WO2002014350A2 - Peptid- und peptidmimetika-derivate mit integrin-inhibitor-eigenschaften ii - Google Patents

Peptid- und peptidmimetika-derivate mit integrin-inhibitor-eigenschaften ii Download PDF

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Ulrich Hersel
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Definitions

  • the invention relates to compounds of the formula
  • B is a bioactive, cell adhesion mediating molecule selected from the group
  • R 2 H or alkyl with 1 to 4 carbon atoms
  • R 4 H A, Ar, OH, OA, OAr, arylalkyl, shark, CN, NO 2 , CF 3 or OCF 3 ,
  • OH, NH 2 , OA, CF 3 , OCF3, CN, NO 2 or shark substituted phenyl which by one, two or three times substituted by A, OH, OA, OCF 3 , CN, NO 2 or shark in the Can be substituted in such a way that an unsubstituted or substituted biphenyl is formed, shark F, CI, Br or I,
  • Het is a saturated, partially or completely unsaturated mono- or bicyclic heterocyclic radical with 5 to 10 ring members, where 1 to 3 N and / or one S or O atom can be present and the heterocyclic radical can be mono- or disubstituted by CN,
  • Het 2 is a 5- or 6-membered aromatic heterocycle with 1 to 4 N and / or S atoms, which is unsubstituted or mono- or disubstituted by F, Cl, Br, A, OA or
  • OCF3 can be substituted, n 4, 5 or 6,
  • n, o, p, q represent 0, 1 or 2 s, t 0, 1, 2, 3, 4, 5; Q is missing or an organic spacer molecule and
  • X 1 is an anchor molecule selected from the group
  • the invention was based on the task of finding new compounds with valuable properties, in particular those which can be used for the production of medicaments.
  • the compounds of the formula I and their salts have very valuable pharmacological properties with good tolerability. Above all, they act as integrin inhibitors, in particular inhibiting the interactions of the ⁇ v -, ⁇ - or ßs-integrin receptors with ligands, such as. B. the binding of fibrinogen to the ß ß - integrin receptor.
  • the compounds are particularly effective in the case of the integrins ⁇ vß3, oc ßs, ⁇ nbß3 and ⁇ vß-i, vß ⁇ and ⁇ vßs. This effect can be demonstrated, for example, by the method described by JW Smith et al. in J. Biol. Chem. 265, 12267-12271 (1990).
  • the GPIIa / IIIb antagonists can be regarded as effective metastasis inhibitors.
  • the (meth) acrylic residue is used to covalently or adsorptively attach the peptides and peptide mimetics to biocompatible surfaces of e.g. To bind implants that have free acrylate or methacrylate residues, e.g. Polymethyl methacrylic shaped bodies (bone cements) or layers containing acrylate or methacrylate, e.g. on metal surfaces.
  • the thiol residue serves for peptide attachment e.g. on gold surfaces or on free surfaces containing amino groups such as e.g. Collagen (e.g. using maleimide), with plasma-treated polymer or metal surfaces (see D.M. Ferris, G.D. Moodie, P.M. Dimond, C.W.D. Giovanni, M.G. Ehrlich, R.F. Valentini, Biomaterials 20, 2323-2331 (1999);
  • the invention therefore relates to the compounds of the formula I for covalent or adsorptive binding via the functional group of
  • the peptides and peptide mimetics according to the invention now enable the biofunctionalization of biomaterials, in particular implants, for all conceivable organs by coating them, predominantly stimulating the adhesion of those cell species which in each case stimulate the
  • Tissue integration of the corresponding biomaterial With the use of such coatings, an accelerated and increased integration of various biomaterials / implants with improved long-term stability can be achieved after their introduction into the body.
  • the peptides according to the invention bind selectively to integrins. After immobilization on biocompatible surfaces, e.g. Implants, they stimulate the adhesion of cells that carry integrins. After coating the compounds on the surfaces, those cell species can be selectively stimulated for binding that should also carry out the implant integration after implantation in natural tissue. So it is e.g. for osteoblasts, osteoclasts and endothelial cells around ⁇ -bearing cell species.
  • the invention therefore relates to the compounds of the formula I as integrin inhibitors for selective cell enrichment on implants.
  • the compounds of the formula I can be used as active pharmaceutical ingredients in human and veterinary medicine, in particular they can be used as Integrin inhibitors for the treatment of diseases, defects and inflammations caused by implants, such as insufficient and delayed integration of biomaterials and implants, of thrombosis caused by implants, of bone and tooth defects, and of osteolytic diseases such as osteoporosis, thrombosis, heart attack, arteriosclerosis, in wound healing to support the healing processes, as well as to accelerate and strengthen the integration process of the implant or the biocompatible surface in the tissue.
  • implants such as insufficient and delayed integration of biomaterials and implants, of thrombosis caused by implants, of bone and tooth defects, and of osteolytic diseases such as osteoporosis, thrombosis, heart attack, arteriosclerosis, in wound healing to support the healing processes, as well as to accelerate and strengthen the integration process of the implant or the biocompatible surface in the tissue.
  • the compounds of formula I can be used as antimicrobial substances in operations where biomaterials, implants, catheters or pacemakers are used. They have an antiseptic effect.
  • the effectiveness of the antimicrobial activity can be demonstrated by the method described by P.Valentin-Weigund et al., In Infection and Immunity, 2851-2855 (1988).
  • the invention thus relates to the compounds of the formula I as integrin inhibitors for the treatment of diseases, defects, inflammations and osteolytic diseases such as osteoporosis, thrombosis, myocardial infarction and arteriosclerosis caused by implants, and for accelerating and intensifying the integration process of the implant or the biocompatible surface into the tissue.
  • diseases, defects, inflammations and osteolytic diseases such as osteoporosis, thrombosis, myocardial infarction and arteriosclerosis caused by implants, and for accelerating and intensifying the integration process of the implant or the biocompatible surface into the tissue.
  • the invention also relates to the use of compounds of the formula I for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases, defects, inflammations and osteolytic diseases such as osteoporosis, thrombosis, heart attack and arteriosclerosis caused by implants, and for accelerating and intensifying the integration process of the implant or the biocompatible surface in the tissue.
  • diseases, defects, inflammations and osteolytic diseases such as osteoporosis, thrombosis, heart attack and arteriosclerosis caused by implants, and for accelerating and intensifying the integration process of the implant or the biocompatible surface in the tissue.
  • Corresponding peptides carrying thiol anchors can be covalently bound to gold-plated supports, such as implants, affinity chromatography or microtiter plates.
  • the invention also relates to the use of compounds of the formula I for coating by means of covalent or adsorptive binding of implants for human and animal organs.
  • Trp tryptophan Tyr tyrosine val valine Trp tryptophan Tyr tyrosine val valine.
  • Trt trityl (triphenylmethyl). If the above-mentioned amino acids can occur in several enantiomeric forms, then above and below, for. B. as a component of the compounds of formula I, all these forms and also their mixtures (z. B. the DL forms) included. Furthermore, amino acids or the free amino group (xi) or the free carboxyl group (xiv) as a constituent of compounds of the formula I can be provided with corresponding protective groups known per se. In particular, side-chain modifications of arginine, such as those made for the non-peptide ⁇ vß 3 antagonists (for example by R. Keenan et al., Abstr. Pap. 211th ACS National Meeting (New Orleans, USA) 1996, MEDI 236), can also used in the cyclopeptides, such as benzimidazole derivatives instead of the guanidine group.
  • prodrug derivatives are also included in the compounds according to the invention, i. H. with z. B. alkyl or acyl groups, sugars or oligopeptides modified compounds of formula I which in
  • Organism can be quickly split into the active compounds of the invention.
  • the invention furthermore relates to an implant suitable for human and animal organs, consisting of a carrier matrix and a layer of a bioactive cell adhesion-promoting molecule which envelops this matrix, the enveloping layer being formed from a compound of the formula I, and between the carrier matrix and the latter There is a covalent or adsorptive bond.
  • the carrier matrix and / or its surface preferably consists of a metal or metal oxide or a polymer. Polymethyl methacrylate, polyhydroxyethyl methacrylate, polylactite, polyglycolic acid or their copolymers are preferred as polymers.
  • the invention further relates to a process for the preparation of compounds of the formula I as claimed in claim 1 and their salts, characterized in that a bioactive molecule B which comprises Protecting groups can be provided, and a spacer-anchor molecule (Q-Xi) or anchor molecule (Xi) provided with protective groups is linked peptically to one another and then the protective groups are split off, and / or that a basic or acidic compound of the formula 1 converted to one of its salts by treatment with an acid or base.
  • a bioactive molecule B which comprises Protecting groups can be provided, and a spacer-anchor molecule (Q-Xi) or anchor molecule (Xi) provided with protective groups is linked peptically to one another and then the protective groups are split off, and / or that a basic or acidic compound of the formula 1 converted to one of its salts by treatment with an acid or base.
  • radicals B, Q and X-i have the meaning given for the formula I, unless expressly stated otherwise.
  • Q is absent or represents an organic spacer molecule.
  • This is preferably a [CO- (CH) % ⁇ -NH-] m -, [CO-CH 2 - (0-CH 2 CH 2 ) y -NH-] m -, [CO- (CH 2 ) z - CO -] -, [NH- (CH 2 ) Z -NH -] -, [CO-CH 2 - (OCH 2 CH 2 ) y -0-CH 2 -CO -] - or a [NH-CH 2 CH 2 - (OCH 2 CH 2 ) y -NH -] - radical and their combinations, the value ranges specified in claim 2 applying to the indices m, x, y and z.
  • the compounds mentioned above have proven to be particularly advantageous, which can assume values between 1 and 8 for m, values between 1 and 5 for x and values between 1 and 6 for y and z.
  • Y is preferably - (CH) n - or
  • Z is preferably NR 2 or CH-R 2 , where R 2 can preferably be an H atom or alkyl radical having 1 to 4 C atoms.
  • R 3 preferably denotes an H atom, Ar, Het or A radical, where A, Ar and Het have one of the meanings given above or below.
  • R 4 preferably denotes an H atom, A, Ar, OH, OA, OAr, arylalkyl, shark,
  • Arylalkyl preferably means benzyl, phenylethyl, phenylpropyl or naphthylmethyl, particularly preferably benzyl.
  • A is preferably a COOH, NH 2 or alkyl radical having 1 to 6, preferably 1, 2, 3, 4, 5 or 6, carbon atoms, unsubstituted or substituted by COOH or NH 2 .
  • A is preferably methyl, furthermore ethyl, propyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl or in part. Butyl, also n-pentyl, 1-, 2- or 3-methylbutyl, 1, 1-, 1, 2- or 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, hexyl, 1-, 2-, 3- or 4 -Methylpentyl, 1, 1-, 1, 2-, 1, 3-, 2,2-, 2,3- or 3,3-
  • Ar preferably denotes unsubstituted or mono-, di- or trisubstituted by A, OH, OA, CF 3 , OCF 3 , CN, NO 2 or shark, which is substituted by mono-, di- or triple by A, OH, OA, NH 2 , OCF 3 , CN, N0 2 or shark substituted phenyl can be substituted in such a way that an unsubstituted or substituted biphenyl is formed.
  • Ar therefore preferably denotes phenyl, o-, m- or p-methylphenyl, o-, m- or p-ethylphenyl, o-, m- or p-propylphenyl, o-, m- or p-isopropylphenyl, o-, m - or p-tert.
  • Het means a saturated, partially or completely unsaturated mono- or bicyclic heterocyclic radical with 5 to 10 ring members, where 1 to 3 N and / or 1S or O atoms can be present and the heterocyclic radical can be substituted once or twice by CN, shark, OH, NH 2 , COOH, OA, CF 3 , A, N0 2 , Ar or OCF 3 .
  • Het is preferably a 0-, m-, p-substituted pyridyl, a 2-, 4-, 5- or 6-substituted pyrimidyl or a 3-, 4-, 5- or 6-substituted pyridazyl, which is preferably unsubstituted or substituted by a methyl, ethyl, propyl group or a methylamino, ethylamino or propylamino group [refers to all of the three heteroaromatics mentioned], and a 2-substituted benzimidazolyl which is unsubstituted or by a 3-methyl, 3 -Ethyl- or 3-benzyl group is substituted, and a 2- substituted dihydroimidazolyl, tetrahydropyrimidyl or tetrahydropyridyl. Examples that are preferably contained in Het:
  • Het 1 means a 5- or 6-membered aromatic heterocycle having 1 to 4 N and / or S atoms, which can be unsubstituted or mono- or disubstituted by F, Cl, Br, A, OA or OCF 3 .
  • Het 1 is preferably a 2,4-, 3,5-, 2,5-disubstituted pyridyl or a 2,4-, 2,5-, 2,6-, 4,6-disubstituted pyrimidyl, a 2,4- , 2,5-disubstituted 1,3-oxazolyl or 1,3-thiazolyl.
  • OA preferably means methoxy, ethoxy, propoxy or butoxy, further also pentyloxy or hexyloxy.
  • Shark preferably means F, Cl, or Br, but also I.
  • indices n, m, o, p, q, s and t have the meaning given in claim 1, unless expressly stated otherwise.
  • the compounds of the formula I can have one or more chiral centers and therefore exist in various stereoisomeric forms.
  • Formula I encompasses all of these forms.
  • the invention relates in particular to those compounds of the formula I in which at least one of the radicals mentioned has one of the preferred meanings indicated above.
  • the starting materials can also be formed in situ, so that they are not isolated from the reaction mixture, but instead are immediately converted further into the compounds of the formula I.
  • Suitable inert solvents are e.g. Hydrocarbons such as hexane, petroleum ether, benzene, toluene or xylene; chlorinated hydrocarbons such as trichlorethylene, 1, 2-dichloroethane, carbon tetrachloride, chloroform or dichloromethane; Alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol or tert-butanol; Ethers such as diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrof ⁇ ran (THF) or dioxane; Glycol ethers such as ethylene glycol monomethyl or monoethyl ether (methyl glycol or ethyl glycol), ethylene glycol dimethyl ether (diglyme); Ketones such as acetone or butanone; Amides such as acetamide, N-methylpyrrolidone, dimethylacetamide
  • TCP resin trityl chloride-polystyrene resin
  • the ESI mass spectra were carried out using a Finnigan device of the LCQ type.
  • Plastic syringes were rotated overhead to mix the resin suspensions at about 15 rpm.
  • Asp (Bu) -TCP resin (1.00 g, 0.6 mmol / g, 0.6 mmol) resulted from a multi-stage known synthesis (see Gibson, C; Goodman, SL; Hahn, D.; Hölzemann, G .; Kessler, H Novel Solid-Phase Synthesis of Azapeptides and Azapeptoides via Fmoc-Strategy and its Application in the Synthesis of RGD-Mimetics. J. Org. Chem. 1999, 64, 7388-7394 and Gibson, C; Kessler, H.

Abstract

Verbindungen der Formel (I): B-Q-X1, worin B ein bioaktives, zelladhäsionsvermittelndes Molekül, ausgewählt aus der Gruppe (i) und Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (ii), Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (iii), Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (iv), Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg (v), Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn (vi), Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg (vii), wobei für (i) X, Y, Z, R?2, R3, R4¿, A, Ar, Hal, Het, Het1, n, m, o, p, q, s, t die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen, Q fehlt oder ein organisches Spacer-Molekül ist, X¿1? ein Ankermolekül, ausgewählt aus der in Anspruch 1 angegebenen Gruppe bedeutet, sowie deren Salze, können als Integrin-Inhibitoren insbesondere zur Behandlung von durch Implantate verursachten Erkrankungen, Defekten, Entzündungen und von osteolytischen Erkrankungen wie Osteoporose, Thrombose, Herzinfakt und Arteriosklerose, sowie zur Beschleunigung und Verstärkung des Integrationsprozesses des Implantates bzw. der biokompatiblen Oberfläche in das Gewebe, verwendet werden.

Description

Peptid- und Peptidmimetika-Derivate mit Integrin- Inhibitor-Eigenschaften II
Die Erfindung betrifft Verbindungen der Formel
B-Q-X-, worin
B ein bioaktives, zelladhasionsvermittelndes Molekül, ausge- wählt aus der Gruppe
Figure imgf000003_0001
und
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (ii)
Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (iii)
Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (iv)
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg (v)
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn (vi)
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg (vii),
wobei für (i)
X H2N-C(=NH)-NH, Het-NH-, H2N-C(=NH)-, A-C(=NH)-NH-* oder
Het-
Y -(CH2)n- oder -(CH2)- - (CH2)0- ,
F R«
Figure imgf000003_0002
Z N-R2 oder CH-R2
R2 H oder Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen
R3 H, Ar, Het oder A
R4 H, A, Ar, OH,OA, OAr, Arylalkyl, Hai, CN, NO2, CF3 oder OCF3,
A COOH, NH2 oder Alkyl mit 1-6 C-Atomen, unsubstituiert oder substituiert mit COOH oder NH2
Ar unsubstituiertes oder ein-, zwei-oder dreifach durch A,
OH, NH2, OA, CF3, OCF3, CN, NO2 oder Hai substituiertes Phenyl, welches durch ein ein-, zwei oder dreifach durch A, OH, OA, OCF3, CN, N02 oder Hai substituiertes Phenyl in der Art substituiert sein kann, dass ein unsubstituiertes oder substituiertes Biphenyl entsteht, Hai F, CI, Br oder I,
Het einen gesättigten, teilweise oder vollständig ungesättigten mono- oder bicyclischen heterocyclischen Rest mit 5 bis 10 Ringgliedern, wobei 1 bis 3 N- und/oder ein S- oder O-Atome vorliegen können und der heterocyclische Rest ein- oder zweifach durch CN,
Hai, OH, NH2, COOH, OA, CF3, A, N02 , Ar oder OCF3 substituiert sein kann,
Het2 einen 5- oder 6-gliedrigen aromatischen Heterocyclus mit 1 bis 4 N- und/oder S-Atomen, der unsubstituiert oder ein- oder zweifach durch F, Cl, Br, A, OA oder
OCF3 substituiert sein kann, n 4, 5 oder 6,
m, o, p, q 0, 1 oder 2 s, t 0, 1 , 2, 3, 4, 5 bedeuten; Q fehlt oder ein organisches Spacer-Molekul und
X 1 ein Ankermolekül, ausgewählt aus der Gruppe
-CO-CH=CH2 (viii)
-CO-(CH2)ι-2o-CO-CH=CH2 (ix) -CO-(CH2).-2o-SH (x)
-CO-CH(NH2)-CH2-SH (xi)
-NH-(CH2)ι-2o-CO-CH=CH2 (xii)
-NH-(CH2)2-2o-SH (xiii)
-NH-CH(C02H)-CH2-SH (xiv) bedeutet,
wobei im Falle der Verbindungen (viii) bis (xi) eine freie Aminogruppe der Gruppe B mit einer freien Carboxylgruppe des Spacer-Moleküls Q oder des Ankermoleküls Xi bzw. eine freie Aminogruppe des Restes Q mit einer freien Carboxylgruppe des Restes Xi peptidartig miteinander verknüpft ist, und im Falle der Verbindungen (xii) bis (xiv) eine freie Carboxylgruppe der Gruppe B mit einer freien Aminogruppe des Spacer-Moleküls Q oder des Ankermoleküls X*ι bzw. eine freie Carboxylgruppe des Restes Q mit einer freien Aminogruppe des Restes X 1 peptidartig miteinander verknüpft ist, sowie deren Salze.
Ähnliche Verbindungen sind aus DE 19932796, DE 19755800 und DE 19831710 bekannt.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit wertvollen Eigenschaften aufzufinden, insbesondere solche, die zur Herstellung von Arzneimitteln verwendet werden können.
Es wurde gefunden, daß die Verbindungen der Formel I und ihre Salze bei guter Verträglichkeit sehr wertvolle pharmakologische Eigenschaften besitzen. Vor allem wirken sie als Integrin-Inhibitoren, wobei sie insbesondere die Wechselwirkungen der αv-, ßß- oder ßs-Integrin-Rezeptoren mit Liganden hemmen, wie z. B. die Bindung von Fibrinogen an den ßß- Integrinrezeptor. Besondere Wirksamkeit zeigen die Verbindungen im Fall der Integrine αvß3, oc ßs, αnbß3 sowie αvß-i, vßβ und αvßs. Diese Wirkung kann z.B. nach der Methode nachgewiesen werden, die von J.W. Smith et al. in J. Biol. Chem. 265, 12267-12271 (1990) beschrieben wird.
Die Abhängigkeit der Entstehung von Angiogenese von der Wechsel- Wirkung zwischen vaskulären Integrinen und extrazellulären Matrixproteinen ist von P.C. Brooks, R.A. Clark und D.A. Cheresh in Science 264, 569-71 (1994) beschrieben.
Verbindungen der Formel I, die die Wechselwirkung von Integrinrezep- toren und Liganden, wie z. B. von Fibrinogen an den Fibrinogenrezeptor (Glycoprotein llb/llla) blockieren, verhindern als GPIIb/llla-Antagonisten die Ausbreitung von Tumorzellen durch Metastase. Dies wird durch folgende Beobachtungen belegt: Die Verbreitung von Tumorzellen von einem lokalen Tumor in das vaskuläre System erfolgt durch die Bildung von Mikroaggregaten (Mikrothromben) durch Wechselwirkung der Tumorzellen mit Blutplättchen. Die Tumorzellen sind durch den Schutz im Mikroaggregat abgeschirmt und werden von den Zellen des Immunsystems nicht erkannt. Die Mikroaggregate können sich an Gefäßwandungen festsetzen, wodurch ein weiteres Eindringen von Tumorzellen in das Gewebe erleichtert wird.
Da die Bildung der Mikrothromben durch Fibrinogenbindung an die Fibrino- genrezeptoren auf aktivierten Blutplättchen vermittelt wird, können die GPIIa/lllb-Antagonisten als wirksame Metastase-Hemmer angesehen werden.
Der (Meth-)acrylrest dient dazu, die Peptide und Peptidmimetika kovalent oder adsorptiv an biokompatible Oberflächen von z.B. Implantaten zu binden, die freie Acrylat- oder Methacrylatreste aufweisen, wie z.B. Polymethylmethacryl-Formkörper (Knochenzemente) oder acrylat- bzw. methacrylathaltige Schichten z.B. auf Metalloberflächen.
Entsprechend dient der Thiolrest der Peptidanbindung z.B. an Goldoberflächen oder an freie Aminogruppen-haltige Oberflächen wie z.B. Kollagen (z.B. mittels Maleinimid), mit Plasma-behandelte Polymer- oder Metalloberflächen (siehe D.M. Ferris, G.D. Moodie, P.M. Dimond, C.W.D. Giovanni, M.G. Ehrlich, R.F. Valentini, Biomaterials 20, 2323-2331(1999);
D.F. Meyers et al., J. Immunol. Methods 121,129-142 (1989); oder mit CVD-Technik behandelte Oberflächen (siehe Lahann, J. et al., Macromol. Rapid Commun. 19, 441-444 (1998))
Gegenstand der Erfindung sind daher die Verbindungen der Formel I zur kovalenten oder adsorptiven Bindung über die funktionelle Gruppe des
Restes X*ι an biokompatible Oberflächen.
Es wird in diesem Zusammenhang auf die am gleichen Tag von der Anmelderin eingereichte zweite Anmeldung verwiesen, in der der Rest Xi eine andere Bedeutung hat.
Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidmimetika ermöglichen nun die Biofunktionalisierung von Biomaterialien, insbesondere Implantaten für alle denkbaren Organe durch deren Beschichtung, wobei vorwiegend die Adhäsion derjenigen Zellspezies stimuliert wird, die jeweils die
Gewebeintegration des entsprechenden Biomaterials vollführen sollen. Mit der Verwendung solcher Beschichtungen ist eine beschleunigte und die verstärkte Integration verschiedener Biomaterialien/Implantate mit verbesserter Langzeitstabilität nach deren Einbringen in den Körper zu erzielen.
Die erfindungsgemäßen Peptide binden selektiv an Integrine. Nach Immobilisierung an biokompatiblen Oberflächen, z.B. Implantaten, stimulieren sie die Adhäsion von Zellen, die Integrine tragen. Nach Beschichtung der Verbindungen auf den Oberflächen, können selektiv diejenigen Zeil-Spezies zur Bindung stimuliert werden, die auch nach Implantation im natürlichen Gewebe die Implantatintegration vollführen sollen. So handelt es sich z.B. bei Osteoblasten, Osteoclasten und Endothelzellen um α -tragende Zellspezies.
Gegenstand der Erfindung sind daher die Verbindungen der Formel I als Integrininhibitoren zur selektiven Zellanreicherung an Implantaten.
Die Verbindungen der Formel I können nach Verankerung an einer biokompatiblen Oberfläche als Arzneimittelwirkstoffe in der Human- und Veterinärmedizin eingesetzt werden, insbesondere können sie als Integrininhibitoren zur Behandlung von durch Implantate verursachten Erkrankungen, Defekten und Entzündungen wie ungenügender und verzögerter Integration von Biomaterialien und Implantaten, von durch Implantate verursachter Thrombose, von Knochen- und Zahndefekten, sowie von osteolytischen Erkrankungen wie Osteoporose, Thrombose, Herzinfarkt, Arteriosklerose, bei der Wundheilung zur Unterstützung der Heilungsprozesse, sowie zur Beschleunigung und Verstärkung des Integrationsprozesses des Implantats bzw. der biokompatiblen Oberfläche in das Gewebe, eingesetzt werden.
Die Verbindungen der Formel I können als antimikrobiell wirkende Substanzen bei Operationen eingesetzt werden, wo Biomaterialien, Implantate, Katheter oder Herzschrittmacher verwendet werden. Dabei wirken sie antiseptisch. Die Wirksamkeit der antimikrobiellen Aktivität kann durch das von P.Valentin-Weigund et al., in Infection and Immunity, 2851-2855 (1988) beschriebene Verfahren nachgewiesen werden.
Gegenstand der Erfindung sind somit die Verbindungen der Formel I als Integrininhibitoren zur Behandlung von durch Implantate verursachten Erkrankungen, Defekten, Entzündungen und von osteolytischen Erkrankungen wie Osteoporose, Thrombose, Herzinfarkt und Arteriosklerose, sowie zur Beschleunigung und Verstärkung des Integrationsprozesses des Implantats bzw. der biokompatiblen Oberfläche in das Gewebe.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung von Verbindungen der Formel I zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von durch Implantate verursachten Erkrankungen, Defekten, Entzündungen und von osteolytischen Erkrankungen wie Osteoporose, Thrombose, Herzinfarkt und Arteriosklerose, sowie zur Beschleunigung und Verstärkung des Integrationsprozesses des Implantats bzw. der biokompatiblen Oberfläche in das Gewebe.
Entsprechende thiolankertragende Peptide können kovalent an vergoldete Träger, wie z.B. Implantate, Affinitätschromatographien oder Mikrotiter- platten gebunden werden. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Verbindungen der Formel I zur Beschichtung mittels kovalenter oder adsorptiver Bindung von Implantaten für humane und tierische Organe.
Die vor- und nachstehend aufgeführten Abkürzungen von Aminosäureresten stehen für die Reste folgender Aminosäuren:
Abu 4-Aminobuttersäure
Aha 6-Aminohexansäure, 6-Aminocapronsäure
Ala Alanin
Asn Asparagin
Asp Asparaginsäure
Arg Arginin
Cys Cystein
Dab 2,4-Diaminobuttersäure
Dap 2,3-Diaminopropionsäure
Gin Glutamin
Glp Pyroglutaminsäure
Glu Glutaminsäure
Gly Glycin
His Histidin homo-Phe homo-Phenylalanin lle Isoleucin
Leu Leucin
Lys Lys in
Met Methionin
Nie Norleucin
Orn Omithin
Phe Phenylalanin
Phg Phenylglycin
4-Hal-Phe 4-Halogen-phenylalanin
Pro Prolin
Ser Serin
Thr Threonin
Trp Tryptophan Tyr Tyrosin Val Valin.
Ferner bedeuten nachstehend:
Ac Acetyl
BOC tert.-Butoxycarbonyl
CBZ oder Z Benzyloxycarbonyi
DCCI Dicyclohexylcarbodiimid
DMF Dimethylformamid
EDCI N-Ethyl-N,N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid
Et Ethyl
FCA Fluoresceincarbonsäure
FITC Fluoresceinisothiocyanat
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
FTH Fluoresceinthiohamstoff
HATU 0-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-
Tetramethyluronium-hexafluorophosphat
HOBt 1 -Hydroxybenzotriazol
Me Methyl
MBHA 4-Methyl-benzhydrylamin
Mtr 4-Methoxy-2,3,6-trimethylphenyl-sulfonyl
HONSu N-Hydroxysuccinimid
OtBu tert.-Butylester
Oct Octanoyl
OMe Methylester
OEt Ethylester
POA Phenoxyacetyl
Pbf Pentamethylbenzofuranyl
Pmc 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl
Sal Salicyloyl
Su Succinyl
TFA Trifluoressigsäure
Trt Trityl (Triphenylmethyl). Sofern die vorstehend genannten Aminosäuren in mehreren enantiomeren Formen auftreten können, so sind vor- und nachstehend, z. B. als Bestandteil der Verbindungen der Formel I, alle diese Formen und auch ihre Gemische (z. B. die DL-Formen) eingeschlossen. Ferner können Aminosäuren bzw. die freie Aminogruppe (xi) oder die freie Carboxylgruppe (xiv) als Bestandteil von Verbindungen der Formel I, mit entsprechenden an sich bekannten Schutzgruppen versehen sein. Vor allem Seitenkettenmodifikationen des Arginins, wie sie z.B. bei den nichtpeptidischen αvß3-Antagonisten vorgenommen wurden (z.B. durch R.Keenan et al., Abstr. Pap. 211th ACS National Meeting (New Orleans, USA) 1996, MEDI 236), können auch bei den Cyclopeptiden eingesetzt werden, wie z.B. Benzimidazolderivate anstelle der Guanidingruppe.
In die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch sogenannte Prodrug- Derivate eingeschlossen, d. h. mit z. B. Alkyl- oder Acylgruppen, Zuckern oder Oligopeptiden abgewandelte Verbindungen der Formel I, die im
Organismus rasch zu den wirksamen erfindungsgemäßen Verbindungen gespalten werden.
Hierzu gehören auch bioabbaubare Polymerderivate der erfindungs- gemäßen Verbindungen, wie dies z. B. in Int. J. Pharm. 115, 61-67 (1995) beschrieben ist.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Implantat, geeignet für humane und tierische Organe, bestehend aus einer Trägermatrix und einer diese Matrix umhüllenden Schicht eines bioaktiven, zelladhäsionsvermittelnden Moleküls, wobei die umhüllende Schicht aus einer Verbindung der Formel I gebildet wird, und wobei zwischen Trägermatrix und dieser Verbindung eine kovalente oder adsorptive Bindung vorliegt. Vorzugsweise besteht die Trägermatrix und/ oder deren Oberfläche aus einem Metall bzw. Metall- oxid oder einem Polymer. Als Polymere kommen bevorzugt Polymethyl- methacrylat, Polyhydroxyethylmethacrylat, Polylactit, Polyglycolsäure oder deren Copolymere in Betracht.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 sowie ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, daß man ein bioaktives Molekül B, welches mit Schutzgruppen versehen sein kann, und ein mit Schutzgruppen versehenes Spacer-Anker-Molekül (Q-Xi) bzw. Anker-Molekül (Xi) peptidisch miteinander verknüpft und anschließend die Schutzgruppen abspaltet, und/oder dass man eine basische oder saure Verbindung der Formel 1 durch Behandeln mit einer Säure oder Base in eines ihrer Salze überführt.
Vor- und nachstehend haben die Reste B, Q und X-i die bei der Formel I angegebene Bedeutung, sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist.
Q fehlt oder bedeutet ein organisches Spacer-Molekul. Bevorzugt ist dieses ein [CO-(CH )%χ-NH-]m-, [CO-CH2-(0-CH2CH2)y-NH-]m-, [CO-(CH2)z-CO-]-, [NH-(CH2)Z-NH-]-, [CO-CH2-(OCH2CH2)y-0-CH2-CO-]- oder ein [NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]-Rest sowie deren Kombinationen, wobei für die Indices m, x, y und z die im Anspruch 2 angegebenen Wertebereiche gelten. Als besonders vorteilhaft haben sich die vorgenannten Verbindungen erwiesen, die für m Werte zwischen 1 und 8, für x Werte zwischen 1 und 5 und für y und z Werte zwischen 1 und 6 annehmen können.
X*ι bedeutet ein Ankermolekül, vorzugsweise aus der Gruppe -CO-CH=CH2, -CO-(CH2)ι-20-CO-CH=CH2, -CO-(CH2)ι-20-SH, -CO-CH(NH2)-CH2-SH, -NH-(CH2) .-2o-CO-CH=CH2, -NH-(CH2)2-20-SH, oder -NH-CH(C02H)-CH2-SH X bedeutet vorzugsweise H2N-C(=NH)-NH-, Het-NH-, H2N-C(=NH)-, A- C(=NH)-NH oder ein Het-Rest.
Y bedeutet vorzugsweise -(CH )n- oder
Figure imgf000012_0001
-(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t- oder -(CH2)p-Het2-(CH2)q-Rest.
Z bedeutet vorzugsweise N-R2 oder CH-R2, wobei R2 vorzugsweise ein H- Atom oder Alkyl-Rest mit 1 bis 4 C-Atomen sein kann. R3 bedeutet vorzugsweise ein H-Atom, Ar, Het oder A -Rest, wobei A, Ar und Het eine der zuvor oder nachstehend angegebenen Bedeutungen haben.
R4 bedeutet vorzugsweise ein H-Atom, A, Ar, OH, OA, OAr, Arylalkyl, Hai,
CN, N02, CF3 oder OCF3 -Rest. Arylalkyl bedeutet bevorzugt Benzyl, Phenylethyl, Phenylpropyl oder Naphthylmethyl, besonders bevorzugt Benzyl.
A bedeutet vorzugsweise ein COOH-, NH2 - oder Alkyl-Rest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 , 2, 3, 4, 5 oder 6 C-Atomen, unsubstituiert oder substituiert mit COOH oder NH2. A bedeutet vorzugsweise Methyl, weiterhin Ethyl, Propyl, n-Butyi, Isobutyl, sek.-Butyl oder teil. Butyl, ferner auch n-Pentyl, 1-,2- oder 3-Methylbutyl, 1 ,1-, 1 ,2- oder 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, 1-,2-,3- oder 4-Methylpentyl, 1 ,1-, 1 ,2-, 1 ,3-, 2,2-, 2,3- oder 3,3-
Dimethylbutyl, 1- oder 2-Ethylbutyl, 1-Ethyl-1 -methylpropyl, 1 -Et yl-2- methylpropyl, 1 ,1 ,2- oder 1 ,2,2-Trimethylpropyl. Besonders bevorzugt für A ist Methyl.
Ar bedeutet vorzugsweise unsubstituiertes oder ein-, zwei- oder dreifach durch A, OH, OA, CF3, OCF3, CN, N02 oder Hai substituiertes Phenyl, welches durch ein-, zwei- oder dreifach durch A, OH, OA, NH2, OCF3, CN, N02 oder Hai substituiertes Phenyl in der Art substituiert sein kann, dass ein unsubstituiertes oder substituiertes Biphenyl entsteht.
Ar bedeutet daher bevorzugt Phenyl, o-, m- oder p-Methylphenyl, o-, m- oder p-Ethylphenyl, o-, m- oder p-Propylphenyl, o-, m- oder p- Isopropylphenyl, o-, m- oder p-tert. Butylphenyl, o-, m- oder p- Hydroxyphenyl, o-, m- oder p-Methoxyphenyl, o-, m- oder p- Ethoxyphenyl, o-, m-, p-Trifluormethylphenyl, o-, m-, p-Trifluormethoxyphenyl, o-, m- oder p-Fluorphenyl, o-, m- oder p-Chlorphenyl, o-, m- oder p-Bromphenyl, o-, m- oder p-Nitrophenyl.
Het bedeutet einen gesättigten, teilweise oder vollständig ungesättigten mono- oder bicyclischen heterocyclischen Rest mit 5 bis 10 Ringgliedern, wobei 1 bis 3 N- und/ oder 1S- oder O-Atome vorliegen können und der heterocyclische Rest ein- oder zweifach durch CN, Hai, OH, NH2, COOH, OA, CF3, A, N02, Ar oder OCF3 substituiert sein kann.
Het ist vorzugsweise ein 0-, m-, p-substituiertes Pyridyl, ein 2-, 4-, 5- oder 6-substituiertes Pyrimidyl oder ein 3-, 4-, 5- oder 6-substituiertes Pyridazyl, das bevorzugt unsubstituiert oder substituiert durch eine Methyl-, Ethyl-, Propylgruppe oder eine Methylamino-, Ethylamino- oder Propylamino- gruppe ist [bezieht sich auf alle der drei genannten Heteroaromaten], sowie ein 2- substituiertes Benzimidazolyl, das unsubstituiert oder durch eine 3-Methyl-, 3-Ethyl- oder 3-Benzylgruppe substituiert ist, sowie ein 2- substituiertes Dihydroimidazolyl, Tetrahydropyrimidyl oder Tetrahydro- pyridyl. Beispiele, die in Het bevorzugt enthalten sind:
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000014_0002
Het1 bedeutet einen 5- oder 6-gliedrigen aromatischen Heterocyclus mit 1 bis 4 N- und/ oder S-Atomen, der unsubstituiert oder ein- oder zweifach durch F, Cl, Br, A, OA oder OCF3 substituiert sein kann. Het1 ist vorzugsweise ein 2,4-, 3,5-, 2,5-disubstituiertes Pyridyl oder ein 2,4-, 2,5-, 2,6-, 4,6-disubstituiertes Pyrimidyl, ein 2,4-, 2,5-disubstituiertes 1 ,3-Oxazolyl oder 1 ,3-Thiazolyl.
OA bedeutet vorzugsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy oder Butoxy, ferner auch Pentyloxy oder Hexyloxy.
Hai bedeutet vorzugsweise F, Cl, oder Br, aber auch I.
Die Indices n, m, o, p, q, s und t haben die im Anspruch 1 angegebene Bedeutung, sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist.
Die Verbindungen der Formel I können ein oder mehrere chirale Zentren besitzen und daher in verschiedenen stereoisomeren Formen vorkommen. Die Formel I umschließt alle diese Formen.
Dementsprechend sind Gegenstand der Erfindung insbesondere diejenigen Verbindungen der Formel I, in denen mindestens einer der genannten Reste eine der vorstehend angegebenen bevorzugten Bedeutungen hat.
Besonders bevorzugt sind folgende Verbindungen der Formel I:
Figure imgf000015_0001
b) Thr-Trp-Tyr-Lys-lle-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys c) Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-lle-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys d) Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys e) Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg f) Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys g) Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala Die Verbindungen der Formel I und auch die Ausgangsstoffe zu ihrer Herstellung werden im übrigen nach an sich bekannten Methoden hergestellt, wie sie in der Literatur (z.B. in den Standardwerken wie Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart oder The Journal of Biological Chemistry, Vol. 271 , No. 44, pp. 27221 ff. (1996)) beschrieben sind, und zwar unter Reaktionsbedingungen, die für die genannten Umsetzungen bekannt und geeignet sind. Dabei kann man auch von an sich bekannten, hier nicht näher erwähnten Varianten Gebrauch machen.
Die Ausgangsstoffe können, falls gewünscht, auch in situ gebildet werden, so dass man sie aus dem Reaktionsgemisch nicht isoliert, sondern sofort weiter zu den Verbindungen der Formel I umsetzt.
Die Fragmentkupplung erfolgt in einem inerten Lösungsmittel, wobei ein Carbonsäurefragment (Acrylat- oder Thiollinker) mit HATU, HOAt und 2,4,6-Collidin in DMF gelöst wird und anschließend mit dem Aminfragment (lineares Peptid, Peptidmimetikum) versetzt wird bzw. auch umgekehrt (Linker = Aminfragment; Peptid/Mimetikum = Carbonsäurefragment).
Als inerte Lösungsmittel eignen sich z.B. Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Petrolether, Benzol, Toluol oder Xylol; chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Trichlorethylen, 1 ,2-Dichlorethan,Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform oder Dichlormethan; Alkohole wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol, n-Butanol oder tert.-Butanol; Ether wie Diethylether, Diisopropylether, Tetrahydrofμran (THF) oder Dioxan; Glykolether wie Ethylenglykol- monomethyl- oder -monoethylether (Methylglykol oder Ethylglykol), Ethylenglykoldimethylether (Diglyme); Ketone wie Aceton oder Butanon; Amide wie Acetamid, N-Methylpyrrolidon, Dimethylacetamid oder Dimethylformamid (DMF); Nitrile wie Acetonitril; Sulfoxide wie Dimethyl- sulfoxid (DMSO); Schwefelkohlenstoff; Carbonsäuren wie Ameisensäure oder Essigsäure; Nitroverbindungen wie Nitromethan oder Nitrobenzol; Ester wie Ethylacetat, Wasser oder Gemische der genannten Lösungsmittel.
Allgemeine Arbeitstechniken: Die Reagenzien wurden von den Firmen Aldrich, Bachern, Fluka, Neosystem und Novabiochem bezogen und ohne weitere Aufreinigung verwendet. Das Tritylchlorid-Polystyrol-Harz (TCP-Harz) stammte von der Firma PepChem.
(RP9)-HPLC-Analytik und semipräparative Trennungen wurden an Geräten der Firmen Waters und Beckman mit UV-Detektor (Uvicord) von Knauer und Amersham Pharmacia Biotech durchgeführt. Die UV-Detektion erfolgte bei der Wellenlänge 220 nm. Folgende Säulenmaterialien wurden für die Analytik (Durchmesser 4 mm) und semipräparative Trennung
(Durchmesser 21 mm bzw. 40 mm) benutzt: Nucleosil RP18 5μ, Nucleosil RP18 HD 5μ und Nucleosil RP 18 7μ von Macherey & Nagel). Als Eluent dienten Laufmittelgemische aus Acetonitril und Wasser mit jeweils 0.1 Vol- % TFA im Gradientenbetrieb.
Die ESI-Massenspektren wurden mit einem Gerät der Fa. Finnigan vom Typ LCQ durchgeführt.
NMR-Spektren wurden an einem Bruker DMX 500 aufgenommen. Interner Standard für chemische Verschiebungen von H und 13C war das
Lösungsmittel von DMSO-d5: 2.49 ppm (1H-NMR) und 39.5 ppm (13C- NMR).
Die Festphasensynthesen wurden in 10 ml-Kunststoffspritzen mit PP- Fritten der Firma Vetter-Laborbedarf (Tübingen) durchgeführt. Die
Kunststoffspritzen wurden zur Durchmischung der Harzsuspensionen mit ca. 15 rpm über Kopf rotiert.
Die Umsetzungen des aktivierten azaGly und die Guanylierungen an der
Festphase wurden unter Ausschluß von Luftfeuchtigkeit durchgeführt.
Das nachfolgende Beispiel beschreibt die erfindungsgemäßen
Verbindungen anhand der mehrstufigen Synthese eines aza-RGD-
Mimetikums mit Acrylatanker.
Beispiel 1 :
Synthese von Gua- ab-azaGly-Asp-Hda-εAhx-εAhx-Aca (4)
Figure imgf000018_0001
Gua(Boc)2-Mab-azaGly-Asp(Bu)-OH (1):
Figure imgf000018_0002
Asp(Bu)-TCP-Harz (1.00 g, 0.6 mmol/g, 0.6 mmol) ergab nach einer mehrstufigen bekannten Synthese (s. Gibson, C; Goodman, S.L.; Hahn, D. ; Hölzemann, G.; Kessler, H. Novel Solid-Phase Synthesis of Azapeptides and Azapeptoides via Fmoc-Strategy and its Application in the Synthesis of RGD-Mimetics. J. Org. Chem. 1999, 64, 7388-7394 und Gibson, C; Kessler, H. 2-Fluoropyrimidine as an efficient reagent in solidphase synthesis of N-aryl- and N-alkyl-N-pyrimidin-2-ylamines. Tetrahydron Lett. 2000, 41 , 1725-1728) die Verbindung 1 (75.5 mg, 21 % Rohausbeute) als farbloses Öl.
HPLC (10-90% in 30 min) Rt = 21.9 min; ESI-MS: m/z 1239.1 (30) [2M + Na+], 1217.0 (30) [2M + H+], 631.1 (30) [M + Na+], 609.0 (100) [M + H+].
Gua(Boc)2-Mab-azaGly-Asρ(Bu)-Hda-H (2):
Figure imgf000018_0003
Gua(Boc)2-Mab-azaGly-Asp(Bu)-OH (1) (75.2 mg, 0.123 mmol), HOAt (16.8 mg, 0.124 mmol, LO Äquiv.) und HATU (56.5 mg, 0.148 mmol, 1.2 Äquiv.) wurden in wasserfreiem DMF (1.5 mL) gelöst und anschließend mit Collidin (163 μL, 149 mg, 1.23 mmol, 10 Äquiv.) versetzt. Nach 2 h wurde diese Lösung unter heftigem Rühren bei 10 °C innerhalb 5 min zu einer Lösung von 1 ,6-Diaminohexan (0.287 g, 2.47 mmol, 20 Äquiv.) in DMF (2 mL) getropft. Man beließ die Reaktion 10 min bei dieser Temperatur und rührte dann weitere 70 min bei Raumtemperatur. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch im Ölpumpenvakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in CH2CI2 (15 mL) aufgenommen und mit H20 (2 * 15 mL) extrahiert. Einengen im Vakuum ergab die Verbindung 2 (82.2 mg, 95% Rohausbeute) als braunen Feststoff.
HPLC (10-90% in 30 min) Rt = 20.1 min; ESI-MS: m/z 1435.2 (30) [2M + Na+], 1413.2 (30) [2M + H+], 729.2 (60) [M + Na+], 707.2 (100) [M + H+].
2:1-Gemisch von Gua(Boc)-Mab-azaGly-Asp(Bu)-Hda-εAhx-εAhx-Aca (3a) und Gua(Boc)2-Mab-azaGly-Asp(Bu)-Hda-εAhx-εAhx-Aca (3b):
Figure imgf000019_0001
3a R = H 3b R = Boc
6-{[6-(allanoylamino)hexanoyl]amino}hexansäure (Aca-εAhx-εAhx-OH) (69 mg, 0.23 mmol, 2.0 Äquiv.) und HATU (97 mg, 0.26 mmol, 2.2 Äquiv) wurden in wasserfreiem DMF (2.5 mL) gelöst und anschließend mit Collidin (340 μL, 310 mg, 2.6 mmol, 22 Äquiv.) versetzt. Nach 1 h wurde unter Rühren innerhalb 5 min eine Lösung von Gua(Boc)2-Mab-azaGly- Asp(Bu)-Hda-H (2) (82.0 mg, 0.116 mmol) in DMF (1 mL) zugetropft. Nach 2 h wurde das Reaktionsgemisch im Ölpumpenvakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus CH2CI2 (1 mL) und TFE (250 μL) aufgenommen und langsam zu CH3CN (35 mL) getropft. Es bildete sich ein farbloser Niederschlag, der durch Zentrifugieren und Abdekandieren abgetrennt wurde. Entfernen des Lösungmittels im Vakuum und Reinigung per HPLC (30-80% in 30 min) ergab ein Gemisch von 3a und 3b im HPLC-Integralverhältnis von 2:1 (33.9 mg, 32%) als farblosen Feststoff.
3a:
HPLC (10-90% in 20 min) Rt = 11.8 min; ESI-MS: m/z 909.3 (70) [M + Na+], 887.3 (40) [M + H+].
3b: HPLC (10-90% in 20 min) Rt = 16.8 min; ESI-MS: m/z 1009.3 (90)
[M + Na+].
Gua-Mab-azaGly-Asp-Hda-εAhx-εAhx-Aca (4):
Ein 2:1-Gemisch von 3a und 3b (33 mg, 36 μmol) wurde in CH CI2 (0.5 mL) suspendiert und anschließend mit einem 95:5 TFA/H2θ-Gemisch versetzt. Nach 1 h wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum eingeengt.
Lyophilisieren aus H20 ergab die Verbindung 4 (29.0 mg, 95%, verunreinigt mit 10% der entguanylierten Verbindung) als farblosen
Feststoff.
1H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 10.31 (s, 1 H, Ar-CO-NH-NH), 10.02 (s, 1 H, NH-Ar), 8.24 (s, 1 H, Ar-CO-NH-NH), 8.04 (mc, 1 H, CO-NH) 7.77
(d, J - 7.8 Hz, 1 H, arom), 8.24-7.50 (m, 8H, 2 x Ar-H, H2N-CNH2-NH, 2 x CO-NH), 7.41 (d, J = 7.9 Hz, 1 H, arom), 7.17-7.09 (m, 1 H, CO-NH), 6.80 (br. s, 1 H, NH-NH-CO-NH), 6.19 (dd, J = 17.2, 10.1 Hz, 1 H, CO- CH=CH2), 6.04 (dd, J = 17.1 , 2.1 Hz, 1 H, CO-CH=CHcisHtrans), 5.54 (dd, J = 10.1 , 2.1 Hz, 1 H, CO-CH=CHcisHtrans), 4.42 (dt, J = J' = 7.9 Hz, 1 H, NH-CH-CO), 3.13-2.94 (m, 8H, 4 x CO-NH-CH2) AB-Signal (δA = 2.63, δß = 2.55, JAB = 16.1 , zusätzlich aufgespalten durch JA,H(CX) = 5.4 Hz und JB,H(α) = 7.2 Hz, 2H, CH-CH2-C02H), 2.01 (t, J = 7.3 Hz, 4H, 2 x CO- CH2), 1.51-1.15 (m, 20H, aliphat); 13C-NMR (125.0 MHz, DMSO): δ =
172.0, 171.83, 171.76, 170.6. 164.4, 157.6, 155.8, 135.6, 133.9, 131.9, 129.8, 127.6, 125.3, 124.7, 123.4, 50.1 , 38.7, 38.4, 38.3, 38.2, 35.3, 29.0, 28.9, 28.8, 26.1 , 25.9, 25.0; HPLC (10-80% in 30 min) Rt = 10.6 min; ESI-MS: m/z 753.3 (10) [M + Na+], 731.3 (100) [M + H+].
Beispiel für Zelladhäsionstest
Es wurde die Adhäsion von Maus-MC3T3 H1-Osteoblastenkulturen in vitro an Peptid-beschichteten Materialoberflächen untersucht. Dabei wurden 50.000 Zellen/cm2 angesät und nach einstündiger Inkubation in serumfreiem Medium bei 37°C / 95 % Luftfeuchte der Anteil adherierter Zellen bestimmt.
Zellanhaftungsrate [%] = adherierte Zellen / angesäte Zellen x 100
Peptid: Zellanhaftungsrate [%]
Gua-Mab-azaGly-Asp-Hda-εAhx-εAhx-Aca: 75 Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys: 105 Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys: 101 Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys: 96 Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg: 17 Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys: 13 Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala: 7
Die Beschichtung von mit Rinderserumalbumin (BSA) vorbeschichteten Kulturoberflächen aus Polystyrol mit Thiolpeptiden ist aus dem Stand der Technik bekannt (siehe DE 198 18098 (Merck Patent GmbH), Bsp. 2). Auch die Beschichtung von PMMA-Oberflächen mit Acrylatpeptiden ist in der DE 198 18098, Bsp. 3 beschrieben.

Claims

Patentansprüche
1. Verbindung der Formel 1
B-Q-X i
worin
B ein bioaktives, zelladhasionsvermittelndes Molekül, ausgewählt aus der Gruppe
Figure imgf000022_0001
und
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys
Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (iii)
Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (iv)
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg (v)
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn (vi)
Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg (vü),
wobei für (i)
X H2N-C(=NH)-NH, Het-NH-, H2N-C(=NH)-, A-C(=NH)-NH- oder Het-
Figure imgf000022_0002
-(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t- oder -(CH2)P-Het1-(CH2)q-, N-R2 oder CH-R2
R2 H oder Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen
RJ H, Ar, Het oder A
R4 H, A, Ar, OH,OA, OAr, Arylalkyl, Hai ,CN, N02, CF3 oder OCF3,
A COOH, NH2 oder Alkyl mit 1-6 C-Atomen, unsubstituiert oder substituiert mit COOH oder NH2
Ar unsubstituiertes oder ein-, zwei-oder dreifach durch A, OH,
NH2, OA, CF3, OCF3, CN, N02 oder Hai substituiertes Phenyl, welches durch ein ein-, zwei oder dreifach durch A, OH, OA, OCF3, CN, N02 oder Hai substituiertes Phenyl in der Art substituiert sein kann, dass ein unsubstituiertes oder substituiertes Biphenyl entsteht,
Hai F, Cl, Br oder I,
Het einen gesättigten, teilweise oder vollständig ungesättigten mono- oder bicyclischen heterocyclischen Rest mit 5 bis 10 Ringgliedern, wobei 1 bis 3 N-und/oder ein S- oder O-Atome vorliegen können und der heterocyclische Rest ein- oder zweifach durch CN, Hai, OH, NH2, COOH, OA, CF3, A, N02 , Ar oder OCF3 substituiert sein kann,
Het1 einen 5- oder 6-gliedrigen aromatischen Heterocyclus mit 1 bis 4 N- und/oder S-Atomen, der unsubstituiert oder ein- oder zweifach durch F, Cl, Br, A, OA oder OCF3 substituiert sein kann, n 4, 5 oder 6,
m, o, p, q 0, 1 oder 2 s, t 0, 1 , 2, 3, 4, 5 bedeuten;
Q fehlt oder ein organisches Spacer-Molekul und
X 1 ein Ankermolekül, ausgewählt aus der Gruppe
-CO-CH=CH2 (viii)
-CO-(CH2)1-20-CO-CH=CH2 (ix)
-CO-(CH2)ι-2o-SH (x) -CO-CH(NH2)-CH2-SH (Xi)
-NH-(CH2)ι-2o-CO-CH=CH2 (Xii)
-NH-(CH2)2-2o-SH (xiii)
-NH-CH(C02H)-CH2-SH (xiv)
bedeutet, wobei im Falle der Verbindungen (viii) bis (xi) eine freie Aminogruppe der Gruppe B mit einer freien Carboxylgruppe des Spacer-Moleküls Q oder des Ankermoleküls Xi bzw. eine freie Aminogruppe des Restes Q mit einer freien Carboxylgruppe des Restes Xi peptidartig miteinander verknüpft ist, und im Falle der Verbindungen (xii) bis (xiv) eine freie Carboxylgruppe der Gruppe B mit einer freien Aminogruppe des Spacer- Moleküls Q oder des Ankermoleküls X. bzw. eine freie Carboxylgruppe des Restes Q mit einer freien Aminogruppe des Restes X ^ peptidartig miteinander verknüpft ist, sowie deren Salze.
2. Verbindung nach Anspruch 1 , worin Q ausgewählt ist aus der Gruppe
[CO-(CH2)x-NH-]m, (xvii)
[CO-CH2-(0-CH2CH2)y -NH-]m, (xviii)
[CO-(CH2)z-CO-] (xix)
[NH-(CH2)Z-NH-] (xx)
[CO-CH2-(OCH2CH2)y-0-CH2-CO-] (xxi)
[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-] (xxii) sowie deren Kombination worin m jeweils unabhängig voneinander 1 bis 20 x 1 bis 12 y 1 bis 50 z 1 bis 12 ist.
3. Verbindung nach Anspruch 1 , worin Q ausgewählt ist aus der Gruppe
[CO-(CH2)x-NH-]m, (xvii)
[CO-CH2-(0-CH2CH2)y -NH-]m, (xviii)
[CO-(CH2)z-CO-j (xix)
[NH-(CH2)z-NH-] (xx) [CO-CH2-(OCH2CH2)y-0-CH2-CO-] (xxi) [NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-] (xxii)
sowie deren Kombination worin m jeweils unabhängig voneinander 1 bis 8
X 1 bis 5 y 1 bis 6 und z 1 bis 6 ist.
4. Verbindungen der Formel 1 gemäß Anspruch 1
Figure imgf000025_0001
b) Thr-Trp-Tyr-Lys-lle-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys c) Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys d) Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys e) Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg f) Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys g) Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala
5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Arzneimittel zur
Behandlung von durch Implantate verursachten Erkrankungen, Defekten, Entzündungen und von osteolytischen Erkrankungen wie Osteoporose, Thrombose, Herzinfarkt und Arteriosklerose, sowie zur Beschleunigung und Verstärkung des Integrationsprozesses des Implantats bzw. der biokompatiblen Oberfläche in das Gewebe.
6. Implantat, geeignet für humane und tierische Organe, bestehend im wesentlichen aus einer Trägermatrix und einer diese Matrix umhüllenden Schicht eines bioaktiven, zelladhäsionsvermittelnden Moleküls, dadurch gekennzeichnet, dass die umhüllende Schicht aus einer Verbindung gemäß der Ansprüche 1 bis 4 gebildet wird, wobei zwischen Trägermatrix und dieser Verbindung eine kovalente oder adsorptive Bindung vorliegt.
7. Implantat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermatrix und/oder deren Oberfläche ein Metall oder ein Metalloxid ist.
8. Implantat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger- Matrix und/oder deren Oberfläche ein Polymer ist.
9. Implantat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer Polymethylmethacrylat, Polyhydroxyethylmethacrylat oder deren Copolymere ist.
10. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1 nach Anspruch 1 sowie ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man ein bioaktives Molekül B, welches mit Schutzgruppen versehen sein kann, und ein mit Schutzgruppen versehenes Spacer-Anker-Molekül (Q-X-i) bzw. Anker- Molekül (X*ι) peptidisch miteinander verknüpft und anschließend die Schutzgruppen abspaltet, und/oder dass man eine basische oder saure Verbindung der Formel I durch Behandeln mit einer Säure oder Base in eines ihrer Salze überführt.
11. Verwendung einer Verbindung nach einem der Anprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von durch Implantate verursachten Erkrankungen, Defekten, Entzündungen und von osteolytischen Erkrankungen wie Osteoporose, Thromböse, Herzinfarkt und Arteriosklerose, sowie zur Beschleunigung und Verstärkung des Integrationsprozesses des Implantats bzw. der biokompatiblen Oberfläche in das Gewebe.
12. Verwendung einer Verbindung nach einem der Anprüche 1 bis 4 zur Beschichtung mittels kovalenter oder adsorptiver Bindung von Implantaten für humane und tierische Organe.
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