CN117129664A - 一种nad+生物发光探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NAD+生物发光探针及其应用。本发明公开的NAD+生物发光探针具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并进一步公开所述NAD+生物发光探针在检测NAD+浓度中的应用或在检测CD38酶活性中的应用或在筛选CD38酶活性调控药物中的应用或在CD38酶活性调控药物的药物效果评估中的应用。本发明首次利用了NAD+生物发光探针实时测量CD38酶反应体系中的NAD+浓度，用NAD+的消耗速率表征CD38的酶活性强弱，创新性地实现了CD38酶活性检测体系中NAD+浓度的直接、实时、无干扰监测。

Description

一种NAD+生物发光探针及其应用
技术领域
本发明属于酶活性检测和药物筛选技术领域，具体涉及一种NAD+生物发光探针及其应用，更具体地涉及NAD+生物发光探针在CD38酶活性检测中的应用。
背景技术
CD38是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有水解酶和环化酶的活性，是一种双功能胞外酶，参与核苷酸代谢。CD38对于维持体内NAD+、NAM、NMN等物质的动态平衡非常重要，最初CD38被作为T细胞激活的特异性标记物，后续研究发现，CD38同CD39、CD73、CD203a等一起，可降解ATP、NAD+、cADPR、AMP，产生ADO，诱导抑制性的免疫微环境。
据研究显示，在人类细胞的衰老、炎症和癌变相关过程中，CD38会异常表达，因此，CD38的酶活性检测是干预衰老、炎症和肿瘤过程中的重要环节。目前，CD38检测的主要手段包括酶联免疫吸附试验法、质谱检测法、荧光测定法等。1)酶联免疫吸附试验法只能定量检测CD38在细胞中的表达水平，而无法表征CD38酶活性，在人体衰老过程中，大量的蛋白结构会错误折叠，但具有正确结构的CD38蛋白才具有生物活性，因此，检测有活性的CD38表达水平是定量检测CD38表达水平的进一步要求。2)质谱检测法的特异性和灵敏度高，但该方法成本高且依赖特定的中心化检测机构，同时也无法进行实时监测CD38活性。3)哺乳动物中CD38有NAD+水解酶和NAD+环化酶两种特性，CD38酶活性荧光测定法利用了ε-NAD和NGD(β-NAD类似物)产物的荧光特性分别实现CD38的水解酶和环化酶活性检测(图1)。ε-NAD和NGD被CD38分解后的产物，能够被300nm波长的光激发产生410nm波长的荧光。反应进程中，随着反应的进行，检测到的荧光会越来越强，荧光增强的速率可表示CD38的酶活性强弱。荧光测定法能够同时实现对CD38酶活性的定性和定量检测，但由于产物发光强度低，只有较高的CD38活性才能被检测到，最低检出限为0.2ng/μl，无法实现更低浓度CD38的活性检测，灵敏度不高。荧光测定法采用两种荧光类似物分别检测CD38的双功能活性，难以真实反映生物样本中CD38的酶反应过程，无法根据测定结果对生物细胞或组织中的NAD+水平进行有效分析，并且，荧光测定法对基质干扰敏感，检测生物样本时，难以排除基质影响。
发明内容
现有技术检测CD38酶活性时，通常存在两个技术难点：(1)灵敏度有限；(2)难以实现活细胞样本的CD38酶活性检测。为了解决现有技术的不足，本发明旨在提供一种NAD+生物发光探针及其应用。
本发明的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种NAD+生物发光探针，所述NAD+生物发光探针具有如SEQID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明第二方面提供编码所述NAD+生物发光探针的核苷酸序列。
本发明第三方面提供所述的NAD+生物发光探针在检测NAD+浓度中的应用或在检测CD38酶活性中的应用或在筛选CD38酶活性调控药物中的应用或在CD38酶活性调控药物的药物效果评估中的应用；
所述CD38酶活性调控药物包括CD38激活剂或CD38抑制剂。
本发明第四方面提供一种NAD+浓度的检测试剂盒，所述试剂盒中包括所述NAD+生物发光探针和生物发光探针底物。
本发明第五方面提供一种CD38酶活性的生物发光检测试剂盒，所述试剂盒包括所述NAD+生物发光探针、β-NAD、MES缓冲液、生物发光探针底物和高氯酸。
本发明第六方面提供一种CD38酶活性调控药物的筛选或药效评估试剂盒，所述试剂盒包括所述NAD+生物发光探针、β-NAD、MES缓冲液、生物发光探针底物、高氯酸和CD38。
本发明第七方面提供一种检测NAD+浓度的方法，所述方法包括如下步骤：
S1.采用所述NAD+生物发光探针与不同标准浓度的NAD+混合，测量不同浓度NAD+下440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值，利用不同浓度NAD+下测得的440nm和580nm两波长光强比值对应NAD+浓度作出标准曲线；
S2.采用所述NAD+生物发光探针与待测样本混合，测量待测样本在440nm和580nm两波长下的光强比值；
S3.在标准曲线上回归获得待测样本对应的NAD+浓度。
本发明第八方面提供一种CD38酶活性的生物发光检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
S1.采用所述NAD+生物发光探针与不同标准浓度的NAD+混合，测量不同浓度NAD+下440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值，利用不同浓度NAD+下测得的440nm和580nm两波长光强比值对应NAD+浓度作出标准曲线；
S2.通过方法(1)或方法(2)测量待测样本反应体系在不同时间点的440nm和580nm两波长光强比值；
方法(1)：将包含MES缓冲液、β-NAD和待测样本的反应液混匀，置于37℃下反应，设置适当时间间隔，每隔一段时间取适量反应液，用高氯酸处理，终止反应，将处理后的反应液与所述生物发光探针和探针底物混合，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长处的发光强度，计算每个时间点的光强比值；
方法(2)：将包含MES缓冲液、所述生物发光探针、β-NAD、探针底物、待测样本，按次序混合，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长发光强度在一段时间内、适当时间间隔的动态变化，计算每个时间点的光强比值；
S3.根据步骤S1制作的标准曲线和步骤S2测量的待测样本反应体系每个时间点的光强比值，对应求得反应体系中每个时间点的NAD+浓度，将NAD+浓度同反应时间作图，利用线性回归确定反应体系中的NAD+消耗速率，即为CD38的酶活性。
进一步地，CD38酶活性的生物发光检测方法中，方法(1)中：
100μl所述反应液包含50mM MES缓冲液、20-200μMβ-NAD和待测样本；
所述高氯酸的浓度为0.5N，所取反应液与高氯酸的体积比为1:4；
10μl所述处理后的反应液中加入的生物发光探针量为0.1-20nM；
方法(2)中：100μl所述反应液包含50mM MES缓冲液、0.1-20nM生物发光探针、20-200μMβ-NAD、探针底物和待测样本；
优选地，方法(1)和方法(2)中所述MES缓冲液的pH为6.5；
优选地，方法(1)中所述时间间隔为10min；
优选地，方法(2)中所述时间间隔为1min。
进一步地，CD38酶活性的生物发光检测方法中，所述待测样本包括生物样本；
优选地，所述生物样本包括生物细胞或组织。
本发明第九方面提供一种CD38酶活性调控药物的筛选方法或CD38酶活性调控药物的药效评估方法，包括如下步骤：
S1.采用所述NAD+生物发光探针与不同标准浓度的NAD+混合，测量不同浓度NAD+下440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值，利用不同浓度NAD+下测得的440nm和580nm两波长光强比值对应NAD+浓度作出标准曲线；
S2.通过方法(1)或方法(2)测量实验组和对照组反应体系反应一段时间后的440nm和580nm两波长光强比值，其中，实验组反应体系中加入待测药物，对照组反应体系中不加入待测药物；
方法(1)：将包含MES缓冲液、β-NAD、CD38和待测药物的反应液混匀或将包含MES缓冲液、β-NAD和CD38的反应液混匀，置于37℃下反应一段时间，取适量反应液，用高氯酸处理，终止反应，将处理后的反应液与所述生物发光探针和探针底物混合，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值；
方法(2)：将包含MES缓冲液、所述生物发光探针、β-NAD、探针底物、CD38和待测药物或将包含MES缓冲液、所述生物发光探针、β-NAD、探针底物和CD38，按次序混合，反应一段时间，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长发光强度，计算光强比值；
S3.根据步骤S1制作的标准曲线和步骤S2测量的反应体系的光强比值，对应反应一段时间后反应体系中的NAD+浓度，计算NAD+的消耗量，最终计算实验组较对照组NAD+消耗量比率(Ratio)；
当Ratio＞1时，所述待测药物为潜在的CD38激活剂，且Ratio值越大，待测药物的药效越强；当Ratio＜1时，所述待测药物为潜在CD38的抑制剂，且Ratio值越小，待测药物的药效越强；当Ratio＝1时，所述待测药物不会影响CD38催化的NAD+消耗。
进一步地，CD38酶活性调控药物的筛选方法或CD38酶活性调控药物的药效评估方法中，方法(1)中：
100μl所述反应液包含50mM MES缓冲液、20-200μMβ-NAD、0.1-10ng/μl CD38和0.01-500μM待测药物；
所述高氯酸的浓度为0.5N，所取反应液与高氯酸的体积比为1:4；
10μl所述处理后的反应液中加入的生物发光探针量为4nM；
方法(2)中：100μl所述反应液包含50mM MES缓冲液、0.1-20nM生物发光探针、20-200μMβ-NAD、0.1-10ng/μl CD38和0.01-500μM待测药物；
优选地，方法(1)和方法(2)中所述MES缓冲液的pH为6.5；
优选地，方法(1)和方法(2)中所述反应时间为1h。
本发明的有益效果为：
本发明首次利用了NAD+生物发光探针实时测量CD38酶反应体系中的NAD+浓度，用NAD+的消耗速率表征CD38的酶活性强弱，具体地，本发明基于CD38具有水解酶和环化酶活性，反应过程中，待测物中的CD38将NAD+转化为NAM和ADPR/cADPR，本发明利用生物发光能量共振转移探针实时测量CD38反应体系中的NAD+浓度，根据酶反应消耗NAD+的速率表征CD38的酶活性强弱。本发明的优势是创新性地实现了CD38酶活性检测体系中NAD+浓度的直接、实时、无干扰监测。本发明在CD38酶促反应体系中使用了NAD+生物发光探针，使NAD+消耗速率得到实时监测。
本发明同时实现CD38酶活性的定性及定量检测，提了高灵敏度，减少了生物样本的基质对检测过程的干扰，实现了对活细胞等生物样本中CD38酶活性的检测，为高通量药物筛选CD38调控药物和CD38酶活性调控药物的药效评估提供了技术基础。与荧光测定法相比，基于NAD+生物发光探针的检测有以下优势：1)探针不会消耗或生成NAD+，不会对原有酶促反应平衡产生影响，使得酶促反应速率更为真实可靠。2)NAD+生物发光探针的灵敏度明显高于荧光测定法，本发明可以实现低至0.1ng/μl CD38的酶活性检测。由于更灵敏的NAD+检测方法，本发明大大降低了CD38活性检测的时间成本，从传统反应的30-60min缩短到10min左右。3)生物发光探针的抗干扰能力明显优于荧光测定法。由于生物样品中诸多基质成分都可能产生吸光，对荧光测定法干扰较强。但生物发光探针基于生物发光迁移效率原理，且发光强度较强，生物样品的生物发光背景信号极低，同时生物样品的吸光干扰几乎不影响结果。4)由于荧光测定法受样品基质干扰，因此对样品的前处理要求严格，通常需要结合免疫共沉淀方法，分离掉干扰基质后才能完成定量，使整体操作繁琐，耗时较长。但是基于NAD+生物发光探针的CD38活性检测可以避免该类前处理。
附图说明
图1：荧光测定法检测CD38活性。
图2：生物发光能量共振转移探针法检测CD38酶活性。
图3：取样法监测CD38酶活性。
图4：连续法监测CD38酶活性。
图5：NAD+生物发光探针定量检测CD38活性(取样法)。
图6：NAD+生物发光探针定量检测CD38活性(连续法)。
图7：测定PBMC中CD38的酶活性(抽样监测)。
图8：天然药物分子调控CD38活性产生的NAD+消耗比率热图。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1
一种用于检测NAD+的生物发光能量共振转移(BRET)探针，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列：
WSHPQFEKGADDDDKVPHMVSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFIKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTVVEQYERSEGRHSTLTLTAATTRAQELRKQLNQYSHEYYVKDQPSVEDYVYDRLYKELVDIETEFPDLITPDSPTQNVGGKVLSGFEKAPHDIPMYSLNKGFSKEDIFAFDERVRKAIGKPVAYCCELLIDGLAISLRYENGVFVRGATRGDGTVGENITENLRTVRSVPMDLTEPISVEVRGECYMPKQSFVALNEEREENGQDIFANPRNAAAGSLRQLDTKIVAKRNLNTFLFTVADFGPMKAKTQFEALEELSAIGFRTNPERQLCQSIDEVWAYIEEYHEKRSTLPYEINGIVIKVNEFALQDELGFTVKAPRWAIAYKFPVDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGTGGSGGTGGSMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGAPGFSSISAHHHHHHHHHH(SEQ ID NO.1)
生物发光能量共振转移探针检测NAD+的原理如下：
NAD+生物发光能量共振转移探针由共振能量转移给体、NAD+响应蛋白和共振能量转移受体串联而成；其中NAD+响应蛋白为DNA连接酶的突变体，共振能量转移给体选自环状排列的生物发光蛋白cpNLuc(circularly permutedNano Luciferase)，共振能量转移受体为红色荧光蛋白mScarlet突变体。探针整体序列为如SEQ ID NO.1所示。NAD+响应蛋白不结合NAD+分子时，探针结构处于“开放”状态，导致共振能量转移给体和受体之间距离较远，共振能量转移效率较低，探针整体发出共振能量转移给体的光。当NAD+响应蛋白结合NAD+分子后，其构象由“开放”转变为“闭合”状态，促使共振能量转移给体和受体靠近，形成较高的共振能量转移效率，探针发出共振能量转移受体的光。NAD+分子引起的共振能量转移效率变化，最终表现为探针内共振能量转移给体和受体发射波长强度的变化。该发射光强比值进而可指示体系中NAD+分子的浓度。
该生物发光能量共振转移(BRET)探针可用于检测CD38酶活性、筛选CD38酶活性调控药物。CD38具有水解酶和环化酶活性，可将NAD+转化为NAM和ADPR/cADPR，基于此，本发明利用生物发光能量共振转移探针实时测量CD38反应体系中的NAD+浓度，根据酶反应消耗NAD+的速率表征CD38的酶活性强弱。本发明依据的生物酶促反应如图2所示。
本发明包含两种检测CD38酶活性的方法：(1)取样法；(2)连续法。
1.光强比值的测量
(1)取样法(图3)。反应液包含50mM MES缓冲液(pH 6.5)、60μMβ-NAD、待测样本。反应液混匀后，置于37℃下反应，设置适当时间间隔，每隔一段时间取适量反应液，用0.5N高氯酸处理，反应液与高氯酸的体积比为1:4，终止反应。将处理后的反应液与4nM NAD+生物发光探针和1000倍稀释的探针底物Furimazine混合，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值(580nm/440nm)。
(2)连续法(图4)。反应液包含50mM MES缓冲液(pH 6.5)、4nMNAD+生物发光探针、60μMβ-NAD、探针底物、待测样本，按次序混合(按次序混合指的是加入一个组分混合后，再加入另一组分)，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长发光强度的动态变化，持续1h，时间间隔1min，计算每个时间点的光强比值(580nm/440nm)。
2.CD38酶活性的表征
用Flex Station3多功能酶标仪在发光模式下测量不同浓度NAD+下440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值，利用不同浓度NAD+下测得的440nm和580nm两波长光强比值对应NAD+浓度作出标准曲线。根据上述取样法或连续法，测量待测样本反应体系在不同时间点的440nm和580nm两波长光强比值(580nm/440nm)，根据标准曲线和每个时间点测得的光强比值，对应求得反应体系中每个时间点的NAD+浓度。将NAD+浓度同反应时间作图，利用线性回归确定反应体系中的NAD+消耗速率，单位为M/min，并以此表征CD38的酶活性。
实施例2
本实施例提供低浓度CD38酶活性的取样定量监测，具体如下：
100μl反应液包含50mM MES缓冲液(pH 6.5)、60μMβ-NAD、不同浓度CD38(0.1ng/μl，0.15ng/μl，0.5ng/μl)。反应温度37℃，每隔10分钟取5μl反应液按1:4比例加20μl 0.5N高氯酸终止反应，终止反应后的混合液取10μl加入4nM NAD+生物发光探针和探针底物。酶标仪检测440nm、580nm发光强度，计算光强比，根据标准曲线，对应每个时间点的NAD+浓度。将NAD+浓度同反应时间作图，结果如图5，利用线性回归确定反应体系中的NAD+消耗速率，单位为μM/min。0.1ng/μl,0.15ng/μl,0.5ng/μl CD38样品中分别测得的酶活性为0.8±0.06μM/min,1.0±0.03μM/min,4.0±0.24μM/min。
实施例3
本实施例提供低浓度CD38酶活性的实时定量监测，具体如下：
100μl反应液包含50mM MES缓冲液(pH 6.5)、4nM NAD+生物发光探针、60μMβ-NAD、探针底物、不同浓度CD38(0.1ng/μl，0.2ng/μl，0.35ng/μl，0.5ng/μl，0.7ng/μl)，按次序混合。反应温度37℃，酶标仪持续1小时监测440nm、580nm发光强度的动态变化，时间间隔1min。计算每个时间点的光强比，根据标准曲线，对应每个时间点的NAD+浓度。将NAD+浓度同反应时间作图，结果如图6，利用线性回归确定反应体系中的NAD+消耗速率，单位为μM/min。0.1ng/μl,0.2ng/μl,0.35ng/μl,0.5ng/μl,0.7ng/μl CD38样品中分别测得的酶活性为0.67±0.1μM/min,1.54±0.1μM/min,2.87±0.24μM/min,4.26±0.28μM/min,6.10±0.05μM/min。
实施例4
本实施例提供生物样本中CD38的酶活性的检测方法，以PBMC生物样本为例进行说明，PBMC是外周血单核细胞，是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞，用聚蔗糖－泛影葡胺(Ficoll-hypaque)密度梯度离心法将PBMC从全血中分离提取，PBMC中CD38的酶活性的检测，具体如下：
100μl反应液包含PBS缓冲液(pH＝7.4)、1×103cells/μl PBMC、60μMβ-NAD、1μM78c(CD38抑制剂)。反应温度37℃，每隔一段时间取5μl反应液按1:4比例加20μl 0.5N高氯酸终止反应，反应后的混合液取10μl加入4nM NAD+生物发光探针和探针底物。酶标仪检测440nm、580nm发光强度，计算光强比，根据标准曲线，对应每个时间点的NAD+浓度。将NAD+浓度同反应时间作图，结果如图7，利用线性回归确定反应体系中的NAD+消耗速率，单位为μM/min。在PBMC+NAD+组中测得PBMC样品表现的CD38活性为0.32±0.03μM/min，在CD38酶抑制剂78C存在时没有测得显著CD38活性。
实施例5
本发明可以作为高通量筛选CD38调控药物(包括CD38激活剂或抑制剂)的生物技术手段。利用NAD+生物发光探针筛选天然药物分子库中与CD38直接相互作用的药物分子。通过测量NAD+消耗速率直接筛选CD38的激活剂或抑制剂。本实施例提供基于酶活性的CD38调控药物筛选方法，具体如下：
测量实验组和对照组反应体系反应一段时间后的440nm和580nm两波长光强比值，其中，实验组反应体系中加入待测药物，对照组反应体系中不加入待测药物。100μl反应液包含50mM MES缓冲液(pH 6.5)、60μMβ-NAD、0.5ng/μl CD38、1μM的药物分子。反应温度为37℃，反应1小时后将反应液按1:4比例加0.5N高氯酸终止反应，反应后的混合液取10μl加入4nM NAD+生物发光探针和探针底物。用酶标仪检测440nm、580nm发光强度，计算光强比，根据标准曲线，对应反应一段时间后反应体系中的NAD+浓度，计算NAD+的消耗量。最终计算实验组较对照组NAD+消耗量比率(Ratio)，Ratio＝实验组NAD+消耗量/对照组NAD+消耗量。当Ratio＞1时，该药物即为潜在的CD38激活剂，且Ratio值越大，待测药物的药效越强；当Ratio＜1时，即为潜在CD38的抑制剂，且Ratio值越小，待测药物的药效越强；若Ratio＝1，该药物则不会影响CD38催化的NAD+消耗。实验同时检测对照组反应体系以验证反应的可靠性，根据定义对照组Ratio＝1，表明测试的有效性。
图8显示了天然药物分子调控CD38活性产生的NAD+消耗比率热图，图8横纵轴为96孔板编号。图中数字为Ratio前期的不同浓度CD38活性的检测，以及CD38抑制剂加入后检测到的CD38活性抑制证实了反应体系的可靠性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 一种NAD+生物发光探针及其应用
<130> CP122010372C
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 754
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Asp Asp Asp Asp Lys Val
1 5 10 15
Pro His Met Val Ser Lys Gly Glu Ala Val Ile Lys Glu Phe Met Arg
20 25 30
Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile
35 40 45
Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys
50 55 60
Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Trp Asp Ile Leu
65 70 75 80
Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Arg Ala Phe Ile Lys His Pro Ala
85 90 95
Asp Ile Pro Asp Tyr Tyr Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp
100 105 110
Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ala Val Thr Val Thr Gln
115 120 125
Asp Thr Ser Leu Glu Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg
130 135 140
Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met
145 150 155 160
Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Glu Asp Gly Val Leu
165 170 175
Lys Gly Asp Ile Lys Met Ala Leu Arg Leu Lys Asp Gly Gly Arg Tyr
180 185 190
Leu Ala Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Met
195 200 205
Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asp Arg Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn
210 215 220
Glu Asp Tyr Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His
225 230 235 240
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ala Ala Thr Thr Arg Ala Gln Glu Leu Arg
245 250 255
Lys Gln Leu Asn Gln Tyr Ser His Glu Tyr Tyr Val Lys Asp Gln Pro
260 265 270
Ser Val Glu Asp Tyr Val Tyr Asp Arg Leu Tyr Lys Glu Leu Val Asp
275 280 285
Ile Glu Thr Glu Phe Pro Asp Leu Ile Thr Pro Asp Ser Pro Thr Gln
290 295 300
Asn Val Gly Gly Lys Val Leu Ser Gly Phe Glu Lys Ala Pro His Asp
305 310 315 320
Ile Pro Met Tyr Ser Leu Asn Lys Gly Phe Ser Lys Glu Asp Ile Phe
325 330 335
Ala Phe Asp Glu Arg Val Arg Lys Ala Ile Gly Lys Pro Val Ala Tyr
340 345 350
Cys Cys Glu Leu Leu Ile Asp Gly Leu Ala Ile Ser Leu Arg Tyr Glu
355 360 365
Asn Gly Val Phe Val Arg Gly Ala Thr Arg Gly Asp Gly Thr Val Gly
370 375 380
Glu Asn Ile Thr Glu Asn Leu Arg Thr Val Arg Ser Val Pro Met Asp
385 390 395 400
Leu Thr Glu Pro Ile Ser Val Glu Val Arg Gly Glu Cys Tyr Met Pro
405 410 415
Lys Gln Ser Phe Val Ala Leu Asn Glu Glu Arg Glu Glu Asn Gly Gln
420 425 430
Asp Ile Phe Ala Asn Pro Arg Asn Ala Ala Ala Gly Ser Leu Arg Gln
435 440 445
Leu Asp Thr Lys Ile Val Ala Lys Arg Asn Leu Asn Thr Phe Leu Phe
450 455 460
Thr Val Ala Asp Phe Gly Pro Met Lys Ala Lys Thr Gln Phe Glu Ala
465 470 475 480
Leu Glu Glu Leu Ser Ala Ile Gly Phe Arg Thr Asn Pro Glu Arg Gln
485 490 495
Leu Cys Gln Ser Ile Asp Glu Val Trp Ala Tyr Ile Glu Glu Tyr His
500 505 510
Glu Lys Arg Ser Thr Leu Pro Tyr Glu Ile Asn Gly Ile Val Ile Lys
515 520 525
Val Asn Glu Phe Ala Leu Gln Asp Glu Leu Gly Phe Thr Val Lys Ala
530 535 540
Pro Arg Trp Ala Ile Ala Tyr Lys Phe Pro Val Asp Gln Met Gly Gln
545 550 555 560
Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe
565 570 575
Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro
580 585 590
Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe
595 600 605
Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys
610 615 620
Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg
625 630 635 640
Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu
645 650 655
Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ser Gly Gly Thr Gly Gly Ser Met Val Phe
660 665 670
Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn
675 680 685
Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln Asn
690 695 700
Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly Glu
705 710 715 720
Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Ala
725 730 735
Pro Gly Phe Ser Ser Ile Ser Ala His His His His His His His His
740 745 750
His His

Claims (11)

1.一种NAD+生物发光探针，其特征在于，所述NAD+生物发光探针具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述NAD+生物发光探针的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的NAD+生物发光探针在检测NAD+浓度中的应用或在检测CD38酶活性中的应用或在筛选CD38酶活性调控药物中的应用或在CD38酶活性调控药物的药物效果评估中的应用；
所述CD38酶活性调控药物包括CD38激活剂或CD38抑制剂。
4.一种NAD+浓度的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述NAD+生物发光探针和生物发光探针底物。
5.一种CD38酶活性的生物发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述NAD+生物发光探针、β-NAD、MES缓冲液、生物发光探针底物和高氯酸。
6.一种CD38酶活性调控药物的筛选或药效评估试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述NAD+生物发光探针、β-NAD、MES缓冲液、生物发光探针底物、高氯酸和CD38。
7.一种检测NAD+浓度的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1.采用权利要求1所述NAD+生物发光探针与不同标准浓度的NAD+混合，测量不同浓度NAD+下440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值，利用不同浓度NAD+下测得的440nm和580nm两波长光强比值对应NAD+浓度作出标准曲线；
S2.采用权利要求1所述NAD+生物发光探针与待测样本混合，测量待测样本在440nm和580nm两波长下的光强比值；
S3.在标准曲线上回归获得待测样本对应的NAD+浓度。
8.一种CD38酶活性的生物发光检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
S1.采用权利要求1所述NAD+生物发光探针与不同标准浓度的NAD+混合，测量不同浓度NAD+下440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值，利用不同浓度NAD+下测得的440nm和580nm两波长光强比值对应NAD+浓度作出标准曲线；
S2.通过方法(1)或方法(2)测量待测样本反应体系在不同时间点的440nm和580nm两波长光强比值；
方法(1)：将包含MES缓冲液、β-NAD和待测样本的反应液混匀，置于37℃下反应，设置适当时间间隔，每隔一段时间取适量反应液，用高氯酸处理，终止反应，将处理后的反应液与权利要求1所述生物发光探针和探针底物混合，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长处的发光强度，计算每个时间点的光强比值；
方法(2)：将包含MES缓冲液、权利要求1所述生物发光探针、β-NAD、探针底物、待测样本，按次序混合，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长发光强度在一段时间内、适当时间间隔的动态变化，计算每个时间点的光强比值；
S3.根据步骤S1制作的标准曲线和步骤S2测量的待测样本反应体系每个时间点的光强比值，对应求得反应体系中每个时间点的NAD+浓度，将NAD+浓度同反应时间作图，利用线性回归确定反应体系中的NAD+消耗速率，即为CD38的酶活性。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，方法(1)中：
100μl所述反应液包含50mM MES缓冲液、20-200μMβ-NAD和待测样本；
所述高氯酸的浓度为0.5N，所取反应液与高氯酸的体积比为1:4；
10μl所述处理后的反应液中加入的生物发光探针量为0.1-20nM；
方法(2)中：100μl所述反应液包含50mM MES缓冲液、0.1-20nM生物发光探针、20-200μMβ-NAD、探针底物和待测样本；
优选地，方法(1)和方法(2)中所述MES缓冲液的pH为6.5；
优选地，方法(1)中所述时间间隔为10min；
优选地，方法(2)中所述时间间隔为1min；
优选地，所述待测样本包括生物样本；
优选地，所述生物样本包括生物细胞或组织。
10.一种CD38酶活性调控药物的筛选方法或CD38酶活性调控药物的药效评估方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.采用权利要求1所述NAD+生物发光探针与不同标准浓度的NAD+混合，测量不同浓度NAD+下440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值，利用不同浓度NAD+下测得的440nm和580nm两波长光强比值对应NAD+浓度作出标准曲线；
S2.通过方法(1)或方法(2)测量实验组和对照组反应体系反应一段时间后的440nm和580nm两波长光强比值，其中，实验组反应体系中加入待测药物，对照组反应体系中不加入待测药物；
方法(1)：将包含MES缓冲液、β-NAD、CD38和待测药物的反应液混匀或将包含MES缓冲液、β-NAD和CD38的反应液混匀，置于37℃下反应一段时间，取适量反应液，用高氯酸处理，终止反应，将处理后的反应液与权利要求1所述生物发光探针和探针底物混合，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值；
方法(2)：将包含MES缓冲液、权利要求1所述生物发光探针、β-NAD、探针底物、CD38和待测药物或将包含MES缓冲液、权利要求1所述生物发光探针、β-NAD、探针底物和CD38，按次序混合，反应一段时间，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长发光强度，计算光强比值；
S3.根据步骤S1制作的标准曲线和步骤S2测量的反应体系的光强比值，对应反应一段时间后反应体系中的NAD+浓度，计算NAD+的消耗量，最终计算实验组较对照组NAD+消耗量比率(Ratio)；
当Ratio＞1时，所述待测药物为潜在的CD38激活剂，且Ratio值越大，待测药物的药效越强；当Ratio＜1时，所述待测药物为潜在CD38的抑制剂，且Ratio值越小，待测药物的药效越强；当Ratio＝1时，所述待测药物不会影响CD38催化的NAD+消耗。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，方法(1)中：
100μl所述反应液包含50mM MES缓冲液、20-200μMβ-NAD、0.1-10ng/μl CD38和0.01-500μM待测药物；
所述高氯酸的浓度为0.5N，所取反应液与高氯酸的体积比为1:4；
10μl所述处理后的反应液中加入的生物发光探针量为4nM；
方法(2)中：100μl所述反应液包含50mM MES缓冲液、0.1-20nM生物发光探针、20-200μMβ-NAD、0.1-10ng/μl CD38和0.01-500μM待测药物；
优选地，方法(1)和方法(2)中所述MES缓冲液的pH为6.5；
优选地，方法(1)和方法(2)中所述反应时间为1h。
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