WO2002021131A1 - Supports solides comprenant une couche de surface traitee - Google Patents

Supports solides comprenant une couche de surface traitee Download PDF

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WO2002021131A1
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solid support
dna
gene
treatment layer
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Michifumi Tanga
Hironao Okayama
Hiroshi Okamura
Keigo Ehara
Kenichi Takagi
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Toyo Kohan Co., Ltd.
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K3/00—Use of inorganic substances as compounding ingredients
    • C08K3/10—Metal compounds
    • C08K3/14—Carbides

Definitions

  • the present invention relates to a solid support used for analysis of a biological substance such as a gene or protein used for gene analysis, diagnosis, treatment, or the like, and a biological substance such as a gene or protein using the solid support. It relates to the method of analysis. Background art
  • a solid support used for gene analysis and the like a solid support of a glass chip, which has been processed so that 10,000 or more genes such as DNA fragments (DNA probes) can be provided on the surface.
  • DNA probes DNA fragments
  • the base sequence is previously elucidated on the solid support, and tens of thousands of base sequences having different base sequences from each other are obtained.
  • a DNA sample labeled with a DNA fragment was prepared by binding the DNA fragments so that their positions could be determined, and a fluorescently labeled DNA sample was allowed to flow through the DNA fragment, the DNA fragment became a DNA fragment (probe) attached to the solid support.
  • Hybridizes with a probe having a complementary sequence of The hybridized portion can be identified as a spot by measuring the fluorescence of the solid support, and the sequence of the DNA fragment in the DNA sample can be elucidated.
  • the solid support for gene analysis can be used to analyze the genome of living organisms, monitor gene expression, and analyze genes such as genomic mismatching, because it can easily identify the base sequence of a certain DNA.
  • it has been applied to gene diagnosis such as detection of sudden mutations in cancer genes and development of pharmaceuticals.
  • the determination is performed by hybridizing a fluorescently labeled DNA sample using the solid support for gene analysis described above and irradiating the solid support with fluorescent light to analyze a spot.
  • the conventional solid support for gene analysis is useful for analyzing the spot.
  • spotting DNA fragments were washed away due to pretreatment such as glass washing, and spots were often not clearly detectable.
  • An object of the present invention is to solve such a problem that the fluorescence detection of the conventional solid support for gene analysis is unclear. Disclosure of the invention
  • the substrate to be used is formed by forming a surface treatment layer on a solid support such as glass, plastic, or silicon, and further performing a chemical modification so that spotted DNA fragments are not washed away even when the solid support is washed. It was firmly immobilized, and when fluorescent light was irradiated, it was noticed that the fluorescent spot became clear.
  • the present invention is based on such findings.
  • the solid support of the present invention comprises, on the surface, hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide, tungsten carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide or vanadium carbide.
  • a surface treatment layer is formed.
  • the thickness of the film of the surface treatment layer is preferably 1 nm to 100 nm. Further, it is preferable that the coating of the surface treatment layer is chemically modified to support an oligonucleotide or a DNA fragment.
  • the solid support of the present invention can be used for a method of analyzing a biological substance such as a gene or a protein by carrying a gene on the surface of the solid support.
  • FIG. 1 is a schematic explanatory diagram when a probe is immobilized on a solid support.
  • the solid support of the present invention when a suitable surface treatment layer is formed on the outermost surface of a solid support such as glass, plastic, and silicon, various types of DNA samples can be placed on the solid support.
  • a suitable surface treatment layer is formed on the outermost surface of a solid support such as glass, plastic, and silicon
  • various types of DNA samples can be placed on the solid support.
  • the production of genes or proteins It is preferable because affinity with body substances and the like become strong.
  • plastics can be used for the plastic as the solid support.
  • polyester resins such as polyethylene terephthalate or polybutylene terephthalate, polyethylene resins, polystyrene resins, polypropylene resins, ABS resins, nylon, acrylic resins, fluororesins, polycarbonate resins, polyurethane resins, methylpentene resins, phenolic resins, melamine
  • Thermosetting or thermoplastic resins such as resin, epoxy resin, and chloride chloride resin can be used.
  • a carbide such as hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, trim carbide, titanium carbide, uranium carbide, tungsten carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide, or vanadium carbide is used. Coated ones are preferred.
  • a mixture of the above-mentioned carbide and another substance for example, a mixture of a metal and a ceramic, or a laminate is also preferable.
  • carbon has excellent chemical stability, and can withstand subsequent chemical modification and reactions when mounting a DNA probe or the like.
  • the probe when the probe is immobilized by chemical modification on the carbide, the probe shows a binding form as shown in Fig. 1 to the carbon of the carbide, and the DNA probe is firmly attached to the solid support. This is considered to be because it can be immobilized.
  • the immobilized probe can be erected vertically on the solid support as shown in FIG. 1, so that the immobilization density per unit area can be increased.
  • the thickness of the surface treatment layer of the carbide of the present invention is not particularly limited, it is sufficient that the thickness is l nm to 100 nm.
  • the thickness of the surface treatment layer is not so uniform as to be too thin, and there is a portion where the underlying solid support is exposed, which is not preferable.
  • a coating exceeding 100 nnr is not preferable because stress is generated in the surface treatment layer during formation and peeling is likely to occur.
  • the thickness of the surface treatment layer is 10 ⁇ ⁇ ! 5500 nm. More preferably, it is 30 to 200 nm.
  • the method for forming the surface treatment layer of the carbide on the solid support can be performed by a known method. For example, high frequency sputtering, DC sputtering, arc ion plating Method, thermal CVD method and the like.
  • the solid support of the present invention can carry a large number of biological substances such as genes or proteins such as DNA probes. Accordingly, a solid support provided with a plurality of microsections on the surface thereof and one section capable of supporting a large number of oligonucleotide fragments is also preferably employed. There is no particular limitation on the type of the DNA probe or the like in each of the microsections, and the type can be appropriately changed depending on the application.
  • the shape of the solid support is not particularly limited, and may be, for example, a plate-like one such as a film or a sheet, or a disk-like one.
  • the thickness, size, etc., of the solid support are not particularly limited, and can be in the same range as that usually used.
  • the properties of the glass used as the substrate of the solid support are also not particularly limited.
  • the glass can be appropriately selected in consideration of various properties such as affinity with a reactive substance attached to the substrate surface.
  • a single layer of Ti, Au, Pt, Nb, WC, or the like, or a composite film thereof may be formed as a reflective layer on the front surface or the rear surface of such a substrate.
  • the thickness of the reflective layer is preferably 100 nm or more because it must be uniformly coated over the entire surface. More preferably, it is 100 nm or more.
  • the surface of the underlying solid support is intentionally roughened. This is because such a roughened surface is advantageous in increasing the surface area of the substrate and fixing a large amount of DNA probes and the like at a high density.
  • the substrate surface is further chemically modified to immobilize DNA and proteins.
  • An example of the chemical modification is to immobilize a group in which an activated ester group is bonded to a terminal of a hydrocarbon group via an amide bond on the support surface.
  • Such chemical modification makes it easier to immobilize biological substances such as DNA, proteins, and peptide bonds on the substrate surface.
  • the solid support is replaced with a hydrocarbon group having a polar group at a terminal, for example, a hydroxyl group, a hydroxyl group, an epoxy group, an amino group, a thiol group, an isocyanate group, or the like.
  • the hydrocarbon group is preferably one having 1 to 12 carbon atoms, particularly preferably 1 to 6 carbon atoms.
  • monocarboxylic acids such as formic acid, acetic acid and propionic acid
  • dicarboxylic acids such as oxalic acid, malonic acid, conodic acid, maleic acid and fumaric acid
  • polycarboxylic acids such as trimellitic acid.
  • oxalic acid and succinic acid are preferred.
  • Chemical modification methods include, for example, irradiating the support with ultraviolet light in chlorine gas to chlorinate the surface, then irradiating the support with ultraviolet light in ammonia gas to aminate, and then applying an appropriate acid chloride or acid anhydride. And carboxylate.
  • the oligonucleotides or DNA fragments (probes) that can be placed on the solid support of the present invention are not particularly limited in the number of bases, such as single- or double-stranded DNA and RNA fragments.
  • the immobilization of the oligonucleotide or the DNA fragment can be performed by chemical bonding to the surface of the solid support or the like.
  • the surface can be activated, that is, the amino group of the terminal base of the DNA can be bonded after facilitating chemical bonding with the DNA.
  • the solid support is irradiated with ultraviolet light in a chlorine gas to chlorinate carbon of a carbide.
  • carboxylation is carried out using an appropriate acid chloride, and the terminal carboxyl group is dehydrated or condensed with carbodiimide or hexylcarbodiimide, which is a dehydrating condensing agent.
  • N-hydroxysuccinimide is dehydrated and condensed with N-hydroxysuccinimide using 3-ethylcarbodiimide to form N-hydroxysuccinyl at the terminal of the hydrocarbon group via an amide bond.
  • a group to which an active ester group such as an imido ester group is bonded can be immobilized and activated.
  • an oligo dT primer may be bound to the solid support, and the desired cDNA may be extended by a reverse transcription reaction or the like, and simultaneously bound to the solid support.
  • a large number of DNA chains can be extended and bound on a solid support using PCR or the like.
  • a DNA sample labeled with fluorescence is passed through the DNA fragment, and the DNA fragment is bound to the solid support.
  • the DNA sample is bound to the solid support.
  • the solid support of the present invention can analyze and identify the base sequence of a certain DNA much more clearly than before using the same method as in the past, thus enabling analysis of the biological genome. It is useful for gene analysis such as monitoring of gene expression and genomic mismatching, and is also useful for gene diagnosis such as mutation detection of cancer genes and development of pharmaceuticals.
  • a polyethylene terephthalate resin was prepared as a solid support for use in gene analysis as follows. First, a polyethylene terephthalate resin having a size of 25 mm (width) ⁇ 75 mm (length) ⁇ 1 mm (thickness) was used. Next, on the surface of the polyethylene terephthalate tree, high-frequency sputtering was performed using hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, titanium carbide, tungsten carbide, or zirconium carbide as a target and argon gas as a working gas. According to the method, a solid support was formed in which a coating made of carbide of each target 1 was formed to a thickness of about 10 nm.
  • the surface of the polyethylene terephthalate resin was chlorinated for 1 minute, then aminated for 10 minutes, and then immersed directly in a succinic chloride solution for 10 minutes. Next, after rinsing with ultrapure water, it was immersed in the activating solution for direct activation.
  • the composition of the activation liquid is
  • the fluorescence intensity of the solid support thus obtained for gene analysis was measured.
  • the measurement time was 1 minute, and the fluorescence intensity after spotting and drying (65 ° C) was measured using a LAS-1000 P 1 us instrument. Was also an excellent value.
  • Each of the solid supports of the present invention was superior to the post-spot and post-dry fluorescence intensities on the conventional solid support in both the post-spot and post-dry fluorescence intensities. That is, in any of the solid supports of the present invention, spotted biological material fragments such as DNA or protein remained on the solid support without being washed away, and spots could be clearly detected.
  • spots of spotted biological material such as DNA or protein were washed away and did not remain on the solid support, and spots could not be clearly detected.
  • a silicon substrate of 25 mm (width) ⁇ 75 mm (length) ⁇ 0.5 mm (thickness) was used as a substrate.
  • a tantalum carbide was used as a target, and a carbide film was formed to a thickness of about 10 nm by high frequency sputtering using argon gas as a working gas.
  • the surface of the silicon substrate was chemically modified and activated.
  • the surface of the silicon substrate was chlorinated by irradiating it with ultraviolet light for 1 minute in chlorine gas, then aminated for 10 minutes in ammonia gas, and immersed in a succinic anhydride solution for 20 minutes.
  • the succinic anhydride solution was prepared by dissolving 14 Mm / L of succinic anhydride and 0.1 MZL of sodium borate (pH 8) in N-methyl-2-pyrrolidone.
  • Activated solution was added to a 200 mL beaker with N-hydroxysuccinimide (115 mg) and 1- [3- (dimethylamino) propyl] 3-ethylcarposimide 959 mg in phosphoric acid. pH6) Dissolve in 50 mL, immerse the silicon substrate in this, react, wash Was cleaned.
  • the activated substrate was spotted with DNA.
  • the DNA sample was dissolved in a 50% DMSO solution (spotting buffer) to a concentration of 0.3 ⁇ g / L to prepare a spotting solution.
  • the DNA solution was pressed against the slide glass using a spotting device. In this way, a large number of DNA samples were attached to the slide glass surface.
  • the DNA sample was fluorescently labeled with a fluorescent labeling kit, and the standardized DNA was alkali-denatured.
  • the label was dissolved in a hybridization buffer (20% SSC, 20% formamide, 0.5% SDS) and dried to 0.3 ⁇ g / ixL to prepare a hybridization solution.
  • cover glass was washed off with 0.1 X SSC, washed twice with a washing solution (2 X SSC, 0.2% SDS), further rinsed with 0.1% SSC and sterilized water, and then centrifuged and dried.
  • the substrate thus obtained was observed with a Fluoro Image Analyzer FLA8000 manufactured by Fuji Photo Film.
  • the fluorescence intensity of the present invention was 1352, which was higher than the conventional 845.
  • the solid support of the present invention can analyze and identify the base sequence of a certain DNA much more clearly than before using the same method as before, so that analysis of living genome, monitoring of gene expression, It is used not only for analysis of genes such as mismatching or biological substances such as proteins, but also for gene diagnosis such as detection of mutations in oncogenes and development of pharmaceuticals.

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Description

明 細 書 表面処理層が形成された固体支持体 技術分野
本発明は、 遺伝子解析、 診断、 治療等に使用される遺伝子あるいは蛋白質等の 生体物質解析用等に用いられる固体支持体及び該固体支持体を用いて遺伝子ある いは蛋白質等の生体物質等を解析する方法に関するものである。 背景技術
従来、 遺伝子解析用等に用いられる固体支持体として、 ガラスチップの固体支 持体であって、 表面に 1万以上の D N A断片 （D N Aプローブ） 等の遺伝子を载 せれるように加工がされているものが広く用いられれている。
前記のようなチップを用いて例えば、 ある D NAサンプルの塩基配列を知りた い場合には、 該固体支持体上に、 予め塩基配列が解明されており、 互いに異なる 塩基配列を有する数万本の D N A断片を、 位置がわかるように結合させておいた ものを用意し、 これに蛍光標識した D N Aサンプルを流すと、 D NA断片は、 該 固体支持体上につけた D N A断片 （プローブ） のうちの相補的な配列を有するプ 口ーブとハイブリダイズする。 ハイプリダイズ部分は、 固体支持体を蛍光測定す ることによりスポットとして識別でき、 D N Aサンプル中の D N A断片の配列を 解明することができる。
このように、 遺伝子解析用固体支持体は、 ある D N Aの塩基配列を簡単に特定 することができることから、 生体ゲノムの解析、 遺伝子発現のモニタリング、 ゲ ノムミスマッチング等の遺伝子解析等に利用されるほか、 さらにガン遺伝子の突 然変異の検出等遺伝子診断や医薬品の開発等に応用されている。
上記遺伝子解析用固体支持体を利用して蛍光標識した D N Aサンプルをハイブ リタイズして、 固体支持体に蛍光照射することによるスポットの解析により判断 される。
し力 し、 従来の遺伝子解析用固体支持体は、 前記スポットの解析をするにあた り、 ガラスの洗浄等の前処理を行うため、 スポットした D NA断片が洗い流され てしまい、 スポットが明瞭に検出できない場合が多かった。
本発明は、 このような従来の遺伝子解析用固体支持体の有する蛍光検出の不明 瞭さという問題点を解決することを目的とするものである。 発明の開示
本発明において、 用いる基板はガラス、 プラスチック、 シリコンなどの固体支 持体に表面処理層を形成し、 更に、 化学修飾を施すことによって、 固体支持体を 洗浄してもスポットした D N A断片が洗い流されずに強固に固定化されており、 蛍光照射した際に、 蛍光スポットが明瞭となることに気が付いた。 本発明は係る 知見に基づくものである。
本発明の固体支持体は、 表面に、 炭化ハフニウム、 炭化ニオブ、 炭化珪素、 炭 化タンタル、 炭ィ匕トリウム、 炭化チタン、 炭化ウラン、 炭化タングステン、 炭化 ジルコニウム、 炭化モリプデン、 炭化クロムあるいは炭化バナジゥムからなる表 面処理層が形成されてなることを特徴とする。
前記表面処理層の被膜の厚みは、 1 n m〜l 0 0 0 n mであることが好ましレ、。 さらに、 前記表面処理層の被膜上に、 化学修飾を施し、 オリゴヌクレオチドま たは D N A断片を担持させたものであることが好ましい。
また、 このような本発明の固体支持体は、 請求項 5記載のように、 固体支持体 の表面に遺伝子を担持させて遺伝子あるいは蛋白質等の生体物質を解析する方法 に利用することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 固体支持体上にプローブを固定化する場合の概略説明図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の固体支持体は、 ガラス、 プラスチック、 シリコンなどの固体支持体の 最表面上に適当な表面処理層が形成されたものを用いると、 固体支持体の上に D N Aサンプルを載せて様々な解析に用いる場合は、 遺伝子あるいは蛋白質等の生 体物質との親和 1·生等が強固になるので好ましい。
固体支持体としてのプラスチックは、 公知のプラスチックが使える。 例えば、 ポリエチレンテレフタレートあるいはポリブチレンテレフタレートなどのポリェ ステル樹脂、 ポリエチレン樹脂、 ポリスチレン樹脂、 ポリプロピレン樹脂、 A B S樹脂、 ナイロン、 アクリル樹脂、 フッ素樹脂、 ポリカーボネート樹脂、 ポリウ レタン榭脂、 メチルペンテン樹脂、 フエノール樹脂、 メラミン樹脂、 エポキシ榭 脂、 塩化ビュル樹脂などの熱硬化性あるいは熱可塑性樹脂が適用できる。
また、 表面処理としては、 炭化ハフニウム、 炭化ニオブ、 炭化珪素、 炭化タン タル、 炭化トリゥム、 炭化チタン、 炭化ウラン、 炭化タングステン、 炭化ジルコ 二ゥム、 炭化モリブデン、 炭化クロムあるいは炭化バナジウム等の炭化物を被覆 したものが好ましい。
さらに、 上記炭化物と他の物質との混合体、 例えば金属やセラミックス等との混 合体、 積層体も好ましい。
すなわち、 炭素は化学的安定性に優れており、 その後の化学修飾や D N Aプロ 一ブ等を載せる際の反応等に耐えることができる。
その理由は、 炭化物上に化学修飾を施し、 プローブを固定化したときに、 炭化 物の炭素に対してプローブが図 1に示すような結合形態を示し、 D NAプローブ を固体支持体に強固に固定化させることができるためであると考えられる。 また、 固定化されたプローブは、 図 1に示すように固体支持体上に垂直に林立 させることができるので、 単位面積あたりの固定化密度を上げることができる。 本発明の炭化物の表面処理層の厚みは、 特に限定するものではないが、 l n m 〜1 0 0 0 n mの厚みがあればよい。 1 n m未満では、 あまりに薄すぎて表面処 理層の厚みが均一にはならずに、 下地の固体支持体が露出してしまう部分が存在 するので好ましくない。 一方、 1 0 0 0 n nrを超える被覆は形成中に表面処理層 の中に応力が生じ、 剥離が生じやすくなるので好ましくない。 工業上の生産性か らすると、 表面処理層の厚みは、 1 0 η π！〜 5 0 0 n mである。 さらに好ましく は、 3 0〜2 0 0 n mである。
固体支持体への炭化物の表面処理層の形成方法は公知の方法で行うことができ る。 例えば、 高周波スパッタ法、 直流スパッタ法、 アークイオンプレーティング 法、 熱 C V D法などが挙げられる。
本発明の固体支持体は、 D N Aプローブ等の遺伝子あるいは蛋白質等の生体物 質を多数載せることができるものである。 従って、 固体支持体の表面上に複数の 微小区分が設けられ、 1つの区分に多数のオリゴヌクレオチド断片を担持可能と なっているものも好ましく採用される。 微小区分のそれぞれにおいて、 D N Aプ ローブ等の種類を変えることについては特に制限はなく、 用途に応じて適宜変化 させることができる。
固体支持体の形状は特に限定されず、 例えば、 フィルムまたはシートのような 平板状のものであってもよく、 また円盤状等のものであってもよい。 また、 固体 支持体の厚さ、 大きさ等にも特に制限はなく、 通常用いられるのと同様の範囲と することができる。
固体支持体の基体となるガラスの特性についても特に限定されるものではない 力 基体表面につける反応性物質との親和性等の種々の特性を考慮して適宜選択 できる。
なお、 このような基体の表面、 もしくは裏面に反射層として T i、 A u、 P t、 N b、 WC等の単層又はこれらの複合膜を製膜してもよい。 反射層の厚みは全体 に均一に被覆されなければならないことから、 1 0 0 n m以上が好ましい。 更に 好ましくは 1 0 0 0 n m以上がよい。
なお、 下地の固体支持体の表面は意図的に粗面化されていることも望ましい。 このような粗面化表面は基体の表面積が増えて多量の D N Aプローブ等を密度を 上げて固定させることに好都合であるからである。
基体表面には、 D N Aや蛋白質を固定するために、 更に化学修飾を施す。 化学 修飾の一例としては、 炭化水素基の末端に活性化エステル基が結合した基を、 支 持体表面にアミド結合を介して固定ィヒすることをいう。 このような化学修飾によ つて、 D N A、 蛋白質、 ペプチド結合等の生体物質を基体表面に固定化しやすく なる。 その化学修飾は、 末端に極性基、 例えば、 水酸基、 力ルポキシル基、 ェポ キシ基、 アミノ基、 チオール基、 イソシァネート基等を有する炭化水素基で固体 支持体を置換することになる。
前記炭化水素基としては、 炭素数が 1〜 1 2のもの、 中でも 1〜6のものが好 ましレ、。 例えば、 蟻酸、 酢酸、 プロピオン酸などのモノカルボン酸；シユウ酸、 マロイン酸、 コノヽク酸、 マレイン酸、 フマル酸などのジカルボン酸； トリメ リ ト 酸等の多価カルボン酸が挙げられる。 中でも、 シユウ酸、 コハク酸が好ましい。 化学修飾方法としては、 例えば、 塩素ガス中で支持体に紫外線照射して表面を 塩素ィ匕し、 次いでアンモニアガス中で紫外線照射してァミノ化した後、 適当な酸 クロリ ドあるいは酸無水物を用いてカルボキシル化する。
本発明の固体支持体に載せることができるオリゴヌクレオチドまたは D N A断 片 （プローブ） については、 1本鎖又は 2本鎖の D NA、 R NA断片等、 塩基数 にも特に制限はない。 オリゴヌクレオチドまたは D N A断片の固定は、 固体支持 体の表面への化学結合等により行うことができる。 例えば、 炭化物の表面処理層 を形成させた固体支持体を用いる場合、 表面を活性化、 すなわち D NAと化学結 合しやすくした後に、 D NAの末端塩基のアミノ基を結合することができる。 この場合の表面処理層を形成した固体支持体の化学修飾あるいは活 "生化の一例 を挙げると、 該固体支持体を塩素ガス中で固体支持体に紫外線照射して炭化物の 炭素を塩素化し、 次いでアンモニアガス中で紫外線照射してァミノ化した後、 適 当な酸クロリ ドを用いてカルボキシル化し、 末端のカルボキシル基を脱水縮合剤 であるカルボジィミ ド或いはジシク口へキシルカルボジィミ ド、 1― [ 3— （ジ メチノレアミノ） プロピル] 3—ェチルカルボジイミ ドを用いて、 N—ヒ ドロキシ スクシンイミ ドと脱水縮合することにより、 アミド結合を介して炭化水素基の末 端に N—ヒドロキシスクシンイミ ドエステル基等の活性エステル基が結合した基 を固定化することができ、 活性化される。
こうして本発明の固体支持体表面を活性化させておけば、 例えば、 塩基配列が 既に解明されている数万本の D N A断片（プローブ）を担持させることができる。 また、 該固体支持体上にオリゴ d Tプライマーを結合させておき、 逆転写反応 等で目的の c D N Aを伸張させると同時に固体支持体に結合することもできる。 さらに、 P C R等を用いて固体支持体上で多数の D NA鎖を伸張させ、 かつ結 合させることもできる。
このようにして、 D NA断片を結合させた後、 これに蛍光標識した D NAサン プノレを流すと、 D N Aサンプルは、 該固体支持体上に結合させた D N A断片 （プ ローブ） のうちの相補的な配列を有するプローブとハイブリダィズするので、 蛍 光スポットとして DNAサンプルの配列を解明することができる。
このように、 本発明の固体支持体は、 ある DNAの塩基配列を従来と同様の方 法をそのまま使いながら従来よりも格段に明瞭に解析、 特定することができるこ とから、 生体ゲノムの解析、 遺伝子発現のモニタリング、 ゲノムミスマッチング 等の遺伝子解析等に利用されるほか、 さらにガン遺伝子の突然変異の検出等遺伝 子診断や医薬品の開発等に有用である。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに説明する。
(実施例 1 )
(1) 以下のようにして、 遺伝子解析用に用いるための固体支持体としてポリェ チレンテレフタレート樹脂を用意した。 まず、 ポリエチレンテレフタレート樹脂 は、 25 mm (幅） X 75 mm (長さ） X 1 mm (厚み） のものを用いた。 次い でポリエチレンテレフタレート樹月旨の表面に、 ターゲットとして、 炭化ハフ-ゥ ム、 炭化ニオブ、 炭化珪素、 炭化タンタル、 炭化チタン、 炭化タングステン、 炭 化ジルコニゥムを用い、アルゴンガスを作動ガスとして高周波スパッタ法により、 それぞれのターゲッ 1、の炭化物からなる被膜をそれぞれ約 10 nmの厚みに形成 した固体支持体を作成した。
(2) 次に、 これらの固体支持体表面を化学修飾し、 活性ィヒさせた。
すなわち、 ポリエチレンテレフタレート樹脂の表面を 1分間塩素化した後、 10 分間ァミノ化し、 さらにコハク酸クロリ ド溶液へ 10分間直接浸漬した。 次に、 超純水で洗浄後、 活性化液へ浸漬して直接活性化を行った。 活性化液の組成は、
1， 4—ジォキサン lmL、 ハイドロゲンシァナミ ド 25mgおよび N—ヒドロ キシスクシンイミド 15 Omgであり、 これらを溶解したものである。 さらに超 純水で洗浄後、 65 °Cで乾燥して活性化した。
前記のようにして作成した固体支持体表面に、 500 pmo 1ノ mL濃度の F AMd A 17溶液 2 Lを滴下した （スポット）。 この際、 バッファ一として超 純水或いは 10%ホルムアルデヒド、 10%グリセリン、 50%DMSOを用い た。
次に、 インキュベーションを行った。 条件は、 水 Zホルムアミド =1/: 気中 65°Cで 1時間とした （乾燥)。
こうして得られた遺伝子解析用として用いる固体支持体につき、 蛍光強度を測 定した。 測定時間は 1分とし、 装置は LAS— 1000 P 1 u sを用いて、 スポ ット後および乾燥 （65°C) 後の蛍光強度を測定したが、 いずれも従来用いられ ている固体支持体よりも優れた値であった。
本発明の固体支持体は、いずれもスポット後および乾燥後の蛍光強度についても、 従来の固体支持体上のスポット後および乾燥後の蛍光強度よりも優れていた。 す なわち、 本発明の固体支持体は、 いずれにおいてもスポットした DNAあるいは 蛋白質等の生体物質断片が洗い流されずに固体支持体上に残留しており、 スポッ トが明瞭に検出できた。
—方、 従来の固体支持体は、 スポットした DNAあるいは蛋白質等の生体物質 の断片が洗い流されてしまい、 固体支持体上に残留していず、 スポットが明瞭に 検出できなかった。
(実施例 2)
基体として、 25 mm (幅） X 75 mm (長さ） X 0. 5 mm (厚み） のシリ コンを用いた。 このシリコン基体の表面に、 ターゲットとして炭化タンタルを用 い、 アルゴンガスを作動ガスとして高周波スパッタ法により、 炭化物からなる皮 膜を約 10 n mの厚みにした。
次に、 このシリコン基体の表面を化学修飾し、 活性化させた。 シリコン基体表 面を塩素ガス中で 1分間紫外線照射して塩素化した後、 アンモニアガス中で 10 分間ァミノ化し、 さらに無水コハク酸溶液に 20分間浸漬した。 無水コハク酸溶 液は、 N メチルー 2—ピロリ ドンに無水コハク酸を 14 OmM/L、 ホウ酸ナ トリウム （pH8) を 0. 1MZLを溶解させて作成した。
次に、 活性化液に浸漬して直接活性化を行った。 活性ィヒ液は、 200mL入り のビーカーに、 N—ヒドロキシスクシンィミ ドを 1 15mgと 1一 [3— （ジメ チルァミノ） プロピル] 3—ェチルカルポジイミドを 959mgをリン酸パッフ 了一 (pH6) 50mLに溶解し、 これにシリコン基体を浸漬して反応させ、 洗 浄した。
次に、活性化した基板に D N Aをスポツチングした。 D N Aサンプルを濃度が 0. 3 μ g/> Lになるように 50%DMSO溶液 （スポッティングバッファー） に 溶解してスポッティング用溶液を準備した。次に、スポッティング装置を用いて、 スライドグラスに DNA溶液を押しつけた。 このようにして、 スライドグラス表 面に D N Aサンプルを多数貼り付けた。
つぎに、 DNA固定化のためにインキュベーションを行った。 まず、 水とホ ム アルデヒドを 1 ： 1に混合した溶液をタイ トボックスに入れ、 調質チャンバ一と した。 次に、 溶液に触れないようにシリコン基体を調湿チャンバ一に入れ、 3時 間放置した。 その後、 洗浄液 （2 X S SC、 0. 2%SDS) で 2度洗浄し、 更 に、 0. 1 % S S Cと滅菌水でリンスし、 遠心乾燥した。
次に、 プレハイブリダイゼーション溶液 （ 50 %ホルムアミ ド、 5 Xデンハルト 液） でブロッキングした。 ブロッキング溶液を基板に滴下し、 気泡が入り込まな いように力パーグラスを静かにのせた。 その後、 基板を調湿チャンバ一に入れ、 60°Cで 1時間ブロッキングを行った。 その後、 0. 1 X S SCでカバーグラス を洗い落とし、 減菌水で 1 5分間洗浄してから遠心乾燥した。
それから、 DN Aサンプルを蛍光標識ラベルキットで蛍光標識した後、 標準化し た DN Aをアルカリ変性した。 標識ラベルをハイブリダイゼ一ションバッファー (20%S SC、 20%ホルムアミ ド、 0. 5%SDS) に溶角旱して 0. 3 μ g / ix Lに調整し、 ハイブリダイゼーション溶液とした。
DNAを固定したシリコン基体を熱水に 5分間浸漬した後、 ハイブリダィゼーシ ョン溶液を基板に滴下し、 気泡が入り込まないように力パーガラスを静かに載せ た。 その後、 調湿チャンパ一中で 1 2時間ハイプリダイゼーシヨンした。
その後、 0. 1 X S S Cでカバーグラスを洗い落とし、 洗浄液 （2 X S S C、 0. 2%SDS) で 2度洗浄し、 更に 0. 1%S SCと減菌水でリンスしてから 遠心乾燥した。
こうして得られた基板を、 富士写真フィルム製フルォロイメージアナライザー FLA 8000で観察を行った。 本発明の蛍光強度は、 1 352であり、 従来 の 845より高かった。 産業上の利用可能性
本発明の固体支持体は、 ある D N Aの塩基配列を従来と同様の方法をそのまま 使いながら従来よりも格段に明瞭に解析、 特定することができることから、 生体 ゲノムの解析、 遺伝子発現のモニタリング、 ゲノムミスマッチング等の遺伝子あ るいは蛋白質等の生体物質の解析等に利用されるほか、 さらにガン遺伝子の突然 変異の検出等遺伝子診断や医薬品の開発等に有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 固体支持体の表面に、 炭化ハフニウム、 炭化ニオブ、 炭化珪素、 炭化タン タル、 炭ィヒトリウム、 炭化チタン、 炭化ウラン、 炭化タングステン、 炭化ジルコ 二ゥム、 炭化モリプデン、 炭化クロムあるいは炭化バナジウムからなる表面処理 層が形成された固体支持体。
2 . 前記表面処理層の厚みが、 1 n m〜l 0 0 0 n mである請求項 1に記載の 固体支持体。
3 . 前記表面処理層の被膜上に、 オリゴヌクレオチドまたは D N A断片を担持 させた請求項 1または 2に記載の固体支持体。
4 . 請求項 1〜 3のいずれかに記載の固体支持体の表面に遺伝子を担持させて 遺伝子あるいは蛋白質等の生体物質を解析する方法。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7308123B2 (en) * 2002-04-23 2007-12-11 Identification International, Inc. System and method for collecting DNA and fingerprints
US20080020941A1 (en) * 2005-03-24 2008-01-24 Jimpei Tabata Biomolecule-immobilized plate and method for fabricating biomolecule-immobilized plate
US8075275B2 (en) 2007-09-27 2011-12-13 General Electric Company Wind turbine spars with jointed shear webs
RU2636465C2 (ru) 2012-02-09 2017-11-23 Лайф Текнолоджис Корпорейшн Способ конъюгирования полимерной частицы
US10843416B2 (en) * 2015-05-11 2020-11-24 Gulfstream Aerospace Corporation Composite reinforcement structures and aircraft assemblies comprising composite reinforcement structures
CN107922974B (zh) 2015-07-02 2021-11-09 生命技术公司 羧基官能亲水微珠的偶合
EP3320115B1 (en) 2015-07-06 2020-09-02 Life Technologies Corporation Substrates and methods useful in sequencing

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08334509A (ja) * 1995-06-09 1996-12-17 Nisshinbo Ind Inc 生物学的活性物質の分析法
JP2000146971A (ja) * 1998-11-10 2000-05-26 Nisshinbo Ind Inc 生物学的活性物質の固定化用担体
JP2000239110A (ja) * 1999-02-19 2000-09-05 Kansai Research Institute 機能性無機粒子およびその製造方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61229229A (ja) * 1985-04-04 1986-10-13 Canon Inc 磁気記録媒体
US4921731A (en) * 1986-02-25 1990-05-01 University Of Florida Deposition of ceramic coatings using sol-gel processing with application of a thermal gradient
US5541057A (en) * 1989-09-18 1996-07-30 Biostar, Inc. Methods for detection of an analyte
US5639671A (en) * 1989-09-18 1997-06-17 Biostar, Inc. Methods for optimizing of an optical assay device
US5494829A (en) * 1992-07-31 1996-02-27 Biostar, Inc. Devices and methods for detection of an analyte based upon light interference
US5965452A (en) * 1996-07-09 1999-10-12 Nanogen, Inc. Multiplexed active biologic array
JP3708567B2 (ja) * 1994-07-20 2005-10-19 日清紡績株式会社 生物学的に活性な物質を固定するための方法
US6340588B1 (en) * 1995-04-25 2002-01-22 Discovery Partners International, Inc. Matrices with memories
US5981268A (en) * 1997-05-30 1999-11-09 Board Of Trustees, Leland Stanford, Jr. University Hybrid biosensors
US6489111B1 (en) * 1998-02-10 2002-12-03 Toyo Kohan Co., Ltd. Apparatus and methods for immobilized DNA library preparation and gene amplification
US6284194B1 (en) * 1998-03-11 2001-09-04 Albert E. Chu Analytical assay device and methods using surfactant treated membranes to increase assay sensitivity
US6572830B1 (en) * 1998-10-09 2003-06-03 Motorola, Inc. Integrated multilayered microfludic devices and methods for making the same
JP3426987B2 (ja) * 1998-11-13 2003-07-14 三菱重工業株式会社 高温用耐食・耐摩耗コーティング部材及び製造方法並びにガスタービン翼
US6287783B1 (en) * 1999-03-18 2001-09-11 Biostar, Inc. Optical assay device and method
US6192168B1 (en) * 1999-04-09 2001-02-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Reflectively coated optical waveguide and fluidics cell integration
CA2270106C (en) * 1999-04-23 2006-03-14 Yousef Haj-Ahmad Nucleic acid purification and process
US6657169B2 (en) * 1999-07-30 2003-12-02 Stratagene Apparatus for thermally cycling samples of biological material with substantial temperature uniformity
US6325977B1 (en) * 2000-01-18 2001-12-04 Agilent Technologies, Inc. Optical detection system for the detection of organic molecules
US6602400B1 (en) * 2000-06-15 2003-08-05 Motorola, Inc. Method for enhanced bio-conjugation events
US6824974B2 (en) * 2001-06-11 2004-11-30 Genorx, Inc. Electronic detection of biological molecules using thin layers

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08334509A (ja) * 1995-06-09 1996-12-17 Nisshinbo Ind Inc 生物学的活性物質の分析法
JP2000146971A (ja) * 1998-11-10 2000-05-26 Nisshinbo Ind Inc 生物学的活性物質の固定化用担体
JP2000239110A (ja) * 1999-02-19 2000-09-05 Kansai Research Institute 機能性無機粒子およびその製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1324043A4 *

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