WO2002029006A3 - Procédé pour le mesurage parallèle des variations génétiques - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne la détermination de l'identité d'un nucléotide à étudier dans une molécule d'acide nucléique cible par combinaison de la cible avec deux amorces. On immobilise la première amorce sur un substrat, et elle s'hybride avec et se développe depuis un emplacement 3' du nucléotide à étudier dans la cible, de façon à incorporer le complément du nucléotide à étudier dans un premier produit d'extension. La seconde amorce s'hybride alors avec et se développe sur la base du premier produit d'extension, qui est immobilisé sur le substrat via la première amorce, en un emplacement 3' du complément du nucléotide à étudier, de façon à incorporer le nucléotide à étudier dans un second produit d'extension. Le second produit d'extension se dissocie alors du premier produit d'extension, et donc du substrat, et se ré-hybride avec une autre molécule d'amorce qui ne s'est pas développée. La première amorce non développée se développe alors depuis un emplacement 3' du nucléotide à étudier dans le second produit d'extension, de façon à former, par combinaison avec le second produit d'extension, un fragment d'acide nucléique à double brin. Les deux amorces sont conçues pour incorporer une partie de la séquence de reconnaissance d'une endonucléase de restriction (RE) qui reconnaît une séquence nucléotide partiellement variable interrompue, en l'occurrence une séquence sous la forme D-N-S où D et S désignent des séquences de nucléotides spécifiques essentielles pour la reconnaissance de la RE, et N est une séquence constituée de n nucléotides viables également nécessaires à la reconnaissance de la RE. La première amorce incorpore la séquence D, la seconde amorce incorpore la séquence S, et elles sont conçues, dans la perspective de la cible, de façon à produire un fragment d'acide nucléique où les séquences constantes D et S sont séparées par la séquence variable N, où le nucléotide à étudier se trouve dans la région N. L'action de la RE sur le fragment d'acide nucléique fournit un petit fragment d'acide nucléique qui se prête à la caractérisation, de façon à révéler l'identité du nucléotide à étudier.
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