WO2002006832A1

WO2002006832A1 - Moyen d'examen pour la nephropathie

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Publication number: WO2002006832A1
Application number: PCT/JP2001/006006
Authority: WO
Inventors: Osamu Hotta; Yasushi Shirahase; Hisahide Hiura
Original assignee: International Reagents Corporation
Priority date: 2000-07-13
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2002-01-24
Also published as: CN1441904A; EP1300683A4; EP1300683A1; US20030224445A1; CN1276255C; AU2001271032A1

Description

明細書腎障害の検査手段技術分野

本発明は、腎障害の検査に関するものであって、尿中のリポタンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分を測定する検査手段に関する。技術背景

尿沈渣中に含まれる成分は、腎に由来する成分、尿路から混入してくる成分、さらには尿中で析出してくる結晶性成分等多種である。沈渣の種類、量を調べることは、腎 · 尿路疾患の鑑別とその程度を知る上で非常に重要である。これらは、通常染色法による鏡検により行われている。また、尿中マクロファージの表面抗原を調べることにより I g A腎症の病態診断が可能であること（臨床検査， 42卷， 588〜590 , 1998)、尿中脂肪球および卵円形脂肪体（以下、単に脂肪体と呼ぶこともある）の鑑別を尿沈渣脂肪染色により行うことにより腎障害の検査が可能であることが示されている（検査と技術， 26巻， 441 -446 , 1998)。さらに、尿中に出現してくる大型マク口ファージは白血球の表面抗原 C D 1 4が陰性、 2 5 F 9が陽性であり、通常のマクロファージが C D1 4陽性、 2 5 F 9陰性であることと大きく異なっており、しかも大型マクロファージに脂肪球、卵円形脂肪体が属していることが示され、これらを測定することは、腎障害の検査として有用であることが述べられている（臨床病理， 47卷，総会号， 73, 1999)。しかしながら、これらの測定はいずれも、染色による鏡検、モノクローナル抗体を用いた蛍光標識免疫染色による鏡検あるいはフローサイトメトリー等により行われていた。これらの方法では、 1検体ずつ鏡検またはフローサイトメトリー等により検査するため、操作が煩雑で多数検体の測定は困難であった。発明の開示

本発明の目的は、腎障害の簡便な検査手段を提供することである。本発明者らは、上記大型マクロファージを微量コレステロール（m C H O ) で測定可能と考え m C H Oを測定していたところ、大型マクロファ一ジが低いレベルでも m C H〇が高値である検体があることを見出した。また、リポタンパク質が出現する患者は、疾患の進行が速く、腎不全に移行する確率が高いものであった。そこで鋭意研究を重ねた結果、リポタンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分、特にアポタンパク質の量が有意に腎障害との関連性を示唆するものであることを見出し、本発明の腎障害の検査手段を完成した。すなわち本発明は、

1 . 尿中のリポタンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分を測定することを特徴とする腎障害の検査手段、

2 . リポタンパク質若しくはその類縁体が、抗ヒトアポ A— I 抗体が反応しうるタンパク質または抗ヒトアポ A — II抗体が反応しうるタンパク質のいずれか 1 または両方を含有する物質であることを特徴とする前項 1 に記載の検査手段、 3 . リポタンパク質若しくはその類縁体が、高比重リポタンパク質若しくはその類縁体であることを特徴とする前項 1 または 2に記載の検査手段、

4 . リポタンパク質若しくはその類縁体に含有される成分として、アポタンパク質を測定することを特徴とする前項 1 〜 3 のいずれか 1 に記载の検查手段、

5 . リポタンパク質若しくはその類縁体に含有される成分として、抗ヒトアポ A— I 抗体が反応しうるタンパク質または抗ヒトアポ A — II抗体が反応しうるタンパク質から選択される 1 または両方を測定することを特徴とする前項 1 〜 4のいずれか 1 に記載の検査手段、

6 . 尿中の白血球の表面抗原を測定することを特徴とする腎障害の検査手段、

7 . さらに尿中の脂質成分を測定することを特徴とする前項 1 〜 6 のいずれか 1 に記載の検査手段、

8 . 脂質成分がコレステロールであることを特徴とする前項 7 に記載の検査手段、 ^_

9 . 前項 1 〜 8 のいずれか 1 に記載の検査に必要な試薬をキット化または単品で構成してなる検査用試薬、

からなる。図面の簡単な説明

【図 1 】尿中脂質関連マーカー (オイルレツド陽性粒子) と疾患との関係を示す図である。（実施例 3 )

【図 2】尿中脂質関連マ一カー（遊離コレステロール）と疾患との関係を示す図である。（実施例 3 ) '

【図 3】尿中脂質関連マーカー（アポ A — I ) と疾患との関係を示す図である。（実施例 3 )

【図 4】尿中脂質関連マーカー（リン脂質）と疾患との関係を示す図である。（実施例 3 )

【図 5 】尿中脂質関連マーカー（全コレステロール）と疾患との関係を示す図である。（実施例 3 )

【図 6 】コレステロール標品の H P L C分析結果を示す図である。〈実施例 5 )

【図 7】濃縮正常尿の H P L C分析結果を示す図である。〈実施例 5〉【図 8 】腎疾患患者尿の H P L C分析結果を示す図である。〈実施例 5 ) 【図 9 】腎疾患患者の治療前、治療後の尿中の m C H Oおよび血清中のクレアチュンの測定値を示す図である。〈実施例 6 )

【図 1 0】腎疾患患者の治療前、治療後の尿中の m C H Oおよび尿中 N—ァセチル — D—ダルコサミニダーゼの測定値を示す図である。〈実施例 6 )

【図 1 1 】腎疾患患者の治療前、治療後の尿中の m C H Oおよび尿中タンパク質の測定値を示す図である。〈実施例 6 )

【図 1 2】腎疾患患者の治療前、治療後の尿中の m C H Oおよび尿中アルブミンの測定値を示す図である。〈実施例 6 )

【図 1 3】腎疾患患者の治療前、治療後の尿中の m C H〇および尿中アポ A— I の測定値を示す図である。〈実施例 6〉符号の説明

(図：！〜 5 について）

1 ： I g A腎症疾患

2 ：糖尿病性腎症疾患

3 ：糸球体硬化症疾患 4 ：膜性腎症疾患

5 ：膜性増殖性糸球体腎炎疾患

6 ：急速進行性腎症疾患

7 ：微小変化型ネフローゼ症候群疾患

8 ：単状糸球体硬化症疾患

9 ：慢性腎不全疾患

1 0 ：正常

(図 9〜 1 3 について）

• _: アポ A— I 陰性患者についての測定値

〇：アポ A — I 陽性患者についての測定値発明を実施するための最良の形態本発明は、腎障害の検査手段であって、尿中のリポタンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分を測定することを特徴とする。ここで、手段とは、目的を達成するための方法および/または媒体を意味する。

すなわち、本発明の腎障害の検査手段は、尿中のリポタンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分を測定することによつて達成される。さらに、これらの物質に加えて、尿中の脂質成分を測定することを特徴とする腎障害の検査手段を提供する。尿中の脂質成分としては、脂肪滴、脂肪体および/または脂肪球に含まれるものおよび高比重リポタンパク質様（H D L様）のリポタンパク質を主要な測定対象とする。特に腎疾患において尿中に H D L様リポタンパク質が現れることを新規に見出した。血清中においては、脂質はリポタンパク質として存在しているが、尿中では顕微鏡でみえる程度の粒子（脂肪滴、脂肪体および/または脂肪球）となっていることが多い。これら不溶性の脂肪の塊になっているものについて、本発明ではその脂質成分量について酵素反応による定量を可能とする。

(対象リボタンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分）

本発明において、主として測定の対象とする尿中のリポタンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分は次のとおりである。一定の割合の脂質とタンパク質を含む複合体をリポタンパク質といい. キロミクロン、 V L D L、 I D L、 L D L、 H D L等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。脂質成分は、後述の（対象とする脂質成分）に記した内容とほぼ同様であるが、主にコレステロール、トリァシルグリセロール'、リン脂質、遊離脂肪酸等が挙げられる。これらの脂質の一部はきわめて疎水性が強いため、リポタンパク質とよばれる特殊な構造体を形成し、表面にはアポタンパク質とよばれる特殊なタンパク質を配置する。アポタンパク質は、リポタンパク質の構造決定のうえで重要な役割を示すとともにリポタンパク質代謝のうえでも重要な機能を果たす。各種リポタンパク質の主要アポタンパク質として、キロミクロンについては A— I 、 B、 C— I 、 II、 IIIが、 V L D Lについては B、 C一 I 、 II、 III、 Eが、 I D Lについては B、 Eが、 L D Lについては Bが、 H D L 2 および H D L 3 については A— I 、 II が構成成分として知られている。本発明におけるリポタンパク質の類縁体とは、電荷の異なったもの、糖その他の物質により修飾されたもの、分子量が異なるもの、アミノ酸配列が類似するもの等が例示される。本発明における抗ヒトアポ A— I 抗体が反応しうるタンパク質または抗ヒトアポ A — II抗体が反応しうるタンパク質とは、ヒトアポ A— I タンパク質またはヒトアポ A — II タンパク質そのものの他、これらのタンパク質と共通する構造を有することにより、上記抗体と反応しうるタンパク質も含む趣旨である。

(脂質成分）

本発明で測定の対象とする尿中の脂質成分は、例えば、中性脂肪およびその誘導体、リン脂質およびその誘導体、過酸化脂質、ステロール類、脂肪酸、脂肪酸塩、脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、脂肪族アルデヒド、糖脂質、スフインゴ脂質、プロスタグランジン、カロチノィド等の中から選ばれた 1種または 2種以上の脂質成分であり、その濃度または含量をこれらの脂質成分に作用する酵素を働かせて測定する。脂質成分のうち特に重要な対象は、ステロール類および /またはリン脂質である。

(測定試料の処理）

尿試料は尿自体でもよく、尿を遠心分離して得られる尿沈渣画分またはその上清画分であってもよい。本発明の脂質成分の測定方法は尿試料を何ら処理することなく直接測定することが可能であるだけでなく、尿を遠心分離し尿沈渣を分画し、その画分の脂質成分を測定することも可能である。 (測定方法）

尿中に含有されるリポタンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分の測定は、これらの物質を検出可能な測定方法で測定すればよく、特に限定されない。該測定は、界面活性剤を使用しなくても使用しても良い。例えばリポタンパク質若しくはその類縁体を測定する場合には、界面活性剤は用いないで測定するのが好ましく、これらに含有される成分を測定する場合には、界面活性剤を用いて測定するのが好ましい。

(リボタンパク質の測定方法）

リポタンパク質の測定は、例えば H P L C、超遠心、ポリエチレングリコールを用いた凝集法などによりリボタンパク質を分画し、分画したリポタンパク質を重量法にて測定することができる。

(アポタンパク質の測定方法）

一方、アポタンパクの測定に関しては,、抗原抗体反応による測定が可能である、例えば、アポ A— I タンパクでは、抗アポ A— I タンパク抗体を用いて、免疫比濁法、粒子凝集免疫測定法、酵素免疫測定法等の公知の測定法が適用できる。他のアポタンパクの例としてアポ A— I I 、アポ ] 3、アポ C、アポ E、アポ L P ( a ) 等がある。

(界面活性剤の添加）

界面活性剤は、尿中の測定対象物を可溶化または分散し均質にし、尿のどの部分を探ってもよいように測定対象物を均質化したり、および/ または酵素や抗体等により定量可能な状態にさせたりする作用を有する物質であれば特に限定されないが、脂肪滴、脂肪体、脂肪球およびリポタンパク質を可溶化する作用を有し、これらが包含する脂質成分、タンパク質、不溶性の脂質等を可溶化 · 分散 · 遊離させ均質にしうるものが好ましい。また、超音波処理を単独または界面活性剤処理と組み合わせてもよい。本発明の具体例では、非ィオン界面活性剤としてトリトン X - 100 を例示したが、格別にこれらに限定されるものではない。当業者は、本発明に開示する結果をもとに、単純な実験的繰り返しにより効果の比較を行い、界面活性剤を選択することができる。非イオン界面活性剤以外に、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両イオン界面活性剤または配糖体を適宜用いることも無論可能である。さらに、界面活性剤を 2種以上併用して用いることにより、より確実に可溶化または分散させ均質化効果を達成することができる。界面活性剤の添加量は、 0 . 1 〜 5 w / V %が一般的であるが、可溶化または分散による均質化の程度を考慮して、適宜増量 · 減量することにより選択可能である。処理条件である温度 · 時間等は、単純な実験的繰り返しにより決定することができる。また、好ましくは、前処理として予め尿に界面活性剤を添加し、可溶化または分散させ均質化処理を行つておくことも可能である。この場合、 1 0〜 4 0 °Cの温度で、数秒から数分程度の処理で充分である。無論、この界面活性剤処理は、酵素反応処理との同時処理も可能である。処理は、適宜段階的処理を行ってもよいが、より好ましくは自動化された条件か一元処理がなされることが好ましい。 (酵素を用いた脂質成分の定量）

尿中に含有される脂質成分の測定は、尿中の脂質成分を検出可能な測定方法で測定すればよい。尿中の脂質成分は、血清中のものと比較して約 1/1000〜： 1/100 しかなく、血清脂質測定用試薬では測定が困難である。上記のように界面活性剤等の添加により可溶化または分散させ均質化した尿中脂質成分の測定は、酵素を用いた脂質の定量方法を用いて行うが、その方法は公知の方法であれば特に限定されない。例えば、 H P L C法、ガスクロマトグラフィー法、電気泳動法、化学的方法、酵素を用いた方法が例示される。このうち、酵素を用いた方法は操作性、感度などの面から好適に用いられる。本発明の脂質成分の測定方法では、下記の具体例に示すように、分解反応、脱水素反応、または酸化反応を触媒する酵素から選ばれる 1種または 2種以上の酵素を利用して、脂質成分の測定を行うことができる。尿中の脂質成分は、血清中の脂質成分と比較して微量にしか存在しておらず、酵素を用いることにより高感度に測定が可能となる。具体的には、中性脂肪を測定する例として、リパーゼで中性脂肪をグリセロールと脂肪酸に分解し、生じるグリセロールを酵素反応により測定する。グリセロールの酵素反応による測定は、グリセロールキナーゼとグリセロール - 3 - リン酸脱水素酵素を作用させ、補酵素 N A Dから N A D Hへの変化速度を測定する方法、グリセロールキナーゼとグリセロールリン酸酸化酵素を作用させ生じる過酸化水素を測定する方法、グリセロールキナーゼとグリセ口ール - 3 - リン酸脱水素酵素およびグリセロールリン酸酸化酵素を作用させサイクリング反応によりグリセロールを測定する高感度測定法、グリセ口ール脱水素酵素を作用させて測定する方法等が用いられる。リン脂質を測定する場合には、ホスホリパーゼおよびグリセ口ホスホリルコリンジエステラーゼを作用させて、グリセロール一 3 — リン酸を生じさせ、そのグリセロール一 3— リン酸を中性脂肪の場合と同様に測定する方法、その他のリン脂質を酵素的に測定する公知の方法が用いられる。 ' 生体中の代表的ステロールであるコレステロールを測定するには、コレステロール酸化酵素を作用させて、過酸化水素を生じさせ、その過酸化水素をペルォキシダーゼにより測定する方法、またはコレステロール脱水素酵素を作用させ補酵素 N A Dの N A D Hへの変化速度、あるいは変化量を測定する方法、さらには、同じくコレステロール脱水素酵素を用いて、捕酵素 N A D Hとチォ N A Dの 2種類の補酵素を用いることによる平衡増幅反応により高感度にコレステロールを測定する方法（特開平 08 - 70894 公報） .や、コレステロールォキシダーゼ等により変換される酸化型捕酵素を還元型捕酵素に再生する第二のデヒドロゲナーゼの還元型基質の存在下、コレステロールを基質としてサイクリング反応をおこさせて測定する方法（特開平 11 - 18797公報）等が知られている。コレステロールの脂肪酸エステルの場合には、コレステロールエステラーゼ等の分解酵素を働かせることにより、遊離のコレステロールに変換して上記の方法で測定することが可能である。脂肪酸の場合には、ァシルコェンザィム Aシンセターゼおよびァシルコェンザィム Aォキシダーゼを作用させて生じる過酸化水素を測定する方法が用いられる。プロスタグランジンではプロスタグランジン脱水素酵素を作用させて測定できる。糖脂質の場合には、糖脂質分解リパーゼぉよび他のリパーゼを作用させて、グリセロールを生成させ測定することが可能である。スフィンゴ脂質の場合にもスフィンゴ脂質分解リパーゼを作用させ測定することが可能である。脂質成分の測定法は、上記に例示した方法に限定されず、既知の脂質成分の測定方法に準じて適宜変更 · 追加が可能である。本発明においては、上記本発明の尿中のリポタンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分の測定方法に必要な試薬をキット化または単品で構成してなる試薬を提供する。本発明の試薬には、尿中の不溶性脂肪を可溶化または分散させ均質化させるための界面活性剤. および脂質成分を定量するための試薬を含むこともできる。また、測定に必要な試薬を担体に含有させた簡単型の測定用デバイスであってもよレヽ <=

(腎障害の検査手段）

本発明の課題解決手段の別の一は、尿中に含有されるリポタンパ質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分、脂質成分を適宜組合わせ、測定することを特徴とする腎障害の検査手段である。従来、腎障害の検出のための尿中脂肪球等の検査は顕微鏡所見等の煩雑な手段により行われていた。本発明では、上記本発明の簡便な尿中脂質成分の測定方法を用いて得られた、尿中に含まれるリポタンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分、脂質成分の測定結果が、有意に腎障害との関連性を示唆するものであることを見出し、簡便な腎障害の検査手段を達成した。また、尿中の上記物質の量をスコア化して、スコアにより被検者の腎障害の程度を判定可能にする。本発明の腎障害の検査手段には、上記本発明の尿中のリポタンパク質若しくはその類縁体、これらに含有される成分、または脂質成分の測定方法を利用することができ、これらを適宜組合わせても良い。測定の対象とする尿中に含有される脂質成分は、主に尿中の脂肪滴、脂肪体および Zまたは脂肪球、 H D L様リポタンパク質に含まれる。そして、少なくとも、中性脂肪およびその誘導体、リン脂質およびその誘導体、過酸化脂質、ステロール類、脂肪酸、脂肪酸塩、脂肪酸エステル、脂肪族ァルコール、脂肪族アルデヒド、糖脂質、スフインゴ脂質、プロスタグランジン、カロチノィドの中から選ばれた 1種あるいは 2種以上の脂質成分を測定の対象とする。また、リポタンパク質若しくはその類縁体に含有される成分として、上記脂質の他、抗ヒトアポ A— I 抗体が反応しうるタンパク質、抗ヒトアポ A — II抗体が反応しうるタンパク質、その他のアポタンパク質が例示され、測定の対象とすることができる。また、リポタンパク質若しくはその類縁体としては、脂質とタンパク質を含む複合体であれば良く、キロミクロン、 V L D L、 I D L、 H D L等、およびその類縁体が例示される。実験例では、腎障害患者のコレステロール値とリン脂質値を測定したが、これらは有意差をもって正常人に比して高値であり、この結果により、尿中に含有する脂質成分、少なくともコレステロールおよび/またはリン脂質を定量することは、腎障害の発見に有用であることが判明した。また、腎疾患の患者の治療前後のアポ A — I と各種尿中成分について測定を行った。この結果、治療後にはアポ A — I の減少が認められ、腎障害の診断に有用であることが示唆された。かくして本発明は、尿中のリポタンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分、脂質成分を測定し、その結果を解析することにより腎障害の検出およびその程度の判定を可能にする腎障害の検査手段を提供する。本発明は、腎障害の検出およびその程度の判定のために、上記物質の測定に加えて、尿中に含まれる白血球の表面抗原の測定または検出を行う方法も組合せて利用することを開示する。特に上記物質が高値（例えば、脂質、リポタンパク類および/またはアポタンパク類の測定結果やそれらのスコア化）を示した試料についてのみ、尿中に含まれる白血球の表面抗原の測定または検出を行う方法を導入してもよい。これらの組合せにより、より好適な腎障害の検査を可能となる。つまり、尿中の脂質成分の測定と合わせて、尿中に含まれる白血球の表面抗原の測定または検出を組み合わせることにより、腎障害の検出およびその程度の判定がより好適に行われる。尿中の上記物質の測定と尿中に含まれる白血球の表面抗原の測定または検出とを組合せて.腎障害の検査を行う場合、尿の一部を上記物質の測定に用いると共に、一部を遠心分離により尿沈渣画分を分画して白血球の表面抗原、例えば C D 1 4、 C D 1 6 、 2 5 F 9等、を公知の鏡検ぁるいはフローサイトメトリー等により測定検出することも可能である。また、尿沈渣画分の一部を用いて、上記物質を測定し、残りの一部で白血球の表面抗原を鏡検あるいはフローサイトメトリー等で検出測定することも可能である。さらに、尿の一部は遠心分離により尿沈渣を分画し、白血球表面抗原を測定検出する一方、尿の一部を凍結融解および/または界面活性剤処理等を単独あるいは組合せて、尿中の細胞や粒子状物質を破壌させる工程を経た尿検体を用いて測定を行うことも可能である。本発明の腎障害 ώ·検査手段が包含する、尿中脂質の測定、尿中リポタンパク類および/ /または尿中アポタンパク類の測定、あるいはこれらと尿中に含まれる白血球の表面抗原の測定若しくは検出、により得られた結果を随時組合せて解析することは、より好適な腎障害判定を可能とする。解析に用いる測定結果は適宜選定可能である。例えば、コレステロールとリン脂質の比を指標にすることも可能であり、その比と C D 1 4 の測定検出結果を組合せることもできる。尿中に含まれる白血球の表面抗原の測定検出結果も複数の結果を組合せることができる。実施例

以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

【実施例 1 】

正常人の尿と腎障害患者の尿について、コレステロール濃度を測定した。尿は予め 1 0 % トリトン X— 1 0 0 と 9 : 1 の割合で混合し、尿検体とした。コレステロール測定は下記の組成の測定試薬 2種類を調製し、尿検体 1 0 μ Lをとり、 2 5 0 μ Lの試薬一 1 に添加し、 3 7 °Cで 5分間反応後、 1 0 0 μ Lの試薬— 2 を添加し、添加後、 1分目から 3分目までの波長 4 1 5 n mにおける 1分間あたりの吸光度変化量を求め、コレステ口ール濃度を求めた。

その結果を表 1 に示した。試薬一 1 '

P I P E S 2 0 m m o 1 / L

K C 1 1 5 0 m m o 1 / L

トリトン X— 1 0 0 0. 3 w / v %

コール酸ナトリウム 0. 3 w / v %

チォ NA D 1 . 2 5 mm o l / L

牛血清アルブミン 0. 1 w / V %

コレステロール脱水素酵素 3 U/m l

コレステロールエステラーゼ δ υ,πι ΐ

ρ Η 7. 0 試薬一 2

C H E S 1 7 5 m m 0 1 / L

トリトン X— 1 0 0 0. 3 w / v %

コール酸ナトリゥ.ム 0. 3 w / v %

)3— N A D Η 3. 5 m m o 1

P H

【実施例 2】

実施例 1 で調製した尿検体について、リン脂質濃度を測定した, リン脂質測定は下記の組成の測定試薬 2種類を調製し、尿検体 1 0 μ Lをとり、 2 5 0 μ Lの試薬一 1 に添加し、 3 7 °Cで 5分間反応後、 1 0 0 μ Lの試薬一 2 を添加し、添加後、 1分目から 3分目までの波長 5 4 6 η mにおける 1分間あたりの吸光度変化量を求め、リン脂質濃度を求めた。その結果を表 1 に示した。試薬一 1

H E P E S 5 0 m m o 1 / L C a C 1 2 . . 0 m m o 1 / L トリトン X— 1 0 . ό 0 . 2 w / v % グリセロール— 3 —リン酸脱水素酵素 1 . 5 U / m 1 ホスホリパーゼ A ' l 2 . 0 U / m 1 ホスホリパーゼ A 2 2 . 0 U / m 1 グリセ口ホスホリコリンホスホージエステラーゼ 0 . 6 U / m 1 N A D H 0 . 5 m M フエノー 0 . 0 5 % ァスコノレビン酸ォ.キシダ一ゼ 3 U / L P H 8 . 0

試薬— 2 '

リン酸緩衝液 2 0 m m o 1 / L

グリセロー 3 — リン酸ォキシダーゼ 2 0 0 U / m 1

P O D 1 0 U / m 1

4 ーァミノアンチピリン 2 . 0 m M

P H 7 . 5 その結果、腎障害患者の尿中コレステロールおよびリン脂質の濃度は、正常人に比べて明らかに高値であることが判り、少なくとも尿中のコレステロールおよび/またはリン脂質を測定することにより、腎障害の検查が可能となることが示唆された。

(表 1 ) 正常人と腎障害患者の尿中コレステロールとリン脂質の測定

I 1—一 ' Γ—— -·— ' · 1

I 尿検体 I コレステロール（m g / d L ) I リン脂質（m g / d L) | ト + + -I

I正常人尿 I 0. 0 7 I 0. 6 1

I腎障害患者尿 1 1 1 . 7 4 I 8. 7 I 卜 +一; + H I腎障害患者尿 2 | ■ 0. 2 4 I 1 2. 8 | h +— + H

1 腎障害患者尿 3 1 0. 1 9 I 1. 5 I

I 腎障害患者尿 4 | 0. 1 6 I 8. 7 I 1^{1 1 1}

【実施例 3 】

1 2 2例の尿検体（ I g A腎症 [ I g AN] 5 1例、糖尿病性腎症 [D MN] 1 0例、糸球体硬化症 [ N e p h r o s c r e 1 o s i s ] 9例、膜性腎症 [MN] 6例、膜性増殖性糸球体腎炎 [M P G N] 7例、急速進行性腎症 [R P GN] 1 2例、微小変化型ネフ口—ゼ症候群 [MC N] 3例、巣状糸球体硬化症 [F G S ] 1 2例、慢性腎不全 [ C R F] 5 例、正常 7例）中のリン脂質、遊離コレステロール、コレステロール、アポ A— I の濃度を測定した。その結果を図 1〜 5 に示した。これらの何れの脂質関連マーカーも、上記の腎障害のいずれかの疾患群で正常尿に比して有意に高値を示すことが判り、尿中の脂質成分を測定することにより、腎障害を検査、診断することが可能であることが明かになった。また、別途、堀田らが報告しているオイルレツ'ド O陽性パーティクル（尿中脂肪球）の個数（ 5 m L 中）を測定した（ Takashi Oda,Osamu Hotta et al. Kidney International , Vol.53， 1190- 1200, 1998.)。尿中脂肪球は、 I g A N、 R P G N、 F G Sで特に高値を示したが、逆に、 M C Nなどでは正常尿と変わらない。それに比して、本発明の方法では I g AN、 R P G N、 F G Sのみならず、他の腎障害をも感度良く検出できることが判り、本発明の有用性が確かめられた。なお、コレステロールの測定は実施例 1 に示す方法、リン脂質の測定は実施例 2に示す方法、遊離コレステロールの測定は実施例 1 に示す試薬一 1 からコレステロールエステラーゼを除いたほかは、実施例 1 と同様の操作を行い測定を行った。アポ A— I の測定は、アポ A— I オート · N 「第一」を用いて測定を行った。尿は予め 1 0 % トリトン X— 1 0 0 と 9 ： 1 の割合で混合し、尿検体とした。尿検体 1 0 μ ί、 1 6 0 /z Lの第一試薬、 4 0 / Lの第二試薬の試薬検体比で測定した以外は取扱説明書に準じて操作を行った。【実施例 4】

定期健康診断受診者から採取された尿検体 1 7 5例を用いて、尿中コレステロールを実施例 1 に記載の方法によって測定し、健常人の尿中コレステロールの参照値を求めた。健常人の血清中のコレステロール値は通常 1 3 0〜 2 5 0 m g / d Lであるのに対して、尿中コレステロールの値は、血清コレステロール値の 1 0 0 0分の 1以下で 0. 0 1〜 0. 2 5 m g / d Lであった。対照として、市販の血清中コレステロール測定キットを用いて、測定したが、何れの検体もコレステロールを測定することはできなかつた。このことから、尿中コレステロールの測定は、本発明の実施例 1 に記載された方法等を用いる高感度測定法が必要であることがわかった。

【実施例 5 】

正常人の尿と腎障害患者の尿中のコレステロールについて、 H P L C および電気泳動により分析を行った。

(試料の調製）

限外ろ過を用いて尿の濃縮を行った。正常尿は約 1 3 0倍、患者尿は約 1 0倍に濃縮を行った。

(実験例 1 ： H P L Cによる分析）カラムは Superose 6(直径 1.0cm X 30cm)および Superose 12 (直径 1.0cm X 30cm) (フアルマシア）を直列で用いた。また、緩衝液は 10mM Tris-HCl buf. pH 7.5 (0.14M NaCl, l .OmM EDTA.2Na, 0.1% NaN₃含有）を用い、流速は 0.3mL/minで送液を行った。上記で調製した試料 100 μ L をインシ、'ェクシヨンし、また標品として血清 30 /i L をインシ"ェクシヨンした。 2分おきに分画し、各フラクションのコレステロール濃度を測定した。測定は、実施例 1 に示す方法で測定を行った。その結果を図 6〜図 8 に示した。図 6および図 8 に示すように、腎障害患者の尿には血清 H D L画分と同じ保持時間の位置にピークが見られたことから、 H D L と同じ分子サイズの脂質画分が含まれていることが示唆された。また図 6および図 7 に示すように、正常尿は血清 V L D L 画分よりも更に大きな分子サイズのところにピークがあり、細胞からの剥離などが考えられた。

(実験例 2 ：電気泳動による分析）

システムとしてへ'レナ研究所のコレトリコンボを使用し、ァガロースゲルを用いて電気泳動を行った。正常および患者尿は原点から泳動されなかった。この事は表面電荷がないことを意味しており、表面タンパク質の修飾が考えられた。

糸球体の基底膜は電荷バリァ一で血中タンパク質などの漏出を抑えている。しかし、 H D Lが疾患により修飾を受け電荷を失ったと考えると、基底膜を通過することができる。こうした修飾の多くは酸化が主たる要因であり、酸化リポタンパク質が、尿細管上皮細胞に接着して細胞毒性を示すことが考えられた。【実施例 6】

(治療前 · 治療後の尿成分の比較）

腎疾患患者（R P GN) の治療前、治療後の尿中の微量コレステロ一ル（m C H O )および尿中成分または血清中のクレアチュンを測定した。また、尿中の成分についてはクレアチニン補正を行った。コレステロールは実施例 1 に示す方法、アポ A— I の測定はアポ A— I オート · Ν「第一」、アルブミンは m— A L B免疫試薬（国際試薬社製）、蛋白質の測定は m— T P試薬（国際試薬社製）、 N—ァセチル — D—グルコサミナダーゼ（NA G) は、 N—アツセィ NAG 「ニットボー」（日東紡績社製）、クレアチニンは C R E試薬 · L B 「コクサイ」（国際試薬社製）を用いて測定した。

また、尿は予め 2 0 % トリトン X— 1 0 0 と 5 0 ： 1 の割合で混合した。その結果を図 9〜図 1 3 に示した。アポ A— I は治療後においては検出されなかったが、他の腎疾患マーカーであるクレアチュン、 NAG、 T P、 A L Bは治療後であっても検出されており、アポ A— I は他のマ一力一とは異なった側面から腎障害の検査が可能となることが示唆された。 '

産業上の利用可能性

以上説明したように本発明の検査手段により、より確実な腎障害の検査が可能となった。

Claims

請求の範囲

1 . 尿中のリポタンパク質若しくはその類縁体、またはこれらに含有される成分を測定することを特徴とする腎障害の検査手段。

2 . リポタンパク質若しくはその類縁体が、抗ヒトアポ A— I 抗体が反応しうるタンパク質または抗ヒトアポ A— II抗体が反応しうるタンパク質のいずれか 1 または両方を含有する物質であることを特徴とする請求項 1 に記載の検査手段。

3 . リポタンパク質若しくはその類縁体が、高比重リポタンパク質若しくはその類縁体であることを特徴とする請求項 1 または 2に記載の検查手段。

4 . リポタンパク質若しくはその類縁体に含有される成分として、アポタンパク質を測定することを特徴とする請求項 1 〜 3 のいずれか 1 に記載の検査手段。

5 . リポタンパク質若しくはその類縁体に含有される成分として、抗ヒトアポ A— I 抗体が反応しうるタンパク質または抗ヒトアポ A— II抗体が反応しうるタンパク質から選択される 1 または両方を測定することを特徴とする請求項 1 〜 4のいずれか 1 に記載の検査手段。

6 . 尿中の白血球の表面抗原を測定することを特徴とする腎障害の検査手段。

7 . さらに脂質成分を測定することを特徴とする請求項 1 〜 6 のいずれか 1 に記載の検査手段。

8 . 脂質成分がコレステロールであることを特徴とする請求項 7に記載の検査手段。

9 . 請求項 1 〜 8のいずれか 1 に記載の検査に必要な試薬をキット化または単品で構成してなる検査用試薬。