WO2002012451A1 - Procede de culture de chondrocytes humains - Google Patents

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    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for culturing normal human chondrocytes, and to normal human chondrocytes obtained by such a method.
  • the present invention also relates to a cartilage treatment material using the obtained normal human chondrocytes.
  • chondrocytes exist in a state in which cells are embedded in a matrix, and cartilage tissue can be isolated from a matrix component by treating cartilage tissue with an enzyme, for example, collagenase.
  • an enzyme for example, collagenase.
  • transplantation of isolated chondrocytes, especially autologous transplantation of chondrocytes has been considered.
  • attempts have been made to transplant chondrocytes isolated in animal experiments into articular cartilage defects (Bently, et. Al., Nature 230, 385-388 (1971); Langer, Clin. Orthop. 124; 237-250 (1977); Aston et. Al., J. Bone Joint Surg. 68-B, 29-35 (1986); Wakitani, et.al., J. Bone Joint Surg. 71-B; 74-80 (1989)).
  • an object of the present invention is to provide a method for culturing human chondrocytes rapidly and in large amounts to obtain normal chondrocytes or cell aggregates thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a cartilage treatment material using the obtained normal human chondrocytes or a cell mass thereof.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that perichondrial cells in the chondrogenic phase support the proliferation ability of human chondrocytes. In addition, they have found that by co-culturing such cells as human feeder cells with human chondrocytes, human chondrocytes can be obtained quickly and in large quantities, especially in primary culture. Furthermore, they found that the chondrocyte mass obtained by layering and culturing the human chondrocytes cultured in such a manner retains normal properties.
  • the present invention provides a method for rapidly and massively culturing human chondrocytes by co-culturing human chondrocytes, a feeder cell supporting the chondrocyte proliferation ability, and perichondrocytes in the chondrogenic phase. I do. Furthermore, a gel-like chondrocyte mass can be obtained by inoculating and culturing the human chondrocytes obtained by the method of the present invention once or twice or more in a stratified manner. The number of times of seeding in layers depends on the desired size of the cultured cartilage tissue, but generally 3 to 4 times is preferable.
  • the feeder cell is preferably a chondrogenic cell in the chondrogenic stage of a mammalian fetus, and more preferably a cell surrounding the first gill arch cartilage / Meckel cartilage. .
  • chondrogenic cells in the chondrogenic phase of embryonic 13S-age mice are especially preferred.
  • the mammalian fetus may be any mammalian fetus, such as a rodent
  • mammals such as dogs, monkeys, penguins, goats and sheep, but mammals whose developmental biology has been studied in fetal life in detail, such as mice Is particularly preferred.
  • the present invention also provides a normal human chondrocyte or cell mass obtained by the method of the present invention.
  • Human chondrocytes obtained by the method of the present invention are wrapped in a cartilage matrix containing chondrocalcin, type II collagen and the like. Furthermore, the cultured chondrocytes bind via the cartilage matrix to form a gel-like cell mass.
  • normal human chondrocytes refer to chondrocytes that retain the properties of the original chondrocytes.
  • the present invention also provides a cartilage treatment material comprising a material in which the human chondrocytes or cell mass is embedded.
  • the material for embedding the human chondrocytes or cell mass may be either an artificial material or a natural material, but the chondrocytes may be blocked from the surroundings to prevent the transplanted chondrocytes from being dispersed and absorbed. Things. It is preferably a scaffold for chondrocytes to be transplanted. Examples of such materials include collagen, polyglycolic acid (PGA), polylactic acid ( s ) alginate (eg, calcium salt), polyethylene oxide, fibrin glue, polylactic acid and polyglycol. Examples include acid copolymer, proteoglycan, glycosaminoglycan, and human dermis. Proteoglycans and glycosaminodalican may be sulfated.
  • the present invention includes a method for treating cartilage-related diseases, characterized by using such a cartilage treatment material.
  • the present invention also relates to the use of the chondrogenic perichondrocytes, which support the chondrocyte proliferation ability, as feeder cells in the treatment method.
  • the culture method of the present invention can be used for culturing chondrocytes of any human cartilage tissue, for example, auricular cartilage, costal cartilage, articular cartilage, intervertebral cartilage and tracheal cartilage. Suitable for culturing chondrocytes of cartilage and articular cartilage.
  • Articular cartilage includes a mandibular joint, an upper arm joint, an elbow joint, a shoulder joint, a hand joint, a hip joint, a hip joint, and an ankle joint, and any articular cartilage may be used.
  • the chondrocytes used for the culture method of the present invention can be isolated from human cartilage tissue by a known method.
  • the excised cartilage tissue is minced with a scissor or the like, treated with trypsin collagenase (eg, type II collagenase), and filtered to obtain an isolated chondrocyte.
  • trypsin collagenase eg, type II collagenase
  • chondrocytes are obtained.
  • the removed cartilage tissue is disinfected with an antibiotic (eg, esiline, kanamycin) or an antifungal agent (eg, amphotericin B), and the cartilage tissue is minced with a scalpel or the like.
  • an antibiotic eg, esiline, kanamycin
  • an antifungal agent eg, amphotericin B
  • chondrocytes 0.5 to 1.0 ⁇ 10 6 cells of chondrocytes can be obtained from 1 cm 3 of human cartilage tissue.
  • known growth factors particularly those that stimulate cartilage growth, such as FGF (eg, bFGF), IGF (eg, IGF-I) and / or bone morphogenetic factor 9 (BMP9 )can be combined.
  • FGF eg, bFGF
  • IGF eg, IGF-I
  • BMP9 bone morphogenetic factor 9
  • a feeder cell is a cell that contributes to the culture of a specific tissue or cell by supporting the proliferative and differentiation potential of that cell.
  • 3T3 cells derived from fibroblasts are known as feeder cells that support the proliferation ability of keratinocytes in the epidermis (Green et al., Cell 6: 331-344 (1975)).
  • Feeder cells suitable for culturing chondrocytes, especially human chondrocytes, are not known.
  • the feeder cells used in the culture method of the present invention support the proliferative ability of human chondrocytes by co-culturing with human chondrocytes, and the proliferating chondrocytes have the same origin as the chondrocytes.
  • Bone tissue a cell having the property of retaining the properties of cartilage tissue used in primary culture.
  • Such feeder cells can be obtained by screening using the above-mentioned characteristics, that is, the support of the proliferative ability of human chondrocytes, and the properties of the proliferated chondrocytes as an index. Specifically, test cells are co-cultured with human chondrocytes, and whether or not the chondrocytes proliferate, and whether the extracellular matrix of the proliferated cells is the cartilage matrix is examined.
  • the cells to be screened may be any of cells isolated from living organisms (including fetuses and embryos) or their tissues, or cloned cells.
  • the feeder cell according to the present invention includes, for example, perichondrocytes in the chondrogenic phase of animals, particularly mammals.
  • the chondrogenesis period is preferably a period in which the first gill arch cartilage ⁇ ⁇ Meckel cartilage is differentiated and formed.
  • the first branchial arch cartilage / Meckel cartilage peripheral cells of vertebrates other than mammals for example, birds (eg, chickens) embryos.
  • Feeder cells are isolated from a fetus or embryo, and then used after being cultivated in a medium S, usually about 10 to 14 3, in a suitable medium that can be used as seeded.
  • the feeder cells can be subcultured (up to about 5 passages, preferably 1 to 3 passages) or can be frozen and stored, preferably without breaking down the organelles.
  • Viable conditions' Store at temperature for example, a method of storing at 130 ° C. or lower in a DME medium containing a cryoprotectant (antifreeze) such as 10% FBS and 10% glycerin can be mentioned.
  • the medium is preferably changed about three times a week.
  • the cryopreserved cells are thawed at appropriate times and used as one feeder cell.
  • the feeder cells can be used by co-culturing only one passage when the growth of chondrocytes is weak when used in co-culture with chondrocytes during primary culture. Particularly, it is most effective and preferable to use it during primary culture.
  • the feeder cells may be treated with radiation (eg, gamma rays or cobalt irradiation) or drugs beforehand to lose the proliferative ability of the feeder cells themselves.
  • radiation eg, gamma rays or cobalt irradiation
  • drugs include an anticancer drug such as mitomycin Cpactinomycin D and an antibiotic such as ampicillin.
  • a known medium suitable for culturing chondrocytes can be used.
  • growth factors such as human bFGF and human IGF-I are appropriately added to the medium (Cuevas et al., Biochem, Biophys, Res, Commun. 156, 611-618 (1988); Froger-Gaillard et al., Endocrinology, 124, 2365-2372).
  • Examples of such media include FBS (preferably about 10%), human bFGF (preferably about 1 OngZml), HC (preferably about 40%) in a 1: 1 mixture of F-12 and DME (H) medium. ng / ral) and human IGF-I (preferably about 5 ng / ml).
  • a feeder cell that has been pre-irradiated in advance into a flask (preferably a concentration of 1.0 ⁇ 10 6 cells for a bottom area of 75 cm 2 ), and then inoculate chondrocytes (preferably 0.5 to 1.OX 10 6 cells). And culture under conditions suitable for the culture of each chondrocyte (eg, at 37 ° C, 10 ° / 0 CO 2 ). Culture is continued until the grown cells are monolayer and confluent (usually between 10 and 14).
  • the subculture can be performed in the same medium as the primary culture (usually, 7 days per passage).
  • the number of cells in the auricular cartilage increases from P0 (primary culture) to P6 from 30 to 746 times.
  • the cell number increases from 65 to 161 times from P0 to P4. If a greater number of chondrocytes is desired, the number of passages can be increased as appropriate.
  • a gel-like chondrocyte mass can be obtained by seeding and culturing human chondrocytes obtained by subculturing once or twice or more, preferably 3 to 4 times, in a stratified manner.
  • human chondrocytes are wrapped in a chondrocyte matrix containing chondrocalcin and the like, and the chondrocytes bind to each other via a chondrocyte matrix such as chondrocalcin and type II collagen to form a gel.
  • a chondrocyte matrix such as chondrocalcin and type II collagen
  • the chondrocytes obtained by the culture method of the present invention retain the properties of the cartilage tissue of its origin, that is, the cartilage tissue used for primary culture.
  • the characteristics of the cartilage tissue of origin can be determined from the morphology of the cultured cells and the composition of the extracellular matrix (eg, chondrocalcin, type II collagen, and other substances such as hyaluronic acid, chondroitin, chondroitin sulfate, and keratosulfate). It is shown that it holds.
  • the human chondrocytes or cell mass obtained according to the present invention can be embedded in a suitable biomaterial and used for transplantation as a cartilage treatment material.
  • suitable biomaterial examples include collagen, polyglycolic acid (PGA), polylactic acid, alginate (for example, calcium salt), polyethylene glycol, as described above.
  • Proteoglycans and glycosaminoglycans may be sulfated.
  • These biomaterials can block chondrocytes from the surroundings in order to prevent the chondrocytes to be transplanted from being dispersed and absorbed, and preferably can be a scaffold for the chondrocytes to be transplanted.
  • any shape such as a membrane such as a sheet, a porous body such as a sponge, a mesh such as a knitted fabric, a woven fabric, a nonwoven fabric, and cotton can be used.
  • a porous material is preferable because it allows the chondrocytes to easily adhere to the biomaterial and penetrate into the interior, thereby promoting the regeneration of cartilage tissue.
  • the collagen When using collagen as a biomaterial, the collagen may be subjected to a crosslinking treatment. Cross-linking of collagen increases the physical strength, and allows the use of cartilage treatment materials in living organisms, etc. In addition to being able to support the chondrocytes or the cell mass while maintaining the necessary strength until the cartilage tissue is regenerated, the cartilage tissue can be supported without causing any loss when fixed using the method.
  • a collagen solution in which collagen is solubilized and a cultured chondrocyte or cell mass are mixed, and, if necessary, gelled tissue can be used as a cartilage treatment material.
  • the collagen solution any known collagen solution can be used.
  • a collagen solution solubilized by a force enzyme is particularly preferable because a telopeptide having immunogenicity is removed.
  • a mixture of collagen solution and chondrocytes can be embedded or adhered with a sponge made of the above-mentioned biomaterial or a nonwoven fabric or the like to form a cartilage treatment material.
  • the cartilage treatment material can induce not only cartilage tissue but also cartilage ossification by appropriately selecting and combining a support as a material for embedding chondrocytes.
  • Materials that can induce such cartilage ossification include, for example, human dermis, and ossification using a growth factor that promotes bone formation, such as bone formation factor (BMP). it can.
  • Chondrocytes were isolated from the posterior auricle (about 1 ⁇ 1 cm) as auricular cartilage and from the precordium (about l ⁇ lcra) as costal cartilage, respectively.
  • Feeder cells Cells around the 1st gill arch cartilage and Meckel cartilage of 13-day-old mouse embryos were collected and cultured, and the resulting cells were used as feeder cells. This feeder cell was named CS 21 cell. (a) Chondrocyte isolation
  • Cartilage pieces were sterilized with penicillin G (100 u / ml) and kanamycin (0.1 mg / ml) and treated with 0.02 ° / 0 EDTA for 15 minutes.
  • the cartilage fragments were minced with a scalpel and a scissor, and allowed to stand at 4 ° C in a medium containing 0.25% trypsin at 4 ° C for 1 minute, then at 37 ° C in 0.3% type II collagenase ZDME medium. For 1-6 hours.
  • the cells were transferred into a 10% FCSZDME medium, stirred gently with a stirrer for 2 hours at room temperature, and filtered through a 100 ⁇ filter to obtain isolated chondrocytes.
  • Embryonic age 13 (chondrogenic phase) A large number of cells around the first branchial cartilage (Meckel's cartilage) were collected using microsurgery technology from the ba1b mouse, and the cell mass obtained was collected. The cells were transferred to a calcium-free medium containing 0.1% trypsin, left in a refrigerator at 4 ° C for 4 hours, gently shaken with a stirrer for 10 minutes, and then filtered through a filter to isolate single cells.
  • Feeder cells were cultured using DME medium supplemented with 5 to 10% FBS (mouse fetal serum). The primary culture became confluent in 3 to 4 days, and the subculture became confluent in 3 to 4 days even in one passage. From the second passage, the cells were passaged once a week, and the first to third passages were cryopreserved. The cells thus obtained (CS21 cells) were used as feeder cells.
  • FBS human fetal serum
  • CS21 cells treated with 60 gray radiation were seeded in a flask with a bottom area of 75 cm 2 at a density of 1.0 ⁇ 10 6 cells / cm 2 .
  • the isolated human cartilage cells were seeded at a density of 0.5 to 1 ⁇ 10 6 cells / cm 2 and cultured at 37 ° C. under 10% CO 2 .
  • 3T3 cells and human chondrocytes were similarly cultured.
  • the medium was changed twice a week.
  • chondrocytes co-cultured with CS21 cells became confluent in a monolayer after culturing for 10 to 14 days, but hardly grew in the case of 3T3 cells (FIG. 1).
  • the obtained cells were used for the next subculture.
  • Subculture was performed under the same conditions as the primary culture, except that no feeder cells were used and one passage was for 7 days.
  • the human chondrocytes obtained in primary culture were seeded at a density of 1.0 X 10 6 cells // bottom area 1 75 cm 2 flasks and passaged every seven days, the cells were cryopreserved after each passage, growth The number of chondrocytes was counted.
  • the concentration of chondrocalcin, a cartilage matrix, in the medium was measured by Enzymimnoassay (EIA) using an anti-chondrocalcin antibody. More than 10 Ong / ml chondrocalcin was measured in the subculture. In contrast, when each chondrocyte was cultured without co-culture with a feeder cell during primary culture, almost no cell proliferation was observed as in the case of co-culture with 3T3 cells. . The results of the cell culture are shown in Table 1 below.
  • the chondrocytes obtained in the subculture were seeded three times at a density of 1 ⁇ 10 6 cells / cm 2 , overlaid, and overlaid. After two weeks of culture, a sheet-like gel mass was formed ( Figure 2).
  • HE hematoxylin-eosin staining of this gel-like chondrocyte mass indicated that the cells were stratified and the cells were bound via a matrix (Fig. 3).
  • immunostaining of type II collagen, a molecular marker of cartilage tissue stained the extracellular matrix, indicating that the extracellular matrix is a cartilage-specific matrix (Fig. Four).
  • formation of cartilage tissue was observed in 100% (10 ⁇ 10) of the specimens.
  • Fig. 5 shows the chondrocyte mass before transplantation
  • Fig. 6 shows the mouse three months after transplantation
  • Fig. 7 shows the extirpated specimen of the transplanted tissue.
  • Forward primer 5'-ATTTTGCAGTCTGCCCAGTTCAGG—3 '(SEQ ID NO: 3) and backward primer: 5'-AGGTCTTACAGGMGACMTAAAT-3' (SEQ ID NO: 4)
  • RNA extraction and ⁇ RT-PCR from the sample were performed according to the Genetic Engineering Manual, Medical School (published in 1995).
  • human chondrocytes can be cultured quickly and in large amounts by co-culturing human chondrocytes and chondrogenic peripheral cells as a feeder cell supporting the chondrocyte proliferation ability. It is. Furthermore, the human chondrocytes obtained by the above method can be inoculated once or twice or more in layers and cultured to obtain a human chondrocyte mass. Also, a cartilage treatment material comprising a material in which human chondrocytes (or cell mass) are embedded can be obtained. By appropriately selecting a material for embedding chondrocytes, the cartilage treatment material can induce not only cartilage tissue but also cartilage ossification, and is effective for treatment of diseases related to cartilage and bone. . BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of primary culture of human chondrocytes and (A) a feeder cell of the present invention (CS 21 cells) or (B) 3T3 cells.
  • Figure 2 is a photograph showing the medium alone (left) or the result of the overlay culture (right).
  • FIG. 3 is a micrograph of HE (hematoxylin-eosin) staining of a gel-like cell mass obtained by the overlay culture.
  • FIG. 4 is a photomicrograph of immunostaining using anti-type II collagen in the tissue of a gel-like cell mass obtained by the overlay culture.
  • FIG. 5 is a photograph of a human chondrocyte mass mounted on PGA as a support (A), and a chondrocyte mass for transplantation (B) sandwiched between PGAs.
  • Figure 6 shows a transplanted mouse 3 months after transplantation of the chondrocyte mass.
  • FIG. 7 is a photograph showing a specimen extracted from a mouse three months after transplantation of the chondrocyte mass.
  • FIG. 8 is a micrograph of toluidine blue staining of an extracted specimen using (A) PGA and (B) calcium alginate as a support.
  • Figure 9 shows a group of chondrocyte clusters embedded in PGA (Group 1) and a roll of human dermis. This is an extirpated specimen from the group that had been transplanted (Group 2).
  • FIG. 10 is a photomicrograph showing the tissue of the second group wound around the human dermis.
  • Fig. 11 is a photomicrograph of HE staining (A) and Alcian blue + PAS (B, C) staining of auricular cartilage tissue after transplantation of a tissue embedded with a collagen sponge as a support.
  • FIG. 12 is a photomicrograph of immunostaining using anti-type II collagen in auricular cartilage tissue after transplantation.
  • FIG. 13 is a photograph showing the results of RT-PCR for type II collagen of the transplanted cartilage tissue.

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Description

明 細 書 ヒト軟骨細胞培養方法 技術分野
本発明は、新規な正常ヒト軟骨細胞の培養方法おょぴかかる方法により得られた 正常ヒト軟骨細胞に関する。本発明はまた得られた正常ヒト軟骨細胞を用いた軟骨 治療材に関する。 背景技術
軟骨細胞は生体では基質の中に細胞が包埋された状態で存在しており、酵素、例 えばコラゲナーゼ、で軟骨組織を処理して、基質成分から軟骨細胞を単離すること ができる。 また、 軟骨に関わる疾病の治療では、 単離した軟骨細胞の移植、 特に軟 骨細胞の自家移植による治療方法が考えられていた。 このため、動物実験において 単離した軟骨細胞を関節軟骨欠損部に移植する試みがなされてきた （Bently, et. al. , Nature 230, 385-388 (1971) ; Langer, Clin. Orthop. 124； 237-250 (1977)； Aston et. al. , J. Bone Joint Surg. 68 - B, 29 - 35 (1986)； Wakitani, et. al. , J. Bone Joint Surg. 71- B; 74-80 (1989) )。
し力 し、 ヒトでは、正常な軟骨細胞が大量に必要であるにもかかわらず、 自家移 植において僅かの量の軟骨し力採取できないため、移植に必要な十分な量の軟骨細 胞を得ることができない。 このため、 ヒトにおいて関節軟骨、 耳介軟骨および肋軟 骨について軟骨細胞の培養が試みられてきた。 しかしながら、培養に僅かな軟骨細 胞数しか用いることができない上に、ヒ トの軟骨細胞について効果的な培養方法が 知られていないために、初代培養を維持できない力 \初代培養に成功したとしても 、培養に 6〜 8週間と非常に長い時間がかかるという問題があった（Brittberg, et. al. , New Engl. J. Med. 331； 889-895 (1994)； Aulthouse, et. al. , In vitro Cell. & Develop. Biol. 25; 659-668 (1989) ; Ting, et. al. , 40, 413-421 (1998)； Rodriguez, et. al. , Plast. Reconstr. Surg. 103； 1111 - 1119 (1999) )。
一方、 ヒト以外の動物 （マウス、 ゥサギ、 ニヮトリ、 ゥシなど） では、 初代培養 の際に大量の軟骨細胞を得ることが可能であり、また、胎児および幼獣では軟骨が 極めて柔らかいので軟骨細胞の単離が容易であることから、軟骨細胞の培養に成功 している (Bently, et. al.， Nature 230, 385-388 (1971)； Langer, Clin. Orthop. 124; 237-250 (1977)； Aston et. al. , J. Bone Joint Surg. 68—B, 29 - 35 (1986) ; Wakitani, et. al. , J. Bone Joint Surg. 71 - B; 74 - 80 (1989) )。 発明の開示
従って、本究明は、 ヒ トの軟骨細胞を迅速かつ大量に培養して正常な軟骨細胞ま たはその細胞塊を得る方法を提供することを目的とする。 また、本発明は得られた 正常ヒト軟骨細胞またはその細胞塊を用いた軟骨治療材を提供することを目的と する。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、軟骨形成期の軟骨周辺細 胞がヒト軟骨細胞の増殖能を支持することを見出した。 また、かかる細胞をフィー ダー細胞としてヒト軟骨細胞と共培養することにより、特に初代培養において、迅 速かつ大量にヒト軟骨細胞が得られることを見出した。 さらに、そのように培養し たヒト軟骨細胞を重層的に播種して培養することによって得られた軟骨細胞塊が 正常な性質を保持していることを見出した。
従って、本発明は、 ヒト軟骨細胞と軟骨細胞増殖能を支持するフィーダ一細胞と 軟骨形成期の軟骨周辺細胞とを共培養することにより、迅速かつ大量にヒト軟骨細 胞を培養する方法を提供する。 さらに、本発明の方法により得られたヒト軟骨細胞 を重層的に 1回または 2回以上播種して培養することによって、ゲル状の軟骨細胞 塊を得ることができる。重層的に播種する回数は、所望する培養軟骨組織の大きさ によつて異なるが、 一般的には 3〜 4回が好ましい。
本発明のヒト軟骨細胞の培養方法において、 フィーダ一細胞は、哺乳類胎児の軟 骨形成期の軟骨周辺細胞であるのが好ましく、第 1鰓弓軟骨 ·メッケル軟骨周辺細 胞であるのがさらに好ましい。特に好ましくは、胎生 1 3 S齢マウスの軟骨形成期 の軟骨周辺細胞である。
本発明において、哺乳類の胎児は、何れの哺乳類の胎児でも良く、例えばげつ歯 類 （マウス、 ラット、 ゥサギなど） の他に、 ィヌ、 サル、 ゥシ、 ャギおよびヒッジ があるが、発生生物学的に胎生期の研究が詳細に行われている哺乳類、例えばマウ スが特に好ましい。
本発明はまた、本発明の方法により得られる正常ヒト軟骨細胞またはその細胞塊 を提供する。 本発明の方法により得られるヒト軟骨細胞は、 コンドロカルシン、 II 型コラーゲン等を含む軟骨基質で包まれている。 さらに、培養された軟骨細胞は軟 骨基質を介して結合して、 ゲル状の細胞塊を形成している。 なお、本発明において、 正常ヒト軟骨細胞とは、 起源の軟骨細胞の性質を保持した軟骨細胞を意味する。 本発明はまた、前記ヒト軟骨細胞または細胞塊を包埋した材料からなる軟骨治療 材を提供する。 ヒ ト軟骨細胞または細胞塊を包埋する材料としては、人工素材また は天然素材の何れでも良いが、移植する軟骨細胞が分散 ·吸収されるのを防ぐため に軟骨細胞を周囲からプロックしうるものである。好ましくは移植する軟骨細胞の 足場となりうるものである。 そのようなものの例には、 コラーゲン、ポリダリコー ル酸 （P GA； polyglycolic acid)、 ポリ乳酸 (polylactic acid) s アルギン酸塩 (例えばカルシウム塩)、 ポリエチレンォキシド、 フイブリン接着剤、 ポリ乳酸一 ポリグリコ一ル酸共重合体、プロテオグリカン (proteoglycan)、グリコサミノダリ カン （glycosaminoglycan) およぴヒトの真皮が挙げられる。 なお、 プロテオグリ カンおよぴグリコサミノダリカンは硫酸化されていてもよい。
なお、本発明は、かかる軟骨治療材を用いることを特徴とする軟骨関連疾病治療 方法を含むものである。
本発明はまた、前記治療方法における、軟骨細胞増殖能を支持する軟骨形成期の 軟骨周辺細胞のフィーダ一細胞としての使用に関する。
ヒト軟骨細胞
本発明の培養方法は、 ヒトの任意の軟骨組織、 例えば耳介軟骨、肋軟骨、 関節軟 骨、椎間軟骨および気管軟骨の軟骨細胞の培養に用いることができるが、特に耳介 軟骨、 肋軟骨、 関節軟骨の軟骨細胞の培養に適している。 関節軟骨には、 下顎関節、 上腕関節、肘関節、 肩関節、 手関節、股関節、腰関節および足関節が包含されるが、 何れの関節軟骨でもよい。 また、本発明の培養方法に供される軟骨細胞は、公知の方法によりヒト軟骨組織 力 ら単離することができる。一般的には摘出した軟骨組織を剪刀等を用いて細切し てトリプシンゃコラゲナーゼ （例えば II型コラゲナーゼ） で処理し、 フィルター で濾過して単離した軟骨細胞を得る力 例えば、以下の手順で軟骨細胞を得るのが 好ましい。
(1) 摘出した軟骨組織を抗生物質 （例えばぺェシリン、 カナマイシン） や抗真菌 剤 （例えばアムホテリシン B) で除菌し、 メス '剪刀等を用いて軟骨組織を細切す る、
(2)細切した軟骨組織を EDT Aで処理した後に、トリプシンを含む培地にて（好 ましくは約 4でで） およそ 1晚静置し、 次に II型コラゲナーゼを含む培地に移し
(必要があれば 1〜6時間静置してもよい）、 37°Cで 1〜6時間インキュベート する、
(3) ゥシ胎仔血清含有培地中に移し、該培地中で数時間穏やかに攪拌し、培地を フィルター （例えば、 100 mフィルター） で濾過して、 単離された軟骨細胞を 得る。
このような方法により、 1cm3のヒト軟骨組織から 0, 5~1.0 X 106細胞個の 軟骨細胞を得ることができる。 また、本発明の培養方法において、公知の増殖因子、 特に軟骨の增殖を刺激するもの、 例えば FGF (例えば bFGF)、 I GF (例え ば I GF— I) および/または骨形成因子 9 (BMP 9) と組合わせることができ る。
フィーダ一細胞
フィーダ一細胞は、特定の組織または細胞の増殖能と分化能を支持することによ りその細胞の培養に寄与する細胞である。例えば、繊維芽細胞由来の 3 T 3細胞が、 表皮の角化細胞（keratinocyte)の増殖能を支持するフィーダ一細胞として知られ ている （Greenら， Cell 6： p.331-344 (1975)) 力 軟骨細胞、 特にヒト軟骨細胞 の培養に適するフィーダー細胞は知られていない。
本発明の培養方法に使用されるフィーダ一細胞はヒト軟骨細胞と共培養するこ とによってヒト軟骨細胞の增殖能を支持し、且つ増殖した軟骨細胞にその起源の軟 骨組織、即ち初代培養に用いる軟骨組織の性質を保持させるという特性を有する細 胞である。
そのようなフィーダ一細胞は、前記特性、即ちヒト軟骨細胞の増殖能の支持、 さ らに増殖した軟骨細胞の性質を指標としてスクリーニングすることによって得る ことができる。 具体的には、被検細胞をヒト軟骨細胞と共培養し、軟骨細胞が増殖 するか否か、 さらに増殖した細胞の細胞外基質が軟骨基質であるかを検査する。ス クリーニングに供する細胞としては、 生体 （胎児、胚を含む） もしくはその組織か ら単離した細胞、またはクローン化されている細胞の何れでもよい。本発明におけ るフィーダ一細胞として、例えば動物、特に哺乳類の軟骨形成期の軟骨周辺細胞を 挙げることができる。
好ましくは、胎生期の発生生物学が詳細に研究されている哺乳類の軟骨形成期の 軟骨周辺細胞であり、 具体的にはげつ歯類 （マウス、 ラット、 ゥサギ）、 特にマウ スの軟骨形成期の軟骨周辺細胞が好ましい。 また、軟骨形成期としては、第 1鰓弓 軟骨■メッケル軟骨が分化 ·形成される時期が好ましく、例えばマウスにおいては 胎生 1 3日齢前後に該当する。 さらに本発明において、哺乳類以外の脊椎動物、例 えば鳥類 （ニヮトリなど） の胚の第 1鰓弓軟骨■メッケル軟骨周辺細胞をフィーダ 一細胞として使用することも可能である。
フィーダ一細胞は、胎児または胚から単離した後、そのまま播種して使用するこ とができる力 S、通常は適当な培地中にて 1 0〜1 4 3程度培養してから使用する。 また、該フィーダー細胞を継代培養 ( 5継代程度まで、 好ましくは 1〜 3継代） す ることもでき、また凍結保存することもでき、好ましくは細胞内小器官が破壌され ずに生存可能な条件'温度で保存する。そのような保存方法としては、例えば 1 0 % F B S、 1 0 %グリセリン等のクライオプロテクタント （凍結防止剤）含有 DM E 培地中で一 1 3 0 °C以下で保存する方法が挙げられる。継代培養において、培地は 週に 3回程度交換するのが好ましい。凍結保存した細胞は、適時解凍してフィーダ 一細胞として使用する。
本発明において、フィーダ一細胞は、初代培養時に軟骨細胞と共培養して使用す る力 軟骨細胞の増殖が弱い場合には 1継代のみに共培養して用いることができ、 特に初代培養時に使用することが最も効果的であり好ましい。 また、軟骨細胞との 共培養に際し、該フィーダ一細胞を予め放射線処理（例えばガンマ線やコバルト照 射）または薬剤処理してフィーダー細胞自体の増殖能を喪失させて使用してもよい。 該薬剤としては、例えばマイトマイシン Cゃァクチノマイシン D等の抗癌剤やアン ピシリン等の抗生物質を挙げることができる。
ヒト軟骨細胞培養方法
ヒト軟骨細胞とフィーダ一細胞との共培養 （主に初代培養） は、軟骨細胞の培養 に適した公知の培地を用いることができる。 また、培地にはヒドロコルチゾン （H C)、 ゥシ胎仔血清 （FBS) の他に、 ヒト b FGF、 ヒト I GF— I等の増殖因 子を適宜添加する （Cuevas ら， Biochem, Biophys, Res, Commun. 156, 611—618 (1988) ； Froger-Gaillard ら， Endocrinology, 124, 2365 - 2372)。 そのような培 地の例として、 F— 1 2と DME (H) 培地の 1 ： 1混合物に、 FBS (好ましく は 10%程度）、 ヒト bFGF (好ましくは 1 OngZml 程度）、 HC (好ましくは 40 ng/ral程度）、 ヒト I G F— I (好ましくは 5 ng/ml程度) を添加した培地を 例示することができる。
1) 初代培養
あらかじめ放射線処理したフィーダ一細胞をフラスコに播種 （底面積 75 cm2の 場合 1.0 X 106個の濃度が好ましい） し、 次に軟骨細胞を播種 （好ましくは 0. 5〜1. OX 106個の濃度） し、 各軟骨細胞の培養に適した条件 （例えば 37°C， 1 0 °/0CO2条件下） にて培養する。 培養は、 増殖した細胞が単層で集密的 (confluent) になるまで行う （通常 10〜 14曰間）。
2) 継代培養
継代培養は初代培養と同じ培地で行うことができる （通常、 1継代 7日間)。 初 代培養で得られた細胞を継代した場合、 耳介軟骨では P 0 (初代培養）→P 6にお いて、 細胞数が 30〜746倍にまで増加する。 肋軟骨では P 0→P4において、 細胞数が 65〜16 1倍にまで増加する。さらに多数の軟骨細胞を所望する場合に は継代回数を適宜増加させることができる。 継代培養により得られたヒト軟骨細胞を重層的に 1回または 2回以上、好ましく は 3〜 4回播種して培養することによって、ゲル状の軟骨細胞塊を得ることができ る。得られた軟骨細胞塊中において、 ヒト軟骨細胞はコンドロカルシン等を含む軟 骨基質で包まれており、 軟骨細胞同士がコンドロカルシン、 II 型コラーゲン等の 軟骨基質を介して結合してゲル状の細胞塊を形成する。
上述したように、本発明の培養方法により得られる軟骨細胞は、その軟骨組織の その起源の軟骨組織、即ち初代培養に用いる軟骨組織の性質を保持している。具体 的には、培養した細胞の形態および細胞外基質の組成 （例えば、 コンドロカルシン、 II 型コラーゲン、 他にヒアルロン酸、 コンドロイチン、 コンドロイチン硫酸、 ケ ラト硫酸） から、 起源の軟骨組織の性質を保持していることが示されている。
軟骨治療材
本発明により得られた前記ヒ ト軟骨細胞または細胞塊を適する生体材料に包埋 し、 これを軟骨治療材として移植に供することができる。 ヒ ト軟骨細胞または細胞 塊を包埋する材料の例としては、上述したようにコラーゲン、ポリグリコール酸（ P G A ； polyglycolic acid) , ポリ乳酸 （polylactic acid)、 アルギン酸塩 （例えば カルシウム塩）、 ポリエチレンォキシド、 フイブリン接着剤、 ポリ乳酸一ポリグリ コール酸共重合体、 プロテオグリカン（proteoglycan)、 グリコサミノダリカン (glycosarainoblycan)およぴヒトの真皮が挙げられ、 これらを単独でまたは組み合 わせて使用することができる。 なお、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカ ンは硫酸化されていてもよい。 これらの生体材料は、移植する軟骨細胞が分散 ·吸 収されるのを防ぐために軟骨細胞を周囲からブロックしうるものであり、好ましく は移植する軟骨細胞の足場となりうるものである。
生体材料の形状は、 シート等の膜、 スポンジ等の多孔体、編物等のメッシュ、織 布、 不織布、綿等、任意の形状のものを使用することができる。 多孔性の材料の使 用は、軟骨細胞が生体材料に容易に接着するとともに内部に浸透し、軟骨組織の新 生を促進することが可能となるため好ましい。
生体材料としてコラーゲンを使用する場合は、コラーゲンを架橋処理してもよい。 コラーゲンを架橋処理すると物理的強度が增し、軟骨治療材を生体にステーブル等 を用いて固定する際に欠損することがない上に、軟骨組織が新生するまでの間、必 要な強度を保持しながら軟骨細胞または細胞塊を支持することができる。
また、コラーゲンを可溶化したコラーゲン液と培養軟骨細胞または細胞塊とを混 合し、必要に応じてゲルイ匕したものを軟骨治療材として使用することもできる。 コ ラーゲン液としては、公知の任意のものを使用することができる力 酵素により可 溶化したコラーゲン液は、免疫原性を有するテロペプチドが除去されるため特に好 ましい。 また、 コラーゲン液と軟骨細胞の混合物を上記生体材料からなるスポンジ ゃ不織布等により包埋し、または接着させて軟骨治療材を構成することも可能であ る。
また、該軟骨治療材は、軟骨細胞を包埋する材料としての支持体を適宜選択し、 組合わせることにより、軟骨組織ばかりか軟骨性骨化を誘導することができる。そ のような軟骨性骨化を誘導し得る材料としては例えばヒト真皮が挙げられる力 さ らに骨形成を促進する成長因子、例えば骨形成因子 （BMP) を用いて骨化を促進 させることができる。
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。 ただし、本発明はこれらの実 施例に制限されることはない。 発明を実施するための最良の形態
実施例
実施例 1 軟骨細胞培養
培地組成： F— 12と DME (H) 培地を 1 ： 1に混合したものに 10% FB S, 1 Ong/ml ヒト b FGF (科研製薬研究所） 、 および 4 Ong/ml HC， お よび 5ngZml ヒ ト I GF— I (G i b c o) を添カロした。
軟骨細胞：耳介軟骨として耳介後部 (約 1 X 1 cm) 、 およぴ肋軟骨として前胸部 (約 l X lcra) から、 それぞれ軟骨細胞を単離した。
フィーダ一細胞：胎生 13日齢のマウス第 1鰓弓軟骨 ·メッケル軟骨周囲の細胞 を採取し、そして培養して得られた細胞をフィーダ一細胞として用いた。 このフィ ーダー細胞を C S 21細胞と名付けた。 (a) 軟骨細胞の単離
軟骨片をペニシリン G (100 u/ml) およびカナマイシン （0. lmg/ml) で 除菌し、 そして 0.02°/0EDTAで 15分間処理した。 次に軟骨片をメスと剪刀 で細切し、 0. 25 %トリプシンを含む培地にて 4 °Cで 1晚静置し、 次に 0. 3 % II型コラゲナーゼ ZDME培地中にて 37°Cで 1〜6時間インキュベートした。 次いで 10%FCSZDME培地中に移し、室温で 2時間スターラ^"でゆつくり撹 拌し、 そして 100 μπιフィルターで濾過して、 単離した軟骨細胞を得た。
(b) フィーダ一細胞
i) フィーダ一細胞の単離
胎生 13曰齢（軟骨形成期） B a 1 bマウス力 ら、第 1鰓弓軟骨（メッケル軟骨） 周囲の細胞をマイクロサージェリー （microsurgery) 技術を用いて多数採取し、得 られた細胞塊を 0. 125 %トリプシンを含むカルシウム無添加培地に移し、 4°C の冷蔵庫に 4時間静置し、スターラーで穏やかに 10分振盪した後、フィルターで 漉過して単細胞を単離した。
ii) 培養条件
5〜10%FBS (ゥシ胎仔血清） 添加した D M E培地を使用し、 フィーダー細 胞を培養した。初代培養では 3〜4日で集密的になり、継代培養においても 1継代 でも 3〜4日で集密的になった。 2継代目からは 1週間に 1回継代し、 1継代から 3継代までを凍結保存した。 このようにして得られた細胞（ C S 21細胞） をフィ ーダー細胞として用いた。
(c) 初代培養
前日に 60グレイの放射線 (コバルト）で処理した C S 21細胞を底面積 75 cm2 のフラスコに 1.0X 106個/ cm2の密度で播種した。 これに単離したヒト軟骨細 胞を 0.5〜1 X 106個/ cm2の密度で播種し、 37°C、 10%CO2条件下で培養 した。 対照として、 3 T 3細胞とヒト軟骨細胞を同様に培養した。初代培養におい て、培地を 1週間に 2回交換した。 その結果、 CS 21細胞と共培養した軟骨細胞 は、 10〜14日間の培養により単層で集密的になったが、 3T3細胞の場合では ほとんど增殖しなかった （図 1) 。 得られた細胞を次の継代培養に使用した。 (d) 継代培養
フィーダ一細胞を用いないこと、および 1継代が 7日間であること以外は、初代 培養と同じ条件で継代培養を実施した。 初代培養で得られたヒ ト軟骨細胞を 1.0 X 106個 //底面積 1 75 cm2フラスコの密度で播種し、 7日ごとに継代し、各継代 後に細胞を凍結保存し、 増殖した軟骨細胞数を計測した。
-耳介軟骨 (n = 20) の場合、 耳介軟骨細胞の初代培養 (n = 20) P 0→P 1 (n = 20) P 1→P 2 (n= 1 3) P 2→P 3 (n= 12) P 3→P 4 (n = 9) P 4→P 5 (n = 6) P 5→P 6 (n= 3) で培養を行い、 それらはすべて各 継代に凍結保存した。 細胞は約 30〜 746倍に増殖した。
•肋軟骨（n= 12)の場合、肋軟骨細胞の初代培養 (n= 12) P 0→P 1 (n = 1 2) P 1→P 2 (n = 6) P 2→P 3 (n = 4) P 3→P 4 (n= 2) で培養 を行い、 同様に凍結保存した。 細胞は約 65〜161倍に増殖した。
また、軟骨基質であるコンドロカルシンの培地中の濃度を、抗コンドロカルシン 抗体を用いたェンザィムィムノアッセィ （E IA) で測定したところ、 耳介軟骨、 肋軟骨共に 7曰間の継代培養において 10 Ong/ml 以上のコンドロカルシンが測 定された。 これに対し、初代培養の際にフィーダ一細胞と共培養せずに、各軟骨細 胞を培養をしたところ、 3 T 3細胞との共培養の場合と同様に細胞増殖はほとんど 観察されなかった。 細胞培養の結果を下記の表 1に示す。
軟骨組織 耳介軟骨 肋軟骨
フィザ 細胞 CS21細胞 なし CS21細胞 なし 細胞増殖 初代培養 ++ 一 ++
継代培養 +++ NT* +++ NT*
* :試験せず （初代培養が不成功、 従って継代培養は不可能） 上述の結果から、従来の方法では初代培養が困難であるため培養系が維持できず また成功しても培養期間が 6〜8週間かかるが、本焭明の方法では、 2週間で初 代培養が可能であり、細胞増殖率も高く迅速かつ大量に正常細胞が培養できること が明らかとなった。 さらに、軟骨基質のコンドロカルシンが培地中に多量に存在し ていたことから、 増殖した細胞は軟骨細胞であることが示唆された。
(e) 重層培養
継代培養において得られた軟骨細胞を 1 X 106個 /cm2の密度で 3回播種し重 層させ重層培養を実施した。 2週間の培養後、 シート状のゲル塊が形成された （図 2)。 このゲル状の軟骨細胞塊について HE (へマトキシリンーェォジン） 染色し たところ、細胞が重層化して細胞同士が基質を介して結合していることが示された (図 3)。 また、軟骨組織の分子マ"カーである II型コラーゲンについて免疫染色 を行ったところ、細胞外基質に染色を呈し、該細胞外基質が軟骨に特異的な基質で あることが示された （図 4)。
実施例 2 軟骨細胞の移植
(a) 先ず、 軟骨細胞を包埋する材料 （支持体） の影響をなくすため、得られたヒ ト軟骨細胞塊をグラスファイバー （フィルター） にはさんでヌードマウス （BAL B/C S i c/n u, 10週令 25 g) の背部皮下に移植し、軟骨が形成される か検討した （n= 10)。 その結果、 3Z10検体で軟骨組織が形成されているこ とが確認された。 ただ、 あまり大きな組織は形成されないため、細胞がグラスファ ィバーに安定ではなく、周囲組織に拡散したと推測される。 また、軟骨細胞塊のみ を移植すると、該軟骨細胞が皮下で分散することが観察され、移植する軟骨細胞塊 を周囲からプロックする必要があることが明らカ となつた。
(b) 次に支持体として、 PGA (n = l 0) でヒト軟骨細胞塊を挟み、 各支持体 に包埋した状態で同様にヌードマウスに移植した。 その結果、 100% (10X1 0) の検体について軟骨組織の形成が観察された。 移植前の軟骨細胞塊を図 5に、 移植後 3ヶ月のマウスを図 6に、 そして移植組織の摘出標本を図 7に示す。
また、支持体としてアルギン酸カルシウム （n= 5) を用いた場合でも 100% (5/5) の検体について軟骨組織の形成が観察された。 そこで、支持体として P GAおよびアルギン酸カルシウムを用いた摘出標本のプレパラートを調製し、 トル イジンプルー染色した。その結果、軟骨組織に特異的なトルイジンブルー異染性が 観察された （図 8)。 し力 し、 形成される軟骨組織は PGAの方が大きく、 支持体 として PGAがより適していると推測される。
(c) 次に、形成される軟骨組織が骨化される条件について検討した。 ヒト軟骨細 胞塊を PGAに包埋し、 その周囲をフイブリンで覆ったもの （第 1群）、 またはヒ ト軟骨細胞塊を PG Aに包埋し、その外側にヒト真皮を巻き、 さらにフイブリンで 周囲を覆ったもの （第 2群）、 これらをヌードラット （F 344/N r nu/r nu, 6週令 250 g) の背部皮下に移植し、両群において軟骨組織が形成される 力検ベた。 3ヶ月後、 6ヶ月 （n = 6) の摘出した標本は軟骨組織に特異的なトイ ルイジンブルー染色で染色性を呈し、両群とも軟骨細胞が形成されていることが確 認された （図 9)。 また、 軟骨細胞塊を PG Aのみで包埋した第 1群では軟骨組織 のみ形成された力 真皮で巻いた第 2群では軟骨膜と間質内に血管新生が認められ 、 さらに軟骨の一部に軟骨性骨化が観察された （図 10)。
(d) 移植後に形成された軟骨組織が、起源 （培養に用いた軟骨組織） の性質を発 現しているかを検討した。 上記標本のプレパラートを調製し、 HE (へマトキシリ ンーェォジン) 染色、 トルイジンブルー染色、 アルシアンプル一"卜 PAS染色およ ぴ EVG (Elastica von Gieson) 染色を行った。 なお、 HE染色では、 細胞膜と 間質が染色され、その細胞の形態および軟骨小腔から軟骨組織が形成されているこ とを確認することができる。 トルイジンブルー染色での異染性は軟骨特異性を示す 。 また、 アルシアンブル一" h PAS染色では、 多糖が染色され、 軟骨基質、 特に弾 性軟骨のエラスチン （糖蛋白質） を多く含むことを確認することができる。 EVG 染色では弹性繊維が染色されるため、弾性軟骨 （耳介軟骨） の形成を確認すること ができる。
培養耳介軟骨細胞を移植した軟骨組織では E V G染色で弾性繊維が強く染色さ れ、ァノレシァンプルー + PAS染色で PAS陽性であったことから耳介軟骨細胞と 同定された。培養肋軟骨細胞移植後の組織では EVG染色で弾性繊維の染色は弱く 、ァルシアンブルー PAS染色で PAS弱陽性であつたことから肋軟骨細胞と同定 された。
(e) また、支持体として PGAの代わりにコラーゲンスポンジを用いて同様に移 植実験を行った結果、 耳介軟骨の場合では 100% (5/5) の検体について軟骨 組織の形成が観察された。その移植標本のプレパラートを調製し、 HE染色または アルシアンプル一 + PAS染色を行ったところ、軟骨組織が形成されていること (HE染色陽性）および形成された軟骨組織が耳介軟骨であること （アルシアンプ ルー +PAS染色陽性） が確認された （図 1 1)。 肋軟骨についても同様の実験を 行ったところ、 軟骨組織の形成が確認された。
(f ) さらに、 移植後の組織がヒト由来であるかを確^ «するために、 抗ヒト II型 コラーゲン抗体を用いて ABC— PC (ペルォキダーゼ）法により抗体染色を行つ た。その結果、耳介軟骨おょぴ肋軟骨共にヒト II型コラーゲンの発現が観察され、 これら軟骨組織がヒ ト由来であることが確認された （図 12)。 これらの結果を下 記の表に示す。
表 2
Figure imgf000015_0001
( g ) さらに形成された軟骨組織がヒト由来であることを確認するために、 II 型 コラーゲンについて R T— P C Rを実施した。 ヒトまたはマウスの II型コラーゲ ンに特異的なヌクレオチド配列を有するプライマー；
ヒ卜 ；
前方プライマー： 5' - ACATACCGGTMGTGGGGCMGAC - 3' (SEQ ID NO: 1)
後方プライマー： 5' - AGGTCTTACAGGMGACMTAAAT- 3' (SEQ ID NO: 2)
マウス；
前方プライマー： 5' - ATTTTGCAGTCTGCCCAGTTCAGG— 3' (SEQ ID NO: 3) および 後方プライマー： 5' -AGGTCTTACAGGMGACMTAAAT- 3' (SEQ ID NO: 4)
を用いて R T— P C Rを実施し、その P C R産物を制限酵素 E c o R Iで処理した。 ヒト由来の II型コラーゲンは E c 0 R Iで切断されるため、 ヒト由来かマウス由 来かを容易に識別することができる。 R T— P C R用試料としてはマウスに移植し て 3ヶ月後の培養ヒト軟骨組織、 フィーダ一細胞のみ、およびフィーダ一細胞 +培 養ヒト軟骨細胞を、対照としてマウス細胞を試験した。試料からの R N A抽出およ ぴ R T— P C Rは、 遺伝子操作技術マニュアル、 医学書院 （1995年出版） に従つ て実施した。
その結果、 移植軟骨組織では 2本のバンドが観察され、 ヒトの II型コラーゲン のみが検出された。 フィーダ一細胞では E c o R Iでは切断されず、 マウスの II 型コラーゲンのみが検出された。そしてフィーダ一細胞 +培養ヒト軟骨細胞では、 該制限酵素で切断されたバンドと切断されないバンドが観察され、マウスとヒ トの II型コラーゲンが検出された。 一方、 対照であるマウス細胞では E c o R Iでは 切断されず、 マウスの II型コラーゲンのみが検出された。 以上の結果から、 移植 後に形成された軟骨組織がヒト由来であることが確認された。この結果を図 1 3に 示す。 産業上の利用可能性
本発明の方法により、ヒト軟骨細胞と、軟骨細胞増殖能を支持するフィーダ一 細胞として軟骨形成期の軟骨周辺細胞とを共培養することにより、迅速かつ大量に ヒト軟骨細胞を培養することが可能である。 さらに、前記方法により得られたヒト 軟骨細胞を重層的に 1回または 2回以上播種して培養し、ヒト軟骨細胞塊を得るこ とができる。 また、 ヒ ト軟骨細胞 （または細胞塊） が包埋された材料からなる軟骨 治療材が得られる。該軟骨治療材は、軟骨細胞を包埋する材料を適宜選択すること により、軟骨組織のみならず軟骨性骨化を誘導することができ、軟骨および骨に関 連する疾病の治療に有効である。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト軟骨細胞と、 （A)本発明のフィーダ一細胞 （C S 2 1細胞） または (B ) 3 T 3細胞との初代培養の結果を示す写真である。
図 2は、 培地のみ （左） または重層培養の結果 （右） を示す写真である。
図 3は、重層培養で得られたゲル状の細胞塊の H E (へマトキシリンーェォジン) 染色の顕微鏡写真である。
図 4は、 重層培養で得られたゲル状の細胞塊の組織における抗 II型コラーゲン を用いた免疫染色の顕微鏡写真である。
図 5は、 支持体として P G A上にヒ ト軟骨細胞塊を載せたもの （A)、 さらに P GAで挟んだ移植用軟骨細胞塊 （B ) の写真である。
図 6は、 軟骨細胞塊の移植後 3ヶ月の移植マウスである。
図 7は、軟骨細胞塊の移植後 3ヶ月のマウスから摘出した標本を示す写真である。 図 8は、支持体として （A) P G Aおよび （B )アルギン酸カルシウムを用いた摘 出標本のトルイジンブルー染色の顕微鏡写真である。
図 9は、軟骨細胞塊を P G Aで包埋した群（第 1群） およびさらにヒト真皮で巻 いた群 （第 2群） の移植後の摘出標本である。
図 10は、 ヒト真皮で卷いた第 2群の組織を示す顕微鏡写真である。
図 1 1は、支持体としてコラーゲンスポンジで包埋した組織の移植後の耳介軟骨 組織.の , HE染色 （A)、 アルシアンブルー + PAS (B， C) 染色の顕微鏡写真で ある。
図 12は、 移植後の耳介軟骨組織における抗 II型コラーゲンを用いた免疫染色 の顕微鏡写真である。
図 13は、 移植された軟骨組織の II型コラーゲンについて RT— PC Rの結果 を示す写真である。

Claims

請求の範囲
1 . ヒト軟骨細胞と、 軟骨細胞増殖能を支持するフィーダ一細胞として軟骨形成 期の軟骨周辺細胞とを共培養してヒト軟骨細胞を培養することを特徴とし、ヒト軟 骨細胞を迅速かつ大量に培養しうる、 ヒ ト軟骨細胞培養方法。
2. 前記フィーダ一細胞が、 哺乳類胎児の軟骨形成期の軟骨周辺細胞であること を特徴とする請求項 1に記載の方法。
3. 前記軟骨周辺細胞が、 第 1鰓弓軟骨 ·メッケル軟骨周辺細胞であることを特 徴とする請求項 2に記載の方法。
4. 前記軟骨周辺細胞が、 胎生 1 3日齢マウスの軟骨周辺細胞であることを特徴 とする請求項 2に記載の方法。
5. 培養細胞を重層的に 1回または 2回以上播種して培養し、 ゲル状の軟骨細胞 塊を得ることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の方法。
6 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の方法により産生される正常ヒ ト軟骨細 胞。
7 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の方法により産生され、 且つ軟骨細胞が コンドロカルシンおよび/または Π型コラーゲンを含む軟骨基質で包まれている 正常ヒト軟骨細胞。
8 . 軟骨細胞が基質を介して結合して、 ゲル状の細胞塊を形成している、 請求項 6または 7に記載の正常ヒ ト軟骨細胞。
9 . 請求項 6〜 8のいずれか 1項に記載の軟骨細胞が包埋された材料からなる軟 骨治療材。
10. 前記材料が、 コラーゲン、 ポリダリコール酸、 ポリ乳酸、 アルギン酸塩、 ポ リエチレンォキシド、 フイブリン接着剤、 ポリ乳酸ーポリグリコール酸共重合体、 プロテオグリカン、グリコサミノダリカンおよび Zまたはヒトの真皮である請求項 9に記載の軟骨治療材。
11. ヒト軟骨細胞と共培養することにより、 軟骨細胞増殖能を支持して迅速かつ 大量にヒ ト軟骨細胞を培養するために使用するフィーダー細胞。
12. 前記フィーダ一細胞が、 哺乳類胎児の軟骨形成期の軟骨周辺細胞である請求 項 11に記載のフィーダ一細胞。
13. 前記軟骨周辺細胞が、 第 1鯉弓軟骨 ·メッケノレ軟骨周辺細胞である、 請求項 12に記載のフィーダー細胞。
14. 前記軟骨周辺細胞が、 胎生 1 3日齢マウスの軟骨周辺細胞である請求項 12 に記載のフィーダ一細胞。
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