WO2001096594A2 - Testsystem zur bestimmung der aktivität von cyclo-nukleotid-abhängigen proteinkinasen und vasp-phosphatasen - Google Patents

Testsystem zur bestimmung der aktivität von cyclo-nukleotid-abhängigen proteinkinasen und vasp-phosphatasen Download PDF

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WO2001096594A2
WO2001096594A2 PCT/EP2001/006621 EP0106621W WO0196594A2 WO 2001096594 A2 WO2001096594 A2 WO 2001096594A2 EP 0106621 W EP0106621 W EP 0106621W WO 0196594 A2 WO0196594 A2 WO 0196594A2
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phosphatase
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Peter DRÜCKES
Thomas Jarchau
Ulrich Walter
Benjamin Bader
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Vasopharm Biotech Gmbh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/91245—Nucleotidyltransferases (2.7.7)

Definitions

  • Test system for determining the activity of cyclo-nucleotide-dependent protein kinases and VASP phosphatases
  • the present invention relates to a test system for the detection of the activity of cyclo-nucleotide-dependent protein kinases or of phosphatases which dephosphorylate the vasodilator-stimulated phosphoprotein (“VASP”), process for its production and its use in (high throughput) screening processes ,
  • VASP vasodilator-stimulated phosphoprotein
  • Cyclo-nucleotide-dependent protein kinases (“cNPK”), their substrates (“cNPKS”), and the corresponding protein phosphatases are part of important physiologically, pathophysiologically and pharmacologically relevant cellular signaling pathways (see citations 1, 2 and 3).
  • the cNPK include cAMP-dependent protein kinases (“cAK”) and cGMP-dependent protein kinases (“cGK”).
  • cGK cGMP-dependent protein kinases
  • cGK cGMP-dependent protein kinases
  • cGK In addition to other cGMP effector systems, e.g. cGMP-regulated phosphodiesterases and ion channels, cGK in particular is an important mediator of cGMP-mediated signal transmission.
  • GC-A, GC-B, GC-C membrane-bound guanylyl cyclases
  • GC-A membrane-bound guanylyl cyclases
  • GC-S membrane-bound guanylyl cyclases
  • One of the most important agonists of soluble guanylyl cyclase is the nitrogen monoxide (NO) formed by the NO synthases (NOS III-III).
  • NOS III-III nitrogen monoxide
  • the established effects caused by an increase in cGMP include relaxation of smooth muscle cells (SMCs) and inhibition of platelet activation.
  • cGMP effects are mediated by the cGK (type I) (see citations 1-3). This could be confirmed in corresponding mouse models with cGK-1 deficiency (see citations 4 and 5).
  • cGK are known as homodimers, from which a soluble (monomer 76 kDa; cGK I) and a membrane-based form (monomer 86 kDa; cGK II) can be distinguished.
  • the membrane anchorage of the cGK II is mediated via the N-terminal myristoylation (cf. citations 1-3). There are two isoforms of cGK I and cGK Iß of cGK I.
  • cGK I which is generally referred to as soluble form, is predominantly present in platelets and partially in smooth muscle cells.
  • a particularly high expression of cGK I can be found in human blood platelets and in smooth muscle cells. Activation of cGK-1 in these cells leads to the effects already described above, such as lowering the intracellular Ca (2+) level, inhibiting blood platelets and the contraction of smooth muscle cells.
  • the known substrates of cGK include, among others, e.g. the inositol 1, 4,5-triphosphate receptor (IP3R) and the VASP, as well as p25, cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) and 6-pyruvoyl tetrahydro-pterine synthase (PTPS).
  • IP3R inositol 1, 4,5-triphosphate receptor
  • VASP p25
  • CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator
  • PTPS 6-pyruvoyl tetrahydro-pterine synthase
  • 8-Br-cGMP, 8-pCPT-cGMP have been described as activators of cGK, while certain cGMP analogs (Rp-8Br-PET-cGMPS, Rp-8-pCPT-cGMPS) and isoquinolinesulfonamide derivatives (KT 5823, H8 and H89) which inhibit cGK (cf. quote 12).
  • cNPK assays are usually carried out by incorporating radioactive phosphorus isotopes ( 32 P or 33 P) in peptide substrates and then separating these reaction products from the starting materials, for example by immobilizing them on a carrier substance (citation 16) or by separating them Reaction products using gel electrophoresis and radio- or immunochemical detection after protein transfer to membranes in the presence of product-specific antibodies (such as in a Western blot, WO 99 / 24,473).
  • a carrier substance citation 16
  • product-specific antibodies such as in a Western blot, WO 99 / 24,473
  • test system described (synonym: assay or diagnostic) is suitable for the effect on a large number of (test) compounds, preferably from chemical or natural substance libraries, in a simple manner to be able to investigate the activity of a cNPK [so-called. High Throughput Screening (short: HTS)].
  • test system can be used to test a large number of (test) compounds from chemical or natural substance libraries in a simple and effective manner for their effect on the activity of a VASP phosphatase [ so-called. High Throughput Screening (short: HTS)].
  • the present invention therefore relates to an HTS-suitable test system for detecting the activity of a cNPK containing a) at least one test compound b) at least one suitable cNPK substrate (cNPKS) c) at least one composition to be incubated containing cNPK and ATP, and d) a suitable detection system for the quantitative determination of the amount of the phosphorylated cNPK substrate.
  • the present invention therefore furthermore relates to an HTS-suitable test system for detecting the activity of the VASP phosphatase containing e) at least one test compound, f) at least one suitable VASP phosphatase substrate, g) at least one composition to be incubated containing VASP phosphatase , and h) a suitable detection system for the quantitative determination of the amount of dephosphorylated VASP phosphatase substrate.
  • test system both objects mentioned are referred to below as the test system according to the invention.
  • test system As a gel-free test system, the test system according to the invention enables a large number of quantitative individual determinations and, by dispensing with gel electrophoretic separation steps, fulfills special requirements with regard to speed, sample size and material consumption. Reproducibility, robustness, solvent tolerance and automation are also guaranteed.
  • test system allows the search for one or more, the same or different test compounds.
  • the cNPK used is preferably a cGK or cAK or a functional variant with the activity of a cNPK.
  • Such protein kinases can be used in purified form or as a crude extract, in particular as a component in protein mixtures from homogenates of biological origin, preferably of human origin.
  • VASP phosphatase used can also be a functional variant with the activity of a VASP phosphatase.
  • VASP phosphatases can be used in purified form or as a crude extract, in particular as a component in protein mixtures from homogenates of biological origin, preferably of human origin.
  • VASP is very particularly preferred as a suitable cNPK substrate according to feature (b) - according to SEQ ID No. 1 (described in C. Haffner et al. In EMBO J., 14 (1), 19-27 (1995)) —containing preferably usable phosphorylation sites, namely: serine-157, serine-239 and threonine-278.
  • cNPK can phosphorylate all three residues, but the cAMP-dependent protein kinase serine 157 is preferred as the main phosphorylation site, while the cGMP-dependent protein kinase Serine-239 preferred.
  • Threonine-278 is phosphorylated by both kinases with a comparable specificity.
  • VASP phosphatase substrate is phosphorylated VASP, corresponding to SEQ ID No. 1, which is phosphorylated at the preferred operable phosphorylation sites, namely: Serin-157, Serin-239 and Threonin-278.
  • such peptide or polypeptide variants or peptoids can also be used as functional variants of a cNPK substrate or a VASP phosphatase substrate, which preferably contain amino acid sequences from VASP, which are present in the vicinity of the phosphorylation or dephosphorylation sites mentioned and although not finally particularly preferably the pentamers with the amino acids 155-159 and / or 237-241 and / or 276-280 according to SEQ ID No. 1 or preferably the decamers with the amino acids 152-161 and / or 234-243 and / or 273-282 from SEQ ID No. 1 or other suitable partial sequences (e.g. see in Fig. 1).
  • Such peptides phosphorylated according to the invention can be detected particularly advantageously with suitable antibodies in terms of features (d) or (h), preferably monoclonal antibodies.
  • the monoclonal antibody 16C2 which is selected and obtainable from the hybridoma cell line DSM ACC2330, is very particularly preferably used (WO 99/24473).
  • This antibody or a functional variant thereof specifically detects a phosphorylation event, very particularly preferably it recognizes an epitope which contains the phosphorylated serine 239 of the VASP sequence.
  • a functional variant relates in particular to those antibodies with an agreement of preferably 90-99% or 70-90% in the amino acid sequence of 16C2 with the homologous function of quantitatively determining a reaction product in the sense of feature (d) or (h).
  • the test system according to the invention can be run both heterogeneously (for example after immobilization of the reaction products) but preferably homogeneously.
  • the immunological detection in the sense of features (d) or (h) can be carried out according to the methods known to the person skilled in the art, such as, for example, coupled enzyme reaction (alkaline phosphatase or luciferase) or general sandwich technologies (for example ELISA), and fluorimetric methods (fluorescence , time-resolved fluorescence, fluorescence resonance energy transfer (FRET)).
  • coupled enzyme reaction alkaline phosphatase or luciferase
  • sandwich technologies for example ELISA
  • fluorimetric methods fluorescence , time-resolved fluorescence, fluorescence resonance energy transfer (FRET)
  • test system according to the invention can preferably be automated as a homogeneous HTS and is therefore suitable for 96, 384, 1536-well plates and more.
  • the present invention also relates to a method for producing a test system, in which at least one compound to be examined and at least one composition containing cNPK, ATP and cNPK substrate, optionally a phosphorylation reaction stopper, at least one suitable detection system, such as an antibody, including an immunological detection agent and if necessary, other aids are put together
  • the present invention also relates to a method for producing a test system, in which at least one compound to be examined, at least a composition containing VASP phosphatase and at least one suitable detection system for quantifying the dephosphorylation of a VASP phosphatase substrate are put together.
  • the present invention further provides an HTS-suitable method for finding one or more active compounds which modulates the activity of the cNPK, comprising the steps: i) bringing the compound to be investigated or a multiplicity of compounds to be investigated into contact with cNPK, ATP and a suitable cNPK substrate, and j) quantification of the phosphorylated cNPK substrate with a suitable detection system, if necessary after termination of the phosphorylation reaction with a suitable phosphorylation reaction stopper.
  • the present invention furthermore relates to an HTS-suitable method for finding one or more active compounds which modulate the activity of VASP phosphatase, comprising the steps: k) bringing the compound to be investigated or a multiplicity of compounds to be investigated into contact VASP phosphatase and a suitable VASP phosphatase substrate, and I) quantification of the dephosphorylated VASP phosphatase substrate with a suitable detection system, if necessary after termination of the dephosphorylation reaction with a suitable dephosphorylation reaction stopper
  • the method for finding a chemical compound as described above takes place in a microtiter plate.
  • the microtiter plate can contain different numbers of vessels. For example, it may contain 96, 384, 768, 1536, 3072 or more vessels. Preferred individual components of the method according to the invention have already been described in more detail above.
  • the active (test) compound can be a pharmaceutically active compound in the function of a modulator - such as (hyper) activator / or (total) inhibitor - for the activity of a cNPK or a natural product in the broadest sense, in particular a raw extract, or a component contained therein.
  • the substance to be examined is generally a naturally occurring, a naturally occurring and chemically modified and / or a synthetic substance. In particular, so-called combinatorial substance libraries can be searched particularly easily and quickly with the methods according to the invention.
  • connection is very particularly preferably suitable which, bypassing the NO / cGMP signal path, directly modulates - activates or inhibits a cNPK; optionally modulated selectively - activated or inhibited.
  • the invention therefore also relates to a method in which the pharmaceutically active compound modulates a cNPK signaling pathway.
  • cNPK cyclo-nucleotide-dependent protein kinases
  • Another object of the present invention is therefore a method for diagnosis by the direct and gel electrophoresis-independent determination of the cNPK activity from samples, comprising the steps: m) incubating a sample in the presence of at least one composition containing suitable cNPKS and possibly ATP, n ) Adding at least one suitable detection system to the composition to quantify the phosphorylation of the cNPKS; and o) determining the activity of the cNPK, in particular in blood / cell or tissue extracts or in the form of permeabilized and / or intact cells.
  • Another object of the invention is a method for diagnosis by the direct and gel electrophoresis-independent determination of the VASP phosphatase activity from samples, comprising the steps: p) incubating a sample in the presence of at least one composition containing a suitable VASP phosphatase substrate q) adding at least one suitable detection system to the composition to quantify the dephosphorylation of the VASP phosphatase substrate; and r) determination of the activity of VASP phosphatase, in particular in blood / cell or tissue extracts or in the form of permeabilized and / or intact cells.
  • the diseases to be diagnosed are preferably cardiovascular diseases and diseases with associated vascular damage, e.g. Hypertension, thrombosis and endothelial dysfunction syndrome, e.g. in arteriosclerosis, diabetes, vasculitis and diseases of hematopoietic cells such as acute leukaemias, myeloproliferative diseases, myelodysplasias (see quote 17).
  • cardiovascular diseases and diseases with associated vascular damage e.g. Hypertension, thrombosis and endothelial dysfunction syndrome, e.g. in arteriosclerosis, diabetes, vasculitis and diseases of hematopoietic cells such as acute leukaemias, myeloproliferative diseases, myelodysplasias (see quote 17).
  • FIG. 1 shows a preferred embodiment of the test system according to the invention.
  • the cGK activity assay is based on the observation of the in vitro phosphorylation of a biotinylated substrate peptide by activated cGK (cf. FIG. 1A).
  • the VASP substrate peptide consists of a partial sequence of the amino acid sequence of human VASP (vasodilator stimulated phosphoprotein), a natural cGK substrate protein.
  • the phosphorylated VASP substrate peptide was surprisingly detectable with the aid of a detection system based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer (FRET) (compare FIG. 1B).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the anti-pSer239-VASP (mAb 16C2) monoclonal antibody which surprisingly specifically recognized the phosphorylated VASP substrate peptide (and left non-phosphorylated VASP substrate peptide undetected).
  • mAb 16C2 anti-pSer239-VASP
  • SA-APC Fluorescence-labeled streptavidin
  • FIG. 2 shows the kinetics of the phosphorylation of the biotinylated substrate peptide by the cGK.
  • the ordinate of FIG. 2 shows the measured FRET signal in cps.
  • the VASP substrate peptide is only phosphorylated in the presence of the cGK and its activator cGMP (tube A). No signal change was observed without cGMP and with cGK (tube B) and without cGK and with cGMP (tube C).
  • FIG. 3 shows the activation of the cGK with the natural activator cGMP and a cGMP-analogous molecule (8-pCPT-cGMP), measured with the test system described.
  • the enzyme activity (in cps / min) is plotted against the activator concentration (in mol / l).
  • FIG. 4 shows the surprising finding that with the test system according to the invention, the enzyme activity of the cGK contained in platelet extracts in this complex biological protein mixture can be observed and quantitatively measured.
  • FIG. 4A shows no difference between the phosphorylation kinetics without (D) and with the specific cAK inhibitor PKI (x).
  • FIG. 4B shows the influence of 100 nmol / l PKI on the phosphorylation of the VASP substrate peptide by purified cGK (0.3 nmol / l) without (D) and with PKI (x) and the influence of PKI on purified cAK (catalytic subunit, 3 nmol / l) without (O) and with PKI (•).
  • Example 1 FRET detection system and titration of the measuring range with phosphopeptide
  • a synthetic phosphopeptide (phosphorylated version of the VASP substrate peptide) was used as a "reaction product" instead of a kinase reaction and quantified with a detection mix.
  • reaction product phosphorylated version of the VASP substrate peptide
  • different mixtures of non-phosphorylated peptide and phosphopeptide were produced.
  • the total concentration of peptide was kept constant at 500 nmol / l. 50 ⁇ l of these mixtures were placed in the wells of a “96 well” microtest plate and 200 ⁇ l each of a detection mix containing the following reagents, diluted in PBS:
  • anti-pSer239-VASP mAb 16C2
  • anti-mouse-Eu W1024, PE Wallac
  • Bovine serum albumin 0J g / l
  • the signal-to-background ratio defined by the quotient of the maximum signal and the signal without phospho-peptide, was about 5.
  • the linearity of the measuring range in titration with the help of synthetically produced phosphopeptide found in Example 1, Table 1 enables the standardization and quantification of the enzymatic kinase reactions based on the test system according to the invention.
  • Vessel A also contained 5 ⁇ mol / l cGMP and 25 ng / ml purified cGK.
  • Vessel B also contained 25 ng / ml purified cGK.
  • Vessel C also contained 5 ⁇ mol / l cGMP.
  • the kinase reaction was started with 50 // mol / l ATP with further incubation at 30 ° C. All concentrations given above are to be understood as final concentrations in a volume of 500 ⁇ ⁇ . At the times indicated, 50 ⁇ ⁇ were removed from the vessels at the end of the reaction and mixed with 50 ⁇ ⁇ of a 30 mmol / l EDTA solution. The phosphorylated substrate peptide was detected as described in Example 1 in the wells of a "384 well" microtest plate.
  • VASP substrate peptide is phosphorylated only in the presence of the cGK and its activator cGMP (vessel A). Without cGMP and with cGK (tube B), without cGK and with cGMP (tube C), no signal change was observed.
  • test system is suitable in the form shown for high-throughput screening.
  • pipetting robots e.g. the Biomek systems from Beckman or the Genesis Workstation from Tecan
  • microtest plates in 96, 384 and even 1536 well format can be processed.
  • the cGK assay could be implemented for such a robot system in 384 well format as follows for screening for activators of the cGK. The following are pipetted sequentially:
  • the dose-dependent activation of the cGK by the natural activator cGMP and a cGMP-analogous molecule (8-pCPT-cGMP) can be analyzed with the test system according to the invention.
  • 8 kinase reactions (as described in Example 3, total volume 500 ⁇ ) were carried out, which contained the following components:
  • biotinylated VASP substrate peptide biotin-VASP 231 -245
  • test system is suitable for specifically measuring the activity of the cGK in tissue extracts or platelet lysates.
  • Platelets were prepared using a known method (cf. quote 15). After producing a soluble platelet extract, this was tested without activator and with 8-pCPT-cGMP (0.5 ⁇ mol / l) according to Example 3. In addition to 8-pCPT-cGMP, a third reaction vessel also contained 100 nmol / l PKI. This inhibitor specifically inactivates the cAMP-dependent protein kinase (cAK), which is also present in platelets.
  • FIG. 4A shows no difference between the phosphorylation kinetics without and with PKI.
  • FIG. 4A shows no difference between the phosphorylation kinetics without and with PKI.
  • 4B shows the influence of 100 nmol / l PKI on the phosphorylation of the VASP substrate peptide by purified cGK (0.3 nmol / l) and purified cAK (catalytic subunit, 3 nmol / I).
  • concentration of PKI used is sufficient to completely inhibit cAK.
  • the activity of the cGK is not affected.
  • ATP adenosine 5'-triphosphate
  • BSA bovine serum albumin
  • cAK cAMP-dependent protein kinase
  • cGK cGMP-dependent protein kinases
  • cGMP cyclo-guanosine-3 ', 5'-monophosphate
  • cNPKS substrate for cyclo-nuceotide-dependent protein kinases
  • cNPK cyclo-nucleotide-dependent protein kinases
  • HTS high-throughput screening
  • PKI protein kinase A specific inhibitor
  • TR-FRET Time-Resolved-Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer
  • VASP Vasodilator-stimulated phosphoprotein
  • Vasodilator dysfunction in aged spontanously hypertensive rat changes in NO synthases III and soluble guanylyl cyclase expression, and in Superoxide anion production. Cardiovascular Res 37, 772-779

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Abstract

Beschrieben wird ein HTS-geeignetes Testsystem zum Nachweis der Aktivität von cyclo-Nucleotid-abhängigen Proteinkinasen (cNPK) enthaltend a) mindestens eine Testverbindung, b) mindestens ein geeignetes cNPK-Substrat, c) mindestens eine zu inkubierende Zusammensetzung enthaltend cNPK und ATP, ggf. Phosphorylierungsreaktionsstopper, und d) ein geeignetes Detektionssytem zur Quantifizierung der Phosphorylierung des cNPK-Substrats. Ferner wird ein HTS-geeignetes Testsystem zum Nachweis der Aktivität von VASP-Phosphatasen beschrieben enthaltend e) mindestens eine Testverbindung, f) mindestens ein geeignetes VASP-Phosphatase-Substrat, g) mindestens eine zu inkubierende Zusammensetzung enthaltend VASP-Phosphatase, und h) ein geeignetes Detektionssystem zur Quantifizierung der Dephosphorylierung des VASP-Phosphatase-Substrats. Die beschriebenen Testsysteme lassen sich zum Auffinden von Verbindungen, die die Aktivität einer cNPK oder einer VASP-Phosphatase modulieren, aus chemischen oder natürlichen Substanzbibliotheken einsetzen.

Description

Beschreibung
Testsystem zur Bestimmung der Aktivität von cyclo-Nukleotid-abhängigen Proteinkinasen und VASP-Phosphatasen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem zum Nachweis der Aktivität von cyclo-Nucleotid-abhängigen Proteinkinasen oder von Phosphatasen, die das Vasodi- lator-stimulierte Phosphoprotein („VASP") dephosphorylieren, Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung in (High Throughput) Screening Verfahren.
Cyclo-Nucleotid-abhängige Proteinkinasen („cNPK"), deren Substrate („cNPKS"), sowie die entsprechenden Proteinphosphatasen, sind Teil wichtiger physiologisch, pathophysiologisch und pharmakologisch relevanter zellulärer Signalwege (vergl. Zitate 1 , 2 und 3). Zu den cNPK zählen cAMP-abhängige Proteinkinasen („cAK") und cGMP-abhängige Proteinkinasen („cGK"). Neben anderen cGMP-Effektorsystemen, wie z.B. cGMP-regulierten Phosphodiesterasen und lonenkanälen, ist insbesondere die cGK ein wichtiger Mediator der cGMP-vermittelten Signalübertragung.
Bei den Signalen, die zu einer Erhöhung des intrazellulären cGMP-Spiegels führen, unterscheidet man solche, die dies durch membranständige Guanylylzyklasen (GC- A, GC-B, GC-C) bewirken, wie z.B. durch natriu retische Peptide (kurz: ANP, BNP, CNP) und Enterotoxin/Guanylin, und jene, die die lösliche Guanylylcyclase (GC-S) aktivieren. Zu den wichtigsten Agonisten der löslichen Guanylylcyclase zählt das von den NO-Synthasen (NOS l-lll) gebildete Stickstoffmonoxid (NO). Zu den etablierten Effekten, die durch eine cGMP-Erhöhung bewirkt werden, gehören u.a. die Relaxation glatter Muskelzellen (SMCs) sowie Hemmung der Blutplättchenaktivierung. Diese cGMP-Effekte werden durch die cGK (Typ I) vermittelt (vergl. Zitate 1-3). Dies konnte in entsprechenden Mausmodelle mit cGK-l-Defizienz bestätigt werden (vergl. Zitate 4 und 5). cGK sind als Homodimere bekannt, von denen eine lösliche (Monomer 76 kDa; cGK I) und eine membranständige Form (Monomer 86 kDa; cGK II) unterschieden werden können. Die Membranverankerung der cGK II wird über die N-terminale My- ristoylierung vermittelt (vergl. Zitate 1-3). Von der cGK I existieren zwei Isoformen cGK lα und cGK Iß. Interessanterweise ist die cGK I, die allgemein als lösliche Form bezeichnet wird, in Blutplättchen überwiegend und in glatten Muskelzellen teilweise partikulär vorhanden. Eine besonders hohe Expression der cGK I findet man in humanen Blutplättchen und in den glatten Muskellzellen. Eine Aktivierung der cGK-l in diesen Zellen führt zu den bereits weiter oben beschriebenen Effekten, wie Senkung des intrazellulären Ca(2+)-Spiegels, Hemmung der Blutplättchen sowie der Kontraktion glatter Muskelzellen.
Zu den bekannten Substraten von cGK zählen neben anderen z.B. der Inositol 1 ,4,5- triphosphat Rezeptor (IP3R) und das VASP, sowie p25, Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) und 6-Pyruvoyltetrahydro-pterinsynthase (PTPS) .
Störungen des ANF / NO / cGMP-Signalweges sind für die verschiedenen Formen der Atherosklerose und Hypertonie bekannt, und die sogenannte „Endotheliale Dys- funktion", eine gestörte Endothel-vermittelte Vasodilatation, ist ein frühes Merkmal von Gefäßkrankheiten assoziiert mit Atherosklerose, Hypertonie und Diabetes (vergl. Zitate 6 und 7). Aktuelle Hinweise belegen, daß in diesen Gefäßkrankheiten insbesondere die Aktivierung und/oder Expression der löslichen Guanylylcyclase pathologisch vermindert ist (vergl. Zitate 8-10). Daraus folgt zwingend, daß Verbindungen/Substanzen, die den NO/cGMP-Signalweg ersetzen können, von größter therapeutischer Bedeutung sind. Dies wird belegt durch den Erfolg der NO-Donoren wie Nitroprussid, Nitroglycerin, Molsidomine und seit neuestem durch NO-unabhängige sGC-Aktivatoren wie YC-1 und Derivate. Trotz dieser erprobten Mittel besteht ein großer Bedarf an zusätzlichen, neuen Substanzen, da es ungelöste Probleme gibt (Toleranzentwicklung, toxische Nebeneffekte etc). Wünschenswert wäre daher die direkte Aktivierung der cGK, und zwar vorzugsweise cGK-l, da diese nach wie vor in pathologisch veränderten Gefäßabschnitten exprimiert wird (vergl. Zitat 10-11). Die Tatsache, daß nicht alle durch NO, bzw. cGMP bewirkten Effekte durch cGK vermittelt werden, birgt das Potential, daß sich spezifisch nur einige der ansonsten breiten Effekte dieses Signalweges beeinflussen lassen und damit einige unerwünschte Nebeneffekte wohl ausbleiben. Bisher sind nur zellmembranpermeable cGMP-Analoga (z.B. 8-Br-cGMP, 8-pCPT-cGMP) als Aktivatoren der cGK beschrieben worden, während gewisse cGMP-Analoga (Rp-8Br-PET-cGMPS, Rp-8-pCPT-cGMPS) und Iso- quinolinesulfonamidderivate (KT 5823, H8 and H89) die cGK hemmen (vergl. Zitat 12).
Ein High-Throughput-Screening Ansatz zur systematischen Suche nach unmittelbaren cGK-Aktivatoren und / oder Inhibitoren bzw. nach unmittelbaren Aktivatoren und/oder Inhibitoren der VASP-Phosphatase ist bisher noch nicht durchgeführt worden. Peptiderge cNPK-Substrate und Inhibitoren werden aufwendig über kombinatorische Peptidbibliotheken gesucht (vergl. Zitat 13).
Im Stand der Technik werden cNPK-Assays üblicherweise durch Einbau von radioaktiven Phosphor-Isotopen (32P oder 33P) in Peptidsubstrate und anschließender Trennung dieser Reaktionsprodukte von den Edukten, z.B. durch ihre Immobilisierung auf eine Trägersubstanz (Zitat 16) durchgeführt oder durch Auftrennung der Reaktionsprodukte mittels Gelelektrophorese und einem radio- oder immunochemi- schen Nachweis nach Proteintransfer auf Membranen beim Vorhandensein produktspezifischer Antikörper (wie z.B. im Western-Blot, WO 99/24,473). Eine Quantifizierung der gebildeten Produktkonzentrationen ist im letzten Fall technisch besonders aufwendig und wenig zuverlässig nur als semiquantitative Relativbestimmung zu einem gewählten Standard möglich und somit zur exakten Bestimmung von Enzymaktivitäten nicht durchführbar. Nachteilig können dabei die Be- und Entsorgung von radioaktiven Isotopen in den hierfür notwendigen Mengen, welche eine kostenintensive und sicherheitstechnische Belastung darstellt, sein. Zum anderen benötigt die Messung radioaktiver Proben mit der erforderlichen Genauigkeit relativ viel Zeit. Insbesondere sind Gele materiell aufwendig und mit hohem zeitlichen Aufwand zu bearbeiten.
Da die im Stand der Technik bekannten Methoden Separations- und Waschschritte beinhalten, sind diese ungeeignet im Hinblick auf die Untersuchung einer großen Anzahl von Testverbindungen mit Hilfe von automatisierten Systemen. Als besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung hat sich herausgestellt, dass das beschriebene Testsystem (synonym: Assay oder Diagnostikum) geeignet ist, auf einfache Art und Weise eine große Anzahl von (Test)-Verbindungen, vorzugsweise aus chemischen oder natürlichen Substanzbibliotheken, auf ihre Wirkung auf die Aktivität einer cNPK untersuchen zu können [sog. High Throughput Screening (kurz: HTS)].
Als weiterer besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung hat sich herausgestellt, dass mit dem Testsystem auf einfache und effektive Art und Weise eine große Anzahl von (Test)-Verbindungen aus chemischen oder natürlichen Substanzbibliotheken auf ihre Wirkung auf die Aktivität einer VASP-Phosphatase untersucht werden können [sog. High Throughput Screening (kurz: HTS)].
Es wurde nun gefunden, dass im beschriebenen Testsystem auch ohne Auftrennung der Produkte und ohne die Verwendung von radioaktiven Phosphor-Isotopen (32P oder 33P) ein Nachweis der Aktivität einer cNPK bzw. einer Proteinphosphatase möglich ist, der die oben beschriebenen Nachteile im Stand der Technik überwindet und somit für das HTS beispielsweise in einer automatisierten Anlage geeignet ist.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein HTS-geeignetes Testsystem zum Nachweis der Aktivität einer cNPK enthaltend a) mindestens eine Testverbindung b) mindestens ein geeignetes cNPK-Substrat (cNPKS) c) mindestens eine zu inkubierende Zusammensetzung enthaltend cNPK und ATP, und d) ein geeignetes Detektionssystem zur quantitativen Bestimmung der Menge des phosphorylierten cNPK-Substrats.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein HTS-geeignetes Testsystem zum Nachweis der Aktivität der VASP-Phosphatase enthaltend e) mindestens eine Testverbindung, f) mindestens ein geeignetes VASP-Phosphatase-Substrat, g) mindestens eine zu inkubierende Zusammensetzung enthaltend VASP- Phosphatase, und h) ein geeignetes Detektionssystem zur quantitativen Bestimmung der Menge des dephosphorylierten VASP-Phosphatase-Substrats.
Beide genannten Gegenstände werden nachstehend als erfindungsgemäßes Testsystem bezeichnet.
Das erfindungsgemäße Testsystem ermöglicht als gelfreies Testsystem eine hohe Zahl an quantitativen Einzelbestimmungen und erfüllt durch seinen Verzicht auf gele- lektrophoretische Trennschritte besondere Anforderungen hinsichtlich Geschwindigkeit, Probengröße und Materialverbrauch. Zudem werden Reproduzierbarkeit, Robustheit, Lösungsmitteltoleranz und Automatisierung gewährleistet.
Das erfindungsgemäße Testsystem gestattet die Suche nach einer oder mehreren, gleichen oder verschiedenen Testverbindungen.
Die eingesetzte cNPK ist vorzugsweise eine cGK oder cAK oder eine funktioneile Variante mit der Aktivität einer cNPK. Solche Proteinkinasen können in gereinigter Form oder als Rohextrakt eingesetzt werden, insbesondere als Bestandteil in Proteinmischungen aus Homogenaten biologischen Ursprungs, vorzugsweise humanen Ursprungs.
Die eingesetzte VASP-Phosphatase kann ebenfalls eine funktionelle Variante mit der Aktivität einer VASP-Phosphatase sein. VASP-Phosphatasen können in gereinigter Form oder als Rohextrakt eingesetzt werden, insbesondere als Bestandteil in Proteinmischungen aus Homogenaten biologischen Ursprungs, vorzugsweise humanen Ursprungs.
Ganz besonders bevorzugt als geeignetes cNPK-Substrat gemäß Merkmal (b) ist VASP - gemäß SEQ ID No. 1 (beschrieben in C. Haffner et al. in EMBO J., 14(1), 19-27 (1995)) - enthaltend bevorzugt bedienbare Phosphorylierungsstellen und zwar: Serin-157, Serin-239 und Threonin-278. Grundsätzlich können cNPK alle drei Reste phosphorylieren, jedoch bevorzugt die cAMP-abhängige Proteinkinase Serin 157 als Hauptphosphorylierungstelle, während die cGMP-abhängige Proteinkinase Serin-239 bevorzugt. Threonin-278 wird von beiden Kinasen mit vergleichbarer Spe- zifität phosphoryliert.
Ganz besonders bevorzugt als geeignetes VASP-Phosphatase-Substrat gemäß Merkmal (b) ist phosphoryliertes VASP, entsprechend SEQ ID No. 1, welches an den bevorzugt bedienbaren Phosphorylierungsstellen phosphoryliert ist und zwar: Serin-157, Serin-239 und Threonin-278.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Testsystems können ebenfalls solche Peptid- oder Polypeptidvarianten oder Peptoide als funktionelle Varianten eines cNPK- Substrates oder eines VASP-Phosphatase-Substrats verwendet werden, die vorzugsweise Aminosäuresequenzen aus VASP enthalten, die in der Umgebung der genannten Phosphorylierungsstellen oder Dephosphorylierungsstellen vorhanden sind und zwar nicht abschließend besonders bevorzugt die Pentamere mit den Aminosäuren 155 - 159 und / oder 237 - 241 und / oder 276 - 280 gemäß SEQ ID No. 1 oder bevorzugt die Decamere mit den Aminosäuren 152 - 161 und / oder 234 - 243 und / oder 273 - 282 aus SEQ ID No. 1 oder andere geeignete Teilsequenzen (z.B. vgl. in Fig. 1).
Solche erfindungsgemäß phosphorylierten Peptide können besonders vorteilhaft mit geeigneten Antikörpern im Sinne der Merkmale (d) bzw. (h), vorzugsweise monoklo- nalen Antikörpern, nachgewiesen werden.
Ganz besonders bevorzugt wird erfindungsgemäß der monoklonale Antikörper 16C2, welcher ausgewählt und erhältlich ist aus der Hybridom-Zelllinie DSM ACC2330, eingesetzt (WO 99/24473). Dieser Antikörper oder eine funktionelle Variante davon weist spezifisch ein Phosphorylierungsereignis nach, ganz besonders bevorzugt erkennt er ein Epitop, welches das phosphorylierte Serin-239 der VASP- Sequenz enthält. Eine funktionelle Variante betrifft insbesondere solche Antikörper mit einer Übereinstimmung von vorzugsweise 90 - 99 % oder 70 - 90 % in der Aminosäuresequenz von 16C2 mit der homologen Funktion ein Reaktionsprodukt im Sinne des Merkmals (d) bzw. (h) quantitativ zu bestimmen. Das erfindungsgemäße Testsystem kann sowohl heterogen (z.B. nach Immobilisierung der Reaktionsprodukte) jedoch bevorzugt homogen gefahren werden. Entsprechend der Durchführungsweise kann die immunologische Detektion im Sinne der Merkmale (d) bzw. (h) nach den dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen, wie z.B. gekoppelter Enzymreaktion (alkalische Phosphatase oder Luziferase) oder allgemeinen Sandwichtechnologien (beispielsweise ELISA), sowie fluorimetrischen Methoden (Fluoreszenz, zeitaufgelöste Fluoreszenz, Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfer (FRET)).
Bevorzugt sind leicht detektierbare radioaktiv markierte oder besonders bevorzugt nicht-radioaktiv markierte, insbesondere fluoreszenzmarkierte, Antikörper. Besonders geeignet sind Lanthanid-Chelate. Besonders vorteilhaft kann zudem auf die zeitaufgelöste Fluoresenz-Resonanz-Energie-Transfer-Technik zugegriffen werden (Figur 1). Solche TR-FRET Systeme sind in WO 97/29373 und WO 98/15830 beschrieben und kommerziell über Wallac Oy (Turku, FI) erhältlich. Vgl ebenfalls „Mini- aturization of a Lance™ -assay" und „Use of Generic Reagent in Lance ™" veröffentlicht bei Wallac Oy, Turku, FI.
Bevorzugt kann jedoch das erfindungsgemäße Testsystem als homogenes HTS automatisiert werden und ist daher für 96, 384, 1536-well Platten und mehr geeignet.
Zur Durchführung der Untersuchungen ist es bevorzugt, weitere Hilfsmittel, wie z. B. Pufferlösungen, Stabilisatoren und/oder Energieäquivalente, insbesondere ATP, einzusetzen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Herstellung eines Testsystems, bei dem mindestens eine zu untersuchende Verbindung und mindestens eine Zusammensetzung enthaltend cNPK, ATP und cNPK-Substrat, ggf. ein Phosphorylierungsreaktionsstopper, mindestens ein geeignetes Detektionssystem, wie ein Antikörper samt immunologischem Detektionsmittel und ggf. weitere Hilfsmittel zusammengestellt werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines Testsystems, bei dem mindestens eine zu untersuchende Verbindung, mindestens eine Zusammensetzung enthaltend VASP-Phosphatase und mindestens ein geeignetes Detektionssystem zur Quantifizierung der Dephosphorylierung eines VASP- Phosphatase-Substrats zusammengestellt werden.
Bevorzugte Ausführungsformen der einzelnen Komponenten sind bereits oben näher beschrieben worden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein HTS-geeignetes Verfahren zum Auffinden einer oder mehrerer wirksamer Verbindungen, die die Aktivität der cNPK moduliert, umfassend die Schritte: i) in Kontakt bringen der zu untersuchenden Verbindung oder einer Vielzahl von zu untersuchenden Verbindungen mit cNPK, ATP und geeignetem cNPK- Substrat, und j) Quantifizierung des phosphorylierten cNPK-Substrats mit einem geeigneten Detektionssystem, gegebenenfalls nach Abbruch der Phosphorylierungs- reaktion mit einem geeigneten Phosphorylierungsreaktionsstopper.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein HTS-geeignetes Verfahren zum Auffinden einer oder mehrerer wirksamer Verbindungen, die die Aktivität der VASP-Phosphatase modulieren, umfassend die Schritte: k) in Kontakt bringen der zu untersuchenden Verbindung oder einer Vielzahl von zu untersuchenden Verbindungen mit VASP-Phosphatase und geeignetem VASP-Phosphatase-Substrat, und I) Quantifizierung des dephosphorylierten VASP-Phosphatase-Substräts mit einem geeigneten Detektionssystem, gegebenenfalls nach Abbruch der Dephosphorylierungsreaktion mit einem geeigneten Dephosphorylierungs- reaktionsstopper
Das Verfahren zum Auffinden einer chemischen Verbindung wie vorstehend beschrieben erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform in einer Mikrotiterplatte. Die Mikrotiterplatte kann dabei unterschiedlich viele Gefäße enthalten. Beispielweise kann diese 96, 384, 768, 1536, 3072 oder mehr Gefäße enthalten. Bevorzugte einzelne Komponenten des erfindungsgemäßen Verfahrens sind oben bereits näher beschrieben. Die wirksame (Test-)Verbindung kann hierbei eine pharmazeutisch wirksame Verbindung und zwar in der Funktion eines Modulators - wie (Hyper)Aktivator / oder (To- tal)lnhibitor - für die Aktivität einer cNPK sein oder ein Naturstoff im weitesten Sinne sein, insbesondere ein Roh-Extrakt, oder eine darin enthaltene Komponente. Die zu untersuchende Substanz ist im allgemeinen eine natürlich vorkommende, eine natürlich vorkommende und chemisch modifizierte und/oder eine synthetische Substanz. Insbesondere können mit den erfindungsgemäßen Verfahren besonders einfach und schnell sogenannte kombinatorische Substanzbibliotheken durchsucht werden.
Ganz besonders bevorzugt ist eine solche Verbindung geeignet, die unter Umgehung des NO/cGMP Signalweges eine cNPK direkt moduliert - aktiviert oder inhibiert; ggf. selektiv moduliert - aktiviert oder inhibiert.
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren, wobei die pharmazeutisch wirksame Verbindung einen cNPK-Signalweg moduliert.
In der Beschreibungseinleitung wurde bereits darauf hingewiesen, daß verschiedene Erkrankungen auf eine Störung der Cyclo-Nucleotid-abhängigen Proteinkinasen (cNPK) zurückzuführen sind. Daher eignet sich die vorliegende Erfindung ebenfalls zur Diagnose einer Erkrankung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Diagnose durch die direkte und Gelelektrophorese-unabhängige Bestimmung der cNPK-Aktivität aus Proben, umfassend die Schritte: m) Inkubieren einer Probe in Gegenwart mindestens einer Zusammensetzung enthaltend geeignetes cNPKS und ggf. ATP, n) Versetzen der Zusammensetzung mit mindestens einem geeigneten Detektionssystem zur Quantifizierung der Phosphorylierung des cNPKS; und o) Bestimmung der Aktivität der cNPK, insbesondere in Blut-/Zell- oder Gewebe- Extrakten oder in Form von permeabilisierten und/oder intakten Zellen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose durch die direkte und Gelelektrophorese-unabhängige Bestimmung der VASP-Phosphatase- Aktivität aus Proben, umfassend die Schritte: p) Inkubieren einer Probe in Gegenwart mindestens einer Zusammensetzung enthaltend geeignetes VASP-Phosphatase-Substrat q) Versetzen der Zusammensetzung mit mindestens einem geeigneten Detektionssystem zur Quantifizierung der Dephosphorylierung des VASP- Phosphatase-Substrats; und r) Bestimmung der Aktivität der VASP-Phosphatase, insbesondere in Blut-/Zell- oder Gewebe-Extrakten oder in Form von permeabilisierten und/oder intakten Zellen.
Die zu diagnostizierenden Erkrankungen sind hierbei vorzugsweise Herz-Kreislauferkrankungen und Krankheiten mit assoziierten Gefäßschäden, z.B. Hypertonie, Thrombose und das Syndrom der endothelialen Dysfunktion, z.B. bei Arteriosklero- se, Diabetes, Vaskulitiden und Erkrankungen hämatopoetischer Zellen, wie z.B. akute Leukämien, myeloproliferative Erkrankungen, Myelodysplasien (vgl. Zitat 17).
Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, ohne sie zu beschränken.
Figur 1 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testsystems. Der cGK-Aktivitätsassay beruht auf der Beobachtung der in vitro Phosphorylie- rung eines biotinylierten Substratpeptids durch aktivierte cGK (vergleiche Figur 1 A). Das VASP-Substratpeptid besteht aus einer Teilsequenz der Aminosäuresequenz von humanem VASP (Vasodilator stimuliertes Phosphoprotein), einem natürlichen cGK-Substratprotein. Das phosphorylierte VASP-Substratpeptid ließ sich überraschenderweise mit Hilfe eines Detektionssystems nachweisen, das auf zeitaufgelöstem Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) beruht (vergleiche Figur 1 B). Dabei waren Hauptkomponenten mit folgenden chemischen Eigenschaften in einem besonderen Mischungsverhältnis in dem Detektionssystem vorhanden:
1. Der anti-pSer239-VASP (mAb 16C2) monoklonale Antikörper, der erstauli- cherweise spezifisch das phosphorylierte VASP-Substratpeptid erkannte (und nicht-phosphoryliertes VASP-Substratpeptid unerkannt ließ).
2. Ein Europium-markierter anti-Maus IgG Zweitantikörper, der spezifisch an den anti-pSer239-VASP (mAb 16C2) binden kann. 3. Fluoreszenzmarkiertes Streptavidin (SA-APC), das die Biotingruppe des VASP-Substratpeptids binden kann.
Bei einem besonderen Mischungsverhältnis aller drei Komponenten und des phosphorylierten VASP-Substratpeptids und bei geeigneter Lichtanregung (340 nm) des Europium-markierten Antikörpers wurde ein Fluroeszenz-Resonanz-Energie- Transfer (FRET) auf die zweite Fluoreszenzkomponente, SA-APC, gefunden, deren Lichtemission bei 660 nm beobachtet werden konnte. Dieses Testsystem besaß die in den folgenden Figuren und Beispielen beobachteten, interessanten Eigenschaften.
Figur 2 zeigt die Kinetik der Phosphorylierung des biotinylierten Substrat-Peptids durch die cGK. Die Ordinate der Figur 2 zeigt das gemessene FRET-Signal in cps. Das VASP-Substratpeptid wird nur in Anwesenheit der cGK und ihres Aktivators cGMP phosphoryliert (Gefäß A). Ohne cGMP und mit cGK (Gefäß B) sowie ohne cGK und mit cGMP (Gefäß C) wurde keine Signaländerung beobachtet.
Figur 3 zeigt die Aktivierung der cGK mit dem natürlichen Aktivator cGMP sowie einem cGMP-analogen Molekül (8-pCPT-cGMP), gemessen mit dem beschriebenen Testsystem. Die Enzymaktivität (in cps/min) ist gegen die Aktivatorkonzentration (in mol/l) aufgetragen.
Figur 4 zeigt den überraschenden Befund, dass mit dem erfindungsgemäßen Testsystem die in Thrombozytenextrakten enthaltene cGK in ihrer Enzymaktivität in dieser komplexen biologischen Proteinmischung beobachtet und quantitativ vermessen werden kann. Figur 4A zeigt keinen Unterschied zwischen der Phosphorylierungski- netik ohne (D) und mit dem spezifischen cAK-lnhibitor PKI (x). In Figur 4B ist der Einfluß von 100 nmol/l PKI auf die Phosphorylierung des VASP-Substratpeptids durch gereinigte cGK (0.3 nmol/l) ohne (D) und mit PKI (x) sowie der Einfluß von PKI auf gereinigte cAK (katalytische Untereinheit, 3 nmol/l) ohne (O) und mit PKI (•) dargestellt. Beispiel 1 : FRET-Detektionssystem und Titration des Meßbereichs mit Phosphopep- tid
Zur Etablierung und Optimierung des Detektionssystems wurde anstatt einer Kinase- reaktion ein synthetisches Phospho-Peptid (phosphorylierte Version des VASP- Substratpeptids) als "Reaktionsprodukt" eingesetzt und mit Detektionsmix quantifiziert. Um den linearen Meßbereich zu ermitteln, wurden unterschiedliche Mischungen aus nicht-phosphoryliertem Peptid und Phospho-Peptid hergestellt. Dabei wurde die Gesamtkonzentration an Peptid konstant bei 500 nmol/l gehalten. 50 μ\ dieser Mischungen wurden in die Vertiefungen einer "96 well" Mikrotestplatte gegeben und mit je 200 μ\ eines Detektionsmix versetzt, der folgende Reagenzien, verdünnt in PBS, enthielt:
anti-pSer239-VASP (mAb 16C2) 1 nmol/l anti-Maus-Eu(W1024, PE Wallac) 1 nmo/l
Streptavidin-APC 2 g/ml
Rinderserumalbumin 0J g/l
Die Messung des zeitaufgelösten FRET-Signals bei Anregung der Europium Fluoreszenz bei 340 nm und Messung der Emission der APC-Fluoreszenz bei 660 nm erfolgte nach 1 Stunde Inkubationszeit bei 20°C mit Hilfe eines PerkinElmer Wallac Fluoreszenzmeßgerätes (Victor2). Folgende Tabelle zeigt einen nahezu linearen Anstieg zwischen 0-100 nmol/l Phospho-Peptid. Bei 160 nmol/l Phospho-Peptid kann das Signal nicht weiter gesteigert werden.
Tabelle 1 : Titration des Meßbereichs mit Phospho-Peptid
Figure imgf000013_0001
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Das Signal-Hintergrund Verhältnis, definiert durch den Quotienten aus Maximalsignal und Signal ohne Phospho-Peptid, lag bei etwa 5. Für die Detektion in "384 well" Platten ergab sich ein optimales Signal / Hintergrund Verhältnis, wenn 20 μ\ einer Lösung enthaltend 500 nmol/l VASP-Substratpeptid mit 40 μ eines Detektionsmix, der die oben angegebenen Konzentrationen der Detektionsreagenzien enthielt, gemischt wurden. Dieses Protokoll wurde bei allen weiteren Experimenten verwendet.
Beispiel 2: Quantifizierung der Enzymaktivität
Die in Beispiel 1 , Tabelle 1 gefundene Linearität des Meßbereichs bei Titration mit Hilfe von synthetisch hergestelltem Phospho-Peptid ermöglicht die Standardisierung und Quantifizierung der enzymatischen Kinasereaktionen auf Basis des erfindungsgemäßen Testsystems. Das Meßsignal, ausgedrückt in cps, kann direkt umgerechnet werden in molare Konzentration an phosphoryliertem Peptid, wodurch die mit dem beschriebenen Testsystem gemessene Aktivität in internationalen Enzymeinheiten (1 Unit = 1 μmol/min) umgerechnet werden kann.
Die Aktivität einer in einem Volumen von 100 /I durchgeführten Enzym reaktion, bei der innerhalb von 2 Minuten ein Signal von 9872 cps gemessen wird, entspricht also einer Aktivität, die 2 pmol Substrat in 2 Minuten umsetzt, was einer Enzymaktivität von 1 x 10"6 U entspricht.
Beispiel 3: Kinase Reaktion
Bei den üblichen radioaktiven Kinase-Assays werden hohe Konzentrationen an VASP-Substratpeptid (50-100 mol/l) und Enzym benötigt (vergl. Zitat 16). Unter Verwendung des in Figur 1 beschriebenen Testsystems konnte bei hohen Substrat- peptid-Konzentrationen keine Kinase-Aktivität detektiert werden. Durch Verringern der Substratkonzentration auf 1 mol/l konnten erstmals auch mit der FRET- Detektion Enzymkinetiken gemessen werden (vergl. Figur 2).
Der Einsatz hoher Enzymkonzentrationen bei niedriger Substratkonzentration führte jedoch zur Erhöhung der nicht-stimulierten Basalaktivität der Kinase, das heißt auch ohne den spezifischen Aktivator cGMP wurde Aktivität gemessen, die durch Zugabe von cGMP nicht oder nur geringfügig gesteigert werden konnte. Dieses Problem konnte durch Verringern der Enzymkonzentration auf 50 ng/ml und weniger überwunden werden (vergl. Zitat 14). Somit kann mit dem erfindungsgemäßen Testsystem die authentische Enzymaktivität der cGK gemessen werden.
In drei Reaktionsgefäßen wurden folgende Komponenten gemischt:
Tris/HCI, pH 7.4 20 mmol/l
MgCI2 10 mmol/l ß-Mercaptoethanol 5 mmol/l
BSA 0.01 g/l biotinyliertes VASP-Substratpeptid (biotin-VASP 231-245) 1 μmol/l
Gefäß A enthielt darüberhinaus 5 μmol/l cGMP sowie 25 ng/ml gereinigte cGK. Gefäß B enthielt darüberhinaus 25 ng/ml gereinigte cGK. Gefäß C enthielt darüberhinaus 5 μmol/l cGMP.
Nach Vorinkubation der Gefäße bei 30°C für 5 Minuten, wurde die Kinasereaktion mit 50 //mol/l ATP gestartet mit weiterer Inkubation bei 30°C. Alle oben angegebenen Konzentrationen sind als Endkonzentrationen in einem Volumen von 500 μ\ zu verstehen. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden zur Beendigung der Reaktion 50 μ\ aus den Gefäßen entnommen und mit 50 μ\ einer 30 mmol/l EDTA Lösung gemischt. Die Detektion des phosphorylierten Substratpeptids erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben in den Vertiefungen einer "384 well" Mikrotestplatte.
Aus Figur 2 ist ersichtlich, dass das VASP-Substratpeptid nur in Anwesenheit der cGK und ihres Aktivators cGMP phosphoryliert wird (Gefäß A). Ohne cGMP und mit cGK (Gefäß B) sowie ohne cGK und mit cGMP (Gefäß C) wurde keine Signaländerung beobachtet.
Beispiel 4: Eignung für das HTS
Das erfindungsgemäße Testsystem ist in der dargestellten Form für das Hochdurch- satz-Screening geeignet. Mit Hilfe von kommerziell erhältlichen Pipettierrobotern (z.B. die Biomek Systeme der Firma Beckman, oder die Genesis Workstation der Firma Tecan) können Mikrotestplatten im 96, 384 und sogar 1536 well Format prozessiert werden. Der cGK-Assay könnte zum Screening nach Aktivatoren der cGK folgendermaßen auf ein solches Robotersystem im 384 well Format implementiert werden. Sequentiell werden pipettiert:
1. 20 μl einer Lösung enthaltend Puffer, cGK, Substratpeptid
2. 5 μ\ einer Testsubstanz in DMSO
3. Start der Reaktion mit 5 μ\ einer ATP-Lösung
4. Stop der Reaktion durch gleichzeitige Zugabe von EDTA und den Detektions- reagenzien.
Die meisten Substanzen, die im HTS getestet werden, liegen gelöst vorzugsweise in DMSO vor. Viele Enzyme oder Testsysteme sind jedoch sehr sensitiv gegenüber DMSO. Um den Einfluß von DMSO auf das erfindungsgemäße Testsystem zu ermitteln, wurden Phosphorylierungskinetiken, wie in Beispiel 2 (vgl. Figur 2) beschrieben, in Anwesenheit von 0, 5, 10, 15 und 20 % DMSO durchgeführt. Tabelle 2 faßt die nach einer Inkubationszeit von 10 min erhaltenen Enzymaktivitäten zusammen. Das erfindungsgemäße Testsystem stellt sich in dieser Beziehung als sehr robust dar. Zugabe von bis zu 20 Volumenprozent DMSO haben keinen wesentlichen Einfluß auf die Reaktion. Tabelle 2: Einfluß von DMSO auf die Enzymaktivität im erfindungsgemäßen Testsystem
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Beispiel 5: Aktivierungskurve der cGK
Die Dosis-abhängige Aktivierung der cGK durch den natürlichen Aktivator cGMP und ein cGMP-analoges Molekül (8-pCPT-cGMP) kann mit dem erfindungsgemäßen Testsystem analysiert werden. Es wurden 8 Kinasereaktionen (wie in Beispiel 3 beschrieben, Gesamtvolumen 500 μ ) durchgeführt, die folgende Komponenten enthielten:
20 mmol/l Tris/HCI, pH 7.4
10 mmol/l MgCI2
5 mmol/l ß-Mercaptoethanol
0.01 g/l BSA
1 μmol/l biotinyliertes VASP-Substratpeptid (biotin-VASP 231 -245)
25 ng/ml cGK
50 mol/I ATP verschiedene Konzentrationen cGMP oder 8-pCPT-cGMP von 10"9 - 10"5 mol/l
Nach 0, 5, 10, 20, 60 Minuten Inkubation bei 30°C wurden Teilvolumina von 50 μ\ entnommen und mit 50 μ\ 30 /mol/l EDTA gemischt. Die Detektion des phosphorylierten Substratpeptids erfolgte dann wie in Beispiel 2 beschrieben. Aus den Kineti- ken der Phosphorylierung des VASP-Substratpeptids wurden die jeweiligen initialen Geschwindigkeiten in cps/min bei verschiedenen Aktivatorkonzentrationen berechnet. Diese sind in Figur 3 gegen die Aktivatorkonzentration aufgetragen.
Die mit dem erfindungsgemäßen Testsystem erhaltenen Aktivierungskurven und die daraus berechneten Aktivierungskonstanten für cGMP (0,26 μmol/l) und 8-pCPT- cGMP (0,10 μmol/l) sind vergleichbar mit für diese Substanzen veröffentlichten Daten, die mit konventionellen radioaktiven Methoden bestimmt wurden (vergl. Zitat 14).
Beispiel 6: Bestimmung der cGK-Aktivität in Gewebsextrakten
Das erfindungsgemäße Testsystem ist geeignet, spezifisch die Aktivität der cGK in Gewebsextrakten oder Thrombozytenlysaten zu messen.
Thrombozyten wurden nach bekannter Methode präpariert (vergl. Zitat 15). Nach Herstellung eines löslichen Thrombozytenextrakts wurde dieses ohne Aktivator und mit 8-pCPT-cGMP (0.5 μmol/l) gemäß Beispiel 3 getestet. Ein drittes Reaktionsgefäß enthielt neben 8-pCPT-cGMP zusätzlich noch 100 nmol/l PKI. Dieser Inhibitor inaktiviert spezifisch die cAMP-abhängige Proteinkinase (cAK), die ebenfalls in Thrombozyten vorhanden ist. Figur 4A zeigt keinen Unterschied zwischen der Phosphorylie- rungskinetik ohne und mit PKI. In Figur 4B ist der Einfluß von 100 nmol/l PKI auf die Phosphorylierung des VASP-Substratpeptids durch gereinigte cGK (0.3 nmol/l) und gereinigte cAK (katalytische Untereinheit, 3 nmol/I) dargestellt. Die verwendete Konzentration an PKI reicht aus, um die cAK vollständig zu hemmen. Die Aktivität der cGK wird nicht beeinflußt.
Figuren 4A und 4B zusammen zeigen daher, dass das erfindungsgemäße Testsystem sehr spezifisch die cGK-Aktivität in komplexen Proben wie Thrombozytenlysaten messen kann. Eine Kreuzaktivität durch die cAK kann ausgeschlossen werden. E- benso konnte in Gewebshomogenaten aus Rattenorganen cGK-Aktivität gemessen werden. Im Text und Figuren verwendete Abkürzungen:
8-pCPT- = 8-(4-Chlorophenylthio)- cAMP = cyclo-Adenosin-3',5'-Monophosphat
APC = Allophycocyanin
ATP = Adenosin-5'-Triphosphat
BSA = Bovine-Serum-Albumin cAK = cAMP-abhängige Proteinkinase cGK = cGMP-abhängige Proteinkinasen cGMP = cyclo-Guanosin-3',5'-Monophosphat cNPKS = Substrat für Cyclo-Nuceotid-abhängige Proteinkinasen cNPK = Cyclo-Nucleotid-abhängige Proteinkinasen
DMSO = Dimethylsulfoxid
Eu = Europium
HTS = High-throughput-screening
LANCE = Lanthanide Chelate Excitation Technology mAb = monoclonal antibody
PKI = Proteinkinase A spezifischer Inhibitor
SA = Streptavidin
TR-FRET = Time-Resolved-Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer
VASP = Vasodilator-stimulated Phosphoprotein
Im Text zitierte Literatur:
1. Lohmann, S.M., Vaandrager, A.B., Smolenski, A., Walter, U. and DeJonge, H.R.
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2. Pfeifer, A., Ruth, P., Dostmann, W., Sausbier, M., Klatt, P. and Hofmann, F. (1999) Structure and Function of cGMP-Dependent Protein Kinases. Rev Physiol Biochem Pharmacol 135, 105 - 149.
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Claims

Patentansprüche:
1. HTS-geeignetes Testsystem zum Nachweis der Aktivität der cyclo-Nucleotid- abhängigen Proteinkinasen (cNPK) enthaltend a) mindestens eine Testverbindung, b) mindestens ein geeignetes cNPK-Substrat (cNPKS), c) mindestens eine zu inkubierende Zusammensetzung enthaltend cNPK und ATP, und d) ein geeignetes Detektionssystem zur quantitativen Bestimmung der Menge des phosphorylierten cNPK Substrats.
2. HTS-geeignetes Testsystem zum Nachweis der Aktivität der VASP-Phosphatase enthaltend e) mindestens eine Testverbindung, f) mindestens ein geeignetes VASP-Phosphatase-Substrat, g) mindestens eine zu inkubierende Zusammensetzung enthaltend VASP- Phosphatase, und h) ein geeignetes Detektionssystem zur quantitativen Bestimmung der Menge des dephosphorylierten VASP-Phosphatase-Substrats.
3. Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Testsytem automatisierbar und heterogen mit Trennung oder Immobilisierung mindestens eines der Reaktionsprodukte oder Nachweisreagenzien ist.
4. Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Testsystem automatisierbar und homogen ist.
5. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Testsystem nichtradioaktiv ist.
6. Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das cNPK- Substrat gemäß Merkmal (b) oder das VASP-Phosphatase-Substrat gemäß Merkmal (f) ausgewählt ist aus SEQ ID No. 1 oder einer funktionellen Variante davon.
7. Testsystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das cNPK-Substrat ein Peptid, Polypeptid oder Peptoid ist enthaltend die Pentamere mit den Aminosäuren 155 - 159 und / oder 237 - 241 und / oder 276 - 280 aus SEQ ID No. 1 oder die Decamere mit den Aminosäuren 152 - 161 und / oder 234 - 243 und / oder 273 - 282 aus SEQ ID No. 1.
8. Testsystem nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die cNPK, vorzugsweise eine cAMP- und / oder cGMP-Kinase, oder ein funktionelle Variante davon ist.
9. Testsystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die cNPK in gereinigter Form, in Form von Blu Zell- oder Gewebe-Extrakten oder in Form von permeabilisierten und/oder intakten Zellen vorliegen.
10. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektionssystem zur Quantifizierung der Phosphorylierung des cNPK- Substrats oder der Dephosphorylierung des VASP-Phosphatase-Substrats mindestens einen geeigneten Antikörper für das phosphorylierte Produkt oder für das dephosphorylierte Produkt enthält.
11.Testsystem nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper durch die Hybridoma Zellinie DSM ACC2330 gebildet wird, insbesondere der monoklo- nale Antikörper 16C2 ist oder eine funktionelle Variante davon.
12. Testsystem nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, daß das Detektionssystem zwei Antikörper aufweist, von denen der erste Antikörper unmarkiert und der zweite Antikörper markiert ist.
13. Testsystem nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, daß das Detektionssystem mindestens einen markierten Antikörper aufweist, sowie ein geeignetes System zum Nachweis der Markierung.
14. Testsystem nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper einen Fluorophor enthält.
15. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionssystem auf Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) beruht, wobei mindestens ein markierter, vorzugsweise ein Fluorophor-markierter, Erst- oder Zweitantikörper und ein dazu korrespondierender Akzeptor- oder Donor-Fluorophor, vorzugsweise am cNPK-Substrat, verwendet werden.
16. Testsystem nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionssystem auf einem zeitaufgelösten FRET-System mit Lanthanidchelaten, vorzugsweise Europiumchelaten, beruht.
17. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß als weitere Hilfsmittel Pufferlösungen, Stabilisatoren und / oder Energieäquivalente eingesetzt werden.
18. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine zu untersuchende Verbindung und mindestens eine Zusammensetzung enthaltend cNPK und ATP, und mindestens ein geeignetes Detektionssystem zur quantitativen Bestimmung der Menge des phosphorylierten cNPK Substrats zusammengestellt werden.
19. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine zu untersuchende Verbindung, mindestens eine Zusammensetzung enthaltend VASP-Phosphatase und mindestens ein geeignetes Detektionssystem zur quantitativen Bestimmung der Menge des dephosphorylierten VASP-Phosphatase-Substrats zusammengestellt werden.
20. HTS-geeignetes Verfahren zum Auffinden einer oder mehrerer wirksamer Verbindungen, die die Aktivität der cNPK modulieren, umfassend die Schritte i) In-Kontakt-Bringen der zu untersuchenden Verbindung oder einer Vielzahl von zu untersuchenden Verbindungen mit cNPK, ATP und geeignetem cNPK- Substrat, und j) Quantifizierung des phosphorylierten cNPK-Substrats mit einem geeigneten Detektionssystem.
21. HTS-geeignetes Verfahren zum Auffinden einer oder mehrerer wirksamer Verbindungen, die die Aktivität der VASP-Phosphatase modulieren, umfassend die Schritte: k) In-Kontakt-Bringen der zu untersuchenden Verbindung oder einer Vielzahl von zu untersuchenden Verbindungen mit VASP-Phosphatase und geeignetem VASP-Phosphatase-Substrat, und
I) Quantifizierung des dephosphorylierten VASP-Phosphatase-Substrats mit einem geeigneten Detektionssystem.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Verbindung ausgewählt ist aus einer natürlich vorkommenden, natürlich vorkommenden und chemisch modifizierten und/oder synthetischen Verbindung.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Verbindung in Form einer kombinatorischen Substanzbibliothek eingesetzt wird.
24. Verfahren zur Diagnose durch direkte und Gelelektrophorese-unabhängige Bestimmung der cNPK-Aktivität aus Proben umfassend die Schritte: m) Inkubieren einer Probe in Gegenwart mindestens einer Zusammensetzung enthaltend geeignetes cNPKS und ATP, n) Versetzen der Zusammensetzung mit mindestens einem geeigneten Detektionssystem zur Quantifizierung der Phosphorylierung des cNPKS; und o) Bestimmung der Aktivität der cNPK, insbesondere in BlutVZell- oder Gewebe- Extrakten oder in Form von permeabilisierten und/oder intakten Zellen.
25. Verfahren zur Diagnose durch direkte und Gelelektrophorese-unabhängige Bestimmung der VASP-Phosphatase-Aktivität aus Proben umfassend die Schritte: p) Inkubieren einer Probe in Gegenwart mindestens einer Zusammensetzung enthaltend geeignetes VASP-Phosphatase-Substrat q) Versetzen der Zusammensetzung mit mindestens einem geeigneten Detektionssystem zur Quantifizierung der Dephosphorylierung des VASP- Phosphatase-Substrats; und r) Bestimmung der Aktivität der VASP-Phosphatase, insbesondere in Blu Zell- oder Gewebe-Extrakten oder in Form von permeabilisierten und/oder intakten Zellen.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die Diagnose einer Erkrankung handelt, die ausgewählt ist aus dem Spektrum der Herz-Kreislauferkrankungen und Krankheiten mit assoziierten Gefäßschäden, insbesondere Hypertonie, Thrombose, und dem Syndrom der endothelialen Dys- funktion bei Arteriosklerose, Diabetes und Vaskulitiden, oder Erkrankungen hä- matopoetischer Zellen, wie akute Leukämie, myeloproliferative Erkrankungen oder Myelodysplasien.
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