し、 予め Smalと BamHI で切断した pUC18 に揷入する。 この 発現べクタ一により β—ガラクトシダ一ゼの 11ァミノ酸残基と、 シグナルべプチ ド、 プロペプチド領域、 膜貫通領域および細胞内ドメインを欠損した厶 ΜΤ5-匪 Ρ (Y1 5 6-C5 6 B) の 414 アミノ酸残基、 計 425 アミノ酸残基からなる^^量約 47kDa の融合タンパク質を発現する。
MT6- MP(SwissProt Accession No. Q9NPA2) の角蝶ドメイン、 ヒンジドメイン
0 8-C5 0 8) を増幅するための PCR プライマーカく設 計できる。 5'側プライマ一には Smalサイト、 3'側プライマ一には終止コドンと Bg I I I サイトを付加する。 Smalサイトは pUC18 の β—iiラクトシダ一ゼにィンフレ ームで連結できるように設計する。 MT6-MMPの全長を含む遺伝子をクローン化し たべクタ一あるいは白血球、 肺、 脾臓 cDNAライブラリ一などを铸型とし、 93°C 3 0秒、 45°C 30秒、 72°C 60秒で 30サイクルの PCRを行う。 得られた PCR産物の 両末端を Smalと Bgl l l で切断し、 予め Smalと BamHI で切断した pUC18 に挿入する 。 この発現ベクターにより /3—ガラクトシダ一ゼの 11アミノ酸 ¾Sと、 シグナル ペプチド、 プロペプチド領域、 顧通領域および細胞内ドメインを欠損した ΔΜΤ 6-MMP (Y1 0 8-C5 0 8) の 401 アミノ酸残基、 計 412 アミノ酸残基からなる^量 45kDaの融合タンパク質を発現する。
ドメィン、 ヒンジドメィンおよびへモぺキシンドメィンからなる組換え夕 ンパク質厶 MT2 -丽 P、 ΔΜΤ3-ΜΜΡ 、 厶 MT4 - MP、 ΔΜΤ5- ΜΡおよび ΔΜΤ6- MMP は 、 実施例 1記載の方法と同様にして inclusion bodyとして回収、 8M urea, 0. 1 M NaCl含有 10 mM リン酸緩衝液 (pH 7. 0)で可溶化し、 preparative SDS - PAGEおよ び電気溶出で精製、 分取すること力くできる。 あるいは穏やかなリフォ一ルディン グを ί亍 ヽ删 Ρ活性を有する ΜΤ- ΜΜΡを作成すること力くできる。
得られた組換え夕ンパク質を免麵として使用することにより、 ポリク口一ナ ル抗体、 モノクローナル抗体を作製すること力くできる。 たとえば得られたモノク 口一ナル抗体とそれぞれの組換えタンパク質（標準抗原） の組み合わせによって ΜΤ2-ΜΜΡ, ΜΤ3-ΜΜΡ, ΜΤ4-ΜΜΡ, ΜΤ5-画 Ρおよび ¥Γ6- ΜΜΡを特異的に測定できるサン ドイッチ ΕΙΑ系力得られる。膜結合型の ΜΤ2 - ΜΜΡ， ΜΤ3-ΜΜΡ, ΜΤ4-ΜΜΡ, ΜΤ5 -匪 Ρお よび ¥Γ6-固 Ρ を測定する ΕΙΑの固相には界面活性剤および還元剤に耐性を示す抗 体を選択すること力く望ましい。 なお、 測 像の膜結合薩 Τ2 -匪 Ρ， ΜΤ3-ΜΜΡ, ΜΤ 4-ΜΜΡ, ΜΤ5- ΜΜΡおよび "ΜΤ6- ΜΡ は、 界面活性剤および還元剤を含有する緩衝液中 で抽出することができる。
また、 得られたモノクローナル抗体を介して ΜΤ2-删 Ρ， ΜΤ3-ΜΜΡ, ΜΤ4-ΜΜΡ, ΜΤ5 -匪 Ρおよび ΪΓ6 - MMPを固相化し、 それぞれの画 P活す生を測定すること力できる。
MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP, MT5-MMPおよび MT6-匪 Pのサンドイッチ EIAゃ活 性測定系は、 癌の悪 ttgの 面、 癌種の特定、 臓器特異的な癌の検出、 リウマチ 性関節炎ゃァルツハイマ一の進行度の推定など種々の臨床分野に応用できる外、 MT - MP活性阻害剤などの医薬、 その開発石开究手段として利用できる。 産業上の利用可能性
本発明により、 簡単な操作および を用い、 感度並びに精度良 迅速に MT 1-層を錢すること力くできる。特に、本発明では、被検試料中の可溶翻 T1 -匪 Pを できる。 さらに、 MT1- MMPの発現を促進または阻害する化合物や因子、 MT1-MMP の酵素活性を促進または阻害する化合物や因子を効率よくスクリーニン グすること力く可能である。 また、本発明で、 細 S¾Mから MT - MMPsを遊离|¾び/又 は可溶化せしめ、該 MT-纏 Ps を ¾Mできる。本発明では、 これら測定に有用な試 薬、 セット、 スクリーニングキット、 そして癌または癌転移検査薬、 リウマ チ性関節炎やアルツハイマーの進行度検査薬、 さらには MT1-讓 P活性阻害剤など の医薬、 その開発研究手段などが樹共される。
本発明は、 前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、 実行できることは明 らカ、である。上述の教示に鑑みて、 本発明の多くの改¾¾ぴ¾¾が可能であり、 従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。本件は特願 2000- 352491号（出願日： 平成 12年 11月 20日） を優先 ¾張の基礎とする出願であって 、 当該出願に添付の明細書の内容はそれを参照することにより本明細書に含めて 解釈されるべきものである。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 膨結合型マトリックスメ夕口プロテアーゼ類 (MT-匪 Ps) から成る群か ら選ばれた MT- MPに対する抗体を用いることを |敫とする MT- MMPの免疫学的 法。
2. MMP-14 (MT卜匪 P)に対する抗体， MMP-15 (MT2 - MMP)に対する抗体， 醒 P-16 (MT3— MMP)に対する抗体， MMP-17 (MT4-匪 P)に対する抗体， MMP-24 (MT5-MM P)に対する抗体及び 25 (MT6-MMP)に対する抗体から成る群から選ばれた抗体 を用いることを とする請求項 1言己載の免疫学的 法。
3. MT1-MMPに対する抗体を用 、且つ MT卜 MMPの免疫学的錢をすること を特徵とする請求項 1又は 2記載の免疫学的 法。
4. 界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いることを特 徵とする請求項 1〜 3の 、ずれか一記載の免疫学的 法。
5. 抗体が、 （0界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものの存 在下で免疫反応性を »できること及び（i i)人為的に変性してェピトープを露 出させた MT-MMPを免疫攝として得られること力、ら成る群から選ばれた 敫の少 なくとも一つを持つものであることを樹敫とする請求項 1〜 4のいずれか一記載 の免疫学的趙法。
6. 抗体がモノクロ一ナル抗体であることを特徴とする請求項 1〜 5のい ずれか一記載の免疫学的錢法。
7. 免疫学的に できる MT-羅 Pが、 （i)界面活性剤及び還元剤から成る 群から選ばれたものを用レ、て細胞膜から遊 び Ζ又は可溶化させた分子及び (i i)自律的に細胞膜から遊离鼠び/又は可溶化した分子から成る群から選ばれた分 子種の少なくとも一つであることを特徵とする請求項 1〜 6の 、ずれか一記載の
8. (a) 界面活性剤及び還元剤から成る群から連ま'れたものを用いて MT - M MPを細謹から遊誕び/又は可溶化させる工撒び（b) MT-MMPを免疫学的に する工程を含むことを ¾とする請求項 1〜 7の 、ずれか一記載の免疫学的
9. 界面活性剤がドデシル硫酸ナトリゥム (SDS) であることを 1敷とする 請求項 4〜 8の 、ずれか一記載の免疫学的錢法。
10. 還元剤力 ¾ -メルカプトェタノールであることを斗纖とする請求項 4〜 8のいずれか一記載の免疫学的趕法。
11. 請求項 1〜10のいずれか一記載の免疫学的定量法に使用するための MT 省の免疫学的測定用織。
12. MT-MMP力 MT1-MMP, MT2- MP, MT3-MMP, MT4- MP, MT5-MMP及び ΪΓ6- MPカヽら成る群から週ま'れたものであることを頓敫とする請求項 11記載の蘭。
13. MT-MMP力 MT1-MMPであることを樹敫とする請求項 11記載の難。
14. 界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを含有しているこ とを特徵とする請求項 11〜13の 、ずれか一記載の ra。
15. 界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用いて、 MT-MMP s力、ら成る群から選ばれたものを、 細胞膜から遊誕ぴン又は可溶化させること を特徴とする MT- MMPの遊离! ¾び/又は可溶化方法。
16. 界面活性剤が SDSであることを樹敷とする請求項 15記載の方法。
17. 還元剤力く 2-メルカプトェタノ一ルであることを糊敫とする請求項 15記 載の方法。
18. MT-MMP力、 MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP, MT5 -固 P及び ¾ - MMPカヽら成る群から選ばれたものであることを特徵とする請求項 15〜17のいずれか 一記載の方法。
19. MT-MMP力く、 MT1-MMPであることを樹!:とする請求項 15〜17のいずれ力、 一記載の方法。
20. (a)請求項 1〜10のいずれか一記載の免疫学的 法あるいは (b)請 求項 15〜19のいずれか一記載の方法に iffflするためのものであることを特徴とす る MT- MMPを遊离! ¾び/又は可溶化する 。
21. 界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを含有して 、るこ とを特徴とする請求項 20記載の ¾¾。
22. MT-MMP力く、 MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4- MP, MT5-MMP及び T6 - MMPカヽら成る群から選ばれたものであることをキ纖とする請求項 20又は 21記載の
23. MT-MMP 、 MT1-MMPであることを特徴とする請求項 20又は 21記載の試 。
24. (a)請求項 1〜10のいずれか一記載の免疫学的 法、 (b)請求項 11 〜14のいずれか一記載の （c)請求項 15〜19のいずれか一記載の方法及び (d )請求項 20〜23のいずれか一記載の難から成る群から選ばれたものを用い、 且 つ MT- MPsから成る群から選ばれたものの発現を促進または阻害する化合物をス クリ一ニングすることを特徵とするスクリ一ニング方法。
25. 被検化合物の存在下及び非存在下にスクリ一ニングを ί亍ぃ、被検化合 物の存在下及び 下での各結果を比較することを特徵とする請求項 24記載の スクリーニング方法。
26. MT1-MMP, ΜΤ2-ΜΜΡ, ΜΤ3-ΜΜΡ, ΜΤ4-ΜΜΡ, ΜΤ5-删 Ρ及び Τ6-讓 Ρから成る 群から選ばれた ΜΤ-删 Ρの発現を促進または阻害する化合物をスクリ—ニングする ことを特徵とする請求項 24又は 25記載のスクリ一二ング方法。
27. ΜΊΊ-匪 Ρの発現を促進または阻害する化合物をスクリ一ニングすること を樹敫とする請求項 24又は 25記載のスクリーニング方法。
28. 言青求項 24〜27の ヽずれか一記載のスクリーニング方法に使用するため の、 MT-MMPsカヽら成る群から選ばれたものの発現を促進または阻害する化合物の スクリーニングキット。
29. (a) MT-MMPs力、ら成る群から選ばれた MT-固 Pに対する抗体、 (b)界面 活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたもの及び（c)免疫学的方法で固相化さ れた MT-顯 Pから成る群から遷ま'れたものを含有することを糊敷とする請求項 28記 載のキット。
30. MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP, MT5-匪 P及び" MT6- MMPから成る 群から選ばれた MT- MPの発現を促進または阻害する化合物のスクリ—ニングのた めのものであることを樹敫とする請求項 28又は 29記載のキット。
31. MT1-固？の を促進または阻害する化合物のスクリ一二ングのための ものであることを樹 I：とする請求項 28又は 29記載のキット。
32. 免疫学的方法で固相化された MT-MMPの酵素活性を測定することを特徵 とする測^法。
33. MT-副 Pの酵素活性を定量的に測定することを特徴とする請求項 32記載 の方法。
34. 固相化された MT - MMP力、 棚 T-丽 P抗体を介して選択的に固相ィヒされた ものであることを特徴とする請求項 32又は 33記載の方法。
35. MT -匪 P力、 MT1-MMP, MT2-MMP, MT3 -匪 P， MT4-MMP, MT5-MMP及び" MT6 - MMP力、ら成る群から選ばれたものであることを置とする請求項 32〜34のいずれ か一記載の方法。
36. MT- MMP力 MT1- MPであることを特徴とする請求項 32〜34の 、ずれか 一記載の方法。
37. MT-固 P力、 （i)界面活性剤及び還元剤から成る群から運ま'れたものを 用 、て細胞膜力、ら遊离扱び Ζ又は可溶化させた好及び (i i)自律的に細胞膜力、ら 遊离級び/又は可溶化した好から成る群から選ばれた分子種の少なくとも一つ であることを特徵とする請求項 32〜36のいずれか一記載の方法。
38. (a)界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用 ヽて ΜΤ-删 Ρ を細胞膜から遊蔽び/又は可溶化させるェ禾 1¾び (b) MT-删 Pの酵素活性を測定 する工程を含むことを特徴とする請求項 32〜37のいずれか一記載の方法。
39. 免疫学的方法で固相化された MT-固 P。
40. 御 T-匪 P抗体を介して選択的に固相ィ匕されたものであることを ϋと する請求項 39記載の固相化された ΜΤ-匪 Ρ。
41. 擴 T- MMP抗体が、 MT - MMPのへモぺキシン様ドメィンを認識する抗体で あることを樹敫とする請求項 40記載の固相化された MT-國 P。
42. MT省が'、 MT1- MP, MT2- MP, MT3 -應 P， T4- MP, MT5 -層及び ΪΓ6 - 匪 Pカヽら成る群から選ばれたものであることを特徴とする請求項 39〜41のいずれ か一記載の固相化された MT -画 P。
43. MT- MMP力 MT1-MMPであることを特徴とする請求項 39〜41のいずれ力、 一記載の固相化された MT- MMP。
44. (i) 請求項 32〜38のいずれか一記載の方法、 あるいは（i i)請求項 39〜 43のレ、ずれか一記載の固相化された MT - MMPを用 こ、 MT-匪 Pの酵素活性を促進ま たは阻害する化合物のスクリーニング方法。
45. 被検化合物の存在下及び非存在下にスクリ一ニングを亍 被検化合 物の存在下及び非存在下での各結果を比較することを特徴とする請求項 44記載の スクリーニンク、'方法。
46. 請求項 32〜38のいずれか一記載の方法に使用するための、 ΜΤ -匪 Ρの酵 素活性を促進または阻害する化合物のスクリーニングキット。
47. 請求項 39〜43のいずれか一記載の固相ィ匕された ΜΤ-匪 Ρを含有して 、る ことを糊敫とする請求項 46記載のキット。
48. (a)請求項 24〜27のいずれか一記載の方法で得られ且つ MT-塵 Psから 成る群から遷ま'れたものの発現を促進または阻害する化合物、 (b)請求項 28〜31 のいずれか一記載のキットを麵して得られ且つ MT -匪 Psから成る群から運ま'れ たものの発現を促進または阻害する化合物、 （c)請求項 44又は 45記載の方法で得 られた MT-匪 Pの酵素活性を促進または阻害する化合物及び（d)請求項 46又は 47記 載のキットを^ fflして得られた MT- MMPの酵素活性を促進または阻害する化合物か ら成る群から選ばれたものを含有していることを とする医薬。
49. T1-MMP, T2- MP, MT3-MMP, MT4-MMP, MT5-應 P及び T6 -議 Pから成る 群から運ま'れた MT-應 Pの発現を促進または阻害する化合物又は該 MT-画 Pの酵素活 性を促進または阻害する化合物を含有していることを樹敫とする請求項 48記載の
50. ΜΉ-匪 Pの発現を促進または阻害する化合物又は MT1- MMPの酵素活性を 促進または阻害する化合物を含有していることを樹敫とする請求項 48記載の医薬
51. (i)請求項 1〜10の 、ずれか一記載の免疫学的 法又は (i 0請求項 32〜38の 、ずれか一記載の方法により、 MT- MMPsから成る群から選ばれたものを 測定するものであることを樹敫とする癌; «または癌転移;！ «¾。
52. (A) ( i )界面活性剤及び還元剤力、ら成る群から選ばれたものを用いて、 細胞膜から遊艱ぴノ又は可溶化させた分子及び (i i)自律的に細胞膜から遊賺 び/又は可溶化した分子力、ら成る群から選ばれた分子種の少なくとも一つである MT - MPの量を指標として使用し、 癌の悪'隨を 面する又は癌転移能を Hffiする 力、、 あるいは （B) (i i i)界面活性剤及び還元剤から成る群から選ばれたものを用 いて細胞膜から遊离！ ¾び/又は可溶化させた分子及び (iv)自律的に細胞膜から遊 离！ ¾ぴゾ又は可溶化した好から成る群から選ばれた分子種の少なくとも一つで ある MT-画 Pの酵素活性の量を指標として删し、 癌の悪膝を割 ffiする又は癌転 移能を割面することを樹敫とする請求項 51記載の^ ¾薬。
53. MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP, MT5-匪 P及び 6-固 Pから成る 群から還ま'れた MT-匪 Pを測定するものであることを特徽とする請求項 51又は 52記
54. MT1-匪 Pを測定するものであることを特徴とする請求項 51又は 52記載の
55. ΜΊΊ-删 Pに対する抗体， T2- MPに対する抗体， MT3-應 Pに対する抗体 , MT4-MMPに対する抗体， MT5-MMP に対する抗体及ひ ΜΓ6-匪 Pに対する抗体から 成る群から選ばれた抗体を含有していることを特徴とする請求項 51〜53の ヽずれ か一記載の検査薬。
56. MT卜匪 Pに対する抗体を含有していることを 4纖とする請求項 51， 52又 は 54記載の検査薬。
57. MH- M Pの酵素活性を測定するものであることを特徵とする請求項 51、 52、 54又は 56記載の^ ¾薬。
58. MT- MMPsから成る群から選ばれた MT-匪 Pに対する抗体であつて、 且つ (i)界面活性剤及び還元剤から成る群から連ま'れたものの存在下で免疫反応性を 膽できること及び (Π)人為的に変性してェピトープを露出させた I 羅 Ρを免疫 抗原として得られることから成る群から遷ま'れた特徵の少なくとも一つを持つも のであることを特徴とする抗体。
59. Π- ΜΡに対する抗体， MT2-MMP に対する抗体， MT3-MMPに対する抗体 , MT4-MMPに対する抗体， MT5- MPに対する抗体及び T6-匪 Pに対する抗体から 成る群から遷ま'れたものであることを特徴とする請求項 58記載の抗体。
60. 抗体がモノク口一ナル抗体であることを とする請求項 58又は 59記 載の抗体。
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