WO2002002136A1 - Constituants medicinaux comportant de l'hormone parathyroidienne humaine et compositions medicinales pour l'administration nasale contenant lesdits constituants - Google Patents

Constituants medicinaux comportant de l'hormone parathyroidienne humaine et compositions medicinales pour l'administration nasale contenant lesdits constituants Download PDF

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acetic acid
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peptide
aqueous solution
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Yoshiharu Minamitake
Tetsu Ono
Kouji Kawanishi
Yuji Suzuki
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Suntory Limited
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    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides

Definitions

  • the present invention relates to a medicinal component of human parathyroid hormone, which has good stability and excellent feeling when used in a pharmaceutical composition.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for nasal administration of human parathyroid hormone used over a long period of time.
  • hPTH Human parathyroid hormone peptide
  • hPTH Human parathyroid hormone peptide
  • hPTH is a physiologically active peptide involved in bone metabolism and having a strong osteogenic effect (Aurbach et al., Recent Progr. Horm. Res., 1972, vol. 28, p35).
  • hPTH is a peptide usually composed of 84 amino acid residues in vivo (hereinafter referred to as hPTHU-84).
  • hPTH a derivative of hPTH composed of 34 amino acid residues from amino acid numbers 1 to 34 of hPTH (hereinafter referred to as hPTH (1 to 34)) has the same pharmacological action as hPTH (l-84).
  • hPTH hPTH
  • hPTH hPTH
  • hPTH While calcitonin and bisphosphonate, which are used as osteoporosis treatment drugs, exert their therapeutic effects by suppressing bone resorption, hPTH (l-84) and hPTH (l-34) provide bone formation and It is expected to be a novel therapeutic agent for osteoporosis by promoting associated bone metabolism (Lane et al., J. Clin. Invest, 1998, vol.102, pl627-1633).
  • hPTH (l-34) increases bone mineral density in humans by subcutaneous administration once a week. However, it has already been reported that subcutaneous administration of 1/5 of the same dose for 5 days daily significantly increases bone mineral density (Sone et al., Miner Electrolyte Metab, 1995, vol. 21). , P232-235). In addition, animal studies have shown that the increase in bone mineral density by divided subcutaneous administration is greater than that by weekly subcutaneous administration (Tawaragi et al., Osteoporosis International, Vol. O, suppl 1, 1996, 245), the therapeutic effect of hPTH is considered to be maximized by daily administration of small doses. Therefore, in view of the gastrointestinal and circulatory side effects that occur when high doses of hPTH are administered, fractional administration, which can be expected to be effective with a small dose, is desirable.
  • Injections are administered under the supervision of a physician, and given pain and other discomfort, patients are forced to go to the hospital and the burden is large. It is not desirable as a necessary therapeutic agent for osteoporosis.
  • a nasal drug which is a preparation that can be administered easily at home without pain and without any burden on patients at home.
  • nasal drugs used for long-term continuous administration show good nasal absorption and, at the same time, have no irritation to the nasal mucosa. It is essential that the user feel good. In particular, good feeling of use is extremely important for nasal drugs such as hPTH, which can be expected to have a therapeutic effect after long-term administration. Therefore, in the preparation of nasal drugs that are acceptable for continuous administration over a long period of time, optimization of the types, concentrations, and combinations of the drugs and their salts, additives, etc. is extremely important and affects the usability. The types and concentrations of chemicals and additives used are limited in terms of odor and irritation.
  • hPTH parathyroid function diagnostic agent (teriparatide acetate: general Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.), there is an injection of pentaacetic acid salt of hPTH (l-34), but there is no nasal drug that satisfies the feeling of use from odor and irritation.
  • the gazette regarding the purified product of hPTH (l-34), it is difficult to obtain a product having a constant acetic acid content because the acetic acid content due to the mixing of acetic acid used in the purification process varies greatly depending on the production lot. Further, it is described that the activity is reduced.
  • a powder composition for nasal administration using a water-soluble organic acid has been reported with regard to the absorption of hPTH (l-34) when a bioactive peptide is used as a nasal drug. (Kaihei 2-111). However, depending on the type or content of the organic acid, these components directly irritate the nasal mucosa and are not suitable for intranasal administration.
  • a nasal drug for hPTH that can be used for a long time
  • a drug product designed with a formulation that satisfies not only stability and absorbability but also a good feeling of use has not yet been developed.
  • the present inventors conducted intensive studies with an object of providing a pharmaceutical composition for nasal administration, and found that hPTH caused an acid odor and irritation upon intranasal administration, and did not satisfy the feeling of use.
  • the present inventors have found that the composition has good compound-changing properties in which various other functional components can be appropriately compounded, and have completed the present invention. That is, the present invention relates to a pharmaceutical component comprising hPTH and acetic acid in a stoichiometric amount less than hPTH.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising hPTH as an active ingredient, which comprises a pharmaceutical ingredient comprising hPTH and a acetic acid in a stoichiometric amount less than hPTH.
  • hPTH as an active ingredient
  • Figure 1 shows the results of reversed-phase HPLC micrography after storing hPTH (l-34) with an acetic acid content of 9.5% at 40 ° C for 6 months.
  • Figure 2 shows the results of reversed phase HPLC chromatography after storing 2.9% hPTH (l-34) at 40 ° C for 6 months.
  • Figure 3 shows the amounts of degraded (by-products) B and D after storing hPTH (l-34) with various acetic acid contents at 80 ° C for 15 hours.
  • FIG. 4 shows the purity of hPTH (l-34) after storing hPTH (l-34) having various acetic acid contents at 80 ° C for 15 hours.
  • FIG. 5 shows the results of reversed-phase HPLC micro chromatography after storing hPTH (l-84) having an acetic acid content of 12.3% at 80 ° C. for 15 hours.
  • Figure 6 shows the amount of decomposition (by-product) produced after storing hPTH (l-84) with various acetic acid contents at 80 ° C for 15 hours.
  • FIG. 7 shows the purity of hPTH (l-84) after storing hPTH (l-84) having various acetic acid contents at 80 ° C for 15 hours.
  • hPTH is a peptide which is involved in bone metabolism, has a strong osteogenic effect and has a serum calcium increasing effect, and is a natural type hPTH having 84 amino acid residues (l-84) Or a derivative thereof.
  • hPTH (l-84) (Biochemistry 17,5723 (1978), Kimura et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., Vol.114, p493, 1983), hPTH (l-38) (Japanese Unexamined Patent Publication No.
  • hPTH (l- 34) (JP-A 9-29600 discloses, Takai et al., Peptide Chemistry, 1979, pl87) , hPTH (l-34) NH 2 ( JP 58- 96052 JP) , [Nle 8 '18] hPTHU -34), [Nle 8' 18, Tyr 3 4] hPTH (l-34) ( JP 55- 113753 discloses), [Nle 8 '18] hPTH (1- 34 ) NH 2 (JP 61- 24598 JP), [Nle 8 '18, Tyr 34] PTH (l-34) NH 2 ( JP 60 - 34996 JP), hPTH (l-37) ( Patent Table 5-505594), hPTH (2-84), hPTH (3-84), hPTH (4-84), hPTH (5-84), hPTH (6-84), hPTH (7-84) And hPTH (8-8-8
  • bioactive peptides are purified by column chromatography when produced by genetic engineering technology or chemical synthesis technology.However, since basic peptides such as hPTH are adsorbed on column resin, adsorption is not possible. Acids are used as eluents to avoid or increase solubility. In addition, in order to obtain a peptide for the purpose of formulation, the peptide must be used as a lyophilized pharmaceutical drug substance, and the acid used as the eluate is volatile. The possible acids are limited.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid have high acidity even at low concentrations, cause side reactions such as hydrolysis, and are also suitable because the acids themselves are corrosive. Absent.
  • organic acids trifluoroacetic acid, formic acid, and acetic acid, which have a low boiling point, can be used, but trifluoroacetic acid is not preferable as a pharmaceutical ingredient in terms of safety, and formic acid has a reducing property, and is not used. Limited and not suitable for peptides such as hPTH.
  • acetic acid which is a weak acid, is the most suitable as a pharmaceutical ingredient in terms of both safety and chemical properties, and is an indispensable acid for the final purification of basic peptides.
  • an eluate containing acetic acid is suitably used in a purification step using reversed-phase high-performance liquid column chromatography (reverse-phase HPLC) or molecular sieving force chromatography. Since acetic acid is used at a concentration at which hPTH does not adsorb to the ram, basic amino acid residues are contained in the sample and the peptide fraction eluted with the acetic acid aqueous solution and in the lyophilized composition thereof. More acetic acid than salt-forming amount remains as a salt or deposit with hPTH.
  • acetic acid is present in the medicinal component of hPTH in the form of both salts and deposits with hPTH. Therefore, since acetic acid is a volatile substance, it is difficult to keep the acetic acid content in the lyophilized composition constant due to differences in freeze-drying conditions, differences in acetic acid concentration or hPTH concentration in the lyophilized stock solution, etc. Met.
  • the pharmaceutical ingredient of the present invention is composed of hPTH and acetic acid having reduced acetic acid content, which is present as a salt or an adhering substance with hPTH, and is used for the stability of hPTH and a pharmaceutical composition according to the ingredient. Improvement in usability during use is obtained by reducing the amount of acetic acid.
  • reduced acetic acid is defined as a stoichiometric amount of acetic acid.
  • hPTH (l-34) Since hPTH (l-34) has 9 basic amino acids (including triflate residues) in the molecule, it can form a salt with up to 9 monovalent acids (such as acetic acid). But the acidic amino acid residue in the hPTH (l-34) molecule Since 4 residues can form a salt in the molecule of hPTH (l-34), in the hPTH (l-34) of the present invention, 5 basic amino acid residues are converted to a chemical equivalent of acetic acid.
  • acetic acid weight X 100 (%) / hPTH peptide weight is used for the acetic acid amount with respect to hPTH
  • chemical equivalent of acetic acid with respect to hPT11 (1-34) is about 7. 3% (% by weight, the same applies hereinafter).
  • hPTH (l-84) of the present invention contains 19 residues of basic amino acid (including tributanphan residue) and 12 residues of acidic amino acid, so that hPTH (l-84) of the present invention can be obtained.
  • seven basic amino acid residues are used as the stoichiometric equivalent of acetic acid.
  • the acetic acid content represented by the formula I is used for the amount of acetic acid with respect to hPTH (l-84), the chemical equivalent of acetic acid with respect to hPTH (l-84) is about 4.5%.
  • the acetic acid having less than the chemical equivalent means acetic acid having a acetic acid amount less than the acetic acid amount that forms a salt with hPTH, excluding the acetic acid amount present as an adhering substance.
  • the present invention provides a stable pharmaceutical ingredient of hPTH by controlling the acetic acid content, and a pharmaceutical composition for nasal administration containing the pharmaceutical ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical component of hPTH having a fixed acetic acid content by controlling the acetic acid content, and a pharmaceutical composition for nasal administration containing the pharmaceutical component.
  • peptides are generally unstable in solution, lyophilized products are used as pharmaceutical ingredients as pharmaceutical ingredients, but peptides containing volatile acetic acid as a salt component, such as hPTH, are used as pharmaceutical ingredients.
  • the 'pharmaceutical component' obtained by freeze-drying from an aqueous solution or dilute acetic acid solution had an inconsistent acetic acid content, and had a problem in production.
  • the present invention is to provide a pharmaceutical component of hPTH having a stable and constant acetic acid content by producing an hPTH aqueous solution with reduced acetic acid, which is advantageous from the viewpoint of production stability. .
  • the acetic acid content is less than the chemical equivalent to hPTH.
  • the acetic acid content is about 7.3 ° / hPTH (l-34).
  • the acetic acid content in the case of hPTH (l-84) is less than about 4.5% with respect to hPTH (l-84), and is about 3.0% or less in terms of stability and use, and production stability. In view of the above, about 0.1% or more is preferable.
  • the pharmaceutical component of the present invention can be produced by a known method or a method analogous thereto.
  • the amount of acetic acid contained as a salt with or adhering to hPTH is reduced in the purification process of hPTH obtained by genetic engineering technology, chemical synthesis technology, etc., in dialysis, electrodialysis, ion exchange chromatography, molecular sieve column chromatography. It can be performed by applying a known method such as chromatography or reversed-phase HPLC.
  • the hPTH solution having an arbitrary acetic acid content can be adjusted by measuring the pH of the solution or directly measuring the acetic acid content.
  • the acetic acid content is adjusted according to the relationship with the pH of the hPTH aqueous solution.
  • an aqueous solution of hPTH obtained by a genetic engineering technique or a chemical synthesis technique in a cylindrical dialysis membrane having a low molecular weight, or the aqueous solution is, for example, an aqueous sodium hydroxide solution or an aqueous ammonia solution.
  • the acetic acid is removed by confining the hPTH aqueous solution adjusted to pH 5 to 9 with a similar pressure and performing dialysis by simple diffusion against water. For example, vinegar For hPTH (l-34) with an acid content of about 2%, continue to obtain the pH of the external dialysate until the pH reaches about 6.5.
  • an aqueous solution of hPTH obtained by genetic engineering technology or chemical synthesis technology, or the aqueous solution is adjusted to a pH of 5 to 9 with an aqueous solution such as a sodium hydroxide aqueous solution or an aqueous ammonia solution.
  • an aqueous solution such as a sodium hydroxide aqueous solution or an aqueous ammonia solution.
  • hPTH having a constant acetic acid content can be produced.
  • hPTH (l-34) having an acetic acid content of about 2% is obtained by continuing electrodialysis until the pH of the dialysate becomes about 6.5.
  • acetic acid is bound and adsorbed to a basic ion-exchange resin to remove acetic acid.
  • a basic ion-exchange resin column such as quaternary ammonium resin or secondary ammonium resin
  • acetic acid is added to the resin.
  • hPTH By obtaining a non-adsorbed fraction that has been ionically bound and passed through the column, hPTH with reduced acetic acid content can be produced.
  • hPTH By changing the amount of ion exchange resin with respect to hPTH, hPTH having a constant acetic acid content can be produced.
  • hPTH (l-34) with an acetic acid content of about 2% is obtained by selecting the amount of resin that makes the pH of the eluate about 6.5.
  • an aqueous solution of hPTH obtained by genetic engineering technology or chemical synthesis technology is applied to the molecular sieve column, or an aqueous solution such as sodium hydroxide aqueous solution or aqueous ammonia solution is added to the aqueous solution.
  • Add the hPTH aqueous solution adjusted to pH 5 to 9 with The acetic acid is removed as an inorganic salt by eluting with an aqueous solution containing an organic solvent such as cetonitrile.
  • hPTH (l-34) with an acetic acid content of about 2% is obtained by adjusting the pH of the hPTH aqueous solution added to the column to about 6.5 and collecting the eluted fractions of hPTH (l-34).
  • the pH of aqueous solution of hPTH obtained by genetic engineering technology or chemical synthesis technology, or the pH of this aqueous solution is adjusted by using an aqueous solution such as sodium hydroxide solution or ammonia solution. Adjust to ⁇ 9.
  • an aqueous solution such as sodium hydroxide solution or ammonia solution. Adjust to ⁇ 9.
  • the inorganic salt components are eluted using, for example, water as an eluent.
  • the adsorbed hPTH is dissolved in an aqueous solution containing an organic solvent such as acetonitrile, whereby hPTH having a reduced acetic acid content is obtained.
  • hPTH having a certain acetic acid content can be produced.
  • acetic acid may be added after removing acetic acid excessively, for example, in a limited amount, to obtain hPTH having a constant acetic acid content.
  • concentration of hPTH (l-34) solution from which acetic acid was excessively removed was diluted to 10 mg / mL with water, and acetic acid was added to a pH of about 6.5. (l-34) Obtain solution.
  • the pharmaceutical component of the present invention can be obtained by freeze-drying the hPTH aqueous solution obtained by each of the above methods and the like by a usual method.
  • the pharmaceutical component may contain at least one of a water-soluble organic acid, preferably at least one of citric acid, adipic acid and dalicholic acid, and a salt or adhering substance with hPTH. Alternatively, it may be contained as an additive.
  • Pharmaceutical components further containing these organic acids have good stability and are suitable for use in drugs for administration routes other than injection, particularly when used in the pharmaceutical composition for nasal administration of the present invention. To the feeling Are better.
  • the pharmaceutical component of the present invention can be used as a component of a pharmaceutical composition for nasal administration used over a long period of time.
  • the pharmaceutical composition for nasal administration of the present invention has good compound-changing properties
  • carriers, excipients, thickeners, preservatives, stabilizers, and antioxidants which are commonly used in formulation are used.
  • various other functional components can be appropriately compounded for the purpose of improving absorption, stabilizing solids, and the like.
  • carriers and excipients are those that are water-soluble or poorly soluble, such as saccharides, polysaccharides, dextrins, celluloses, synthetic or semi-synthetic polymers, amino acids, Examples include polyamino acids, proteins, and phospholipids.
  • saccharides examples include D-mannitol, glucose, lactose, fructose, inositol, shonan, maltose, etc., and polysaccharides such as dextran, pullulan, Alginic acid, hyaluronic acid, pectic acid, phytic acid, phytin and the like can be mentioned.
  • the dextrins include cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, dextrin, hydroxypropyl starch, and hydroxyshetil. Starch and the like.
  • cenorelloses include methinoresenorelose, ethylsenolace mouth, hydroxykisechinoresenorelose, hydroxypro pinoresenorelose, hydroxypro pinorelemo chinoresenorelose, and canolepoximetinorelosole. And the like.
  • Synthetic and semi-synthetic polymers include polyvinyl alcohol, carboxyvinyl polymer, polyethylene glycol, polyvinylinolepyro Ridon (PVP), sodium polyacrylate, polylactic acid, and the like.
  • amino acids examples include glycine and taurine
  • polyamino acids examples include polyglutamic acid, polyaspartic acid, polydaricin, and polyleucine.
  • proteins examples include gelatin and the like.
  • Other examples include chitin and chitosan.
  • sonolevic acid shionidenza benzanoreconidum, shionidani cetinorepiridium, benzethonium chloride or methyl parahydroxybenzoate, ethyl parahydroxybenzoate, propyl parahydroxybenzoate, butyl parahydroxybenzoate, paraoxyl Parabens such as isobutyl benzoate, arabic gum, sorbite, magnesium stearate, talc, silica, crystalline cellulose, starch, calcium phosphate, vegetable oil, carboxymethylcellulose, sodium lauryl sulfate , Water, ethanol, glycerin, syrup, etc. can also be used.
  • surfactant examples include nonionic surfactants such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, and sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, glycerin monomitrate, and the like.
  • Glycerin fatty acid esters such as glycerin monostearate; polyglycerin fatty acid esters such as decaglyceryl monostearate, decaglyceryl distearate, decaglyceryl monolinoleate; polyoxyethylene sorbitan Mono laurate, polyoxyethylene sonolebitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbonotan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan trioleate, polyoxyethylene sorbitan Polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as restearate; polyoxyethylene sorbite fatty acid esters such as polyoxyethylene sorbite tetraoleate; polyoxyethylene sorbite fatty acid esters; and polyoxyethylene glyceryl monostearate Polyoxyethylene daliserine fatty acid ester; Polyethylene dalicol fatty acid ester such as polyethylene dali call distearate; Polyoxyethylene lauryl Polyethylene
  • Polyoxyethylene urenolequinolephenynoreatenore Polyoxyethylene castor oil, Polyoxyethylene hydrogenated castor oil (polyethylene hydrogen castor oil), etc.
  • Oxyethylene hydrogenated castor oil Polyoxyethylene sorghum derivatives such as polyoxyethylene sonolevite smelt; Polyoxyethylene slag such as polyoxyethylene lanolin Norrin derivatives; polyoxyethylene fatty acid amides such as polyoxyethylene stearate amides and the like having HLB 6 to 18; anionic surfactants, for example, sodium cetyl sulfate, lauryl sulfate Alkyl sulfate having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as sodium and sodium oleyl sulfate; average of ethylene oxide such as sodium polyoxyethylene lauryl sulfate Number of carbon atoms of alkyl group with addition mole number of 2 to 4 A polyoxyethylene alkyl ether sulfate having an alkyl group of 10
  • sulfur-containing reducing agent examples include N-acetyl cysteine, N-acetyl phomocystin, thioic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and salts thereof, sodium thiosulfate, Examples thereof include those having sulfhydryl groups such as daltathione and thioalkanoic acids having 1 to 7 carbon atoms.
  • antioxidants include erythorbic acid, dibutyl hydroxytoluene, p-tinole hydroxyanisolone, a- tocopherolone, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and its salts, and L-ascorbic acid. Palmitate, L-ascorbate stearate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or ethylene sodium diammonium tetranitrate (EDTA), sodium pyrrolinate, metallin Chelating agents such as sodium acid.
  • EDTA ethylene sodium diammonium tetranitrate
  • the ratio of each component in the pharmaceutical composition of the present invention is about 0.01 to 20% h PTH, preferably about 0.05 to: L0%, and an organic acid can be added as needed. Is about 0.05 to 99.5%, preferably about 0 :! to 99.0%, and components such as carriers, excipients and the like usually used for formulation are added as necessary. Can be used, e.g. about 0. 01 to 99.5%. In addition, various other functional components can be added as needed, and when used, for example, it is about 0.05 to 99.5%.
  • the pharmaceutical composition for nasal administration of the present invention can be prepared according to a known method.
  • the pharmaceutical component of hPTH in which acetic acid has been reduced may be used as a pharmaceutical composition as it is, or a carrier or excipient that is generally used in the preparation of a pharmaceutical component of hPTH in which acetic acid has been reduced may be used as necessary.
  • a component such as a fixative, an organic acid or various functional components may be added and blended for use as a pharmaceutical component.
  • the compounding can be carried out by replacing the organic acid with acetic acid or by adding it.
  • the pharmaceutical components of hPTH and, if necessary, components such as carriers and excipients that are commonly used in formulation are once dissolved in distilled water and lyophilized, and then, if necessary, organic acids or various functions are added.
  • a homogeneous composition can also be obtained by dissolving the active ingredients together and lyophilizing.
  • the pharmaceutical component of hPTH and the organic acid or various functional components are once dissolved in distilled water and freeze-dried, and then, if necessary, the components such as carriers and excipients commonly used in formulation are combined. By melting and freeze-drying, a uniform composition can be obtained.
  • the pharmaceutical ingredient of the present invention can be formulated into various dosage forms according to the administration method, and can be formulated into a dosage form capable of mucosal administration such as rectum, nasal cavity, and oral cavity.
  • the pharmaceutical composition for nasal administration of the present invention is preferably administered in the form of a nasal drug.
  • a preferred example of the pharmaceutical composition for nasal administration according to the present invention is lyophilized
  • the medicinal component of the present invention provided as a composition is contained in a freeze-dried part, and a dissolution-in-use preparation to which a solution part is attached is mentioned.
  • the above-mentioned organic acids and organic acids such as citric acid, adipic acid, and dalicholic acid as absorption enhancers are used in the lyophilized part as a salt or adhering substance with hPTH or as an additive. Alternatively, it may be used after being added or dissolved in a solution portion.
  • the administration of the pharmaceutical composition for nasal administration of the present invention can be performed according to a known method.
  • the pharmaceutical composition for nasal administration of the present invention can be used, for example, in the form of a formulation used as a nasal drug.
  • a sprayer is attached to a container containing the pharmaceutical composition, and the tip of the nozzle is put into the nasal cavity to spray the nasal cavity.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the type of disease, the age, weight, degree of symptoms and the administration route of the patient.
  • hPTH hPTH
  • 1 It can be administered once a day or divided into several times a day, and it is preferable to administer a single dose of hPTH (l-34) in the range of 10 to 5000 ⁇ g. Also, once the drug is stopped, it can be administered again depending on the symptoms.
  • test methods and instruments used in this example were as described below unless otherwise specified.
  • Reverse-phase HPLC was performed using the following equipment and conditions to search for peptide content and degradation (by-product).
  • the amount of acetic acid in the dialysate and the freeze-dried product was determined under the following ion-exchange HPLC conditions.
  • the masses of hPTH, the degradation product (by-product) of hPTH and its enzyme digest were determined using the following equipment and conditions.
  • the following equipment was used for amino acid composition analysis of hPTH, the degradation (by-product) of hPTH, and its enzyme digest.
  • the samples were stored in the following storage under each temperature condition.
  • DNA encoding a ⁇ -galactosidase derivative derived from Escherichia coli and DNA encoding hPTH (34) were ligated with a linker containing a cleavage motif (Lys-Arg) of the processing enzyme Kex2.
  • An expression plasmid pG117S4HPPH34 Japanese Unexamined Patent Publication No. 9-29660 containing a gene coding for a chimeric protein of hPTH (1-34) ligated with DNA to be ligated was used to transform E. coli M25 strain, ff3110 / ompT: Sugimura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 153, 1988, p753-759) and transformed E. coli M25 strain was cultured in a 20-L culture tank using a medium containing 2% yeast extract.
  • the mixture was crushed using a modifier (Manton-Gaullin), centrifuged, and washed to obtain about 625 mL of a suspension containing about 100 g of an inclusion body of the chimeric protein.
  • a modifier Manton-Gaullin
  • the solution was diluted to 5 L with deionized water, after which the 250 mM CaCl 2 was added 50 mL, a derivative of Kex2 flop port Teaze consisting amino acid numbers 1 to 6 6 0 of Kex2 protease Kex2- 660 ( (JP-A-10-229884) was added at a concentration of 20 kU / mL or more, and the mixture was gently stirred for 2 hours to cut out hPTH (34) from the chimeric protein.
  • the reaction solution was adjusted to pH 6.4 with acetic acid, and the reaction solution was further diluted 2-fold with deionized water to precipitate unreacted chimeric protein and the 3-galatatosidase derivative.
  • the supernatant containing hPTH (1-34) was obtained.
  • the supernatant was adjusted to pH 5.0 with acetic acid, adsorbed on a cation exchange resin (SP Toyopearl, manufactured by Tosoh Corporation) previously equilibrated with sodium acetate buffer, and 10 mM sodium acetate was added. After washing with buffer, a fraction containing 6.0 g of hPTH (1-34) with 0.4M NaCl was obtained.
  • Acetic acid was added to this fraction to 3 v / v%, and added to a low-pressure reversed-phase 0DS (Soken0DS-W, Soken Chemical Co., Ltd.) column previously equilibrated with 3 v / v% acetic acid.
  • hPTH (l-34) was eluted with 30 v / v% acetonitrile containing / v% acetic acid.
  • the eluate containing hPTH (l-34) is concentrated under reduced pressure, added to a reversed-phase HPLC column (TSKgelODS120T, 55 mm x 600 mm, manufactured by Tosoh Corporation), and the flow rate is 40 mL / min for 60 minutes at 5, v / v.
  • the concentration of acetonitrile in v% acetic acid was varied linearly from 16% to 32% to elute hPTH (l-34), and the purified fraction containing 4g of hPTH (l-34) was eluted. Obtained.
  • the remaining 60 g of inclusion bodies were treated in the same manner, and the purified fractions containing 5 g of hPTH (l-34) obtained in the same manner were combined, and acetonitrile was distilled off under reduced pressure to obtain 5 v / v%.
  • the hPTH (l-34) concentration was adjusted to 10 mg / mL with acetic acid. Each 15 mL of this solution was filled in a glass vial and freeze-dried to obtain 9 g (150 mg x 60) of hPTH (l-34).
  • the molecular weight and amino acid composition of this substance are as shown below, and it was confirmed that this substance was hPTH (l-34).
  • ESI-MS 4117.7 (theoretical 4117.8), amino acid composition after hydrolysis of 6 N hydrochloric acid: Asx; 4.0 (4), Ser; 2.6 (3), Glx; 4.9 (5), Gly; 1.0 (1 ), Val; 3.0 (3), Met; 2.0 (2), Ile; l. 0 (1), Leu; 5, Phe; 1.1 (1), Lys; 30 (3), His; 3.0 (3), Arg; 2.0 (2), Trp; Not detected (1).
  • the cells were cultured in a 200-L culture tank. Cell concentration is 0D 66. Continue culturing until the cell concentration reaches 160, and disrupt the cells using a high-pressure homogenizer in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.2) containing 1 mM EDTA, centrifuge, and wash. Through the process, about 10 suspensions containing about 5 kg of inclusion bodies of chimeric protein were obtained.
  • the eluate containing hPTHd-34) is concentrated under reduced pressure, filtered through a 0.22 m filter, and then applied to a reversed-phase HPLC column (TSK ODS 80Ts 20 ⁇ m, 105 ram ID x 550 mm, manufactured by Tosoh Corporation). Then, in the presence of 3 v / v% acetic acid, the product was purified by elution with an acetonitrile gradient. The eluted fractions were combined, and acetonitrile was distilled off under reduced pressure to obtain 10.4 L of a hPTH (l-34) solution containing 70 g of 99.6% pure hPTH (l-34).
  • Linker containing a cleavage motif (Lys-Arg) of Kex2 protease which is a processing enzyme for DNA encoding ⁇ -galactosidase derivative from E. coli and DNA encoding hPTH (1-84)
  • Plasmid pGP # 19 Japanese Unexamined Patent Publication No. 9-29600 containing the gene encoding the chimeric protein of hPTH (l-84), which is ligated with DNA encoding 3 and cultured at 7 ° C, culture medium turbidity colonies of E. coli M25 strain at fermentor 3 L (OD 6 6.) when the became 1, I isopropyl beta Chio galactosamine Toshido (IPTG) Was added to a final concentration of 1.0 mM.
  • IPTG I isopropyl beta Chio galactosamine Toshido
  • the culture was further continued for 4 hours, and the cells were collected by centrifugation and suspended in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0). French press The microbial cells were disrupted, and centrifugation and resuspension were repeated to wash and recover the inclusion bodies.
  • This suspension of the inclusion body is dissolved in 8.0 M urea, 10 mM Tris pH 8.0, and the centrifuged supernatant is loaded on a 100 mL QAE Toyopearl column (manufactured by Tosoh Corporation). Purified by 0-0.4 M gradient elution. The purified inclusion body solution was concentrated using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 10,000.
  • reaction solution composition 50 mM BisTris ⁇ 6.8, 1.0 mM CaC 12 , 5 mg / mL chimeric protein
  • Kex2-660 was added to 2 kU / mL.
  • the lyophilized product (hPTH (: L-34) 150 mg) obtained in Reference Example 1 was dissolved in distilled water (30 mL) to prepare a 5 mg / mL (pH 4.7) aqueous solution. This solution was distilled at room temperature against distilled water (100 mL) against an electrodialysis membrane AC-130-10 (Asahi Kasei). Electrodialysis was performed using a MicroAcilizer-1 G1 (Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.) equipped with Seiko Kogyo Co., Ltd. to remove acetic acid until the pH reached 5.0. A freeze-dried product containing about 150 mg of hPTH (l-34) and containing 4.8% acetic acid was obtained from the dialysate containing 6.8% acetic acid.
  • the decrease in acetic acid due to freeze-drying decreased with the decrease in acetic acid, and the difference in the decrease in acetic acid due to freeze-drying could be reduced due to the decrease in acetic acid. Therefore, the reduction of acetic acid is useful for producing a medicinal component of hPTH having a certain acetic acid content, which has been difficult.
  • Lyophilization was performed in the same manner as in (1), and the acetic acid content was quantified by ion exchange HPLC. Table 1 shows the results.
  • Lyophilization was performed in the same manner as in (1), and the acetic acid content was quantified by ion exchange HPLC. Table 1 shows the results.
  • Lyophilization was performed in the same manner as in (1), and the acetic acid content was quantified by ion exchange HPLC. Table 1 shows the results.
  • Lyophilization was performed in the same manner as in (1), and the acetic acid content was quantified by ion exchange HPLC. Table 1 shows the results.
  • the solution was dispensed so that 150 mg of hPTH (l-34) was contained per vial, and a freeze-dried product with acetic acid content of 2.5% containing 57.8 g of hPTH (1-34) (385 piar) was obtained. .
  • hPTH (l-34) 150 mg On the inner wall of a vial containing the freeze-dried product (hPTH (l-34) 150 mg ) obtained in Example (1), acetic acid of 3.78 was added with a micro syringe to hPTH (l-34). Was added without touching. After the acetic acid is volatilized in the vial at 80 ° C for 5 minutes, the vial is shaken with a vortex mixer to convert the hPTH (l-34) in the vial into a fine powder. hPTH (l-34) powder was obtained.
  • hPTH (l-34) 5.28 ⁇ L of acetic acid was added to hPTH (l-34) with a micro syringe on the inner wall of the vial containing the freeze-dried product (hPTH (l_34) 150 mg) obtained in this example (1). Added without touching. After volatilizing the acetic acid in the vial at 80 ° C for 5 minutes, shake the vial with a vortex mixer to convert the hPTH (l-34) in the vial into a fine powder, with an acetic acid content of 6.2%. hPTH (l-34) powder was obtained.
  • hPTH (l-34) 7.23 ⁇ L of acetic acid was added to hPTH (l-34) with a micro syringe on the inner wall of a vial containing the freeze-dried product (hPTHd-34) 150 mg) obtained in Example 4 (1). Added without touching. After volatilizing the acetic acid in the vial at 80 ° C for 5 minutes, shake the vial with a vortex mixer to convert the hPTH (l-34) in the vial into a fine powder, with an acetic acid content of 7.5%. hPTH (l-34) powder was obtained.
  • Example 4 obtained in lyophilized (hPTH (l - 34) 150 mg) inside wall surface of the vial containing the, hPTH acetic acid 9.48 mu L at a micro silicon down di (1-34 ) Was added without touching. After volatilizing the acetic acid in the vial at 80 ° C for 5 minutes, shake the vial with a Portex mixer to make the hPTH (l-34) in the vial into a fine powder. l-34) A powder was obtained.
  • Example 4 Lyophilized product obtained in Example 4 (1) (150 mg of hPTH (l-34)) 14.28 ⁇ L of acetic acid was added to the inner wall of the vial containing the microspheres without touching hPTH (l-34). After acetic acid is volatilized in the vial at 80 ° (5 minutes, shake the vial with a vortex mixer to convert the hPTH (l-34) in the vial into a fine powder. l-34) A powder was obtained.
  • Example 4 The lyophilized product (hPTH (l-34) 150mg) obtained in Example 4 (1) was put on the inside wall of a vial containing 16 mg of acetic acid, and then touched with hPTH (l-34) using a micro syringe. Was added so as not to be present. After volatilizing the acetic acid in the vial at 80 ° C for 5 minutes, shake the vial with a vortex mixer to convert the hPTH (l-34) in the vial into a fine powder. (1-34) A powder was obtained.
  • Example 4 100 ⁇ L of acetic acid was added to the inside wall of the vial containing the freeze-dried product (hPTH (l-34) 150 mg) obtained in Example 4 (1) using a micro syringe. Was added without touching. After volatilizing the acetic acid in the vial at 80 ° C for 5 minutes, shake the vial with a vortex mixer to convert the hPTH (l-34) in the vial into a fine powder, and remove the acetic acid content from 72.5% h. ⁇ (1-34) powder was obtained.
  • Example 6 After weighing 5.05 mg of the dried product obtained in Example 6 (1) in a 5-mL vial, 1.7 ⁇ l of a 10 vol% acetic acid / methylene chloride solution was added with a micro syringe to obtain an acetic acid content of 5.2. % Of the hPTH (l-84) component was obtained.
  • Example 6 After weighing 5.59 mg of the dried product obtained in Example 6 (1) into a 5-mL vial, 2.5 ⁇ L of a 10 vol% acetic acid / methylene chloride solution was added using a micro syringe, and the acetic acid content was 6.4%. % Of the hPTH (l-84) component was obtained.
  • Example 6 After weighing out 5 Olmg of the dried product obtained in Example 6 (1) into a 5 mL vial, add 10 vol% acetic acid / methylene chloride solution with a micro syringe to 3.0 / L, and add acetic acid content. 8.0% of the hPTH (l-84) component was obtained.
  • Example 6 After weighing 5.48 mg of the dried product obtained in Example 6 (1) into a 5-mL vial, 4.4 vol / L of a 10 vol% acetic acid / methylene chloride solution was added using a micro syringe, and the acetic acid content was 10.2%. % Of the hPTH (l-84) component was obtained.
  • Example 6 After weighing 5.47 mg of the dried product obtained in Example 6 (1) into a 5-mL vial, 5.5 ⁇ l of a 10 vol% acetic acid / methylene chloride solution was added with a micro syringe to obtain an acetic acid content of 12.3%. % HPTH (l-84) was obtained.
  • Example 6 After weighing 5.10 mg of the dried product obtained in Example 6 (1) in a 5-mL vial, 10.2 / zL of a 10 vol% acetic acid / methylene chloride solution was added with a micro syringe, and an acetic acid content of 22.9 was added. % HPTH (l-84) was obtained.
  • Example 6 (1) 5.53 mg of the dried product obtained in Example 6 (1) was placed in a 5-mL vial. After weighing, 16.6% of a 10 vol% acetic acid / methylene chloride solution was added with a micro syringe to obtain an hPTH (l-84) component having an acetic acid content of 33.6%.
  • Fig. 1 shows the reversed-phase HPLC chromatogram after storage.
  • B was found to be [N ⁇ -acetyl-Lys 13 ] -hPTH (l-34) and [N ⁇ -acetyl-Lys 26 ] -hPTH (Table 34).
  • C was [ ⁇ -acetyl-Ser-hPTHd-34) and D was [N ⁇ -acetyl-Lys 27 ] -hPTH (l-34) T ?.
  • Example 1 (3) the stability of the freeze-dried hPTH (l-34) product having a 2.9% sulfuric acid content obtained in Example 1 (3) was similarly examined.
  • a freeze-dried product containing about 150 mg of hPTH (l-34) filled in a glass vial and containing 2.9% of acetic acid was stored in Nagano Kagaku LH-30-14 storage at 40 C for 6 months.
  • Reversed phase HPLC was performed at the start of storage and after storage, and the decomposition (by-product) existing at the start of storage and the decomposition (by-product) generated after storage were isolated, and their structures were examined. Table 3 shows the results.
  • Fig. 2 shows the reversed-phase HPLC chromatogram after storage. From Figure 2 As is evident, the areas of peaks B, C and D all decreased compared to the lyophilized hPTH (l-34) containing 9.5% acetic acid. As shown in Table 3, the total area of peaks B, C, and D was 0.2% at the start of storage, similar to the lyophilized hPTH (l-34) with acetic acid content of 9.5%. However, after storage, it was 3.6%, which was significantly reduced as compared with 13.8% of a 1 ⁇ 111 (1-34) lyophilized product having an acetic acid content of 9.5%.
  • the acetyl group is a biodegradable product, and the acid which is present as a salt or an adhering substance reduces the stability.
  • the stability of hPTH was found to be improved. That is, it was shown that a pharmaceutical ingredient having good stability was provided by reducing the amount of acetic acid.
  • Peak ⁇ is a mixture Test example 2. Stability of hPTH (l-34) (2)
  • Example 4 After storing the samples having each acetic acid content obtained in Example 4 and Reference Example 4 at 80 ° C for 15 hours, 15 mL of distilled water was added with a syringe to dissolve, and decomposed (by-product) After storage, the purity was measured. Table 4 shows the results.
  • Figure 3 shows the amount (%) of acetyl-form (B, D) produced after storage at each acetic acid content.
  • Example 6 The pial containing the sample having each acetic acid content obtained in Example 6 and Reference Example 5 was left at room temperature for 1 minute to evaporate methylene chloride, and then stoppered. After storing these samples with various acetic acid contents at 80 ° C for 15 hours, 1 mL of distilled water was added with a syringe to dissolve, and the decomposition (by-product) and purity after storage were measured. Table 5 shows the results. Fig. 5 shows the reversed-phase HPLC chromatogram after storage for 15 hours, and Fig. 6 shows the amount of decomposed (by-product) generated (%) after storage at each acetic acid content.
  • hPTH ((84) increased with decreasing acetic acid content and increased at less than the chemical equivalent (acetic acid content of about 4.5%). From the above results, in the case of hPTH (l-84), decomposition products (by-products) not related to the acetic acid content are generated, but as in the case of hPTH (l-34), most of them are salts or attached with hPTH. It was shown that acetic acid present as a kimono is involved, that is, the reduction of acetic acid provides a medicinal ingredient having good stability.
  • the usability of the pharmaceutical component of hPTH during intranasal administration was examined.
  • the lyophilized product of hPTH (1-34) obtained in Reference Example 1 was dissolved in 0.6 w / v% aqueous citric acid solution or water (lOing / ml), transferred to a glass pipe with a screw, and manufactured by Paroa.
  • the spray nozzle (50 beta 1) is mounted, by spraying with 50 ⁇ ⁇ the nostril and evaluated the odor and irritation by intranasal administration (healthy adult males 12 persons).
  • the odor the degree to which the odor is felt is “acid odor”
  • odor is not recognized in citrate itself, so the odor in the medicinal component of hPTH is determined by converting acetic acid contained as a salt with hPTH (l-34) or adhering substance into acetic acid aqueous solution. was found to be a cause at concentrations that did not smell.
  • Example 2 a freeze-dried hPTH (l-34) product having an acetic acid content of 2.9% obtained in Example 1 (3), a 0.4 k aqueous solution of hPTH having a concentration of 5 mg / mL was prepared. Smell and irritation due to intranasal administration were evaluated (12 healthy adult men). Table 6 shows the results. As is evident from Table 6, odor and irritation were suppressed by the reduction of acetic acid, and it was shown that a pharmaceutical component having excellent feeling when used in a pharmaceutical composition was provided.
  • the freeze-dried product (hPTH (1-34) 300 mg) having an acetic acid content of 9.5% obtained in Reference Example 1 was dissolved in distilled water (30 mL) to prepare an lOmg / mL aqueous solution.
  • a micro-assembly (Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.) equipped with an electrodialysis membrane AC-130-10 (Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.) for this solution (PH4.7)
  • the solution was electrodialyzed at, and acetic acid was removed until the pH reached 5.0 (acetic acid content: 7.3%) to prepare an hPTH (l-34) aqueous solution.
  • acetic acid was removed until the pH reached 6.0 (acetic acid content: 2.9%) to prepare a hPTH (1-34) aqueous solution.
  • Acetic acid was removed until the pH reached 7.6 (acetic acid content 0.5%) to prepare an hPTH (l-34) aqueous solution.
  • Test example 6 Influence of various organic acids on hPTH stability
  • Acetic acid can be removed by the above-described method such as electrodialysis, but it is also possible by replacing acetic acid with another organic acid.
  • hPTH (l-34) contains 9 residues of basic amino acid and 4 residues of acidic amino acid, and is the amount that a positive charge of +5 forms a salt with the acid component in the whole molecule, that is, the chemical equivalent 1 5/2 moles of adipic acid (Mw. 146.14) per mole of hP TH (l-34) (Mw. And 5/3 moles of citric acid (Mw. 192.13) or 5 moles of glycolic acid (Mw. 76.05).
  • a 5 mg / mL aqueous solution of hPTH (l_34) was prepared using the lyophilized product of hPTH (l-34) having an acetic acid content of 2.9% obtained in Example 1 (3).
  • the purity of the lyophilized hPTH (1-34) containing 2.9% acetic acid was 92.7%, whereas the purity after storage was 92.7% with adipic acid. It was 93.9% for citrate and 90.3% for glycolate. Therefore, as well as the pharmaceutical component of hPTH in which acetic acid contained as a salt or a deposit with hPTH is reduced to less than the chemical equivalent, the pharmaceutical component obtained by adding adipic acid, cunic acid, or dalicholic acid is also excellent. It was shown to be a pharmaceutical composition having stability and satisfying both usability and stability.
  • acetic acid present as a salt with or adhering to hPTH was replaced with these organic acids to reduce the acetic acid content to obtain a similar pharmaceutical ingredient.
  • a pharmaceutical ingredient having good stability and excellent feeling when used in a pharmaceutical composition obtained by reducing the amount of acetic acid is used for the purpose of improving absorption. It was shown that the compound had a compound change property that was stable even when the acid was added.
  • Nasal absorption one of the important factors in designing nasal formulations, was investigated.
  • the nasal absorption effect of citric acid and ascorbic acid, which were confirmed to be organic acids with excellent usability in Test Example 4 was evaluated by the area under the one-hour curve of blood drug concentration (AU C) and bioavailability. did.
  • the lyophilized product of hPTH (l-34) having an acetic acid content of 2.9% obtained in Example 1 (3) was added with 0.3w / v%, 0.6w / v% ascorbic acid and 0.2w / v%, 0.3w / v%, 0.4w / v%, 0.6w / v% dissolved in aqueous solution of citric acid to prepare a 5 mg / mL peptide solution.
  • the lyophilized hPTH (l-84) with 0.9% acetic acid content obtained in Example 5 (4) was dissolved in a 0.6 w / v% aqueous solution of citric acid to prepare a 10 mg / mL peptide solution.
  • Example 5 the lyophilized hPTH (l-34) having an acetic acid content of 2.9% obtained in Example 1 (3) and the acetic acid content of 0.9% obtained in Example 5 (4) were used.
  • femoral artery tension is applied under pentoparbital anesthesia and 5 / z L of each sample solution or IOL (including benzalkonium chloride and sucrose) is administered into the left nasal cavity with a pipetman. did.
  • Blood was collected from the blood sample into a blood collection tube supplemented with an anticoagulant and an enzyme inhibitor, and centrifuged to obtain plasma.
  • concentrations of hPTH (l-34) and hPTH (1-84) in plasma were measured by the RIA method using an anti-PTH (1-34) antibody (manufactured by CHEMI CON INTERNATI ONAL INC.).
  • the sample solution was administered subcutaneously to the back of the rat with a syringe at a volume of 1 mL / kg, and the hPTH concentration in plasma was determined in the same procedure as for nasal administration.
  • the bioavailability was calculated as the ratio of hPTHU-34) to the subcutaneous injection AUC for 3 hours after administration, and for hPTH (l-84) up to 6 hours after administration. Table 9 shows the results.
  • the bioavailability for subcutaneous injection was 1.4% for hPTH (l-34) alone, whereas 0.3% / 0.6w / v% for hPTH (l-34).
  • the improvement was 5% to 10% and 12% to 19%, respectively.
  • the product was shown to be suitable for use as a nasal drug.
  • hPTH (l-34) concentration was 3.8 mg / mL (200 m.
  • JP purified water
  • the lyophilized hPTH (l-34) with 2.1% acetic acid content obtained in Example 2 as a pharmaceutical ingredient was weighed in an amount of 805 mg (powder weight), dissolved in 360 mL of purified water (JP), and reconstituted.
  • An aqueous solution with a hPTH (l-34) concentration of 2 mg / mL on a phase HPLC was prepared.
  • 1 g of mannitol (JP) was weighed and dissolved in 50 mL of purified water (JP) to prepare an aqueous mannitol solution.
  • the lyophilized hPTH (l-34) containing 2.1% acetic acid obtained in Example 2 as a pharmaceutical ingredient was weighed in an amount of 805 mg (powder weight), dissolved in 360 mL of purified water (JP), and reverse-phase HPLC. Prepare an aqueous solution with the above hPTH (l-34) concentration of 2 mg / mL did.
  • 5 g of mannitol (JP) was weighed and dissolved in 50 mL of purified water (JP) to prepare an aqueous mannitol solution.
  • Example 5 About 50 mg (powder weight) of the freeze-dried hPTH (1-84) acetic acid content of 2.5% obtained in Example 5 (2) as a pharmaceutical ingredient was added, and water for injection (JP) was added. A 2 mg / mL hPTH (l-84) aqueous solution was prepared on a 25-phase HPLC (25 mL)
  • Benzetonium chloride (JP) 0.35 g and adipic acid (JP) 21.0 g were weighed and dissolved in 3500 mL of purified water. This solution was dispensed into 3 mL bottles of polypropylene to prepare an attached solution.
  • Example 4 2.5% acetic acid frozen obtained in Example 4 (1) as a pharmaceutical ingredient
  • the dried product (6 vials, 900 mg of hPTH (l_34)) was dissolved in 18 mL of water for injection (JP) (50 mg / mL).
  • JP water for injection
  • 12 g of citric acid (JP) was dissolved in water for injection (JP) to make 100 mL (1.2 w / v% aqueous solution of citric acid).
  • a liquid preparation was prepared as follows.
  • good stability is achieved by reducing the amount of acetic acid.
  • a medicinal component having an excellent feeling when used in a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical component of the present invention can be appropriately mixed with various other functional components, as well as components such as carriers and excipients, which are usually used in the formulation, and is used in pharmaceutical compositions of various dosage forms. It is applicable to various dosage forms.
  • a pharmaceutical composition for nasal administration which is used for a long period of time.

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Description

明 細 書 ヒ ト副甲状腺ホルモンの医薬用成分および該成分を含有する経鼻投 与用医薬組成物 発明の分野
本発明は、 良好な安定性を有し、 かつ、 医薬組成物に使用される とき使用感に優れたヒ ト副甲状腺ホルモンの医薬用成分に関する。 また、 本発明は、 長期に渡って使用されるヒ ト副甲状腺ホルモンの 経鼻投与用医薬組成物に関する。
背景技術
ヒ ト副甲状腺ホルモンペプチド （以下、 hPTHという） は、 骨代謝 に関与し、 強い骨形成効果を有する生理活性ペプチドである （Aurb achら、 Recent Progr. Horm. Res. , 1972年、 28卷、 p35) 。 hPTHは、 生体内では通常 8 4個のアミノ酸残基で構成されるペプチドである (以下、 hPTHU- 84)という） 。 また、 hPTHのアミノ酸番号 1〜 3 4 の 3 4個のアミ ノ酸残基で構成される hPTHの誘導体 （以下、 hPTH( 1-34)という） も hPTH(l-84)と同様の薬理作用を有していることが 知られてレヽる （Tregearら、 Hoppe-Seyler's Z. , Physiol Chem,1974 ,νοΐ.355,ρ415) 。 hPTH(l-84)及び hPTH(l_34)のアミノ酸配列を配 列表にそれぞれ配列番号 ： 1及び 2 と して示す。
骨粗鬆症治療薬として使用されているカルシ トニン、 ビスフォス フォネー トなどが骨吸収を抑制することで治療効果を発揮するのに 対し、 hPTH(l- 84)や hPTH(l-34)は骨形成とそれに伴う骨代謝を促進 することによ り新規な骨粗鬆症治療薬として期待されている （Lane ら、 J. Clin. Invest, 1998, vol.102 ,pl627~ 1633) 。
hPTH(l- 34)は、 ヒ トにおいて週 1 回の皮下投与で骨塩量の増加を もたらすが、 同用量の 5分の 1 を連日 5 日間分割皮下投与しても有 意に骨塩量を増加させることが既に報告されている （Soneら、 Mine r Electrolyte Metab， 1995， vol.21， p232〜 235) 。 また、 分割皮下 投与による骨塩量の増加は、 週 1回の皮下投与による骨塩量の増加 より大きいことが動物実験で示されていることより （Tawaragiら、 Osteoporosis Inter national, Vol. o, suppl 1 , 1996 , 245) 、 hPTHの 治療効果は少量を連日投与することで最大に発揮されるものと考え られる。 従って、 hPTHの高用量を投与したときにみられる消化器、 循環器への副作用の面からも、 少ない用量で薬効が期待できる分割 投与が望ましい。
また注射剤は、 医師の管理下において投与されること、 また、 痛 みなどの苦痛が伴う ことを考えた場合、 患者は通院を強いられ、 負 担が大きいこと等から、 長期に渡る治療が必要な骨粗鬆症の治療薬 として好ましくない。
そこで、 痛みを伴わず、 また、 患者に負担なく在宅で簡便に連日 投与可能な製剤である、 経鼻薬の開発が望まれている。
しかしながら、 鼻粘膜は薬剤や添加物の刺激から障害を受けやす いため、 長期に渡る連続投与に使用される経鼻薬には、 良好な経鼻 吸収を示すと同時に、 鼻粘膜に対する刺激がなく投与時の使用感が 良いことが必須である。 特に、 使用感の良さは長期投与で治療効果 が期待できる hPTHのような薬物の経鼻薬には極めて重要である。 従 つて、 長期に渡る連続投与に認容できる経鼻薬の調製には、 薬剤お よびその塩類、 添加物などの種類、 濃度、 それらの組み合わせの最 適化が極めて重要であり、 使用感に影響する要素として挙げられる 臭いや刺激の点から、 使用する薬剤、 添加物の種類、 濃度は制限さ れる。
hPTHについては、 副甲状腺機能診断薬 （酢酸テリパラチド ： 一般 名、 旭化成工業株式会社製） として、 hPTH( l- 34)の 5酢酸塩の注射 剤があるが、 臭いや刺激から使用感を満足する経鼻薬は存在しない 一方、 特開昭 64- 16799号公報には、 hPTH( l- 34)の精製品について 、 精製工程に用いた酢酸の混入による酢酸含量が製造ロッ トにより 大きく変化して一定の酢酸含量を有する製品を得ることは困難であ り、 しかも活性が低下することが記載されている。
同公報では、 hPTH( l-34)の安定性を改善することを課題と して、 酒石酸を用いた hPTH( l-34)の凍結乾燥組成物が報告されている。 し かしながら、 酒石酸は、 酸性度が高く、 鼻腔内投与には適していな レヽ
hPTH( l- 34)について経鼻薬として生理活性べプチドを使用する場 合の吸収性を課題と して、 水溶性有機酸を用いた経鼻投与用粉末組 成物が報告されている （特開平 2- 111号公報） 。 しかしながら、 有 機酸の種類またはその含量によっては、 これらの成分が直接鼻粘膜 を刺激し、 鼻腔内投与に適さない。
このよ うに、 長期に渡って使用可能な hPTHの経鼻薬として、 安定 性と吸収性に加え、 良好な使用感をも満足する処方により設計され た製剤は未だ開発されていない。
発明の開示
本発明は、 良好な安定性を有し、 かつ、 医薬組成物に使用される とき使用感に優れた hPTHの医薬用成分の提供を目的とするものであ る。 また、 本発明は、 長期に渡って使用される hPTHの経鼻投与用医 薬組成物の提供を目的とするものである。
そこで、 本発明者らは、 経鼻投与用医薬組成物の提供を課題とし て鋭意研究を行い、 hPTHが鼻腔内投与時に酸臭と刺激を生じ使用感 を満足せず、 またその原因が精製工程で用いられ、 hPTHとの塩また は付着物として微量に存在する酢酸であるとの知見を得て、 酢酸含 量を減じた医薬用成分を取得してこれを評価した結果、 驚くべきこ とに該成分が良好な安定性を有し、 また該成分が医薬組成物に使用 されるとき使用感に優れ、 さらに製剤化に際し通常用いられる担体 、 賦形剤等の成分はもとより、 吸収改善、 固体安定化等を目的と し て種々の他の機能性成分を適宜配合することができる良好な配合変 化特性を有することを見い出し、 本発明を完成するにいたった。 すなわち、 本発明は、 hPTHと hPTHに対して化学当量未満の酢酸か らなることを特徴とする医薬用成分に関する。 また、 本発明は、 hP THを有効成分とする医薬組成物であって、 hPTHと hPTHに対して化学 当量未満の酢酸からなる医薬用成分を含有することを特徴とする経 鼻投与用医薬組成物に関する。
図面の簡単な説明
図 1は酢酸含量 9. 5%の hPTH( l- 34)を 40°Cにて 6ヶ月保存した後の 逆相 HPLCク口マ トグラフィ一の結果を示す。
図 2は酢酸含量 2. 9%の hPTH( l- 34)を 40°Cにて 6ケ月保存した後の 逆相 HPLCク口マ トグラフィ一の結果を示す。
図 3は各種酢酸含量の hPTH( l-34)を 80°Cにて 15時間保存した後の 分解 （副成） 物 B、 Dの生成量を示す。
図 4は各種酢酸含量の hPTH( l-34 )を 80°Cにて 15時間保存した後の hPTH( l- 34)の純度を示す。
図 5は酢酸含量 12. 3%の hPTH( l- 84 )を 80°Cにて 15時間保存した後 の逆相 HPLCク 口マ トグラフィ一の結果を示す。
図 6は各種酢酸含量の hPTH( l- 84)を 80°Cにて 15時間保存した後の 分解 （副成） 物の生成量を示す。
図 7は各種酢酸含量の hPTH( l- 84)を 80°Cにて 15時間保存した後の hPTH( l-84)の純度を示す。 発明の実施の形態
本発明において hPTHは、 骨代謝に関与し、 強い骨形成効果を有し 、 血清カルシウム上昇作用を有するペプチド類であって、 8 4個の ァミノ酸残基を有する天然型 hPTH(l-84)またはその誘導体である。 例えば、 hPTH(l-84) (Biochemistry 17,5723(1978), Kimuraら、 Biochem. Biophys. Res. Commun. , vol.114, p493, 1983) 、 hPTH(l-3 8) (特開昭 57- 81448号公報） 、 hPTH(l- 34) (特開平 9- 29600号公報 、 Takaiら、 Peptide Chemistry, 1979， pl87) 、 hPTH(l-34)NH2 ( 特開昭 58- 96052号公報） 、 [Nle8 ' 18]hPTHU-34) 、 [Nle8'18, Tyr3 4]hPTH(l-34) (特開昭 55- 113753号公報) 、 [Nle8 ' 18 ] hPTH( 1- 34) NH2 (特開昭 61- 24598号公報） 、 [Nle8' 18， Tyr34 ] PTH(l-34) NH2 (特開昭 60 - 34996号公報） 、 hPTH(l-37) (特表平 5 - 505594号公報） 、 hPTH(2-84)、 hPTH(3 - 84)、 hPTH(4 - 84)、 hPTH(5 - 84)、 hPTH(6-84) 、 hPTH(7- 84)、 hPTH(8-84) (特表平 4-505259号公報） 等が挙げられ る。 このような hPTHは、 上記した文献及び公報に記載された遺伝子 工学技術による方法もしくは化学合成技術による方法に従って、 ま たはこれらに準じた方法によ り製造することができる。
一般に、 生理活性ペプチドは、 遺伝子工学技術あるいは化学合成 技術によ り製造される際、 カラムクロマ トグラフィーにより精製す るが、 hPTHのような塩基性べプチドはカラム樹脂に吸着されるため 、 吸着を避ける 目的あるいは溶解性を上げる 目的で、 溶出液と して 酸が用いられている。 また、 製剤にする 目的でペプチドを得るため には、 当該べプチドは凍結乾燥組成物である医薬用原体とする必要 があり、 溶出液として用いられる酸は、 揮発性であること等、 使用 できる酸は限定される。
例えば、 塩酸などの無機酸は、 低濃度でも酸性度が高く、 加水分 解などの副反応を生じ、 また、 酸自身に腐食性があるため適してい ない。 有機酸では沸点の低い、 ト リ フルォロ酢酸、 蟻酸、 酢酸が対 象となるが、 ト リ フルォロ酢酸は安全性の面で医薬用成分としては 好ましくなく、 また蟻酸は還元性を有するため使用が制限され、 hP THのよ うなぺプチドには適していない。
一方、 弱酸で、 安全性及び化学的性質の両面で酢酸は医薬用成分 として最適であり、 塩基性ぺプチドの最終精製には欠かせない酸と なっている。 例えば、 逆相高速液体カラムクロマ トグラフィー （逆 相 HPLC) や分子篩力ラムク ロマ トグラフィ一を用いた精製工程では 酢酸を含む溶出液が好適に使用されている。 hPTHが力ラムと吸着し ない濃度の酢酸が使用されるため、 酢酸水溶液で溶出された試料お よびべプチド画分並びにこれらの凍結乾燥組成物中には、 塩基性ァ ミ ノ酸残基と塩を形成する量以上の酢酸が hPTHとの塩または付着物 と して残留する。
すなわち、 酢酸は hPTHの医薬用成分中に hPTHとの塩及び付着物の 双方の形態で存在する。 従って、 酢酸は揮発性物質であるため、 凍 結乾燥条件の違い、 凍結乾燥原液中の酢酸濃度あるいは hPTH濃度の 違いなどによ り、 凍結乾燥組成物中の酢酸含量を一定にすることは 困難であった。
本発明の医薬用成分は、 hPTHとの塩または付着物と して存在する 酢酸含量を減じた hPTHと酢酸からなるものであり、 該成分によれば hPTHの安定性及び医薬組成物に使用されるときの使用感の向上が、 酢酸の減量によ り取得される。
本発明の医薬用成分においては、 減量された酢酸は化学当量未満 の酢酸と して定義される。
hPTH( l- 34 )は、 分子中に塩基性アミ ノ酸を 9残基 （ト リブトファ ン残基を含む） 有するため、 最大で 9分子の一価酸 （酢酸など） と 塩を形成することができるが、 hPTH ( l - 34 )分子中の酸性アミノ酸残 基 4残基が hPTH ( l- 34 )の分子内で塩を形成することができるため、 本発明の hPTH( l-34)においては、 塩基性ァミノ酸残基 5残基を酢酸 の化学当量とする。 また、 hPTHに対する酢酸量に式 I ： 酢酸重量 X 100 ( %) /hPTHのペプチ ド重量、 で表される酢酸含量を用いれば、 hPT 11 ( 1-34 )に対する酢酸の化学当量は約7. 3% (重量％、 以下同様） と なる。
同様に、 hPTH( l- 84)は塩基性アミ ノ酸を 1 9残基 （ト リブトファ ン残基を含む） 、 酸性ァミノ酸を 1 2残基含むことより、 本発明の hPTH ( l - 84 )においては、 塩基性ァミノ酸残基 7残基を酢酸の化学当 量とする。 また、 hPTH( l- 84 )に対する酢酸量に式 I で表される酢酸 含量を用いれば、 hPTH( l-84)に対する酢酸の化学当量は約 4. 5%とな る。
すなわち、 本発明において化学当量未満の酢酸とは、 付着物と し て存在する酢酸量を除外して、 さらに hPTHとの塩を形成する酢酸量 未満の酢酸を意味する。
本発明は酢酸含量を制辨して、 安定な hPTHの医薬用成分及び該医 薬用成分を含有する経鼻投与用医薬組成物を提供するものである。
また、 本発明は酢酸含量を制御して、 一定の酢酸含量を有する hP THの医薬用成分及び該医薬用成分を含有する経鼻投与用医薬組成物 を提供するものである。
一般にべプチドは溶液中では不安定であるため、 医薬用原体と し て凍結乾燥品が医薬用成分に使用されるが、 hPTHのよ うな揮発性の 酢酸を塩成分とするぺプチドをその水溶液や稀酢酸溶液から凍結乾 燥して得られた'医薬用成分は酢酸含量が一定せず、 製造上の問題が あった。 本発明は、 酢酸を減量した hPTH水溶液を用いて製造するこ とにより、 安定に一定の酢酸含量を有する hPTHの医薬用成分を提供 するものであり、 製造安定性の面から有利なものである。 本発明の医薬用成分において、 酢酸含量は、 hPTHに対して化学当 '量未満である。 例えば、 hPTH (卜 34)の場合の酢酸含量は、 hPTH( l- 3 4)に対して約 7. 3°/。未満であり、 安定性及び使用面から約 6. 0%以下、 特に約 4. 0%以下が好ましく、 また製造安定性の面から約 4. 0%以下、 特に約 3. 0%以下が好ましい。 また、 酢酸含量が小さいと hPTHは安定 性、 使用感において優れるが、 hPTH( l-34)の等電点は p l = 8. 2である ことからも、 高い pHで hPTH( l - 34)は不溶化するため、 酢酸を過度に 減じることは製造上好ましく なく、 約 0. 5%以上、 特に約 1. 0%以上が 好ましい。 一方、 hPTH( l-84 )の場合の酢酸含量は、 hPTH( l- 84)に対 して約 4. 5%未満であり、 安定性及び使用面から約 3. 0%以下、 製造安 定性の面から約 0. 1 %以上が好ましい。
本発明の医薬用成分は、 公知の方法またはこれに準じた方法で製 造することができる。 すなわち、 hPTHとの塩または付着物として含 まれる酢酸の減量は、 遺伝子工学技術、 化学合成技術等により得ら れた hPTHの精製工程において、 透析、 電気透析、 イオン交換クロマ トグラフィー、 分子篩カラムクロマ トグラフィー、 逆相 HPLCなどの 既知の方法を適用して行うこ とができる。
また、 透析、 電気透析、 イ オン交換クロマ トグラフィーなどの方 法で酢酸を除去する場合、 溶液の p Hあるいは直接酢酸含量を測定 することで随意の酢酸含量の hPTH溶液が調整できる。.
例えば、 hPTH水溶液に対する p Hとの関係によ り酢酸含量を調整 'する。
透析では、 低分子力ッ トの筒状の透析膜中に遺伝子工学技術ある いは化学合成技術によ り得られた hPTHの水溶液、 あるいは該水溶液 を例えば水酸化ナト リ ゥム水溶液、 ァンモニァ水溶液等のアル力リ で p H 5〜 9に調整した hPTH水溶液を封じ込め、 水に対する単純拡 散による透析を行なう ことにより、 酢酸が除去される。 例えば、 酢 酸含量約 2 %の hPTH( l- 34 )は、 透析外液の p Hを約 6. 5になるまで透 析を継続して取得する。
また、 電気透析では、 遺伝子工学技術あるいは化学合成技術によ り得られた hPTHの水溶液、 あるいは該水溶液を例えば水酸化ナトリ ゥム水溶液、 ァンモニァ水溶液等のアル力リで p H 5〜 9に調整し た hPTH水溶液を、 電場をかけた分子量 3 0 0カツ ト程度の透析膜間 を循環させることによ り、 陽極側に酢酸イオン、 陰極側に hPTH遊離 塩基を集積させ、 分子量の小さい酢酸ィオンは膜を通過させ系外に 除去し、 分子量の大きい hPTH遊離塩基を透析系に循環させる。 透析 液の P Hあるいはイオン強度を測定し、 酢酸の除去量をモニターす ることにより、 一定の酢酸含量を有する hPTHが製造できる。 例えば 、 酢酸含量約 2 %の hPTH( l- 34)は、 透析液の p Hを約 6· 5になるまで 電気透析を継続して取得する。
また、 イオン交換ク ロマ トグラフィーでは、 塩基性イオン交換樹 脂に酢酸を結合、 吸着させ、 酢酸を除去する。 例えば、 4級アンモ 二ゥム榭脂あるいは 2級アンモニゥム樹脂等の塩基性イオン交換樹 脂カラムに遺伝子工学技術あるいは化学合成技術によ り得られた hP THの水溶液を添加し、 酢酸を樹脂にイオン的に結合させ、 カラムを 素通り した非吸着画分を得ることにより酢酸含量が減少した hPTHが 製造できる。 hPTHに対するイオン交換樹脂量を変えることにより、 一定の酢酸含量を有する hPTHが製造できる。 例えば、 酢酸含量約 2 %の hPTH( l- 34 )は、 溶出液の p Hを約 6. 5にする樹脂量を選択して取 得する。
また、 分子篩カラムクロマトグラフィーでは、 分子篩カラムに遺 伝子工学技術あるいは化学合成技術によ り得られた hPTHの水溶液、 あるいは該水溶液に例えば水酸化ナ ト リ ゥム水溶液、 アンモユア水 溶液等のアル力 リで p H 5〜 9に調整した hPTH水溶液を添加し、 了 セ トニ ト リル等の有機溶媒を含む水溶液で溶出させることによ り、 酢酸を無機塩として除去する。 力ラムに添加する hPTH水溶液の p H を調整することによ り、 一定の酢酸含量を有する hPTHが製造できる 。 例えば、 酢酸含量約 2 %の hPTH( l- 34)は、 カラムに添加する hPTH 水溶液の pHを約 6· 5に調整し、 hPTH( l- 34)溶出画分を集めて取得す る。
さ らに、 逆相 HPLCでは、 遺伝子工学技術あるいは化学合成技術に より得られた hPTHの水溶液、 あるいは該水溶液を例えば水酸化ナト リ ゥム水溶液、 アンモニア水溶液等のアル力リで p Hを 5〜 9に調 整する。 この溶液を水で初期化した C18、 C4などの逆相 HPLCに添加 した後、 例えば水を溶出液として、 無機塩成分を溶出させる。 この 後、 ァセ トニ ト リル等の有機溶媒を含む水溶液で吸着した hPTHを溶 出させることによ り、 酢酸含量が減少した hPTHが得られる。
カラムに添加する hPTHの水溶液の p Hを調整することにより、 一 定の酢酸含量を有する hPTHが製造できる。 また、 酢酸を過度に、 例 えば限界量除去したのち酢酸を添加し、 一定の酢酸含量を有する hP THを得ることもできる。 例えば、 過度に酢酸を除去した hPTH( l- 34) 溶液の濃度を 10mg/mLに水で稀釈し、 pHを約 6. 5になるように酢酸を 添加して、 酢酸含量約 2 %の hPTH( l-34 )溶液を取得する。
上記各方法等によ り得られた hPTH水溶液を通常の方法によって凍 結乾燥するこ とによ り、 本発明の医薬用成分を得ることができる。 本発明において、 医薬用成分は、 吸収改善等を目的として、 水溶 性有機酸、 好ましく はクェン酸、 アジピン酸およびダリ コール酸の 少なく とも 1種をさ らに hPTHとの塩もしく は付着物または添加物と して含有していてもよい。 これら有機酸をさらに含有する医薬用成 分は、 良好な安定性を有しており、 注射以外の投与経路用の薬剤、 特に本発明の経鼻投与用医薬組成物に使用されるとき、 使用感にも 優れている。
従って、 本発明の医薬用成分は、 長期に渡って使用される経鼻投 与用医薬組成物の成分として使用できる。
また、 本発明の経鼻投与.用医薬組成物は、 良好な配合変化特性を 有するので、 製剤化に際し通常用いられる担体、 賦形剤、 増粘剤、 保剤、 安定化剤、 酸化防止剤、 結合剤、 崩壊剤、 湿潤剤、 滑沢剤、 着色剤、 芳香剤、 嬌味剤、 懸濁化剤、 乳化剤、 溶解補助剤、 緩衝剤 、 等張化剤、 界面活性剤、 無痛化剤、 含硫還元剤等の成分はもとよ り、 吸収改善、 固体安定化等を目的と して種々の他の機能性成分を 適宜配合するこ とができる。
担体、 賦形剤の例と しては、 水溶性または難溶性のもので、 例え ば糖類、 多糖類、 デキス ト リ ン類、 セルロース類、 合成または半合 成高分子類、 アミ ノ酸類、 ポリアミノ酸類、 タンパク質類、 リ ン脂 質類等が挙げられる。
糖類 （単糖類、 少糖類） としては、 例えば D—マンニ トール、 ブ ドウ糖、 乳糖、 果糖、 イ ノ シトール、 ショ糠、 マル トース等が挙げ られ、 多糖類と してはデキス トラン、 プルラン、 アルギン酸、 ヒア ルロ ン酸、 ぺクチン酸、 フィチン酸、 フィチン等が挙げられる。 ま たデキス ト リ ン類と してはひ 一シク ロデキス ト リ ン、 β —シク ロデ キス ト リ ン、 γ —シク ロデキス ト リ ン、 デキス ト リ ン、 ヒ ドロキシ プロ ピルスターチ、 ヒ ドロキシェチルスターチ等が挙げられる。
さ らに、 セノレロース類と してはメチノレセノレロース、 ェチルセノレ口 ース、 ヒ ドロ キシェチノレセノレロース、 ヒ ドロ キシプロ ピノレセノレロー ス、 ヒ ドロキシプロ ピノレメ チノレセノレロース、 カノレポキシメチノレセノレ ロースナト リ ゥム等が挙げられる。
合成および半合成高分子類としてはポリ ビュルアルコール、 カル ポキシビュルポリ マー、 ポリエチレングリ コール、 ポリ ビニノレピロ リ ドン （ P V P ) 、 ポリ アク リル酸ナ ト リ ウム、 ポリ乳酸等が挙げ られる。
アミ ノ酸類と してはグリ シン、 タウ リ ン等が挙げられ、 ポリ アミ ノ酸類と してはポリ グルタミ ン酸、 ポリ アスパラギン酸、 ポリ ダリ シン、 ポリ ロイ シン等が挙げられる。
タンパク質類と しては、 ゼラチン等が挙げられる。 その他キチン 、 キ トサン等が挙げられる。
これらの担体、 賦形剤の中でも、 特にショ糖、 マルトース、 a — シク ロデキス ト リ ン、 ]3 —シク ロデキス ト リ ン、 デキス ト リ ン、 D —マンニ トーノレ、 イ ノ シ トール、 乳糖、 デキス ト ラ ン、 メチルセル ロース、 ヒ ドロキシプロ ピノレセノレロ ース、 ポリ ビニノレアノレコーノレ、 プルランが好ましい。
この他に、 ソノレビン酸、 塩ィ匕ベンザノレコニゥム、 塩ィ匕セチノレピ リ ジゥム、 塩化べンゼトニゥムあるいはパラォキシ安息香酸メチル、 パラォキシ安息香酸ェチル、 パラォキシ安息香酸プロ ピル、 パラオ キシ安息香酸プチル、 パラォキシ安息香酸ィ ソブチル等のパラベン 類、 アラ ビアゴム、 ソルビッ ト、 ステアリ ン酸マグネシウム、 タル ク、 シリ カ、 結晶セルロース、 デンプン、 リ ン酸カルシウム、 植物 油、 カルポキシメチルセルロース、 ラウ リル硫酸ナ ト リ ウム、 水、 エタノール、 グリセリ ン、 シロ ップ等も使用するこ とができる。 界面活性剤と しては、 非イオン界面活性剤、 例えばソルビタンモ ノ カプリ レー ト、 ソルビタンモノラウ レー ト、 ソルビタ ンモノパル ミテー ト等のソルビタン脂肪酸エステル ； グリセリ ンモノカプリ レ ー ト、 グリ セリ ンモノ ミ リテー ト、 グリセリ ンモノステアレー ト等 のグリ セ リ ン脂肪酸エステル ； デカグリ セ リ ルモノ ステアレー ト、 デカグリ セ リ ルジステアレー ト、 デカグリ セ リルモノ リ ノ レー ト等 のポリ グ リ セ リ ン脂肪酸エステル ； ポ リ オキシエチレンソルビタ ン モノ ラウ レー ト、 ポリ オキシエチレンソノレビタンモノォレエー ト、 ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレー ト、 ポリ ォキシェチ レンソノレビタンモノパルミテー ト、 ポリオキシエチレンソルビタン ト リ オレエ一ト、 ポリ オキシエチレンソルビタン ト リ ステアレー ト 等のポリ オキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル ； ポリオキシェ チレンソルビッ トテ トラステアレー ト、 ポリ オキシエチレンソルビ ッ トテ トラオレエー ト等のポリオキシエチレンソルビッ ト脂肪酸ェ ステル ； ポリ オキシエチレングリ セリルモノステアレー ト等のポリ ォキシエチレンダリセリ ン脂肪酸エステル ； ポリエチレンダリ コー ルジステアレー ト等のポリエチレンダリ コール脂肪酸エステル ； ポ リ ォキシエチレンラウ リルエーテル等のポリ ォキシエチレンアルキ ルエーテル ； ポリ ォキシエチレンポリォキシプロ ピレンダリ コーノレ エーテル、 ポリ ォキシエチレンポリ 才キシプロ ピレンプロ ピルエー テル、 ポリォキシエチレンポリ 才キシプロ ピレンセチルエーテル等 のポリ ォキシエチレンポリ ォキシプロ ピレンアルキルエーテル ； ポ リォキシェチェレンノニノレフ エニノレエーテノレ等のポリ ォキシェチレ ンァノレキノレフェニノレエーテノレ ； ポリ ォキシエチレンヒマシ油、 ポリ ォキシエチレン硬化ヒマシ油 （ポリ ォキシエチレン水素ヒマシ油） 等のポリ オキシエチレン硬化ヒ マシ油 ； ポリ オキシエチレンソノレビ ッ ト ミツロ ウ等のポリオキシエチレンミツロ ウ誘導体 ； ポリオキシ エチレンラノ リ ン等のポリ オキシエチレンラノ リ ン誘導体 ； ポリ オ キシエチレンステアリ ン酸アミ ド等のポリオキシエチレン脂肪酸ァ ミ ド等の H L B 6〜 1 8を有するもの ； 陰イオン界面活性剤、 例え ばセチル硫酸ナト リ ウム、 ラウリル硫酸ナト リ ウム、 ォレイル硫酸 ナ ト リ ゥム等の炭素原子数 1 0〜 1 8のアルキル基を有するアルキ ル硫酸塩 ； ポリ オキシエチレンラウ リル硫酸ナ ト リ ウム等の、 ェチ レンォキシ ドの平均付加モル数が 2〜 4でアルキル基の炭素原子数 が 1 0 〜 1 8であるポリォキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩 ； ラウ リルスルホコハク酸エステルナト リ ゥム等の、 アルキル基の炭 素原子数が 8 〜 1 8 のアルキノレスルホコハク酸エステノレ塩 ； 天然系 の界面活性剤、 例えばレシチン、 グリ セ口 リ ン脂質 ； スフイ ンゴミ エ リ ン等のフィ ンゴリ ン脂質 ； 炭素原子数 1 2 〜 1 8 の脂肪酸のシ ョ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。 本発 明の製剤には、 これらの界面活性剤の 1種または 2種以上を組み合 わせて添加することができる。
含硫還元剤としては、 N—ァセチルシスティン、 N—ァセチルホ モシスティン、 チォク ト酸、 チォジグリ コール、 チォエタノールァ ミ ン、 チォグリセロール、 チォソルビトール、 チォグリ コール酸及 びその塩、 チォ硫酸ナト リ ウム、 ダルタチオン、 並びに炭素原子数 1 〜 7のチオアルカン酸等のスルフヒ ドリル基を有するもの等が挙 げられる。
また、 酸化防止剤と しては、 エリ ソルビン酸、 ジブチルヒ ドロキ シ トルエン、 プチノレヒ ドロ キシァニソーノレ、 a - ト コ フェ ローノレ、 酢酸ト コフェ ロール、 L —ァス コルビン酸及びその塩、 L 一ァスコ ルビン酸パルミテート、 L ーァスコルビン酸ステアレート、 亜硫酸 水素ナト リ ウム、 亜硫酸ナト リ ウム、 没食子酸ト リアミル、 没食子 酸プロピルあるいはエチレンジアミ ン四酢酸ニナト リ ゥム （E D T A ) 、 ピロ リ ン酸ナト リ ウム、 メタリ ン酸ナト リ ウム等のキレー ト 剤が挙げられる。
本発明の医薬組成物における各成分の割合は、 h P T H約 0. 01〜 20 % 、 好ましく は約 0. 05〜： L0%、 有機酸は必要に応じて添加することが でき、 使用する場合は約0. 05〜 99. 5%、 好ましくは約 0.：!〜 99. 0% であり、 また、 製剤化に際し通常用いられる担体、 賦形剤等の成分 は、 必要に応じて添加することができ、 使用する場合は例えば約 0. 01 ~ 99. 5 %である。 また、 種々の他の機能性成分は必要に応じて添 加することができ、 使用する場合は例えば約 0. 05〜99. 5 %である。
本発明の経鼻投与用医薬組成物の調製は公知の方法に準じて行う ことができる。
例えば、 酢酸が減じられた hPTHの医薬用成分をそのまま医薬組成 物と して用いてもよく、 また酢酸が減じられた hPTHの医薬用成分に 必要に応じて製剤化に際し通常用いられる担体、 賦形剤等の成分、 有機酸あるいは種々の機能性成分を加えて配合して医薬用成分とし て用いてもよい。 配合は、 有機酸の酢酸との置換の他、 添加により 行う ことができ、 例えば hPTHの医薬用成分に、 必要に応じて製剤化 に際し通常用いられる担体、 賦形剤等の成分、 有機酸あるいは種々 の機能性成分からなる混合物を蒸留水に一度溶解して凍結乾燥し、 均一な組成物を得ることができる。
あるいは hPTHの医薬用成分と必要に応じて製剤化に際し通常用い られる担体、 賦形剤等の成分を蒸留水に一度溶解して凍結乾燥した 後、 これに必要に応じて有機酸あるいは種々の機能性成分を合わせ て溶解し、 凍結乾燥するこ とにより、 均一な組成物を得ることもで きる。
あるいは hPTHの医薬用成分と有機酸あるいは種々の機能性成分を 蒸留水に一度溶解して凍結乾燥した後、 これに必要に応じて製剤化 に際し通常用いられる担体、 賦形剤等の成分を合わせて溶解し、 凍 結乾燥することによ り、 均一な組成物を得ることもできる。
本発明の医薬用成分は、 投与方法に応じた種々の剤型に製剤化す ることが可能であり、 直腸、 鼻腔、 口腔などの粘膜投与ができる剤 型に製剤化することが可能である。 また、 本発明の経鼻投与用医薬 組成物は、 経鼻薬の形態で投与することが好ましい。
本発明の経鼻投与用医薬組成物の好ましい例としては、 凍結乾燥 組成物として提供された本発明の医薬用成分が凍結乾燥部に含有さ れ、 これに溶解液部が添付された用時溶解型製剤が挙げられる。 上記した有機酸及び吸収促進剤としてのクェン酸、 アジピン酸お よびダリ コール酸等の有機酸は、 凍結乾燥部に hPTHとの塩もしくは 付着物または添加物と して本発明の医薬用成分をなすか、 または溶 解液部に添加溶解されて用いられてもよい。
また、 本発明の経鼻投与用医薬組成物の投与は公知の方法に準じ て行う ことができ、 例えば、 本発明の経鼻投与用医薬組成物は経鼻 薬として用いる製剤と して、 例えば、 該医薬組成物を入れた容器に 噴霧器を取りつけ、 ノズルの先端を鼻腔内に入れてスプレーする、 スプレーによる鼻腔内投与方法等が適用できる。
本発明の医薬組成物の投与量は、 疾患の種類、 患者の年齢、 体重 、 症状の程度及び投与経路等によっても異なるが、 例えば hPTH( l-3 4)の経鼻投与の場合は、 1日 1回あるいは数回に分けて連日投与する ことができ、 1回あたり hPTH( l- 34)として 10〜5000 μ gの範囲で投 与することが好ましい。 また、 一旦休薬した後、 症状に応じて再度 投与することもできる。
実施例
本発明を以下の実施例でさらに詳細に説明するが、 本発明はこれ ら実施例に限定されるものではない。
本実施例において用いた試験法と機器は、 特に記載しない限り以 下に記載のものを使用した。
1 . hPTHの HPLCによる分析
ペプチドの含量と分解 （副成） 物の検索に以下の機器と条件で逆 相 HPLCを実施した。
機器 ： 島津 LC-9Aシステム
カ ラム ： YMC PROTE IN - RP (4. 6 mm φ 150 mm) カラム温度 ： 4 0 °C
溶出液 ： 0.1%ト リ フルォロ酢酸中、 ァセ トニ ト リル濃度を 3 0分間 で 25%から 40%に直線的に変化させた。
流速 ： 1 mL/分
検出 ： UV(210 nm)
注入量 ： 50 / L
2. 酢酸分析
透析液と凍結乾燥品中の酢酸量を下記のィォン交換 HPLC条件で求 めた。
機器 ： 島津 LC-9Aシステム
カラム ： Shimadzu IC-A1 (4.6 mm x 100 mm)
カラム温度 ： 4 0 °C
溶出液 ： 0.84% フタル酸水溶液と 0.58% ト リ スヒ ドロキシメチル ァミノメタン水溶液の 1 ： 1混合液
流速 ： 1.5 mL/分
検出 ： 電気伝導度検出器
注入量 ： 10 μ L
3. 質量分析
hPTH、 hPTHの分解 （副成） 物およびその酵素消化物の質量を下記 の機器および条件で求めた。
機器 ： フィニガン MAT TSQMS
ィォン源 ： ESI
検出イオンモー ド ： positive
スプレー電圧 ： 4· 5kV
キヤビラリ一温度 ： 250°C
移動相 ： 0.2%酢酸 ' メタノ一ル混液 （ 1 : 1 )
流速 ： 0.2 mL/分 スキヤ ン範囲 ： m/z 550〜850
4. ァミ ノ酸配列分析
hPTHの分解 （副成） 物およびその酵素消化物のアミ ノ酸配列分析 に下記の機器を用いた。
機器 ： パーキンエルマ一社 477A型シークェンサ一
5. ァミ ノ酸組成分析
hPTH、 hPTHの分解 （副成） 物およびその酵素消化物のアミノ酸組 成分析に下記の機器を用いた。
機器 ： 日立製作所製 い 8500型アミノ酸分析機計
6. 試料の保存 （安定性試験）
以下の保存庫に各温度条件で保存した。
機器 ： ナガノ科学 LH- 30-14
設定温度 ： 1 ) 40±1°C、 2 ) 60土 1°C、 3 ) 80 + 2°C
7. 凍結乾燥
機器 ： 共和真空技術株式会社製 RL— 903BS ' パィ アル ： 15mLガラスバイ ァル
参考例 1 . hPTH(l- 34)の製造 （ 1 )
大腸菌由来の β -ガラク トシダーゼの誘導体をコードする DNAと hP TH (卜 34)をコ一ドする DNAをプロセッシング酵素である Kex2プ口テ ァーゼの切断モチーフ（Lys-Arg)を含むリ ンカーをコー ドする DNAで つないだ hPTH( 1-34)のキメラタンパク質をコー ドする遺伝子を含む 発現プラスミ ド pG117S4HPPH34 (特開平 9- 29660号公報） を、 大腸菌 M25株 、 ff3110/ompT： Sugimuraら、 Biochem. Biophys. Res. Commun. , vol.153, 1988, p753-759) に導入し、 形質転換した大腸菌 M25株を 2%酵母エキスを含む培地を用い、 2 0L培養槽にて培養した。
菌体濃度が 0D66Q = 1 2になるまで培養を継続し、 得られた菌体 を ImM EDTAを含む 10mM ト リス塩酸緩衝液 （ p H8.2) 中で、 高圧ホ モジナイザー （Manton- Gaullin) を用いて破砕し、 遠心分離、 洗浄 を経てキメラタンパク質の封入体約 100gを含む懸濁液約 625mLを得 た。 封入体 40gを含む懸濁液 250mLに、 1M ト リス塩酸緩衝液 （ p H8 .2) 100 mL、 5 M NaCl 50 mL、 脱イオン水 500 mL、 および尿素を 9 00g添加し、 30°Cで攪拌して封入体を溶解させた。
この溶液を脱イオン水で 5 Lに希釈し、 250 mM CaCl2を 50 mL添加 した後、 Kex2プロテアーゼのアミ ノ酸番号 1〜 6 6 0からなる Kex2 プ口テアーゼの誘導体である Kex2- 660 (特開平 10- 229884号公報） を 20kU/mL以上になるよう添加し、 2時間ゆるやかに攪拌し、 hPTH( 卜 34)をキメラタンパク質から切り出した。 反応液を酢酸で p H6.4 に調整し、 さらに脱イオン水で反応液を 2倍に希釈して、 未反応の キメラタンパク質と ） 3-ガラタ トシダーゼ誘導体を沈殿させ、 遠心 分離によ り 6.7 の hPTH(l- 34)を含む上清を得た。 この上清を酢酸 で p H5.0に調整し、 予め ΙΟιηΜ酢酸ナト リ ゥム緩衝液で平衡化した陽 イオン交換樹脂 （SPトヨパール、 東ソー株式会社製） に吸着させ、 10mM酢酸ナト リ ゥム緩衝液で洗浄後、 0.4M NaClで 6.0gの hPTH( 1- 34 )を含む画分を得た。
この画分に酢酸を 3v/v%になるよ うに加え、 予め 3 v/v%酢酸で 平衡化した低圧逆相 0DS (Soken0DS-W, 綜研化学株式会社製） カラ ムに添加し、 3 v/v%酢酸を含む 30 v/v%ァセ トニ ト リルで hPTH(l- 34)を溶出させた。 hPTH(l- 34)を含むこの溶出液を減圧下濃縮し、 逆相 HPLCカラム （TSKgelODS120T、 55mm x 600mm, 東ソー株式会社製 ) に添加し、 流速 40mL/minで、 60分間かけ 5, v/v%酢酸中のァセ ト 二 ト リル濃度を 16%から 32%まで直線的に変化させて、 hPTH(l- 34) を溶出させ、 4gの hPTH(l-34)を含む精製画分を得た。
残りの封入体 60 gを同様に処理して得られた 5gの hPTH(l- 34)を含 む精製画分をあわせ、 減圧下でァセ トニ ト リルを留去し、 5v/v% 酢酸で hPTH(l- 34)濃度を 10 mg/mLに調整した。 この溶液を 15mLずつ ガラスパイアルに充填し、 凍結乾燥することで、 hPTH(l- 34) 9 g ( 150mgX60本） を得た。 この物質の分子量、 アミノ酸組成比は以下 に示すとおりであり、 この物質が hPTH(l- 34)であることが確認され た。
ESI-MS; 4117.7 (理論値 4117.8)、 6 N塩酸加水分解後のアミ ノ酸 組成比 ： Asx; 4.0 (4) , Ser; 2.6 (3)， Glx; 4.9 (5)， Gly; 1.0 ( 1) , Val; 3.0 (3)， Met; 2.0 (2) , Ile;l.0(1), Leu; 5， Phe; 1.1 (1)， Lys; 30 (3)， His; 3.0 (3)， Arg; 2.0 (2), Trp; 検出され ず（1)。
参考例 2. hPTHCl- 34)の製造 （ 2 )
参考例 1 と同様の生産菌を用いて、 200L培養槽にて培養した。 菌 体濃度が 0D66。 = 1 6 0になるまで培養を継続し、 得られた菌体を 1 mM EDTAを含む 10mMト リ ス塩酸緩衝液 （pH 8.2) 中で、 高圧ホモジ ナイザーを用いて破碎し、 遠心分離、 洗浄を経てキメ ラタンパク質 の封入体約 5kgを含む懸濁液約 10レを得た。
封入体 2kgを含む懸濁液 4, 0Lに、 1 M ト リ ス塩酸緩衝液 （pH 8.2 ) 1.6L、 5M NaCl 0.8L、 脱イオン水 15Lおよび尿素 13kgを添加し、 3 o°cで攪拌して封入体を溶解させた。
この溶液を脱イオン水で 80Lに希釈し、 250mM CaCl2を 0.8L添加し た後、 本溶液に Kex2- 660 (特開平 10- 229884号公報） を 10 kU/mL以 上になるよう添加し、 1時間ゆるやかに攪拌し、 hPTH(;l-34)をキメ ラタンパク質から切り出した。 反応液を酢酸で pH6.3に調整し、 さ らに脱イオン水で反応液を 2倍に希釈して、 未反応のキメラタンパ ク質と -ガラク トシダーゼ誘導体を沈殿させ、 圧搾ろ過によ り hPT H(l- 34)を含む上清を得た。
この上清を酢酸で p H5.0に調整し、 予め 10mM酢酸ナ ト リ ゥム緩衝 液で平衡化した陽イオン交換樹脂 （Poros 50 HS、 PerSeptive Bios ystems (米国） ） カラム （5 L) に吸着させ、 10mM酢酸ナト リ ウム 緩衝液で洗浄後、 NaCl濃度勾配にて溶出させ、 hPTH(l- 34)を含む画 分を集めた。 本溶液に齚酸を 3v/v%になるよ うに加え、 予め 3 v/v %酢酸で平衡化した低圧逆相 ODS (SokenODS-W, 綜研化学株式会社 製） カラム （5L) に添加し、 3v/v%酢酸を含む 30v/v%ァセ トニ ト リルで hPTH(l - 34)を溶出させた。
hPTHd- 34)を含むこの溶出液を減圧下濃縮し、 0.22 mのフィル ターでろ過後、 逆相 HPLCカラム （TSK ODS 80Ts 20 μ m, 105 ram ID x 550 mm, 東ソー株式会社製） に添加し、 3v/v%酢酸存在下、 ァセ トニ ト リル濃度勾配溶出にて精製した。 溶出画分を合わせ、 減圧下 でァセ トニト リルを留去し、 純度 99· 6%の hPTH(l- 34)を 70g含む、 10 .4Lの hPTH(l-34)溶液を得た。 また、 残りの封入体約 3 kgのうち 2 k gについて、 同様の方法を用いて精製し、 純度 99.6%の hPTH(l- 34)を 78g含む、 11.6Lの hPTH(l- 34)溶液を得た。
参考例 3. hPTH(l- 84)の製造
大腸菌由来の β -ガラク トシダーゼの誘導体をコー ドする DNAと hP TH(1- 84)をコ一ドする DNAをプロセッシング酵素である Kex2プ口テ ァーゼの切断モチーフ（Lys- Arg)を含むリ ンカーをコー ドする DNAで つないだ hPTH(l-84)のキメラタンパク質をコー ドする遺伝子を含む 発現プラスミ ド pGP#19 (特開平 9- 29600号公報） を、 大腸菌 M25株に 導入し、 形質転換した大腸菌 M25株のコロニーを 3 Lの培養槽にて 3 7 °Cで培養し、 培養液濁度 （OD 6 6 。 ） が 1 になった時点で、 ィ ソプロピルベータチォガラク トシド （IPTG) を最終濃度 1.0 mMにな るよ うに添加した。
さ らに 4時間培養を継続し、 遠心分離によ り菌体を回収し、 TE ( 1 0 mM ト リ ス、 1 mM EDTA、 pH8.0) に懸濁した。 フレンチプレス によ り菌体を破砕し、 遠心分離と再懸濁を繰り返して封入体を洗浄 回収した。 本封入体懸濁液を 8 .0 M 尿素、 10 mM ト リ ス pH8.0 に 溶解し、 その遠心上清を 100 mLの QAE トヨパールカラム （東ソー株 式会社製） にロー ドし、 NaCl 0- 0.4 M 濃度勾配溶出により精製し た。 精製封入体溶解液を排除限界分子量 10， 000の限外ろ過膜で濃縮 した。 これを、 反応液組成 （50 mM BisTris ρΗ 6· 8、 1.0 mM CaC 12、5 mg/mL キメ ラタンパク質） になるように希釈し、 Kex2- 660 を 2kU/mLとなるよ うに添加し、 30°C 1時間反応させて hPTH( 1-84) を切り出した。
酢酸にて反応液 pHを 5.0 に調整し、 更に脱イオン水で 2倍に希釈 することで、 未反応のキメ ラタンパク質及び β -ガラ ク トシダ一ゼ 誘導体を凝集沈殿させた。 遠心分離により hPTH(l- 84)を含む上清を 得、 これに酢酸を最終 3 v/v%となるように添加し、 3 v/v%酢酸で 平衡化した TSK gel ODS 80Ts (21 mm ID x 250 mm、 東ソー株式会 社製） にて精製した。 純度 9 8 %以上のフラタショ ンを集め、 溶媒 を除去した後、 凍結乾燥し、 hPTH(l- 84)500mgを得た。 この物質の 分子量、 アミ ノ酸組成比は以下に示すとおりであり、 この物質が hP TH(1 - 84)であることが確認された。
ESI-MS; 9424.7 (理論値 9424.7)、 6 N塩酸加水分解後のアミ ノ酸 組成比 ： Asx;10.1 (10) , Thr;l.1 (1)， Ser; 6.3 (7)， Glx;ll.0 ( 11) , Pro; 2.9 (3)， Gly; 4.1 (4) , Ala; 7.0 (7) , Val; 8.0 (8)， Met ; 1.9 (2)， Ile;l.0 (1)， Leu; 10， Phe; 1.0 (1)， Lys; 8.9 (9)， His; 3.9 (4) , Arg; 5.0 (5)， Trp; 検出されず（1)。
実施例 1 . hPTH(l- 34)の酢酸除去 （ 1 )
( 1 ) 参考例 1で得られた凍結乾燥品（hPTH(:L-34)150 mg)を蒸留 水（30mL)に溶かし、 5mg/mL (pH 4.7) の水溶液を調製した。 この溶 液を室温下で、 蒸留水（100 mL)に対し、 電気透析膜 AC- 130- 10(旭化 成工業株式会社）を装着したマイクロアシライザ一 G1 (旭化成工業 株式会社） にて電気透析を行い、 pHが 5.0になるまで酢酸を除去し た。 酢酸含量 6.8%の透析液から、 hPTH(l- 34)約 150mgを含む酢酸含 量 4.8 %の凍結乾燥品を得た。
( 2 ) 参考例 1で得られた凍結乾燥品（hPTH(l- 34)150 mg)を蒸留 水（30mL)に溶かし、 5mg/iaL (pH 4.7) の水溶液を調製した。 この溶 液を本実施例 （ 1 ) と同様の方法によ り電気透析を行い、 pHが 5.5 になるまで酢酸を除去した。 酢酸含量 4.6%の透析液から、 hPTH(l- 3 4 )約 150 m gを含む酢酸含量 3.8 %の凍結乾燥品を得た。
( 3 ) 参考例 1で得られた凍結乾燥品（hPTH(l- 34)150 mg)を蒸留 水（30mL)に溶かし、 5mg/mL (pH 4.7) の水溶液を調製した。 この溶 液を本実施例 （ 1 ) と同様の方法により電気透析を行い、 !1が5.9 になるまで酢酸を除去した。 酢酸含量 3.1%の透析液から、 hPTH(l - 3 4)約 150mgを含む酢酸含量 2.9%の凍結乾燥品を得た。
( 4) 参考例 1で得られた凍結乾燥品（hPTH(l-34)150 mg)を蒸留 水（30mL)に溶かし、 5mg/mL (pH 4.7) の水溶液を調製した。 この溶 液を本実施例 （ 1 ) と同様の方法によ り電気透析を行い、 pHが 7.0 になるまで酢酸を除去した。 酢酸含量 1.6%の透析液から、 hPTHU - 3 4)約 150mgを含む酢酸含量 1.6%の凍結乾燥品を得た。
以上の結果から、 酢酸の減量に伴い凍結乾燥による酢酸の減少量 が少なくなり、 酢酸の減量によ り凍結乾燥による酢酸の減量の差を 減少させることができた。 従って、 酢酸の減量は、 困難であった一 定の酢酸含量を有する hPTHの医薬用成分の製造に有用である。
実施例 2. hPTH(l- 34)の酢酸除去 （ 2 )
参考例 2で得られた約 150gの hPTH(l- 34)を含む溶液に 5N NaOHを 添加して PH5.5と した。 該溶液の 1/4を、 あらかじめ 5ν/ν%ァセ トニ ト リル水溶液で平衡化した低圧逆相 ODS (Soken 0DS-W (800 mL) 、 綜研化学株式会社製） カラムに負荷して hPTH(l-34)を吸着させ、 5v /v%ァセ トニト リル水溶液 4 Lで酢酸ナト リ ゥムを溶出させた後、 50 v/v%ァセ トニ ト リル水溶液で hPTH(l- 34)を溶出させた。 4回これを 繰り返して全量を処理し、 hPTHd- 34)122.5g (回収率 82%) を含む 酢酸含量 1.13%の脱酢酸画分を 8.2L得た。
次に、 本画分に蒸留水を加え 10 mg/mLの hPTH(l- 34)に調整した後 、 hPTHに対する酢酸含量が 3 %となるように酢酸を 2.3g加え良く攪 拌した。 この溶液をパイアルあたり 150 mgの hPTH(l- 34)が含まれる ように分注し、 酢酸含量 2.1%の凍結乾燥品を得た。
実施例 3. hPTH(l-34)の酢酸除去 （ 3 )
( 1 ) 参考例 1で得られた凍結乾燥品（hPTH (卜 34)300mg)を蒸留 水 （30mL) に溶かして 10mg/mLの水溶液を調製した。 この酢酸含量 9 .5%の溶液 （pH4.7) を、 2mLずつ 3本のガラスパイアルに分注して 、 FZ- 6凍結乾燥機 （ラボコンコ社製） で真空度を 0.13mBar以上に保 ち、 1次乾燥 （棚温 ； - 20°C、 12時間） 、 2次乾燥 （棚温 ； 25°C、 4 8時間） で凍結乾燥した。 2次乾燥終了後、 凍結乾燥機庫内を窒素 ガスで充填しながら自動打栓した。 各凍結乾燥パイアルに蒸留水 2m Lを加え、 イオン交換 HPLCによ り酢酸含量を定量した。 結果を表 1 に示す。 '
( 2 ) 参考.例 1 で得られた凍結乾燥品（hPTHU_34)300mg)を蒸留 水 （30mL) に溶かして lOmg/mLの水溶液を調製した。 この溶液 （pH4 .7) に対し、 電気透析膜 AC-130- 10 (旭化成工業株式会社） を装着 したマイ ク ロァシライザ一 （旭化成工業株式会社） にて電気透析を 行ない、 pHが 5.0 (酢酸含量 7.3%) になるまで酢酸を除去した。 こ の透析液を、 2mLずつ 3本のガラスパイアルに分注して、 本実施例 ( 1 ) と同様に凍結乾燥し、 イオン交換 HPLCにより酢酸含量を定量 した。 結果を表 1 に示す。 ( 3 ) 参考例 1で得られた凍結乾燥品（hPTH(l-34)300mg)を蒸留 水 （30mL) に溶かして 10mg/mLの水溶液を調製した。 この溶液 （PH4 .7) に対し、 電気透析膜 AC-130- 10 (旭化成工業株式会社） を装着 したマイクロァシライザ一 （旭化成工業株式会社） にて電気透析を 行ない、 11が5.5 (酢酸含量 4.6%) になるまで酢酸を除去した。 こ の透析液を、 2mLずつ 3本のガラスパイアルに分注して、 本実施例
( 1 ) と同様に凍結乾燥し、 イオン交換 HPLCにより酢酸含量を定量 した。 結果を表 1に示す。
( 4 ) 参考例 1で得られた凍結乾燥品（hPTH(l- 34)300mg)を蒸留 水 （30mL) に溶かして 10mg/mLの水溶液を調製した。 この溶液 （pH4 .7) に対し、 電気透析膜 AC- 130- 10 (旭化成工業株式会社) を装着 したマイク ロァシライザ一 (旭化成工業株式会社) にて電気透析を 行ない、 1)11が6.3 (酢酸含量 2.0%) になるまで酢酸を除去した。 こ の透析液を、 2mLずつ 3本のガラスパイアルに分注して、 本実施例
( 1 ) と同様に凍結乾燥し、 イオン交換 HPLCにより酢酸含量を定量 した。 結果を表 1 に示す。
( 5 ) 参考例 1で得られた凍結乾燥品（hPTHa-34)300mg)を蒸留 水 （30mL) に溶かして 10mg/mLの水溶液を調製した。 この溶液 （pH4 .7) に対し、 電気透析膜 AC- 130- 10 (旭化成工業株式会社） を装着 したマイクロァシライザ一 （旭化成工業株式会社） にて電気透析を 行ない、 pHが 7.0 (酢酸含量 1.1%) になるまで酢酸を除去した。 こ の透析液を、 2mLずつ 3本のガラスパイアルに分注して、 本実施例
( 1 ) と同様に凍結乾燥し、 イオン交換 HPLCにより酢酸含量を定量 した。 結果を表 1 に示す。
( 6 ) 参考例 1で得られた凍結乾燥品（hPTH(l-34)300mg)を蒸留 水 （30mL) に溶かして 10mg/mLの水溶液を調製した。 この溶液 （pH4 .7) に対し、 電気透析膜 AC- 130- 10 (旭化成工業株式会社） を装着 したマイクロァシライザ一 （旭化成工業株式会社） にて電気透析を 行ない、 11が7.6 (酢酸含量 0.5%) になるまで酢酸を除去した。 こ の透析液を、 2mLずつ 3本のガラスパイアルに分注して、 本実施例
( 1 ) と同様に凍結乾燥し、 イオン交換 HPLCにより酢酸含量を定量 した。 結果を表 1 に示す。
表 1から明らかなように、 凍結乾燥前の酢酸含量が少なくなるに 従い、 凍結乾燥後の酢酸含量の減少量が小さくなり、 また、 凍結乾 燥前の酢酸含量が少ないほど、 凍結乾燥による酢酸の減少量にロッ ト間のパラつきが少なく、 酢酸の減量は、 困難であった一定の酢酸 含量を有する hPTHの医薬用成分の製造に有用であることが示された 表 1 凍 乾燥による酢酸 量の変化
Figure imgf000028_0001
実施例 4. hPTH(l-34)の酢酸除去 （ 4 )
( 1 ) 参考例 1 と同じ生産菌を 200L培養槽にて培養し、 菌体破碎 遠心分離、 洗浄を経てキメラタンパク質の封入体 4.8kgを得た。 このうち 2.4kgについて、 参考例 2 と同様に Kex2-660による hPTH(l- 34)の切り出し、 陽イオン交換ク ロマ トによる精製、 低圧逆相 0DSク 口マ トによる脱塩、 および逆相 HPLCによる最終精製を行なった。 次 いで実施例 2 と同様に、 本精製画分を 5N 水酸化ナト リ ゥムで pH5. 5と した後、 低圧逆相 0DSカラムに負荷した。 5v/v%ァセ トニ ト リル 水溶液を通じ酢酸ナト リ ウムを除いた後、 50v/v%ァセ トニト リル水 溶液で hPTH(l- 34)を溶出させ、 hPTH(l- 34)58 gを含む酢酸含量 1.2 。/。の！^了！！ ^ 溶液 Lを得た。 本溶液に酢酸含量が 3%になるよ うに、 酢酸を l.Og添加しよく撹拌した。 この溶液をパイアルあたり 150 mgの hPTH(l- 34)が含まれるように分注して、 hPTH( 1-34) 57.8g を含む酢酸含量 2.5%の凍結乾燥品（パイァル 385本）を得た。
( 2 ) 本実施例 （ 1 ) で得られた凍結乾燥品（hPTH(l_34)150mg) を ト リ フルォロェタノール 3mLに溶解させ、 ジェチルエーテル 30mL で析出させた。 得られた粉末を苛性ソーダペレツ ト存在下、 デシケ 一ター中で 24時間減圧乾燥し、 hPTH(l-34)約 130mgを含む酢酸含量 2 .0%の乾燥品を得た。
( 3 ) 本実施例 （ 1 ) で得られた凍結乾燥品（hPTH(l_34)150mg) を入れたパイアルの内側壁面に、 1.53 μ Lの酢酸をマイクロシリ ン ジで hPTH(l-34)に触れないよ うに添加した。 80°C、 5分で酢酸をパ ィアル内で揮発させた後、 パイアルをポルテックスミクサ一で振と う し、 パイアル内の hPTH(l-34)を細かい粉末とし、 酢酸含量 3.6%の hPTH(l-34)粉末を得た。
( 4 ) 本実施例 （ 1 ) で得られた凍結乾燥品（hPTH(l- 34)150mg) を入れたパイアルの内側壁面に、 3.78 の酢酸をマイクロシリ ン ジで hPTH(l- 34)に触れないよ うに添加した。 80°C、 5分で酢酸をパ ィアル内で揮発させた後、 パイアルをボルテックスミクサ一で振と う し、 パイアル内の hPTH(l- 34)を細かい粉末とし、 酢酸含量 5.1%の hPTH(l-34)粉末を得た。
( 5 ) 本実施例 （ 1 ) で得られた凍結乾燥品（hPTH(l_34)150mg) を入れたパイアルの内側壁面に、 5.28 μ Lの酢酸をマイクロシリ ン ジで hPTH(l- 34)に触れないように添加した。 80°C、 5分で酢酸をパ ィアル内で揮発させた後、 パイアルをボルテックスミ クサ一で振と う し、 パイアル内の hPTH(l-34)を細かい粉末と し、 酢酸含量 6.2%の hPTH(l- 34)粉末を得た。
参考例 4.
( 1 ) 実施例 4 ( 1 ) で得られた凍結乾燥品（hPTHd- 34)150mg) を入れたパイアルの内側壁面に、 7.23 μ Lの酢酸をマイクロシリ ン ジで hPTH(l- 34)に触れないように添加した。 80°C、 5分で酢酸をパ ィアル内で揮発させた後、 パイアルをボルテックスミ クサ一で振と う し、 パイアル内の hPTH(l- 34)を細かい粉末と し、 酢酸含量 7.5%の hPTH(l- 34)粉末を得た。
( 2 ) 実施例 4 ( 1 ) で得られた凍結乾燥品（hPTH(l - 34)150mg) を入れたバイアルの内側壁面に、 9.48 μ Lの酢酸をマイクロシリ ン ジで hPTH( 1-34)に触れないように添加した。 80°C、 5分で酢酸をパ ィアル内で揮発させた後、 パイアルをポルテックスミ クサ一で振と う し、 パイアル内の hPTH(l-34)を細かい粉末とし、 酢酸含量 9.1%の hPTH(l- 34)粉末を得た。
( 3 ) 実施例 4 ( 1 ) で得られた凍結乾燥品（hPTH(l- 34)150mg) を入れたパイアルの内側壁面に、 10.53 μ Lの酢酸をマイクロシリ ン ジで hPTH( 1-34)に触れないように添加した。 80°C、 5分で酢酸をパ ィアル内で揮発させた後、 パイアルをボルテックスミ クサ一で振と う し、 パイアル内の hPTH(l- 34)を細かい粉末とし、 酢酸含量 9.9%の hPTH(l- 34)粉末を得た。
( 4) 実施例 4 ( 1 ) で得られた凍結乾燥品（hPTH(l-34)150mg) を入れたパイアルの内側壁面に、 14.28 μ Lの酢酸をマイクロシリ ン ジで hPTH(l-34)に触れないように添加した。 80° ( 、 5分で酢酸をパ ィアル内で揮発させた後、 パイアルをボルテックスミクサ一で振と う し、 パイアル内の hPTH(l- 34)を細かい粉末とし、 酢酸含量 12.5% の hPTH(l- 34)粉末を得た。
( 5 ) 実施例 4 ( 1 ) で得られた凍結乾燥品（hPTH(l- 34)150mg) を入れたパイアルの内側壁面に、 16 の酢酸をマイクロシリ ンジ で hPTH(l- 34)に触れないように添加した。 80°C、 5分で酢酸をパイ アル内で揮発させた後、 パイアルをボルテックスミクサ一で振と う し、 パイアル内の hPTH(l- 34)を細かい粉末とし、 酢酸含量 13.7%の h PTH(1- 34)粉末を得た。
( 6 ) 実施例 4 ( 1 ) で得られた凍結乾燥品（hPTH(l- 34)150mg) を入れたパイアルの内側壁面に、 22.6 Lの酢酸をマイクロシリ ン ジで hPTH(l- 34)に触れないよ うに添加した。 80°C、 5分で酢酸をパ ィアル内で揮発させた後、 パイアルをポルテックスミクサ一で振と う し、 パイアル内の hPTH(l- 34)を細かい粉末とし、 酢酸含量 18.3% の hPTH(l- 34)粉末を得た。
( 7 ) 実施例 4 ( 1 ) で得られた凍結乾燥品（hPTH(l-34)150mg) を入れたパイアルの内側壁面に、 100 μ Lの酢酸をマイクロシリ ンジ で hPTH(l- 34)に触れないように添加した。 80°C、 5分で酢酸をパイ アル内で揮発させた後、 パイアルをボルテックスミクサ一で振と う し、 パイアル内の hPTH(l- 34)を細かい粉末と し、 酢酸含量 72.5%の h ΡΤΗ(1-34)粉末を得た。
実施例 5. hPTH(l- 84)の酢酸除去 （ 1 )
( 1 ) 参考例 3で得られた酢酸含量約 5.4%の凍結乾燥品（hPTH(l - 84)50 mg)を蒸留水（10 mL)に溶かし、 5mg/mL (pH 4.7) の水溶液を 調製した。 この溶液を室温下で、 蒸留水（100 ml)に対し、 電気透析 膜 AC-130-10(旭化成工業株式会社）を装着したマイクロァシライザ 一 G1 (旭化成工業株式会社） にて電気透析を行い、 pHが 5.0になる まで酢酸を除去した。 透析液から、 hPTH(l-84)約 50mgを含む酢酸含 量 3 · 9 %の凍結乾燥品を得た。
( 2 ) 参考例 3で得られた酢酸含量約 5.4%の凍結乾燥品（hPTH(l - 84)50 mg)を蒸留水（10 mL)に溶かし、 5mg/mL (pH 4.7) の水溶液を 調製した。 この溶液を本実施例 （ 1 ) と同様の方法により電気透析 を行い、 pHが 6.0になるまで酢酸を除去した。 透析液から、 hPTH (卜 84)約 50mgを含む酢酸含量 2.5%の凍結乾燥品を得た。
( 3 ) 参考例 3で得られた酢酸含量約 5· 4%の凍結乾燥品（hPTH(l- 84)50 mg)を蒸留水（10 mL)に溶かし、 5mg/mL (pH 4.7) の水溶液を 調製した。 この溶液を本実施例 （ 1 ) と同様の方法によ り電気透析 を行い、 pHが 7.0になるまで酢酸を除去した。 透析液から、 hPTH(l - 84)約 50mgを含む酢酸含量 1.3%の凍結乾燥品を得た。
(4 ) 参考例 3で得られた酢酸含量約 5.4%の凍結乾燥品（hPTH(l - 84)50 mg)を蒸留水（10 mL)に溶かし、 5mg/mL (pH 4.7) の水溶液を 調製した。 この溶液を本実施例 （ 1 ) と同様の方法により電気透析 を行い、 pHが 8.0になるまで酢酸を除去した。 透析液から、 PTHU- 84)約 50mgを含む酢酸含量 0.9%の凍結乾燥品を得た。
実施例 6. hPTH (卜 84)の酢酸除去 （ 2 )
( 1 ) 参考例 3で得られた酢酸含量約 5.4%の凍結乾燥品（hPTH(l - 84) 100 mg)を 500 しの ト リ フルォロエタノールに溶かした後、 ジ ェチルエーテル 20 mLを加え沈殿させた。 これをフィルター上で濾 取し、 苛性ソーダペレツ ト存在下、 デシケーター中で 2 4時間減圧 乾燥し、 hPTH(l- 84)約 90 mgを含む酢酸含量 1.6%の乾燥品を得た。
( 2 ) 本実施例 （ 1 ) で得られた乾燥品を 5 mLパイアルに 5.49mg を量り とった後、 10vol%酢酸/塩化メチレン溶液をマイクロシリ ン ジで 0,3 し添加し、 酢酸含量 2.2%の hPTH(l- 84)成分を得た。
( 3 ) 本実施例 （ 1 ) で得られた乾燥品を 5 mLパイアルに 5.58 m g量り とつた後、 10 vol %酢酸/塩化メチレン溶液をマイクロシリ ン ジで 0.6 /zL添加し、 酢酸含量 2· 7%の hPTH(l-84)成分を得た。
( 4) 本実施例 （ 1 ) で得られた乾燥品を 5 mLパイアルに 4.96 m g量り とつた後、 10 vol %酢酸/塩化メチレン溶液をマイクロシリ ン ジで 1.0 μ L添加し、 酢酸含量 3· 8%の hPTH(l- 84)成分を得た。
参考例 5.
( 1 ) 実施例 6 ( 1 ) で得られた乾燥品を 5 mLパイアルに 5.05mg 量り とつた後、 10 vol %酢酸/塩化メチレン溶液をマイクロシリ ン ジで 1.7 μじ添加し、 酢酸含量 5.2%の hPTH(l- 84)成分を得た。
( 2 ) 実施例 6 ( 1 ) で得られた乾燥品を 5 mLパイアルに 5.59mg 量り とつた後、 10 vol %酢酸/塩化メチレン溶液をマイクロシリ ン ジで 2.5μ L添加し、 酢酸含量 6.4%の hPTH(l- 84)成分を得た。
( 3 ) 実施例 6 ( 1 ) で得られた乾燥品を 5 mLパイアルに 5· Olmg 量り とつた後、 10 vol %酢酸/塩化メチレン溶液をマイクロシリ ン ジで 3.0 / L添加し、 酢酸含量 8.0%の hPTH(l- 84)成分を得た。
( 4) 実施例 6 ( 1 ) で得られた乾燥品を 5 mLパイアルに 5.48mg 量り とつた後、 10 vol %酢酸/塩化メチレン溶液をマイクロシリ ン ジで 4.4/ L添加し、 酢酸含量 10.2%の hPTH(l- 84)成分を得た。
( 5 ) 実施例 6 ( 1 ) で得られた乾燥品を 5 mLパイアルに 5.47mg 量り とつた後、 10 vol %酢酸/塩化メチレン溶液をマイクロシリ ン ジで 5.5 μじ添加し、 酢酸含量 12.3%の hPTH(l-84)成分を得た。
( 6 ) 実施例 6 ( 1 ) で得られた乾燥品を 5 mLパイアルに 5.10mg 量り とつた後、 10 vol %酢酸/塩化メチレン溶液をマイ クロシリ ン ジで 10.2/zL添加し、 酢酸含量 22.9 %の hPTH(l-84)成分を得た。
( 7 ) 実施例 6 ( 1 ) で得られた乾燥品を 5 mLパイアルに 5.53mg 量り とつた後、 10 vol %酢酸/塩化メチレン溶液をマイクロシリ ン ジで 16.6 添加し、 酢酸含量 33.6%の hPTH(l-84)成分を得た。
試験例 1 . hPTH(l- 34)の安定性 （ 1 )
hPTHとの塩または付着物と して含まれる酢酸を除去した hPTHの安 定性について検討した。
ガラスパイアルに充填、 密閉した参考例 1で得られた hPTH(l- 34) 150 mgを含む酢酸含量 9.5%の凍結乾燥品をナガノ科学 LH- 30- 14保 管庫で 40土 1°Cの条件下、 6ヶ月保存し、 保存開始時、 保存後に逆相 HPLCを行い、 保存開始時に存在する分解 （副成） 物及び保存後に生 じる分解 （副成） 物を単離し、 それらの構造を調べた。 結果を表 2 に示す。
また、 保存後の逆相 HPLCクロマ トグラムを図 1に示す。 hPTH(l - 3 4)ピークの後方 （保持時間 13分〜 17分） に Cおよび Dの 3本のピ ークが現れた。 これらのピーク面積％は、 表 2に示すよ うに、 それ ぞれ B; 3.9%、 C; 6.9%、 D; 3.0%で、 合計 13.8%になり hPTHd - 34)劣 化の主因であった。 また、 それぞれのピークの構造解析を行った結 果、 Bが [N ε -acetyl-Lys13]-hPTH(l-34)と [N ε -acetyl - Lys26 ] - hPT H (卜 34)の混合物、 Cが [Να - acetyl- Ser -hPTHd- 34)、 Dが [N ε - ac etyl-Lys27 ]-hPTH(l-34)T?あった。
次に実施例 1 ( 3 ) で得られた齚酸含量 2.9%の hPTH(l- 34)凍結乾 燥品について同様に安定性について検討した。
ガラスパイアルに充填、 密閉した hPTH(l- 34)約 150 mgを含む酢酸 含量 2.9%の凍結乾燥品をナガノ科学 LH- 30- 14保管庫で 40土 Cの 条件下、 6ヶ月保存し、 保存開始時、 保存後に逆相 HPLCを行い、 保 存開始時に存在する分解 （副成） 物及び保存後に生じる分解 （副成 ) 物を単離し、 それらの構造を調べた。 結果を表 3に示す。
また、 保存後の逆相 HPLCクロマ トグラムを図 2に示す。 図 2から 明らかなように、 酢酸含量 9. 5%の hPTH( l-34)凍結乾燥品と比較し、 ピーク B、 Cおよび Dの面積がいずれも減少した。 また、 表 3に示す よ うに、 ピーク B、 Cおよび Dの面積の合計は、 保存開始時は酢酸含 量 9. 5%の hPTH( l- 34 )凍結乾燥品と同様、 0. 2%であったが、 保存後は 、 3. 6%であり、 酢酸含量9. 5%の1^111( 1-34)凍結乾燥品の13. 8%と比 較して著しく減少した。
従って、 hPTHの場合、 ァセチル体が生要分解物であり、 塩または 付着物として存在する鲊酸が安定性を低下させるため、 hPTHとの塩 または付着物として存在する酢酸含量を減らすことで、 hPTHの安定 性が向上することが判明した。 すなわち、 酢酸の減量により良好な 安定性を有する医薬用成分が提供されることが示された。
表 2
Figure imgf000035_0001
* ： ピーク Βは混合物
表 3 . hPTH(l- 34)の安定性 (酢酸含量 ： 2.9%、 40 ノ6ケ月保存）
開始時 保存後 ピーク 分解 （副成） 物
(ピーク面積0 /0 ) (ピーク面積％ )
XI [Met(0)8 ]-hPTH(l-34) 0.1% 0.1%
12 [Met(O)1 8 ]-hPTH(l-34) 0.1% "θ.1%
[ ΐ -AcLys1 3 ]-hPTH(l-34) -検出されず 1.4%
B*
[ ε -AcLys2 6 ] -hPTH(l-34)
[Na - AcSer1 ] - hPTH(l- 34) 0.2% し 0%
D [ ε -AcLys2 7 ] - hPTH( 1 - 34 ) — き- -?—. L.2% その他 未同定分解物 0.1% 3.9% hPTH(l-34) 99.5% 92.3%
、 100.0% 100.0%
* ： ピーク Βは混合物 試験例 2. hPTH(l- 34)の安定性 （ 2 )
実施例 4及び参考例 4で得られた各酢酸含量を有する試料を、 各 々 80°Cで 15時間保存した後、 蒸留水 15 mLをシリ ンジで加え溶解さ せ、 分解 （副成） 物と保存後純度を測定した。 結果を表 4に示す。 また、 各酢酸含量における保存後のァセチル体 （B、 D) の生成 量 （％ ) を図 3に示す。
表 4及び図 3から明らかなように、 酢酸含量の減少に伴い、 ァセ チル化由来の分解物 B、 C、 Dが減少した。
また、 各酢酸含量における保存後純度を図 4に示すが、 図 4から 明らかなように、 化学当量 （酢酸含量約 7.3%) を変曲点に純度がシ グモイ ド様となり、 化学当量未満で安定性が急に上昇したことが明 らかになった。
すなわち、 酢酸の減量によ り良好な安定性を有する医薬用成分が 提供されることが示された。 表 4 hPTH(l-34)の安定性 （80°Cノ 15時間保存）
酢酸含量 （％)
分解（副成）物 CD
2 00-0 2.5 3.6 5.1 6.2 7.5 9.1 9.9 12.5 13.7 72.5*
XI ( ) ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND
X2 (%) ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND
B (%) 0.15 0.43 0.64 0.91 0.95 1.32 2.19 1.87 1.82 1.93 2.75 5.24
C (%) 0.09 0.28 0.61 1.30 1.63 2.85 4.92 4.80 6.25 6.92 17.8 19.5
D (%) 0.16 0.27 0.40 0.60 0.87 1.04 1.50 1.58 1.28 1.31 1.82 2.8 その他（％) 0.74 0.93 1.10 1.14 1.48 2.22 1. 5 2.54 1.91 2.58 12.4 39.9 hPTH(l-34)
98.1 97.2 96.0 95.1 92.6 89.9 89.2 88.7 87.3 65.2 32.6 (%)
ND： 検出されず
*保存後液状
XI [Met(0)8]-hPTH(l-34)
X2 [Met(0)18]-hPTH(l-34)
B [Ν ε -AcLys13]-hPTH(l-34)と [Ν ε -AcLys26 ] - hPTH( 1- 34)の混合物
C [No; -AcSer1 ]-hPTH(l-34)
D [ ε -AcLys27]-hPTH(l-34)
00
O * 試験例 3 . hPTH( l-84 )の安定性
実施例 6及び参考例 5で得られた各酢酸含量を有する試料の入つ たパイアルを、 室温に 1分間放置して塩化メチレンを蒸散させた後 に打栓した。 これら種々の酢酸含量をもつ試料を 80°Cで 15時間保存 した後、 蒸留水 1 mLをシリ ンジで加え溶解させ、 分解 （副成） 物と 保存後純度を測定した。 結果を表 5に示す。 また、 15時間保存時の 逆相 HPLCクロマ トグラムを図 5に、 さらに、 各酢酸含量における保 存後の分解 （副成） 物の生成量 （％) を図 6に示す。
図 5に示されるよ うに、 保存によ り R1から R6までの分解 （副成） 物が生成した。 また、 表 5及び図 6よ り、 R5以外の分解 （副成） 物 は、 酢酸含量の上昇に伴い増加したことが明らかになつた。
さらに、 各酢酸含量における保存後純度を図 7に示すが、 hPTH( 卜 84)の純度は酢酸含量の低下に伴い高く なり、 化学当量 （酢酸含 量約 4. 5%) 未満で上昇した。 以上の結果から、 hPTH( l-84)の場合は 、 酢酸含量に関係しない分解 （副成） 物が生じるものの、 hPTH( l - 3 4)と同じように大部分が hPTHとの塩または付着物と して存在する酢 酸が関与し、 すなわち、 酢酸の減量によ り良好な安定性を有する医 薬用成分が提供されることが示された。
表 5 hPTH(l- 84)の安定性—（80°C/15時間保一存）
酢酸含量 (%)
分解（副成）物
1.6 2.2 2.7 3.8 5.2 6.4 8.0 10.2 12.3 22.9 33.6
R1 (%) ND 2.52 4.38 4.55 5.46 6.60 6.82 8.04 8.8 12.0 12.4
R2 (%) 0.05 0.24 1.83 1.85 2.67 4.05 3.80 5.03 5.91 11.3 14.8
R3 (%) ND ND 1.82 1.80 2.00 2.31 2.22 2.28 2.45 3.21 9.32
CO R4 (%) 0.88 1.83 2.18 2.15 2.39 2.57 2.59 2.86 2.96 3.41 6.61
R5 ( ) 5.68 5.27 4.48 5.11 5.56 4.89 4.62 4.82 5.03 5.89 5.13
R6 (%) 0.68 1.66 1.66 1.83 2.94 2.83 2.76 3.33 4.70 6.87 12.2 hPTH(l-84)
92.8 88.5 S3.6 82.7 79.0 76.7 77.2 73.6 70.1 57.3 39.6 (%)
ND： 検出されず
試験例 4 . 官能性試験 （ 1 )
hPTHの医薬用成分について鼻腔内投与時の使用感を検討した。 0. 6 w/v%クェン酸水溶液あるいは水に、 参考例 1で得られた hPTH ( 1-34 )の凍結乾燥品を溶解し （lOing/ml ) 、 ねじ付きガラスパイ ァ ルに移しパロァ社製スプレーノズル （50 β 1 ) を装着し、 50 μ ΐを 片鼻に噴霧し、 鼻腔内投与による臭いと刺激を評価した （健常成人 男性 12名） 。 臭いに関しては、 臭いを感じる程度を 「酸臭あり」 、
「僅かに酸臭あり」 、 「ほとんどなし」 及び 「なし」 に分類して評 価した。 また、 刺激は、 刺激を 「痛みを伴う刺激」 、 「強い刺激」 、 「弱い刺激」 及び 「ごく弱い刺激」 の 4段階スコアで評価した。 なお、 コ ン ト ロールとして、 生理食塩水を用いた。 結果を表 6に示 す。
表 6から明らかなように、 hPTH ( l-34 )のクェン酸水溶液、 hPTH ( 1 - 34 )の水溶液ともに、 強い酸臭が示され、 不快感が認められた。 次に、 各種有機酸の水溶液を調製し、 鼻腔内投与時の臭いと刺激 の原因を検'討した。 有機酸と しては、 酢酸およびクェン酸並びに酒 石酸、 蓚酸、 リ ンゴ酸、 フタル酸、 ァスコルビン酸、 アジピン酸お よびグリ コール酸を用いた。
0. 1v/v%、 0. 2v/v%、 0. 3v/v%および 0. 6v/v%の酢酸水溶液、 クェン 酸、 酒石酸、 蓚酸、 リ ンゴ酸、 フタル酸、 ァスコルビン酸、 アジピ ン酸およびダリ コール酸の 0. 6w/v%水溶液を調製し、 鼻腔内に噴霧 し、 上記と同様にして臭いと刺激の評価を行った （健常成人男性 4 名） 。 結果を表 6に示す。 表 6から明らかなように、 酢酸は 0. 3v/v %以上で強い酸臭が示され、 0. 3v/v%以上で刺激も増大した。
一方、 使用した有機酸の水溶液では臭いが感じられず、 また刺激 についてはクェン酸は、 ァス コルビン酸、 アジピン酸、 ダリ コール 酸と ともに、 生理食塩水の鼻腔内投与による結果と同程度であった また、 参考例 1で得られた hPTH(l- 34)凍結乾燥品の酢酸含量は約 9· 5%であり、 本試験例で投与したこの hPTH(l- 34)溶液と 0.1v/v% 酢酸水溶液は、 ほぼ同量の酢酸を含有している。
上記の結果よ り、 クェン酸自身には臭いが認められないので、 hP THの医薬用成分において臭いは、 hPTH(l-34)との塩または付着物と して含まれる酢酸が酢酸水溶液としては臭いを感じさせない濃度で 原因になることが明らかになった。
ついで、 実施例 1 ( 3 ) で得られた酢酸含量 2· 9%の hPTH(l- 34)凍 結乾燥品を用いて hPTHが 5mg/mLの 0.4 kゥェン酸水溶液を調製し 、 同様に、 鼻腔内投与による臭いと刺激を評価した （健常成人男性 12名） 。 結果を表 6に示す。 表 6よ り明らかなように酢酸の減量に よ り臭いと刺激が抑制され、 医薬組成物に使用されるとき使用感に 優れた医薬用成分が提供されることが示された。
Figure imgf000042_0001
++++ ：痛みを伴う強い刺激
+++ ：強い刺激
++ ：弱い刺激
+ ：ごく弱い刺激
※ェ. 10 mg/mL hPTH(l- 34) (酢酸含量 9.5%) の 0.6w/v% タエ ン酸水溶液
※2. 10 mg/mL hPTH(l- 34) (酢酸含量 9.5%) の水溶液
¾ 3. 5 mg/mL hPTH(l- 34) (酢酸含量 2.9%) の 0.4w/v% クェ ン酸水溶液
試験例 5. 官能性試験 （ 2 )
( 1 ) 試験液の調製
参考例 1 で得られた酢酸含量 9.5%の凍結乾燥品（ hPTH ( 1- 34 ) 300mg )を蒸留水 （30mL) に溶かして lOmg/mLの水溶液を調製した。 さ らに 、 この溶液 （PH4.7) に対し、 電気透析膜 AC- 130-10 (旭化成工業株 式会社） を装着したマイクロァシライザ一 （旭化成工業株式会社） にて電気透析を行ない、 pHが 5.0 (酢酸含量 7.3%) になるまで酢酸 を除去し、 hPTH(l-34)水溶液を調製した。
同様に、 pHが 6.0 (酢酸含量 2.9%) になるまで酢酸を除去し、 hP TH(1- 34)水溶液を調製した。 また pHが 7.6 (酢酸含量 0.5%) になる まで酢酸を除去し、 hPTH(l- 34)水溶液を調製した。
( 2 ) 官能性試験
本試験例 （ 1 ) で調製した各試験液 1.5mLに、 各々精製白糖 270mg 、 クェン酸 12mg及び塩化べンザルコニゥム 0.3mgを含む水溶液 1.5mL を混合し経鼻処方溶液とした。 この経鼻処方溶液の入ったパイアル にバロア社製のスプレーノズル （50 μ ΐ) を装着して官能試験に用 いた （健常成人男性 5名） 。 臭いについて、 「Α : 酢酸臭をほとん ど感じない」 、 「Β : 酢酸臭が弱い」 及び 「C : 酢酸臭が強い」 に分 類して評価した。 刺激について、 「A : 刺激を感じない」 、 「B： 多 少刺激がある」 及び 「C : 刺激が強い」 に分類して評価した。 結果 を表 7に示す。
表 7より明らかなように、 酢酸の減量により、 臭いと刺激が抑制 され、 経鼻投与用医薬組成物に使用されるとき長期に渡って使用可 能な、 使用感に優れた医薬用成分が提供されることが示された。
7 . 各穉酢酸含量 hPTH( l- 34)含有製剤の官能試験
Figure imgf000044_0001
臭い
A ： 酢酸臭をほとんど感じない
B 酢酸臭が弱い
C 酢酸臭が強い
刺激
A 刺激を感じない
B 多少刺激がある
C 刺激が強い
試験例 6 . 各種有機酸の hPTHの安定性における影響
酢酸の除去は、 前述した電気透析等の方法により行えるが、 酢酸 を他の有機酸に置換することによつても、 可能である。
酢酸を他の有機酸で置換した場合の hPTHの安定性について評価し た。
本試験例には有機酸は吸収促進剤として知られ、 試験例 4におい て使用感に優れた有機酸であることが確認された、 アジピン酸、 ク ェン酸およびグリ コール酸を用いた。 なお、 有機酸の添加は、 酢酸 と置換する量と して、 化学当量添加した。 hPTH( l - 34 )は塩基性アミ ノ酸 9残基と酸性ァミノ酸 4残基を含み、 分子全体で + 5の陽電荷 が酸成分と塩を形成する量、 すなわち、 化学当量である 1 モルの hP TH( l-34) ( Mw. 4117. 8) あたり、 アジピン酸（Mw. 146. 14 ) 5/2モル 、 クェン酸（Mw. 192.13) 5/3モルあるいはグリ コール酸 （Mw. 76.0 5) 5モルを各々添加した。
実施例 1 ( 3 ) で得られた酢酸含量 2.9%の hPTH(l- 34)凍結乾燥品 を用いて、 5mg/mLの hPTH(l_34)水溶液を調製した。
この溶液 2 mL (hPTH(l- 34)10 mg、 2.43μιηο1) に対し、 アジピ ン酸 888 μ g (2.43X5/2 μ mol)、 クェン酸 778 μ g (2.43X5/3 μ m ol)あるいはダリ コール酸 924 g (2.43X5/ mol)を各々添加した 。 蒸留水でペプチド濃度が lmg/mLになるよ うに各溶液を調製、 凍結 乾燥し、 hPTH(l - 34)を 10 mgずつ含む凍結乾燥品を得た。 これら各 試料を 6 0 °Cで 3週間保存し、 開始時純度、 保存後純度を逆相 HPLC を用いて測定し、 安定性の評価を行った。 コン ト ロールには、 実施 例 1 ( 3 ) で作製した酢酸含量 2.9 %の hPTH(l- 34)凍結乾燥品を使 用した。 結果を表 8に示す。
アジピン酸、 クェン酸、 グリ コール酸を添加した場合、 酢酸含量 2.9 %の hPTH ( 1-34)凍結乾燥品の保存後の純度が 92.7%であるのに対 し、 アジピン酸塩で 92.0%、 クェン酸塩で 93.9%、 グリ コール酸塩 で 90.3%であった。 従って、 hPTHとの塩または付着物として含まれ る酢酸を化学当量未満に減量した hPTHの医薬用成分と同様、 これに アジピン酸、 クェン酸またはダリ コール酸を加えた医薬用成分も、 優れた安定性を有し、 いずれも使用感と安定性を満足する医薬用成 分であることが示された。
また、 hPTHとの塩または付着物と して存在する酢酸をこれら有機 酸と置換し酢酸含量を減らして同様の医薬用成分が得られることが 示された。 さ らに、 酢酸の減量によ り得られた、 良好な安定性を有 し、 かつ、 医薬組成物に使用されるとき使用感に優れた医薬用成分 が、 吸収改善を目的と して有機酸を配合しても安定である配合変化 特性を有することが示された。
Figure imgf000046_0001
※ ： 酸含量 =酸重量 X100(%)ノ hPTHのぺプチ ド重量 試験例 7. 経鼻吸収試験
経鼻投与製剤の設計に際し、 重要な要素のひとつである経鼻吸収 性について検討を行った。 試験例 4で使用感に優れた有機酸である ことが確認されたクェン酸とァスコルビン酸の経鼻吸収効果を、 血 中薬物濃度一時間曲線下面積 （AU C) とパイオアべィラビリティ 一により評価した。
実施例 1 ( 3 ) で得られた酢酸含量 2.9%の hPTH(l- 34)凍結乾燥 品を、 0.3w/v%、 0· 6w/v%ァスコルビン酸および 0· 2w/v%、 0.3w/v% 、 0.4w/v%、 0.6w/v%クェン酸水溶液に溶解し、 5mg/mLのペプチド溶 液を調製した。 同様に、 実施例 5 ( 4 ) で得られた酢酸含量 0.9%の hPTH(l-84)凍結乾燥品をクェン酸の 0.6w/v%水溶液に溶解し、 10 mg /mLのペプチド溶液を調製し、 本試験に使用した。 なお、 コ ン ト 口 ールとして、 実施例 1 ( 3 ) で得られた酢酸含量 2· 9%の hPTH(l- 34 )凍結乾燥品および実施例 5 ( 4 ) で得られた酢酸含量 0.9%の hPTH( 1 - 84)凍結乾燥品を生理食塩水に溶解した溶液を用いた。
また、 実施例 1 ( 3 ) で得られた酢酸含量 2.9%の hPTH(l- 34)凍 結乾燥品の 0.3w/v%あるいは 0.6w/v%クェン酸水溶液に、 蛋白質分解 酵素の阻害剤と して知られているメシル酸力モスタツ トを 0.3w/v% 添加した溶液を調製し、 本試験に使用した。
7〜 9週齢の Sprague - Dawley系 ¾性ラッ ト （Crj: CD、 日本チヤ ールズリパー） を金属ケージにて、 温度 22±5°C、 湿度 30〜70%、 明 暗サイクル 1 2時間で飼育し、 固形飼料と水道水を自由に摂取させ た。 試験 2 4時間前から絶食させ試験に供した （1群 5匹） 。
経鼻投与の場合、 ペントパルビタール麻酔下で大腿動脈力ニュー レを施した後、 各試料溶液 5 /z Lあるいは I O L (塩化ベンザルコニ ゥム、 シユークロースを含む） をピペッ トマンで左鼻腔内に投与し た。 力ニューレよ り、 凝固防止剤と酵素阻害剤を添加した採血チュ ーブに採血し、 遠心して血漿を得た。 血漿中の hPTH( l- 34)及び hPTH ( 1- 84)の濃度を抗 PTH ( 1- 34)抗体 ( CHEMI CON INTERNATI ONAL INC.製 )を用いた RIA法で測定した。
皮下投与の場合、 ラッ ト背部皮下にシリ ンジにて 1 mL/kgの容量 で試料溶液を投与し、 経鼻投与と同様の手順で血漿中 hPTH濃度を求 めた。
なお、 パイオアべィラビリティ一は hPTHU - 34)については投与後 3時間、 また hPTH( l-84)については投与後 6時間までの対皮下注 AUC との比で算出した。 結果を表 9に示す。
皮下注に対するパイオアべィラビリティーが、 hPTH( l- 34)単独に おいては 1. 4%であったのに対し、 hPTH( l- 34 )の 0. 3w/v%〜0. 6w/v% ァスコルビン酸水溶液あるいは 0. 2w/v%〜 0. 6w/v%クェン酸水溶液の 場合は、 それぞれ 5% ~ 10%、 12%〜19%と向上した。
また、 hPTH( l- 84 )では、 0. 6w/v%クェン酸水溶液で約 30%のパイ ォアベイラビリティ一を示した。
さらに、 蛋白質分解酵素の阻害剤であるメシル酸力モスタツ トを 加えた溶液においては、 hPTH( l-34)で 27%〜31%のノ ィオアべィラビ リティーを示した。
このよ う に、 有機酸の低濃度での使用によ り、 良好な経鼻吸収効 果が認められた。 また、 さらに吸収促進剤を加えることによ り、 さ らに良好な経鼻吸収効果が認められた。 すなわち、 hPTHとの塩また は付着物として存在する酢酸を減じることにより得られた、 良好な 安定性を有し、 かつ、 医薬組成物に使用されるとき使用感に優れた 医薬用成分を含有する経鼻投与用医薬組成物が経鼻薬として好適に 使用できることが示された。
Figure imgf000049_0001
製剤例 1
精製白糖 （日局） 40.5 gを精製水 （日局） 124.2 gで溶解し、 27w /v%精製白糖水溶液 150 mLを調製した。 一方、 医薬用成分と して実 施例 2で得られた酢酸含量 2.1%の凍結乾燥品（パイアル 10本、 hPTH( 1-34)1.5 g) を約 75 mLの精製水 （日局） で溶解した。 逆相 HPLC測 定の結果、 該溶液の hPTH(l- 34)濃度は 20.4 mg/mLであった。 この溶 液 72.0 111しに精製水を25.9 mL加え、 濃度を 15mg/mLに調整した。 こ のように調整した 15 mg/mLの hPTH(l-34)溶液 97 mLをと り、 先に調 製した 27Wv%精製白糖水溶液 48.5 mLと混合し、 精製白糖濃度 9w/v %、 hPTH(:i-34)濃度 10 mg/mLの hPTH(l- 34)7 溶液を約 145 mL得た。 該溶液を 3 mLずつパイアル 47本に充填し、 FZ- 6凍結乾燥機 （ラボコ ンコ社製） で凍結乾燥し、 バイアルあたり 270 mgの精製白糖と 30 m gの hPTH(l- 34)を含む安定な医薬組成物を得た。
製剤例 2
精製白糖 （日局） 40.5 gを精製水 （日局） 124.2 gで溶解し、 27w /v%精製白糖水溶液 150 mLを調製した。 一方、 医薬用成分と して実 施例 2で得られた酢酸含量 2.1%の凍結乾燥品（パイアル 5本、 hPTH(l- 34)750mg)を精製水 （日局） 146 mLに溶かし、 hPTH( 1- 34)濃度 5.1 m g/mLの hPTH(l- 34)水溶液を得た。 さらに精製水 （日局） 54 mLを加 えよく撹拌し、 hPTH(l-34)濃度を 3· 8 mg/mLに調整した （200mい 。 得られた hPTH(l - 34)濃度 3.8 mg/mLの溶液 200 mLと先に調整した 27w /v%精製白糖水溶液 lOOinLを混合し、 精製白糖濃度 9w/v%、 hPTH(l- 3 4)濃度 2.5 mg/mLの hPTH(l- 34)水溶液を約 300mL得た。 該溶液を 3 mL ずつパイアル 90本に充填し、 FZ-6凍結乾燥機 （ラボコンコ社製） で 凍結乾燥し、 パイアルあたり 270mgの精製白糖と 7.5mgの hPTH(l- 34) を含む安定な医薬組成物を得た。
製剤例 3 マンニ トール （日局） 22.5 gを精製水 （日局） 124.2 gで溶解し 、 15% マンニ トール水溶液 150 mLを調製した。 一方、 医薬用成分 と して実施例 2で得られた酢酸含量 2.1%の凍結乾燥品（パイアル 10 本、 hPTHU-34)1.5 g) を約 75 mLの精製水 （日局） で溶解した。 逆 相 HPLC測定の結果、 該溶液の1^1111(1-34)濃度は20.4 mg/mLであった 。 この溶液 72.0 mLに精製水を 25.9 mL加え、 濃度を 15mg/mUこ調整 した。 このよ うに調整した 15 mg/mLの hPTH(l- 34)溶液 97 mLをと り 、 先に調製した 15% マンニ トール水溶液 48.5 mLと混合し、 マンニ ト一ル濃度 5%、 hPTH(l- 34)濃度 10 mg/mLの hPTH(l- 34)水溶液を約 14 5 mL得た。 該溶液を 3 mLずつパイアル 47本に充填し、 FZ- 6凍結乾燥 機 （ラボコンコ社製） で凍結乾燥し、 パイアルあたり 150 mgのマン 二 トールと 30 mgの hPTH(l- 34)を含む安定な医薬組成物を得た。
製剤例 4
医薬用成分と して実施例 2で得られた酢酸含量 2.1%の hPTH(l - 34) 凍結乾燥品を 805 mg (粉末重量） 量り と り、 精製水 （日局） 360 mL に溶かし、 逆相 HPLC上の hPTH(l- 34)濃度が 2 mg/mLの水溶液を調製 した。 一方、 マンニ トール （日局） 1 gを量り、 精製水 （日局） 50 mLに溶かしマンニ トール水溶液を調製した。
このマンニトール水溶液 50mL全量と、 先に調製した hPTH(l- 34) 水溶液（2mg/mL)50 mLをよく混合し、 ノ ィアルに 1 mLずつ分注した 。 FZ- 6凍結乾燥機 （ラボコンコ社製） で凍結乾燥し、 パイアルあた り 1 mgの hPTH(l-34)とマンニトール 10 mgを含む安定な医薬組成物 を得た。
製剤例 5
医薬用成分として実施例 2で得られた酢酸含量 2.1%の hPTH(l - 34) 凍結乾燥品を 805 mg (粉末重量） 量り と り、 精製水 （日局） 360 mL に溶かし、 逆相 HPLC上の hPTH(l-34)濃度が 2 mg/mLの水溶液を調製 した。 一方、 マンニ トール （日局） 5 gを量り、 精製水 （日局） 50 mLに溶かしマンニ トール水溶液を調製した。
このマンニ トール水溶液 50mL全量と、 先に調製した hPTH(l-34) 水溶液（2mg/mL)50 mLをよく混合し、 パイアルに 1 mLずつ分注した 。 FZ-6凍結乾燥機 （ラボコンコ社製） で凍結乾燥し、 パイアルあた り 1 mgの hPTH(l- 34)とマンニトール 50 mgを含む安定な医薬組成物 を得た。
製剤例 6
医薬用成分と して実施例 2で得られた酢酸含量 2.1%の hPTH(l - 34) 凍結乾燥品約 11 mg (粉末重量） を量り、 注射用水 （日局） を加え て 500 mLとし、 逆相 HPLC上、 20 μ g/mLの hPTH(l_34)水溶液を得た (溶液 A) 。 精製白糖 （日局） 5 g と塩化べンゼトニゥム 100 mgを 注射用水 （日局） に溶かし、 100 mLに調製した （溶液 B) 。 溶液 Aと 溶液 Bをそれぞれ 30 mLずつ混合し、 1 mLをバイアルに分注し、 FZ- 6 凍結乾燥機 （ラボコンコ社製） で凍結乾燥し、 パイアルあたり 10 μ gの hPTH(l- 34)、 25 mgの精製白糖および 0.5 mgの塩化べンゼト二 ゥムを含む安定な医薬組成物を得た。
製剤例 7
医薬用成分と して実施例 5 ( 2 ) で得られた酢酸含量 2.5%の hPTH (1-84) 凍結乾燥品を約 50 mg (粉末重量） 量り、 注射用水 （日局） を加え、 逆相 HPLC上 2 mg/mLの hPTH(l-84)水溶液を調製した（25 mL)
—方、 精製白糖 （日局） 2 gに注射用水 （日局） を加え 100 mLの 精製白糖水溶液と した。 hPTH(l-84)水溶液（2 mg/mL)20mLと、 調製 した精製白糖水溶液 （2w/v%) 20 mLを混合し、 得られた溶液を lmL ずつパイアル 35本に充填し、 FZ- 6凍結乾燥機 （ラボコンコ社製） で 凍結乾燥し、 パイアルあたり 1 mgの hPTH(l-84)と 10 mgの精製白糖 を含む安定な医薬組成物を得た。
製剤例 8
上記製剤例 1〜 7で得られた医薬組成物を、 用時溶解型製剤と し て使用する場合の添付溶解液を次のよ うに調製した。
塩化ベンザルコニゥム （日局） 0.35g、 クェン酸 （日局） 21. 0 gを量り取り、 3500mLの精製水に溶解した。 この溶液を 3mLずつ ポリプロピレン製ボトルに分注して、 添付溶解液を作成した。
製剤例 9
上記製剤例 1 7で得られた医薬組成物を、 用時溶解型製剤と し て使用する場合の添付溶解液を次のよ うに調製した。
塩化べンゼトニゥム （日局） 0.70g、 クェン酸 （日局） 14. 0 g を量り取り、 3500mLの精製水に溶解した。 この溶液を 3mLずつポ リ プロ ピレン製ボトルに分注して、 添付溶解液を作成した。
製剤例 1 0
上記製剤例 1〜 7で得られた医薬組成物を、 用時溶解型製剤と し て使用する場合の添付溶解液を次のよ うに調製した。
塩化べンゼトニゥム （日局） 0.35g、 アジピン酸 （日局） 21. 0 gを量り取り、 3500mLの精製水に溶解した。 この溶液を 3mLずつ ポリ プロ ピレン製ボトルに分注して、 添付溶解液を作成した。
製剤例 1 1
上記製剤例 1〜 7で得られた医薬組成物を、 用時溶解型製剤と し て使用する場合の添付溶解液を次のよ うに調製した。
塩化セチルピリ ジゥム （日局） 0.70g、 アジピン酸 （日局） 14. O gを量り取り、 3500mLの精製水に溶解した。 この溶液を 3mLず つポリ プロ ピレン製ポトルに分注して、 添付溶解液を作成した。 製剤例 1 2
医薬用成分と して実施例 4 ( 1 ) で得られた酢酸含量 2.5%の凍結 乾燥品 （ 6バイアル、 hPTH(l_34) 900 mg) を 18mLの注射用水 （日 局） に溶解した （50 mg/mL) 。 一方、 クェン酸 （日局） 12 gを注 射用水 （日局） に溶解し、 lOOOmLと した （1.2w/v%クェン酸水溶液 ) 。 これらを用いて液剤を次のようにして調製した。
1 . pH 3、 hPTH (1-34) 5mg/mL、 クェン酸 0.6w/v%溶液調製
1.2w/v% クェン酸水溶液 6mLと 50mg/mLの hPTH(l-34)水溶液 1.2mL を混合し、 IN NaOH 95 w Lを加えて pHを 3に調整した。 次にこの溶 液に注射用水を加え 12 mLの溶液と した。 得られた溶液を 0.22 μ ιηろ 過フィルターでろ過し、 標記医薬組成物を得た。
2 . pH 3.5、 hPTH (1 - 34) 5mg/mL、 クェン酸 0.6w/v%溶液調製
1.2w/v% クェン酸水溶液 6mLと 50mg/mLの hPTH(l-34)水溶液 1.2mL を混合し、 IN NaOH 210 x Lを加えて pHを 3. 5に調整した。 次にこ の溶液に注射用水を加え 12 mLの溶液とした。 得られた溶液を 0.22 μ ιηろ過フィルターでろ過し、 標記医薬組成物を得た。
3 . pH 4、 hPTH (1-34) 5mg/mL、 クェン酸 0.6w/v%溶液調製
1.2w/v% クェン酸水溶液 6mLと 50mg/mLの hPTH(l- 34)水溶液 1.2mL を混合し、 IN NaOH 350 μ Lを加えて pHを 4.0に調整した。 次にこの 溶液に注射用水を加え 12 mLの溶液と した。 得られた溶液を 0· 22 μ πι ろ過フィルターでろ過し、 標記医薬組成物を得た。
4 . pH 4.5、 hPTH (1 - 34) lmg/mL、 クェン酸 0.4w/v%溶液調製
1.2w/v% クェン酸水溶液 4mL、 50mg/mLの hPTH(:L 34)水溶液 0.24mL 、 および精製水約 5mLを混合し、 IN NaOH 335 μ Lを加えて pHを 4.5に 調整した。 次にこの溶液に注射用水を加えて 12HILの溶液とした。 得 られた溶液を 0.22 μ ιηろ過フィルターでろ過し、 標記医薬組成物を 得た。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 酢酸の量を減少することによ り、 良好な安定性 を有し、 かつ、 医薬組成物に使用されるとき使用感に優れた医薬用 成分が得られる。
本発明の医薬用成分は、 製剤化に際し通常用いられる担体、 賦形 剤等の成分はもとより、 種々の他の機能性成分を適宜配合すること ができ、 種々の投与形態の医薬組成物に使用され、 また、 種々の剤 形に適用可能なものである。
本発明によれば、 長期に渡って使用される経鼻投与用医薬組成物 が提供される。

Claims

求 の 範 囲
1 . ヒ ト副甲状腺ホルモンペプチドまたはその誘導体と、 ヒ ト副 甲状腺ホルモンぺプチドまたはその誘導体に対して化学当量未満の 酢酸からなることを特徴とする医薬用成分。
2 . ヒ ト副甲状腺ホルモンぺプチドまたはその誘導体と酢酸との 塩からなる医薬用成分であって、 酢酸がヒ ト副甲状腺ホ モンぺプ チドまたはその誘導体に対して化学当量未満である請求項 1記載の 医薬用成分。
3 . ヒ ト副甲状腺ホルモンペプチドまたはその誘導体が、 ァミノ 酸番号 1〜 8 4からなるぺプチドである場合は該ぺプチドと該ぺプ チドに対して 3重量％以下の酢酸からなり、 また、 アミ ノ酸番号 1 〜 3 4からなるぺプチドである場合は該ぺプチドと該ペプチドに対 して 6重量％以下の酢酸からなる請求項 1 または 2記載の医薬用成 分。
4 . ヒ ト副甲状腺ホルモンペプチドまたはその誘導体が、 アミ ノ酸番号 1〜 3 4からなるぺプチドである場合は該ぺプチドと該ぺ プチドに対して 4重量％以下の酢酸からなる請求項 1〜 3のいずれ か 1項に記載の医薬用成分。
5 . 凍結乾燥組成物である請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の 医薬用成分。
6 . 経鼻投与用である請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の医薬 用成分。
7 . ヒ ト副甲状腺ホルモンペプチドまたはその誘導体を有効成分 とする医薬組成物であって、 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の 医薬用成分を含有することを特徴とする経鼻投与用医薬組成物。
8 . 凍結乾燥部と添付溶解液部で構成され、 請求項 1〜 6のいず れか 1項に記載の医薬用成分を凍結乾燥部に含有する用時溶解型製 剤。
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