WO2002033074A1 - Protéine artificielle à immunogénicité d'épitope potentialisée - Google Patents

Protéine artificielle à immunogénicité d'épitope potentialisée Download PDF

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acid sequence
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Kiyotaka Shiba
Tsuneya Ohno
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Japan Science And Technology Corporation
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Definitions

  • the present invention relates to an artificial protein with enhanced immunogenicity of an epitope, an inducer of an immune response comprising the artificial protein, a method for producing an antibody using the artificial protein as an antigen, and a method for producing an antibody.
  • Functional food containing protein as an active ingredient desensitization of intestinal bacteria expressing human eta protein, inducer of immune tolerance, DNA encoding artificial protein And a DNA vaccine for inducing an immune response.
  • RNA populations with various diversity For example, a group of Szostak et al., The DNA population with a random sequence having a length of 1 0 0 salt group papermaking create a DNA synthesizer, and transcribed into RNA this DNA population in vitro, 1 0 1 3 Prepare RNA populations with various diversity, select RNA molecules that specifically bind to specific dyes from this RNA population, Report whether a molecule satisfies a given function
  • the present inventors have proposed a method for efficiently and simply producing a repetitive polymer of microgenes by applying DNA polymerase to oligonucleotides A and B, at least a part of which are complementary to each other.
  • a Mike-mouth gene polymerization method Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 9-3222775
  • the polymerization reaction is carried out by causing the polymerization reaction, is proposed.
  • DNA encoding an amino acid polymer having a repeating unit similar to a repeating unit of a natural protein such as silk protein or elastin Japanese Patent Application Laid-Open No. H10-14886
  • Gene cassette encoding a protein US Pat. No. 5,089,046
  • synthetic repetitive DNA for producing large polypeptides having a repeating sequence of amino acids US Pat. No. 5,614,164
  • a DNA sequence encoding a peptide having an amino acid repeating unit US Pat. No. 5,770,097.
  • synthetic repetitive DNAs for the production of large polypeptides containing repetitive sequences of amino acids US Pat. No. 5,830,713
  • one of the six reading frames designed an ⁇ ; a DNA fragment that easily formed a helical structure, and the library created therefrom frequently encodes a stable protein. It was reported that one of the reading frames designed a DNA fragment that easily formed an
  • the problem of the present invention is that Peptide-type epitopes for which sufficient immune response-inducing activity cannot be obtained.
  • Another object of the present invention is to provide a method for imparting a strong immune response-inducing ability. More specifically, production of artificial proteins with enhanced immunogenicity of epitopes, inducers of immune response containing the artificial proteins, and antibodies using the human protein as antigens Method, a functional food containing the artificial protein as an active ingredient, an inducing agent for desensitization and immune tolerance comprising intestinal bacteria expressing the artificial protein, and a DNA encoding the artificial protein.
  • the present invention provides a DNA vaccine for inducing an immune response comprising
  • peptide peptides In order for peptide peptides to have sufficient antigenicity, the peptide peptides are efficiently taken up by immunocompetent cells, processed, and then efficiently converted to B cells and T cells by MHC molecules. Must be presented. In order for such “incorporation”, “processing”, and “presentation by MHC” reactions to proceed efficiently, it is considered that the peptidic epitope must be present in a context close to the natural protein. Based on this idea, we designed and designed an “artificial protein with properties close to a natural protein that has at least one copy of a peptide-type epitope” and conducted an experiment to examine the immunogenicity of this artificial protein was first implemented.
  • the region called loop 3 of the gp120 protein of the AIDS virus is known as a neutralizing epitope, and some antibodies against this epitope have a neutralizing activity such as suppressing the growth of the virus. It is an important antibody that can be used for the treatment of disease. It is known that the AIDS virus rapidly changes its own gene sequence, thereby changing the amino acid sequence of the loop 3 region and evading the attack from this neutralizing antibody. During ⁇ From the viewpoint of clinical use of Japanese antibodies, it is necessary to rapidly produce a new neutralizing antibody against the newly emerged AIDS virus mutant, but the gp120 protein itself can be used as an immunogen.
  • an artificial protein that has at least one copy of the loop 3 peptide sequence in its structure while having “property close to that of a natural protein as a whole” was prepared, and an efficient immunity induction method using this was made. Tried ( Figure 1).
  • the production of artificial proteins includes “multifunctional base sequences and artificial genes containing the same” (Japanese Patent Application No. 2000-180,977) and “microgene polymerization method” (Japanese Patent Application Laid-Open No. No. 2,775,757).
  • RKS IRI QRGP GRT F VT I GKI known as a neutralizing antigen of AIDS virus in one of the reading frames.
  • the first R corresponds to the six codons “C GT”, “C GC”, “C GA”, “C GG”, “AGA”, and “AGG”.
  • the next (lysine) corresponds to the two codons “AAA” and “AAG”. From these, specific codons are selected, and in the same manner, specific codons are sequentially selected to design microgenes.
  • the number of nucleotide sequences encoding the neutralizing antigen peptide in one of the reading frames is about 160.1 billion due to the degeneracy of codons.
  • a single microgene has three reading frames on each of the plus and minus strands, it is possible to encode six different peptides, for example, two different reading frames in the same direction. In the reading frame, two peptides completely different from the neutralizing antigen peptide are encoded. Therefore, a nucleotide sequence encoding a peptide having the property of “easy to form a secondary structure” in one of the two other reading frames in the same direction was selected from the above-mentioned approximately 165 billion base sequences. We decided to search by computer.
  • This microgene “design—25,” encodes a neutralizing antigen sequence in one of its reading frames, has no stop codon in the other two reading frames, and has an alpha in one of them. It encodes a peptide that easily forms a helix, and can be said to be a micro-mouth gene in which two biological functional structures such as “AIDS virus neutralizing antigen” and “structure-forming ability” are latent.
  • the microgene “design one 25” was polymerized by using the microgene polymerization method by the present inventor (Japanese Patent Laid-Open No.
  • the present invention provides an artificial protein having enhanced immunogenicity of a peptide, which comprises an amino acid sequence containing the whole or a part of the amino acid sequence of a peptide-type epitope. 1) or the whole or a part of the amino acid sequence of peptide peptides, 2.
  • the amino acid sequence containing the whole or a part of the amino acid sequence of the artificial protein (Claim 6) or peptidic epitope in which the amino acid sequence is enhanced is an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 24 to 47.
  • the present invention also relates to an agent for inducing an immune response, comprising an artificial protein having enhanced immunogenicity of the peptide according to any one of claims 1 to 7 (claim 8).
  • a method for producing an antibody comprising using an inducer of an immune response (claim 10) or an artificial protein with enhanced immunogenicity of the epitope according to any one of claims 1 to 7 as an antigen ( Claim 11 1) or the antibody is a monoclonal antibody.
  • the method for producing an antibody according to claim 11 (claim 12) or the antibody (claim 13) obtained by the method for producing an antibody according to claim 11 or 12 A cell that produces the antibody according to claim 13 (claim 14) or an expression system that can express an artificial protein with enhanced immunogenicity of the epitope according to any one of claims 1 to 7
  • the present invention relates to an agent for inducing desensitization and immunological tolerance (claim 17).
  • the present invention provides a DNA encoding an artificial protein with enhanced immunogenicity of the epitope according to any one of claims 1 to 7 (claim 18), and when the reading frame of the nucleotide sequence is different, A peptide peptide is encoded in at least one reading frame of the base sequence, and a peptide capable of imparting a property that enhances the antigenicity of the peptide peptide to another reading frame is encoded.
  • the DNA vaccine for inducing an immune response according to claim 20 (claim 22)
  • the present invention relates to the functional food (claim 24) according to claim 23, which can induce the following.
  • FIG. 1 shows an artificial protein with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention. It is a figure for explaining that high-quality immunity guidance ability is acquired.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of a flow of an operation for calculating an automatic design of microgenes.
  • FIG. 3 is a diagram showing a designed microphone gene comprising a designed double-stranded multifunctional DNA sequence and the amino acid sequence encoded thereby.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of DNA encoding an artificial protein with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing one f! J of DNA encoding a human protein with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention, and is a continuation of FIG. 4.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of an artificial protein with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention.
  • FIG. 7 is a view showing an example of an artificial protein having an enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention, and is a continuation of FIG.
  • FIG. 8 is a diagram showing an example of a human protein with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention, and is a continuation of FIG. 7.
  • FIG. 9 is a view showing an example of an artificial protein with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention, which is a continuation of FIG.
  • FIG. 10 shows the results of ELISA of antisera obtained by using artificial proteins with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention.
  • FIG. 11 shows the results of ELISA of various dilutions of antisera obtained using artificial proteins with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of ELISA of antisera obtained using other artificial proteins with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of ELISA of antisera obtained using another artificial protein with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention.
  • Examples of the human protein with enhanced immunogenicity of the peptide of the present invention include: a protein or a peptide composed of an amino acid sequence containing the whole or a part of the amino acid sequence of a peptide type epitope;
  • the artificial protein is not particularly limited as long as it is present, and the artificial protein is a non-naturally occurring protein or peptide, for example, as described in the aforementioned literature (Vaccine 17: 2392-2399, 1999).
  • Known tandem polymers of peptide epitopes such as fusions of HIV gp120 loop 3 peptide tandem polymers and carrier proteins, known peptide epitopes or known peptides
  • a fusion protein or fusion peptide of a tandem polymer of a sex peptide with a known carrier protein is excluded.
  • the artificial protein with enhanced immunogenicity of the epitope include an amino acid sequence containing all or a part of the amino acid sequence of a peptide epitope and having a property to assist the formation of higher-order structure of protein.
  • Artificial protein composed of an amino acid sequence composed of an amino acid sequence containing all or a part of the amino acid sequence of a peptide-type epitope, and having the property of assisting antigen presentation processing by immunocompetent cells. It can be suitably exemplified.
  • properties that assist the formation of higher-order structures of the above proteins include properties related to helical formation ability, secondary structure formation ability, and ability to improve hydrophobicity.
  • Examples of the assisting property include properties relating to the ability to improve affinity with class I and class II MHC molecules, and various properties similar to those of a natural protein can be added. it can.
  • An amino acid sequence having these useful properties can be prepared by adjusting the amino acid composition or the repeatability of the sequence, or by referring to a known sequence retaining such properties.
  • the immunity of the epitope of the present invention As an amino acid sequence other than the amino acid sequence derived from the amino acid sequence of the epitope of the artificial protein with enhanced protogenicity, a peptide sequence or an antigen by immunocompetent cells capable of imparting a property to assist the formation of a higher-order structure of the above protein
  • a peptide sequence that can provide properties that assist the presentation process for example, a peptide sequence that has a sugar addition signal can also be used.
  • the synthesized natural protein can be modified with a sugar.
  • the artificial protein of the present invention may be, for example, a protein-monosaccharide hybrid artificial protein.
  • the gp120 loop of HIV which is an immunogenic extremely weak peptide peptide
  • the artificial protein having the enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention including these human peptides or human proteins, can provide an immune response for inducing an immune response such as humoral immunity or cellular immunity in a living body. It can be used as an inducer (drug) agent.
  • the DNA encoding the artificial protein with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention includes a peptide-type epitope in at least one open reading frame of the base sequence when the reading frame of the nucleotide sequence is different.
  • Examples of DNA encoding a peptide capable of imparting a property that enhances the antigenicity of peptidic epitopes include, for example, expression vectors incorporating such DNA, such as cell-mediated immunity and humoral immunity. It can be used as a DNA vaccine for inducing an immune response.
  • the present invention also relates to an artificial animal in which the immunogenicity of the above-described epitope of the present invention is enhanced.
  • the host cells include Salmonella, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Streptococcus, Saccharomyces bacterium, and other prokaryotic cells such as yeast and Aspergillus.
  • Fungal cells insect cells such as Drosophila S2, Spodoptera Sf9, L cells, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, BALB / c3T3 cells (reduct dihydrofolate) (Including mutants deficient in thymidine kinase etc.), animal cells such as BHK21 cells and HEK293 cells, and plant cells.
  • Intestinal bacteria such as Salmonella Can be preferably exemplified.
  • intestinal bacteria expressing such an artificial protein are administered to a living body, desensitization and immunological tolerance can be induced. Therefore, these intestinal bacteria can be expected as an inducer of desensitization / immunotolerance.
  • the expression system may be any expression system capable of expressing the artificial protein with enhanced immunogenicity of the above-described epitope of the present invention in a host cell.
  • Expression systems derived from episomes and viruses for example, vectors derived from bacterial plasmid, yeast plasmid, papovavirus such as SV40, vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus, retrovirus And vectors derived from pacteriophages, transposons, and combinations thereof, for example, those derived from plasmids such as cosmid-p-phagemid and genetic elements of bacteriophage.
  • the expression system may contain control sequences that regulate expression as well as cause expression. Also, a series of expression vectors that can be translated by changing the reading frame can be advantageously used.
  • DNA encoding the human protein of the present invention into an expression system incorporating DNA encoding the artificial protein into host cells is described by Davis et al. (BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) and in many standard laboratory manuals, such as Sambrook et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • the method for producing the artificial protein of the present invention is not particularly limited as long as it is a conventionally known method for producing a protein.
  • a host cell is transformed by incorporating a DNA encoding the artificial protein into an expression vector.
  • it can be obtained by culturing the transformed cells or by a peptide synthesis method.
  • the DNA encoding the artificial protein can be produced, for example, by using the Mic-mouth gene polymerization method as described in the Examples, in which case the human epitope added to the base sequence encoding the epitope is used.
  • the nature of the protein may be in the same reading frame or different reading frames of the microphone gene, but the production of DNA encoding the artificial protein is not limited to these methods. Absent.
  • a base sequence encoding a polyhistidine residue may be present in the translation region derived from the expression vector to separate and purify a polyhistidine residue and the like in a part of the amino acid sequence of the artificial protein. You can also have a peptide dinner for your use.
  • the artificial protein of the present invention can be used as a fusion protein or fusion peptide in which a marker protein and Z or a peptide tag are bound.
  • the marker protein is not particularly limited as long as it is a conventionally known marker protein, and specific examples thereof include alkaline phosphatase, the Fc region of an antibody, HRP, and GFP.
  • Specific examples of peptide tags include conventionally known peptide tags such as Myc tag, His tag, FLAG tag, and GST tag.
  • Such a fusion protein or fusion peptide can be produced by a conventional method, and it purifies the artificial protein of the present invention using the affinity of Ni—NTA and His tag, and a protein having T cell inducing activity. It is also useful as a detection reagent, a quantification of an antibody against the artificial protein of the present invention, a marker for diagnosing immunodeficiency, etc., and also as a research reagent in the field.
  • the method for producing the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it is a method using a human protein with enhanced immunogenicity of a peptide as an antigen.
  • immunospecific antibodies such as polyclonal antibodies, chimeric antibodies, single-chain antibodies, and humanized antibodies.
  • These include artificial proteins or artificial proteins with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention.
  • Some of them can be prepared by the conventional method using as a bobara.
  • monoclonal antibodies are preferable in terms of their specificity, and in particular, monoclonal antibodies having a neutralizing activity against the growth of AIDS virus are more preferable. .
  • Such an antibody such as a monoclonal antibody is useful, for example, for clarifying not only the treatment of immunodeficiency such as AIDS but also the pathogenesis of immunodeficiency such as AIDS.
  • the antibody of the present invention can be prepared by using a conventional protocol to prepare an artificial protein or a part thereof, in which the immunogenicity of the epitope of the present invention is enhanced in animals (preferably other than humans). Or produced by administering a cell expressing a complex of a part of the artificial protein and MHC on the membrane surface, for example,
  • monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method (Nature 256, 495-497, 1975), the trioma method, or the human B cell hybridoma method (Immunology Today), which results in antibodies produced by continuous cell line cultures. 4, 72, 1983) and the EBV-hybridoma method (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
  • a method for preparing a single-chain antibody (US Pat. No. 4,946,778) can be applied. Further, in order to express a humanized antibody, transgenic mice or other mammals or the like are used. Can be isolated and identified, or the polypeptide can be purified by affinity chromatography. Antibodies to artificial proteins having enhanced immunogenicity of the epitopes of the present invention and peptides containing the antigenic epitopes may be used for diagnosis and treatment of immunodeficiency diseases such as AIDS.
  • the cells producing the above-mentioned antibodies of the present invention are preferably cell lines in culture, for example, monoclonal antibody-producing hybridomas, cell lines B and the like.
  • the functional food of the present invention may be any food as long as it contains an artificial protein with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention as an active ingredient. It can be obtained by adding or blending in the production process or after production.
  • Such functional foods are not particularly limited, and include baked goods such as cookies, breads, cakes, rice crackers and the like, tablet confections such as ramune confections, Japanese sweets such as yokan, chilled confections such as pudding, jelly, ice cream, etc. , Chewing gum, candy, etc., crackers, chips, etc.
  • the microphone mouth gene was constructed according to Considering the processing capacity of the computer, the 20 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 1 are three amino acid sequences that are partial sequences that partially overlap each other, that is, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: Each of the peptides was divided into peptides consisting of the three amino acid sequences shown in Fig. 4, and calculations were performed for each.
  • SEQ ID NO: 4 The same calculation as above was performed for SEQ ID NO: 4, and in the first reading frame, a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 was identified, and in the second reading frame, a peptide having a high possibility of forming a helix was determined.
  • An amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 which encodes and has the first to third amino acid sequence of the peptide corresponding to the 11th to 13th amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 A row of peptides was selected.
  • This peptide is an amino acid sequence encoded in the second reading frame of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 10 obtained by the above operation were linked together with consideration of duplication, and a migrant gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 "Design 1 2 5" was obtained.
  • the designed microgene as shown in Figure 3, encodes a partial sequence of the gp120 protein of a group of HIV virus variants in the first reading frame and 0 in the second reading frame. ! Encodes a peptide sequence that easily forms a helical structure.
  • the minus strand of the micromouth gene (sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 11) is subject to additional restrictions such as avoidance of a stop codon.
  • the microgene A polymer library was prepared.
  • KY-119 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 was used as the oligonucleotide A serving as the base for polymerization
  • KY- of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 was used as the oligonucleotide B. 1 198 was synthesized and used.
  • Both the 10 nucleotides on the 3 'side of oligonucleotide A consisting of 34 nucleotides and the 10 residues on the 3' side of oligonucleotide B consisting of 36 nucleotides are complementary to each other except for the 3 'end. It is configured as a typical arrangement.
  • the conditions for the polymerization reaction using oligonucleotide A and oligonucleotide B are as follows for a reaction volume of 50 L.
  • DNA polymerase (“Vent R ” manufactured by New Grand Biolabs) was added for 5.2 units.
  • the polymerization reaction was performed using a Parkin 'Elma company's 2400 GeneAmp PCR system.
  • the reaction conditions were as follows: heat denaturation at 94 ° C for 10 seconds; cycle at 66 ° C for 60 seconds; performing cycle and elongation; repeated 55 cycles, final extension at 66 ° C For 7 minutes.
  • the artificial gene of the present invention obtained as a polymerization reaction product was cloned into a plasmid vector pTZ19R (Protein Eng., 1: 67-74, 1986), and the base sequence of the inserted DNA fragment was sequenced. (Parkin 'Elma).
  • FIGS. 10 cloned DNA fragments i.e., pTH127, pTH133, pTH136, pTH142, pTH143, pTH145, pTH155 , PTH167, pTH177 and pTH176 are shown in FIGS.
  • pTH133, pTH142, pTH143 and pTH167 have long lengths of their fragments and, due to their repetitive sequence properties, their full-length bases. Since the sequence could not be determined, the partial sequence is shown in FIGS.
  • FIGS. 4 and 5 are shown in SEQ ID NOs: 14 to 23, respectively.
  • the inserted sequence of p TH 178 and p TH 136 transferred to 600 was transferred to p KS 600 and the inserted sequence of p TH 179 and p TH 143 was transferred to p KS 6.
  • the inserted sequence of pTH180 and pTH145 transferred to 0 0 is replaced by the inserted sequence of pTH181 and pTH155 transferred to pKS610.
  • the inserted sequence of pTH182 and pTH167 transferred to 1 was transferred to pKS601, and the inserted sequence of pTH183 and pTH171 transferred to pKS601.
  • the inserted sequence of pTH184 and pTH176 was transferred to pKS601, and the inserted sequence of pTH185 and pTH127 was transferred to pKS603.
  • the transfer sequence of p TH 167 was transferred to p KS 603, The inserted sequence was transferred to pKS603, and pTH19
  • FIGS. 6 to 9 show only the peptide sequence of the N-terminal region for only the partial sequence of the polymer base sequence.
  • the insertion peptide sequence of pTH177 shown in FIGS. 6 to 9 is inserted into SEQ ID NO: 24, the input peptide sequence of pTH178 is inserted into SEQ ID NO: 25, and the insertion of PTH179 is inserted.
  • SEQ ID NO: 26 for the peptide sequence
  • SEQ ID NO: 27 for the inserted peptide sequence of pTH180
  • SEQ ID NO: 28 for the inserted peptide sequence of PTH181
  • inserted peptide for pTH182 The sequence is shown in SEQ ID NO: 29, the input peptide sequence of pTH183 is shown in SEQ ID NO: 30, the input peptide sequence of pTH184 is shown in SEQ ID NO: 31, and the sequence of PTH185 is shown in SEQ ID NO: 31.
  • the inserted peptide sequence is shown in SEQ ID NO: 32
  • the inserted peptide sequence of PTH186 is shown in SEQ ID NO: 33
  • the inserted peptide sequence of PTH187 is shown in SEQ ID NO: 34
  • pTH1 The inserted peptide sequence of 88 is shown in SEQ ID NO: 35
  • the input peptide sequence of pTH189 is shown in SEQ ID NO: 36
  • the input peptide sequence of PTH190 is shown in SEQ ID NO: 36.
  • SEQ ID NO: 37 The sequence is shown in SEQ ID NO: 37, the input peptide sequence of pTH191 is shown in SEQ ID NO: 38, the inserted peptide sequence of pTH192 is shown in SEQ ID NO: 39, and the inserted peptide sequence of PTH193 is shown in SEQ ID NO: 39.
  • SEQ ID NO: 40 for the peptide sequence
  • SEQ ID NO: 41 for the insertion peptide sequence of pTH194
  • SEQ ID NO: 42 for the insertion peptide sequence of pTH195
  • SEQ ID NO: 42 for pTH196 The sequence is shown in SEQ ID NO: 37, the input peptide sequence of pTH191 is shown in SEQ ID NO: 38, the inserted peptide sequence of pTH192 is shown in SEQ ID NO: 39, and the inserted peptide sequence of PTH193 is shown in SEQ ID NO: 39.
  • SEQ ID NO: 41 for the insertion peptide sequence of pTH
  • the inserted peptide sequence is shown in SEQ ID NO: 43
  • the inserted peptide sequence of pTH 197 is shown in SEQ ID NO: 44
  • the inserted peptide sequence of p TH 198 is shown in SEQ ID NO: 45
  • the inserted peptide sequence of PTH 199 is shown in SEQ ID NO: 45.
  • the input peptide sequence is shown in SEQ ID NO: 46
  • the input peptide sequence of pTH200 is shown in SEQ ID NO: 47.
  • coli XL IB lue lines with each expression bra corner de starting at 3 7 ° C, are expressed inducing agent when the OD 6 6 Q of the culture solution reached 0.2 IPTG was added to a concentration of 0.24 gZ 1, culture was continued for another 3 hours, and the culture was centrifuged at 3,000 g for 10 minutes to collect the cells.
  • N a H 2 PO 4 in lysis buffer (5 0 mM of 4 0 m l the bacteria mentioned above collecting bacteria (p H 8. 0), 1 0 mM in T ris - HC 1 (p H 8. 0), 6 Suspended in M guanidine hydrochloride, 100 mM NaC then ImM PMS F), incubated at 37 ° C for 1 hour, and centrifuged at 7,000 g x 30 minutes. Mix the supernatant with 4 ml of 50% TALON resin (Clontech) pre-equilibrated with lysis buffer, and gently mix for 20 minutes at room temperature. Then, the mixture was centrifuged at 700 g ⁇ 5 minutes.
  • the purified protein bound to the TALON resin was eluted with MES (pH 5.0), 8 M urea, 100 mM NaCl, and 25 OmM imidazole.
  • the eluted fraction containing the purified protein was dialyzed against 50 mM Tris-acetic acid, pH 4.0, 100 mM NaC, and ImM EDTA (Pierce, molecular weight cut off 10,000). After concentration with an ultrafiltration membrane (Amicon, Centrip, molecular weight cut off 10,000), the concentration was measured and used as a purified sample.
  • the 20 purified proteins were divided into 3 doses every 3 weeks, and 20 to 25 g were immunized by injecting each of 5 mice (BAL BZc) into a total of 100 spleens for final immunization. Blood was collected from mouse retinal blood vessels 5 days after. In addition, 5 mice (BAL BZc) were similarly immunized using a 40-mer synthetic peptide containing the HIV gp120 loop 3 region, I NCTR PNNNTRKS IRI QRGP GRT FNT IGKI GNMR Q AH CNI (SEQ ID NO: 48). ) was used as a control (V3).
  • an ELISA experiment was performed using a 40-mer synthetic peptide containing the HIV gp120 loop 3 region by a conventional method, and the immunity-inducing ability was evaluated.
  • mouse serum was adsorbed as a primary antibody, washed, and then bound with peroxidase as a secondary antibody.
  • Hit A di-anti-mouse IgG antibody (Amersham Pharmacia Biotech) was added, and after washing, the color was developed using OPD (o-Phenylenediamine) as a substrate, and the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured.
  • mice immunized with a 40-mer synthetic peptide containing the HIV gp120 loop 3 region did not give the expected results with antisera against the synthetic peptide
  • FIG. The same sample used in the experiment was mixed in 5 mice with the same antigen, and after various dilutions, a synthetic peptide having the sequence of 4 Omer containing the HIV gp120 loop 3 region was used as the antigen.
  • the results of the ELISA experiment are shown in FIG. This result indicates that antibodies to a portion of the engineered protein corresponding to the gp120 loop 3 sequence are produced in many mice.
  • FIG. 12 shows the results of ELISA using a 40-mer synthetic peptide containing the HIV gp120 loop 3 region, which was separately diluted 400-fold and used as an antigen. This result indicates that antibodies against a portion corresponding to the gp120 loop 3 sequence of the engineered protein have been produced in many mice.
  • Serum from 5 immunized mice, respectively, from immunization experiments using purified proteins from pTH183, pTH187, pTH189, pTH197, pTH200 was diluted 5000-fold and ELISA was performed using a 40-mer synthetic peptide containing the HIV gp120 loop 3 region as an antigen. The results are shown in FIG. Industrial applicability
  • the artificial protein with enhanced immunogenicity of the epitope of the present invention can induce humoral immunity in a living body.
  • an antibody against the above-mentioned epitope can be easily and efficiently produced, and the obtained antibody is obtained by using an antibody. It can be used for therapy and diagnosis using antibodies.
  • the DNA encoding the artificial protein as a DNA vaccine, it is possible to induce cellular immunity in a living body. The results show that the induction of humoral immunity and cellular immunity can be used as a protein against a wide range of antigens such as malaria.
  • intestinal bacteria that express artificial proteins can be used for desensitization and induction of immune tolerance, as well as a technique for inducing immune responses to proteins that are in an immune-tolerant state (such as antigens and fetal antigens) in vivo. Also available as

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Description

ェピ卜一プの免疫原性が増強された人工タンパク質 技術分野
本発明は、 ェピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質や、 該 人工夕ンパク質を含んでなる免疫応答の誘導剤や、 該人工夕ンパク質を 抗原として用いる抗体の製造方明法や、 該人工夕ンパク質を有効成分とし て含有する機能性食品や、 該人エタ細ンパク質を発現する腸内細菌からな る脱感作 ·免疫寛容状態の誘導剤や、 該人工タンパク質をコードする D N Aを含んでなる免疫応答誘導用 D N Aワクチン等に関する。 背景技術
分子進化工学の誕生により、 生命反応の根幹を形成するタンパク質あ るいはそれらをコードする遺伝子 D N Aを、 実験室の中で人工的に創り 出すことが行われている。 この技術により、 自然には存在しない新たな 活性を持った酵素 · タンパク質や、 天然のタンパク質とは大きく構造の 異なるタンパク質を産み出すことが可能となり、 医療領域や工学領域へ の様々な応用が期待されている。 分子進化工学では、 タンパク質又はそ れをコ一ドする遺伝子を構成するアミノ酸又はヌクレオチドのブロック 単位のランダムな重合体プールの中から、 目的とする活性を持つ分子を 選び出す操作が行われる。 例えば、 Szostak らのグループは、 1 0 0塩 基の長さをもつランダムな配列をもった D N A集団を D N A合成機で作 製し、 この D N A集団をインビトロで R N Aに転写し、 1 0 1 3の多様性 をもつ R N A集団を用意し、 この R N A集団の中から特定の色素に特異 的に結合する R N A分子を選択し、 どのような配列構造を有する R N A 分子が与え ら れた機能 を満足する か につ いて報告 してい る
(Nature, 346:818-822, 1990)。 Szostakらのグループはさらに同様のァ ブローチで、 リガ一ゼ活性といったより複雑な活性をもつ R N A分子を 創出することに成功している （Science, 261: 1411-1418, 1993)。
一方、 遺伝子は小さな遺伝子が繰り返し重合して誕生したのではない かという仮説があり （Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:3391-3395,1983)、 また、 繰り返し構造に富むポリべプチドは安定な高次構造を取りやすい と考えられるので、 大きなタンパク質や遺伝子を対象とする分子進化工 学では、 短い構造単位を繰り返し重合させ巨大分子を合成する技術が要 求されている （Nature, 367:323-324, 1994)。 短い D N A単位の繰り返し 重合体を得る方法として、 ローリング 'サークル合成法が報告されてい る (Proc,Natl,Acad.Sci.USA,92:4641-4645, 1995) 力 この方法はリン 酸化反応、 連結反応、 重合反応、 二本鎖形成反応などのステップを何段 階も経なければならないため、 反応系が複雑である。
そこで本発明者らは、 効率的かつ単純にマイクロ遺伝子の繰り返し重 合体を作製する方法として、 少なくとも一部の配列が互いに相補してい るオリゴヌクレオチド A及びオリゴヌクレオチド Bに、 D N Aポリメラ ーゼを作用させて重合反応を行うことを特徴とするマイク口遺伝子重合 法 （特開平 9 一 3 2 2 7 7 5号公報） を提案している。
また、 絹タンパク質やエラスチン等の天然タンパク質の反復単位に類 似する反復単位を有するアミノ酸ポリマーをコードする D N A (特開平 1 0 - 1 4 5 8 6号公報） や、 繰返しアミノ酸配列を有する人エタンパ ク質をコードする遺伝子カセット（米国特許第 5 0 8 9 4 0 6号明細書） や、 アミノ酸の繰返し配列を有する大ポリべプチド作製用の合成反復 D N A (米国特許第 5 6 4 1 6 4 8号明細書） や、 アミノ酸の繰返し単位 を有するぺプチドをコ一ドする D N A配列 （米国特許第 5 7 7 0 6 9 7 号明細書） や、 アミノ酸の反復配列を含む大ポリペプチド作製用の合成 反復 DNA (米国特許第 5 8 3 0 7 1 3号明細書） が知られている。 ま た、 6つの読み枠の 1つが α;ヘリックス構造を形成しやすい DN A断片 をデザィンし、 そこから作成したライブラリ一が高頻度に安定なタンパ ク質をコードすることや、 同様に、 6つの読み枠の中の 1つが |8ストラ ン ド構造を形成しやすい D N A断片をデザィ ンする こ とが報告 (Proc,Natl,Acad.Sci.USA,94:3805-3810,1997) されてレ る。
従来また、 ぺプチド性ェピトープの抗原性を増強する手法としては、. ぺプチド性ェピトープをタンデムにいくつも連結し、 得られる種々のぺ プチド性ェピトープのタンデム重合体を免疫原として用いる手法が知ら れており （J. Immunol. 153:5634-5642, 1994)、 例えば米国特許第 5 , 9 5 1 , 9 8 6号明細書には、 H I Vのェピトープを多価にもつべプチ ドの免疫原としての利用について開示されている。 また、 枝状に連結し 多価にェピトープをもつ巨大分子を作製する方法 （米国特許第 5， 2 2 9 , 4 9 0号明細書、 特表平 0 8— 5 1 1 0 0 7号公報） や、 ぺプチド 性ェピトープを提示するファージを免疫原として利用する方法 （Nature Biotechnology, 18:873-876, 2000) なども知られている。
上記、 ぺプチド性ェピ卜一プをタンデムに重合する手法は簡便ではあ るが、 かならずしも全てのェピトープで有効に機能するわけではない (Mol. Immunol. 34:599-608, 1997)。 例えば H I Vの g p 1 2 0ループ 3ペプチドは、 タンデムに重合して、 さらにキャリア一タンパク質と融 合させた型ではマウスでの免疫誘導反応の改善が見られるが、 キャリア 一タンパク質と融合しない状態では単独のぺプチドを用いた免疫との有 意な差は見られない（Vaccine 17:2392- 2399， 1999)。 このような免疫原 性の極めて弱いペプチド性ェピトープについて、 強い免疫原性を与える 新しい手法の開発が望まれていた。 本発明の課題は、 従来の手法からは 十分な免疫応答誘導活性が得られないぺプチド性ェピトープに関しても. 強い免疫応答誘導能力を付与する手法を提供することにある。 より具体 的には、 ェピ卜ープの免疫原性が増強された人工タンパク質や、 該人工 夕ンパク質を含んでなる免疫応答の誘導剤や、 該人エタンパク質を抗原 として用いる抗体の製造方法や、 該人工タンパク質を有効成分として含 有する機能性食品や、 該人工タンパク質を発現する腸内細菌からなる脱 感作 ·免疫寛容状態の誘導剤や、 該人工タンパク質ををコードする D N Aを含んでなる免疫応答誘導用 D N Aワクチン等を提供することにある, 発明の開示
ぺプチド性ェピト一プが十分な抗原性をもっためには、 そのべプチド 性ェピトープが、 免疫担当細胞に取り込まれ、 プロセシングを受けた後 に、 M H C分子により B細胞、 T細胞へと効率よく提示される必要があ る。 このような 「取り込み」 「プロセシング」 「M H Cによる提示」 反応 が効率よく進むためには、 ペプチド性ェピトープが、 天然のタンパク質 に近いコンテクストの中に存在する必要があると考えられる。 このよう な考えのもとに、 「ぺプチド性ェピトープを少なくとも 1コピーもつよ うな天然のタンパク質に近い性質をもった人工タンパク質」 をデザィ ン ·作製し、 この人工タンパク質の免疫原性を調べる実験をまず実施し た。
エイズウイルスのもつ g p 1 2 0タンパク質のループ 3と呼ばれる領 域は、 中和ェピトープとして知られており、 このェピトープに対する抗 体のいくつかは、 ウィルスの増殖を抑えるといった中和活性をもち、 ェ ィズ治療に利用できる重要な抗体となる。 エイズウイルスは、 急速に自 身の遺伝子配列を変化させることにより、 ループ 3領域のアミノ酸配列 を変化させ、 この中和抗体からの攻撃を逃れることが知られている。 中 和抗体の臨床利用の観点から考えると、 このようにして新たに出現した エイズウイルス変異体に対する新しい中和抗体の迅速な作製が必要とな るが、 g p 1 2 0タンパク質そのものを免疫原としても、 あるいは、 ル ープ 3領域に相当するべプチドを免疫原としても、 十分な免疫誘導が引 き起こすことができないことも知られており、 中和抗体の新たな作製に は多大の時間と労力が必要であるのが現状であった （Nature 376:115, 1995)。そして、従来用いられているようなェピトープ配列のタンデム重 合体を抗原として用いても、 ループ 3ぺプチド配列に対する十分な免疫 を誘導できないことが報告されている （Vaccine 17:2392- 2399， 1999)。 g 1 2 0タンパク質そのものを免疫原としてもループ 3領域に対する 抗体ができない理由は、 ループ 3ペプチドが、 g p 1 2 0タンパク質の 内部に埋もれているからと考えられている。 ループ 3領域に相当するべ プチドが弱い免疫原性しかもたないのは、 免疫担当細胞による 「取り込 み」 「プロセシング」 「MHCによる提示」 反応が、 このペプチドでは効 率よく進まないためだと考えられる。
そこで、 「全体としては天然のタンパク質に近い性質」をもちながら、 その構造上に少なくとも 1コピーのループ 3ペプチド配列をもつような 人工タンパク質を作製し、 これを用いた効率の良い免疫誘導法を試みた (図 1 )。 なお、 人工タンパク質の作製には 「多機能塩基配列及びそれを 含む人工遺伝子」 （特願 2 0 0 0— 1 8 0 9 9 7 ) や、 「マイクロ遺伝子 重合法」 （特開平 9一 3 2 2 7 7 5号公報） に記載された方法を用いた。
まず、 エイズウィルスの中和抗原として知られているループ 3ぺプチ ド 「RKS I R I QRGP GRT F VT I GK I」 を読み枠の 1つにコ —ドするマイクロ遺伝子をデザインすることとした。 例えば、 最初の R (アルギニン） には 「C GT」 「C GC」 「C GA」 「C GG」 「AGA」 「AGG」 の 6つのコドンが対応するがこの中から特定のコドンを選択 し、 次の （リシン） には 「AAA」 「AAG」 の 2つのコドンが対応す るがこの中から特定のコドンを選択し、 以下同様にして特定のコ ドンを 順次選択しマイクロ遺伝子をデザィンする場合、 上記中和抗原べプチド を読み枠の 1つにコードする塩基配列は、 コドンの縮重から約 1， 6 5 1億種あることになる。 また、 単一マイクロ遺伝子はプラス鎖及びマイ ナス鎖に各 3種の読み枠をもつことから、 6種の異なるぺプチドをコ一 ドすることができることになり、 例えば、 同じ方向の異なる 2つの読み 枠では、 上記中和抗原ペプチドとは全く異なる 2つのペプチドがコード されることになる。そこで、同じ方向の他の読み枠 2つのいずれかで「二 次構造を形成しやすい」 という性質を有するペプチドをコードする塩基 配列を、 上記約 1， 6 5 1億種の塩基配列の中から計算機により検索す ることにした。
計算機として S u nの E n t e r p r i s e 2 5 0を用いて実行した ところ、 約 1 , 6 5 1億種の塩基配列全てを同時に計算するには無理が あることがわかったので、 上記中和抗原ペプチドの両端を削除した 「 I R I QRG P GRTFVTJ の 1 3個のアミノ酸からなるペプチドにつ いて計算することとした。 1つの読み枠でこのべプチドをコードする可 能性のある塩基配列を全て計算機内に書き出したところ、 約 5億種の塩 基配列が作成された。 これら 5億種の塩基配列の、 同じ方向の他の 2つ の読み枠を翻訳し、 終止コドンが現れて翻訳が途中でストップするもの や、 ペプチド配列として重複するものを除いた、 約 1 , 5 06万種のぺ プチド配列の集団を計算機の中に作成した。 次に、 この約 1， 5 0 6万 種のペプチドの中から 「二次構造を形成しやすい」 という性質をもつぺ プチドを、 二次構造予測プログラムを用いて個別に計算してスコアづけ を行った。 この計算に 1週間以上要したが、 得られた結果をスコアの高 い順にソートしたところ、 第 2読み枠で《ヘリックスを非常に形成しや すい塩基配列として、 「ATAC GCATT CAGAGAGG C C CT GGC C GCACTTTTGTTACTJ を選択することができた。 上記計算は、 エイズウイルス中和抗原べプチド 2 0アミノ酸残基の真 ん中部分 1 3アミノ酸残基について実施したので、 未計算の両端部分に ついても同様の計算をおこない、 それらの結果を合わせてマイクロ遺伝 子 「デザイン一 2 5」 を得ることができた。 このマイクロ遺伝子 「デザ イン— 2 5」 は、 その読み枠の 1つに中和抗原配列をコードし、 他の読 み枠 2つに終止コドンをもたず、 さらに、 そのうちの 1つに αヘリック スを形成しやすい性質のペプチドをコードし、 「エイズウイルス中和抗 原性」 と 「構造形成能力」 といった 2つの生物機能構造が潜源化したマ イク口遺伝子ということができる。 次に、 かかるマイクロ遺伝子 「デザ イン一 2 5」 を、 前記本発明者によるマイクロ遺伝子重合法 （特開平 9 - 3 2 2 7 7 5号公報） を利用して重合し、 「中和抗原配列」 と 「 ヘリ ックスを形成しやすい配列」 とが複雑に組み合わさった種々の人工遺伝 子からなる人工遺伝子ライブラリ一を作製した。 これら人工遺伝子ライ ブラリーを用いて種々の人工タンパク質を大腸菌で発現させ、 全体とし ては ヘ リックスの構造に支えられながら、 その中のところどころにェ ィズウィルス中和坊原配列をもつ人エタンパク質が得られた。 かかる人 エタンパク質を用いてマウスを免疫し、 g ρ 1 2 0夕ンパク質のループ 3領域に対する抗血清を効率よく作製することができることや、 対照実 験としてのループ 3領域に相当する合成べプチドを用いた免疫からは有 意な免疫誘導が生起しないことを確認し、 本発明を完成するに至った。 すなわち本発明は、 ぺプチド性ェピトープのアミノ酸配列の全部又は その一部を含むアミノ酸配列から構成されていることを特徴とするェピ ト一プの免疫原性が増強された人工タンパク質 （請求項 1 ) や、 ぺプチ ド性ェピト一プのアミノ酸配列の全部又はその一部を含み、 夕ンパク質 の高次構造形成を補助する性質が付与されたアミノ酸配列から構成され ていることを特徴とする請求項 1記載のェピト一プの免疫原性が増強さ れた人工タンパク質 （請求項 2 ) や、 ペプチド性ェピトープのアミノ酸 配列の全部又はその一部を含み、 免疫担当細胞による抗原提示処理を補 助する性質が付与されたアミノ酸配列から構成されていることを特徴と する請求項 1記載のェピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質 (請求項 3 ) や、 ペプチドタグ又はマーカータンパク質が融合している ことを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載のェピトープの免疫原性 が増強された人工タンパク質 （請求項 4 ) や、 ペプチドタグがポリヒス チジン残基であることを特徴とする請求項 4記載のェピトープの免疫原 性が増強された人工タンパク質 （請求項 5 ) や、 ペプチド性ェピト一プ のアミノ酸配列が、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列であることを特 徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載のェピトープの免疫原性が増強さ れた人工タンパク質 （請求項 6 ) や、 ペプチド性ェピトープのアミノ酸 配列の全部又はその一部を含むアミノ酸配列が、 配列番号 2 4〜4 7の いずれかに示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項 1〜4 のいずれか記載のェピト一プの免疫原性が増強された人工夕ンパク質 (請求項 7 ) に関する。
また本発明は、 請求項 1〜 7のいずれか記載のェピ卜一プの免疫原性 が増強された人工タンパク質を含んでなることを特徴とする免疫応答の 誘導剤 （請求項 8 ) や、 免疫応答が体液性免疫であることを特徴とする 請求項 8記載の免疫応答の誘導剤 （請求項 9 ) や、 免疫応答が細胞性免 疫であることを特徴とする請求項 8記載の免疫応答の誘導剤 （請求項 1 0 ) や、 請求項 1〜 7のいずれか記載のェピトープの免疫原性が増強さ れた人工タンパク質を抗原として用いることを特徴とする抗体の製造方 法 （請求項 1 1 ) や、 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とす る請求項 1 1記載の抗体の製造方法 （請求項 1 2) や、 請求項 1 1又は 1 2記載の抗体の製造方法により得られることを特徴とする抗体 （請求 項 1 3) や、 請求項 1 3記載の抗体を産生する細胞 （請求項 1 4) や、 請求項 1〜 7のいずれか記載のェピトープの免疫原性が増強された人工 タンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞 （請求 項 1 5) や、 腸内細菌であることを特徴とする請求項 1 5記載の宿主細 胞 （請求項 1 6) や、 請求項 1 6記載の腸内細菌を含んでなることを特 徴とする脱感作，免疫寛容状態の誘導剤 （請求項 1 7 ) に関する。
さらに本発明は、 請求項 1〜 7のいずれか記載のェピトープの免疫原 性が増強された人工タンパク質をコードする DN A (請求項 1 8) や、 塩基配列の読み枠を異にした場合、 該塩基配列の少なくとも 1つの読み 枠にぺプチド性ェピトープがコ一ドされ、 他の読み枠に該ぺプチド性ェ ピトープの抗原性を高めるような性質を付与しうるべプチドがコードさ れていることを特徴とする請求項 1 8記載の DNA (請求項 1 9 ) や、 請求項 1 8又は 1 9記載の D N Aを含んでなることを特徴とする免疫応 答誘導用 DNAワクチン （請求項 2 0) や、 免疫応答が体液性免疫であ ることを特徴とする請求項 2 0記載の免疫応答誘導用 D N Aワクチン (請求項 2 1 ) や、 免疫応答が細胞性免疫であることを特徴とする請求 項 2 0記載の免疫応答誘導用 DNAワクチン （請求項 2 2 ) や、 請求項 1〜 7のいずれか記載のェピト一プの免疫原性が増強された人工タンパ ク質を有効成分として含有する機能性食品 （請求項 2 3 ) や、 脱感作 - 免疫寛容状態を誘導することができる請求項 2 3記載の機能性食品 （請 求項 2 4 ) に関する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明のェピ卜ープの免疫原生が増強された人工タンパク 質が強い免疫誘導能力を獲得することを説明するための図である。 第 2図は、 マイクロ遺伝子の自動デザィンの計算作業のフローの一例 を示す図である。
第 3図は、 デザインされた 2本鎖多機能 D N A配列からなるマイク口 遺伝子とそれがコードするアミノ酸配列を示す図である。
第 4図は、 本発明のェピトープの免疫原生が増強された人工タンパク 質をコードする D N Aの一例を示す図である。
第 5図は、 本発明のェピトープの免疫原生が増強された人エタンパク 質をコードする D N Aの一 f!jを示す図であり、 図 4の続きである。 第 6図は、 本発明のェピトープの免疫原生が増強された人工タンパク 質の一例を示す図である。
第 7図は、 本発明のェピトープの免疫原生が増強された人工タンパク 質の一例を示す図であり、 図 6の続きである。
第 8図は、 本発明のェピトープの免疫原生が増強された人エタンパク 質の一例を示す図であり、 図 7の続きである。
- 第 9図は、 本発明のェピトープの免疫原生が増強された人工タンパク 質の一例を示す図であり、 図 8の続きである。 - 第 1 0図は、 本発明のェピトープの免疫原生が増強された人工夕ンパ ク質を用いて得られた抗血清の E L I S Aの結果を示す図である。 第 1 1図は、 本発明のェピトープの免疫原生が増強された人工タンパ ク質を用いて得られた抗血清の種々の希釈物の E L I S Aの結果を示す 図である。
第 1 2図は、 本発明のェピトープの免疫原生が増強された他の人工夕 ンパク質を用いて得られた抗血清の E L I S Aの結果を示す図である。 第 1 3図は、 本発明のェピト一プの免疫原生が増強された他の人工夕 ンパク質を用いて得られた抗血清の E L I S Aの結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明のェピ卜ープの免疫原性が増強された人エタンパク質としては. ぺプチド性ェピトープのアミノ酸配列の全部又はその一部を含むアミノ 酸配列から構成されているタンパク質又はべプチドであれば特に制限さ れるものではなく、 ここで人工タンパク質とは、 天然に存在しないタン パク質又はペプチドであって、 例えば前記文献（Vacc i ne 17 : 2392-2399, 1999)に記載された、 H I Vの g p 1 2 0ループ 3ぺプチドのタンデム重 合体とキヤリァ一タンパク質との融合体など、 公知のぺプチド性ェピト ープのタンデム重合体や、 公知のぺプチド性ェピトープ又は公知のぺプ チド性ェピト一プのタンデム重合体と公知のキヤリアタンパク質との融 合タンパク質や融合べプチドは除かれる。 かかるェピトープの免疫原性 が増強された人工タンパク質としては、 ぺプチド性ェピトープのァミノ 酸配列の全部又はその一部を含み、 夕ンパク質の高次構造形成を補助す る性質が付与されたアミノ酸配列から構成されている人工タンパク質や， ペプチド性ェピトープのアミノ酸配列の全部又はその一部を含み、 免疫 担当細胞による抗原提示処理を補助する性質が付与されたアミノ酸配列 から構成されている人工タンパク質を好適に例示することができる。 上記タンパク質の高次構造形成を補助する性質としては、 ひヘリック ス形成能力、 二次構造形成能力、 疎水性度向上能力に関する性質を例示 することができ、 また、 免疫担当細胞による抗原提示処理を補助する性 質としては、 クラス I、 クラス I Iの M H C分子との親和性向上能力に関 する性質を例示することができるが、 その他、 天然のタンパク質に類似 させた種々の性質を付与することもできる。 そして、 これらの有用な性 質を有するアミノ酸配列は、 アミノ酸組成や配列の繰り返し性を調整す ることにより、 あるいは、 かかる性質を保持した既知の配列を参考にす ることにより調製することができる。 また、 本発明のェピトープの免疫 原性が増強された人工タンパク質のェピトープのアミノ酸配列に由来す るアミノ酸配列以外のアミノ酸配列として、 上記タンパク質の高次構造 形成を補助する性質を付与しうるべプチド配列や免疫担当細胞による抗 原提示処理を補助する性質を付与しうるペプチド配列の他、 例えば、 糖 の付加シグナルをもったペプチド配列を用いることもでき、 かかるぺプ チド配列を加えることにより、合成された天然タンパク質は糖修飾され、 タンパク質一糖のハイブリッド人工タンパク質などとすることもできる, 本発明の人工タンパク質として、 具体的には、 免疫原性のきわめて弱 ぃぺプチド性ェピト一プである H I Vの g p 1 2 0ループ 3に強い免疫 原生を付与することができる、 該ペプチド性ェピトープループ 3の全部 又はその一部を含むアミノ酸配列、 例えば配列番号 2 4〜4 7のいずれ かに示されるアミノ酸配列から構成される人エペプチドあるいは人工夕 ンパク質を挙げることができる。 これら人エペプチドあるいは人エタン パク質を含め、 本発明のェピトープの免疫原性が増強された人工タンパ ク質は、 生体おける体液性免疫や細胞性免疫等の免疫応答を誘導するた めの免疫応答の誘導 （薬） 剤として用いることができる。
本発明のェピトープの免疫原性が増強された人工タンパク質をコード する D N Aとしては、 塩基配列の読み枠を異にした場合、 該塩基配列の 少なくとも 1つの読み枠にぺプチド性ェピトープがコ一ドされ、 他の読 み枠に該ぺプチド性ェピトープの抗原性を高めるような性質を付与しう るべプチドがコ一ドされている D N Aや、 同じ読み枠にぺプチド性ェピ トープと該ペプチド性ェピトープの抗原性を高めるような性質を付与し うるべプチドがコードされている D N Aを例示することができ、 例えば かかる D N Aを組み込んだ発現べクタ一ば細胞性免疫や体液性免疫等の 免疫応答誘導用 D N Aワクチンとして用いることができる。
本発明はまた、 上記本発明のェピト一プの免疫原性が増強された人工
2 夕ンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関し 宿主細胞としては、 サルモネラ菌、 大腸菌、 ストレプトミセス、 枯草菌、 ストレプトコッカス、 ス夕フイロコッカス等の細菌原核細胞や、 酵母、 ァスペルギルス等の真菌細胞や、 ドロソフイラ S 2、 スポドプテラ S f 9等の昆虫細胞や、 L細胞、 C H O細胞、 C O S細胞、 H e L a細胞、 C 1 2 7細胞、 B A L B / c 3 T 3細胞 （ジヒドロ葉酸レダク夕ーゼゃ チミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、 B H K 2 1細胞、 H E K 2 9 3細胞等の動物細胞や、 植物細胞等を挙げることができるが、 サ ルモネラ菌等の腸内細菌を好ましく例示することができる。 かかる人工 タンパク質を発現する腸内細菌を生体に投与すると、 脱感作，免疫寛容 状態を誘導することができることから、 これら腸内細菌は脱感作 ·免疫 寛容状態の誘導剤として期待できる。
また、 発現系としては、 上記本発明のェピトープの免疫原性が増強さ れた人工夕ンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系であ ればどのようなものでもよく、 染色体、 ェピソ一ム及びウィルスに由来 する発現系、 例えば、 細菌プラスミ ド由来、 酵母プラスミ ド由来、 S V 4 0のようなパポバウィルス、 ワクシニアウィルス、 アデノウイルス、 鶏痘ウィルス、 仮性狂犬病ウィルス、 レトロウイルス由来のベクター、 パクテリオファージ由来、 トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由 来するベクター、 例えば、 コスミ ドゃファ一ジミ ドのようなプラスミ ド とバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができ る。 この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列 を含んでいてもよい。 また、 読み枠を変えて翻訳することができる発現 ベクタ一シリーズも有利に用いることができる。
本発明の人エタンパク質をコードする D N Aゃ該人工タンパク質をコ —ドする D N Aが組み込まれた発現系の宿主細胞への導入は、 Davis ら ( BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986 ) 及び Sambrookら （MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、 例えば、 リン酸カルシウムトランスフエクシヨン、 D E A E—デキスト ラン媒介トランスフエクシヨン、 トランスべクション（transvection)、 マ イク口インジェクション、 カチオン性脂質媒介トランスフエクション、 エレクト口ポレーシヨン、 形質導入、 スクレープローデイング （scrape loading), 弹丸導入（ballistic introduction), 感染等により行うことがで きる。
本発明の人工タンパク質の製法としては、 従来公知のタンパク質の製 造方法であれば特に制限されるものではなく、 例えば、 該人工タンパク 質をコードする D N Aを発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換 し、 該形質転換細胞を培養することにより、 あるいはペプチド合成法に より得ることができる。 上記人工タンパク質をコードする D N Aは、 例 えば実施例に説明されているようなマイク口遺伝子重合法を用いること により作製することができ、 その際ェピトープをコ一ドする塩基配列に 付加する人エタンパク質の性質は、 マイク口遺伝子の同じ読み枠に存在 していても異なる読み枠に存在していてもよいが、 人工タンパク質をコ ―ドする D N Aの作製はこれらの方法に限定されるものではない。また、 上記発現べクタ一由来の翻訳領域に、 ポリヒスチジン残基.をコードする 塩基配列を存在させるなどして、 該人工夕ンパク質のアミノ酸配列の一 部にポリヒスチジン残基等の分離精製用のぺプチド夕グを存在させるこ ともできる。
また、 本発明の人工タンパク質を、 マ一カータンパク質及び Z又はべ プチドタグと結合させた融合タンパク質や融合べプチドとすることもで きる。 マーカータンパク質としては、 従来知られているマーカ一タンパ ク質であれば特に制限されるものではなく、 例えば、 アルカリフォスフ ァタ一ゼ、 抗体の F c領域、 H R P、 G F Pなどを具体的に挙げること ができ、 またペプチドタグとしては、 M y cタグ、 H i sタグ、 F L A Gタグ、 G S Tタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例 示することができる。 かかる融合タンパク質や融合ペプチドは、 常法に より作製することができ、 N i — N T Aと H i sタグの親和性を利用し た本発明の人工タンパク質の精製や、 T細胞誘導活性を有するタンパク 質の検出や、 本発明の人工タンパク質に対する抗体の定量、 免疫不全症 の診断用マ一カーなどとして、 また当該分野の研究用試薬としても有用 である。
本発明の抗体の製造方法としては、 ェピト一プの免疫原性が増強され た人エタンパク質を抗原として用いる方法であれば特に制限されるもの ではなく、 かかる抗体の種類としては、 モノクローナル抗体、 ポリクロ ーナル抗体、 キメラ抗体、 一本鎖坊体、 ヒト化抗体等の免疫特異的な抗 体を具体的に挙げることができ、 これらは本発明のェピトープの免疫原 性が増強された人工タンパク質又はその一部を坊原として用いて常法に より作製することができるが、 その中でもモノクローナル抗体がその特 異性の点で好ましく、 特にエイズウィルスの増殖に対する中和活性をも つたモノクローナル抗体がより好ましい。 かかるモノクローナル抗体等 の抗体は、 例えば、 エイズ等の免疫不全症等の治療ばかりでなく、 エイ ズ等の免疫不全症の発症機構を明らかにする上で有用である。
また、 本発明の抗体は、 慣用のプロトコールを用いて、 動物 （好まし くはヒト以外） に本発明のェピ卜ープの免疫原性が増強された人工タン パク質又はその一部を、 あるいはかかる人工タンパク質の一部と M H C との複合体を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、 例 えばモノクローナル抗体の調製には、 連続細胞系の培養物により産生さ れる抗体をもたらす、 ハイプリ ドーマ法 （Nature 256， 495-497, 1975)、 トリオ一マ法、 ヒト B細胞ハイブリ ドーマ法（Immunology Today 4， 72, 1983) 及び E B V—ハイブリ ドーマ法 （MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985) など任 意の方法を用いることができる。
本発明の上記人工タンパク質に対する一本鎖抗体をつくるために、 一 本鎖抗体の調製法（米国特許第 4,946,778号） を適用することができる。 また、 ヒト化抗体を発現させるために、 トランスジエニックマウス又は 他の哺乳動物等を利用したり、 上記抗体を用いて、 本発明のェピトープ の免疫原性が増強された人工タンパク質を発現するクローンを単離 · 同 定したり、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一でそのポリべプチドを精 製することもできる。 本発明のェピトープの免疫原性が増強された人工 夕ンパク質やその抗原ェピトープを含むぺプチドに対する抗体は、 エイ ズ等の免疫不全症の診断や治療に使用できる可能性がある。 また本発明 の上記抗体を産生する細胞としては、 株化した培養細胞が好ましく、 例 えば、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマ、 株化 B細胞等を例示す ることができる。
本発明の機能性食品としては、 本発明のェピトープの免疫原性が増強 された人工タンパク質を有効成分として含有するものであればどのよう な食品でもよく、 かかる人工タンパク質を飲食品原料の一部として用い たり、 あるいは製造工程又は製造後に添加 ·配合することにより得るこ とができる。 かかる機能性食品としては特に制限されるものではなく、 クッキ一、 パン、 ケーキ、 煎餅などの焼き菓子、 ラムネ菓子等などの錠 菓、 羊羹などの和菓子、 プリン、 ゼリー、 アイスクリーム類などの冷菓、 チューインガム、 キャンディ等の菓子類や、 クラッカ一、 チップス等の
6 スナック類や、 うどん、 そば等の麵類や、 かまぼこ、 ハム、 魚肉ソ一セ —ジ等の魚肉練り製品や、 チーズ、 バターなどの乳製品や、 みそ、 しょ う油、 ドレッシング、 マヨネーズ、 甘味料等の調味類や、 豆腐、 こんに やく、 その他佃煮、 餃子、 コロッケ、 サラダ、 スープ、 シチュー等の各 種総菜や、 ヨーグルト、 ドリンクヨーグルト、 ジュース、 牛乳、 豆乳、 酒類、 コーヒー、 紅茶、 煎茶、 ウーロン茶、 スポーツ飲料等の各種飲料 などを具体的に例示することができる。
以下に、 実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、 この発 明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例 1
H I Vウィルスの一群の亜種がもつ g p 1 2 0夕ンパク質の部分配列 である、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるぺプチドをコ一ド する塩基配列を読み枠の 1つとし、 かつ同方向の他の読み枠 2つのうち の少なくとも 1つの読み枠で 2次構造を形成しやすいアミノ酸配列から なるペプチドをコードすることができるマイクロ遺伝子をデザィンする ために、 図 2に示すフローチヤ一トにしたがってマイク口遺伝子を構築 した。 計算機の処理能力を考慮して、 配列番号 1に示される 2 0ァミノ 酸残基を、 互いに一部重複する部分配列である 3つのアミノ酸配列、 す なわち配列番号 2、 配列番号 3、 配列番号 4にそれぞれ示される 3つの アミノ酸配列からなるペプチドに分割し、 それぞれについて計算を実行 した。
配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるぺプチドをコードする塩 基配列の場合、 まず読み枠の 1つに配列番号 3に示されるアミノ酸配列 からなるペプチドをコードすることのできる全ての塩基配列 （塩基長は 1 3 X 3 = 3 9 ) である約 5億種の塩基配列を計算機内に作成し、 この 配列集団の中から、 同方向の他の 2つの読み枠に終止コドンをもたない 約 1 , 1 3 5万種の塩基配列を計算機内で選び出した。 次に、 これら選 び出された塩基配列の読み枠 1と同方向の他の 2つの読み枠のコードす る全てのアミノ酸配列約 2 , 2 7 0万種を計算機内に作成し、 このアミ ノ酸配列からなるペプチド集団の中から同じアミノ酸配列をもった重複 配列を除き、 それぞれ異なる配列をもつペプチド集団約 1， 5 0 6万種 を選び出した。 このそれぞれのペプチド集団に対して、 その Q!ヘリック ス、 あるいは、 /3シートの二次構造形成能力を前記の二次構造予測プロ グラムを用いたスコア一によつて評価し、 二次構造形成能力が高いと予 想されるペプチドの中から、 配列番号 5に示されるァミノ酸配列からな るペプチドを選定した。 このペプチドは、 配列番号 6に示される塩基配 列の第 2読み枠にコ一ドされるアミノ酸配列であり、 ひヘリックス構造 を形成しやすい配列と予想された。
配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるぺプチドをコードする塩 基配列についても、 上記同様の計算を実行し、 第 1読み枠で、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、 第 2読み枠で へリツ クスを形成する可能性が高いペプチドをコードし、 かつ、 そのペプチド の 4番目から 6番目のアミノ酸配列が、 上記配列番号 5に示されるアミ ノ酸配列の 1番目から 3番目のアミノ酸配列に一致する、 配列番号 7に 示されるアミノ酸配列からなるぺプチドを選び出した。このべプチドは、 配列番号 8に示される塩基配列の第 2読み枠にコードされるアミノ酸配 列である。
配列番号 4についても上記同様の計算を実行し、 第 1読み枠で、 配列 番号 4に示されるアミノ酸配列からなるぺプチドを、 第 2読み枠でひへ リックスを形成する可能性が高いペプチドをコードし、 かつ、 そのぺプ チドの 1番目から 3番目のアミノ酸配列が、 配列番号 5の 1 1番目から 1 3番目のアミノ酸配列に一致する、 配列番号 9に示されるアミノ酸配 列からなるペプチドを選び出した。 このペプチドは、 配列番号 1 0に示 される塩基配列の第 2読み枠にコードされるアミノ酸配列である。
上記の操作で得られた配列番号 6、 配列番号 8、 配列番号 1 0にそれ ぞれ示される塩基配列を、 重複を考慮しながら連結し、 配列番号 1 1に 示される塩基配列を有するマイグロ遺伝子 「デザイン一 2 5」 を得た。 このデザインされたマイクロ遺伝子は、 図 3に示すように、 第 1読み枠 で H I Vウィルスの一群の亜種がもつ g p 1 2 0夕ンパク質の部分配列 をコードし、 第 2読み枠で、 0!ヘリックス構造を形成しやすいペプチド の配列をコードする。 なお、 マイクロ遺伝子デザイン— 2 5の場合、 マ イク口遺伝子のマイナス鎖 （配列番号 1 1に示される塩基配列に対して 相補的な配列） に関しては、 終止コドンの出現の回避などの制限を加え ていない
上記のデザインされたマイクロ遺伝子 「デザイン一 2 5」 を出発材料 とし、 前記特開平 9 - 3 2 2 7 7 5号公報記載の高分子マイクロ遺伝子 重合体の作成方法の技術を用いて、 マイクロ遺伝子重合体ライブラリー を作製した。 なお、 重合の基礎となるオリゴヌクレオチド Aとして、 配 列番号 1 2に示される塩基配列からなる K Y— 1 1 9 7を、 オリゴヌク レオチド Bとして、 配列番号 1 3に示される塩基配列からなる K Y— 1 1 9 8をそれぞれ合成して用いた。 これら 3 4ヌクレオチドからなるォ リゴヌクレオチド Aの 3 ' 側 1 0残基と、 3 6ヌクレオチドからなるォ リゴヌクレオチド Bの 3 ' 側 1 0残基とが、 ともに 3 ' 端を除いて互い に相補的な配列として構成されている。
上記オリゴヌクレオチド Aとオリゴヌクレオチド Bとを用いた重合反 応の条件は、 5 0 Lの反応容量では以下の通りである。
K Y - 1 1 9 7 2 0 p m o 1
K Y— 1 1 9 8 2 0 p m o 1 K C 1 1 0 mM
(NH4) 2 S 04 1 0 mM
T r i s -HC l (pH 8 8 ) 1 0 mM
M g S 04 2 mM
T r i t o n X- 1 0 0 0. 1 %
2. 5 mM d NT P 7 L
上記反応液を 94°Cで 1 0分間処理した後、 DN Aポリメラーゼ （二 ュ一ィングランドバイオラブス社製 「V e n t R」） を 5. 2ュニッ ト加 えた。
重合反応は、 パ一キン ' エルマ一社の 24 0 0ジーンアンプ P C Rシ ステムを用いて行った。 反応条件は、 94°Cで 1 0秒間熱変性させ、 6 6°Cで 6 0秒間ァ二一リングと伸張反応を行うというサイクルで 5 5サ ィクル繰り返し、 最後の伸張反応を 6 6 °Cで 7分間行った。 重合反応産 物として得られた本発明の人工遺伝子をプラスミ ドベクター p T Z 1 9 R (Protein Eng.， 1 :67-74， 1986)にクローニングし、 その挿入 DNA断片 の塩基配列をシークェンサ一 （パ一キン ' エルマ一社） を用いて決定し た。 クローニングした 1 0種類の D N A断片、 すなわち p TH 1 2 7、 p TH 1 3 3、 p TH 1 3 6、 p TH 1 42、 p TH 1 4 3、 p TH 1 4 5、 p TH 1 5 5、 p TH 1 6 7、 p T H 1 7 1及び p T H 1 7 6を 図 4及び図 5に示す。 このうち、 p TH 1 3 3、 p TH 1 42、 p TH 1 4 3及び p TH 1 6 7は、 その揷入断片が長く、 また繰り返し配列と いった性質をもっために、 その全長の塩基配列を決定することができな いので、 その部分配列が図 4及び図 5に示している。 これら図 4及び図 5に示される各揷入塩基配列を配列番号 1 4〜 2 3にそれぞれ示す。 上記マイクロ遺伝子重合体である人工遺伝子を大腸菌内で発現させる ために、 プラスミ ドベクター p T Z 1 9 Rにクロ一ニングした 1 0種の 揷入 DNA断片を切りだし、 方向、 読み枠などを考慮しながら、 方向、 読み枠を選んで発現させることができる発現プラスミ ドベクタ一シリ一 ズ p KS 6 0 0〜p K S 6 0 5のいずれか 1つに再クローニングした。 この 6種の発現プラスミ ドベクター p KS 6 0 0〜pKS 6 0 5は、 キ ァゲン社から発売されている読み枠を 1つずつずらした発現べクターシ リーズである P QE— 9、 p QE— 1 0、 p QE— 1 1のクロ一ニング サイ トを改変したもので、 プラス鎖とマイナス鎖のそれぞれ 3読み枠、 合計 6種の読み枠のいずれかにより翻訳産物を大腸菌の中で大量発現さ せることができるように作製したものである。
これら人工遺伝子が挿入された 24種類の発現プラスミ ドベクタ一 p TH 1 7 7〜p TH 2 0 0、 すなわち、 p TH 1 2 7の挿入配列を p K
5 6 0 1に移し変えた p TH 1 7 7、 p TH 1 3 3の挿入配列を p K S
6 0 1に移し変えた p TH 1 7 8、 p TH 1 3 6の揷入配列を p K S 6 0 0に移し変えた p TH 1 7 9、 p TH 1 4 3の挿入配列を p K S 6 0 0に移し変えた p TH 1 8 0、 p TH 1 4 5の揷入配列を p K S 6 0 1 に移し変えた p TH 1 8 1、 p TH 1 5 5の挿入配列を p K S 6 0 1に 移し変えた p TH 1 8 2、 p TH 1 6 7の挿入配列を p K S 6 0 1に移 し変えた p TH 1 8 3、 p TH 1 7 1の挿入配列を p K S 6 0 1に移し 変えた p TH 1 84、 p TH 1 7 6の揷入配列を p K S 6 0 1に移し変 えた p TH 1 8 5、 p TH 1 2 7の挿入配列を p K S 6 0 3に移し変え た p TH 1 8 6、 p TH 1 3 3の挿入配列を p K S 6 0 3に移し変えた p TH 1 8 7 p TH 1 42の挿入配列を p K S 6 0 2に移し変えた p TH 1 8 8、 p TH 1 43の挿入配列を p KS 6 0 2に移し変えた p T H 1 8 9、 p TH 1 5 5の挿入配列を p K S 6 0 3に移し変えた p TH 1 9 0、 p TH 1 6 7の挿入配列を p K S 6 0 3に移し変えた p TH 1 9 1、 p TH 1 7 1の挿入配列を p K S 6 0 3に移し変えた p TH 1 9
2 2であり、 p TH 1 7 6の揷入配列を p K S 6 0 3に移し変えた p TH 1 9 3、 p TH 1 2 7の挿入配列を p KS 6 0 5に移し変えた p TH l 94、 p TH 1 3 3の揷入配列を p K S 6 0 5に移し変えた p TH l 9 5、 p TH 1 4 3の挿入配列を p KS 6 04に移し変えた p TH 1 9 6 p TH 1 5 5の揷入配列を p K S 6 0 5に移し変えた p TH 1 9 7、 p TH 1 6 7の揷入配列を p KS 6 0 5に移し変えた p TH 1 9 8、 p T Η 1 7 1の挿入配列を ρ K S 6 0 5に移し変えた ρ ΤΗ 1 9 9、 ρ ΤΗ 1 7 6の挿入配列を p K S 6 0 5に移し変えた ρ ΤΗ 2 0 0、 が導入さ れた大腸菌 XL 1 B 1 u e株を、 発現誘導剤である I P TG存在下で培 養することにより、 H I V g p 1 2 0のループ 3ペプチド配列の全部、 あるいは一部をもつ人工タンパク質が得られた。
上記 p TH 1 7 7〜p TH 2 0 0翻訳産物であり、 それらの N末と C 末には発現プラスミ ド由来べプチド配列が融合している 24種類の人工 タンパク質のアミノ酸配列を図 6〜 9に示す。 なお、 図 6〜 9には、 そ の重合体塩基配列の部分配列しかわからないものについては、 N末領域 のべプチド配列のみが示されている。 図 6〜 9に示される p TH l 7 7 の揷入ぺプチド配列を配列番号 24に、 p TH 1 7 8の揷入ぺプチド配 列を配列番号 2 5に、 P TH 1 7 9の挿入べプチド配列を配列番号 2 6 に、 p TH 1 8 0の挿入ペプチド配列を配列番号 2 7に、 P TH 1 8 1 の挿入ペプチド配列を配列番号 2 8に、 p TH 1 8 2の挿入ペプチド配 列を配列番号 2 9に、 p TH 1 8 3の揷入ぺプチド配列を配列番号 3 0 に、 p TH 1 8 4の揷入ペプチド配列を配列番号 3 1に、 P TH 1 8 5 の挿入べプチド配列を配列番号 3 2に、 P TH 1 8 6の揷入ぺプチド配 列を配列番号 3 3に、 P TH 1 8 7の挿入べプチド配列を配列番号 3 4 に、 p TH 1 8 8の挿入ペプチド配列を配列番号 3 5に、 p TH 1 8 9 の揷入ぺプチド配列を配列番号 3 6に、 P TH 1 9 0の揷入ぺプチド配 列を配列番号 3 7に、 p TH 1 9 1の掙入ぺプチド配列を配列番号 3 8 に、 p TH 1 9 2の挿入ペプチド配列を配列番号 3 9に、 P TH 1 9 3 の挿入べプチド配列を配列番号 4 0に、 p TH 1 9 4の挿入べプチド配 列を配列番号 4 1に、 p TH 1 9 5の挿入べプチド配列を配列番号 4 2 に、 p TH 1 9 6の挿入ペプチド配列を配列番号 4 3に、 p TH 1 9 7 の揷入ペプチド配列を配列番号 4 4に、 p TH 1 9 8の挿入ペプチド配 列を配列番号 4 5に、 P TH 1 9 9の揷入ぺプチド配列を配列番号 4 6 に、 p TH 2 0 0の揷入ぺプチド配列を配列番号 4 7に示す。
前記 2 4種類の人工遺伝子が挿入された発現ベクター p TH 1 7 Ί〜 p TH 2 0 0の翻訳産物の中で、 発現量の多い p TH 1 7 7、 p TH l 7 8、 p TH 1 8 0、 p TH 1 8 1、 p TH 1 8 3、 p TH 1 8 4、 p TH 1 8 5 p TH 1 8 6、 p TH 1 8 7、 p TH 1 8 8、 p TH 1 8 9、 p TH 1 9 0、 p TH 1 9 2、 p TH 1 9 4、 p TH 1 9 5、 p T H 1 9 6、 p TH 1 9 7、 p TH 1 9 8、 p TH 1 9 9、 p TH 2 0 0 の各人工タンパク質について、 発現べクタ一に由来する N末端のポリヒ スチジン残基を利用することによって次のように精製した。 各発現ブラ スミ ドをもつ大腸菌 XL I B l u e株の 5 0 0 m lスケールの培養を 3 7 °Cで開始し、 培養液の OD 6 6 Qが 0. 2に達した時点で発現誘導剤で ある I P T Gを 0. 2 4 gZ 1 になるように加え、 さらに 3時間培養を 続け、 培養液を 3 , 0 0 0 gで 1 0分間遠心し、 集菌した。
上記集菌した菌体を 4 0m lの溶菌バッファー （ 5 0 mMの N a H2 P O 4 ( p H 8. 0)、 1 0 mMの T r i s — H C 1 ( p H 8. 0 )、 6 Mの塩酸グァニジン、 l O O mMの N a C し I mMの PMS F) に懸 濁し、 3 7 °Cで 1時間インキュベートし、 7 , 0 0 0 g X 3 0分間遠心 して得られた上清を、 溶菌バッファーで平衡化前処理した 5 0 %TAL ON樹脂 （クロンテック社） 液 4m l と混合し、 室温で 2 0分間緩やか に攪拌した後、 7 0 0 g X 5分間遠心した。 次いで、 上清を捨て、 2 0 m 1 の溶菌バッファ一で洗浄し、 室温で 1 0分間緩やかに攪拌した後、 7 0 0 g X 5分間遠心して上清を捨て溶菌バッファ一による洗浄を繰り 返した。 次に、 2 m 1 の溶菌バッファ一を加え、 voltexで懸濁し、 カラ ムに充填し、 6 m 1 の洗浄バッファー （ 5 0 mMの N a H2 P 04 ( p H 7. 0)、 8 Mの尿素、 l O OmMの N a C し 1 5mMのイミダゾ一ル） で洗浄した後、 溶出バッファ一 （ 5 0 mMの N aH2 P〇4 (p H 5. 0), 2 0mMの ME S ( p H 5. 0 )、 8 Mの尿素、 l O OmMの N a C l、 2 5 OmMのィミダゾ一ル） で TAL ON樹脂に結合した精製タンパク 質を溶出させた。 精製夕ンパク質を含む溶出分画を 5 0 mMの T r i s 一酢酸、 pH 4. 0、 l O O mMの N a C し I mMの EDTAで透析 (ピアス社、 分画分子量 1万） し、 限外濾過膜 （アミコン社、 セントリ ップ、 分画分子量 1万） で濃縮後、 濃度を測定し精製標本とした。
実施例 2
2 0種の精製タンパク質を 3週ごと 3回にわけて、 2 0〜 2 5 gを それぞれ 5匹のマウス （BAL BZc )、合計 1 0 0匹の脾臓に注射する ことにより免疫し、 最終免疫から 5日目に血液をマウス網膜血管から採 取した。 また、 H I V g p 1 2 0ループ 3領域を含む 4 0 m e rの合成 ペプチド I NCTR PNNNTRKS I R I QRGP GRT FNT I G K I GNMR Q AH C N I (配列番号 4 8) を用いて同様に免疫した 5 匹のマウス （BAL BZc ) から採取した血液を対照 （V 3) として用 いた。 次に、 常法により、 H I V g p 1 2 0ループ 3領域を含む 4 0 m e rの合成ペプチドを用いた E L I S A実験を行い、 免疫誘導能力を評 価した。 E L I S Aは、 9 6穴プレート （ファルコン社、 3539) に上記 合成ペプチド （配列番号 48 ) を固相化した後、 マウス血清を一次抗体 として吸着させ、 洗浄の後、 二次抗体としてペルォキシダ一ゼ結合ヒッ ジ抗マウス I g G抗体（アマシャムフアルマシアバイオテク社） を加え、 洗浄の後、 OPD (o-Phenylenediamine) を基質として発色させ、 波長 4 9 2 nmにおける吸光度を測定することにより行った。
p TH 1 7 7、 p TH 1 7 8、 p TH 1 8 0、 p TH 1 8 1、 p TH 1 84、 p TH 1 8 5、 p TH 1 8 6、 p TH 1 8 8、 p TH 1 9 0、 p TH 1 9 2からの精製夕ンパク質及び対照としての H I V g p 1 2 0 ループ 3領域を含む 4 0 m e rの合成ペプチドを免疫原として用いた免 疫実験の、それぞれ 5匹の免疫マウスから得た血清を 2 5 0 0倍希釈し、 E L I S Aを行った。 結果を図 1 0に示す。 図 1 0に示される結果は、 これらの人工タンパク質がマウスの生体内で異物として認識され、 免疫 反応を誘導することを示している。 また、 対照実験である H I V g p 1 2 0ループ 3領域を含む 40 m e rの合成べプチドで免疫したマウスか らは該合成べプチドに対する抗血清は予想通りの結果が得られなかった, 図 1 0の実験で用いた同一サンプルを、 同一抗原の 5匹のマウス内で 混合し、 いろいろな希釈の後に H I V g p 1 2 0ループ 3領域を含む 4 O me rの配列をもつ合成ペプチドを抗原とした E L I S A実験を行つ た結果を図 1 1に示す。 この結果は、 人工タンパク質の g p 1 2 0ルー プ 3配列に相当する部分に対する抗体が多くのマウスで作られているこ とを示している。
p TH 1 94、 p TH 1 9 5 , p TH 1 9 6、 p TH 1 9 8、 p TH 1 9 9からの精製タンパク質を用いた免疫実験の、 それぞれ 5匹の免疫 マウスから得た血清を別々に 40 0 0倍希釈し、 H I V g p 1 2 0ル一 プ 3領域を含む 4 0 m e rの合成べプチドを抗原とした E L I S Aの結 果を図 1 2に示す。 この結果は、 人工タンパク質の g p 1 2 0ループ 3 配列に相当する部分に対する抗体が多くのマウスで作られていることを 示している。 p TH 1 8 3、 p TH 1 8 7、 p TH 1 8 9、 p TH 1 9 7、 p TH 2 0 0からの精製タンパク質を用いた免疫実験の、 それぞれ 5匹の免疫 マウスから得た血清を 5 0 0 0倍希釈し、 H I V g p 1 2 0ループ 3領 域を含む 40me rの合成ペプチドを抗原とした E L I S Aの結果を図 1 3に示す。 産業上の利用可能性
本発明のェピトープの免疫原性が増強された人工夕ンパク質を用いる と、 生体での体液性免疫を誘導することができる。 また、 かかる人工夕 ンパク質を用いてマウスその他の動物を免疫することにより、 前記ェピ ト一プに対する抗体を簡便かつ効率的に製造することができ、 得られた 抗体は、 抗体を用いた治療や抗体を用いた診断に利用できる。 前記人工 夕ンパク質をコードする DNAを DNAワクチンとして用いることによ り、 生体での細胞性免疫を誘導することができる。 そして、 これらの体 液性免疫、 細胞性免疫の誘導は、 マラリアなど広い抗原に対するヮクチ ンとして利用できることを示している。 さらに、 人工タンパク質を発現 する腸内細菌等は脱感作 ·免疫寛容の誘導にも利用できる他、 生体内で 免疫寛容状態のタンパク質 （癥抗原や胎児抗原など） に免疫反応を引き 起こさせる手法としても利用できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ぺプチド性ェピトープのアミノ酸配列の全部又はその一部を含むァ ミノ酸配列から構成されていることを特徴とするェピト一プの免疫原性 が増強された人工夕ンパク質。
2 . ぺプチド性ェピトープのアミノ酸配列の全部又はその一部を含み、 タンパク質の高次構造形成を補助する性質が付与されたアミノ酸配列か ら構成されていることを特徴とする請求項 1記載のェピトープの免疫原 性が増強された人工タンパク質。
3 . ペプチド性ェピトープのアミノ酸配列の全部又はその一部を含み、 免疫担当細胞による抗原提示処理を補助する性質が付与されたアミノ酸 配列から構成されていることを特徴とする請求項 1記載のェピト一プの 免疫原性が増強された人工夕ンパク質。
4 . ぺプチド夕グ又はマーカ一夕ンパク質が融合していることを特徴と する請求項 1〜 3のいずれか記載のェピト一プの免疫原性が増強された 人エタンパク質。
5 . ペプチドタグがポリヒスチジン残基であることを特徴とする請求項 4記載のェピトープの免疫原性が増強された人エタンパク質。
6 . ペプチド性ェピトープのアミノ酸配列が、 配列番号 1に示されるァ ミノ酸配列であることを特徴とする請求項 1〜 5のいずれか記載のェピ ト一プの免疫原性が増強された人エタンパク質。
7 . ぺプチド性ェピトープのアミノ酸配列の全部又はその一部を含むァ ミノ酸配列が、 配列番号 2 4〜4 7のいずれかに示されるアミノ酸配列 であることを特徴とする請求項 1〜 6のいずれか記載のェピトープの免 疫原性が増強された人工タンパク質。
8 . 請求項 1〜 7のいずれか記載のェピト一プの免疫原性が増強された 人工夕ンパク質を含んでなることを特徴とする免疫応答の誘導剤。
9. 免疫応答が体液性免疫であることを特徴とする請求項 8記載の免疫 応答の誘導剤。
1 0. 免疫応答が細胞性免疫であることを特徴とする請求項 8記載の免 疫応答の誘導剤。
1 1. 請求項 1〜 7のいずれか記載のェピト一プの免疫原性が増強され た人工タンパク質を抗原として用いることを特徴とする抗体の製造方法,
1 2. 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 1 1記 載の抗体の製造方法。
1 3. 請求項 1 1又は 1 2記載の抗体の製造方法により得られることを 特徴とする抗体。
1 4. 請求項 1 3記載の抗体を産生する細胞。
1 5. 請求項 1〜 7のいずれか記載のェピトープの免疫原性が増強され た人エタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞 1 6. 腸内細菌であることを特徴とする請求項 1 5記載の宿主細胞。
1 7. 請求項 1 6記載の腸内細菌を含んでなることを特徴とする脱感 作 ·免疫寛容状態の誘導剤。
1 8. 請求項 1〜 7のいずれか記載のェピト一プの免疫原性が増強され た人工タンパク質をコ一ドする DNA。
1 9. 塩基配列の読み枠を異にした場合、 該塩基配列の少なくとも 1つ の読み枠にぺプチド性ェピトープがコ一ドされ、 他の読み枠に該ぺプチ ド性ェピトープの抗原性を高めるような性質を付与しうるべプチドがコ —ドされていることを特徴とする請求項 1 8記載の DNA。
2 0. 請求項 1 8又は 1 9記載の DN Aを含んでなることを特徴とする 免疫応答誘導用 D N Aワクチン。
2 1. 免疫応答が体液性免疫であることを特徴とする請求項 2 0記載の 免疫応答誘導用 D N Aワクチン。
2 2 . 免疫応答が細胞性免疫であることを特徴とする請求項 2 0記載の 免疫応答誘導用 D N Aワクチン。
2 3 . 請求項 1〜 7のいずれか記載のェピトープの免疫原性が増強され た人工タンパク質を有効成分として含有する機能性食品。
2 4 . 脱感作 ·免疫寛容状態を誘導することができる請求項 2 3記載の 機能性食品。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010141320A1 (en) * 2009-06-01 2010-12-09 Mariposa Biotechnology, Inc. Device for removing cumulus from oocytes

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4644680B2 (ja) * 2004-10-15 2011-03-02 積水化学工業株式会社 動物の免疫方法、免疫用組成物、抗体の製造方法、ハイブリドーマの製造方法、及びモノクローナル抗体の製造方法
WO2015002134A1 (ja) * 2013-07-02 2015-01-08 公益財団法人がん研究会 細胞性免疫誘導ワクチン
US20210040174A1 (en) * 2019-08-08 2021-02-11 Navrogen, Inc. Composition and Use of Humoral Immune Suppressor Antagonists for the Treatment of Humoral Immune Suppressed Diseases

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5914109A (en) * 1990-06-15 1999-06-22 New York University Heterohybridomas producing human monoclonal antibodies to HIV-1
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5683695A (en) * 1993-02-10 1997-11-04 United Biomedical, Inc. Production of recombinant proteins containing multiple antigenic determinants linked by flexible hinge domains
JP2004500810A (ja) * 1999-12-09 2004-01-15 ヒューマン　ジノーム　サイエンシーズ，　インコーポレイテッド Ｉｌ−６様ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体
JP2001352990A (ja) * 2000-06-16 2001-12-25 Japan Science & Technology Corp 多機能塩基配列及びそれを含む人工遺伝子

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. FOMSGAARD ET AL.: "Improved humoral and cellular immune responses against the gp120 V3 loop of HIV-1 following genetic immunization with a chimeric DNA vaccine encoding the V3 inserted into the hepatitis B surface antigen", SCAND. J. IMMUNOL., vol. 47, no. 4, 1998, pages 289 - 295, XP000857024 *
A. GAL-ON ET AL.: "Characterization of genetically modified cucumber mosaic virus expressing histidine-tagged 1a and 2a proteins", ARCH. VIROL., vol. 145, 25 January 2000 (2000-01-25), pages 37 - 50, XP002907703 *
A. TANG ET AL.: "Self-assembled peptides exposing epitopes recognizable by human lymphoma cells", BIOCONJUGATE CHEM., vol. 11, no. 3, May 2000 (2000-05-01), pages 363 - 371, XP002907702 *
B.R. MINEV ET AL.: "Synthetic insertion signal sequences enhance MHC class I presentation of a peptide from the melanoma antigen MART-1", EUR. J. IMMUNOL., vol. 30, no. 8, August 2000 (2000-08-01), pages 2115 - 2124, XP002907701 *
J.D. FONTENOT ET AL.: "Human immunodeficiency virus (HIV) antigens: structure and serology of multivalent human mucin MUC1-HIV V3 chimeric proteins", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 92, 1995, pages 315 - 319, XP002907704 *
M. HONDA ET AL.: "Protective immune responses induced by secretion of a chimeric soluble protein from a recombinant mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin vector candidate vaccine for human immunodeficiency virus type 1 in small animals", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 92, 1995, pages 10693 - 10697, XP002907705 *
See also references of EP1329507A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010141320A1 (en) * 2009-06-01 2010-12-09 Mariposa Biotechnology, Inc. Device for removing cumulus from oocytes

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