JPH078289A - リボソームを用いたペプチドおよびタンパク質の合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 インビトロのタンパク質合成系において、ア
ミノアシルおよびミスアミノアシルtＲＮＡならびに人
工mＲＮＡを用いて任意のアミノ酸配列を有するペプチ
ドおよびタンパク質を合成する新規な方法が提供され
る。 【効果】 本方法によれば、天然アミノ酸および非天然
アミノ酸を用いて任意にペプチドおよびタンパク質を合
成することができる。即ち、本発明は、種々の工業分野
ならびに生化学、分子生物学およびタンパク質工学など
の基礎研究分野において重要な基礎技術を提供するもの
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はペプチドおよびタンパク
質の新規な合成法に関する。更に詳しくは、本発明は、
インビトロのタンパク質合成系において、アミノアシル
およびミスアミノアシルtＲＮＡならびに人工mＲＮＡを
用いて任意のアミノ酸配列を有するペプチドおよびタン
パク質を合成する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ペプチドおよびタンパク質は、医薬品工
業、食品工業、化学工業、電子工業などの分野で広く利
用されている。また、近年ではコンピューターによるタ
ンパク質の分子設計技術の発達により、タンパク質の構
造・機能の相関の研究、ならびにその知見に基づくタン
パク質工学の発展が注目されている。タンパク質工学の
成果を充分に実現するためには、短時間に種々のアミノ
酸配列を有するタンパク質を合成することが必要であ
る。

【０００３】現在、ペプチドおよびタンパク質を合成す
る手段としては、化学的合成法、酵素法、遺伝子組換え
法、インビトロのタンパク質合成系による合成法などが
存在する。

【０００４】ペプチドの化学的合成法は、アミノ酸のア
ミノ基と側鎖の官能基を適当な保護基で保護しながら、
縮合剤を用いて逐次的に合成していく方法である。アミ
ノ基の保護基としては、t−ブチルオキシカルボニル基
(t−Ｂoc基)(文献１：本明細書中で引用した参考文献は
まとめて後記する)や９−フルオレニルメチルオキシカ
ルボニル基(Ｆ−moc基)(文献２)などが挙げられる。縮
合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣ
Ｃ)がよく用いられている。反応は、液相法または固相
法で行われる。液相法は、通常の有機合成法と同様に溶
液状態で反応させるものである。液相法で合成する場合
は、反応と精製を一残基毎に行う。このために多くの時
間と労力がかかるが、精製度の高いペプチドが得られ
る。固相法は、ポリスチレンやポリアクリルアミドなど
の不溶性の担体にＣ末端アミノ酸を固定化して担体上で
ペプチドを伸長させる方法であり、1963年にＭerrifiel
dによって開発された(文献４)。この方法によると、工
程途中の精製はできないが、操作が容易であり、自動化
が可能であり、自動合成機も一般に市販されている。こ
の自動合成機によって４０残基程度のペプチドを合成す
ることができる。しかし、どちらの方法によっても、目
的生成物の他に微量に生ずる副産物の分離が非常に困難
であるという欠点がある。また、縮合反応を繰返すこと
により指数関数的に副産物が累積するため、分子量の大
きなタンパク質は合成することができない。しかし、非
天然アミノ酸を含むペプチドを合成することができると
いう利点がある。

【０００５】酵素法は、アミノ酸の縮合反応に酵素を利
用するものであり、プロテアーゼによるペプチド結合の
逆合成と、アミノアシルtＲＮＡシンテターゼ(ＡＲＳ)
による合成法が知られている。プロテアーゼによるペプ
チド合成としては、1938年にＢergmannらが保護ジペプ
チドをパパインによって逆合成したのが最初の例である
(文献５)。酵素としては、パパインの他、α−キモトリ
プシンやカルボキシペプチダーゼＹ、トリプシン、ペプ
シンなどのプロテアーゼが用いられ(文献６)、多くの種
類のペプチドが合成されている(文献７)。また、ＡＲＳ
を利用する方法では、tＲＮＡのアミノアシル化反応の
反応中間体であるアミノアシルＡＭＰ・ＡＲＳ複合体を
求核成分として用い、第２のアミノ酸成分を逐次反応さ
せてペプチドを形成する(文献８)。これら酵素法による
合成は縮合効率が悪く、小さなペプチドやキメラタンパ
ク質の合成に用いられている程度で、逐次合成によるタ
ンパク質の全合成には適していない。

【０００６】遺伝子組換え法は、適当な宿主−ベクター
系に目的タンパク質の遺伝子を組込み、宿主生物に目的
タンパク質をインビボで合成させる方法であり、1973年
にＣhoenとＢoyerらによって確立された(文献９)。この
方法によれば、化学合成法および酵素法では合成不可能
な大きな分子量のタンパク質の合成が可能である。しか
し、この方法によって実用的なレベルで微生物に目的遺
伝子を発現させようとすると、目的遺伝子に適した発現
ベクターの選択、菌の培養条件の検討、生成物の分離お
よび精製など、多くの検討項目を解決する必要がある。
また、毒性タンパク質や菌体内タンパク質分解酵素の攻
撃を受けやすい小さなペプチドなどの生産には特に困難
を伴う。更に、インビボ合成においては、tＲＮＡへの
アミノ酸の結合はアミノアシルtＲＮＡシンテターゼに
よって厳密に制御されており、タンパク質に非天然アミ
ノ酸を導入することはほとんど不可能である。

【０００７】インビトロのタンパク質合成系を用いる合
成法は、大腸菌などの細胞内タンパク質合成系を試験管
内に移し、目的タンパク質の遺伝子またはmＲＮＡとタ
ンパク質合成に必要な因子を加えて、目的タンパク質を
合成させる方法であり、1961年にＮirenbergらが外因性
mＲＮＡに依存したインビトロタンパク質合成系を確立
したのが最初である(文献１０)。その後、多くの生物か
らインビトロタンパク質合成系が調製されているが、一
般に、バッチ法による合成では数時間で反応が停止し、
実用レベルのタンパク質を得ることは困難である。最
近、Ｓpirinらは、必要な基質を連続的に反応系に供給
することによって、合成反応を数十時間に延長し、mg単
位の目的タンパク質が得られるシステムを開発した(文
献１１)。この方法によれば、宿主生物からの目的タン
パク質の精製過程が大幅に簡素化される、毒性タンパク
質やタンパク質分解酵素によって分解されやすいペプチ
ドなども合成できる、あるいは非天然アミノ酸を含むタ
ンパク質を合成できるなどの利点がある。

【０００８】このように、遺伝子組換え技術およびイン
ビトロのタンパク質合成系による合成法によれば、化学
合成法および酵素法では不可能な高分子量のタンパク質
を合成することができる。更に、インビトロタンパク質
合成系による合成法を用いると、非天然アミノ酸含有タ
ンパク質の合成も可能である。しかし、遺伝子組換え技
術およびインビトロタンパク質合成系による合成では、
目的タンパク質のアミノ酸配列情報は遺伝子ＤＮＡまた
はmＲＮＡの形で予め用意されなければならない。即
ち、これらの遺伝子は他の生物から既にクローニングさ
れているか、または化学的に合成しておかなければなら
ない。従って、特定タンパク質の一次構造の部分的な変
更や、任意のアミノ酸配列を持つペプチドまたはタンパ
ク質を合成する場合は、必要な遺伝子を調製および改変
する工程が必要となる。これらの工程には、目的遺伝子
の生体からのクローニングまたは化学的合成と精製、塩
基配列の決定、一部の塩基配列の改変など、大腸菌の宿
主−ベクター系を用いた複雑な実験操作が含まれてい
る。このため、全く新規なアミノ酸配列を有するタンパ
ク質を合成する場合、およびこれらタンパク質の一次構
造を様々に改変するような実験においては、大腸菌を用
いた遺伝子組換え技術やインビトロのタンパク質合成系
による合成法では限界がある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、種々の
天然ペプチドまたはタンパク質ならびに非天然アミノ酸
含有ペプチドまたはタンパク質の合成方法としては、イ
ンビトロのタンパク質合成系による合成法が適してい
る。しかし、この方法においては、アミノ酸配列情報が
mＲＮＡ上に存在するため、タンパク質の一次構造を任
意に変更して迅速に目的タンパク質を合成したり、タン
パク質内に複数の非天然アミノ酸を導入することは困難
である。そこで本発明者らは、インビトロのタンパク質
合成系において、目的タンパク質のアミノ酸配列順序を
内在性のmＲＮＡによって規定するのではなく、系の外
部から任意に指示できるようにすることにより、任意の
アミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質を合成
する方法を得ようとした。

【００１０】

【課題を解決するための手段】インビボまたはインビト
ロのタンパク質合成において、mＲＮＡ上の遺伝暗号は
リボソームによってタンパク質に翻訳される。mＲＮＡ
の３塩基連鎖(遺伝子コドン)が遺伝暗号の単位であり、
このコドンは６４種類存在する。mＲＮＡ上の遺伝暗号
をアミノ酸配列情報として解読するのはアミノアシルt
ＲＮＡであり、ストップコドンを除く６１種類すべての
遺伝子コドンに対してそれぞれ特異的なtＲＮＡが存在
する。各々のtＲＮＡにはアミノアシルtＲＮＡシンテタ
ーゼ(ＡＲＳ)によってそれぞれ決められたアミノ酸が結
合される。ＡＲＳの厳密な特異性によって、遺伝子コド
ンとアミノ酸の対応が保証されている。

【００１１】最近、Ｈechtらは、tＲＮＡに本来結合す
べきアミノ酸以外のアミノ酸または非天然アミノ酸が結
合したミスアミノアシルtＲＮＡを化学的に合成し得る
ことを示した(文献１２および１３)。このようなミスア
ミノアシルtＲＮＡは正常なアミノアシルtＲＮＡと同様
にリボソームによるタンパク質合成系において基質とな
り、タンパク質に取込まれることが示されている(文献
１４、１５および１６)。またＳhultzらは、ＵＡＧコド
ン(ストップコドン)を認識するサプレッサーtＲＮＡに
化学的に種々の非天然アミノ酸を結合させて人工ミスア
ミノアシルtＲＮＡを合成し、β−ラクタマーゼ遺伝子
の特定部位をＵＡＧコドンに置換することにより、イン
ビトロタンパク質合成系においてβ−ラクタマーゼタン
パク質に部位特異的に非天然アミノ酸を組込むことに成
功した(文献１７)。このように、tＲＮＡとアミノ酸の
結合を人為的に変更することによりミスアミノアシルt
ＲＮＡを合成して、任意のアミノ酸や非天然アミノ酸を
タンパク質に組込むことが可能である。

【００１２】本発明者らは、予め決めた配列を有する人
工mＲＮＡと上記のミスアミノアシルtＲＮＡを用い、イ
ンビトロのタンパク質合成系において逐次的に伸長反応
させることによって、任意のアミノ酸配列を有するペプ
チドまたはタンパク質を合成できるのではないかと考
え、鋭意研究を行なった。その結果として、本発明を完
成するに至ったものである。

【００１３】即ち、本発明は、互いに異なる複数の遺伝
子コドンに対応する複数のtＲＮＡのそれぞれについ
て、対応の天然アミノ酸の結合したアミノアシルtＲＮ
Ａおよび非対応の天然もしくは非天然アミノ酸の結合し
たミスアミノアシルtＲＮＡを用意し、該複数の遺伝子
コドンの繰返し構造を持つ人工mＲＮＡを鋳型として用
意し、該mＲＮＡおよびリボソームを含むインビトロの
タンパク質合成系に、導入しようとするアミノ酸成分が
結合したアミノアシルまたはミスアミノアシルtＲＮＡ
のみを加え、逐次的に伸長反応させることを特徴とす
る、任意のアミノ酸配列を有するペプチドの合成法を提
供するものである。本発明の方法によれば、天然アミノ
酸および非天然アミノ酸を用いて任意にペプチドおよび
タンパク質を合成することができる。従って、本発明
は、種々の工業分野ならびに生化学、分子生物学および
タンパク質工学などの基礎研究分野において重要な基礎
技術を提供するものである。

【００１４】本発明を実施する際の最も簡単な例は、互
いに異なる複数の遺伝子コドンが２種類である場合であ
る。この場合、これら２種類の遺伝子コドンが交互に配
列した人工mＲＮＡを鋳型として用いる。一方、上記２
種類の遺伝子コドンに対応する２種類のtＲＮＡのそれ
ぞれについて、対応の天然アミノ酸の結合したアミノア
シルtＲＮＡおよび非対応の天然もしくは非天然アミノ
酸の結合したミスアミノアシルtＲＮＡを用意する。次
いで、上記mＲＮＡおよびリボソームを含むインビトロ
のタンパク質合成系に、導入しようとするアミノ酸成分
が結合したアミノアシルまたはミスアミノアシルtＲＮ
Ａのみを加え、逐次的に伸長反応させることによって、
任意のアミノ酸配列を持つペプチドを合成することがで
きる。

【００１５】例えば、アラニルグリシルチロシンという
トリペプチドを逐次反応で合成する場合を以下に説明す
る。人工mＲＮＡとしては、例えばフェニルアラニンお
よびグルタミン酸の遺伝子コドンＵＵＵおよびＧＡＧを
用いて、ＵＵＵＧＡＧという塩基配列の繰返し構造を含
むmＲＮＡを用意する。大腸菌より調製したリボソーム
に、この人工mＲＮＡとＳ１００画分、およびインビト
ロのタンパク質合成に必要な成分を含む緩衝液を加え
る。次いで、目的ペプチドの第１アミノ酸であるアラニ
ンがtＲＮＡ^Phe(対応のアミノ酸がフェニルアラニンで
あり、mＲＮＡ上のフェニルアラニンのコドンと複合体
を形成するtＲＮＡ)に結合したミスアミノアシルtＲＮ
Ａを加えて３７℃で適当時間(例えば１５分)反応させる
と、mＲＮＡ上のフェニルアラニンのコドンとリボソー
ムとアラニルtＲＮＡ^Pheの間で結合が生じ、複合体が形
成される。この時、mＲＮＡ上のフェニルアラニンのコ
ドンの次はグルタミン酸のコドンであり、反応系にアミ
ノアシルtＲＮＡ^Gluが存在しないため、ペプチド形成反
応はこれ以上進行することができない。この複合体を、
例えば分子篩クロマトグラフィーなどの手法によって他
の成分より分離する。次に、この複合体画分を、例えば
限外ろ過法などによって濃縮する。このように濃縮され
たリボソーム−mＲＮＡ−アラニルtＲＮＡ^Phe複合体
を、目的ペプチドの第２アミノ酸を結合させるために用
いることができる。

【００１６】即ち、濃縮した複合体画分に、Ｓ１００画
分、インビトロタンパク質合成に必要な成分を含む適当
な緩衝液、および目的ペプチドの第２アミノ酸であるグ
リシンがtＲＮＡ^Gluに結合したグリシルtＲＮＡ^Gluを加
え、同様に３７℃で適当時間反応させると、リボソーム
上で第１のミスアミノアシルtＲＮＡ(アラニルtＲＮＡ
^Phe)と第２のミスアミノアシルtＲＮＡ(グリシルtＲＮ
Ａ^Glu)の間で反応が起こり、アラニルグリシルtＲＮＡ
^Gluが形成される。この時、アラニルグリシルtＲＮＡ
^GluはmＲＮＡ上のグルタミン酸コドンに結合しており、
その隣にはフェニルアラニンのコドンが存在するが、反
応系にはアミノアシルtＲＮＡ^Pheが存在しないため、こ
れ以上のペプチド形成反応は進行しない。従って、アラ
ニルグリシンのみが形成される。そこで、再び、このリ
ボソーム−mＲＮＡ−アラニルグリシルtＲＮＡ^Glu複合
体を、分子篩クロマトグラフィーによって他の成分より
分離し、限外ろ過により濃縮する。

【００１７】得られた複合体画分に、Ｓ１００画分、イ
ンビトロタンパク質合成に必要な成分を含む適当な緩衝
液、および目的ペプチドの第３アミノ酸であるチロシン
がtＲＮＡ^Pheに結合したチロシルtＲＮＡ^Pheを加え、同
様に３７℃で適当時間反応させると、リボソーム上でア
ラニルグリシルtＲＮＡ^GluとチロシルtＲＮＡ^Pheの間で
反応が起こり、アラニルグリシルチロシルtＲＮＡ^Pheが
形成される。この時、アラニルグリシルチロシルtＲＮ
Ａ^PheはmＲＮＡ上のフェニルアラニンコドンに結合して
おり、その隣にはグルタミン酸のコドンが存在するが、
反応系にはアミノアシルtＲＮＡ^Gluが存在しないため、
これ以上のペプチド形成反応は進行しない。従って、ア
ラニルグリシルチロシンのみが形成される。

【００１８】このように目的のペプチドが合成された
後、例えばフェノール抽出によって反応液よりペプチジ
ルtＲＮＡを含むＲＮＡ画分を得ることができる。この
ＲＮＡ画分を例えばアルカリ加水分解することにより、
ＲＮＡを分解して、目的ペプチドをtＲＮＡより離脱さ
せることができる。次に、得られた目的ペプチドとＲＮ
Ａの分解物より、例えば逆相クロマトグラフィーなどの
手法によって目的ペプチドのみを精製することができ
る。

【００１９】即ち、上記したペプチドの逐次的合成反応
は、(a)目的ペプチドのＮ末端アミノ酸の結合したアミ
ノアシルまたはミスアミノアシルtＲＮＡがリボソーム
およびmＲＮＡと複合体を形成する反応(開始反応)、(b)
リボソーム−mＲＮＡ−(ミス)アミノアシルtＲＮＡ複合
体上で目的ペプチドの第２アミノ酸残基から逐次的にペ
プチド鎖を伸長する反応(伸長反応またはペプチド形成
反応)、および(c)リボソーム−mＲＮＡ−ペプチジルtＲ
ＮＡ複合体から目的ペプチドを分離する反応(終結反応)
の３つの反応サイクルに分解することができる。

【００２０】工程(a)の開始反応サイクルは、目的ペプ
チドのＮ末端アミノ酸の結合したアミノアシルまたはミ
スアミノアシルtＲＮＡがリボソームおよびmＲＮＡと複
合体を形成する反応、リボソーム−mＲＮＡ−(ミス)ア
ミノアシルtＲＮＡ複合体の高速分子篩クロマトグラフ
ィーによる分離、およびリボソーム−mＲＮＡ−(ミス)
アミノアシルtＲＮＡ複合体画分の限外ろ過法による濃
縮の３つのステップからなる。

【００２１】工程(b)の伸長反応サイクルは、アミノ酸
を１個づつ逐次的に結合するための反応サイクルであ
る。このサイクルは、リボソーム−mＲＮＡ−ペプチジ
ル[Ｎ個のアミノ酸よりなるペプチド(Ｎは１またはそれ
以上の整数である)]tＲＮＡ複合体上で(Ｎ＋１)番目の
アミノ酸残基を結合させるペプチド形成反応、リボソー
ム−mＲＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体の高速分子篩ク
ロマトグラフィーによる分離、およびリボソーム−mＲ
ＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体画分の限外ろ過法によ
る濃縮の３つのステップからなる。この反応サイクルの
繰返しによって任意の数のアミノ酸を結合させることが
でき、任意のアミノ酸配列を有するペプチドを合成する
ことができる。

【００２２】工程(c)の終結反応サイクルは、リボソー
ム−mＲＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体からのフェノー
ル抽出とエタノール沈澱によるペプチジルtＲＮＡの回
収、ＲＮＡの加水分解による目的ペプチドの遊離、およ
び目的ペプチドの高速逆相クロマトグラフィーによる精
製の３つのステップからなる。

【００２３】以上においては、互いに異なる複数の遺伝
子コドンが２種類である場合、即ちこれら２種類の遺伝
子コドンが交互に配列した人工mＲＮＡを鋳型として用
いる場合について説明したが、さらに多種類の互いに異
なる遺伝子コドンを用いることもできる。即ち、本発明
の方法において用いる人工mＲＮＡは、以下の配列：

【化２】[Ａ₁Ａ₂・・・・Ａ_m]_n (配列中、ｍは２〜６４の整数であり、ｎは１以上の整
数であって、ｍ×ｎは目的ペプチドのアミノ酸残基数に
等しいかまたはそれ以上であり、Ａ₁、Ａ₂、・・・・お
よびＡ_mは互いに異なる遺伝子コドンである)を含むもの
であってよい。

【００２４】例えば、５種類の互いに異なるコドンの繰
返し構造を有する人工mＲＮＡを鋳型として用いる場合
には、工程(b)のペプチド形成反応に１サイクル当たり
４種類のアミノアシルまたはミスアミノアシルtＲＮＡ
を使用することができ、１サイクル当たり４つのアミノ
酸を一度に伸長させることが可能になる。tＲＮＡは少
なくとも２０種類のコドンを識別することができるの
で、これら２０種類のコドンの繰返し構造を有する人工
mＲＮＡを鋳型として用いると、１サイクル当たり１９
個のアミノ酸を一度に結合させることができる。このよ
うに、本発明の方法によれば、長いペプチドを少ないサ
イクル数で合成することができるので、化学合成では困
難であったタンパク質を合成することが可能になる。

【００２５】原材料および方法 本発明を実施する際に使用する大腸菌のリボソームおよ
びインビトロタンパク質合成系に必要な各種タンパク質
合成因子を含むＳ１００画分は、一般的にはＮollら(文
献１８)の方法に従って調製することができる。即ち、
対数増殖期中期の大腸菌(例えば、ＭＲＥ６００)を１０
mＭマグネシウムイオンを含む緩衝液[例えば、２０mＭ
Ｔris・Ｃl、１０mＭ (ＣＨ₃ＣＯＯ)₂Ｍg、１００mＭ
ＮＨ₄Ｃl、３mＭ ２-メルカプトエタノール(pＨ７.５)]
中で酸化アルミニウムとともにすりつぶし、更にＤＮア
ーゼＩを加えて内在性のＤＮＡを分解する。次に、試料
溶液を遠心(例えば、３０,０００Ｘgで４５分間)して上
清を得る(Ｓ３０画分)。このＳ３０画分を等量の緩衝液
Ｂ[例えば、１.１Ｍスクロース、１０mＭ (ＣＨ₃ＣＯ
Ｏ)₂Ｍg、６０mＭ ＮＨ₄Ｃl、３mＭ ２-メルカプトエタ
ノールを含む１０mＭＴris・Ｃl(pＨ７.５)]に重層し、
分離用超遠心機によって１００,０００Ｘgで２０時間遠
心する。リボソームは透明な沈澱として回収される。ま
た、上清にはタンパク質合成に必要な各種因子が含まれ
ており。Ｓ１００画分としてインビトロタンパク質合成
系に添加して使用することができる。

【００２６】本発明を実施する際に使用する複数の遺伝
子コドンの繰返し構造を持つmＲＮＡとしては、例えば
ポリ(ＡＧ)[ポリＡrg-Ｇluをコードする]、ポリ(ＡＣ)
[ポリＴhr-Ｈisをコードする]、ポリ(ＡＵ)[ポリＩle-
Ｔyrをコードする]、およびポリ(ＣＵ)[ポリＬeu-Ｓer
をコードする]がSIGMA CHEMICAL COMPANYから市販され
ている。また、任意の遺伝子コドンの繰返し構造を持つ
mＲＮＡは、官能基が保護された４種類のＲＮＡヌクレ
オチド(例えば、ＤＭＴ−シアノエチルＲＮＡホスホア
ミダイト試薬)と合成しようとするＲＮＡの３'末端側の
保護基付きＲＮＡヌクレオチドが結合した固相樹脂を用
いて、β−シアノエチル法による固相合成法により目的
の塩基配列の順序で縮合させて化学合成することができ
る(文献１９および２０)。合成には、市販のＤＮＡ合成
装置(例えば、ABI MODEL 380B)を利用することができ
る。合成したＲＮＡフラグメントは樹脂より切り出し、
２'-ヒドロキシル保護基の脱保護(例えば、１Ｍテトラ
ブチルアンモニウムフロリドを含むテトラヒドロフラン
溶液によって室温で６時間処理する)を行なった後、高
速逆相クロマトグラフィーによって精製する(例えば、W
ATERS μ-BONDASPHERE5μ C18-300Åカラムを用いてア
セトニトリルの直線濃度勾配によってＲＮＡフラグメン
トを溶離する)。この合成mＲＮＡを本発明において鋳型
として使用する。

【００２７】本発明を実施する際に使用するアミノアシ
ルtＲＮＡは、アミノアシルtＲＮＡシンテターゼを用い
た西村ら(文献６)の方法により調製することができる。
即ち、アミノアシル化しようとするアミノ酸特異的tＲ
ＮＡに目的アミノ酸、アデノシン三リン酸(ＡＴＰ)およ
びアミノアシルtＲＮＡシンテターゼを加え、適当な緩
衝液中で反応させる。得られた反応液からフェノール抽
出によってタンパク質を除去し、生成したアミノアシル
tＲＮＡをエタノール沈澱によって回収する。基質とな
る各アミノ酸特異的tＲＮＡ、およびアミノアシルtＲＮ
Ａシンテターゼ(大腸菌由来)はSIGMA CHEMICAL COMPANY
より市販されている。ミスアミノアシルtＲＮＡの合成
方法としては、Ｓ.Ｍ.Ｈechtら(文献２１)の方法が知ら
れている。即ち、初めにジヌクレオチド、pＣpＡを化学
的に合成し、更に化学的にpＣpＡの３'末端にアミノ酸
をエステル結合させてアミノアシルpＣpＡを得る。次
に、ヘビ毒ホスホジエステラーゼでtＲＮＡを部分分解
して、３'末端のpＣpＡを除去したtＲＮＡ-Ｃ-ＯＨを得
る。最後に、アミノアシルpＣpＡをtＲＮＡ-Ｃ-ＯＨの
３'末端にＲＮＡリガーゼを用いて酵素的に結合させて
ミスアミノアシルtＲＮＡを得る。

【００２８】一般的なインビトロタンパク質合成系(例
えば、ポリＵ依存性ポリフェニルアラニン合成)の成分
および反応条件は、次に示す通りである(文献２２)。２
０〜６０mＭ Ｔris-ＨＣl(pＨ７.０〜８.０)、１０〜１
５mＭ 塩化マグネシウムまたは酢酸マグネシウム、１０
〜１００mＭ ＮＨ₄Ｃl、１〜１０mＭ ２-メルカプトエ
タノールまたはジチオスレイトール、１〜２mＭ ＡＴ
Ｐ、０.１〜０.５mＭ ＧＴＰ、５〜１５mＭ ホスホエノ
ールピルビン酸ナトリウム、２〜５０μg／ml ピルビン
酸キナーゼ、５０〜１７０μＭ 非標識アミノ酸(フェニ
ルアラニンを除く)、５〜１００μＭ 標識フェニルアラ
ニン(例えば、１０〜１００μＣi／μmolのＬ-[Ｕ-
¹⁴Ｃ]フェニルアラニン)、０.１〜１mg／ml フェニルア
ラニン特異的tＲＮＡ、０.１〜０.８mg／ml ポリＵ、２
〜５０Ａ₂₆₀単位／ml リボソーム、および２mg／ml Ｓ
１００画分をそれぞれ含む１００〜５００μlの反応液
を３７℃で１５〜３０分間インキュベートする。

【００２９】反応終了後の生成物の確認は一般に次のよ
うにして行なう。即ち、１mlの１０％トリクロロ酢酸
(ＴＣＡ)溶液を反応液に添加し、９０℃で２０分間処理
してアミノアシルtＲＮＡおよびペプチジルtＲＮＡより
アミノ酸およびペプチドを離脱させる。次に、沈澱をグ
ラスマイクロファイバーフィルター(例えば、GF/C、Wha
tman International Ltd.)に集め、５％ ＴＣＡで４
回、９９％エタノールで４回洗浄し、フィルターを乾燥
する。次いで、５mlの液体シンチレーションカクテル
(例えば、ECONOFLUOR-2、NEN Research Products)にフ
ィルターを浸潤させ、液体シンチレーションカウンター
(例えば、BECKMAN Model LS5000TD)によってフィルター
内の沈澱画分の放射活性を測定し、生成した産物の量を
推定する。生成物を反応液より精製するためには、一般
のタンパク質の精製に用いられる各種の方法が利用でき
る。即ち、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、等電点
電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などを生成物の精製に利用することができる。

【００３０】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【００３１】実施例１ インビトロのタンパク質合成系
と天然型アミノアシルtＲＮＡを用いた逐次反応による
ペプチドの合成 大腸菌リボソームとＳ１００画分および人工mＲＮＡを
含むインビトロのタンパク質合成系において、天然型ア
ミノアシルtＲＮＡを用いて逐次反応によりトリペプチ
ドを合成した。 Ａ．大腸菌リボソームおよびＳ１００画分の調製ならび
に精製リボソームの性質および活性 Ａ-１．大腸菌の培養 大腸菌 ＭＲＥ６００(ATCC No.29417)は、American Typ
e Culture Collectionより購入した。Ｌ-ブロス培地
は、１０gのバクト−トリプトン(Difco Laboratorie
s)、５gのバクト−酵母エキス(Difco Laboratories)、
５gのＮaＣlおよび１gのグルコースを１Ｌの超純水に溶
解後、pＨを７.５に調整し、オートクレーブ処理して用
いた。超純水はＭＩＬＬＩ−Ｑ ＳＰシステム(日本ミリ
ポア・リミテッド)により調製した。３mlのＬ-ブロス中
で大腸菌 ＭＲＥ６００を一夜培養した後、１ＬのＬ-ブ
ロスに接種して更に３７℃で２.０〜１.５時間培養した
(Ａ₆₀₀＝０.４〜０.６)。大腸菌は１０,０００Ｘgで１
５分間遠心して集菌し、リボソーム調製用の出発材料と
して使用するまで−２０℃で保存した。

【００３２】Ａ-２．リボソームおよびＳ１００画分の
調製 大腸菌７０ＳリボソームおよびＳ１００画分はＮollら
(１８)の方法に若干の変更を加えて調製した。すべての
操作は４℃以下で行った。凍結した大腸菌に２倍量の酸
化アルミニウムを加え、乳鉢ですりつぶした。大腸菌と
酸化アルミニウムが良く混合し、著しく高い粘度を示す
ようになり、乳鉢内ですりつぶすと弾けるような音がす
るようになったときに、等量の緩衝液Ａ[２０mＭ Ｔris
・Ｃl、１０mＭ (ＣＨ₃ＣＯＯ)₂Ｍg、１００mＭ ＮＨ₄
Ｃl、３mＭ ２-メルカプトエタノール(pＨ７.５)]を加
え、更にＤＮアーゼＩ(宝酒造株式会社)を最終濃度が３
μg／mlになるように添加した。再び懸濁液を約１０分
間すりつぶし、懸濁液の粘度が十分に低下した後、３
０,０００Ｘgで４５分間遠心して上清を得た(Ｓ３０画
分)。Ｓ３０画分を等量の緩衝液Ｂ[１.１Ｍ スクロー
ス、１０mＭ (ＣＨ₃ＣＯＯ)₂Ｍg、６０mＭ ＮＨ₄Ｃl、
および３mＭ ２-メルカプトエタノールを含む１０mＭ
Ｔris・Ｃl(pＨ７.５)]に重層し、分離用超遠心機 BECK
MAN MODEL L8Mによって１００,０００Ｘg(Type 45 Tiロ
ーター、３０,０００x rpm)で２０時間遠心した。透明
な沈澱をリボソームとして、また、上層(上清の２／３)
をＳ１００粗画分として回収した。透明なリボソームの
沈澱を緩衝液Ａに穏やかに懸濁し、約２時間緩やかに撹
拌してリボソームを分散させた。得られたリボソーム溶
液を緩衝液Ｂに再度重層して１００,０００Ｘg(Type 45
Tiローター、３０,０００x rpm)で２０時間遠心した。
得られたリボソームの沈澱を緩衝液Ａに再び懸濁した
後、緩衝液Ａに対して透析して、以後の実験にリボソー
ム溶液として用いた。得られたリボソーム溶液の２６０
nmの吸光度を測定することによってリボソームの濃度を
決定した。この時、２６０nmの吸光度が１.０の溶液を
１.０Ｕ／mlのリボソームとした。リボソーム溶液は使
用するまで−８０℃で保存した。Ｓ１００粗画分は更に
７０％の飽和硫安で分画し、沈澱画分を緩衝液Ａで透析
して、Ｓ１００画分として以後の実験に用いた。Ｓ１０
０画分のタンパク質濃度は２８０nmの吸光度を測定する
ことによって決定した。Ｓ１００画分は使用するまで−
８０℃で保存した。

【００３３】Ａ-３．精製リボソームの性質 ３Ｌの大腸菌培養液より、約８０００Ｕのリボソーム
(１Ｕ＝１ Ａ２６０)が得られた。得られた精製リボソ
ームの純度を検定する目的で、１０mＭおよび１mＭマグ
ネシウムイオンの存在下に蔗糖密度勾配超遠心法により
精製リボソームを分析した。精製リボソームを、１０m
Ｍ Ｍg²⁺および１mＭ Ｍg²⁺の存在下、１０％〜３０％
の蔗糖密度勾配超遠心法によって分析した。蔗糖密度勾
配は次のように調製した。１０％、１５％、２０％、２
５％、および３０％の蔗糖をそれぞれ含む３mＭ ２-メ
ルカプトエタノール、６０mＭ ＮＨ₄Ｃl、１mＭまたは
１０mＭ (ＣＨ₃ＣＯＯ)₂Ｍg、１０mＭ Ｔris・Ｃl(pＨ
７.５)を調製し、シリンジを用いて蔗糖密度の低い溶液
から７.４mlずつ遠心チューブの低部に積層した(全量３
７ml)。次に４℃で一夜放置して蔗糖密度勾配を形成さ
せた。２０Ｕのリボソームを含む０.１mlの１mＭまたは
１０mＭ (ＣＨ₃ＣＯＯ)₂Ｍg、３mＭ ２-メルカプトエタ
ノール、６０mＭ ＮＨ₄Ｃl、１０mＭ Ｔris・Ｃl(pＨ
７.５)溶液を、それぞれ同一のＭg²⁺濃度の蔗糖密度勾
配溶液に重層し、１６０,０００Ｘg(ＳＷ２８、２０,０
００rpm)で１５時間遠心した。遠心終了後、蔗糖密度勾
配溶液を低部より１ml毎に分取した。この結果、１０m
Ｍのマグネシウム存在下では、全リボソームのうち、活
性型リボソームである７０Ｓリボソームのみが検出さ
れ、５０Ｓおよび３０Ｓリボソームサブユニットはほと
んど認められなかった(図１)。一方、７０Ｓリボソーム
は１mＭのマグネシウム存在下ではほぼ完全に５０Ｓと
３０Ｓサブユニットに解離した。これらの結果は、調製
したリボソームが充分な純度を保持していることを示す
ものである。

【００３４】Ａ-４．精製リボソームの活性 次に、精製リボソームのタンパク質合成活性を検討する
目的で、精製リボソームおよび鋳型としてポリウリジル
酸を用いてインビトロのタンパク質合成系により、ポリ
フェニルアラニン合成の活性を測定した。ポリウリジル
酸、リボソームおよびＳ１００画分を用いたインビトロ
タンパク質合成反応はＳpedding(文献２２)の方法に若
干の変更を加えて行った。即ち、１０μlの１０倍濃縮
緩衝液[０.１Ｍ ＭgＣl₂、０.５Ｍ ＮＨ₄Ｃl、１０mＭ
ジチオスレイトール(ＤＴＴ)、１０mＭ アデノシン三リ
ン酸(ＡＴＰ)、１０mＭ グアノシン三リン酸(ＧＴＰ)、
５０mＭ ホスホエノールピルビン酸ナトリウムを含む
０.５Ｍ Ｔris・Ｃl緩衝液(pＨ８.０)]に、１μlの３,
５００Ｕ／ml ピルビン酸キナーゼ(オリエンタル酵母工
業株式会社)、１０μlの２０Ｕ／ml フェニルアラニン
特異的tＲＮＡ(SIGMA CHEMICAL COMPANY)、１μlの１４
０Ｕ／μl リボヌクレアーゼインヒビター(宝酒造株式
会社)、１０μlの２４mg／ml Ｓ１００画分、１０〜２
００Ｕの精製リボソーム、〜２０μgのポリウリジル酸
ナトリウム(ヤマサ醤油株式会社)、および１μＣiのＬ-
[２,３,４,５,６−³Ｈ]フェニルアラニン(１３０Ｃi／m
mol；アマシャム・ジャパン株式会社)を加え、Ｈ₂Ｏで
全量を１００μlとした後、３７℃で１５分間反応させ
た。反応終了後、１mlの１０％ トリクロロ酢酸(ＴＣ
Ａ)溶液を添加し、９０℃で２０分間処理した。沈澱を
グラスマイクロファイバーフィルター(ＧＦ／Ｃ、Whatm
an International Ltd.)に集め、５％ＴＣＡで４回、９
９％エタノールで４回洗浄した。フィルターを乾燥した
後、５mlの液体シンチレーションカクテル ECONOFLUOR-
2(NEN Research Products)にフィルターを浸潤させ、液
体シンチレーションカウンター(BECKMAN Model LS5000T
D)によってフィルター内の沈澱画分の放射活性を測定し
た。この結果、ＴＣＡ不溶性画分への放射性アミノ酸の
取込みは０.４pmol／分／nmol リボソームであり、反応
液中のポリウリジル酸に対して用量依存性が認められた
(図２)。これらの結果は、調製されたリボソームが充分
な活性を保持していることを示すものである。

【００３５】Ｂ．鋳型mＲＮＡおよび標準ペプチドの化
学合成 Ｂ-１．鋳型mＲＮＡの化学合成 本実施例で用いた鋳型mＲＮＡ(ＡＵＧＵＵＵＧＡＧＵＵ
ＵＧＡＧおよびＵＵＵＧＡＧＵＵＵＧＡＧ)は、ＤＮＡ
合成装置 ABI MODEL 380B(Applied Biosystems社)によ
り、０.２μモルのＤＭＴ-rＧ(iＢu)-２'-tＢuＳi-ＣＰ
Ｇ(PENINSULA LABORATORIES, INC.)を固相としてＤＭＴ
-rＡ(Ｂz)-２'-tＢuＳi-ＣＥＰ、ＤＭＴ-rＧ(iＢu)-２'
-tＢuＳi-ＣＥＰ、およびＤＭＴ-Ｕ-２'-tＢuＳi-ＣＥ
Ｐ(PENINSULA LABORATORIES, INC.)を用いたβ−シアノ
エチル法によって化学合成した。合成終了後、樹脂を２
mlのアンモニア／エタノール(３:１)溶液で２時間処理
して、ＲＮＡフラグメントを樹脂より切り出した。次い
で、試料をアンモニア／エタノール(３:１)溶液中にて
５５℃で８時間加熱して脱保護を行なった後、遠心濃縮
機で減圧乾固した。この乾固試料に、１Ｍ テトラブチ
ルアンモニウムフルオライドを含むテトラヒドロフラン
溶液を１０ Ａ₂₆₀単位のＲＮＡに対して１０μlの割合
で加えて溶解し、室温で６時間処理して２'-ヒドロキシ
ル保護基の脱保護を行なった。得られた反応液をＮＡＰ
-２５カラム(Pharmacia)による５０mＭトリエチルアミ
ンアセテート(ＴＥＡＡ)を展開液としたゲルろ過によっ
て脱塩した。得られたＲＮＡフラグメントはWATERS μ-
BONDASPHERE 5μ C18-300Å(３.９mmｘ１５cm)カラムに
よる高速逆相クロマトグラフィーによって精製した。即
ち、５００μl以下のＲＮＡ溶液をカラムに注入し、５
０mＭ ＴＥＡＡを含む０％から２０％アセトニトリルの
直線濃度勾配によって目的ＲＮＡフラグメントを溶出し
た。ＲＮＡフラグメントの画分を集めて遠心濃縮機で減
圧乾固した後、Ｈ₂Ｏに溶解し、２６０nmの吸光度を測
定した。

【００３６】Ｂ-２．標準ペプチドの化学合成 標準トリペプチド(Ｐhe-Ｇlu-Ｐhe)およびテトラペプチ
ド(Ｐhe-Ｇlu-Ｐhe-Ｇlu)を、ペプチド自動合成機 ABI
MODEL 430A(Applied Biosystems社)を用い、p-メチル
ＢＨＡ樹脂を固相樹脂としたt-Ｂoc法によって化学合成
した。樹脂から切り出した合成ペプチドは、WATERS μ-
BONDASPHERE 5μ C18-300Å(３.９mmｘ１５cm)カラムに
よる高速逆相クロマトグラフィーによって精製した。精
製ペプチドのアミノ酸配列は、プロテインシーケンサー
MODEL 477A(Applied Biosystems社)によって分析し
た。

【００３７】Ｃ．高速分子篩クロマトグラフィーによる
リボソーム−mＲＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体の分離 合成mＲＮＡと天然型アミノアシルtＲＮＡを用いたイン
ビトロの逐次反応合成系によるトリペプチドの合成を、
開始反応サイクル、ペプチド伸長反応サイクルおよび終
結サイクルによって構築した。まず、(a-1）目的ペプチ
ドのＮ末端アミノ酸が結合したアミノアシルtＲＮＡが
リボソームおよびmＲＮＡと複合体を形成する反応、(a-
2）リボソーム−mＲＮＡ−アミノアシルtＲＮＡ複合体
の高速分子篩クロマトグラフィーによる分離、および(a
-3）リボソーム−mＲＮＡ−アミノアシルtＲＮＡ複合体
画分の限外ろ過法による濃縮の３つのステップからなる
工程を開始反応サイクルとした。次に、(b-1）リボソー
ム−mＲＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体上で次のアミノ
酸残基を結合させるペプチド形成反応、(b-2）リボソー
ム−mＲＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体の高速分子篩ク
ロマトグラフィーによる分離、および(b-3）リボソーム
−mＲＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体画分の限外ろ過法
による濃縮の３つのステップからなる工程をペプチド伸
長反応サイクルとした。最後に、(c-1）リボソーム−m
ＲＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体からのフェノール抽
出とエタノール沈澱によるペプチジルtＲＮＡの回収、
(c-2）ＲＮＡの加水分解による目的ペプチドの遊離、お
よび(c-3）目的ペプチドの高速逆相クロマトグラフィー
による精製の３つのステップからなる工程を終結反応サ
イクルとした。逐次反応によるトリペプチドの合成は、
開始反応サイクルに続いて２回のペプチド伸長反応サイ
クルを繰り返した後、最後に終結反応サイクルを行うこ
とによって達成した。

【００３８】しかし、上記のように構築したインビトロ
タンパク質合成系による逐次反応系が成立するために
は、開始反応サイクルおよび伸長反応サイクルにおいて
リボソーム−mＲＮＡ−アミノアシルtＲＮＡ複合体およ
びリボソーム−mＲＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体が分
子篩クロマトグラフィーによってtＲＮＡおよび他のア
ミノ酸成分から分離され、更に、分離、濃縮の過程でこ
の複合体が安定に保持されていなければならない。そこ
で、先に調製したリボソーム、合成mＲＮＡおよびアミ
ノアシルtＲＮＡを用いて複合体を形成させ、この複合
体を下記の分子篩クロマトグラフィーによって分離し、
更に蔗糖密度勾配超遠心法(上記Ａ-３中の記載と同様に
して行なう)によって分析した。

【００３９】分子篩クロマトグラフィー Shodex PROTEIN KW-803カラム(８mmｘ３０cm、２本組)
による高速分子篩クロマトグラフィーによってリボソー
ム−mＲＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体を分離した。送
液システムはWaters 600E Multisolvent Delivery Syst
emを用いた。カラムは予め、６０mＭ ＮＨ₄Ｃlと１０m
Ｍ (ＣＨ₃ＣＯＯ)₂Ｍgを含む１０mＭ Ｔris・Ｃl緩衝液
(pＨ７.５)で平衡化した。リボソーム−mＲＮＡ−ペプ
チジルtＲＮＡ複合体を含む試料溶液２００μl以下をカ
ラムに注入し、１.０ml／分の流速で展開した。溶出液
の２６０nmの吸光度をWaters 484 Tunable Aborbance D
etectorでモニターし、結果をWaters 741 Data Module
によって記録した。溶出液は０.５mlずつ分取した。０.
５mlの各溶出液画分に２mlの液体シンチレーションカク
テル Ready Safe(BECKMAN Instrument,Inc.)を添加して
溶解し、液体シンチレーションカウンター(BECKMAN Mod
el LS5000TD)によって放射活性を測定した。ＨＰＬＣ用
分子量決定用タンパク質マーカーはオリエンタル酵母工
業(株)より購入した。分子量マーカーとして、グルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ(Mw 290,000)、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ(Mw 142,000)、エノラーゼ(Mw 67,000)、アデニル
酸キナーゼ(Mw 32,000)、およびチトクロムＣ(Mw 12,40
0)を用いた。

【００４０】Ｍet-Ｐhe-Ｇlu-Ｐhe-Ｇluのアミノ酸配列
をコードする鋳型mＲＮＡ(ＡＵＧＵＵＵＧＡＧＵＵＵＧ
ＡＧ)を用いたインビトロタンパク質合成系において放
射性メチオニンをリボソームに取込ませた後、反応液を
Shodex KW803カラムによる高速分子篩クロマトグラフィ
ーで分画すると、リボソームはボイド画分に、tＲＮＡ
は分子量約６万の領域に、そして遊離の放射性アミノ酸
は分子量約１万以下の低分子画分にそれぞれ溶出され
た。ボイド画分およびtＲＮＡの溶出位置にそれぞれ放
射性アミノ酸の取込みが観察された(図３)。放射活性を
有するボイド画分を、蔗糖密度勾配超遠心法で分析する
と、放射活性の大部分は７０Ｓリボソームの画分に回収
され、７０Ｓリボソームに放射性アミノ酸が結合してい
ることが分かった(図４)。これに対して、Ｐhe-Ｇlu-Ｐ
he-Ｇluのアミノ酸配列をコードする鋳型mＲＮＡ(ＵＵ
ＵＧＡＧＵＵＵＧＡＧ)を用いたインビトロタンパク質
合成系において、同様に放射性メチオニンをリボソーム
に取り込ませた後、反応液を高速分子篩クロマトグラフ
ィーで分画すると、tＲＮＡ画分にはＡＵＧＵＵＵＧＡ
ＧＵＵＵＧＡＧを鋳型とした場合とほぼ同等に放射性ア
ミノ酸の取込みが認められたが、リボソーム画分への放
射性アミノ酸の取込みはほとんど認められなかった。従
って、鋳型mＲＮＡにＡＵＧコドンが存在する場合にの
み、放射性アミノ酸がリボソームに結合したと結論する
ことができる。

【００４１】次に、放射活性を持つリボソーム画分をフ
ェノール処理してＲＮＡ画分を回収し、再度高速分子篩
クロマトグラフィーで分析すると、放射活性の大部分が
tＲＮＡ画分に溶出され、リボソームにアミノアシルtＲ
ＮＡが結合していることが分かった(図５)。更に、放射
活性を有するリボソーム画分を、再度高速分子篩クロマ
トグラフィーで分析すると、放射活性の大部分は７０Ｓ
リボソームの画分に回収された(データは示していな
い)。

【００４２】以上の結果は、インビトロタンパク質合成
で形成されたリボソーム−mＲＮＡ−アミノアシルtＲＮ
Ａ複合体が、高速分子篩クロマトグラフィーによってt
ＲＮＡその他の成分から分離され、更に、この複合体が
高速分子篩クロマトグラフィーおよび蔗糖密度勾配超遠
心分離の過程でも安定に存在していることを示すもので
ある。

【００４３】Ｄ．インビトロのタンパク質合成系による
ペプチドの合成 Ｍet-Ｐhe-Ｇlu-Ｐhe-Ｇluのアミノ酸配列をコードする
人工mＲＮＡを鋳型とするインビトロのタンパク質合成
系においてペプチドを合成した。 Ｄ-１．連続反応系でのペプチドの合成 まず、対照として、³Ｈ-Ｐheおよび¹⁴Ｃ-Ｇluをインビ
トロタンパク質合成反応系に添加して１５分間連続的に
合成させた後、高速分子篩クロマトグラフィーによって
リボソームを回収し、フェノール処理とアルカリ加水分
解でリボソームに結合しているペプチジルtＲＮＡから
生成ペプチドを遊離させた。回収された生成物を高速逆
相クロマトグラフィーで分析した結果、³Ｈ-Ｐheと¹⁴Ｃ
-Ｇluの溶出位置には遊離の³Ｈ-Ｐheと¹⁴Ｃ-Ｇluと考え
られるピークが検出され、更に化学合成した標準Ｐhe-
Ｇlu-Ｐhe-Ｇluの溶出位置には³Ｈ−Ｐheと¹⁴Ｃ−Ｇlu
の両方の放射活性が検出された(図６)。この結果は、Ｍ
et-Ｐhe-Ｇlu-Ｐhe-Ｇluのアミノ酸配列をコードする人
工mＲＮＡを鋳型として、インビトロタンパク質合成系
で反応を行わせると、添加アミノ酸はアミノアシルtＲ
ＮＡとしてリボソームおよびmＲＮＡと共に複合体を形
成したが、その一部は更に伸長反応によってペプチド鎖
に成長し、結果としてmＲＮＡにコードされているテト
ラペプチド、Ｐhe-Ｇlu-Ｐhe-Ｇluが合成されたことを
示している。

【００４４】Ｄ-２．逐次反応系でのペプチドの合成 次に、同一のmＲＮＡを鋳型として逐次反応系を用い、
伸長反応サイクルを２回実施することによって、Ｐhe-
Ｇlu-Ｐheの逐次合成を試みた。開始反応サイクル(サイクル−０) ：２０μlの１０倍濃
縮タンパク質合成用緩衝液に、２μlの３,５００Ｕ／ml
ピルビン酸キナーゼ、２０μlの２０Ｕ／mlフェニルア
ラニン特異的tＲＮＡ(SIGMA CHEMICAL COMPANY)、２μl
の１４０Ｕ／μl リボヌクレアーゼインヒビター、２０
μlの２４mg／ml Ｓ１００画分、１０〜２００Ｕの精製
リボソーム、４０μlの４０μＭ 合成mＲＮＡ、および
２０μlの１mＭ フェニルアラニンを加え、Ｈ₂Ｏで全量
を２００μlとした。この混合物を３７℃で１５分間反
応させた。反応終了後、反応液をShodex PROTEIN KW-80
3カラム(８mmｘ３０cm、２本組)による高速分子篩クロ
マトグラフィーによって分画し、リボソーム画分を得
た。次いで、リボソーム画分をセントリコン-３０(グレ
ースジャパン株式会社)による遠心限外ろ過によって容
量約５０μlまで濃縮した。得られた濃縮溶液を、リボ
ソーム−mＲＮＡ−フェニルアラニルtＲＮＡ^Phe複合体
画分とした。

【００４５】ペプチド伸長反応サイクル(サイクル−
１)：サイクル−０で得られたリボソーム−mＲＮＡ−フ
ェニルアラニルtＲＮＡ^Phe複合体画分に、２０μlの１
０倍濃縮タンパク質合成用緩衝液、２μlの３,５００Ｕ
／ml ピルビン酸キナーゼ、２０μlの２０Ｕ／ml グル
タミン酸特異的tＲＮＡ(SIGMA CHEMICAL COMPANY)、２
μlの１４０Ｕ／μl リボヌクレアーゼインヒビター、
２０μlの２４mg／ml Ｓ１００画分、１μＣiのＬ-[Ｕ-
¹⁴Ｃ]グルタミン酸(２７０mＣi／mmol；アマシャム・ジ
ャパン株式会社)を加え、Ｈ₂Ｏで全量を２００μlとし
た。この混合物を３７℃で１５分間反応させた。反応終
了後、反応液をサイクル−０と同様に高速分子篩クロマ
トグラフィーによって分画し、リボソーム画分を得た。
次いで、リボソーム画分をセントリコン-３０によって
容量約５０μlまで濃縮した。得られた濃縮溶液を、リ
ボソーム−mＲＮＡ−フェニルアラニルグルタミックア
シジルtＲＮＡ^Glu複合体画分とした。

【００４６】ペプチド伸長反応サイクル(サイクル−
２)：サイクル−１で得られたリボソーム−mＲＮＡ−フ
ェニルアラニルグルタミックアシジルtＲＮＡ^Glu複合体
画分に、２０μlの１０倍濃縮タンパク質合成用緩衝
液、２μlの３,５００Ｕ／ml ピルビン酸キナーゼ、２
０μlの２０Ｕ／ml フェニルアラニン特異的tＲＮＡ(SI
GMACHEMICAL COMPANY)、２μlの１４０Ｕ／μl リボヌ
クレアーゼインヒビター、２０μlの２４mg／ml Ｓ１０
０画分、１μＣiのＬ-[２,３,４,５,６-³Ｈ]フェニルア
ラニン(１３０Ｃi／mmol；アマシャム・ジャパン株式会
社)を加え、Ｈ₂Ｏで全量を２００μlとした。この混合
物を３７℃で１５分反応させた。反応終了後、反応液を
高速分子篩クロマトグラフィーによって分画した。得ら
れたリボソーム画分を、リボソーム−mＲＮＡ−フェニ
ルアラニルグルタミックアシジルフェニルアラニルtＲ
ＮＡ^Phe複合体画分とした。

【００４７】終結反応サイクル(サイクル−ＥＮＤ)：サ
イクル−２で得られたリボソーム−mＲＮＡ−フェニル
アラニルグルタミックアシジルフェニルアラニルtＲＮ
Ａ^Phe複合体画分に、等量のＴＥ飽和フェノール溶液を
加えて懸濁し、１０,０００xgで１０分間遠心した。得
られた水相を更にクロロホルム／イソアミルアルコール
(２４：１)で抽出した。得られた水相に２倍量の９９％
エタノールを加え、−８０℃で２０分静置した。次い
で、１０,０００xgで１０分間遠心してＲＮＡを沈澱さ
せた。得られたＲＮＡ沈澱を１００μlの０.１Ｎ ＫＯ
Ｈに溶解し、３７℃で３０分間処理することによってＲ
ＮＡを加水分解した。反応終了後、反応混合液に１００
μlの０.１Ｎ ＨＣlを添加して中和した。反応混合液を
μ-BONDASPHERE 5μ C18-300Å(３.９mmｘ１５cm)カラ
ムに注入し、０.１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を含む
１２％から５１％アセトニトリルの直線濃度勾配によっ
てフェニルアラニルグルタミックアシジルフェニルアラ
ニンを溶離した。溶出液は０.５mlずつ分取した。０.５
mlの各溶出液画分に２mlの液体シンチレーションカクテ
ルReady Gel(BECKMAN Instrument, Inc.)を添加して溶
解し、液体シンチレーションカウンター(BECKMAN Model
LS5000TD)によって放射活性を測定した。

【００４８】上記の終結反応サイクルで回収された生成
物を高速逆相クロマトグラフィーで分析すると、連続反
応系の場合と同様に、³Ｈ-Ｐheと¹⁴Ｃ-Ｇluの溶出位置
に遊離の³Ｈ-Ｐheと¹⁴Ｃ-Ｇluと考えられるピークが検
出され、更に化学合成した標準Ｐhe-Ｇlu-Ｐheの溶出位
置には³Ｈ-Ｐheと¹⁴Ｃ-Ｇluの両方の放射活性が検出さ
れた(図７)。この結果は、逐次反応系においても、連続
反応系と同様に、添加アミノ酸は開始反応サイクルにお
いてアミノアシルtＲＮＡとしてリボソームおよびmＲＮ
Ａと共に複合体を形成したが、その一部は更に伸長反応
サイクルにおいてペプチド鎖に成長し、結果としてmＲ
ＮＡにコードされているトリペプチドＰhe-Ｇlu-Ｐheが
合成されたことを示すものである。

【００４９】以上のように本実施例で得られた結果は、
予め決めた配列を有する人工mＲＮＡとアミノアシルま
たはミスアミノアシルtＲＮＡを用い、リボソームによ
るインビトロ逐次反応合成系を用いることによって、任
意のアミノ酸配列を有するペプチドを合成し得ることを
示すものである。

【００５０】参考文献 １．F.C.McKay, W.F.Albertson, J.Am.Chem.Soc., 79,
4686 (1957) ２．L.A.CarpinoおよびG.Y.Han, J.Am.Chem.Soc., 92,
5748 (1970) ４．R.B.Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85, 2149 (196
3) ５．M.BergmannおよびH.Fraenkel-Conrat, J.Biol.Che
m., 124,1 (1938) ６．T.OkaおよびK.Morihara, J.Biochem.(Tokyo), 84,
1277 (1978) ７．H.Takai, K.Sakato, N.Nakamizo, Y.Isowa, “Pept
ide Chemistry 1980",K.Okawa編, Protein Research Fo
undation, p.213 (1981) ８．H.Nakajima, S.Kitabatade, R.Tsurutani, I.Tomio
ka, K.YamamotoおよびK.Imahori, Biochim.Biophys.Act
a, 790, 197 (1984) ９．S.N.Cohen, A.C.Chang, H.W.Boyer, R.B.Helling,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 69, 3448 (1973) 10．M.W.Nirenberg, J.H.Matthaei, Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA, 47, 1588 (1961) 11．A.S.Spirin, V.I.Baranov, L.A.Ryabova, S.U.Ovod
ov, Y.B.Alahhov, Science, 242, 1162 (1988) 12．T.G.Heckler, L.H.Chang, Y.Zama, T.NakaおよびS.
M.Hecht, Tetrahedron, 40, 87 (1984) 13．T.G.Heckler, L.H.Chang, Y.Zama, T.Naka, M.S.Ch
orghadeおよびS.M.Hecht, Biochemistry, 23, 1468 (19
84) 14．T.G.Heckler, Y.Zama, T.,NakaおよびS.M.Hecht,
J.Biol.Chem., 258, 4492 (1983) 15．J.R.Roesser, M.S.ChorghadeおよびS.M.Hecht, Bio
chemistry, 25, 6361(1986) 16．R.C.Payne, B.P.NicholsおよびS.M.Hecht, Biochem
istry, 26, 3197 (1987) 17．C.J.Noren, S.J.Anthony-Cahill, M.C.Griffithお
よびP.G.Schultz, Science, 244, 188 (1989) 18．M.Noll, B.Hapke, M.H.SchreierおよびH.Noll, JH.
Mol.Biol., 75, 281 (1973) 19．N.Usman, K.K.Ogilvie, M.-Y.JiangおよびR.J.Cede
rgren, J.Amer.Chem.Soc., 109, 7845 (1987) 20．K.K.Ogilvie, N.Usman, M.-Y.JiangおよびR.J.Cede
rgren, Proc.Natl.Acad.Sci., 16, 5764 (1988) 21．T.G.Heckler, L.H.Chang, Y.Zama, T.Naka, M.S.Ch
orghadeおよびS.M.Hecht, Biochemistry, 23, 1468 (19
84) 22．G.Spedding, “Ribosomes and Protein Synthesi
s", G.Spedding編, Oxford University Press, p.25 (1
989)

【図面の簡単な説明】

【図１】 大腸菌由来リボソームを蔗糖密度勾配超遠心
法により分析した結果を示すグラフである。

【図２】 ポリウリジル酸の濃度を変えてインビトロで
タンパク質を合成したときの結果を示すグラフである。

【図３】 リボソーム−mＲＮＡ−アミノアシルtＲＮＡ
複合体を高速分子篩クロマトグラフィーにより分析した
結果を示すグラフである。

【図４】 リボソーム−mＲＮＡ−アミノアシルtＲＮＡ
複合体を蔗糖密度勾配超遠心法により分析した結果を示
すグラフである。

【図５】 リボソーム−mＲＮＡ−アミノアシルtＲＮＡ
複合体からフェノール抽出によって得られたＲＮＡ画分
を高速分子篩クロマトグラフィーにより分析した結果を
示すグラフである。

【図６】 インビトロタンパク質合成系において連続反
応により合成されたＰhe-Ｇlu-Ｐhe-Ｇluを逆相クロマ
トグラフィーによって分析した結果を示すグラフであ
る。

【図７】 インビトロタンパク質合成系において逐次反
応により合成されたＰhe-Ｇlu-Ｐheを逆相クロマトグラ
フィーによって分析した結果を示すグラフである。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 互いに異なる複数の遺伝子コドンに対応
   する複数のtＲＮＡのそれぞれについて、対応の天然ア
   ミノ酸の結合したアミノアシルtＲＮＡおよび非対応の
   天然もしくは非天然アミノ酸の結合したミスアミノアシ
   ルtＲＮＡを用意し、該複数の遺伝子コドンの繰返し構
   造を持つ人工mＲＮＡを鋳型として用意し、該mＲＮＡお
   よびリボソームを含むインビトロのタンパク質合成系
   に、導入しようとするアミノ酸成分が結合したアミノア
   シルまたはミスアミノアシルtＲＮＡのみを加え、逐次
   的に伸長反応させることを特徴とする、任意のアミノ酸
   配列を有するペプチドの合成法。
2. 【請求項２】 目的ペプチドのＮ末端アミノ酸の結合し
   たアミノアシルまたはミスアミノアシルtＲＮＡがリボ
   ソームおよびmＲＮＡと複合体を形成する反応(開始反
   応)、リボソーム−mＲＮＡ−(ミス)アミノアシルtＲＮ
   Ａ複合体上で目的ペプチドの第２アミノ酸残基から逐次
   的にペプチド鎖を伸長する反応(伸長反応)、およびリボ
   ソーム−mＲＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体から目的ペ
   プチドを分離する反応(終結反応)の３つの反応サイクル
   からなる請求項１に記載のペプチド合成法。
3. 【請求項３】 開始反応サイクルが、目的ペプチドのＮ
   末端アミノ酸の結合したアミノアシルまたはミスアミノ
   アシルtＲＮＡがリボソームおよびmＲＮＡと複合体を形
   成する反応、リボソーム−mＲＮＡ−(ミス)アミノアシ
   ルtＲＮＡ複合体の高速分子篩クロマトグラフィーによ
   る分離、およびリボソーム−mＲＮＡ−(ミス)アミノア
   シルtＲＮＡ複合体画分の限外ろ過法による濃縮の３つ
   のステップからなる請求項２に記載のペプチド合成法。
4. 【請求項４】 伸長反応サイクルが、リボソーム−mＲ
   ＮＡ−ペプチジル[Ｎ個のアミノ酸よりなるペプチド(Ｎ
   は１またはそれ以上の整数である)]tＲＮＡ複合体上で
   (Ｎ＋１)番目からＭ個のアミノ酸残基(Ｍは１〜６３の
   整数である)を結合させるペプチド形成反応、リボソー
   ム−mＲＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体の高速分子篩ク
   ロマトグラフィーによる分離、およびリボソーム−mＲ
   ＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体画分の限外ろ過法によ
   る濃縮の３つのステップからなる請求項２に記載のペプ
   チド合成法。
5. 【請求項５】 終結反応サイクルが、リボソーム−mＲ
   ＮＡ−ペプチジルtＲＮＡ複合体からのフェノール抽出
   とエタノール沈澱によるペプチジルtＲＮＡの回収、Ｒ
   ＮＡの加水分解による目的ペプチドの遊離、および目的
   ペプチドの高速逆相クロマトグラフィーによる精製の３
   つのステップからなる請求項２に記載のペプチド合成
   法。
6. 【請求項６】 人工mＲＮＡが、以下の配列： 【化１】[Ａ₁Ａ₂・・・・Ａ_m]_n (配列中、ｍは２〜６４の整数であり、ｎは１以上の整
   数であって、ｍ×ｎは目的ペプチドのアミノ酸残基数に
   等しいかまたはそれ以上であり、Ａ₁、Ａ₂、・・・・お
   よびＡ_mは互いに異なる遺伝子コドンである)を含むもの
   である請求項１に記載のペプチド合成法。
7. 【請求項７】 ミスアミノアシルtＲＮＡを用いる請求
   項１に記載のペプチド合成法。