WO2001090392A1 - Nouveau vecteur d'adenovirus recombinant a effets secondaires reduits - Google Patents

Nouveau vecteur d'adenovirus recombinant a effets secondaires reduits Download PDF

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WO2001090392A1
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Michio Nakai
Kazuo Komiya
Masashi Murata
Naoki Tohdoh
Izumu Saito
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Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant adenovirus vector for gene therapy and a method for producing the same.
  • the present invention provides a novel recombinant adenovirus vector which reduces inflammation upon in vivo administration by suppressing the induction of adenovirus gene expression by a foreign promoter inserted into the adenovirus genome, and its production.
  • the present invention relates to a method, a cell line used for the production of the recombinant adenovirus vector, and a certain class relates to a gene therapy method using the recombinant adenovirus vector.
  • Adenovirus vectors are excellent vectors for gene transfer into animal cells because of their advantages such as high gene transfer efficiency, gene transfer into non-dividing cells, and easy preparation of high titer virus solution. Clinical application as a vector for gene therapy has been attempted.
  • a widely used adenovirus vector is a non-propagating vector in which the E1 gene essential for adenovirus propagation and expression of all adenovirus proteins has been deleted. This vector is a first-generation adenovirus vector. (Also may include a deletion of the E3 gene).
  • first-generation adenovirus vector lacks the E1 gene, it was thought that normal cells that do not express the E1 gene, such as human cells, would not express any adenovirus protein.
  • transfection of transgenes in vivo using first-generation adenovirus vectors results in transient transgene expression and an inflammatory response at the transfected site. USA, Vol. 91, 4407-4411, (1994), and Wilmott RW et al., Hum. Gene Ther., Vol. 7, 301. —318 ⁇ (1996)).
  • adenovirus vectors that also deleted genes essential for the growth of adenovirus other than the El gene and that enabled virus growth by supplementing the protein encoded by that gene from virus-producing cells.
  • adenovirus vectors in which the E2A gene has been deleted Zhou H. et. Al., J. Virol., Vol. 70, 7030-7038. (1996), and Gorziglia MI et. Virol., Vol. 70, 4173-4178. (1996)
  • an adenovirus vector in which the E4 gene, which is the same as the E2A gene, is deleted Zagliak V. et al., Hum. Gene Ther., Vol. 6, 1575-1586.
  • HD vector helper-dependent adenovirus vector
  • This HD vector is also called a gutted vector or gutless vector. It has been reported that the HD vector exhibited effects of vector improvement, such as prolonged transgene expression and reduced inflammatory response (Morsy MA et. Al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.
  • the HD vector when this HD vector is clinically applied as a drug, there is a major problem in that the productivity of the vector is low.
  • the reason is as follows. First, at the time of HD vector production, the HD vector relies on helper adenovirus to supply all the proteins necessary for growth. Because of the production principle of propagating the HD vector while always keeping the helper virus at a certain ratio or less, the reported HD vector production per unit cell is clearly lower than that of the first-generation adenovirus vector. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95, 7866-7871. (1998), and Schiedner G. et. Al., Nature Gnent., Vol. 18, 180. -183. (1998)).
  • the target HD vector is always contaminated with the helper virus used for its production, both viruses must be separated by ultracentrifugation based on the subtle difference in the specific gravity of both viruses to remove the helper virus. You have to.
  • the first generation adenovirus vector may also be purified by ultracentrifugation, but its purpose is to remove contaminating proteins from adenovirus particles.
  • the purification of the HD vector it is necessary to remove the contaminating proteins and to separate the helper virus as described above. Therefore, the amount that can be purified by one ultracentrifugation is smaller than that of the first-generation adenovirus vector. If the helper virus is not sufficiently removed, the safety of the vector itself is a concern.
  • the first-generation adenovirus vector uses a column method (Huyghe BD et. al., Hum. Gene Ther., Vol. 6, 1403-1416. (1995)).
  • For the HD vector it is necessary to remove the helper virus. Not applicable.
  • HD vectors are clearly less productive than first-generation adenovirus vectors, both during production in cultured cells and in the subsequent purification process. Therefore, it is considered extremely difficult and impractical to produce a sufficient amount of HD vector for clinical use.
  • CMV cytomegalovirus
  • Virus-derived promoters such as the (RSV) promoter are widely used in gene therapy vectors such as adenovirus vectors because of their high promoter activity.However, they are used for long-term expression of target genes from these promoters in vivo. Require the protein encoded by the adenovirus E4 gene (Armentano D. et al., J. Virol., Vol. 71, 2408-2416.
  • An object of the present invention is to provide an adenovirus vector capable of multiplying independently of a helper virus, and hardly expressing adenovirus proteins in vivo, and consequently not inducing an inflammatory response
  • An object of the present invention is to provide a new adenovirus vector having the property that the expression period can be maintained.
  • Another object is to provide a powerful adenovirus vector for gene therapy.
  • the present inventors diligently studied the cause of an inflammatory response when a first-generation adenovirus vector lacking the E1 gene was administered to an individual animal. As a result, they found that the mechanism of expression of adenovirus proteins when cells were infected with the first-generation adenovirus vector was completely different from the conventional hypothesis, in the absence of the E1 protein. That is, the present inventors did not trigger the expression of the adenovirus protein by the expression of the adenovirus virus, but by the expression of the early gene, which has been heretofore described. It was clarified that this was due to a foreign promoter inserted into the tractor.
  • a specific component such as an enhancer
  • a specific component such as an enhancer
  • the mainly expressed adenovirus gene is not a major late gene that is controlled by the major late promoter (MLP) and encodes a hexon or the like, but a protein IX gene that has an independent promoter. I found something.
  • MLP major late promoter
  • Protein IX is not an essential protein for the growth of adenovirus, but it is a protein that is necessary to construct a complete adenovirus particle. Therefore, simply deleting the protein IX gene from the first-generation adenovirus vector does not provide the normal adenovirus vector desired by the present inventors. Thus, the present inventors have further studied diligently and found that the problem can be solved by the following two methods.
  • One is a method of rearranging the protein IX gene of the adenovirus vector from a normal position to a position not affected by the foreign promoter (referred to as a protein IX rearranged adenovirus vector).
  • the other is a method in which the protein IX gene is deleted from the adenovirus vector, a new cell line producing protein IX is produced, and the cell line is used to produce an adenovirus vector in which the protein IX gene is deleted. (Protein IX deleted adenovirus vector).
  • the adenovirus gene whose expression is induced by the influence of the foreign promoter is mainly the protein IX gene, but the expression of the protein IVa2 gene and L1 gene may be induced.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • adenovirus genome promoter is an MLP and / or IVa2 gene promoter.
  • the protein IX gene of the adenovirus genome has been rearranged from a normal position to a position that is not induced by a foreign motor
  • the recombinant adenovirus vector according to 9. which carries ORF 3 of E4 gene of adenovirus genome.
  • adenovirus vector according to any one of the above 1 to 17, wherein the foreign promoter comprises a component derived from a mammal and a component derived from Z or an animal virus.
  • adenovirus vector according to any one of 1 to 22 above, wherein the adenovirus is a human adenovirus.
  • adenovirus vector according to 23 wherein the adenovirus is a type 2 or 5 adenovirus.
  • E 1 A and E 1 B genes, E 3 genes, and adenovirus genome The recombinant adenovirus vector according to any one of the above 25 to 27, wherein all or a part of at least one gene other than the protein IX gene has been deleted.
  • the recombinant adenovirus vector according to the above 30. which carries the ORF 3 of the E4 gene of the adenovirus genome.
  • the adenovirus is a human adenovirus, 25.-37.
  • Mammalian-derived cells having the following features (1 2) and (1 3):
  • the adenovirus protein IX gene is The cell according to the above 40, wherein the expression is controlled by a foreign promoter other than one of the following:
  • the cell according to 40 or 41 further expressing at least one or more adenovirus genes other than the adenovirus E1 gene and protein IX gene.
  • the cell according to 42 which expresses the adenovirus E1 gene, protein IX gene, and E2A gene.
  • the foreign adenovirus vector according to any one of 45 to 48, wherein a foreign gene including a foreign promoter is inserted leftward.
  • the foreign promoter is the EF1 ⁇ promoter, as described in 45. to 49. Any of the recombinant adenovirus vectors described above,
  • a recombinant adenowinores vector having the following characteristics (19) to (21), which reduces inflammation when administered in vivo:
  • a nucleotide sequence having a property of suppressing the induction of adenovirus gene expression by the foreign promoter is inserted between the foreign promoter and the adenovirus gene;
  • a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient a recombinant adenovirus vector selected from the above 1. to 39. and 45. to 53., which does not reduce or induce inflammation upon administration of in ViVo,
  • a method for reducing inflammation during in Vivo administration comprising administering to a mammal a recombinant adenovirus vector selected from the above 1. to 39. and 45. to 53.
  • a gene therapy method for reducing inflammation upon administration of in vivo comprising administering to a mammal a recombinant adenovirus vector selected from the above 1. to 39. and 45. to 53.
  • a recombinant adenovirus vector selected from the above 1. to 39. and 45. to 53. for producing a pharmaceutical composition for gene therapy that does not reduce or induce inflammation upon in vivo administration. About.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the adenovirus vector used in the experiment.
  • CAG indicates the CAG promoter
  • pA indicates the poly A sequence
  • the arrow above it indicates the direction of transcription.
  • Ad5 genome is the human adenovirus type 5 genome
  • lacZ is the E. coli lacZ gene
  • Cre is the recombinase Cre gene
  • hGH is the human growth hormone cDNA.
  • FIG. 2 is a graph showing the average daily changes in serum GPT values of C57BL / 6 mice to which the adenovirus vector AxlCAHGH or ⁇ 2 ⁇ -CAHGH was administered via the tail vein (5 animals per group).
  • ⁇ is 1 X 10 9 PFU
  • ⁇ is 3 X 10 8 PFU
  • ⁇ is 1 x 10.
  • the group to which the PFU adenovirus vector was administered is shown.
  • FIG. 3 is a daraf showing the average daily changes in serum GPT of C57BL / 6 mice to which adenovirus vectors or UV-inactivated adenovirus particles of various structures were administered via tail vein (5 mice per group).
  • the reference is 1 X 10.
  • PFU indicates 3 ⁇ 10 ° PFU
  • ⁇ indicates 1 ⁇ 10 8 PFU
  • ⁇ indicates the group to which 3 ⁇ 10 7 PFU vector was administered.
  • Saline indicates a group administered with saline
  • UV-inactivated indicates a group administered with UV-inactivated adenovirus particles.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of a Northern blot.
  • A549 cells or HepG2 cells were infected with the following adenovirus vectors at moi 100, and RNA was prepared from the cells 24 hours later. After electrophoresis of 5 ⁇ g of each RNA, Northern blot was performed to detect (A) L3 RNA, (B) IVa2 RNA, and (C) pIX RNA.
  • Mock mock infection
  • lwl Axlwl
  • CAwt AxCAwt
  • HGH AxlCAHGH
  • ⁇ 2 ⁇ ⁇ 2 ⁇ -CAHGH.
  • Arrows and numbers on the right side of the gel indicate the position and size of the target band.
  • Ad5-dlX Saito I. et. Al., J. Virol., Vol. 54, 711-719. (1985)
  • Ad5-dlX Saito I. et. Al., J. Virol., Vol. 54, 711-719. (1985)
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of a Northern plot of the protein IX (pIX) gene.
  • A549 cells were infected with AxCAwt or AdCMVlacZ using the moi shown in the figure, and RNA was prepared from the cells 24 hours later. After electrophoresis of each RNA 5, Northern blot was performed and pIX
  • RNA was detected.
  • the abbreviations in the figure indicate Mock: Motta infection, CAG: AxCAwt, CMV: AdCMVlacZ.
  • Ad5-dlX (see Fig. 4) was used to infect A549 cells with a moi of 10, after 24 hours, RNA was prepared, and the amount of RNA shown in the figure was measured. They were used for swimming.
  • FIG. 6 is a photograph showing the result of a Northern blot of the pIX gene.
  • A549 cells were infected with each of the adenovirus vectors shown in the figure with moi 30 or moi 100, and RNA was recovered 24 hours later.
  • Northern blot was performed using 5 ⁇ g of each RNA, and pIX RNA was detected.
  • FIG. 7 shows the average daily change in serum GPT of C57BL / 6 mice to which adenovirus vectors having different promoters were administered via tail vein (5 mice per group).
  • ⁇ indicates the group to which 1 ⁇ 10 ”PFU
  • ⁇ indicates the group to which 3 ⁇ 10” PFU was administered
  • ⁇ indicates the group to which 1 ⁇ 10 8 PFU was administered.
  • FIG. 8 is a photograph showing the results of a Western blot using an antiserum to pIX fusion protein (GST-pIX).
  • Ad5-dlX (see Fig. 4) was used to infect A549 cells with a moi of 10. After about one day, the cells were collected and dissolved in SDS sample buffer. This cell lysate or purified virus particles (7.5 x 10'PFU) was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions, and Western blotting was performed.
  • Anti-pIX serum # 1 Anti- pIX
  • Pre-immune pre-immune
  • the abbreviations in the figure indicate Mock: uninfected cells, Ad5: Ad5-dlX infected cells, and Virion: purified virus particles.
  • the numbers on the right side of the figure indicate the molecular weights of the molecular weight markers.
  • a colored molecular weight marker (GIBC0 BRL, Cat. No. 10748-010) was used.
  • a value corrected from the mobility of an uncolored molecular weight marker (New England Biolabs, model number P7702S) was used.
  • the values in parentheses are values that have not been corrected for the uncolored molecular weight.
  • FIG. 9 is a photograph showing the result of pIX western blot.
  • A549 cells were infected with AxCAwt (moi 100), Awlwl (moi 100) or Ad5-dlX (moi 10), and the cells were collected about 1 day later and dissolved in SDS sample buffer. After SDS-PAGE, Western blotting was performed to detect pIX.
  • Ad5 Ad5-dlX infected cells
  • CAwt AxCAwt infected cells
  • lwl Awlwl infected cells
  • Mock uninfected cells.
  • the numbers on the right side of the figure indicate the molecular weight (see Fig. 8).
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing the structure of a pIX rearranged adenovirus vector, a pIX deleted adenovirus vector, and the like.
  • lacZ indicates the expression unit of E. coli lacZ gene
  • pIX indicates the protein IX gene
  • psi indicates the packaging signal
  • CAG indicates the CAG promoter
  • hGH indicates the human growth hormone cDNA
  • pA indicates the poly A sequence.
  • Arrows indicate the transcription direction of each gene.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing a method for constructing the cosmid vectors pAx ApIXcw and pAx ApIXCAHGH.
  • the white box indicates the human adenovirus type 5 genome
  • the thin line indicates the DNA sequence derived from Escherichia coli.
  • the numbers on the restriction enzyme names indicate the nucleotide numbers of the respective restriction enzyme recognition sites in human adenovirus type 5.
  • Ap R indicates the ampicillin resistance gene
  • ori indicates the replication origin of E. coli
  • COS indicates the COS site of ⁇ phage.
  • FIG. 12 is a photograph showing the result of a Northern blot of the pIX gene in the pIX-expressing cell line.
  • Four clones of the pIX-expressing cell line (# 2, # 5, # 6, # 10) were passaged up to passage 30, RNA was prepared from the cell line every 5 passages, and Northern blotting was performed.
  • P1, P5, P10, P15, P20, P25, and P30 indicate the number of passages.
  • the left three lanes are negative and positive controls.
  • Mock indicates RNA prepared from 293 cells not infected with virus, and 8 hr and 24 hr indicate RNA prepared by infecting 293 cells with Axlwl at moi 10 and 8 hours (8 hours) and 24 hours (24 hours).
  • FIG. 13 is a photograph showing the result of western blot of pIX in a pIX-expressing cell line. After 4 passages of 4 clones (# 2, S5, # 6, and # 10) of the pIX-expressing cell line, Dissolved in one. After SDS-PAGE, western blot was performed to detect pIX. The three lanes on the right are negative and positive controls. See Figure 12 for details. An uncolored molecular weight marker (New England Biolabs, model number P7702S) was used as the molecular weight marker.
  • the cause of inflammation that occurs when a recombinant adenovirus vector is administered in vivo is caused by an exogenous promoter.
  • a gene of the adenovirus genome that should not be expressed is expressed by the action of a foreign promoter, and that the expressed adenovirus-derived protein causes inflammation.
  • the genomic structure of the recombinant adenovirus vector should be appropriately modified so as not to be affected by the foreign promoter.
  • a person skilled in the art can modify the genomic structure of the recombinant adenovirus vector so as not to be affected by the foreign promoter, by using ordinary gene recombination techniques.
  • the recombinant adenovirus of the present invention may have any structure as long as it has a modified genomic structure of the recombinant adenovirus vector so as not to be affected by the above-described foreign promoter. Included in the category of vectors.
  • Representative forms of the recombinant adenovirus vector of the present invention include those having the following features (1) to (4).
  • the adenovirus used for producing the recombinant adenovirus vector of the present invention is a virus using an animal as a natural host, and particularly a human adenovirus using a human as a host is preferably used.
  • human adenovirus of subgroup C such as human adenovirus type 2 or 5 is used.
  • map units maps, hereinafter abbreviated as mu, 1 mu is about 360 base pairs
  • mu maps
  • the entire nucleotide sequence of the human adenovirus type 2 genome is in Genebank (accession number J01949), and the entire nucleotide sequence of the human adenovirus type 5 genome is in genebank (accession number). Number M73260).
  • the deletion of the adenovirus E1A gene and the E1B gene in the above (1) means that all or a part of the nucleotide sequence of both genes is absent, so that functional E1A and E1B proteins are not produced. There is no particular limitation on the range of deletion as long as the deletion is simple.
  • the protein IX gene exists at a position completely overlapping with a part of the E1B gene, but the deletion of the E1B gene does not usually include the deletion of the protein IX gene.
  • Examples of deletions of the E1A and E1B genes include deletion of 1.3-9.3 mu of adenovirus type 5 (deletion of all E1A genes and most of E1B genes; Trapnell BC, Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 12, 185-199.
  • the E1A gene and the E1B gene may be simply referred to as an E1 gene or an E1 region.
  • the foreign promoter is the original promoter of adenovirus.
  • the term “foreign gene” refers to a gene encoding a promoter, a protein, and the like, and a base sequence for performing transcription comprising a polyA sequence and the like.
  • the term “foreign gene” generally refers to a gene that expresses a protein or the like for treating a target disease when gene therapy is intended.
  • a foreign gene can be easily prepared by inserting a gene encoding a desired protein into various commercially available expression vectors. Insertion of the prepared foreign gene into the adenovirus genome can also be performed by a known technique described in the literature (Graham F. et al., A1., Pro Natl. Acad. Sci.
  • the foreign gene is preferably inserted into the E1 gene deletion site.
  • the gene of the adenovirus genome whose expression is induced by the foreign promoter refers to a gene of the adenovirus genome such that the transcription of the gene is caused by the action of a specific component in the foreign promoter.
  • Specific examples include protein IX gene, protein IVa2 gene, and L1 gene.
  • the gene of the adenovirus genome which is induced to be expressed by such a foreign promoter is rearranged from a normal position to a position which is not to be induced by a foreign promoter, or By deleting the gene, expression of the gene during in vivo administration can be prevented.
  • a specific example is the protein IX gene. This achieves the object of the present invention that inflammation is reduced during in vivo administration.
  • the gene is deleted in the above, the previously deleted gene is introduced and expressed in the cells in which the recombinant adenovirus vector is propagated in order to form normal virus particles. There is a need.
  • having the property equivalent to that of an adenovirus wild-type strain means maintaining the ratio of components of virus particles such as proteins, physicochemical properties of virus particles, and infectivity to cells. In terms of viewpoint, it has almost the same properties as the wild type.
  • all or part of at least one adenovirus genome gene other than the E1A and E1B genes can be further deleted. Specifically, it is possible to delete all or a part of the E3 gene, the E2A gene, and the Z or E4 gene.
  • the E4 gene is to be deleted here, it is preferable to delete at least one ORF of the E4 gene. Particularly, a deletion retaining at least 0RF3 is preferable.
  • Suitable forms of the recombinant adenovirus vector of the present invention include those having the following features (5) to (8).
  • the protein IX gene of the adenovirus genome has been rearranged from a normal position to a position that is not subject to expression induction by a foreign mouth motor;
  • the foreign gene in the above (6) is preferably inserted at the E1 gene deletion site. More preferably, a foreign gene has been inserted into the viral genome at a site where 1.3-1.2 mu has been deleted, that is, at a site where all of the E1 gene and the protein IX gene have been deleted (due to rearrangement). Is desirable.
  • the adenovirus protein IX (hereinafter sometimes referred to as pIX) of the above (7) is a small component constituting the groups of nine hexons in the capsid of adenovirus particles, and is a virion. And the size of the viral genome that can be packaged.
  • protein IX is not an essential component of adenovirus growth, virions lacking protein IX become unstable to heat (Colby WW et. Al., J. Virol., Vol. 39, 977- 980. (1981)), and can package only genomic DNA of 90% of the size of the wild-type strain (Ghosh-Choudhury G. et. Al., EMB0 J., Vol. 6, 1733-1739. (1987)). Therefore, protein IX is required to form normal virus particles.
  • the fact that the protein IX gene of the adenovirus genome is rearranged from a normal position to a position not to be induced by a foreign promoter means that the protein IX gene is originally present in the wild-type adenovirus genome.
  • Location, ie 9.7-11.2 mu in the human adenovirus type 5 genome does not have the protein IX gene and the protein IX gene exists at any other position in the adenovirus genome. It is.
  • the protein IX gene is not induced to be expressed by the foreign promoter indicates that the transcription of the protein IX gene is not induced by the foreign promoter.
  • the adenovirus vector in which the protein IX gene has been rearranged may be referred to as “protein IX rearranged adenovirus vector”.
  • the position where the protein IX gene is rearranged is not particularly limited as long as the protein IX gene is not induced by a foreign promoter and the expression of the protein IX is not significantly suppressed in the vector growth cycle. Hanare ,. However, it is desirable to relocate it to a position more than 10 kb away from the foreign promoter, and to a position where cloning of the foreign gene is easy.
  • a preferred example of such a position is a position 18 kb or more away from the foreign promoter, and a specific example thereof is that between the L3 gene and the E2A gene of the adenovirus genome (Japanese Patent Laid-Open No. 8-308585). Location.
  • Another preferred example is a position 24 kb or more away from the foreign promoter, and a specific example thereof is a deletion site of the E3 gene of the adenovirus genome. Further, another preferable example is a position 30 kb or more away from the foreign motor, and specific examples thereof include the upstream region of the E4 gene of the adenovirus genome and the 3 ′ ITR (inverted repeat sequence). (Saito I. et. Al., J. Virol., Vol. 54, 711-719. (1985)).
  • Deletion of the protein IX gene from a normal position and rearrangement to the above position can be easily performed based on ordinary gene recombination techniques or the above-mentioned known recombinant adenovirus production technique. Whether the produced protein IX rearranged adenovirus vector is suitable for the purpose of the present invention was determined by examining the presence or absence of inflammation during in vivo administration described in Example 5 and described in Example 6. It can be evaluated by Northern blot analysis or the like.
  • the virus particle containing the protein IX equivalent to that of the wild type adenovirus strain refers to an adenovirus particle containing the protein IX in substantially the same ratio as the protein IX contained in the wild type adenovirus particle.
  • normal ui A virus particle is an adenovirus particle that retains infectivity to cells, exhibits thermostability, and has properties similar to those of a wild-type adenovirus, such as the size of genomic DNA that can be packaged.
  • the protein IX rearranged adenovirus vector it is possible to delete the E1A and E1B genes, rearrange the protein IX gene, and delete all or part of the other genes of the adenovirus genome. it can. Specifically, it is possible to delete all or a part of the E3 gene, the E2A gene, and the Z or E4 gene.
  • the length of “all or a part” is not particularly limited as long as it is a deletion that does not produce a functional viral protein.
  • the base sequences of the adenovirus genome such as the E3 gene, E2A gene, and E4 gene are described in, for example, the literature (Edited by The Adenoviruses, Ginsberg HS, 1984, Plenum Press, New York). If so, the operation of deleting these genes from the adenovirus vector can be easily performed.
  • the E4 gene When deleting the E4 gene, it is desirable to retain at least one 0RF (open reading frame) of the E4 gene. In particular, it is desirable to retain 0RF3 of the E4 gene.
  • the E4 gene encodes seven types of polypeptides due to differences in splicing of RNA after transcription, and 0RF3 is one of the polypeptides. . 0RF3 has a function of promoting viral gene expression and DNA replication during the adenovirus growth cycle.
  • 0RF3 of the E4 gene is required for some exogenous promoters such as the CMV promoter described below to maintain their promoter activity in vivo for a long time (Luskv M. et al., J. Virol., Vol. 73, 8308-8319. (1999), and Yew NS et. Al., Hum. Gene Ther., Vol. 10, 1833—1843.
  • the cell line that produces the protein IX rearranged adenovirus vector of the present invention can be used for the production of a recombinant adenovirus vector that expresses the E1 gene and expresses the E1 gene like 293 cells derived from human fetal kidney (ATCC CRL-1573).
  • a suitable cell line There is no particular limitation as long as it is a suitable cell line.
  • an undesired adenovirus may be produced by homologous recombination.
  • a cell line containing only the minimum necessary portion of the E1 gene was used to minimize the presence of overlapping DNA sequences between the vector genome and the chromosome of the cell line. It is preferable to do so.
  • An example is the PER cell line derived from human embryonic retina (HER) cells (Fallaux F. J. et. Al., Hum. Gene Ther., Vol. 9, 1909-1917.
  • Cell lines expressing other adenovirus genes such as the E2A gene in addition to the El gene can also be used, if necessary.
  • the other adenovirus gene-expressing cell lines can be prepared, for example, by introducing an expression vector prepared by incorporating the adenovirus gene into an appropriate expression vector into the E1 gene-expressing cell by a conventional method. Can be.
  • Another preferred form of the recombinant adenovirus vector of the present invention is an adenovirus vector in which the E1 gene and the protein IX gene are deleted from the adenovirus genome, but the virus particles contain a normal amount of the protein IX. Is received. That is, a recombinant adenovirus vector having the following features (9) to (11) is mentioned.
  • (11) Contains the same protein IX as the wild-type adenovirus strain and forms normal virus particles.
  • protein IX deletion type adenovirus vector This vector is referred to as “protein IX deletion type adenovirus vector”.
  • the protein IX gene is deleted, and there is no particular limitation as long as the partial peptide of protein IX is a deletion that does not express a peptide derived from the protein IX gene. Nare, It is preferable to delete at least the entire coding region of the protein IX gene. Further, it is more preferable to delete 1.3-11.2 mu from the virus genome and delete all of the E1 gene and the protein IX gene. These deletions can be easily made by ordinary gene recombination techniques.
  • a cell line that expresses protein IX is required.
  • the cell line will be described later.
  • the foreign gene in the above (10) is preferably inserted at the E1 gene deletion site. More preferably, a foreign gene is desirably inserted into the viral genome at the site where 1.3-11.2 mu is deleted, that is, at the site where the entire E1 gene and the protein IX gene are deleted. Similarly to the protein IX rearranged adenovirus vector, the protein IX deletion type adenovirus vector can delete all or part of the adenovirus E3 gene. It is also possible to insert a foreign gene at the site of the deletion.
  • the virus particle containing the protein IX equivalent to that of the wild type adenovirus strain refers to an adenovirus particle containing the protein IX at substantially the same ratio as the protein IX contained in the wild type adenovirus particle.
  • a normal virus particle is an adenovirus particle that retains infectivity to cells, and has properties similar to those of a wild-type adenovirus, such as heat stability and the size of genomic DNA that can be packaged. .
  • the virus particles can be produced by infecting a cell line expressing protein ⁇ with a protein IX-deficient adenovirus vector and growing the same.
  • the protein IX-deleted adenowinores vector of the present invention can delete the E1A and E1B genes and the protein IX gene, and further delete all or part of the other adenovirus genomic genes. . Specific deletion is the same as in the case of the protein IX rearranged adenovirus vector described above. It is possible to delete all or part of the E2A gene and the Z or E4 gene.
  • the length of “all or part” is not particularly limited as long as it is a deletion that does not produce a functional viral protein.
  • nucleotide sequences of the adenovirus genome such as the E3 gene, E2A gene, and E4 gene are described in, for example, the literature (The Adenoviruses, edited by Ginsberg HS, 1984, Plenum Press, New York). Thus, an operation for deleting these genes from the adenovirus vector can be easily performed.
  • the recombinant adenovirus vector of the present invention is a foreign promoter for expressing a target foreign gene such as a therapeutic gene.
  • a target foreign gene such as a therapeutic gene.
  • An exogenous promoter can be any promoter that functions in mammalian cells and can express a desired gene in a desired amount, such as an animal virus-derived promoter, a mammalian cell-derived promoter, or a hybrid promoter of both. It can be used without limitation.
  • a foreign promoter in many cases, the higher the expression level of the therapeutic gene is, the more desirable it is.
  • CMV promoter Feecking MK et. Al. Gene, Vol. 45, 101-105. (1986)
  • CAG promoter Newa H. et. Al., Gene, Vol. 108, 193-200. (1991)
  • IE immediate early gene of human megarow inoles
  • the CAG promoter consists of a CMV IE enhancer, a chicken] 3-actin promoter, a heron] 3-globin splice receptor and a polyA sequence.
  • both the CMV promoter and the CAG promoter include the enhancer of the IE gene of CMV (Boshart M. et. Al., Cell, Vol. 41, 521-530. (1985)).
  • the enhancer of the IE gene of CMV may be simply referred to as “CMV enhancer”.
  • CMV enhancer which the CMV promoter and CAG promoter have in common, is a cause of induction of expression of adenovirus genes such as protein IX. That is, CMV enhancer acts on the promoter of the protein IX gene and the like, and as a result, it is considered that the protein IX and the like are expressed.
  • adenovirus vectors currently being clinically developed use a CMV promoter or a hybrid promoter containing a CMV enhancer. Therefore, for clinical application, the recombinant adenovirus vector of the present invention, which reduces inflammation when administered in vivo, is extremely effectively used.
  • the same viral promoter In addition to the promoter containing the CMV enhancer described above, the same viral promoter, the SV40 promoter, the Rous sarcoma virus (RSV) promoter (Takebe Y. et. Al., Mol. Cell Biol., Vol. 8) , 466-472. (1988)).
  • RSV Rous sarcoma virus
  • a gene encoding a protein such as a cytokinin, an enzyme, a receptor, a structural protein of a virus, a gene encoding an antisense RNA-ribozyme, or the like may be used. be able to.
  • the protein IX-deleted adenovirus vector of the present invention is derived from human fetal kidney Cell lines that express the El gene but do not express protein IX, such as 293 cells, can also grow.
  • a protein IX-deficient adenovirus vector produced in a cell line that does not express protein IX does not contain the desired amount of protein IX in the virus particles, and thus has the desired properties in the present invention.
  • No lus vector is available. Therefore, a special cell line that expresses at least the E1 gene and protein IX is required to produce the protein IX-deleted adenovirus vector of the present invention. That is, when the protein IX-deleted adenovirus vector of the present invention is propagated, mammalian cells having the following characteristics (12) and (13) are used.
  • a protein IX deletion type adenovirus vector can be propagated.
  • the method for preparing a cell line that expresses protein IX is as follows: cell lines that already express the E1 gene, such as human fetal kidney-derived 293 cells (ATCC CRL-1573), are expressed in an expression vector that contains the protein IX gene. Alternatively, cells that do not express the E1 gene may be transformed sequentially or simultaneously with an expression vector containing the E1 gene and the protein IX gene. However, even if cells are transformed with a DNA fragment containing all of the 1.3-11.2 mu E1A, E1B, and protein IX genes, a cell line expressing protein IX cannot be obtained. It is necessary to transform cells with a DNA fragment to which an appropriate promoter has been added.
  • the promoter used for the expression of the protein IX is not particularly limited, and may be an exogenous promoter or an original promoter of the protein IX gene.
  • the target cell line can be established and maintained, and as long as the protein IX-deficient adenovirus vector produced in the cell line forms a virus particle containing a normal amount of protein IX.
  • constitutive promoters include the CAG promoter, CMV promoter, EF-1 ⁇ promoter, SRa promoter, SV40 promoter, RSV promoter, adenovirus major late promoter (MLP), and the like.
  • inducible promoters include the metamouth thionein gene promoter and the mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter.
  • MMTV mouse mammary tumor virus
  • a system in which the expression of a constitutive promoter is induced by tetracitalin ecdysone may be used.
  • the above-described expression vector having a promoter and its expression induction system are either commercially available or can be obtained from public institutions. When commercially available, it can be purchased from, for example, Invitrogen, Clontech, or the like.
  • the coding region of the protein IX gene is cloned by PCR and inserted into a commercially available expression vector (for example, pcDNA3.1 (+), Invitrogen). It can be produced by, for example, introducing into human fetal kidney-derived 293 cells and expressing the same. For details, refer to the examples described below.
  • a cell line that further expresses the deleted gene is required.
  • cell lines expressing these three genes are used.
  • the E2A gene can be introduced and expressed in cells by the same method as the protein IX gene.
  • a method for producing a recombinant adenovirus vector using the above cell line is as follows. It is a method well known to those skilled in the art, for example, using the C0S-TPC method (Miyake S. et.Al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 93, 1320-1324. (1996)) and the like. be able to.
  • a typical form of the recombinant adenovirus vector of the present invention is the recombinant adenovirus vector having the above-mentioned features (1) to (4).
  • a preferred form is the protein IX rearranged adenovirus.
  • Vectors and Proteins The explanation has been made by taking an IX deletion type adenovirus vector as an example.
  • Other forms other than the above recombinant adenovirus vector include modifying the exogenous promoter itself to a form that does not induce adenovirus gene expression, or preventing the expression of adenovirus gene from being induced.
  • Recombinant adenovirus vectors using various foreign promoters That is, another form of the recombinant adenovirus vector of the present invention includes a recombinant adenovirus vector having the following features (14) and (15).
  • a foreign motor that does not induce adenovirus gene expression is inserted into the adenovirus genome.
  • the term “foreign promoter that does not induce the expression of the adenovirus gene” may be any promoter as long as it is at least a foreign promoter that does not induce the expression of the protein IX gene.
  • the protein IX gene does not need to be rearranged and deleted as described above, and it is sufficient that the protein IX gene is retained at its original position in the adenovirus genome.
  • recombinant adenovirus vectors into which foreign genes containing various foreign promoters were inserted were prepared, and for example, the in vivo administration described in Example 5 was performed.
  • the exogenous promoter does not contain at least CMV enhancer, and specific examples include EF-let promoter (Kim DW et. Al. Gene, Vol. 91, 217-223. (1990)). Can be Regarding the fact that the EF-1 promoter does not induce the expression of protein IX and does not induce inflammation, see Examples 8 and 9 described later. Furthermore, it is desirable that the expression unit including the foreign port motor that does not induce the expression of protein IX such as the EF- ⁇ promoter be inserted leftward (in the reverse direction of the transcription direction of the E1 gene). This is because, when the expression unit is inserted rightward, there is a concern that transcription from the foreign promoter will not be partially terminated at the regular site and will be transcribed to the protein IX gene.
  • recombinant adenovirus vector of the present invention includes a recombinant adenovirus vector having the following features (19) to (21).
  • a nucleotide sequence having a property of suppressing the induction of adenovirus gene expression by the foreign promoter is inserted between the foreign promoter and the adenovirus gene.
  • a nucleotide sequence having the property of suppressing the induction of adenovirus gene expression by a foreign promoter refers to a DNA sequence that has the effect of suppressing the activation of the adenovirus gene promoter by the enhancer present in the foreign promoter.
  • Examples include insulators such as "scs" and "da” that were initially discovered in Drosophila.
  • An insulator is a DNA sequence that, when located between an enhancer and a promoter, prevents the promoter from being activated by the enhancer (Chung JC et. Al., Pro Natl. Acad. Sci. USA , Vol. 94, 575-580. (1997) and Bell AC, et. Al., Curr.
  • the insulator include, in addition to the above “ ⁇ ?” And “ada”, a DNA fragment of about 1.2 kb at the 5'HS4 site of the 20] 3-globin locus (Chung JC et. al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, 575-580. (1997)) Yahi preparative T cell receptor alpha / [delta] locus over 7 (B eli A. C, et . al., Curr. Op in. Genet.
  • the insulator to be inserted into the adenovirus vector of the present invention is not particularly limited. If the foreign enhancer promoter is an insulator that does not induce adenovirus gene expression, its origin, the size of the DNA fragment used, etc. No restrictions.
  • an adenovirus vector containing an insulator an adenovirus vector containing the above-mentioned chicken-globin insulator and an inducible promoter (Steinwaerder DS et. Al., Bene Ther., Vol. 7, 556-567. 2000)), and an adenovirus vector (Vassux G. et. Al., Gene Ther., Vol.
  • the background of the invention of the recombinant adenovirus vector of the present invention will be described. That is, the background of the discovery that forms the basis of the present invention, that is, the discovery that the cause of inflammation in the first-generation adenovirus vector is due to the induction of adenovirus gene expression by a foreign promoter will be described.
  • the first generation adenovirus vector refers to a non-replicating adenovirus vector lacking the adenovirus E1 gene.
  • First generation adenovirus vectors can only propagate in cell lines expressing the E1 gene, such as 293 cells.
  • the deletion of the E3 gene in the first generation adenovirus vector is optional.
  • the present inventors In order to test the conventional hypothesis that the expression of the E2A gene, which is the early gene of the adenovirus, is triggered by the occurrence of the phenotype, the present inventors also prepared an adenovirus vector lacking the E2A gene.
  • the details of the method for preparing the E2A-deficient adenovirus vector of the present inventors are disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-308585. Therefore, in this specification, only the outline of the method for preparing is described below.
  • the ⁇ ⁇ sequence which is the recognition sequence for the P1 phage recombinase Cre, was located between the adenovirus 3 gene and the E2A gene (61.5 mu) and at the N3 site where the E3 gene was deleted (78.0 mu).
  • a first-generation adenovirus vector Fig. 1, Ax2LD3LCAHGH
  • This Ax2LD3LCAHGH and the first-generation adenovirus vector expressing recombinase Cre were co-infected into 293 cells, resulting in an E2A-deficient adenovirus vector in which the E2A gene and L4 gene sandwiched between two ⁇ sequences were deleted. (Fig. 1, ⁇ E2A-CAHGH).
  • each virus was separated according to the specific gravity of each virus particle by density gradient ultracentrifugation using cesium chloride, and the E2A-deficient adenovirus vector was purified with a purity of 97 to 98%.
  • the expression unit was inserted into this E2A-deficient adenovirus vector ⁇ 2 ⁇ -CAHGH so that human growth hormone (hGH) was expressed as a reporter gene under the control of the CAG promoter described above.
  • hGH human growth hormone
  • a control vector for the E2A-deficient adenovirus vector a first-generation adenovirus vector having the same expression unit (Fig. 1, AxlCAHGH) was also prepared.
  • the E2A gene was certainly deleted in the E2A-deficient adenovirus vector thus prepared. That is, the expression level of the protein DBP (single stranded DNA binding protein) encoded by the E2A gene in A549 cells (human lung cancer-derived cell line) infected with ⁇ E2A-CAHGH or AxlCAHGH was compared by the fluorescent antibody method. In AE2A-CAHGH-infected cells, DBP expression was clearly reduced, confirming the deletion of the E2A gene.
  • DBP single stranded DNA binding protein
  • the E2A-deficient adenovirus vector was evaluated using the blood GPT value as an index.
  • the blood GPT value was increased in the AE2A-CAHGH-administered mouse as well as in the AxlCAHGH-administered mouse.
  • Inflammation images such as infiltration of leukocytes including T cells in the liver and apoptosis of hepatocytes were observed in mice treated with AxlCAHGH 5 days after administration, but similar inflammation images were observed in mice treated with ⁇ ⁇ 2 ⁇ -CAHGH Was observed. That is, there was no difference in histopathology between the mice treated with both adenovirus vectors.
  • Adenovirus genes other than the E2A gene, such as the E4 gene, are directly activated by cell-derived factors, and the expressed adenovirus protein itself induces cellular immunity or induces the expression of another adenovirus protein. However, the adenovirus protein induces cellular immunity and inflammation occurs.
  • the hGH protein used as a reporter gene induces cell-mediated immunity, causing inflammation.
  • the foreign promoter ( CAG promoter) inserted into the vector is adenowill It acts on the promoter to act as an enhancer, adenovirus protein is expressed, and the adenovirus protein induces cellular immunity, resulting in inflammation.
  • ⁇ ⁇ Not the protein synthesized de novo in the cells infected by the vector, but the protein itself that constitutes the adenovirus particles that have entered the cells by infection induces cellular immunity and inflammation occurs. Alternatively, the invasion of the adenovirus particles into the cells itself is a stimulus, and inflammation occurs, for example, by inducing the production of inflammatory cytokines.
  • UV-inactivated adenovirus particles are cells that retain their infectivity and can enter cells, but cannot grow in cells that allow the growth of adenovirus before inactivation. Adenovirus particles that have been inactivated so that expression of the foreign gene does not occur.
  • AxCAwt-administered mice had about the same degree of inflammation as AxlCAHGH-administered mice, and Axlwl-administered mice had no inflammation.Therefore, the only structural difference between AxCAwt and Axlwl was the presence or absence of the CAG promoter. The cause of inflammation in the first generation adenovirus vector was found to be due to the CAG promoter inserted in the vector (3).
  • E2A-deficient adenovirus vector ⁇ 2 ⁇ -CAHGH
  • AxlCAHGH, AxCAwt, Axlwl three types of first-generation adenovirus vectors described in (a) to (c) above were transferred to A549 cells (human lung cancer-derived cell line).
  • A549 cells human lung cancer-derived cell line
  • HepG2 cells human liver cancer-derived cell line
  • the adenovirus gene expressed 24 hours later was analyzed by Northern blot.
  • the following eight adenovirus genes were examined for expression.
  • CAG promoter early gene: E2A, E4, major late promoter (MLP) control of the major late genes: Ll, L2, L3, L5, delayed-early (delayed early) gene
  • MLP major late promoter
  • AxCAwt is a gene that is expressed to the same extent as infected cells, but hardly expressed in first-generation adenovirus vector (Axlwl) infected cells without the CAG promoter.
  • the IVa2 gene was expressed to the same extent in all four adenovirus vector-infected cells, and no induction of expression by the CAG promoter was observed.
  • the expression of the IVa2 gene was reduced only in Axlwl-infected cells, and induction of expression by the CAG promoter was observed.
  • protein IX gene expression was the same in both cell lines, with ⁇ 2 ⁇ -CAHGH, AxlCAHGH, and AxCAwt-infected cells expressing protein IX gene at about the same level, but almost no Axlwl-infected cells. . That is, the induction of expression of the protein IX gene by the CAG promoter was clearly observed. From the above results, it was shown that the adenovirus gene clearly induced to be expressed by the CAG promoter is mainly the protein IX gene. Therefore, that the expression of the protein IX gene is causing inflammation when the first generation adenoviral vector was administered in v i V0 it was strongly suggested.
  • the above results also revealed that the expression of protein IVa2 gene and L1 gene is induced by the CAG promoter in some types of cells. Since the protein IVa2 gene has an independent promoter, it can be easily inferred that it is directly activated by the CAG promoter. However, since the L1 gene is one of the major late genes and is controlled by MLP, which is a common promoter with other late genes such as the L3 and L5 genes, only the L1 gene is induced by the CAG promoter. It is hard to guess. However, the L2 to L5 genes are expressed only late in infection. Since the L1 gene is known to be expressed early in infection (Shaw AR et. Al., Cell, Vol. 22, 905-916.
  • the reason that only the LI gene is induced to be expressed by the CAG promoter may be based on the difference in the gene expression mechanism between the early and late stages. Furthermore, it has been reported that both protein ⁇ IX and protein IVa2 have an activity to activate MLP (Lutz P. et. Al., J. Virol., Vol. 71, 5102-5109. (1997) , Tribouley C. et. Al., J. Virol., Vol. 68, 4450-4457. (1994)), the CAG promoter does not activate MLP directly but indirectly via protein IX or protein IVa2. There is a possibility that MLP is activated.
  • CAG promoter The induction of expression of these protein IVa2 gene and L1 gene by CAG promoter is weaker than that of protein IX gene, but induces inflammation by acting in addition to protein IX. It is considered possible.
  • the CAG promoter is composed of the IE enhancer of CMV, the chicken J3-actin promoter, the heron] 3-globin splice acceptor and the polyA sequence.
  • the CAG promoter was inserted into the deletion site (1.3-9.2 mu) of the E1 gene in the left direction (in the opposite direction to the transcription direction of E1) and transcribed in the right direction.
  • the insertion direction of the promoter is opposite to that of the protein IX gene (9.7-11.2 mu) to be inserted. Therefore, it was considered that the inducer of the protein IX gene is not the [3-actin promoter] but a CMV IE enhancer. Therefore, the CAG promoter is used as an adenovirus vector (AdCMVlacZ) into which the CMV promoter that is common to only the IE enhancer of CMV is inserted. The expression of the protein IX gene was examined.
  • the first-generation adenovirus vector causes inflammation due to the induction of adenovirus gene expression by CMV enhancer.
  • a new mechanism has been discovered by the inventors.
  • Promoters containing CMV enhancers are used in many adenovirus vectors currently undergoing clinical trials due to their high promoter activity.
  • An example of a vector using the CMV promoter itself is an adenovirus vector expressing the tumor suppressor gene ⁇ 53 (Clayman GL et.al., J. Clin.Oncol., Vol. 16, 2221-2232. 1998), and Swisher SG et. Al., J. Natl. Cancer Inst., Vol. 91, 763-771. (1999)), an interleukin-2 expressing adenovirus vector (Stewart AK et. Al., Gene Ther , Vol. 6, 350-363.
  • vascular endothelial growth factor VEGF121-expressing adenowinores vector Rosengart TK et. Al., Circulation, Vol. 100, 468-474. (1999)
  • vascular endothelial growth factor VEGF121-expressing adenowinores vector Rosengart TK et. Al., Circulation, Vol. 100, 468-474. (1999)
  • an adenovirus vector using a hybrid promoter containing the CMV IE enhancer an adenovirus vector expressing the cystic fibrosis transmembrane regulatory protein (CFTR) (Knowles MR et. Al., ⁇ . Engl. J. Med., Vol. 333, 823-831. (1995), and Zuckerman JB et. Al., Hum. Gene Ther., Vol. 10, 2973-2985. 1999))).
  • CFTR cystic fibrosis transmembrane regulatory protein
  • the inventors' discovery that the exogenous promoter induces the expression of adenovirus genes and causes inflammation is not simply a phenomenon limited to recombinant adenovirus vectors having a CAG promoter, but is actually used in clinical trials. This is a universal phenomenon that applies to many of the adenovirus vectors used. Therefore, based on such findings, the adenovirus vector improved so that the expression of the adenovirus gene is not induced by the foreign promoter can be expected to reduce inflammation upon administration and maintain the expression of the therapeutic gene. However, its practical value is very high.
  • a foreign promoter drives the expression of an adenovirus gene may apply not only to CMV IE enhancers but also to adenovirus vectors having other viral promoters.
  • examples of such a promoter include the RSV promoter, a promoter containing the SV40 early gene enhancer, or the SRa promoter.
  • the range of the protein IX gene to be amplified includes not only the coding region of protein IX but also the 5 'and 3' untranslated regions of the protein IX gene.
  • 5 'untranslated region is protein It is desirable to include the promoter region of the quality IX gene, for example, it is desirable to include at least the sequence from position 3525 onwards of the nucleotide sequence of adenovirus type 5, and it is more desirable to include the sequence from position 3213 onward. ,.
  • the range of the 3 'untranslated region is not particularly limited as long as it includes the nucleotide sequence up to the stop codon of the protein IX gene, and even if the polyA sequence of another gene is added immediately after the stop codon.
  • the original poly A sequence of the protein IX gene may be used.
  • the base sequence of the PCR primer is not particularly limited as long as it can amplify the protein IX gene in the above-mentioned range, but it facilitates cloning of the DNA fragment containing the amplified protein IX gene into plasmid. It is desirable to include an appropriate restriction enzyme recognition sequence.
  • the DNA fragment containing the protein IX gene amplified by PCR may be directly inserted into the desired position of the adenovirus genome.However, in order to confirm that no nucleotide sequence mutation has occurred during the PCR reaction, Should be cloned into an appropriate plasmid or the like, and its nucleotide sequence should be confirmed before use.
  • the plasmid used for cloning the amplified fragment there is no particular limitation on the plasmid used for cloning the amplified fragment, and examples include plasmid pUC19.
  • the site where the protein IX gene is rearranged includes a site between the L3 gene and the E2A gene, a site where the E3 gene is deleted, and a more preferable example.
  • the method of relocation to the ITR is described in detail below.
  • the protein IX gene was deleted from its original position (9.7 to 11.2 mu), and the upstream region of the E4 gene was deleted.
  • the method for preparing a recombinant adenovirus vector shown below is based on the cosmid vector containing most of the adenovirus genome and the DNA obtained by digesting the terminal protein-adenovirus DNA complex (DNA-TPC) with restriction enzymes. 293 cells and other cells, and obtain the desired recombinant adenovirus by homologous recombination between the cosmid vector and the adenovirus DNA-TPC. (Miyake S. et. Al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, 1320-1324. (1996)) and patents (JP-A-7-298877).
  • DNA-TPC terminal protein-adenovirus DNA complex
  • the cosmid vector pAx4w contains 2.6-98.0 m.u of the adenovirus type 5 genome (E3 gene deleted) and 98.0-100 mu of the adenovirus type 2 genome, and has a promoter of the E4 gene.
  • a vector having a restriction enzyme Swal site, which is a cloning site, between the upstream region of E. coli and the 3 side ITR (99.3 mu) (Miyake S. et. AL, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 93, 1320-1324. (1996), pAx4w is referred to as pAdex4w in the literature).
  • the Swal site of the PAx4w insert the protein IX gene prepared by PCR method or the like described above, to obtain the old ink stick de vector ⁇ ⁇ 4 ⁇ .
  • the recombinant adenovirus vector Adex4SRLacZL is derived from adenovirus type 5 (deleting the E1A, E1B, and E3 genes) and has the E. coli lacZ gene expression unit inserted at the same 99.3 mu position as pAx4w. It is a non-propagating adenovirus vector.
  • Adenovirus genomic DNA prepared from this Adex4SRLacZL was transformed with cosmid vector pAx4pIX by transforming 293 cells with DNA-TPC digested with restriction enzymes Asel and EcoRI, which have multiple recognition sites in the right half of the genome.
  • a recombinant adenovirus Ax4pIX in which the expression unit of Escherichia coli lacZ gene of Adex4SRLacZL is replaced with protein IX gene can be obtained.
  • Ax4pIX is a recombinant adenovirus having the protein IX gene at the original position of the protein IX gene and at two places between the upstream region of the E4 gene and the 3 'ITR.
  • the range of the base sequence to be deleted at the original position of the protein IX gene is described. Will be described. Protein IX gene is transcribed to the right, but its 3 'untranslated region is partially transcribed to the left. The protein IX gene is deleted because it partially overlaps the 3' untranslated region of the IVa2 and E2B genes. The range must not affect the function of the IVa2 and E2B genes. Since the site of addition of polyA in the IVa2 gene and the E2B gene is the 4060th base in the case of adenovirus type 5, the deletion range must be to the left of this. As long as this condition is satisfied and protein IX is not expressed, there is no particular limitation on the range of the deletion.
  • a vector containing the adenovirus genome lacking the range can be easily constructed from the cosmid vector pAxcw (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-308585, p. 15, pAdexlcw is the same as pAxcw).
  • pAxcw is a cosmid vector containing most of the E1 gene-deleted ( ⁇ 454-3328) adenovirus type 5 genome.With pAxcw as the primary material, pAxcw cuts off the PvuII site to the AlwNI site by several steps.
  • the cosmid vector pAxApIXcw containing the lost adenovirus genome can be obtained.
  • pAxApIXcw is a vector in which the E1A, E1B and protein IX genes have been deleted ( ⁇ 454-4053), and a cloning site (Clal and Swal site) of a foreign gene has been inserted into the deletion site.
  • Genomic DNA prepared from the recombinant adenovirus Ax4pIX described above was digested with a restriction enzyme EcoT22I having multiple recognition sites on the left side of the genome, and DNA-TPC was digested with the cosmid vector pAx ApIXcw described above to transform 293 cells. By the conversion, a recombinant adenovirus vector AxRpIXcw in which the desired protein K gene has been rearranged can be obtained.
  • AxRpIXcw does not contain a foreign gene such as a promoter.
  • AxRpIXcw genomic DNA is EcoT22I-digested DNA-TPC and cosmid vector pAx ApIXcw has a foreign gene inserted into the Swal site or Clal site.
  • a protein IX rearranged adenovirus vector into which an arbitrary foreign gene has been inserted can be easily obtained.
  • any foreign gene can be inserted by homologous recombination between DNA-TPC obtained by digesting Ax4pIX genomic DNA with EcoT22I and a cosmid vector in which a foreign gene has been inserted into the Swal site or Clal site of cosmid vector pAx ApIXcw. Protein IX rearranged adeno A viral vector can be obtained.
  • the method for preparing the protein IX rearranged adenovirus vector has been described above using adenovirus type 5 as an example.However, the protein IX gene to be rearranged does not necessarily need to use a gene derived from the same serotype adenovirus.
  • the protein IX genes of other serotypes may be used as long as the protein IX functions sufficiently in the above. Examples include vectors in which the type 2 protein IX gene is rearranged in the basic skeleton of adenovirus type 5, and conversely, vectors in which the type 5 protein IX gene is rearranged in the basic skeleton of adenovirus type 2. You.
  • the range of the protein IX gene to be introduced into cells is not particularly limited as long as it includes the coding region of protein IX.
  • a DNA fragment containing the coding region of protein IX can be excised from plasmid containing the gene by restriction enzyme digestion, or prepared by PCR.
  • the promoter for expressing the protein IX is not particularly limited, and a promoter that functions constitutively in animal cells or an inducible promoter may be used. Alternatively, the original promoter of the protein IX gene may be used.
  • a cell line that expresses protein IX can be obtained by transforming any cell with a plasmid or the like containing an expression unit of protein IX gene, and the cell used for producing the cell line is an adenovirus E1 gene. It is desirable that the cell be one that expresses Escherichia coli and that can efficiently produce a first-generation adenovirus vector lacking the E1 gene. Examples of such cells include 293 cells. Furthermore, in order to prevent the emergence of replication competent adenovirus (RCA), which has the ability to proliferate by homologous recombination between the vector genome and the cell genome, a cell line in which only the minimum necessary region of the E1 gene has been introduced.
  • RCA replication competent adenovirus
  • a desired cell line can also be obtained by first preparing a protein IX-expressing cell line from cells that do not express the E1 gene, and then transforming the cell line with the E1 gene. cell There is no particular limitation on the method of transformation and the method of selecting the target cell line, as long as the cell line can supply a sufficient amount of protein IX to the protein IX-deficient adenovirus vector.
  • the range in which the protein IX gene is deleted does not affect the functions of the IVa2 gene and E2B gene, and it is sufficient if the protein IX is not expressed.
  • the cosmid vector pAxApIXcw described above is a vector corresponding to the deletion of the adenovirus genome in the range.
  • This pAxA pIXcw is transformed with the first-generation adenovirus vector, for example, DNA-TPC obtained by digesting AxCAwt or Axlwl genomic DNA with a restriction enzyme such as EcoT22I, to transform the aforementioned protein IX-expressing cell line.
  • the desired protein IX deletion type adenovirus vector can be obtained.
  • the protein IX-deficient adenovirus vector thus prepared ⁇ pIXcw does not contain a foreign gene such as a motor.
  • a cosmid vector in which a foreign gene is inserted into the Swal site or Clal site of the cosmid vector pAx A pIXcw, and the genomic DNA of Ax A pIXcw such as EcoT22I By homologous recombination with DNA-TPC digested with the above restriction enzymes, a protein IX-deleted adenovirus vector into which a desired foreign gene has been inserted can be easily obtained.
  • any first-generation adenovirus vector for example, DNA-TPC obtained by digesting AxCAwt or Axlwl genomic DNA with EcoT22I, and a cosmid vector in which a foreign gene is inserted into the Swal site or Clal site of cosmid vector pAx ⁇ pIXcw
  • a protein IX-deleted adenovirus vector into which an arbitrary foreign gene has been inserted can be obtained.
  • the method for producing the protein IX rearranged adenovirus vector and the protein IX deletion adenovirus vector has mainly been described by taking adenovirus type 5 as an example, but the present invention is not limited to adenovirus type 5, The present invention can be applied to any adenovirus vector having an adenovirus of other serotypes such as adenovirus type 2 as a basic skeleton.
  • a pharmaceutical composition comprising the recombinant adenovirus vector of the present invention as an active ingredient, and a gene therapy method with reduced inflammation will be described.
  • the recombinant adenovirus vector of the present invention obtained as described above is a highly safe vector with reduced inflammation when administered to humans, and is used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for various diseases. Can be used for gene therapy.
  • any of the iv vivo method and the ex vivo method can be appropriately selected and applied depending on the disease to be treated, the target organ, and the like.
  • the in vivo method is a method in which a pharmaceutical composition for gene therapy is directly introduced into a patient's body
  • the ex vivo method is a method in which certain cells are removed from a patient and the above-mentioned method is performed outside the body. In this method, a pharmaceutical composition is introduced into the cells, and then the cells are returned to the body.
  • the administration route of the in vivo method is not particularly limited.
  • the form of the preparation when administered by the in vivo method there is no limitation on the form of the preparation when administered by the in vivo method.
  • the injection when used as an injection, can be prepared by a conventional method. That is, for example, the recombinant adenovirus vector of the present invention is aseptically dissolved in an appropriate solvent (buffer such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc.) and then filled into a sterile container. Can be manufactured. If necessary, a conventional carrier may be added to the preparation.
  • an appropriate solvent buffer such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc.
  • a conventional carrier may be added to the preparation.
  • cells to be used are not limited, and cells suitable for the purpose such as leukocytes such as lymphocytes and various cancer cells derived from patients can be used.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention to a patient can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age and weight of the patient, and the like.
  • the recombinant adenovirus vector of the present invention 6 to ⁇ ) 1 (PFU), preferably about 8 to ⁇ 12 (PFU) is administered once, or continuously for several days, or about once a month. Is preferred.
  • adenovirus vectors currently undergoing clinical trials include the tumor suppressor gene p53 expression vector, interleukin 2 expression vector, vascular endothelial growth factor VEGF121 expression vector, and cystic fibrosis transmembrane regulatory protein ( (CFTR) expression vectors and the like are known. These vectors can be used in place of the conventional adenovirus vector as a vector in which inflammation caused by using the conventional adenovirus vector is reduced.
  • CFTR cystic fibrosis transmembrane regulatory protein
  • the recombinant adenovirus vector of the present invention can be used not only as a pharmaceutical for human gene therapy, but also as a vector for introducing a gene into an animal individual.
  • the method can be performed according to the above-described methods for gene therapy for humans such as the in vivo method and the ex vivo method.
  • adenovirus vector of the present invention which is a vector in which inflammation is reduced
  • the characteristics of the adenovirus vector of the present invention can be used for various purposes such as production of disease model animals, treatment models for human diseases, and functional analysis of arbitrary genes, even when used in animals. In this case, there is no need to consider the side reaction derived from the vector such as inflammation, and there is a great advantage that conventional adenovirus vectors do not have.
  • the cosmid vector pAxCAwt (Kanegae Y. et.al., Nucleic acid Res., Vol. 23, 3816-3821 (1995)) and pAxcw (JP-A-8-308585, page 15, used in this example)
  • pAdexlcw is identical to pAxcw
  • pAxCAwt has a CAG promoter (Niwa H. et. Al., Gene, Vol. 108, 193-200 (1991) and Japanese Patent No. 2824434) introduced into the E1 gene deletion site, and a promoter.
  • pAxcw is the E1 gene Only Clal and Swal sites are inserted at the offspring deletion site.
  • Phage DNA was prepared from a human pituitary adenoma-derived cDNA library (CL0NTECH) and used as template DNA for PCR.
  • the PCR primers were designed to add restriction enzyme recognition sites to both ends, the 5 'primer contained an initiation codon and a Nhel recognition site, and the 3' primer contained a stop codon and a Sphl recognition site. The sequence of each primer is shown below.
  • PCR was carried out using polymerase pfu (Takara Shuzo) according to a conventional method to obtain an amplified fragment of about 700 bp containing the hGH cDNA.
  • the amplified fragment was blunted with Klenow enzyme and inserted into the Hindi site of plasmid pUC19 to obtain plasmid pUCHGH (3.4 kb).
  • the nucleotide sequence of the hGH cDNA portion of pUCHGH was decoded, and it was confirmed that the sequence was identical to the sequence described in the literature (Chen EY et. al. Genomics Vol. 4, 479-497. (1989)).
  • pUCHGH was digested with Nhel and Bgll, and the ends were blunted to obtain a DNA fragment of about 0.7 kb containing the coding region of hGH cDNA. This DNA fragment was inserted into the Swal site between the promoter and the polyA sequence of the cosmid vector pAxCAwt to obtain the cosmid pAxlCAHGH.
  • a plasmid containing the hGH expression unit was constructed from pAxlCAHGH, and the hGH protein was transiently transfected into C0S7 cells (monkey kidney-derived cell line).
  • C0S7 cells monkey kidney-derived cell line
  • C0S7 cells were transformed with PxlCAHGH by the DEAE-dextran method, and the hGH concentration in the culture supernatant after 2 days was measured by ELISA (Picoia TM HGH plate: Sumitomo Pharma).
  • the hGH concentration in the culture supernatant of C0S7 cells into which plasmid was not introduced was below the detection limit, but the culture supernatant of C0S7 cells transformed with Px1 CAHGH contained more than 1 ng / ml hGH. was detected. From these results, it was confirmed that the expression unit of hGH was correctly incorporated in the cosmid pAxlCAHGH.
  • the cosmid vector pAx2LD3LCAwt (pAdex2LD3LCAwt on page 19 of JP-A-8-308585, is the same as pAx2LD3LCAwt) is a derivative of the aforementioned cosmid vector pAxCAwt.
  • pAx2LD3LCAwt is a cosmid in which the ⁇ sequence is inserted between the adenovirus 3 gene of pAxCAwt and the E2A gene (61.5 map units), and the deletion site of the E3 gene (78.0 map units), respectively.
  • the base sequence other than the ⁇ ⁇ ⁇ insertion part is the same as pAxCAwt.
  • the adenovirus vector Adex2LD3LCANLacZ (FIG. 1, page 21 of JP-A-8-308585) is a recombinant adenovirus in which two loxP sequences are inserted at the same position as the cosmid vector pAx2LD3LCAwt and expresses Escherichia coli J3-galactosidase. .
  • adenovirus DNA-terminal protein complex was prepared from Adex2LD3LCANLacZ and then digested with EcoT22I. 293 cells were transformed with this DNA-terminal protein complex and the cosmid pAx2LD3LCAHGH to obtain a recombinant adenovirus Ax2LD3 having an hGH expression unit and two loxP sequences to obtain CAHGH (FIG. 1).
  • This Ax2LD3LCAHGH has the same structure as the adenovirus vector AxlCAHGH prepared in Example 1 except for the loxP insertion site, and has the same structure as the adenovirus vector Adex2LD3LCANLacZ except for the expression unit.
  • E2A-deficient adenovirus vector a recombinant adenovirus in which the E2A gene and the L4 gene sandwiched between two 1oxP sequences were deleted from the adenovirus vector Ax2LD3LCAHGH by the action of recombinase Cre. I got it.
  • the adenovirus vector Ax2LD3LCAHGH and the recombinase Cre-expressing Adenouenores vector AxCANCre were subjected to ultracentrifugation.
  • the virus was purified as described above, and the titer of each virus was measured by the limiting dilution method using 293 cells (see above).
  • the cell suspension containing the culture supernatant was placed in a 50-ml centrifuge tube, and centrifuged at 2500 rpm (1130 xg) at 4 ° C for 5 minutes. The supernatant was discarded and the cell fraction was frozen and stored at -80 ° C. .
  • the desired hGH-expressing E2A-deficient adenovirus vector ( ⁇ 2 ⁇ -CAHGH: 28.Ikb) is produced, but at the same time, Ax2LD3LCAHGH (34.4 kb) and AxCANCre (34.7 kb) is also present, and these three types of adenovirus are mixed (the genome size in parentheses is the size of each virus). Therefore, to isolate ⁇ ⁇ ⁇ 2 ⁇ -CAHGH based on the difference in the specific gravity of the virus, the E2A-deficient adenovirus was purified by the following cesium chloride (CsCl) density gradient ultracentrifugation method. All CsCl solutions used for purification were prepared in 50 mM H-labeled es buffer (pH 7.4), and all centrifugation and ultracentrifugation were performed at 4 ° C.
  • CsCl cesium chloride
  • Ax2LD3LCAHGH (34.4 kb) and AxCANCre (34.7 kb) have almost the same genome size, so the virus specific gravity is almost the same, and the virus band after ultracentrifugation overlapped, but ⁇ 2 ⁇ -CAHGH (28.lkb) Because of the lower specific gravity of both viruses, ultracentrifugation produced a band at the top of the tube. A hole was made in the side of the ultracentrifuge tube with a syringe needle, and the AE2A-CAHGH band was collected.
  • the virus was dialyzed once against PBS (-) containing 10% glycerol to obtain a final purified product of ⁇ 2 ⁇ -CAHGH.
  • the dialyzed virus was stored frozen at -80 ° C after dispensing.
  • the titer cannot be measured by a normal method using growth in 293 cells as an index, such as the first-generation adenovirus vector (deleting the E1 gene). Therefore, the relative strength of A E2A_CAHGH is determined by comparing the amount of hGH produced by the hGH-expressing first-generation adenovirus vector AxlCAHGH with a known titer and ⁇ E2A-CAHGH using the amount of reporter gene hGH produced as an index. The titer (infectious titer) was determined.
  • test adenovirus vector was serially diluted with 2% FCS-containing DMEM medium, and 50 ⁇ l of the diluted adenovirus was cultured in a 96-well microplate. ⁇ 549 cells (human lung cancer-derived cell line) Infected. Next, the virus solution was removed, and the cells were washed once with the medium, added with 100% DMEM medium containing 2% FCS, and cultured for 2 days. After culturing, determine the amount of hGH in the supernatant.
  • the titer is known AxlCAHGH (Lot. B, titer 3 ⁇ 0 ⁇ 10 1 0 PFU / ml) as a control ⁇ -virus, it was measured infectious titer of AE2A-CAHGH (Lot. 3) .
  • the dilution ratio of each virus at the time of infection was 30,000, 90,000, 270,000-fold, and the hGH production two days later was compared.
  • the E2A-deficient adenovirus vector is purified by ultracentrifugation, but is slightly contaminated with first-generation adenovirus vectors (Ax2LD3LCAHGH and AxCANCre) that could not be removed during purification. Since these contaminated first-generation adenovirus vectors can grow in 293 cells, the titer measured by the normal method (limited dilution method) using 293 cells is the same as that of the contaminated first-generation adenovirus. Reflects the amount of vector. Thus, in order to determine the purity of ⁇ 2 ⁇ -CAHGH (Lot. 3), the titer was measured by the limiting dilution method using 293 cells.
  • ⁇ ⁇ 2 ⁇ - CAHGH titer of (Lot. 3) is 7. 8 x 10 8 PFU / ml
  • at AxlCAHGH titer of (Lot. B) is 4. 4 x 10 1 0 PFU / ml, the ratio is 1. 8%.
  • A549 cells (approximately 1.5 x 10 5 cells) confluent with collagen-coated 8-well culture slides (BECKTON DIKINS0N, # 40630) contain 5% FCS to give moi 100 or moi 10
  • Virus solution 100 containing AE2A_CAHGH or AxlCAHGH diluted in DMEM medium was added, and the cells were infected at 37 ° C for 1 hour. After infection, the virus solution was removed, and 0.3 ml of DMEM medium containing 5% FCS was added, followed by culturing for 2 days.
  • hGH-expressing E2A-deficient adenovirus vector ( ⁇ (2 ⁇ -CAHGH) or hGH-expressing first-generation adenovirus vector (AxlCAHGH) was administered to mice, and blood GPT (glutamate-pyruvate-transaminase) levels were measured.
  • the inflammation-inducing effects of both adenovirus vectors were compared with each other as an index. The method and results are shown below.
  • mice C57BL / 6 mice (7 weeks old, female) were used as mice.
  • adenovirus vector AE2A-CAHGH (Lot. 3) or AxlCAHGH (Lot. C) was used.
  • the dose of adenovirus vector was 1 ⁇ 10 J PFU, 3 ⁇ 10 8 PFU or 1 ⁇ 10 8 PFU (5 mice per group).
  • 0.2 ml of adenovirus vector diluted with saline was added to each mouse. Administration was via the tail vein. 3 days before administration of the adenovirus vector and 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, and 63 days after administration: Heparin treatment under ether anesthesia From the orbital vein using a matcrit tube Partial blood was collected.
  • the mean serum GPT measured daily is shown in FIG.
  • the hGH concentration of the serum was also measured 3 days and 5 days after the administration of the adenovirus vector.
  • the serum GPT value was measured.
  • the serum GPT level increased according to the dose of the adenovirus vector, and there was no difference from the mice administered the first-generation adenovirus vector AxlCAHGH. From this result, adenovirus
  • UV-inactivated adenovirus particles were prepared by the following procedure.
  • Example 2 hGH-expressing adenovirus vector purified by the method described in (2)
  • AxlCAHGH (3. 0 x 10 1 0 PFU / ml, 1. 4 x 10 1 "particles / ml) in 1. 8 ml, was added 33 mg / ml concentration of 8- methoxypsoralen (8-MOP) 18 ⁇ ⁇ (The final concentration of 8-MOP was 330 ⁇ g / ml), and 0.6 ml of each was dispensed into three 35-cm diameter tissue culture dishes (Sumitomo Bakelite, model number MS-10350).
  • UV irradiation was performed for 1 hour (UV intensity about 1.8 mW) while changing the position of the petri dish every 10 minutes.
  • the virus solution was collected from the petri dish to remove 8-M0P.
  • Dialysis was performed with PBS (-) containing 10% glycerol Finally, about 1.7 ml of virus solution with a particle concentration of 1.1 x 10 1 particles / ml was collected and frozen at -80 ° C. saved.
  • the inactivation of the adenovirus vector by the above treatment was confirmed by two methods: hGH production and titer measurement.
  • the amount of hGH production was measured by the method described in Example 2- (4). However, the difference was that the hGH concentration one day after infection with the adenovirus vector was measured.
  • hGH production amount when the adenoviral vector AxlCAHGH before UV inactivation treatment were infected with 1 X 10 "particles / ml is infected with about 0.
  • the adenovirus vector subjected to the above-mentioned inactivation treatment produced 0.4 ng / ral hGH even when infected with 1 ⁇ 10 10 particles / ml. Therefore, when calculated from the amount of hGH production, it was confirmed that the infectivity of the adenovirus vector was reduced to 1/10 "by the inactivation treatment. In addition, the titer was measured in the usual manner using 293 cells.
  • the virus titer before the inactivation treatment was about 3 ⁇ 10 1 O pFU / ml, but the titer after the inactivation treatment was less than 2 ⁇ 10 3 PFU / ml, and the virus titer was 10 7 minutes. It had dropped to 1 or less.
  • Example 3 administration of the E2A-deficient adenovirus vector to mice did not result in a decrease in serum GPT levels compared to administration of the first-generation adenovirus vector (AxlCAHGH). showed that. There are four possible interpretations of the results. 1 E2A gene expression is not involved in inflammation.
  • the hGH protein used as the reporter becomes an antigen of cell-mediated immunity and inflammation occurs.
  • adenoviruses of various structures were administered to mice, and the cause of inflammation when the first-generation adenovirus vector was administered was examined using serum GPT as an indicator of inflammation.
  • the adenovirus vector used, the experimental method and the results are shown below.
  • the adenovirus vectors used are shown below. All are first generation adenovirus vectors.
  • Adenovirus vector without foreign gene inserted such as promoter (only the restriction enzyme Swal site is inserted): Axlwl (Fig. 1, Miyake S. et. Al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93) , 1320-1324. (1996), which is referred to as Adexlw in this document)
  • the vector dose was 1 ⁇ 10 9 PFU, 3 ⁇ 10 8 PFU, 1 ⁇ 10 8 PFU or 3 ⁇ 10 7 PFU (5 animals per group).
  • the dose of UV-inactivated particles was not determined in terms of PFU, so that the dose was adjusted to be the same as AxlCAHGH in terms of the number of particles.
  • Blood collection was performed 3 days before vector administration, 3, 5, 7, 10 (or 11), 14, 21, and 28 days after administration.
  • the experiment was performed in two parts. The first time, AxlCAHGH and AxCAwt were compared ( Figure 3, top). For the second time, AxlCAHGH, Axlwl and UV-inactivated particles were compared ( Figure 3, bottom). In both experiments, a group to which only the physiological saline used for dilution of the vector was administered was set as a negative control. In FIG. 3, the data of the physiological saline administration group show only the results of the first experiment, but the results of the second experiment were similar.
  • AxCAwt and Axlwl are only the presence or absence of the CAG promoter and polyA sequence, indicating that the cause of the increase in serum GPT level, ie, the cause of inflammation, is mainly due to the CAG promoter.
  • adenovirus vectors used in cell lines (A549 Cells or HepG2 cells) and expressed adenovirus genes were analyzed by Northern blot.
  • the adenovirus vectors used in the study were the first-generation adenovirus vector having a CAG promoter (AxlCAHGH, AxCAwt), the first-generation vector without an exogenous promoter (Axlwl) and CAG This is an E2A-deficient adenovirus vector having a promoter (A E2A-CAHGH).
  • the target adenovirus gene that is, the gene whose expression is induced by the CAG promoter, is an adenovirus that is expressed to the same extent in three types of vector-infected cells, AxlCAHGH, AxCAwt, and ⁇ 2 ⁇ -CAHGH, but hardly expressed in Axlwl-infected cells. Is a gene. The method and the results are shown below.
  • A549 cells human lung cancer-derived cell line
  • HepG2 cells human liver cancer-derived cell line
  • FCS-containing DMEM 5% FCS-containing DMEM.
  • 0.3 ml of each adenovirus vector diluted with the medium was added, and the cells were infected for 1 hour (moi 100). After infection, the virus solution was removed, and 5 ml of DMEM medium containing 5% FCS was added and cultured for 24 hours. Twenty-four hours later, the medium was removed and the cells were washed twice with PBS (-), and RNA was prepared from each virus-infected cell using IS0GEN (Futtsu Gene) according to the instruction manual.
  • IS0GEN Fluttsu Gene
  • Probe used for Northern blot a DNA amplified by PCR old ink stick de vector pAxcw the (supra) as a template, using a BcaBEST TM Label ing Kit (Takara Shuzo) - and [ ⁇ 3 2 P] dCTP-labeled.
  • the sequences of the primers used for PCR are shown below.
  • L1 5 'primer 5'-ACTGCGGCTAATGGTGACTGAGACA-3' (12, 818-12, 842 / sequence 3) 3 'primer 5'-CGGCCGCGCGATGCAAGTAGTCCAT-3' (13, 440-13, 416 / sequence 4)
  • L2 5 ' Primer 5 '-AGCGGCGCGGAAGAGAACTCCAACG-3' (15, 098-15, 122 / sequence 5) 3 'primer 5' -ATGCCCAGGGCCTTGTAAACGTAGG-3 '(15, 834-15, 810 / sequence 6)
  • L3 5' primer 5 '- GGGCTCCAGTGAGCAGGAACTGAAA-3 '(21, 735-21, 759 / sequence 7) 3' primer 5 '-CTGCGCACTGTGGCTGCGGAAGTAG-3' (22, 305-22, 281 / sequence 8)
  • L5 5 '-GACCCCTCACAGTGTCAGAAGGAAA-3' (31, 4
  • RNA was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, blotting was performed on nylon finoletters (Hybond- NT , Amersham) by the capillary transfer method, and UV cross-linking was performed. After confirming the position of the stained 28S and 18S of the RNA to the filter at 0.02% methylene blue solution, buffer A (0. 5M Na 2 HP0 4 (pH7. 2) / 7% SDS / lmM EDTA) and 50 ml was added Prehybridization was performed at 65 ° C for 2 hours. Then, while handling buffer A 50ml containing 3 2 P-labeled probe 12.
  • Examples of Northern plot results are shown in FIGS. 4A to 4C, and a summary of the results is shown in Table 1.
  • MLP adenovirus major late promoter
  • MLP adenovirus major late promoter
  • the expression of the E2A gene was naturally decreased in ⁇ 2 ⁇ -CAHGH-infected cells, but there was no difference between Axlwl-infected cells and AxCAwt-infected cells, and expression was similar in both virus-infected cells.
  • the expression of the E4 gene did not differ among all the vector-infected cells, and was expressed to the same extent in all virus-infected cells (data not shown). Therefore, the expression is not induced by the CAG promoter for both E2A and E4 genes. It became clear.
  • the expression of the IVa2 gene was similar in HepG2 cells between Axlwl-infected and AxCAwt-infected cells, with no difference. On the other hand, in A549 cells, the expression of the IVa2 gene was reduced only in Axlwl-infected cells (FIG. 4B).
  • the expression of the L1 gene one of the late genes governed by MLP, also had a similar tendency to that of the IVa2 gene, with different results between H-marked G2 cells and A549 cells (see Table 1).
  • protein IX gene is delayed-early gene that is not also subject to MLP the IVa2 gene (hereinafter, pIX gene) expression was the same result both A549 and the He P G2 cells. That is, in the AE2A-CAHGH-infected cells, the expression of the pIX gene did not decrease, but only in the Axlwl-infected cells, the expression was clearly reduced (FIG. 4C).
  • both A549 cells and H-marked G2 cell lines showed the same expression pattern as the changes in serum GPT level, that is, AxCAwt, AxlCAHGH, and AE2A_CAHGH infected cells were almost the same and infected with Axlwl
  • the only gene whose expression was reduced in cells was the pIX gene. This indicated that the pIX gene was the one whose expression was induced by the CAG promoter and caused inflammation.
  • the recombinant adenovirus into which the CMV promoter was inserted was the recombinant adenovirus AdCMVlacZ (Osada S. et.al., idney) in which the CMV promoter and the E. coli lacZ gene were inserted rightward into the E1 deletion site of adenovirus type 5. Int., Vol. 55, 1234-1240. (1999)) was used.
  • AdCMVlacZ Oxada S. et.al., idney
  • AxCAwt shown in Example 6 was used as a control virus into which the CAG promoter was inserted.
  • A549 cells were infected with AdCMVlacZ or AxCAwt in the same manner as described in Example 6, and RNA was recovered 24 hours later.
  • the moi at the time of infection was moi 6 or moi 2 for AdCMVlacZ, and moi 300 or moi 100 for AxCAwt.
  • Northern blot was performed using the pIX probe described in Example 6.
  • Fig. 5 shows the results.
  • Cells infected with AdCMVlacZ at moi 6 expressed pIX genes equal to or greater than cells infected with AxCAwt at moi 100. Because the moi of the two viruses are different and the insertion direction of the promoter is different and the distance from the promoter to the pIX gene is different, it is not possible to compare the degree of CAG promoter and CMV promoter expression induction of the pIX gene. However, since the CMV promoter-inserted AdCMVlacZ-infected cells expressed the pIX gene even at a lower moi, it was clearly shown that the CMV promoter also induced the pIX gene expression.
  • Example 8 shows the results.
  • the exogenous promoter used in the study was the SRa promoter (Takebe Y. et. Al., Moi. Cell. Biol. Vol. 8, 466-472. (1988)) and the EF-la promoter (Kim DW et. al., Gene, Vol. 91, 217-223 ⁇ (1990)), the promoters and the E. coli lacZ gene were inserted to the left. Denovirus vectors (AxSRLacZ-Ashi and AxEFLacZ-L) were used.
  • an adenovirus vector AxCAwt into which only the CAG promoter was inserted (see Example 5) and an adenovirus vector (AxCALacZ-) into which the CAG promoter and the E. coli lacZ gene were inserted leftward were used.
  • Methods for producing AxSRLacZ-AxEFLacZ-L and AxCALacZ-L are disclosed by Saito et al. (JP-A-7-298877), and AdexlSRLacZ-AxSRLacZ-L and AdexlEFLacZ-L in the material are AxEF AcZ_L and AdexlCALacZ-L are the same as AxCALacZ-shi, respectively.
  • Example 5 As a negative control, an adenovirus vector Axlwl into which no foreign promoter was inserted (see Example 5) was used. Furthermore, the adenovirus vector having the CMV promoter (AdCMVlacZ) used in Example 7 was examined again.
  • A549 cells were infected with the six adenowinores vectors (AxSRLacZ-L, AxEFLacZ-, AxCALacZ-, and AdCMVlacZlacAxCAwt, Axlwl) with moi 30 or moi 100, RNA was collected 24 hours later, and the pIX probe was collected. A Northern plot was performed using the method (see Example 6 for details of the method).
  • Fig. 6 shows the results.
  • the pIX gene is also clearly expressed, and the expression level is as a positive control.
  • the cells infected with the adenovirus vector having the CAG promoter (AxCALacZ-L and AxCAwt) was equal to or better than
  • the expression of the pIX gene by the foreign promoter is specific to the promoter, and there is a foreign promoter that does not induce the expression of the pIX gene at all, such as the EF-la promoter. Furthermore, since the common part of the structure between the CAG promoter and the CMV promoter is only the CMV IE enhancer, it was shown that the expression of the pIX gene is mainly induced by the CMV IE enhancer.
  • Example 9 Examination of inflammation-inducing ability of adenovirus vectors having different promoters
  • Adenovirus vectors were administered 1 ⁇ 10 9 PFU (other than AdCMVlacZ), 3 ⁇ 10 8 PFU, 1 ⁇ 10 8 PFU in the tail vein (5 animals per group), 3 days before administration, and 3, 5, 7, 10, Blood was collected 14, 21, 28 and 35 days later and GPT values were measured.
  • the details of each method conformed to the method described in Example 3.
  • Fig. 7 shows the results.
  • the mice administered with AdCMVlacZ having the CMV promoter had higher serum GPT levels than the mice administered with AxCALacZ-L having the CAG promoter, and the degree of inflammation was correlated with the expression level of the pIX gene shown in Example 8.
  • the serum GPT level hardly increased, and was at the same level as the Axlwl-administered mouse in which the exogenous promoter was not inserted.
  • the following procedure was performed to clone the coding region of the pIX gene of human adenovirus type 5 (Ad5) by PCR.
  • a PCR reaction was performed using the cosmid vector pAxcw described above as a template and primers having the following sequences.
  • the 5 'primer has the nucleotide sequence at positions 3585-3605 of Ad5 and the EcoRI recognition site, and the 3' primer has the nucleotide sequence at positions 4034-4015 of Ad5 and the Xhol recognition site. Designed.
  • a PCR reaction was performed using Pfx DNA polymerase (GIBCO BRL) to amplify a 470 bp DNA fragment containing the coding region of the pIX gene.
  • the commercial expression plasmid vector pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) has a multicloning site downstream of the CMV promoter. Therefore, the 470 bp DNA fragment amplified by PCR was simultaneously digested with EcoRI and Xhol, inserted between the EcoRI site and the Xhol site in the multicloning site of pcDNA3.1 (+), and the pIX expression plasmid pCMV- IX (5.9 kb) was obtained.
  • the nucleotide sequence of the pCMV-IX including the coding region of the pIX gene was decoded, and it was confirmed that the sequence was not different from the existing sequence (Genebank: Accession No. M73260).
  • GST-pIX fusion protein of pIX and daltathione S-transferase
  • the plasmid pCMV-IX was simultaneously digested with EcoRI and XhoI to obtain a 470 bp DNA fragment containing the pIX gene.
  • the commercially available GST fusion protein Escherichia coli expression plasmid vector pGEX-5X-1 (Amersham Pharmacia Biotech) has a multiple cloning site on the C-terminal side of GST. Therefore, a 470 bp DNA fragment obtained from pCMV_IX was inserted between the EcoR I site and the Xho I site in the pGEX-5X-1 multicloning site, and the GST-pIX expression plasmid pGST-IX (5 4 kb).
  • E. coli strain JM109 was transformed with plasmid pGST-IX. Since GST-pIX expressed in the transformant was insoluble, GST-pIX was purified according to the method for purifying inclusion body proteins. First, the transformed Escherichia coli was cultured overnight at 37 ° C in 40 ml of LB medium, 800 ml of LB medium was added, and the cells were further cultured for 1 hour, and then IPTG (isopropyl-l-thio-j3-D-galactoside) was added to the mixture (final concentration: 0.2 mM) and cultured for 6 hours, and the cells were collected.
  • IPTG isopropyl-l-thio-j3-D-galactoside
  • lysis buffer containing lysozyme (lmg / ml) buffer Suspended in 20 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) / lmM EDTA / 100 mM NaCl), incubated at room temperature for 20 minutes, added lml of lysis buffer containing 10% sodium deoxycholate, and lysed. . Next, add 100 ⁇ l of 1 M MgCl 2 solution, 100 ⁇ l of 1 M MnCl 2 solution and 201 of DNasel (70 U / ⁇ 1) solution, incubate at 37 ° C for 15 minutes, and centrifuge for 15 minutes (11, 850 X g).
  • the purified GST-pIX was used to immunize Egret (Japanese white species) while containing 6M guanidine hydrochloride.
  • FIG. 8 shows the results of Western blotting using antiserum # 1 as an example among the two types of antisera.
  • antiserum # 1 As an example among the two types of antisera.
  • a band of approximately 14 kDa corresponding to the molecular weight of pIX was clearly detected in the lane to which Ad5-dlX-infected cells and purified virus particles were applied. This band was not detected in the lane to which untreated A549 cells were applied.
  • this 14 kDa band was not detected at all in any lane. Data are not shown, but the # 2 antiserum had similar results. From the above results, it was confirmed that the 14 kDa band detected in these antisera was derived from pIX. Therefore, these antisera were used as anti-pIX antibodies in subsequent experiments.
  • A549 cells are infected with the adenovirus vector AxCAwt (see Example 5) into which only the CAG promoter has been inserted or the adenovirus vector Axlwl (see Example 5) into which no foreign promoter has been inserted, and the cells are recovered approximately one day later. did.
  • A549 cells infected with Ad5-dlX at moi 10 and collected about one day later were used.
  • Western blotting was performed in the same manner as described in (3) above, and pIX was detected with an anti-pIX antibody ().
  • 14 kDa pIX was detected in AxCAwt-infected cells, as in Ad5-dlX-infected cells.
  • this 14 kDa band was not observed at all in Axlwl infected cells. This confirmed that the expression of pIX was induced by the CAG promoter even at the protein level.
  • Adenovirus vectors in which the pIX gene has been rearranged include the following (1) to (3) It was prepared according to the procedure.
  • PCR was performed using the cosmid vector pAxcw (described above) containing most of the adenovirus type 5 genome other than the E1 gene and E3 gene as a template and primers having the following sequences. A restriction enzyme recognition site was added to each primer.
  • a DNA fragment of about 0.6 kb containing the pIX gene amplified by PCR was simultaneously digested with EcoRI and BamHI, inserted between the EcoRI site and the BamHI site in the multicloning site of the commercially available plasmid pUC19, and inserted into the plasmid pUCfpIX. (3.3 kb) was obtained.
  • the base sequence of the insert part containing the pIX gene of pUCfpIX was decoded, and it was confirmed that the sequence was not different from the existing sequence (Genebank: Accession No. M73260).
  • the cosmid vector pAx4w contains 2.6-98.0 m.u of the adenovirus type 5 genome (E3 gene deleted) and 98.0-100 mu of the adenovirus type 2 genome, and contains the E4 gene.
  • This vector has a restriction enzyme Swal site, a cloning site, between the upstream region of the promoter and the 3 'ITR (99.3 mu) (Miyake S. et. Al, Pro Natl. Acad. Sci., Vol. 93, 1320-1324.
  • pAx4w is described as pAdex4w in the literature.
  • the plasmid pUCfpIX was digested with Rsal to obtain a DNA fragment of about 0.6 kp containing the pIX gene. This 0.6 kb DNA fragment was inserted into the Swal site of the cosmid vector pAx4w to obtain cosmids pAx4pIXL and pAx4pIXR.
  • pAx4pIXL is a vector into which the pIX gene is inserted leftward
  • pAx4pIXR is a vector into which the ⁇ gene is inserted rightward.
  • the pIX gene was located between the upstream region of the ⁇ 4 gene and the 3 'ITR by the C0S / TPC method.
  • the following operations were performed to produce the inserted recombinant adenovirus.
  • the recombinant adenovirus vector Adex4SRLacZL (see Miyake S. et. Al., Pro Natl. Acad. Sci., Vol. 93, 1320-1324. (1996) and FIG. 10) was derived from adenovirus type 5 (E1A And the E3 gene are deleted), and the expression unit of the E. coli lacZ gene is inserted at the same 99.3 mu position as pAx4w in the left direction.
  • DNA-TPC An adenovirus DNA-terminal protein complex (DNA-TPC) was prepared from Adex4SRLacZL, and this DNA-TPC was simultaneously digested with restriction enzymes Asel and EcoRI.
  • Adex4SRLacZL genomic DNA has multiple Asel sites and EcoRI sites in the right half of the genome containing the lacZ gene expression unit.By digesting Adex4SRLacZL DNA-TPC with both restriction enzymes, the right half of the genome A digested DNA-TPC is obtained. And the restriction enzyme digestion DNA-TPC, was transformed 293 cells with the old ink stick de P Ax4pIX or PAx4pIXR.
  • the target virus clone was identified by digesting the genomic DNA of the resulting recombinant adenovirus with the restriction enzymes BspEI and Pmll, and the recombinant adenovirus Ax4pIXL or Ax4pIXR (Adex4SRLacZL) in which the expression unit of the E. coli lacZ gene was replaced by the pIX gene was used.
  • Figure 10 was obtained.
  • Ax4pIXL and Ax4pIXR are recombinant adenoviruses that have the pIX gene at its native position (9.7-11.2 mu) and at a location between the upstream region of the E4 gene and the 3 'ITR .
  • Ax4pIXL and Ax4pIXR differ only in the insertion direction of the pIX gene between the E4 gene and the ITR.
  • Ax4pIXL is a recombinant adenovirus in which the pIX gene is inserted to the left
  • Ax4pIXR is a recombinant adenovirus in which the pIX gene is inserted to the right. is there.
  • the following procedure was performed to prepare a plasmid containing 17% of the left end of the adenovirus type 5 genome containing the pIX gene.
  • the aforementioned cosmid vector pAxcw (FIG. 11) is a vector containing most of the adenovirus type 5 genome except for the E1 gene ( ⁇ 454-3328) and the E3 gene ( ⁇ 28592-30470).
  • pAxcw was digested with Hindlll and EcoRV, then blunted with Klenow enzyme and self-ligated to obtain plasmid pAxl7cw (6.5 kb: FIG. 11).
  • pAxl7cw is a plasmid containing about 17% (1-453, 3329-6241) of the adenovirus type 5 excluding the E1 gene.
  • the following three types of DNA fragments were prepared.
  • the three fragments (a), (b) and (c) were ligated to obtain a plasmid pAxl7 ApIXcw (5.8 kb: FIG. 11) in which the E1A, E1B and pIX genes were deleted ( ⁇ 454-4053).
  • cosmid vector in which an expression unit of human growth hormone (hGH) was inserted into the E1A, E1B, and pIX gene deletion sites of the cosmid vector pAx ApIXcw.
  • a cosmid pAxlCAHGH (Example 1) having an hGH expression unit with an hGH cDNA linked downstream of the CAG promoter was digested with the restriction enzyme Pmel to obtain a DNA fragment of about 3. Okb containing the hGH expression unit.
  • This DNA fragment was inserted into the Swal site of the cosmid vector pAx ApIXcw to obtain the cosmid pAx ApIXCAHGH (44.8 kb: FIG. 11).
  • Adenovirus DNA-TPC was prepared from Ax4pIXL and Ax4pIXR, and each DNA-TPC was then digested with the restriction enzyme EcoT22I. Since there are multiple EcoT22I sites in the left half of the genomic DNA of Ax4pIXL and Ax4pIXR, DNA-TPC in which the left half of the genome is digested can be obtained by EcoT22I digestion.
  • 293 cells were transformed with EcoT22I-digested Ax4pIXR DNA-TPC and cosmid pAx ApIXCAHGH. Identify the target virus clone by subjecting the genomic DNA of the recombinant adenovirus that has appeared to restriction enzyme digestion (XhoI, Nrul, BspEI, etc.). As a result, the pIX gene did not exist at the original position (9.7-1.2 mu) of the pIX gene, and the pIX gene was rearranged between the upstream region of the E4 gene and the 3 'ITR. A pIX relocated adenovirus vector (AxRpIXRCAHGH, Fig. 10) is obtained.
  • AxRpIXLCAHGH a pIX rearranged adenovirus vector (AxRpIXLCAHGH, FIG. 10) can be obtained.
  • AxRpIXRCAHGH and AxRpIXLCAHGH differ only in the insertion direction of the pIX gene.
  • AxRpIXRCAHGH is a recombinant adenovirus in which the pIX gene is inserted to the right and AxRpIXLCAHGH is the pIX gene inserted to the left.
  • 293 cells were transformed to produce a pIX-expressing cell line for use in producing a pIX-deleted adenovirus vector.
  • pCMV-IX contains a neomycin resistance gene 3 days after the transformation, the medium was replaced with a medium containing 600 g / ml of G418 sulfate (Geneticin: GIBCO BRL). The transformed cells were further cultured for 13 days, and then the cells were cloned. For any 10 clones among the G418-resistant cell lines, whether or not the pIX gene was expressed was examined by Northern blot.
  • pIX was also confirmed at the protein level by the Western blot method described in Example 10- (3) using the cells at the 25th passage (FIG. 13).
  • 293 cells infected with the adenovirus vector Axlwl into which no foreign promoter was inserted were used as a positive control. Even if Axlwl is infected to cells that do not express the adenovirus E1A and E1B genes, such as A549 cells, pIX hardly expresses at the RNA level (Fig. 4, Fig. 6) or the protein level (Fig. 9).
  • Axlwl when used to infect 293 cells expressing the E1A and E1B genes, they will fit into the normal growth cycle of a first generation adenovirus vector lacking the E1 gene and will express sufficient amounts of pIX. From the results shown in FIG. 13, it was confirmed that, although slightly lower than the expression level of pIX in Axlwl-infected 293 cells, all four clones also expressed pIX at the protein level.
  • Example 5 The homologous recombination between the adenovirus vector AxCAwt used in Example 5 and the pIX gene deletion cosmid vector pAx ApIXCAHGH shown in Example 10- (2) was performed to produce a pIX deletion type adenovirus vector. The following operations were performed.
  • Adenovirus DNA-TPC was prepared from AxCAwt and then digested with EcoT22I. This Transform 293 cells or the pIX-expressing cell line shown in Example 12 with DNA-TPC and the cosmid vector pAx ApIXCAHGH. By digesting the genomic DNA of the resulting recombinant adenovirus with restriction enzymes (Clal, Nrul, Sail, etc.), the target virus clone is identified, and the pIX-deleted adenovirus vector Ax ApIXCAHGH (FIG. 10) is obtained.
  • Ax ApIXCAHGH is a recombinant adenovirus derived from adenovirus type 5, which has deleted the E1A, E1B, and pIX genes ( ⁇ 454-4053) and also deleted the E3 gene ( ⁇ 28592-30470).
  • a pIX-expressing cell line When a pIX-expressing cell line is transformed to obtain a pIX-deficient adenovirus vector, the pIX-expressing cell line is used for virus passage and large-scale preparation. On the other hand, when 293 cells are transformed to obtain a pIX-deleted adenovirus vector, a large amount of virus is prepared using a pIX-expressing cell line.
  • the pIX deletion adenovirus vector is purified to prepare virus particles, and the virus particles are confirmed to contain a normal amount of pIX protein by Western blotting using an anti-pIX antibody.
  • hGH-expressing pIX-deficient adenovirus vector Ax ApIXCAHGH (Example 13).
  • hGH-expressing first-generation adenovirus vector AxlCAHGH (Example 5)
  • mice to which AxlCAHGH was administered the serum GPT level was significantly increased as in Examples 3 and 5.
  • serum GPW levels do not increase at all, as in mice treated with Axlwl.
  • the above results indicate that the pIX rearranged adenovirus vector and the pIX deleted adenovirus vector hardly cause inflammation even when administered in vivo.
  • the present invention it is possible to provide a highly safe adenovirus vector for gene therapy in which expression of viral proteins is suppressed and inflammation is reduced.

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Description

明 細 書 副作用を軽減した新規な組換えアデノウィルスベクター 技術分野
本発明は、 遺伝子治療用の組換えアデノウィルスベクター及びその製造方法な どに関する。 具体的には、 本発明は、 アデノウイルスゲノム中に挿入された外来 プロモーターによるアデノウィルス遺伝子の発現誘導を抑制することにより、 i n V i v o投与時の炎症を軽減した新規な組換えアデノウィルスベクター及 びその製造方法、 前記組換えアデノウイルスベクターの製造に用いる細胞株、 あ るレヽは前記組換えアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療方法などに関する。 背景技術
アデノウイルスベクターは、 遺伝子導入効率の高さ、 非分裂細胞にも遺伝子導 入できること、 高力価のウィルス液の調製の容易さなどの利点から、 動物細胞へ の優れた遺伝子導入用ベクターであり、 遺伝子治療用のベクターとして臨床応用 が試みられている。 現在、 広く用いられているアデノウイルスベクターは、 アデ ノウィルスの增殖および全てのアデノウィルスタンパク質の発現に必須の E1遺伝 子を欠失させた非増殖型のベクターで、 このベクターは第一世代アデノウィルス ベクターとも呼ばれている （さらに E3遺伝子の欠失を含む場合もある） 。
第一世代アデノウイルスベクターは、 E1遺伝子を欠失しているため、 ヒ ト細胞 など E1遺伝子を発現していない通常の細胞では、 一切のアデノウィルスタンパク 質は発現しないと考えられていた。 しかし最近の研究により、 第一世代アデノウ ィルスベクターを用いて in vivoで遺伝子導入を行うと、 導入遺伝子の発現は一 過的であり、 しかも遺伝子導入した部位に炎症反応の生じることが明らかとなつ てきた （Yang Y. et. al.， Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91， 4407-4411, (1994)、 および Wilmott R. W. et al. , Hum. Gene Ther.， Vol. 7, 301—318· (1996) ) 。
その原因の説明として、 次の仮説が提唱された。 第一世代アデノウイルスべク ターを感染させた細胞では、 まず細胞由来の転写因子により E2A遺伝子などのァ デノウィルス初期遺伝子が微量に発現し、 アデノウィルス主要後期プロモーター ( LP) を活性化する。 次いで、 主要後期タンパク質が発現し、 それに対する細 胞傷害性 T細胞 （CTし） が誘導され、 CTUこより外来遺伝子導入細胞が排除される。 すなわち、 アデノウィルス初期タンパク質の発現を介した後期タンパク質の発現 力 炎症反応および導入遺伝子の発現が持続しない原因であるとの説である (Engelhardt J. F. et. al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 6196—
6200. (1994)、 および Yang Y. et. al. , Nature Gnent.， Vol. 7, 362-368·
(1994) ) 。
この仮説に基づき、 El遺伝子以外のアデノウィルスの増殖に必須の遺伝子も欠 失させ、 その遺伝子にコードされるタンパク質をウィルス産生細胞から補うこと によりウィルスの増殖を可能とした、 種々の改良型アデノウィルスベクターが構 築された。 その例として、 E2A遺伝子を欠失させたアデノウイルスベクター ( Zhou H. et. al. , J. Virol. , Vol. 70, 7030-7038. (1996) 、 および Gorziglia M. I. et. al. , J. Virol. , Vol. 70, 4173 - 4178. (1996) ) 、 E2A遺 伝子と同じく初期遺伝子である E4遺伝子を欠失させたアデノウィルスベクター (Krougliak V. et al.， Hum. Gene Ther. , Vol. 6, 1575-1586. (1995)、 およ び Wang Q. et al.， Gene Ther.， Vol. 2, 775—783. (1995)、 Yeh P. et. al. , J. Virol. , Vol. 70, 559-565. (1996) ) などが報告されている。 しかしながら、 E2A遺伝子を欠失させたアデノウィルスベクターは、 導入遺伝子の発現期間の延 長や炎症反応の低下などのベクターの改良の効果はほとんど認められていない (Morral N. et al.， Hum. Gene Ther.， Vol. 8, 1275-1286. (1997)、 および Lusky M. et. al.， J. Virol. , Vol. 72, 2022-2032. (1998)、 および 0， neal W. K. et al. , Hum. Gene Ther.， Vol. 9， 1587-1598. (1998) ) 。 また E4遺伝子を 欠失させたアデノウィルスベクターでは、 若干の改良効果が認められたものの不 十分であったことが報告されている （Gao G- P. et. al. , J. Virol. , Vol. 70, 8934-8943. (1996)、 Wang Q. et al. , Gene Ther. , Vol. 4, 393-400. (1997)、 および Dedieu J - F. et. al. , J. Virol. , Vol. 71, 4626-4637. (1997) ) 。
そこで、 さらなる改良型ベクターとして、 逆方向反復配列 （inverted
terminal repeat ： ITR) とパッケージング配列のみを残し、 他のアデノウイノレ ス遺伝子全てを欠失し、 そしてヘルパーウィルスに依存して増殖する、 ヘルパー 依存型アデノウイルスベクター （HDベクター） が考案された （Kochanek S. et. al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, 5731-5736· (1996)、 および Parks R. J. et. al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93， 13565—13570. (1996) ) 。 この HDベクターは、 ガッティ ド （gutted) ベクターまたはガットレス (gutless) ベクターとも呼ばれている。 当該 HDベクターでは、 導入遺伝子の発 現期間の延長や炎症反応の低下など、 ベクターの改良の効果が現れたことが報告 されてレヽる (Morsy M. A. et. al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95, 7866-7871. (1998)、 およぴ Schiedner G. et. al. , Nature Gnent. , Vol. 18, 180—183. (1998)、 および Morral N. et al. , Hum. Gene Ther.， Vol. 9, 2709- 2716. (1998) ) 。
し力 し、 この HDベクターを医薬品として臨床応用する場合、 ベクターの生産性 の低さという大きな問題点がある。 その理由は次の通りである。 まず HDベクター 産生時において、 HDベクターは増殖に必要なタンパク質全ての供給をヘルパーァ デノウィルスに依存している。 そして、 ヘルパーウィルスを常に一定割合以下に 保ちながら HDベクターを増殖させるという生産原理から、 報告された単位細胞当 たりの HDベクターの産生量は、 第一世代アデノウィルスベクターに較べると明ら 力 に低レ、 （Morsy M. A. et. al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95, 7866-7871. (1998)、 および Schiedner G. et. al. , Nature Gnent. , Vol. 18， 180-183. (1998) ) 。 また目的の HDベクターには産生に用いたヘルパーウィルス が常に混入しているため、 両ウィルスの比重の微妙な差に基づいた超遠心法によ り両ウィルスを分離し、 ヘルパーウィルスを除去しなければならなレ、。 第一世代 アデノウィルスベクターも超遠心法により精製を行う場合があるが、 その目的は アデノウイルス粒子から挟雑タンパク質を除くことにある。 一方、 HDベクターの 精製においては、 挟雑タンパク質を除くと共に、 前記のようにヘルパーウィルス を分離する必要があるため、 一度の超遠心で精製できる量は第一世代アデノウイ ルスベクターよりも少ない。 もし、 ヘルパーウィルスが十分に除去されていなけ れば、 ベクターの安全性自体が懸念される。 さらに、 第一世代アデノウイルスべ クタ一は、 超遠心法よりも大量のウィルスを扱えるカラム法 （Huyghe B. D. et. al. , Hum. Gene Ther. , Vol. 6, 1403-1416. (1995) ) による精製も可能である 力 HDベクターにおいてはヘルパーウィルスの除去の必要性から、 現在の技術水 準ではカラム法は適用できない。 以上の理由から、 HDベクターは培養細胞での産 生時及びその後の精製過程の両方において、 第一世代アデノウィルスベクターよ りも生産性が明らかに低い。 従って、 臨床に必要な十分量の HDベクターを製造す ることは極めて困難であり、 非現実的であると考えられる。
さらに、 サイ トメガロウィルス （CMV) プロモーターやラウス肉腫ウィルス
(RSV) プロモーターなどのウィルス由来プロモーターは、 プロモーター活性が 高いためアデノウィルスベクターをはじめとする遺伝子治療用のベクターに汎用 されているが、 in vivoでこれらのプロモーターから目的遺伝子を長期間発現さ せるためには、 アデノウィルス E4遺伝子にコードされるタンパク質が必要である と報告されている （Armentano D. et al. , J. Virol. , Vol. 71, 2408-2416.
(1997)、 および Brough D. E. et al. , J. Virol. , Vol. 71, 9206-9213.
(1997) ) 。 このようなプロモーター活性の持続の観点からも、 高活性なウィルス 由来プロモーターを挿入したアデノウイルスベクターは、 第一世代アデノウィル スベクターに近い構造のベクターを用いる必要がある。 発明の開示
本発明の目的は、 ヘルパーウィルスに依存せず増殖することができるアデノゥ ィルスべクタ一であって、 かつ in vivoでアデノウイルスタンパク質がほとんど 発現せず、 その結果炎症反応を誘導せず導入遺伝子の発現期間を持続させること ができるという性質を有した、 新たなアデノウィルスベクターを提供することに ある。 さらに、 力かるアデノウイルスベクターを遺伝子治療に提供することにあ る。
本発明者らは、 E1遺伝子を欠失した第一世代アデノウィルスベクターを動物個 体に投与した際に炎症反応が起きる原因を鋭意検討した。 その結果、 E1タンパク 質が存在しなレ、細胞に第一世代アデノウイルスベクターを感染させた際にアデノ ウィルスタンパク質が発現する機構は、 従来の仮説とは全く異なることを発見し た。 すなわち本発明者らは、 アデノウイルスタンパク質の発現の引き金となるの は、 従来言われていた初期遺伝子の発現によるものではなく、 アデノウイルスべ クタ一に挿入した外来プロモーターによるものであることを明らかにした。 具体 的には、 外来プロモーター中の特定の構成成分 （ェンハンサーなど） が当該プロ モーター近傍に存在するアデノウイルスプロモーターに作用し、 その結果、 アデ ノウィルス遺伝子が発現するという新たな機構を解明した。 しかも、 主に発現す るアデノウイルス遺伝子は、 従来言われていた、 主要後期プロモーター （MLP) に制御され、 へキソンなどをコードする主要後期遺伝子ではなく、 独立したプロ モーターを持つタンパク質 IX遺伝子であることを発見した。
タンパク質 IXはアデノウィルスの増殖に必須のタンパク質ではないが、 完全な アデノウイルス粒子を構成するために必要なタンパク質である。 従って、 第一世 代アデノウィルスベクターから単にタンパク質 IX遺伝子を欠失させるだけでは、 本発明者らが目的とする正常なアデノウィルスベクターは得られない。 そこで、 本発明者らはさらに鋭意検討し、 次の 2種類の方法により当該課題を解決できる ことを見出した。 一つは、 当該アデノウイルスベクターのタンパク質 IX遺伝子を、 正常な位置から外来プロモーターの影響を受けない位置に再配置する方法である (タンパク質 IX再配置型アデノウイルスベクターと称する） 。 もう一つは、 当該 アデノウィルスベクターからタンパク質 IX遺伝子を欠失させ、 タンパク質 IXを産 生する新たな細胞株を作製し、 当該細胞株によりタンパク質 IX遺伝子を欠失した アデノウィルスベクターを製造する方法である （タンパク質 IX欠失型アデノウイ ノレスベクター） 。
さらに、 本発明者らの検討から、 外来プロモーターの影響を受け発現が誘導さ れるアデノウイルス遺伝子は、 主にはタンパク質 IX遺伝子であるが、 タンパク質 IVa2遺伝子ならびに L1遺伝子も発現誘導される可能性があることも明らかになつ た。 従って、 タンパク質 IVa2ならびに L1遺伝子のプロモーターを外来プロモータ 一の影響を受けないように改変したアデノウィルスベクターも、 それ単独もしく はタンパク質 IX遺伝子の改変と組み合わせることにより、 アデノウイルスタンパ ク質が発現せず炎症を誘導しにくいべクターとして用いることができる。
本発明は、 以上のような知見に基き完成するに至ったものである。
即ち本発明は、
1 . 以下の （1 ) 〜 （4 ) の特徴を有する、 i n V i v o投与時に炎症が軽 減される組換えアデノウィルスベクター：
(1) アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子が欠失している ；
(2) アデノウィルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されて いる ；
(3) 以下の （A) 及びノ又は （B) の特徴を有する ；
(A) 外来プロモーターにより発現誘導を受けるアデノウィルスゲノムの遺伝子 力 正常な位置から外来プロモーターによる発現誘導を受けない位置に再配置さ れているか、 又は欠失している ；
(B) 外来プロモーターにより発現誘導を受けるアデノウィルスゲノム遺伝子の プロモーターの塩基配列が、 外来プロモーターの作用を受けないように置換され ている ；
(4) アデノウィルス野性株と同等の性質を有する正常なウィルス粒子を形成し ている、
2. アデノウイルスゲノムのプロモーターが ML P及び/又は I V a 2遺伝子 プロモーターである、 前記 1. 記載の組換えアデノウイルスベクター、
3. 以下の （5) 〜 （8) の特徴を有する、 前記 1. 又は 2. 記載の組換えァ デノウィルスベクター：
(5) アデノウイルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子が欠失している ；
(6) アデノウィルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されて いる ；
(7) アデノウイルスゲノムのタンパク質 I X遺伝子が、 正常な位置から外来プ 口モーターによる発現誘導を受けない位置に再配置されている ；
(8) アデノウイルス野性株と同等のタンパク質 I Xを含有し、 正常なウィルス 粒子を形成している、
4. アデノウイルスゲノムの E 1 A及ぴ E 1 B遺伝子欠失部位に、 外来プロモ 一ターを含む外来遺伝子が挿入されている、 前記 1. 〜3. いずれか記載の組換 えアデノウィルスベクター、
5. アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子以外の少なくとも一つの 遺伝子の全部又は一部が欠失した、 前記 1. 〜4. いずれか記載の組換えアデノ ベクター、
6. アデノウイルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子、 ならびにタンパク質 I X遺伝子以外の少なくとも一つの遺伝子の全部又は一部が欠失した、 前記 3. 〜 5. いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
7. アデノウイルスゲノムの E 3遺伝子の全部又は一部が欠失した、 前記 1. 〜 6. いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター、
8. アデノウイルスゲノムの E 2 A遺伝子の全部又は一部が欠失した、 前記 1. 〜7. いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター、
9. アデノウィルスゲノムの E 4遺伝子の少なくとも 1つの〇RFを保持する、 前記 1. 〜8. いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
10. アデノウイルスゲノムの E 4遺伝子の OR F 3を保持する、 前記 9. 記 載の組換えアデノウィルスベクター、
1 1. アデノウイルスゲノムの E 4遺伝子の OR F 3以外の他の ORFの全部 又は一部が欠失した、 前記 10. 記載の組換えアデノウイルスベクター、
1 2. 外来プロモーターから 1 8 k b以上離れた位置にタンパク質 I X遺伝子 が再配置された、 前記 3. 〜1 1. いずれか記載の組換えアデノウイルスベクタ
1 3. アデノウイルスゲノムの L 3遺伝子と E 2 A遺伝子の間にタンパク質 I X遺伝子が再配置された、 前記 1 2. 記載の組換えアデノウイルスベクター、 14. 外来プロモーターから 24 k b以上離れた位置にタンパク質 I X遺伝子 が再配置された、 前記 3. 〜1 1. いずれか記載の組換えアデノウイルスベクタ
1 5. アデノウイルスゲノムの E 3遺伝子欠失部位にタンパク質 I X遺伝子が 再配置された、 前記 14. 記載の組換えアデノウイルスベクター、
1 6. 外来プロモーターから 30 k b以上離れた位置にタンパク質 I X遺伝子 が再配置された、 前記 3. 〜1 1. いずれか記載の糸且換えアデノウイルスベクタ
1 7. アデノウイルスゲノムの E 4遺伝子上流領域と 3， I TRとの間にタン パク質 I X遺伝子が再配置された、 前記 16. 記載の組換えアデノウイルスべク ター、
1 8. 外来プロモーターが哺乳動物由来及び Z又は動物ウィルス由来の成分を 含む、 前記 1. 〜1 7. いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
1 9. 外来プロモーターが CMVェンハンサーを含む、 前記 18. 記載の組換 えアデノウイルスベクター、
20. 外来プロモーターが CMVプロモーターである、 前記 19. 記載の組換 えアデノウィルスベクター、
2 1. 外来プロモーターが CAGプロモーターである、 前記 19. 記載の糸且換 えアデノウィルスベクター、
22. 外来プロモーターが RSVプロモーター又は S Rひプロモーターである、 前記 1 8. 記載の組換えアデノウイルスベクター、
23. アデノウイルスがヒ トアデノウイルスであることを特徴とする、 前記 1. 〜22. いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター、
24. アデノウィルスが 2型又は 5型のアデノウィルスであることを特徴とす る、 前記 23. 記載の組換えアデノウイルスベクター、
25. 以下の （9) 〜 （1 1) の特徴を有する、 前記 1. 又は 2. 記載の組換 えアデノウィルスベクター：
(9) アデノウイルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子、 ならびにタンパク質 I
X遺伝子が欠失している ；
(10) アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入され ている ；
(1 1) アデノウイルス野生株と同等のタンパク質 I Xを含有し、 正常なウィル ス粒子を形成している、
26. アデノウイルスゲノムの E 3遺伝子の全部又は一部が欠失した、 前記 2 5. 記載の組換えアデノウイルスベクター、
27. アデノウイルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子欠失部位、 又は E 3遺 伝子欠失部位に、 外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている、 前記 2 5. 又は 26. 記載の組換えアデノウイルスベクター、
28. アデノウイルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子、 E 3遺伝子、 ならび にタンパク質 I X遺伝子以外の少なくとも一^ 3の遺伝子の全部又は一部が欠失し た、 前記 25. 〜27. いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
29. アデノウイルスゲノムの E 2 A遺伝子の全部又は一部が欠失した、 前記
25. 〜28. いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
30. アデノウイルスゲノムの E 4遺伝子の少なくとも 1つの ORFを保持す る、 前記 25. 〜29. いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
31. アデノウイルスゲノムの E 4遺伝子の ORF 3を保持する、 前記 30. 記載の組換えアデノウィルスベクター、
32. アデノウィルスゲノムの E 4遺伝子の ORF 3以外の他の ORFの全部 又は一部が欠失した、 前記 31. 記載の組換えアデノウイルスベクター、
33. 外来プロモーターが哺乳動物由来及び Z又は動物ウィルス由来の成分を 含む、 前記 25. 〜32. いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター、 34. 外来プロモーターが CMVェンハンサーを含む、 前記 33. 記載の組換 えアデノウィルスベクター、
35. 外来プロモーターが CMVプロモーターである、 前記 34. 記載の組換 えアデノウィルスベクター、
36. 外来プロモーターが C AGプロモーターである、 前記 34. 記載の組換 えアデノウィルスベクター、
37. 外来プロモーターが RSVプロモーター又は S Raプロモーターである、 前記 33. 記載の組換えアデノウイルスベクター、
38. アデノウイルスがヒ トアデノウイルスであることを特徴とする、 前記 2 5. 〜37. いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、 る、 前記 38. 記載の組換えアデノウイルスベクター、
40. 以下の （1 2) 及び （1 3) の特徴を有する、 哺乳動物由来の細胞：
(1 2) アデノウイルスの E 1遺伝子及びタンパク質 I X遺伝子を発現する ；
(13) 前記 25. 〜39. いずれか記載の組換えアデノウイルスベクターを増 殖できる、
41. アデノウイルスのタンパク質 I X遺伝子が、 当該遺伝子の本来のプロモ 一ター以外の外来プロモーターにより発現制御されている、 前記 40. 記載の細 胞、
42. アデノウイルスの E 1遺伝子及ぴタンパク質 I X遺伝子以外の少なくと も 1つ以上のアデノウイルスの遺伝子をさらに発現する、 前記 40. 又は 4 1. 記載の細胞、
43. アデノウイルスの E 1遺伝子、 タンパク質 I X遺伝子、 及び E 2 A遺伝 子を発現する、 前記 42. 記載の細胞、
44. 前記 40. 〜43. いずれか記載の細胞を用いることを特徴とする、 前 記 25. 〜39. いずれか記載の組換えアデノウィルスベクターの製造方法、 45. 以下の （14) 及ぴ （1 5) の特徴を有する、 i n v i v o投与時に 炎症が軽減される組換えアデノウィルスベクター：
(14) アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子が欠失している ；
(1 5) アデノウイルスゲノムに、 アデノウイルス遺伝子の発現を誘導しない外 来プロモーターが挿入されている、
46. 以下の （16) 〜 （18) の特徴を有する、 前記 45. 記載の組換えァ デノウイノレスベタター：
(1 6) アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子が欠失している ；
(1 7) アデノウイルスゲノムのタンパク質 I X遺伝子を本来の位置に保持して いる ；
(1 8) アデノウイルスゲノムに、 タンパク質 I X遺伝子の発現を誘導しない外 来プロモーターが挿入されている、
47. アデノウィルスゲノムの E 1 A及ぴ E 1 B遺伝子欠失部位に、 外来プロ モーターを含む外来遺伝子が挿入されている、 前記 45. 又は 46. 記載の組換 えアデノウィルスべクター、
48. 外来プロモーターが CMVェンハンサーを含まないことを特徴とする、 前記 45. 〜47. いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター、
49. 外来プロモーターを含む外来遺伝子が左向きに挿入されている、 前記 4 5. 〜48. いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター、
50. 外来プロモーターが E F 1 αプロモーターである、 前記 45. 〜49. いずれか記載の組換えアデノウィルスべクター、
5 1. 以下の （1 9) 〜 （2 1) の特徴を有する、 i n v i v o投与時に炎 症が軽減される組換えアデノウイノレスベクター：
(1 9) アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子が欠失している ； (20) アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入され ている ；
(21) 外来プロモーターとアデノウイルス遺伝子との間に、 外来プロモーター によるアデノウィルス遺伝子の発現誘導を抑制する性質を有する塩基配列が挿入 されている、
52. アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子欠失部位に、 外来プロ モーターを含む外来遺伝子が挿入されている、 前記 51. 記載の組換えアデノウ ィノレスベタター、
53. 外来プロモーターが CMVェンハンサーを含むことを特徴とする、 前記 51. 又は 52. 記載の組換えアデノウイルスベクター、
54. 前記 1. 〜39. 及び前記 45. 〜53. より選択される組換えアデノ ウィルスベクターを有効成分として含有する、 i n V i V o投与時に炎症を軽 減するもしくは誘導しない医薬組成物、
55. 前記 1. 〜39. 及び前記 45. 〜53. より選択される組換えアデノ ウィルスベクターを哺乳動物に投与することからなる、 i n V i v o投与時の 炎症を軽減する方法、
56. 前記 1. 〜39. 及び前記 45. 〜53. より選択される組換えアデノ ウィルスベクターを哺乳動物に投与することからなる、 i n v i v o投与時の 炎症が軽減される遺伝子治療方法、
57. i n V i v o投与時に炎症を軽減するもしくは誘導しない医薬糸且成 物を製造するための前記 1.〜 39.及ぴ前記 45.〜53.より選択される組換え アデノウイルスベクターの使用、 ならびに
58. i n V i v o投与時に炎症を軽減するもしくは誘導しない遺伝子治 療用医薬組成物を製造するための前記 1.〜 39.及び前記 45.〜 53.より選択 される組換えアデノウィルスベクターの使用、 に関する。
図面の簡単な説明
図 1は実験に用いたアデノウィルスベクターの構造を示す模式図である。 図中、 CAGは CAGプロモーターを、 pAはポリ A配列を示し、 その上の矢印は転写の方向を 示す。 また、 Ad5 genomeはヒ トアデノウイルス 5型ゲノムを、 lacZは大腸菌 lacZ 遺伝子を、 Creはリコンビナーゼ Cre遺伝子を、 hGHはヒ ト成長ホルモン cDNAを示 す。
図 2は、 アデノウィルスベクター AxlCAHGHまたは Δ Ε2Α- CAHGHを尾静脈投与し た C57BL/6マゥスの血清 GPT値の経日変化の平均値を示すグラフである （一群 5 匹） 。 図中、 參は 1 X 10 9 PFU、 〇は 3 X 108 PFU、 ▲は 1 x 10。 PFUのアデノ ウィルスベクターを投与した群を示す。
なお、 実験は一群 5匹で行ったが、 AxlCAHGHの 1 x 10 9 PFU投与群ならびに Δ E2A- CAHGHの 3 x 10 ° PFU投与群において、 それぞれ各 1匹のマウスの血中 hGH濃 度が他の 4匹より明らかに低かった （10分の 1以下、 データ省略） ので、 これら 両群においては、 平均値の計算時にそれぞれのマウスの値を除き、 一群 4匹での GPT値の平均値を示した。
図 3は、 種々の構造のアデノウィルスベクターまたは UV不活化アデノウィルス 粒子を尾静脈投与した C57BL/6マウスの血清 GPT値の経日変化の平均値を示すダラ フである （一群 5匹） 。 図中、 參は 1 X 10。 PFU、 〇は 3 X 10 ° PFU、 ▲は 1 x 10 8 PFU, △は 3 X 10 7 PFUのベクターを投与した群を示す。 また、 Salineは生 理食塩水投与群、 UV- inactivatedは UV不活化アデノウィルス粒子を投与した群を 示す。
図 4はノザンブロットの結果を示す写真である。 A549細胞または HepG2細胞に、 以下に示した各アデノウイルスベクターを moi 100で感染させ、 24時間後に細胞 から RNAを調製した。 各々 の RNA 5 ;u gを電気泳動後、 ノザンブロットを行い、 (A) L3 RNA、 (B) IVa2 RNA、 (C) pIX RNAを検出した。 ゲル上の略号は、 Mock：モッ ク感染、 lwl： Axlwl、 CAwt： AxCAwt , HGH： AxlCAHGH, Δ Ε2Α： Δ Ε2Α- CAHGHを示 す。 ゲル右側の矢印と数字は、 目的のバンドの位置とそのサイズを示す。
また、 Ad5と記した右側 3レーンは陽性対照である。 E3遺伝子のみを欠失した アデノウイルス 5型野生株由来ウィルス （Ad5- dlX ： Saito I. et. al. , J. Virol. , Vol. 54， 711-719. (1985) ) を、 moi 10で H印 G2細胞に感染させ、 24時 間後に RNAを調製し、 図中に示した量の RNAを電気泳動に供した。
図 5はタンパク質 IX (pIX) 遺伝子のノザンプロッ トの結果を示す写真である。 AxCAwtもしくは AdCMVlacZを図中に示した moiで A549細胞に感染させ、 24時間後に 細胞から RNAを調製した。 各々の RNA 5 を電気泳動後、 ノザンブロットを行い、 pIX
RNAを検出した。 図中の略号は、 Mock ： モッタ感染、 CAG ： AxCAwt、 CMV ： AdCMVlacZを示す。
また、 Ad5と記した右側 3 レーンは陽性対照で、 Ad5-dlX (図 4参照） を moi 10 で A549細胞に感染させ、 24時間後に RNAを調製し、 図中に示した量の RNAを電気泳 動に供した。
図 6は、 pIX遺伝子のノザンブロットの結果を示す写真である。 図中に示した 各アデノウイルスベクターを moi 30または moi 100で A549細胞に感染ざせ、 24時 間後に RNAを回収した。 各々の RNA 5 μ gを用いてノザンブロットを行レ、、 pIX RNA を検出した。
図 7は、 異なるプロモーターを有するアデノウィルスベクターを尾静脈投与し た C57BL/6マウスの血清 GPT値の経日変化の平均値を示す （一群 5匹） 。 図中、 · は 1 X 10 " PFU、 〇は 3 X 10 " PFU、 ▲は 1 x 108 PFUのベクターを投与した群 を示す。
図 8は、 pIX融合タンパク質 （GST- pIX) に対する抗血清を用いたウェスタンブ ロッ トの結果を示す写真である。 Ad5- dlX (図 4参照） を moi 10で A549細胞に感 染させ、 約 1 日後に細胞を回収し、 SDSサンプルバッファーに溶解した。 この細 胞溶解液、 または精製ウィルス粒子 （7. 5 X 10 ' PFU) を還元条件下、 SDSポリア クリルアミ ド電気泳動 （SDS-PAGE) 後、 ウェスタンブロットを行い、 抗 pIX血清 #1 (Anti-pIX) または免疫前血清 （Pre- immune) で pIXを検出した。 図中の略号 は、 Mock：非感染細胞、 Ad5 ： Ad5- dlX感染細胞、 Virion：精製ウィルス粒子を示 す。 また、 図右側の数字は、 分子量マーカーの分子量を示す。 なお、 分子量マー カーとしては、 着色分子量マーカー （GIBC0 BRL社、 Cat. No. 10748-010) を用 いたが、 その分子量は非着色分子量マーカー （ニュー イングランド バイオラブ ズ社、 型番 P7702S) の移動度から補正した値を用いた。 また、 括弧付きの数値は、 非着色分子量マ一力一で補正していない値を用いた。
図 9は、 pIXのウェスタンブロッ トの結果を示す写真である。 A549細胞に、 AxCAwt (moi 100)、 Awlwl (moi 100)または Ad5- dlX (moi 10) を感染させ、 約 1 日後に細胞を回収し、 SDSサンプルバッファーに溶解した。 SDS- PAGE後、 ウェス タンプロッ トを行い pIXを検出した。 図中の略号は、 Ad5： Ad5-dlX感染細胞、 CAwt： AxCAwt感染細胞、 lwl： Awlwl 感染細胞、 Mock：非感染細胞を示す。 図右 側の数字は分子量を示す （図 8参照） 。
図 1 0は、 pIX再配置型アデノウイルスベクター、 pIX欠失型アデノウイルスべ クタ一などの構造を示す模式図である。 図中、 lacZは大腸菌 lacZ遺伝子の発現単 位を、 pIXはタンパク質 IX遺伝子を、 psiはパッケージングシグナルを、 CAGは CAG プロモーターを、 hGHはヒ ト成長ホルモン cDNAを、 pAはポリ A配列を示す。 矢印 は、 各々の遺伝子の転写方向を示す。
図 1 1は、 コスミ ドベクター pAx ApIXcwおよび pAx ApIXCAHGHの構築方法を示 す模式図である。 図中、 白抜きの箱はヒ トアデノウイルス 5型ゲノムを、 細線部 は大腸菌由来 DNA配列を示す。 制限酵素名上の数字は、 ヒ トアデノウイルス 5型 における各々の制限酵素認識部位の塩基番号を示す。 また、 ApRはアンピシリン 耐性遺伝子を、 oriは大腸菌複製オリジンを、 COSは λファージの COSサイ トを示 す。
図 1 2は、 pIX発現細胞株の pIX遺伝子のノザンブロットの結果を示す写真であ る。 pIX発現細胞株 4クローン （#2、 #5、 #6、 #10) を 30継代まで継代し、 5継代 ごとに細胞株から RNAを調製しノザンブロットを行った。 図中、 Pl、 P5、 P10、 P15、 P20、 P25、 P30は継代数を示す。 また、 左側 3レーンは、 陰性および陽性対 照である。 Mockはウィルス非感染 293細胞から調製した RNA、 8hrおよび 24hrは、 293細胞に Axlwlを moi 10で感染させ、 8時間後 （8hr) および 24時間後 （24hr) に調製した RNAを示す。
図 1 3は、 pIX発現細胞株の pIXのウェスタンブロットの結果を示す写真である。 pIX発現細胞株 4クローン （#2、 S5、 #6、 #10) を 25継代後、 SDSサンプルパッフ ァ一に溶解した。 SDS-PAGE後、 ウェスタンプロッ トを行い pIXを検出した。 右側 3レーンは、 陰性および陽性対照である。 詳細は図 1 2参照。 なお、 分子量マー カーとしては、 非着色分子量マーカー （ニュー イングランド バイオラブズ社、 型番 P7702S) を用いた。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明においては、 組換えアデノウイルスベクター を in vivo投与した際に生 じる炎症の原因が、 外来プロモーターに起因することを初めて明らかにした。 具 体的には、 本来発現しないはずのアデノウイルスゲノムの遺伝子が、 外来プロモ 一ターの作用により発現し、 そしてこの発現したアデノウイルス由来のタンパク 質が炎症の原因となることを初めて明らかにした。
従って、 in vivo投与時の炎症を軽減するためには、 外来プロモーターの作用 を受けないように、 組換えアデノウィルスベクターのゲノム構造を適宜改変すれ ば良いことは明らかである。 このように、 外来プロモーターの作用を受けないよ うに組換えアデノウイルスベクターのゲノム構造を改変することは、 当業者であ れば、 通常の遺伝子組換え技術を用いることにより行うことができる。
本発明においては、 以上のような外来プロモーターの作用を受けないように組 換えアデノウィルスベクターのゲノム構造を改変したものであれば、 いかなる構 造を有するものであっても、 本発明の組換えアデノウィルスベクターの範疇に含 まれる。
本発明の組換えアデノウイルスベクターの代表的な形態として、 以下の （1 ) 〜 （4 ) の特徴を有するものが挙げられる。
( 1 ) アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子が欠失している ；
( 2 ) アデノウィルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されて レヽる ；
( 3 ) 以下の （A) 及び Z又は （B ) の特徴を有する ；
(A) 外来プロモーターにより発現誘導を受けるアデノウィルスゲノムの遺伝子 力 正常な位置から外来プロモーターによる発現誘導を受けない位置に再配置さ れているか、 又は欠失している ； ( B ) 外来プロモーターにより発現誘導を受けるアデノウィルスゲノム遺伝子の プロモーターの塩基配列が、 外来プロモーターの作用を受けないように置換され ている ；
( 4 ) アデノウィルス野性株と同等の性質を有する正常なウィルス粒子を形成し ている。
ここで、 本発明の組換えアデノウィルスベクターを作製するために用いられる アデノウイルスは、 動物を自然宿主とするウィルスであり、 特にヒ トを宿主とす るヒ トアデノウイルスが好適に用いられ、 さらに好適にはヒ トアデノウイルス 2 型や 5型など C亜群のヒ トアデノウイルスが用いられる。 本明細書ではアデノウ ィルスゲノムでの遺伝子の位置を示すため、 マップ単位 （map units、 以後 m. u. と略す、 1 m. u.は約 360塩基対） を使用することがあるが、 その値はアデノウィ ルス 5型を基準にしたものを用いている。 当該アデノウィルスのゲノム構造は周 知であり、 例えばヒ トアデノウイルス 2型ゲノムの全塩基配列はジーンバンク (アクセス番号 J01949) に、 またヒ トアデノウイルス 5型ゲノムの全塩基配列は ジーンバンク （アクセス番号 M73260) に登録されている。
前記 （1 ) においてアデノウイルス E1A遺伝子および E1B遺伝子が欠失している とは、 両遺伝子の全てもしくは一部の塩基配列が存在しないことであり、 機能的 な E1Aタンパク質および E1Bタンパク質が産生されないような欠失であれば、 欠失 する範囲に特に制限はない。 また、 E1B遺伝子の一部と完全に重複する位置にタ ンパク質 IX遺伝子が存在するが、 通常 E1B遺伝子の欠失にはタンパク質 IX遺伝子 の欠失は含まれない。 E1Aおよび E1B遺伝子の欠失の例として、 アデノウイルス 5 型の 1· 3-9. 3 m. u.の欠失 （E1A遺伝子の全てと E1B遺伝子の大半を欠失； Trapnell B. C. , Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 12, 185 - 199. (1993) Elsevier Science Publishers B. V. ) カ挙げられる。 当該欠失は、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. , T. Maniatis ら編、 2版 (1989) ， Cold Spring Harbor Laboratory 等の基本書に基いて、 当業者ならば容易に行うことができる。
本発明において、 E1A遺伝子と E1B遺伝子とを合わせて、 単に E1遺伝子もしくは E1領域と呼ぶことがある。
前記 （2 ) において外来プロモーターとは、 アデノウイルスの本来のプロモー ター以外のプロモーターのことであり、 また外来遺伝子とは、 プロモーター、 タ ンパク質などをコードする遺伝子、 及びポリ A配列などから成る転写を行うため の塩基配列を指す。 当該外来遺伝子とは、 遺伝子治療を目的とする場合には、 通 常、 対象疾患を治療するためのタンパク質などを発現させる遺伝子を指す。 外来 遺伝子は、 市販されている種々の発現ベクターに所望のタンパク質をコードする 遺伝子を挿入することなどにより、 容易に作製することができる。 また、 作製さ れた外来遺伝子をアデノウィルスゲノムへ挿入することも、 文献等に記載された 公知の技術 (Graham F. し et. A1.， Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 8802-8806. (1994)、 および Miyake S. et. Al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, 1320-1324. (1996)など） に基づき容易に行うことができる。 なお、 外 来遺伝子は、 前記 E1遺伝子欠失部位に挿入されることが好ましい。
前記 （3 ) において、 外来プロモーターにより発現誘導を受けるアデノウィル スゲノムの遺伝子とは、 外来プロモーター中の特定の構成成分の作用により遺伝 子の転写が生じるような、 アデノウイルスゲノムの遺伝子を指す。 具体的には、 タンパク質 I X遺伝子、 タンパク質 IVa2遺伝子、 L1遺伝子が挙げられる。
前記 （3 ) の （A) においては、 このような外来プロモーターにより発現誘導 を受けるアデノウィルスゲノムの遺伝子を、 正常な位置から外来プロモーターに よる発現誘導を受けない位置に再配置するか、 又は当該遺伝子を欠失させること により、 in vivo投与時の当該遺伝子の発現を阻止することができる。 その具体 例として、 タンパク質 I X遺伝子が挙げられる。 これにより、 in vivo投与時に 炎症が軽減されるという、 本発明の目的を達成することができる。 なお、 前記に おいて遺伝子を欠失させた場合には、 正常なウィルス粒子を形成させるために、 組換えアデノウィルスベクターを増殖させる細胞において、 あらかじめ欠失させ た遺伝子を導入し、 発現させておく必要がある。
以上のような遺伝子の再配置及び欠失の具体例については後に詳しく述べる 、 基本的には、 種々の再配置又は欠失を施した組換えアデノウィルスベクターを作 製し、 実施例 5に記載の in vivo投与時の炎症の有無の検討や、 実施例 6に記載 のノザンプロット解析等を行うことにより、 どのような再配置や欠失であれば本 発明の目的にかなうものであるかを評価することがでぎる。 前記 （3 ) の （B ) における遺伝子の具体例としては、 M L P (Major Late Promoter) 及び 又は IVa2遺伝子プロモーターが挙げられる。 これらアデノウィ ルスゲノムのプロモーターの塩基配列を、 本来の機能を損なわない範囲で外来プ 口モーターの作用を受けないように置換することにより、 前記アデノウィルスゲ ノムのプロモーターの支配下にある遺伝子の in vivo投与時の発現を阻止するこ とができる。 これにより、 in vivo投与時に炎症が軽減されるという、 本発明の 目的を達成することができる。 なお、 具体的な置換等に関しては、 後述の実施例 を参考にして当業者であれば適宜行うことができる。すなわち、 種々の置換を施 した組換えアデノウイルスベクターを作製し、 実施例 5に記載の in vivo投与時 の炎症の有無の検討や、 実施例 6に記載のノザンブロット解析等を行うことによ り、 如何なる置換であれば本発明の目的にかなうものであるかを評価することが できる。
以上の （3 ) の （A) 及び （B ) に記載のアデノウイルス遺伝子の再配置、 欠 失および置換の具体的な操作は、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. , T. Maniatis ら編、 第 2版 (1989) , Cold Spring Harbor Laboratory 等の基本書 や、 公知の組換えアデノウイルス作製技術 （Graham F. L. et. Al. , Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, Vol. 91, 8802—8806. (1994)、 および Miyake S. et. Al. , Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93， 1320-1324. (1996)など) に基いて、 当業者な らば容易に行うことができる。
前記 （4 ) においてアデノウイルス野性株と同等の性質を有するとは、 タンパ ク質等のウィルス粒子の構成成分の比率やウィルス粒子の物理化学的性質、 なら びに細胞への感染性を保持するという観点において、 野生株とほぼ同じ性質を有 することを言う。
以上のような本発明の組換えアデノウィルスベクターにおいては、 前記 E1A及 び E1B遺伝子以外の少なくとも一つのアデノウィルスゲノムの遺伝子の全部又は 一部を、 さらに欠失させることも可能である。 具体的には、 E3遺伝子、 E2A遺伝 子、 及び Z又は E4遺伝子の、 全部又は一部を欠失させることが可能である。 ここ で E4遺伝子を欠失させる場合には、 E4遺伝子の少なくとも 1つの 0RFを保持した 欠失が好ましい。 特に、 少なくとも 0RF3を保持した欠失が好ましい。 これらの欠 失に関しては後に詳述する。
本発明の組換えアデノウイルスベクターの好適な形態としては、 以下の （5 ) 〜 （8 ) の特徴を有するものが挙げられる。
( 5 ) アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子が欠失している ； ( 6 ) アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が揷入されて いる ；
( 7 ) アデノウイルスゲノムのタンパク質 I X遺伝子が、 正常な位置から外来プ 口モーターによる発現誘導を受けない位置に再配置されている ；
( 8 ) アデノウイルス野性株と同等のタンパク質 I Xを含有し、 正常なウィルス 粒子を形成している。
以下、 これらの特徴を有する組換えアデノウイルスベクターを例にとり、 本発 明を詳しく説明する。
前記 （6 ) における外来遺伝子は、 E1遺伝子欠失部位に挿入されていることが 好ましい。 さらに好ましくは、 ウィルスゲノムの 1. 3-11. 2 m. u.が欠失した部位、 すなわち E1遺伝子の全ておよびタンパク質 IX遺伝子が欠失 （再配置による） した 部位に、 外来遺伝子が挿入されていることが望ましい。
前記 （7 ) のアデノウイルスタンパク質 IX (以下、 pIXと呼ぶこともある） は、 アデノウイルス粒子のキヤプシド中の 9個群へキソン （the groups of nine hexons) を構成する少量の成分であり、 ビリオンの熱安定性、 およびパッケージ ングできるウィルスゲノムのサイズに関与している。 タンパク質 IXはアデノウィ ルスの増殖に必須の成分ではないが、 タンパク質 IXを欠失したビリオンは熱に対 して不安定となり （Colby W. W. et. al. , J. Virol. , Vol. 39， 977-980. (1981) ) 、 また野生株の 90%のサイズのゲノム DNAしかパッケージングできない (Ghosh-Choudhury G. et. al. , EMB0 J. , Vol. 6， 1733-1739. (1987) ) 。 従つ て、 正常のウィルス粒子を形成するためにはタンパク質 IXが必要である。
前記 （7 ) において、 アデノウイルスゲノムのタンパク質 IX遺伝子が正常な位 置から外来プロモーターによる発現誘導を受けない位置に再配置されていること とは、 野生型アデノウィルスゲノムにおいてタンパク質 IX遺伝子が本来存在する 位置、 すなわちヒ トアデノウイルス 5型ゲノムにおいては 9. 7-11. 2 m. u.の位置 (Maat J. et. al. , Gene, Vol. 10, 27-38. (1980) ) にはタンパク質 IX遺伝子 が存在せず、 アデノウィルスゲノムの他の任意の位置にタンパク質 IX遺伝子が存 在することである。 また、 タンパク質 IX遺伝子が外来プロモーターによる発現誘 導を受けないとは、 外来プロモーターによりタンパク質 IX遺伝子の転写が誘導さ れないことを示す。 以後、 このタンパク質 IX遺伝子が再配置されたアデノウィル スベクターを、 「タンパク質 IX再配置型アデノウイルスベクター」 と呼ぶことも める。
前記 （7 ) において、 タンパク質 IX遺伝子を再配置する位置としては、 タンパ ク質 IX遺伝子が外来プロモーターによる発現誘導を受けず、 かつベクターの増殖 サイクルにおいてタンパク質 IXの発現が著しく抑制されない限り、 特に制限はな レ、。 しかし、 外来プロモーターから十数 kb以上離れた位置で、 しかも外来遺伝子 のクローニングが容易な位置に再配置することが望ましい。 そのような位置の好 適な例としては、 外来プロモーターから 18kb以上離れた位置が挙げられ、 その具 体例としては、 アデノウイルスゲノムの L3遺伝子と E2A遺伝子との間 （特開平 8- 308585) の位置が挙げられる。 また、 別の好適な例としては、 外来プロモーター から 24kb以上離れた位置が挙げられ、 その具体例としては、 アデノウイルスゲノ ムの E3遺伝子の欠失部位が挙げられる。 さらに、 別の好適な例としては、 外来プ 口モーターから 30kb以上離れた位置が挙げられ、 その具体例としては、 アデノウ ィルスゲノムの E4遺伝子の上流域と 3 ' 側 ITR (逆方向反復配列） との間の位置 (Saito I. et. al.， J. Virol. , Vol. 54, 711-719. (1985) ) が挙げられる。 タンパク質 IX遺伝子の正常な位置からの欠失、 及び、 前記の位置への再配置は、 通常の遺伝子組換え技術や前述した公知の組換えアデノウィルス作製技術に基づ き容易に行うことができる。 また、 作製されたタンパク質 IX再配置型アデノウィ ルスベクターが本発明の目的にかなうものであるかどうかは、 実施例 5に記載の in vivo投与時の炎症の有無の検討や、 実施例 6に記載のノザンブロット解析等 を行うことにより、 評価することができる。
前記 （8 ) において、 アデノウイルス野生株と同等のタンパク質 IXを含有する ウィルス粒子とは、 野生型アデノウィルス粒子に含まれるタンパク質 IXとほぼ同 じ比率のタンパク質 IXを含むアデノウィルス粒子のことである。 また正常のウイ ルス粒子とは、 細胞への感染性を保持し、 熱安定性およびパッケージングできる ゲノム DNAのサイズなどが、 野生型アデノウィルスとほぼ同様の性質を示すアデ ノウィルス粒子のことである。
前記タンパク質 IX再配置型アデノウィルスベクターにおいては、 E1A及び E1B遺 伝子を欠失させ、 タンパク質 IX遺伝子を再配置し、 さらに、 それ以外のアデノウ ィルスゲノムの遺伝子の全部又は一部を欠失させることができる。 具体的には、 E3遺伝子、 E2A遺伝子、 及び Z又は E4遺伝子の全部又は一部を欠失させることな どが可能である。 ここで 「全部又は一部」 の長さとしては、 機能的なウィルスタ ンパク質が産生されないような欠失であれば、 欠失する範囲に特に制限はない。 また、 前記 E3遺伝子、 E2A遺伝子、 及び E4遺伝子等のアデノウイルスゲノムの塩 基配列は、 例えば文献 （The Adenoviruses, Ginsberg H. S.編集、 1984, Plenum Press, New York ) に記載されており、 当業者であれば、 これらの遺伝子をアデ ノウィルスベクターから欠失させる操作を容易に行うことができる。
前記遺伝子のうち、 E3遺伝子の全部又は一部を欠失させることにより、 より長 いサイズの外来遺伝子の挿入が可能となる。 当該 E3遺伝子の全部または一部を欠 失させた場合は、 組換えアデノウイルスベクターを増殖させる細胞において、 当 該 E3遺伝子を発現させる必要ない。 一方、 E2A遺伝子や E4遺伝子の全部又は一部 を欠失させた場合は、 正常なウィルス粒子を形成させるために、 組換えアデノウ ィルスベクターを増殖させる細胞において、 あらかじめ欠失させた遺伝子を導入 し、 発現させておく必要がある。
E4遺伝子を欠失させる場合には、 E4遺伝子の少なくとも 1つの 0RF (オープン • リーディング ' フレーム） を保持することが望ましい。 特に、 E4遺伝子の 0RF3 を保持していることが望ましい。 5型や 2型のアデノウイルスにおいて、 E4遺伝 子には転写後の RNAのスプライシングの違いにより 7種類のポリべプチドがコ一 ドされており、 0RF3はそのポリペプチドの一^ ^でぁる。 0RF3は、 アデノウイルス の増殖サイクルにおいて、 ウィルス遺伝子の発現ならびに DNA複製を促進する機 能を有している。 一方、 後述する CMVプロモーターなどの一部の外来プロモータ 一が in vivoでそのプロモーター活性を長期間維持するには、 E4遺伝子の 0RF3が 必要だとされている （Luskv M. et al. , J. Virol. , Vol. 73, 8308 - 8319. (1999)、 およぴ Yew N. S. et. al. , Hum. Gene Ther. , Vol. 10， 1833—1843.
(1999) ) 。 以上の理由により、 当該 0RF3を保持することが望ましい。
本発明のタンパク質 IX再配置型アデノウイルスベクターを生産する細胞株は、 ヒ ト胎児腎由来 293細胞 （ATCC CRL-1573) のように、 E1遺伝子を発現し組換えァ デノウィルスべクタ一の生産に適した細胞株であれば特に制限はない。 ただし、 細胞株の染色体にインテグレーションされたアデノウィルス DNAとベクターのゲ ノムとの間に相同な DNA配列が存在すると、 相同組換えにより目的としないアデ ノウィルスが生成する可能性がある。 そこで、 当該アデノウイルスベクターの生 産には、 ベクターのゲノムと細胞株の染色体との間に重複する DNA配列が極力存 在しないよう、 E1遺伝子の必要最低限の部分のみを含む細胞株を使用するのが好 ましい。 その例として、 ヒ ト胎児網膜 (human embryonic retina： HER) 細胞由 来の PER細胞株 (Fallaux F. J. et. al.， Hum. Gene Ther.， Vol. 9， 1909-1917.
(1998) ) が挙げられる。 また、 El遺伝子に加え、 必要に応じて E2A遺伝子など他 のアデノウィルス遺伝子を発現する細胞株も用いることができる。 当該他のアデ ノウィルス遺伝子を発現する細胞株は、 例えば適当な発現ベクターに当該アデノ ウィルス遺伝子を組み込んで作製した発現ベクターを、 常法により前記 E1遺伝子 発現細胞に導入することにより、 作製することができる。
本発明の組換えアデノウィルスベクターの他の好適な形態としては、 アデノゥ ィルスゲノムからは E1遺伝子およびタンパク質 IX遺伝子が欠失しているが、 当該 ウィルス粒子には正常量のタンパク質 IXを含むアデノウィルスベクターが挙げら れる。 すなわち、 以下の （9 ) 〜 （11) の特徴を有する組換えアデノウイルスべ クタ一が挙げられる。
( 9 ) アデノウイルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子、 ならびにタンパク質 I
X遺伝子が欠失している ；
(10) アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されて いる ；
(11) アデノウイルス野生株と同等のタンパク質 I Xを含有し、 正常なウィルス 粒子を形成している。
以後、 このべクタ一を 「タンパク質 IX欠失型アデノウイルスベクター」 と呼ぶ こともある。
前記 （9 ) において、 タンパク質 IX遺伝子を欠失させる範囲に特に制限はなく、 タンパク質 IXの部分べプチドゃタンパク質 IX遺伝子に由来するぺプチドが発現し ないような欠失であれば、 特に制限されなレ、。 少なくともタンパク質 IX遺伝子の コーディング領域は全て欠失させることが好ましい。 さらに、 ウィルスゲノムの 1. 3-11. 2 m. u.を欠失させ、 E1遺伝子およびタンパク質 IX遺伝子の全てを欠失さ せるのがより好ましい。 これらの欠失は、 通常の遺伝子組換え技術により容易に 行うことができる。
なお、 タンパク質 IX欠失型アデノウィルスベクターを生産するためにはタンパ ク質 IXを発現する細胞株が必要であるが、 当該細胞株については後述する。
前記 （10) における外来遺伝子は、 E1遺伝子欠失部位に挿入されていることが 好ましい。 さらに好ましくは、 ウィルスゲノムの 1. 3- 11. 2 m. u.が欠失した部位、 すなわち E1遺伝子の全ておよびタンパク質 IX遺伝子が欠失した部位に、 外来遺伝 子が挿入されていることが望ましい。 また、 前記タンパク質 IX再配置型アデノウ ィルスべクタ一と同様に、 タンパク質 IX欠失型アデノウイルスベクターにおいて もアデノウィルス E3遺伝子の全部又は一部を欠失させることが可能であるが、 こ の E3遺伝子欠失部位に、 外来遺伝子を挿入することも可能である。
前記 （11) において、 アデノウイルス野生株と同等のタンパク質 IXを含有する ウィルス粒子とは、 野生型アデノウィルス粒子に含まれるタンパク質 IXとほぼ同 じ比率のタンパク質 IXを含むアデノウイルス粒子のことである。 また正常のウイ ルス粒子とは、 細胞への感染性を保持し、 熱安定性およびパッケージングできる ゲノム DNAのサイズなどが、 野生型アデノウィルスとほぼ同様の性質を示すアデ ノウィルス粒子のことである。 当該ウィルス粒子は、 タンパク質 IX欠失型アデノ ウィルスベクターを、 タンパク質 Πを発現する細胞株に感染させ、 増殖させるこ とにより、 作製することができる。
本発明のタンパク質 IX欠失型アデノウイノレスベクターは、 E1A及び E1B遺伝子、 ならびにタンパク質 IX遺伝子を欠失させ、 さらに、 それ以外のアデノウイルスゲ ノムの遺伝子の全部又は一部を欠失させることができる。 具体的な欠失は、 前述 のタンパク質 IX再配置型アデノウィルスベクターの場合と同様であり、 E3遺伝子、 E2A遺伝子、 及び Z又は E4遺伝子の全部又は一部を欠失させることなどが可能で ある。 ここで 「全部又は一部」 の長さとしては、 機能的なウィルスタンパク質が 産生されないような欠失であれば、 欠失する範囲に特に制限はない。 また、 前記 E3遺伝子、 E2A遺伝子、 及び E4遺伝子等のアデノウイルスゲノムの塩基配列は、 例えば文献 (The Adenoviruses, Ginsberg H. S.編集、 1984, Plenum Press, New York ) に記載されており、 当業者であれば、 これらの遺伝子をアデノウィ ルスベクターから欠失させる操作を容易に行うことができる。
前記遺伝子のうち、 E3遺伝子の全部又は一部を欠失させることにより、 より長 いサイズの外来遺伝子の挿入が可能となる。 当該 E3遺伝子を欠失させた場合は、 組換えアデノウイルスベクターを増殖させる細胞において、 当該 E3遺伝子を発現 させる必要はない。 一方、 E2A遺伝子や E4遺伝子の全部又は一部を欠失させた場 合は、 組換えアデノウイルスベクターを増殖させる細胞において、 あらかじめ欠 失させた遺伝子を導入し、 発現させておく必要がある。
E4遺伝子を欠失させる場合には、 E4遺伝子の少なくとも 1つの 0RFを保持する ことが望ましい。 特に、 E4遺伝子の 0RF3を保持していることが望ましい。 0RF3を 保持する利点については、 前記タンパク質 IX再配置型アデノウィルスベクターの 項を参照されたい。
本発明のタンパク質 IX再配置型アデノウィルスベクターおよびタンパク質 IX欠 失型アデノウィルスベクターで代表される、 本発明の組換えアデノウィルスべク ターは、 治療用遺伝子などの目的の外来遺伝子を発現させるための外来プロモー ターが必要である。 外来プロモーターは、 哺乳動物細胞で機能し目的の遺伝子を 所望する量発現させることができるプロモーターであれば、 動物ウィルス由来プ 口モーターや哺乳動物細胞由来プロモーター、 または両者のハイブリッドプロモ 一ターなど、 特に制限なく用いることができる。 外来プロモーターの例としては、 多くの場合、 治療用遺伝子の発現量は高いほど望ましいため、 CMVプロモーター (Foecking M. K. et. al. Gene, Vol. 45, 101-105. (1986) ) や CAGプロモータ 一 (Niwa H. et. Al. , Gene, Vol. 108, 193-200. (1991) ) など、 特に高発現と されているプロモーターを用いるのが好ましい。 CMVプロモーターはヒ トサイ ト メガロウイノレス （CMV) の immediate early (IE) 遺伝子のェンハンサーおよびプ 口モーターから成り、 CAGプロモーターは、 CMVの IEェンハンサー、 ニヮトリ ]3— ァクチンプロモーター、 ゥサギ ]3—グロビンのスプライスァクセプターおよびポ リ A配列からなる。 このように、 CMVプロモーター及び CAGプロモーターは、 共に CMVの IE遺伝子のェンハンサー （Boshart M. et. al.， Cell, Vol. 41, 521-530. (1985) ) を含む。 本明細書においては、 この CMVの IE遺伝子のェンハンサーを、 単に 「CMVェンハンサー」 と称することもある。
後述の実施例で示されるように、 CMVェンハンサーを有するプロモーターであ る CMVプロモーター及び CAGプロモーターのいずれを用いた場合にも、 タンパク質 IX遺伝子の発現誘導が認められた。 一方、 CMVェンハンサーを含まないプロモー ターである EF-l aプロモーターを用いた場合は、 タンパク質 IX遺伝子の発現誘導 は認められなかった。 従って、 前記 CMVプロモーター及び CAGプロモーターが共通 に有している CMVェンハンサ一が、 タンパク質 IX等のアデノウィルス遺伝子の発 現誘導を引き起こす原因であると理解される。 すなわち、 CMVェンハンサ一がタ ンパク質 IX遺伝子等のプロモーターに作用し、 その結果、 タンパク質 IX等が発現 すると理角军される。
プロモーター活性の強さから、 現在、 臨床開発されつつあるほとんどのアデノ ウィルスベクターにおいては、 CMVプロモーター若しくは CMVェンハンサーを含む ハイブリッドプロモーターが用いられている。 従って、 臨床への適用に当たり、 in vivo投与時に炎症が軽減される本発明の組換えアデノウィルスベクターが、 極めて有効に用いられる。
なお、 上記の CMVェンハンサーを含むプロモーターのみならず、 同じウィルス 性のプロモーターである SV40プロモーター、 ラウス肉腫ウィルス （RSV) プロモ 一ター （Takebe Y. et. al. , Mol. Cell Biol. , Vol. 8, 466-472. (1988) ) な ども、 用いることができる。
本発明のアデノウィルスベクターに挿入する外来遺伝子には特に制限はなく、 サイト力イン、 酵素、 レセプター、 ウィルスの構造タンパク質などのタンパク質 をコードする遺伝子や、 アンチセンス RNAゃリボザィムをコードする遺伝子など を用いることができる。
前記本発明のタンパク質 IX欠失型アデノウイルスベクターは、 ヒ ト胎児腎由来 293細胞のように El遺伝子は発現するがタンパク質 IXは発現しない細胞株でも増 殖することができる。 しかし、 このようなタンパク質 IXを発現しない細胞株で製 造したタンパク質 IX欠失型アデノウィルスベクターは、 ウィルス粒子に所望の量 のタンパク質 IXが含まれないため、 本発明で目的とする性質を有するアデノウイ ルスベクターは得られない。 従って、 本発明のタンパク質 IX欠失型アデノウィル スベクターを製造するためには、 少なくとも E1遺伝子およびタンパク質 IXを発現 する特別な細胞株が必要である。 すなわち本発明のタンパク質 IX欠失型アデノゥ ィルスベクターを増殖させる際には、 以下の （12) 及び （13) の特徴を有する哺 乳動物由来の細胞が用いられる。
(12) アデノウイルスの E1遺伝子及びタンパク質 IX遺伝子を発現する ；
(13) タンパク質 IX欠失型アデノウィルスベクターを増殖できる。
タンパク質 IXを発現する細胞株の作製方法は、 ヒ ト胎児腎由来 293細胞 （ATCC CRL-1573) のように既に E1遺伝子を発現している細胞株をさらにタンパク質 IX遺 伝子を含む発現べクタ一で形質転換してもよいし、 E1遺伝子を発現していなレ、細 胞を E1遺伝子おょぴタンパク質 IX遺伝子を含む発現べクターで順次あるいは同時 に形質転換してもよい。 ただし、 1. 3- 11. 2 m. u.の E1A、 E1B、 タンパク質 IX遺伝 子全てを含む DNA断片で細胞を形質転換してもタンパク質 IXを発現する細胞株は 得られないので、 タンパク質 IX遺伝子の上流に適当なプロモーターを付加した DNA断片で細胞を形質転換する必要がある。 なぜならば、 293細胞には、 タンパク 質 IX遺伝子の全長を含むヒ トァデノウィルス 5型の 1-4344番目の塩基が挿入され ている （Louis N. , Virolgy, Vol. 233, 423-429. (1997) ) にもかかわらず、 タ ンパク質 IXはほとんど発現していなレ、 （Krougliak V. . et al.， Hum. Gene Ther. , Vol. 6， 1575-1586. (1995) ) ことや、 また他の細胞株でも、 タンパク質 IX遺伝 子の全長を含む E1遺伝子が挿入されているにもかかわらずタンパク質 IXはほとん ど発現してない （Fallaux F. J. et al. , Hum. Gene Ther. , Vol. 9， 1909-1917. (1998) ) ことなどが報告されているからである。 これらの細胞株でタンパク質 IX が発現していない理由は、 タンパク質 IX遺伝子のプロモーターを貫いて E1B遺伝 子の転写が起こっている時は、 タンパク質 IX遺伝子の転写が抑制される （Vales L. D. , Genes Dev. , Vol. 3, 49-59. (1989) ) ためであると考えられている。 本発明のタンパク質 IXを発現する細胞株において、 タンパク質 IXの発現に用い るプロモーターには特に制限はなく、 外来プロモーターであってもタンパク質 IX 遺伝子の本来のプロモーターでもよい。 外来プロモーターを用いる場合は、 目的 の細胞株が樹立 ·維持でき、 さらには当該細胞株で増殖 ·生産したタンパク質 IX 欠失型アデノウィルスベクターが正常量のタンパク質 IXを含むウィルス粒子を形 成する限りは、 恒常的に発現するプロモーターであってもよいし、 また誘導型の プロモーターでもよレ、。 恒常型プロモーターの例として、 CAGプロモーター、 CMV プロモーター、 EF-1 αプロモーター、 SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 RSVプロモーター、 アデノウイルス主要後期プロモーター （MLP) などが挙げられ る。 また、 誘導型のプロモーターの例としては、 メタ口チォネイン遺伝子プロモ 一ター、 マウス乳ガンウィルス （MMTV) プロモーターなどが挙げられる。 さらに、 テトラサイタリンゃェクダイソンにより恒常型プロモーターの発現が誘導される システムを用いてもよい。 以上のようなプロモーターを有する発現ベクター及び その発現誘導システムは、 いずれも市販されているか、 あるいは公的な機関から 入手できる。 市販されている場合は、 例えば Invitrogen社、 Clontech社などか ら購入することができる。
以上のようなタンパク質 IXを発現する細胞株は、 タンパク質 IX遺伝子のコーデ イング領域を PCR法によりクローユングし、 これを市販の発現ベクター （例えば pcDNA3. 1 (+)、 Invitrogen社） ) に挿入した後に、 常法によりヒ ト胎児腎由来 293 細胞に導入し、 発現させること等により、 作製することができる。 詳しくは後述 の実施例等を参照されたい。
さらに、 アデノウィルス E1遺伝子及びタンパク質 IX遺伝子以外のアデノウイノレ スの遺伝子をさらに欠失させた、 タンパク質 IX欠失型アデノウィルスベクターを 増殖させる場合には、 当該欠失させた遺伝子をさらに発現する細胞株が必要とな る場合がある。 例えば、 アデノウイルスの E1遺伝子、 タンパク質 IX遺伝子、 及び E2A遺伝子を欠失させた場合には、 これらの 3つの遺伝子を発現する細胞株が用 レヽられる。 E2A遺伝子は、 前記タンパク質 IX遺伝子と同様の手法にて細胞内に導 入 ·発現させることができる。
以上のような細胞株を用いて組換えアデノウィルスベクターを製造する方法は 当業者に周知の手法であり、 例えば C0S-TPC法 (Miyake S. et. Al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , Vol. 93, 1320-1324. (1996) ) などを用いて製造することができる。 以上、 本発明の組換えアデノウイルスベクターの代表的な形態として、 前記 ( 1 ) 〜 （4 ) の特徴を有する組換えアデノウイルスベクターを挙げ、 その好ま しい形態として、 タンパク質 IX再配置型アデノウイルスベクター及びタンパク質 IX欠失型アデノウィルスベクターを例にとり説明した。 以上のような組換えアデ ノウィルスベクター以外の他の形態としては、 外来プロモーター自身を、 アデノ ウィルス遺伝子の発現を誘導しない形に改変したり、 または、 アデノウイルス遺 伝子の発現を誘導しないような外来プロモーターを使用した組換えアデノウィル スベクターが挙げられる。 すなわち本発明の組換えアデノウイルスベクターの他 の形態として、 以下の （14) 及び（15)の特徴を有する組換えアデノウイルスべク ターが挙げられる。
(14)アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子が欠失している ；
(15)アデノウィルスゲノムに、 アデノウィルス遺伝子の発現を誘導しない外来プ 口モーターが挿入されている。
ここで 「アデノウイルス遺伝子の発現を誘導しない外来プロモーター」 とは、 少なくともタンパク質 IX遺伝子の発現を誘導しない外来プロモーターであれば、 如何なるプロモーターであっても良い。 このような外来プロモーターを用いた場 合は、 タンパク質 IX遺伝子は、 前記のような再配置 ·欠失を行う必要は無く、 ァ デノウィルスゲノム中の本来の位置に保持されていれば良い。 どのような外来プ 口モーターであればタンパク質 IXの発現を誘導しないかに関しては、 種々の外来 プロモーターを含む外来遺伝子を挿入した組換えアデノウィルスベクターを作製 し、 例えば実施例 5に記載の in vivo投与時の炎症の有無の検討や、 実施例 6に 記載のノザンプロット解析等を行うことにより、 評価することができる。 当該外 来プロモーターは、 少なくとも CMVェンハンサーを含まないものであり、 具体的 には、 EF - l etプロモーター （Kim D. W. et. al. Gene, Vol. 91, 217-223. (1990) ) 等が挙げられる。 なお、 当該 EF-1ひプロモーターがタンパク質 IXの発現 を誘導しないこと、 そして炎症を誘導しないことに関しては、 後述の実施例 8及 び 9を参照されたい。 さらに、 当該 EF-Ι αプロモーター等のタンパク質 IXの発現を誘導しない外来プ 口モーターを含む発現単位は、 左向き （E1遺伝子の転写方向の逆向き） に挿入さ れていることが望ましい。 なぜならば、 発現単位を右向きに挿入した場合、 外来 プロモーターからの転写が一部正規の部位で終了せず、 タンパク質 IX遺伝子まで 転写されることが懸念されるからである。
さらに、 本発明の組換えアデノウイルスベクターの他の一つの形態として、 以 下の （19) 〜（21)の特徴を有する組換えアデノウイルスベクターが挙げられる。
(19)アデノウィルスゲノムの E 1 A及ぴ E 1 B遺伝子が欠失している ；
(20)アデノウイルスゲノムに外来プロモータ一を含む外来遺伝子が挿入されてい る ；
(21)外来プロモーターとアデノウィルス遺伝子との間に、 外来プロモーターによ るアデノウィルス遺伝子の発現誘導を抑制する性質を有する塩基配列が挿入され ている。
ここで 「外来プロモーターによるアデノウィルス遺伝子の発現誘導を抑制する 性質を有する塩基配列」 とは、 外来プロモーター内に存在するェンハンサ一がァ デノウィルス遺伝子のプロモーターを活性化するのを抑制する作用を持つ DNA配 列のことを言う。 その例として、 当初ショウジョバエで発見された 「scs」 や 「 ダ^ァ」 などに代表されるインシュレーター （insulators) が挙げられる。 ィ ンシュレーターとは、 ェンハンサ一とプロモーターとの間に位置するとき、 ェン ハンサーによるプロモーターの活性化を阻止する DNA配列のことである （Chung J. C. et. al.， Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, 575-580. (1997)および Bell A. C, et. al. , Curr. Opin. Genet. Dev. , Vol. 9, 191-198. (1999) ) 。 従って、 El遺伝子欠失部に挿入した外来遺伝子 （ェンハンサー /プロモーター を含む） の右側 （MLP側） にインシュレーターを挿入したアデノウイルスベクタ 一は、 タンパク質 IX遺伝子がアデノウイルスゲノムの本来の位置に存在しても、 タンパク質 IXをはじめとするアデノウィルスタンパク質が発現せず、 炎症も誘導 しない。
インシュレーターの具体例としては、 前述した 「 ■?」 や 「 ァ ダ」 以外に、 二 ヮトリ ]3—グロビン遺伝子座の 5'HS4部位の約 1. 2kbの DNA断片 （Chung J. C. et. al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, 575-580. (1997) ) ゃヒ ト T細胞 レセプター α / δ遺伝子座の ー 7 (Beli A. C, et. al.， Curr. Op in. Genet.
Dev. , Vol. 9， 191-198. (1999) ) などが挙げられる。 本発明のアデノウイルス ベクターに挿入するインシュレーターには特に制限はなく、 外来ェンハンサー プロモーターがアデノウィルス遺伝子発現を誘導しないような作用を持つインシ ユレ一ターであれば、 その由来、 用いる DNA断片のサイズ等に制限はない。 イン シュレーターを挿入したアデノウィルスベクターとして、 前述したニヮトリ — グロビンインシュレーターと誘導型プロモーターとを挿入したアデノウィルスべ ク タ一 ( Steinwaerder D. S. et. al. , bene Ther.， Vol. 7, 556 - 567. (2000) ) や、 ゥシ成長ホルモンの転写終了シグナル （transcription stop signal) 内のインシュレーターと糸且織特異的プロモーターとを挿入したアデノゥ ィルスベクター （Vassux G. et. al.， Gene Ther.， Vol. 6， 1192—1197. (1999) ) などが報告されている。 し力 し、 両報告とも、 外来ェンハンサー プロ モーターによるアデノウィルス遺伝子発現を抑制するのが目的ではなく、 アデノ ウィルスのェンハンサ一により外来プロモーターが活性化されるのを抑制するこ とが目的である。 従って、 両報告のアデノウイルスベクターにおいて、 外来ェン ハンサー zプロモーターからのアデノウィルス遺伝子発現が抑制されている証拠 は無く、 アデノウィルス遺伝子の発現と炎症の誘導を抑制するためにインシュレ 一ターを挿入した本発明と両報告とは本質的に異なるものである。
次に、 本発明の組換えアデノウイルスベクターの発明を完成するに至った経緯 にっき説明する。 すなわち、 本発明の根幹をなす発見、 すなわち第一世代アデノ ウィルスベクターで炎症が起きる原因は外来プロモーターによるアデノウィルス 遺伝子の発現誘導に起因する、 との発見に至った経緯について説明する。
本明細書において第一世代アデノウィルスベクターとは、 アデノウィルス E1遺 伝子を欠失した非増殖型アデノウイルスベクターのことを言う。 第一世代アデノ ウィルスベクターは、 293細胞のように E1遺伝子を発現している細胞株でのみ増 殖可能である。 なお、 第一世代アデノウイルスベクターにおいて E3遺伝子の欠失 は任意である。
「従来の技術」 の項でも述べたが、 「第一世代アデノウイルスベクターで炎症 が起こる原因は、 アデノウィルス初期遺伝子である E2A遺伝子の発現が引き金と なる」 との従来の仮説を検証するため、 本発明者らも E2A遺伝子を欠失したアデ ノウィルスベクターを作製した。 本発明者らの E2A欠損アデノウィルスベクター の作製法の詳細は特開平 8- 308585公報に開示しているので、 本明細書では作製法 の概略のみを以下に説明する。 まず、 アデノウイルスし 3遺伝子と E2A遺伝子との 間 （61. 5 m. u. ) および E3遺伝子の欠失部位 （78. 0 m. u. ) のニケ所に、 P1ファー ジのリコンビナーゼ Creの認識配列である ΙοχΡ配列 （Abremski K. et. al. , J. Biol. Chem.， Vol. 259, 1509-1514. (1984) 、 お よ び Hoess R. H. et. al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81， 1026-1029. (1984) ) を揷入した 第一世代アデノ ウイルスベクター （図 1、 Ax2LD3LCAHGH) を作製した。 この Ax2LD3LCAHGHとリコンビナーゼ Cre発現第一世代アデノウィルスべクター （図 1、 AxCANCre) とを 293細胞に同時感染することにより、 二つの ΙοχΡ配列に挟まれた E2A遺伝子および L4遺伝子が除かれた E2A欠損アデノウィルスベクター （図 1、 Δ E2A-CAHGH) を生成させた。 次いで、 塩化セシウムを用いた密度勾配超遠心法に より、 各ウィルスをそれぞれのウィルス粒子の比重に応じて分離し、 E2A欠損ァ デノウィルスベクターを 97〜98%の純度で精製した。 なお、 この E2A欠損アデノウ ィルスベクター ΔΕ2Α- CAHGHには、 前述した CAGプロモーターの制御下にレポータ 一遺伝子としてヒ ト成長ホルモン （hGH) を発現するように、 その発現単位を挿 入した。 また、 E2A欠損アデノウイルスベクターのコントロールベクターとして、 同じ発現単位を持つ第一世代アデノウイルスベクター （図 1、 AxlCAHGH) も作製 した。
次に、 このようにして作製した E2A欠損アデノウィルスベクターでは E2A遺伝子 が確かに欠失していることを確認した。 すなわち、 Δ E2A-CAHGHもしくは AxlCAHGHを感染させた A549細胞 （ヒ ト肺癌由来細胞株） での E2A遺伝子にコード されるタンパク質 DBP (single stranded DNA binding protein) の発現量を蛍光 抗体法により比較し、 AE2A-CAHGH感染細胞では DBPの発現が明らかに低下してい たことにより E2A遺伝子の欠失を確認した。 さらに、 後期遺伝子である L3遺伝子 にコードされ、 ウィルス粒子の主要な構成タンパク質であるへキソンの発現量を、 同様に蛍光抗体法により比較したところ、 ΔΕ2Α - CAHGH感染細胞では 発現が明らかに低下していた。 この結果は、 「微量発現した E2A遺伝子がアデノ ウィルス主要後期プロモーター （MLP) を活性化し、 主要後期タンパク質が発現 する。 」 との従来の仮説は、 この箇所においては正しいことを示していた。
そこで、 次に E2A欠損アデノウイルスベクターでは in vivoでの炎症反応も低下 しているかどうかを検討した。 Δ Ε2Α- CAHGHまたは AxlCAHGHをマウスに静脈投与 し、 血中の肝逸脱酵素 GPT (グルタミン酸一ピルビン酸一 トランスアミナーゼ） 値を炎症の指標として測定した。 まず、 各アデノウイルスベクターの感染効率を 確認するため、 アデノウィルスベクター投与 3日目の血中の hGH濃度を測定した。 両アデノウイルスベクター投与群間で血中 hGH濃度に有意の差がなかったことに より、 両アデノウイルスベクターの動物個体内での感染効率に差がないことを確 認した。 そこで、 血中 GPT値を指標に E2A欠損アデノウイルスベクターを評価した 、 AE2A-CAHGH投与マウスでも AxlCAHGH投与マウスと同程度に血中 GPT値は増加 した。 この結果より、 E2A欠損アデノウイルスベクターには炎症を軽減する効果 は全く認められないことが明らかになった。 また、 一部のマウスでは、 アデノウ ィルスベクター投与後、 一定期間ごとに肝臓切片を作製し病理組織学的解析を行 つた。 AxlCAHGHを投与したマウスでは、 投与 5日後以降、 肝臓の T細胞を含む白 血球の浸潤、 肝細胞のアポトーシスなどの炎症像が認められたが、 Δ Ε2Α- CAHGH を投与したマウスでも同様の炎症像が認められた。 すなわち、 両アデノウイルス ベクタ一投与マウス間で、 病理組織学的にも差はなかつた。
以上の結果は、 E2A遺伝子の欠失は炎症の軽減に効果がないことを示している。 このように E2A欠損アデノウィルスベクターと第一世代アデノウィルスベクター とで炎症の惹起作用に差がなかった原因として、 次の 4つの可能性が考えられた。
① E4遺伝子などの E2A遺伝子以外のアデノウィルス遺伝子が、 細胞由来の因子 により直接活性化され、 発現したアデノウィルスタンパク質そのものが細胞性免 疫を誘導するか、 あるいはさらに別のアデノウイルスタンパク質の発現を誘導し、 そのアデノウイルスタンパク質が細胞性免疫を誘導し炎症が生じる。
②レポーター遺伝子として用いた hGHタンパク質が細胞性免疫を誘導し炎症が 生じる。
③ベクターに挿入した外来プロモーター （CAGプロモーター） がアデノウィル スプロモーターにェンハンサー的に作用し、 アデノウィルスタンパク質が発現し、 そのアデノウィルスタンパク質が細胞性免疫を誘導し炎症が生じる。
④ベクターが感染した細胞で de novoに合成されたタンパク質ではなく、 感染 により細胞内に侵入したアデノウィルス粒子を構成するタンパク質そのものが細 胞性免疫を誘導し炎症が生じる。 もしくは、 アデノウイルス粒子が細胞に侵入す ること自体が刺激となり、 例えば炎症性サイ トカインの産生を誘導するなどして 炎症が起きる。
そこで、 E2A欠損アデノウィルスベクターで炎症の惹起作用が低下しなかった 原因が上記①〜④のどの可能性であるかを明らかにするため、 次の 4種類のアデ ノウィルスベクターを用いて炎症の原因を検討した。
(a) hGH発現一世代アデノウィルスベクター （AxlCAHGH：陽性対照）
(b) hGH cDNAを有さず CAGプロモーターのみが挿入された第一世代アデノウィル スベクター （図 AxCAwt：ポリ A配列も挿入）
(c)プロモーター等の外来遺伝子が挿入されていない第一世代アデノウィルスべ クタ一 （図 1、 Axlwl)
(d) UV不活化アデノウイルス粒子 （AxlCAHGHを不活化）
これら 4種類のベクターをマウスに静脈内投与し、 血清 GPT値を測定した。 な お、 （d)の UV不活化アデノウィルス粒子の定義および調製法の詳細は既存の文献 (Birnstiel M. L. et. al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89， 6094— 6098. (1992)、 Birnstiel M. L. et. al.， Virology, Vol. 205, 254-261. (1994) ) に記載されているが、 その定義を以下に簡単に述べる。 UV不活化アデノ ウィルス粒子とは、 細胞への感染性は保持しており細胞内に侵入できるが、 不活 化前のアデノウィルスの増殖が許容される細胞においても増殖することができず、 また挿入された外来遺伝子の発現も起こらない状態に不活化されたアデノウィル ス粒子のことである。
結果を概略すると、 UV不活化アデノウィルス粒子投与マウス及び外来遺伝子が 挿入されていない Axlwl投与マウスでは、 血清 GPT値は全く上昇しなかった。 一方、 CAGプロモーターのみが挿入された AxCAwt投与マゥスは、 hGHを発現する AxlCAHGH 投与マウスとほぼ同程度、 血清 GPT値が増加した。 AxCAwt投与マウスでも炎症が 生じたことより、 ②の hGHタンパク質が原因である可能性は否定された。 また、 UV不活化アデノウィルス粒子を投与したマウスでは全く炎症が起こらなかったこ とより、 ④のアデノウィルス粒子自体が炎症の原因である可能性も否定された。 さらに、 Axlwl投与マウスでは炎症が起こらなかったことから、 ①の原因単独で 炎症が起こる可能性も否定された。 結局、 AxCAwt投与マウスでは AxlCAHGH投与マ ウスと同程度の炎症が起こり、 Axlwl投与マウスでは全く炎症が起こらなかった ことより、 AxCAwtと Axlwlとの構造の差異は CAGプロモーターの有無だけであるの で、 第一世代アデノウイルスベクターで炎症が起こる原因は、 ③のベクターに挿 入した CAGプロモーターに起因することが明らかになった。
そこで次に、 CAGプロモーターにより発現が誘導されるアデノウイルス遺伝子、 すなわち炎症に関与しているアデノウィルス遺伝子の同定を行った。 E2A欠損ァ デノウィルスベクター （ΔΕ2Α - CAHGH) または前記（a)から（c)の 3種類の第一世 代アデノウイルスベクター （AxlCAHGH、 AxCAwt, Axlwl) を A549細胞 （ヒ ト肺癌 由来細胞株） または HepG2細胞 （ヒ ト肝癌由来細胞株） に高 moi (重複感染度） で 感染させ、 24時間後に発現しているアデノウイルス遺伝子をノザンブロットによ り解析した。 発現を検討したアデノウイルス遺伝子は、 次の 8種類である。 初期 遺伝子： E2A、 E4、 主要後期プロモーター （MLP) 支配の主要後期遺伝子： Ll、 L2、 L3、 L5、 遅延初期 （delayed early) 遺伝子： タンパク質 IX、 IVa20 目的とする アデノウィルス遺伝子、 すなわち CAGプロモーターより発現が誘導され炎症に関 与しているアデノウイルス遺伝子の定義とは、 CAGプロモーターを有していれば、 E2A欠損アデノウイルスベクター （ΔΕ2Α - CAHGH) 感染細胞でも第一世代アデノウ ィルスベクター （AxlCAHGHおよび AxCAwt) 感染細胞とほぼ同程度発現するが、 CAGプロモーターが無い第一世代アデノウイルスベクター （Axlwl) 感染細胞では ほとんど発現しなレ、遺伝子である。
まず、 E2A遺伝子の発現を検討したところ、 ΔΕ2Α - CAHGH感染細胞ではほとんど 発現せず、 他の 3種類の第一世代アデノウイルスベクター感染細胞では、 CAGプ 口モーターの有無にかかわらず E2A遺伝子はほぼ同程度発現していたことより、 本発明で用いた E2A欠損アデノウィルスベクターは、 E2A遺伝子が完全に欠失して いることが再度確認できた。 同時に、 E2A遺伝子の発現は CAGプロモーターにより 誘導されないことも明らかになった。 他の初期遺伝子である E4遺伝子は、 4種類 のアデノウィルスベクター感染細胞全てでほぼ同程度発現しており、 E4遺伝子の 発現も CAGプロモーターにより誘導されないことが明らかとなった。
次に、 MLPに支配される主要後期遺伝子の発現を検討した。 主要後期遺伝子の うち L2、 L3および L5の 3種類の遺伝子は、 H印 G2細胞では ΔΕ2Α- CAHGH感染細胞で のみ発現が低下しており、 A549細胞では ΔΕ2Α- CAHGHおよび Axlwl感染細胞での発 現が明らかに低下していた。 従って、 前述したタンパク質レベルだけでなく遺伝 子レベルでも、 『E2A遺伝子が主要後期遺伝子の発現を誘導する』 という従来の 仮説が確認できたものの、 これらの主要後期遺伝子は CAGプロモーターにより発 現は誘導されないことが明らかになった。 また、 L1遺伝子の発現は、 用いた細胞 株により異なる結果となつた。 HepG2細胞では Δ E2A-CAHGH感染細胞でのみ L1遺伝 子の発現が低下し、 CAGプロモーターによる発現誘導は認められなかった。 一方、 A549細胞では Axlwl感染細胞でのみ L1遺伝子の発現が低下し、 CAGプロモーターに よる発現誘導が認められた。
最後に、 独自のプロモーターを有する IVa2遺伝子とタンパク質 IX遺伝子の二つ の遅延初期遺伝子の発現を検討した。 IVa2遺伝子の発現パターンは、 L1遺伝子と 同様に用いた細胞株により異なる結果となった。 すなわち、 HepG2細胞では 4種 類のアデノウィルスベクター感染細胞全てで IVa2遺伝子はほぼ同程度発現してお り、 CAGプロモーターによる発現誘導は認められなかった。 それに対し、 A549細 胞では Axlwl感染細胞でのみ IVa2遺伝子の発現が低下しており、 CAGプロモーター による発現誘導が認められた。
一方、 タンパク質 IX遺伝子の発現は両細胞株とも同じ結果となり、 Δ Ε2Α- CAHGH、 AxlCAHGHおよび AxCAwt感染細胞ではタンパク質 IX遺伝子はほぼ同程度発 現していたが、 Axlwl感染細胞ではほとんど発現していなかった。 すなわち、 タ ンパク質 IX遺伝子は、 CAGプロモーターによる発現誘導が明確に認められた。 以上の結果より、 CAGプロモーターにより明らかに発現誘導されるアデノウイ ルス遺伝子は、 主にタンパク質 IX遺伝子であることが示された。 従って、 タンパ ク質 IX遺伝子の発現が第一世代アデノウィルスベクターを in viV0で投与した際 の炎症の原因となっていることが強く示唆された。 また、 前述した結果より、 タンパク質 IVa2遺伝子および L1遺伝子も、 細胞の種 類によっては CAGプロモーターにより発現が誘導されることも明らかになった。 タンパク質 IVa2遺伝子は独立したプロモーターを有するので、 CAGプロモーター により直接活性化されることは容易に推測できる。 し力 し、 L1遺伝子は主要後期 遺伝子の一つであり、 L3や L5遺伝子などの他の後期遺伝子と共通のプロモーター である MLPに制御されているので、 CAGプロモーターにより L1遺伝子のみが発現誘 導されることは推測し難い。 しかし、 L2〜し 5遺伝子は感染後期にしか発現しない 力 L1遺伝子は感染初期にも発現することが知られているので （Shaw A. R. et. al. , Cell, Vol. 22, 905-916. (1980) ) 、 LI遺伝子のみが CAGプロモーターによ り発現誘導されるのは、 この初期と後期における遺伝子発現機構の差異に基づい ている可能性がある。 さらに、 タンパク^ IXおよびタンパク質 IVa2とも MLPを活 性化する作用があることが報告されているので （Lutz P. et. al. , J. Virol. , Vol. 71, 5102-5109. (1997)、 Tribouley C. et. al.， J. Virol. , Vol. 68, 4450-4457. (1994) ) 、 CAGプロモーターが MLPを直接活性化しているのではなく、 タンパク質 IXもしくはタンパク質 IVa2を介して間接的に MLPが活性化されている 可能性もある。 これらタンパク質 IVa2遺伝子およぴ L1遺伝子の CAGプ口モーター による発現誘導の程度は、 タンパク質 IX遺伝子の発現誘導に較べると弱いが、 タ ンパク質 IXと相加的に作用し炎症を誘導している可能性があると考えられる。 次に、 CAGプロモーターのどの構成成分が、 タンパク質 IX遺伝子をはじめとす るアデノウイルス遺伝子の発現を誘導するかについて検討した。 CAGプロモータ 一は、 CMVの IEェンハンサー、 ニヮトリ J3—ァクチンプロモーター、 ゥサギ ]3— グロビンのスプライスァクセプターおよびポリ A配列から構成されている。 本発 明で用いたアデノウイルスベクターは、 E1遺伝子の欠失部位 （1. 3- 9. 2 m. u. ) に CAGプロモーターが左向き （E1の転写方向の逆向き） に挿入されており、 右向き に転写されるタンパク質 IX遺伝子 （9. 7- 11. 2 m. u. ) とはプロモーターの挿入方 向が逆向きである。 従って、 タンパク質 IX遺伝子の発現を誘導しているのは ]3— ァクチンプロモーターではなく、 CMVの IEェンハンサーである可能性が強いと考 えられた。 そこで、 CAGプロモーターとは CMVの IEェンハンサ一部分のみが共通な CMVプロモーターを挿入したアデノウイルスベクター （AdCMVlacZ) を用いて、 タ ンパク質 IX遺伝子の発現を検討した。 その結果、 AdCMVlacZ感染 A549細胞では、 CAGプロモーターのみが挿入された AxCAwt感染細胞とほぼ同程度タンパク質 IX遺 伝子が発現していたという結果が得られたことにより、 CMV IEェンハンサー (CMVェンハンサー） がタンパク質 IX遺伝子をはじめとするアデノウィルス遺伝 子の発現を誘導していることが確認された。
このことをより確実なものとするため、 CMVェンハンサーを含まないプロモー ターである EF-Ι αプロモーターを挿入したアデノウィルスベクター （AxEFLacZ- L) を用いて、 タンパク質 IXの発現を検討したところ、 AxEFLacZ- L感染細胞では タンパク質 IX遺伝子は全く発現しなかった。 さらに、 CAGプロモーターと lacZ遺 伝子とを挿入したアデノウイルスベクター （AxCALacZ-L) を陽性対照として、 マ ウスに静脈投与した際の血清 GPT値を指標に、 AdCMVlacZと AxEFLacZ-しとの炎症の 程度を比較検討した。 その結果、 AdCMVlacZ投与マウスは AxCALacZ-Lと同等かそ れ以上に血清 GPT値が上昇したが、 AxEFLacZ- L投与マウスでは、 血清 GPT値はほと んど上昇しないことが確認された。 従って、 CMVェンハンサーを含まない EF- 1 α プロモーターはタンパク質 IXの発現を誘導せず、 タンパク質 IXの発現を誘導しな いアデノウィルスベクターでは炎症が起きないことが示された。
以上の一連の結果をまとめると、 第一世代アデノウィルスベクターにより炎症 が生じる原因は、 CMVェンハンサ一がアデノウィルス遺伝子の発現を誘導するこ とに起因するという、 従来は知られていなかった非常に重要な新たな機構が本発 明者らにより発見されたことになる。
CMVプロモーターをはじめとする CMVェンハンサーを含むプロモーターは、 その プロモーター活性が高いため、 現在臨床試験が行われている数多くのアデノウイ ルスベクターに用いられている。 その例を挙げると、 CMVプロモーターそのもの を用いたベクターの例としては、 癌抑制遺伝子 ρ53発現アデノウイルスベクター (Clayman G. L. et. al. , J. Clin. Oncol. , Vol. 16, 2221-2232. (1998)、 お よび Swisher S. G. et. al.， J. Natl. Cancer Inst. , Vol. 91， 763 - 771. (1999) ) 、 インターロイキン 2発現アデノウイルスベクター （Stewart A. K. et. al. , Gene Ther. , Vol. 6， 350-363. (1999) ) 、 血管内皮増殖因子 VEGF121発現 アデノウイノレスベクター (Rosengart T. K. et. al. , Circulation, Vol. 100, 468-474. (1999) ) などがあり、 CMV IEェンハンサーを含むハイブリッドプロモ 一ターを用いたアデノウィルスベクターの例としては、 嚢胞性線維症膜貫通型調 節蛋白 （CFTR) 発現アデノウイルスベクター （Knowles M. R. et. al. , Ν. Engl. J. Med. , Vol. 333， 823-831. (1995)、 および Zuckerman J. B. et. al. , Hum. Gene Ther. , Vol. 10, 2973-2985. (1999) ) が挙げられる。
従って、 外来プロモーターがアデノウィルス遺伝子の発現を誘導し炎症が起き るという本発明者らの発見は、 単に CAGプロモーターを有する組換えアデノウイ ルスベクターに限定された現象ではなく、 実際に臨床試験で用いられているアデ ノウィルスベクターの多くに当てはまる普遍的な現象である。 それ故、 かかる知 見に基づき、 外来プロモーターによりアデノウィルス遺伝子の発現が誘導されな いように改良したアデノウィルスベクターは、 投与時の炎症が軽減され治療用遺 伝子の発現が持続することが期待でき、 実用上の価値が大変高いものである。 さらに、 外来プロモーターがアデノウィルス遺伝子の発現を誘導するという本 発明の発見は、 CMV IEェンハンサーのみでなく他のウィルスプロモーターを有す るアデノウイルスベクターでも当てはまる可能性がある。 そのようなプロモータ 一の例として、 RSVプロモーター、 SV40初期遺伝子ェンハンサーを含むプロモー ター、 あるいは SR aプロモーターなどが挙げられる。
次に、 本発明の好ましい形態であるタンパク質 IX再配置型アデノウィルスべク ター及びタンパク質 IX欠失型アデノウィルスベクターを例にとり、 本発明の実施 方法を具体的に説明する。
まず、 タンパク質 IX再配置型アデノウィルスベクターの作製方法の例について 述べる。 タンパク質 IX遺伝子の塩基配列や位置は、 文献 （Maat J. et. al. , Gene, Vol. 10， 27-38. (1980) ) に記載されている。 再配置するタンパク質 IX遺 伝子の調製法に特に制限は無く、 タンパク質 IX遺伝子を含むプラスミ ドゃコスミ ド （Miyake S. et. Al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , Vol. 93， 1320-1324. (1996) ) などから制限酵素消化により切り出してもよいが、 その後の構築の利便 性から PCR法により増幅することが望ましい。 増幅するタンパク質 IX遺伝子の範 囲は、 タンパク質 IXのコーディング領域のみでなくタンパク質 IX遺伝子の 5' な らびに 3' 非翻訳領域を含むことが望ましレ、。 5' 非翻訳領域としては、 タンパク 質 IX遺伝子のプロモーター領域を含むことが望ましく、 その例としてアデノウイ ルス 5型の塩基配列で少なくとも 3525番目以降の配列を含むことが望ましく、 さ らには 3213番目以降を含むのがより望ましレ、。 3 ' 非翻訳領域の範囲は、 タンパ ク質 IX遺伝子の終止コドンまでの塩基配列を含みさえすれば特に制限はなく、 終 止コドンのすぐ後ろに他の遺伝子のポリ A配列を付加してもよいし、 またタンパ ク質 IX遺伝子本来のポリ A配列を用いてもよい。 後者の例として、 タンパク質 IX 遺伝子のポリ A付加シグナルおよび実際にポリ Aが付加するとされている部位を 含む 4070番目までの塩基配列を含むことが望ましく、 さらには 4076番目までを含 むのがより望ましい。 PCRのプライマーの塩基配列は、 前述した範囲のタンパク 質 IX遺伝子を増幅できる配列である限り特に制限はないが、 増幅後のタンパク質 IX遺伝子を含む DNA断片のプラスミ ドへのクローニングを容易に行うため、 適当 な制限酵素認識配列を含むことが望ましい。
PCRにより増幅したタンパク質 IX遺伝子を含む DNA断片は、 アデノウィルスゲノ ムの所望の位置に直接挿入しても良いが、 PCR反応中に塩基配列の変異が起きて いないことを確認するため、 まず増幅断片を適当なプラスミ ド等にクローニング し、 その塩基配列を確認してから用いるのが望ましい。 増幅断片をクローニング するプラスミ ド等に特に制限はなく、 その例としてプラスミ ド pUC19などが挙げ られる。
タンパク質 IX遺伝子を再配置する部位としては、 前述したように L3遺伝子と E2A遺伝子との間、 E3遺伝子の欠失部位などが挙げられるが、 より好ましい例と して、 E4遺伝子の上流域と 3' 側 ITRとの間への再配置の方法について以下に具体 的に述べる。 当該部位にタンパク質 IX遺伝子を再配置したアデノウィルスベクタ 一を作製する手順として、 タンパク質 IX遺伝子を本来の位置 （9. 7- 11. 2 m. u. ) からは欠失させ、 かつ E4遺伝子の上流域と 3 ' 側 ITRとの間にタンパク質 IX遺伝子 が挿入された構造のアデノウイルスゲノムを含むプラスミ ドゃコスミ ドベクター で 293細胞などの細胞株を形質転換し、 目的の組換えアデノウィルスを一段階で 得ることも可能である。 し力 し、 その代替法として、 タンパク質 IX遺伝子を本来 の位置に保有し、 かつ E4遺伝子の上流域と 3 ' 側 ITRとの間にもタンパク質 IX遺伝 子が挿入された組換えアデノウィルスをまず作製し、 次いで本来の位置のタンパ ク質 IX遺伝子を欠失させることにより、 タンパク質 IX遺伝子を再配置したアデノ ウィルスベクターを作製するという二段階の手順で行うこともできる。 後者の方 法は手順は多いが、 目的の糸且換えアデノウィルスを確実に得ることができるため 望ましい方法であり、 以下はこの 2段階の作製方法について詳細に説明する。 な お、 以下に示す組換えアデノウイルスベクターの作製方法は、 アデノウイルスゲ ノムの大部分を含むコスミ ドベクターと、 末端タンパク質一アデノウイルス DNA 複合体 （DNA- TPC) を制限酵素消化した DNAとで 293細胞などの細胞を形質転換し、 コスミ ドベクターとアデノウイルス DNA - TPCとの間の相同組換えにより目的の組 換えアデノウィルスを得る方法で、 その原理ならびに操作方法の詳細は既存の文 献 （Miyake S. et. Al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93， 1320-1324. (1996) ) および特許 （特開平 7-298877) に開示されている。
コスミ ドベクター pAx4wは、 アデノウイルス 5型ゲノムの 2. 6 - 98. 0 m. u (E3 遺伝子は欠失） とアデノウイルス 2型ゲノムの 98. 0 - 100 m. u.を含み、 かつ E4 遺伝子のプロモーターの上流域と 3， 側 ITRとの間 （99. 3 m. u. ) にクローニング 部位である制限酵素 Swal部位を有するベクターである （Miyake S. et. AL , Proc. Natl. Acad. Sci. , Vol. 93， 1320-1324. (1996)、 当該文献中では pAx4wを pAdex4wと記載） 。 この pAx4wの Swal部位に、 前述した PCR法などにより調製した タンパク質 IX遺伝子を挿入し、 コスミ ドベクター ΡΑχ4ρΙΧを得る。 一方、 組換え アデノウイルスベクター Adex4SRLacZLは、 アデノウイルス 5型由来で （E1A · E1B · E3遺伝子を欠失） 、 かつ pAx4wと同じ 99. 3 m. u.の位置に大腸菌 lacZ遺伝子の発 現単位が挿入された非増殖型アデノウィルスベクターである。 この Adex4SRLacZL から調製したアデノウィルスゲノム DNAを、 ゲノム右半分に複数の認識部位が存 在する制限酵素 Aselおよび EcoRIで消化した DNA-TPCと、 コスミ ドベクター pAx4pIXとで 293細胞を形質転換することにより、 Adex4SRLacZLの大腸菌 lacZ遺伝 子の発現単位がタンパク質 IX遺伝子に置換された組換えアデノウィルス Ax4pIXを 得ることができる。 Ax4pIXは、 タンパク質 IX遺伝子の本来の位置および E4遺伝子 の上流域と 3' 側 ITRとの間のニケ所に、 タンパク質 IX遺伝子を有する組換えアデ ノウィルスである。
次に、 タンパク質 IX遺伝子の本来の位置の欠失させるべき塩基配列の範囲につ いて説明する。 タンパク質 IX遺伝子は右向きに転写されるが、 その 3 ' 非翻訳領 域は左向きに転写される IVa2遺伝子および E2B遺伝子の 3' 非翻訳領域と一部重複 しているため、 タンパク質 IX遺伝子の欠失範囲は、 IVa2遺伝子および E2B遺伝子 の機能に影響を及ぼさなレ、範囲でなければならない。 IVa2遺伝子およぴ E2B遺伝 子のポリ A付加部位は、 アデノウイルス 5型を例とすると 4060番目の塩基とされ ているので、 欠失範囲はこれよりも左側まででなければならない。 この条件を満 たし、 かつタンパク質 IXが発現しない限り、 欠失範囲に特に制限は無いが、 その 例として、 アデノウィルス 5型の PvuII部位 （Ad5 ： 452 - 457) から AlwNI部位 (Ad5： 4048 - 4056) の欠失が挙げられる。 当該範囲を欠失したアデノウィルス ゲノムを含むベクターは、 コスミ ドベクター pAxcw (特開平 8-308585号公報、 15 頁、 pAdexlcwは pAxcwと同一である） から、 容易に構築することができる。 pAxcw は、 E1遺伝子を欠失した （Δ454 - 3328) アデノウイルス 5型ゲノムの大部分を 含むコスミ ドベクターであり、 pAxcwを主発材料として数段階の構築により、 PvuII部位から AlwNI部位間を欠失したアデノウィルスゲノムを含むコスミ ドべク ター pAxApIXcwを得ることができる。 pAxApIXcwは、 E1A、 E1Bおよびタンパク質 IX遺伝子を欠失し （Δ454 - 4053) 、 その欠失部位に外来遺伝子のクローニング 部位 （Clalおよび Swal部位） が挿入されたベクターである。
前述した組換えアデノウィルス Ax4pIXから調製したゲノム DNAをそのゲノム左 側に複数箇所の認識部位を有する制限酵素 EcoT22Iなどで消化した DNA- TPCと、 前 述のコスミ ドベクター pAx ApIXcwとで 293細胞を形質転換することにより、 目的 とするタンパク質 K遺伝子が再配置された組換えアデノ ウィルスベクター AxRpIXcwを得ることができる。 この AxRpIXcwにはプロモーター等の外来遺伝子は 挿入されていないが、 AxRpIXcwのゲノム DNAを EcoT22I消化した DNA- TPCと、 コス ミ ドベクター pAx ApIXcwの Swal部位もしくは Clal部位に外来遺伝子を挿入したコ スミ ドベクターとの相同組換えにより、 任意の外来遺伝子が挿入されたタンパク 質 IX再配置型アデノウィルスベクターを容易に得ることができる。 または、 Ax4pIXのゲノム DNAを EcoT22I消化した DNA - TPCと、 コスミ ドベクター pAx ApIXcw の Swal部位もしくは Clal部位に外来遺伝子を挿入したコスミ ドベクターとの相同 組換えによっても、 任意の外来遺伝子が挿入されたタンパク質 IX再配置型アデノ ウィルスベクターを得ることができる。
以上、 アデノウィルス 5型を例としてタンパク質 IX再配置アデノウィルスべク ターの作製法を説明したが、 再配置するタンパク質 IX遺伝子は必ずしも同じ血清 型アデノウィルス由来の遺伝子を用いる必要はなく、 当該アデノウィルスの増殖 サイクルにおいてタンパク質 IXが十分に機能しさえすれば、 他の血清型のタンパ ク質 IX遺伝子を用いてもよい。 その例として、 アデノウイルス 5型の基本骨格に 2型のタンパク質 IX遺伝子を再配置したベクターや、 その逆にアデノウィルス 2 型の基本骨格に 5型のタンパク質 IX遺伝子を再配置したベクターなどが挙げられ る。
次にタンパク質 IX欠失型アデノウイルスベクターの作製法を説明する。 当該べ クタ一を作製するには、 タンパク質 IX発現細胞株が必要であるので、 まずタンパ ク質 IX発現細胞株の作製法について説明する。 細胞に導入するタンパク質 IX遺伝 子の範囲は、 タンパク質 IXのコーディング領域を含んでいる限り特に制限はなレ、。 タンパク質 IXのコーディング領域を含む DNA断片は、 当該遺伝子を含むプラスミ ド等から制限酵素消化により切り出すこともできるし、 また PCR法により調製し てもよレ、。 タンパク質 IXを発現させるためのプロモーターに特に制限はなく、 動 物細胞で恒常的に機能するプロモーターを用いてもよいし、 誘導型プロモーター を用いてもよい。 また、 タンパク質 IX遺伝子の本来のプロモーターを用いてもよ レ、。 タンパク質 IXを発現する細胞株は、 任意の細胞をタンパク質 IX遺伝子の発現 単位を含むプラスミ ド等で形質転換することにより得ることができるが、 当該細 胞株の作製に用いる細胞は、 アデノウィルス E1遺伝子を発現する細胞であって、 かつ E1遺伝子を欠失している第一世代アデノウィルスベクターを効率よく産生で きる細胞であることが望ましい。 そのような細胞の例として、 293細胞が挙げら れる。 さらに、 ベクターゲノムと細胞のゲノム間での相同組換えにより増殖能を 有するァァノウイノレス (replication competent adenovirus ： RCA) カ 出現する のを防ぐため、 E1遺伝子の必要最低限の領域のみが導入された細胞株を用いて、 タンパク質 IX発現細胞株を作製するのがより望ましい。 また、 E1遺伝子を発現し ていない細胞から、 まずタンパク質 IX発現細胞株を作製し、 その後当該細胞株を E1遺伝子で形質転換することによっても所望の細胞株を得ることができる。 細胞 の形質転換法および目的細胞株の選択法に特に制限はなく、 タンパク質 IX欠失型 アデノウィルスベクターに十分量のタンパク質 IXを供給できる細胞株であればよ レ、。
次いでタンパク質 IX欠失型アデノウィルスベクターの作製法を、 より具体的に 説明する。 タンパク質 IX遺伝子を欠失させる範囲は、 タンパク質 IX再配置型アデ ノウィルスベクターと同様、 IVa2遺伝子および E2B遺伝子の機能に影響を及ぼさ ず、 かつタンパク質 IXが発現しなければよく、 その例として既に述べた PvuI I部 位 (Ad5： 452 - 457) から AlwNI部位 (Ad5： 4048 - 4056) の欠失が挙げられる。 前述したコスミ ドベクター pAx A pIXcwは当該範囲のアデノウィルスゲノムの欠失 に対応したベクターである。 この pAx A pIXcwと、 任意の第一世代アデノウイルス ベクター、 例えば AxCAwtや Axlwlのゲノム DNAを EcoT22Iなどの制限酵素で消化し た DNA- TPCとで、 前述したタンパク質 IX発現細胞株を形質転換することにより、 目的のタンパク質 IX欠失型アデノウィルスベクターを得ることができる。 このよ うにして作製したタンパク質 IX欠失型アデノウィルスベクター Αχ Δ pIXcwにはプ 口モーター等の外来遺伝子は揷入されていない。 し力 し、 タンパク質 IX再配置型 アデノウイルスベクターの場合と同様、 コスミ ドベクター pAx A pIXcwの Swal部位 もしくは Clal部位に外来遺伝子を挿入したコスミ ドベクターと、 Ax A pIXcwのゲ ノム DNAを EcoT22Iなどの制限酵素で消化した DNA- TPCとの相同組換えにより、 任 意の外来遺伝子が挿入されたタンパク質 IX欠失型アデノウィルスベクターを容易 に得ることができる。 または、 任意の第一世代アデノウイルスベクター、 例えば AxCAwtや Axlwlのゲノム DNAを EcoT22I消化した DNA-TPCと、 コスミ ドベクター pAx △ pIXcwの Swal部位もしくは Clal部位に外来遺伝子を挿入したコスミ ドベクター との相同組換えによっても、 任意の外来遺伝子が挿入されたタンパク質 IX欠失型 アデノウィルスベクターを得ることができる。
以上、 タンパク質 IX再配置型アデノウイルスベクターおよびタンパク質 IX欠失 型アデノウィルスベクターの作製法は、 主にアデノウィルス 5型を例として説明 したが、 本発明はアデノウイルス 5型に限定されるものでなく、 アデノウイルス 2型をはじめとするその他の血清型のアデノウィルスを基本骨格とする任意のァ デノウィルスベクターに適用することができる。 次に、 本発明の組換えアデノウィルスベクターを有効成分とする医薬組成物、 及び炎症が軽減された遺伝子治療方法につき説明する。 上記のようにして得られ た本発明の組換えアデノウイルスベクターは、 ヒ トに投与した際の炎症が軽減さ れた安全性の高いベクターであり、 医薬組成物の有効成分として種々の疾患の遺 伝子治療に用いることができる。 本発明の組換えアデノウイルスベクターを医薬 組成物として用いる場合、 治療目的の疾患および標的臓器などに応じて、 iv vivo法、 ex vivo法のいずれかの方法を適宜選択して適用することができる。 こ こで in vivo法とは、 遺伝子治療用の医薬組成物を直接患者の体内に導入する手 法であり、 また ex vivo法とは、 患者からある種の細胞を取り出して、 体外で前 記医薬組成物を該細胞に導入し、 その後細胞を体内に戻す手法である。
本発明のアデノウイルスベクターにおいて、 in vivo法の投与経路に特に制限 はなく、 例えば、 静脈投与、 動脈投与、 皮下投与、 皮内投与、 筋肉内投与や、 肝 臓、 肺、 腎臓、 脳などの対象臓器へ直接投与することもできる。 また、 in vivo 法により投与する場合の製剤形態にも制限はなく、 例えば注射剤として用いる場 合、 当該注射剤は常法により調製することができる。 すなわち、 例えば本発明の 組換えアデノウイルスベクターを、 無菌的に適切な溶剤 （PBS等の緩衝液、 生理 食塩水、 滅菌水等） に溶解した後、 無菌的な容器に充填することにより調.製する ことができる。 当該製剤には必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。
本発明のアデノウイルスベクターを ex vivo法に適用する場合、 用いる細胞に 制限はなく、 リンパ球などの白血球や患者由来の種々のガン細胞など、 目的に応 じた細胞を用いることができる。
前記本発明の医薬組成物の患者への投与量は、 治療目的の疾患、 患者の年齢、 体重等により適宜調製することができる。 通常、 本発明の組換えアデノウイルス ベクター 6〜^) 1 (PFU) 、 好ましくは 8〜^ 1 2 (PFU) 程度を、 1回投与、 もしくは数日間連続投与、 あるいは月に 1回程度投与するのが好ましい。
前記したように、 現在臨床試験が進められているアデノウィルスベクターとし ては、 癌抑制遺伝子 p53発現ベクター、 インターロイキン 2発現ベクター、 血管 内皮増殖因子 VEGF121発現ベクター、 嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白 （CFTR) 発 現ベクター等が知られているが、 本発明の組換えアデノウイルスベクターは、 こ れら従来のアデノウィルスベクターを使用した際に生じる炎症を軽減したベクタ 一として、 従来のアデノウィルスベクターの代わりに用いることができる。
例えば、 癌抑制遺伝子 p53発現ベクターを用いた臨床試験のプロトコール等は、 文献 （Roth J. A. et. al.， Hum. Gene Ther. , Vol. 7， 1013-1030. (1996) ) に 記載されており、 従って、 当該プロ トコールに従って、 本発明の遺伝子治療方法 を実施することが可能である。
本発明の組換えアデノウイルスベクターは、 医薬品としてヒ トの遺伝子治療に 用いるだけでなく、 動物個体に遺伝子導入するためのベクターとしても用いるこ とができる。 その方法は、 in vivo法および ex vivo法など前述したヒ 卜への遺伝 子治療の方法に準じて行うことができる。
また、 既に公知の多くの文献や、 後述の実施例を参照して行うこともできる。 炎症が軽減されたベクターという本発明のアデノウィルスベクターの特徴は、 動 物個体に用いる場合においても、 疾患モデル動物の作製、 ヒ トの疾患の治療モデ ル、 任意の遺伝子の機能解析など様々な目的において、 炎症などベクターに由来 する副反応を考慮する必要がなく、 従来のアデノウイルスベクターには無い大き な利点がある。
以下、 実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれらの実施 例によりなんら限定されるものではなく、 本発明の技術分野における通常の変更 ができることは言うまでもない。 なお、 実施例中のファージ、 プラスミ ド、 D N A、 各種酵素、 大腸菌、 培養細胞等を取り扱う諸操作は、 特に断らない限り、 「 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis ら編、 第 2 |¾ (1989) , Cold Spring Harbor Laboratory] に記載の方法に準じて行った。
本実施例で用レヽたコスミ ドベクター pAxCAwt (Kanegae Y. et. al. , Nucleic acid Res. , Vol. 23, 3816 - 3821 (1995) ) および pAxcw (特開平 8- 308585号公報、 15頁、 pAdexlcwは pAxcwと同一である） は、 アデノウイルス E 1および E 3遺伝 子以外のアデノウィルス 5型ゲノムの大部分を含むベクターである。 また、 pAxCAwtは、 E 1遺伝子欠失部位に CAGプロモーター （Niwa H. et. Al. , Gene, Vol. 108, 193- 200 (1991)および日本特許第 2824434号） が導入され、 かつプロモ 一ターとポリ A配列との間にクローニング部位が存在する。 pAxcwは、 E 1遺伝 子欠失部位に Clalおよび Swal部位のみが挿入されている。 これらコスミ ドベクタ 一とアデノウイルス DNA—末端蛋白質複合体とで 293細胞 （ATCC CRL-1573) を形 質転換し、 相同組換えにより組換えアデノ ウィルスベクターを作製する方法
(C0S/TPC法） は、 既存の文献 （Miyake S. et. Al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93， 1320-1324. (1996) ) および特許 （特開平 7- 298877) に開示され ている方法に準じた。 さらに、 超遠心法によるアデノウイルスベクターの精製法
( Kanegae Y. et. al.， Jpn. J. Med. Sci. Biol.， Vol. 47， 157-166. (1994) ) 、 および 293細胞を用いた限界希釈法によるウィルス力価測定法 （特開 平 7-298877) も、 特に断りがない限り既存の方法に準じた。
実施例 1
ヒ ト成長ホルモン発現アデノウイルスベクターの作製
( 1 ) ヒ ト成長ホルモン cDNAのクローニング
PCR法によりヒ ト成長ホルモン （hGH) cDNAをクローニングするため、 以下の操 作を行った。
巿販ヒ ト脳下垂体アデノーマ由来 cDNAライブラリー （CL0NTECH社） からファー ジ DNAを調製し、 これを PCRのテンプレート DNAとした。 PCRのプライマーは両末端 に制限酵素の認識部位を付加するように設計し、 5' 側プライマーは開始コドン ならびに Nhel認識部位を含み、 3' 側プライマーは終止コドンならびに Sphl認識 部位を含む。 各々のプライマーの配列を以下に示した。
5' 側プライマー 5 , -TGGCTAGCTCACCTAGCGGCAATGGCT-3， (配列番号： 1)
Nhel Met
3' 側プライマー 5 ' -CAGGCATGCCACCCGGGCAGCTAGAA-3 ' (配列番号： 2)
Sphl End
前述した cDNAライブラリー由来 DNAをテンプレートとし、 ポリメラーゼ pfu (宝 酒造） を用いて常法により PCR反応を行い、 hGH cDNAを含む約 700bpの増幅断片を 得た。 この増幅断片を Klenow酵素で平滑化後、 プラスミ ド pUC19の Hindi部位に 挿入し、 プラスミ ド pUCHGH (3. 4kb) を得た。 pUCHGHの hGH cDNA部分の塩基配列 を解読し、 その配列が文献 （Chen E. Y. et. al. Genomics Vol. 4, 479 - 497. (1989) ) 記載の配列と同一であることを確認した。 ( 2 ) ヒ ト成長ホルモン発現組換えアデノウイルスベクターの作製
pUCHGHを Nhelおよび Bgllで消化し、 さらに末端を平滑化し、 hGH cDNAのコード 領域を含む約 0. 7kbの DNA断片を得た。 この DNA断片を、 コスミ ドベクター pAxCAwt のプロモーターとポリ A配列との間の Swal部位に挿入し、 コスミ ド pAxlCAHGHを 得た。
コスミ ド pAxlCAHGHに hGHの発現単位が正確に組み込まれていることを確認する ため、 pAxlCAHGHから hGHの発現単位を含むプラスミ ドを構築し、 C0S7細胞 （サル 腎臓由来細胞株） で hGH蛋白を一過的に発現させた。 すなわち、 まず pAxlCAHGHを Nrul消化後自己ライゲーシヨンさせ、 アデノウイルス DNAの大部分を除いた （左 端約 0. 4kbは含む） hGH発現プラスミ ド、 PxlCAHGHを得た。 次いで PxlCAHGHにて C0S7細胞を DEAE-dextran法で形質転換し、 2日後の培養上清中の hGH濃度を ELISA 法 （ピコィァ TMHGHプレート ：住友製薬） で測定した。 プラスミ ドを導入して いない C0S7細胞の培養上清中の hGH濃度は検出限界以下であつたが、 Px 1 CAHGHで 形質転換した C0S7細胞の培養上清中には 1 ng/ml以上の hGHが検出された。 この結 果より、 コスミ ド pAxlCAHGHには hGHの発現単位が正確に組み込まれていることが 確認できた。
最後に、 前述した C0S/TPC法により、 コスミ ド pAxlCAHGHとアデノウィルス DNA 末端蛋白質複合体とで 293細胞を形質転換し、 hGH発現組換えアデノウィルス Ax 1 CAHGH (図 1、 El及び E3遺伝子欠失） を得た。
実施例 2
hGHを発現する E2A遺伝子欠損アデノウィルスベクターの作製
( 1 ) E2A欠損アデノウィルスベクター作製用の組換えアデノウィルスの作製 コスミ ドベクター pAx2LD3LCAwt (特開平 8- 308585公報 19頁の pAdex2LD3LCAwtは pAx2LD3LCAwtと同一である） は、 前述したコスミ ドベクター pAxCAwtの誘導体で ある。 pAx2LD3LCAwtは、 pAxCAwtのアデノウイルスし 3遺伝子と E2A遺伝子との間 (61. 5マップ単位） 、 ならびに E3遺伝子の欠失部位 （78. 0マップ単位） にそれぞ れ ΙοχΡ配列が挿入されたコスミ ドで、 ΙοχΡ揷入部以外の塩基配列は pAxCAwtと同 じである。
実施例 1で作製したプラスミ ド pUCHGHを Nhelおよび Bgllで消化後、 末端を平滑 ィ匕し、 hGH cDNAのコード領域を含む約 0. 7kbの DNA断片を得た。 この DNA断片を、 コスミ ドベクター pAx2LD3LCAwtのプロモーターとポリ A配列との間の Swal部位に 挿入し、 コスミ ド pAx2LD3LCAHGHを得た。
アデノウイルスベクター Adex2LD3LCANLacZ (図 1、 特開平 8-308585公報 21頁） は、 コスミ ドベクター pAx2LD3LCAwtと同じ位置に二つの loxP配列が挿入され、 大 腸菌 J3—ガラク トシダーゼを発現する組換えアデノウィルスである。
Adex2LD3LCANLacZの挿入遺伝子を、 lacZから hGmこ置換した組換えアデノウイ ルスを作るため、 既存の方法 （特開平 7- 298877) に従い以下の操作を行った。 ま ず、 Adex2LD3LCANLacZからアデノウイルス DNA—末端蛋白質複合体を調製し、 次 いで EcoT22I消化した。 この DNA—末端蛋白質複合体とコスミ ド pAx2LD3LCAHGHと で 293細胞を形質転換し、 hGH発現単位および二つの loxP配列を有する組換えアデ ノウィルス Ax2LD3し CAHGH (図 1 ) を得た。 この Ax2LD3LCAHGHは、 loxP挿入部以外 の構造は実施例 1で作製したアデノウィルスベクター AxlCAHGHと同一であり、 ま た発現単位以外の構造はアデノウィルスべクター Adex2LD3LCANLacZと同一である。 ( 2 ) E2A欠損アデノウイルスベクターの作製
リコンビナーゼ Creの作用により、 アデノウィルスベクター Ax2LD3LCAHGHから 二つの 1 oxP配列に挟まれた E2 A遺伝子および L4遺伝子を欠損させた組換えアデノ ウィルス （E2A欠損アデノウイルスベクター） を作製するため、 以下の操作を行 つた。
まず、 アデノウイルスベクター Ax2LD3LCAHGHおよびリコンビナーゼ Cre発現ァ デノウイノレスベクター AxCANCre (図 1、 Kanegae Y. et. al. , Nucleic. Acids Res. , Vol. 23， 3816-3821. (1995) ) を超遠心法 (前出) にて精製し、 293細胞 を用いた限界希釈法 （前出） によりそれぞれのウィルスの力価を測定した。
次に、 コラーゲンコートした 225cm "の培養フラスコにほぼコンフルェント (confluent) となった 293細胞に、 3. 0 x 10 ' PFU/mlの Ax2LD3LCAHGH (moi 2) と 1. 5 x 107 PFU/mlの AxCANCre (moi 1) とを含む培地 （5% FCS含有ダルベッコ 変法イーグル培地： DMEM培地） 4mlを加え、 両ウィルスを 37°Cで 1時間感染させ た。 感染終了後、 5% FCS含有 DMEM培地 21mlを加え、 5% C02の存在下 37°Cで培養 した。 2日後、 フラスコ底面に付着している細胞をセルスクレーパーで剥がし、 培養上清を含む細胞縣濁液を 50ml容量の遠心管に入れ、 2500 rpm (1130 x g) 、 4 °C、 5分間遠心後、 上澄を捨て細胞画分を- 80°Cで凍結保存した。
( 3 ) E2A欠損アデノウイルスベクターの精製
前記 Ax2LD3LCAHGHと AxCANCreとを同時感染させた 293細胞中では、 目的とする hGH発現 E2A欠損アデノウイルスベクター （ Δ Ε2Α- CAHGH： 28. Ikb) が生成してい るが、 同時に Ax2LD3LCAHGH (34. 4kb) および AxCANCre (34. 7kb) も存在し、 これ ら 3種類のアデノウィルスが混在している （括弧内は各ウィルスのゲノムサイ ズ） 。 そこで、 ウィルスの比重の差に基づき Δ Ε2Α- CAHGHを単離するため、 以下 に示す塩化セシウム （CsCl) 密度勾配超遠心法により、 E2A欠損アデノウイルス の精製を行った。 なお、 精製に用いた CsCl溶液は全て 50mM H印 esバッファー (pH7. 4) で調製し、 遠心および超遠心は全て 4°Cで行った。
① -80°Cで凍結保存していた AE2A-CAHGHを含む 293細胞の細胞画分を融解し、 225cm 2フラスコ 8本分の細胞当たり 25mlの 50mM H印 esバッファー （pH7. 4) に縣 濁した。 次いで、 細胞縣濁液を 200ml容量のソニケ一ターカップに入れ、 密閉式 超音波破砕装置 （コスモバイオ社製、 UCD- 200T型） で超音波破碎した （200W、 3 分 （30秒 X 6回） 、 4 °C) 。 細胞破砕液を 30ml容量の遠心管に移し、 10, 000 rpm (11, 850 X g) で 10分間遠心した。 遠心後の上澄を次に示す 3段階の超遠心法に 供した。
②細胞破砕液中のアデノウィルスを濃縮するため、 ベックマン社スイングロー ター SW28用の超遠心チューブに比重 1. 43の CsCl溶液 8mlを入れ、 その上に①で調 製した上澄約 25mlを重層し、 23, 000 rpm (95, 400 x g) で約 1. 5時間超遠心した。 遠心後、 水相と CsCl相との界面付近のアデノウイルスを含むバンドを回収し （チ ユーブ当たり約 2. 5ml) 、 回収したウィルス液と等量の飽和 CsCl溶液を加えた。
③ベックマン社スイングローター SW41用の超遠心チューブに、 下から順に次の 溶液を重層した。 ②で調製したウィルス液 （約 5ml ) /比重 1. 32の CsCl溶液
(4. 5ml) Z比重 1. 25の CsCl溶液 (2. 5ml) 。 これを 35, 000 rpm (210, 000 x g) で 3時間超遠心した。 この超遠心により、 蛋白質は比重 1. 25と 1. 32の CsCl溶液の 界面付近でブロードなバンドに、 ウィルスは比重 1. 32の CsCl溶液の中ほどでシャ ープなバンドとなるので、 蛋白質のバンドを含まないようにウィルスのバンドを 回収し （チューブ当たり約 1. 5ml) 、 回収したウィルス液と等量の比重 1. 36の CsCl溶液を加えた。
④ SW41用の超遠心チューブに、 ③で調製したウィルス液約 2mlと比重 1. 34の CsCl溶液約 10mlを入れ、 よく混合後、 30, 000 rpm (154, 000 x g) で約 19時間超 遠心した。 この超遠心により、 各ウィルスの比重に応じて、 それぞれのウィルス のバンドが分離する。 Ax2LD3LCAHGH (34. 4kb) と AxCANCre (34. 7kb) とはゲノム サイズがほぼ等しいのでウィルスの比重もほぼ等しく、 超遠心後のウィルスバン ドは重なっていたが、 Δ Ε2Α- CAHGH (28. lkb) はこれら両ウィルスよりも比重が 小さいため、 超遠心によりチューブの上側にバンドを生じた。 超遠心チューブの 側面に注射針で穴を開け、 AE2A-CAHGHのバンドを回収した。
⑤最後にウイルス液から CsClを除くため、 10%グリセ口ールを含む PBS (-)で一 晚透析し、 ΔΕ2Α- CAHGHの最終精製品を得た。 透析後のウィルスは、 分注後- 80°C で凍結保存した。
( 4 ) E2A欠損アデノウィルスベクターの感染力価ならびに純度測定
①感染力価測定
E2A欠損アデノウィルスは 293細胞では増殖しないため、 第一世代アデノウィル スベクター （E1遺伝子を欠失） のように、 293細胞での増殖を指標とした通常の 方法では力価を測定できない。 そこで、 レポーター遺伝子である hGHの産生量を 指標に、 力価が既知の hGH発現第一世代アデノウィルスベクター AxlCAHGHと Δ E2A - CAHGHとの hGH産生量を比較することにより、 A E2A_CAHGHの相対的な力価 (感染力価） を測定した。
被験アデノウイルスベクターを 2% FCS含有 DMEM培地で段階希釈後、 その 50 μ ΐ を 96穴マイクロプレートで培養した Α549細胞 （ヒ ト肺癌由来細胞株） 〖こ添カロし、 37°Cで 1時間感染させた。 次いでウィルス液を除き、 培地で一度洗浄後、 2% FCS 含有 DMEM培地 100 1を添加し 2日間培養した。 培養終了後、 上清中の hGH量を
ELISA法 （ピコィァ TM HGHプレート ：住友製薬） で測定した。
まず、 第一世代アデノウイルスベクター AxlCAHGHを用いて予備検討を行い、 ゥ ィルス感染時の moi 0. 01〜 1の範囲では添加したウィルス量と hGH産生量がほぼ 比例したことより、 hGH産生量がウィルス量を反映することを確認した。 そこで、 力価が既知の AxlCAHGH (Lot. B、 力価 3· 0 χ 10 1 0 PFU/ml) を対照ゥ ィルスとして、 AE2A-CAHGH (Lot. 3) の感染力価を測定した。 感染時の各ウィル スの希釈倍率を、 30, 000、 90, 000, 270, 000倍希釈とし、 2日後の hGH産生量を比 較した。 いずれの希釈倍率とも、 ΔΕ2Α- CAHGH (Lot. 3) より AxlCAHGH (し ot. B)の 方が hGH産生量は高く、 その平均は約 1. 1倍であった。 従って、 Δ Ε2Α- CAHGH (Lot. 3) の力価は、 3. 0 X 10 1 0 PFU/ml x 1/1. 1 = 2. 7 x 10 1 0 PFU/ml (相 当） と算出した。
この値を元に AE2A-CAHGH (Lot. 3) の総収量を計算すると、 225cm フラスコ 48本分の 293細胞から 4. 7 X 10 1 0 PFU (相当） のウィルスが得られた。 さらに、 精製ウィルスの 260 nmの吸光度の測定から、 A E2A_CAHGH (Lot. 3) の粒子数 (particles) プラーク形成単位 （PFU) 比は 63であった。
また、 Δ Ε2Α- CAHGHの別ロッ トについても同様の測定を行い、 Δ Ε2Α- CAHGH
(Lot. 2) の総収量は 225cm 2フラスコ 20本分の 293細胞あたり 1. 9 x 10 1 0 PFU (相当） 、 粒子数 プラーク形成単位比は 47であった。
②純度測定
E2A欠損アデノウィルスベクターは超遠心法により精製しているが、 精製時に 除去できなかった第一世代アデノ ウィルスベクター （Ax2LD3LCAHGHおよび AxCANCre) が若干混入している。 これら混入している第一世代アデノウイルスべ クタ一は 293細胞で増殖できるので、 293細胞を用いた通常の方法 （限界希釈法） で測定した力価は、 混入している第一世代アデノウイルスベクターの量を反映し ている。 そこで、 Δ Ε2Α- CAHGH (Lot. 3) の純度を求めるため、 293細胞を用いた 限界希釈法により力価を測定した。 Δ Ε2Α- CAHGH (Lot. 3) の力価は 7. 8 x 10 8 PFU/ml , AxlCAHGH (Lot. B)の力価は 4. 4 x 10 1 0 PFU/mlで、 その比は 1. 8%であ つた。 ①の結果から、 AxlCAHGH (Lot. B)は AE2A-CAHGH (Lot. 3) の 1· 1倍の感染 力価であることより、 この値を補正し、 AE2A-CAHGH (Lot. 3) の純度は、 （1 - 0. 018 X 1. 1) X 100 = 98% と算出した。
また、 同様の測定から別ロット AE2A_CAHGH (Lot. 2) の純度は 97%であった。 ( 5 ) E2A欠損アデノウィルスベクターのアデノウィルス蛋白の発現低下の確認 E2A欠損アデノウィルスベクター感染細胞では、 E2A遺伝子にコードされる DBP (single stranded DNA binding protein) およびアデノウイルス粒子の主要な 構成蛋白質であるへキソンの発現が低下しているかどうかを蛍光抗体法により検 討した。
コラーゲンコートされた 8ゥェルカルチャースライド （BECKTON DIKINS0N社、 #40630) でコンフルェントとなった A549細胞 （約 1. 5 x 10 5 cells) に、 moi 100または moi 10となるように 5% FCS含有 DMEM培地で希釈した AE2A_CAHGHまたは AxlCAHGHを含むウィルス液 100 を添加し、 37°Cで 1時間感染させた。 感染後、 ウィルス液を除き 5% FCS含有 DMEM培地 0. 3 mlを添加し 2日間培養した。 2日後、 培地を除き細胞を PBS (-)で洗浄後、 2%パラホルムアルデヒ ド ZPBS (-) を 0. 4 ml 加え、 室温で 10分間細胞を固定し、 PBS (-)で 2回洗浄した。 さらに、 1 mg/mlの サポニンにより膜透過処理 （室温、 30分） を行った後、 DBPもしくはへキソンの 検出に供した。
DBPの検出は、 スライドグラスを 10% 正常ャギ血清でブロッキング後、 ゥサギ 抗 DBPぺプチド （RPPTMEDVSSPSPSPPPPRAPPKKR： DBPの 22 - 46番目のアミノ酸残基に 相当） 抗体、 FITC標識ャギ抗ゥサギ抗体 （JACKSON社、 #111-096-003) を順次反 応させた後、 DAPI (4， ， 6- diamino- 2- phenyl- indole) 溶液で核染色を行い、 落 射式蛍光顕微鏡 （ォリンパス BX- 50) にて観察した。
へキソンの検出は、 スライドグラスを 10% 正常ゥサギ血清でブロッキング後、 ャギ抗へキソン抗体 （CHEMIC0N社、 AB- 1056) 、 FITC標識ゥサギ抗ャギ抗体 (Vector Laboratories社、 FI- 5000) を順次反応させた後、 DAPIで核染色を行い、 落射式蛍光顕微鏡にて観察した。
ΔΕ2Α - CAHGH感染細胞では、 DBPおよびへキソンとも発現量が明らかに減少し、
AE2A-CAHGHを moi 100で感染させた細胞での DBPおよびへキソン陽性細胞の割合 は、 AxlCAHGHを moi 10で感染させた細胞とほぼ同じであった。 従って、 Δ Ε2Α- CAHGHは当初の目的通りアデノウィルス遺伝子の発現が低下していることが確認 できた。
実施例 3
E2A欠損アデノウィルスの炎症惹起作用の検討
アデノウィルス E2A遺伝子を欠失させることにより炎症惹起作用が低下するか どうかを明らかにするため、 hGH発現 E2A欠損アデノウイルスベクター （Δ Ε2Α - CAHGH) または hGH発現第一世代アデノウイルスベクター （AxlCAHGH) をマウスに 投与し、 血中 GPT (グルタミン酸一ピルビン酸一トランスアミナーゼ） 値を指標 に、 両アデノウイルスベクターの炎症惹起作用を比較した。 以下に方法及び結果 を示す。
( 1 ) 方法
マウスは、 C57BL/6マウス （7週齢、 雌） を用いた。 またアデノウイルスべク ターは、 A E2A-CAHGH (Lot. 3) 又は AxlCAHGH (Lot. C) を用いた。 アデノウィル スベクター投与量は 1 X 10 J PFU、 3 x 108 PFU又は 1 x 108 PFU (—群 5匹） とし、 生理食塩水で希釈したアデノウイルスベクターを、 マウス 1匹当たり 0. 2mlずつ尾静脈より投与した。 アデノウィルスベクター投与 3日前および投与 3、 5、7、10、14、21、28、35、42、49、56、及び 63日後に、 エーテル麻酔下、 へパリン処理へ マトクリツト管を用いて眼窩静脈より部分採血した。 血液を 10， 000回転、 5分遠 心し、 血清を分離し、 使用まで- 20°Cで保存した。 血清中の GPT値は、 トランスァ ミナーゼ C II-テス トヮコー （和光純薬） を用い、 P0P-T00S法にて測定した。
( 2 ) 結果
アデノウィルスベクターを C57BL/6マウスに投与後、 経日的に測定した血清 GPT 値の平均値を図 2に示した。 それぞれの投与群のベタターの投与効率を確認する ため、 アデノウィルスベクター投与 3日後および 5日後の血清の hGH濃度も測定 した。 アデノウイルスベクター投与量が同じ群では、 AxlCAHGH投与群と Δ Ε2Α -
CAHGH投与群での血中 hGH濃度には有意の差はなく、 両ベクターは同じ効率で投与 されたことを確認した。
次いで、 血清 GPT値の測定を行った。 AE2A-CAHGH投与マウスにおいても、 アデ ノウィルスベクター投与量に応じて血清 GPT値は上昇し、 第一世代アデノウィル スベクター AxlCAHGH投与マウスと差は無かった。 この結果より、 アデノウイルス
E2A遺伝子を欠損させても炎症惹起作用を軽減できないことが示された。
実施例 4
UV不活化アデノウィルス粒子の調製
アデノウィルスベクターをマウスに投与した際に生じる炎症の原因が、 アデノ ウィルス粒子自体に起因するか否かを明らかにする目的に使用するため、 以下の 操作により UV不活化アデノウィルス粒子の調製を行った。
実施例 2— （2 ) に記載した方法で精製した hGH発現アデノウイルスベクター
AxlCAHGH ( 3. 0 x 10 1 0 PFU/ml、 1. 4 x 10 1 " particles/ml ) 1. 8mlに、 33 mg/mlの濃度の 8- methoxypsoralen (8-MOP) 18 μ ΐを添加し （8- MOPの終濃度 330 μ g/ml) 、 その 0. 6mlずつを直径 35圓の組織培養用シャーレ （住友ベークライ ト、 型番 MS- 10350) 3枚に分注した。 次いで、 シャーレを氷上に置き、 シャーレのフ タをしたまま、 波長 365 nmの UVランプを装着した （8ワット、 5本） UVクロスリ ンカー （StratalinkerT M UV Crosslinker 1800 model, STRATAGENE社） の UVラ ンプ下 5cmの位置においた。 そして、 10分おきにシャーレの位置を変えながら、 1時間 UVを照射した （UV強度約 1. 8 mW) 。 UV照射後、 シャーレからウィルス液を 回収し、 8-M0Pを除くために 10%グリセロール含有 PBS (-)でー晚透析した。 最終的 に粒子濃度 1. 1 X 10 1 particles/mlのウィルス液を約 1. 7ml回収し、 - 80°Cで凍 結保存した。
上記処理によりアデノウイルスベクターが不活化されたことは、 hGH産生量と 力価測定の二つの方法で確認した。 hGH産生量の測定は、 実施例 2— （4 ) に示 した方法で行った。 ただし、 異なる点として、 アデノウイルスベクター感染 1 日 後の hGH濃度を測定した。 UV不活化処理前のアデノウィルスベクター AxlCAHGHを 1 X 10 " particles/mlで感染させた場合の hGH産生量は約 0. 2 ng/ml、 1 x 10 1 0 particles/mlで感染させた場合は約 28 μ g/mlであった。 一方、 上記不活化処理 を行ったアデノウイルスベクターは、 1 X 10 1 0 particles/mlで感染させた場 合でも hGH産生量は 0. 4 ng/ralであった。 従って、 hGH産生量から計算すると、 ァ デノウィルスベクターの感染性は、 不活化処理により 10 "分の 1に低下している ことが確認された。 また、 293細胞を用いた通常の方法での力価測定も行った。 不活化処理前のウィルス力価は約 3 X 10 1 O pFU/mlであったが、 不活化処理後の 力価は 2 X 103 PFU/ml未満であり、 ウィルス力価は 10 7分の 1以下に低下して いた。
以上の結果より、 本方法により UV照射処理を行ったウィルス （UV不活化アデノ ウィルス粒子） は、 十分に不活化されていることを確認した。 実施例 5
第一世代アデノウィルスベクター投与時の炎症の原因の検討
実施例 3で E2A欠損アデノウィルスベクターをマウスに投与しても、 第一世代 アデノウイルスベクター （AxlCAHGH) を投与した場合に較べて血清 GPT値が低下 しなレ、、 すなわち炎症が軽減されなかったことを示した。 この結果の解釈として、 以下の 4つの可能性が考えられた。 ① E2A遺伝子の発現は炎症には関与しない。
②レポーターとして用いた hGH蛋白質が細胞性免疫の抗原となり炎症が起きる。
③外来プロモーター （CAGプロモーター） により発現が誘導されたウィルス遺伝 子産物が細胞性免疫の抗原となる。 ④感染した動物個体内で新たに合成されるゥ ィルス蛋白ではなく、 ウィルス感染時に細胞内に持ち込まれたウィルス粒子構成 蛋白質が細胞性免疫の抗原となる。
そこで、 種々の構造のアデノウイルスをマウスに投与し、 血清 GPT値を炎症の 指標として、 第一世代アデノウィルスベクター投与時の炎症の原因の検討を行つ た。 以下に、 用いたアデノウイルスベクター、 実験方法及び結果を示す。
( 1 ) アデノウイルスベクター
用いたアデノウィルスベクターを以下に示す。 全て第一世代アデノウィルスべ クタ一である。
• hGH発現アデノウィルスベクター： AxlCAHGH
• hGH cDNAを有さず CAGプロモーターのみが揷入されたアデノウィルスべクタ —： AxCAwt (図 1 ：ポリ A配列も挿入） （Kanegae Υ· et. al. , Nucleic. Acids
Res. , Vol. 23, 3816-3821. (1995) )
. プロモーター等の外来遺伝子が挿入されていないアデノウイルスベクター （制 限酵素 Swal部位のみが挿入） ： Axlwl (図 1、 Miyake S. et. Al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93， 1320-1324. (1996)、 なお本文献中では Adexlwと記 載）
• AxlCAHGHを UV照射により不活化したウィルス ： UV不活化粒子 （実施例 4参照） ( 2 ) 方法
方法の大部分は実施例 3に示した方法と同じである。 以下、 相違点のみを記載 する。 ベクター投与量は、 1 x 109 PFU、 3 x 10 8 PFU、 1 x 108 PFU又は 3 x 10 7 PFU (一群 5匹） で行った。 なお UV不活化粒子は PFU換算では投与量が決められな いので、 粒子数換算で AxlCAHGHと同量になるよう投与した。
採血は、 ベクター投与 3日前おょぴ投与 3、5、7、10 (又は 11)、14、21、28日後に行つ た。
( 3 ) 結果
実験は 2回に分けて行った。 1回目は、 AxlCAHGHと AxCAwtとを比較した （図 3、 上段） 。 2回目は、 AxlCAHGH、 Axlwl及び UV不活化粒子を比較した （図 3、 下 段） 。 両実験とも陰性対照としてベクターの希釈に用いた生理食塩水のみを投与 した群を設定した。 図 3において、 生理食塩水投与群のデータは 1回目の実験の 結果のみを示すが、 2回目の実験の結果も同様であった。
CAGプロモーターの制御下に hGHを発現するアデノ ウイルスベクター (AxlCAHGH) 投与群と、 CAGプロモーターのみを有するアデノウイルスベクター (AxCAwt) 投与群との間には、 血清 GPT値の上昇の程度にほとんど差が無かった。 従って、 レポーター遺伝子である hGHの発現は炎症に関与していないことが示さ れた。 一方、 外来遺伝子が挿入されていないアデノウイルスベクター （Axlwl) 投与群および UV不活化粒子投与群では、 血清 GPT値は全く上昇しなかった。 AxCAwtと Axlwlとの構造の違いは CAGプロモーター及びポリ A配列の有無だけであ るので、 血清 GPT値の上昇の原因、 すなわち炎症の原因は、 主に CAGプロモーター に起因することが示された。
実施例 6
CAGプロモーターにより発現が誘導されるアデノウィルス遺伝子の同定
第一世代アデノウィルスベクターにおいて、 CAGプロモーターにより発現が誘 導され炎症の原因となるアデノウィルス遺伝子を同定するため、 以下に示す種々 のアデノウイルスベクターを、 第一世代アデノウイルスベクターが増殖できない 細胞株 （A549細胞または HepG2細胞） に感染させ、 発現するアデノウイルス遺伝 子をノザンブロットにより解析した。 検討に用いたアデノウイルスベクターは、 CAGプロモーターを有する第一世代アデノ ウィルスべクター （AxlCAHGH、 AxCAwt) 、 外来プロモーターが存在しない第一世代ベクター （Axlwl) および CAG プロモーターを有する E2A欠損アデノウイルスベクター （A E2A-CAHGH) である。 なお、 目的のアデノウイルス遺伝子、 すなわち CAGプロモーターにより発現誘導 される遺伝子とは、 AxlCAHGH、 AxCAwt, Δ Ε2Α - CAHGHの 3種のベクター感染細胞 では同程度発現するが、 Axlwl感染細胞ではほとんど発現しないアデノウィルス 遺伝子である。 以下に、方法及び結果を示す。
( 1 ) 方法
25cm の培養フラスコにほぼコンフルェント （confluent) となった （約 5 x 10 6 cells) A549細胞 （ヒ ト肺癌由来細胞株） もしくは HepG2細胞 （ヒ ト肝癌由 来細胞株） に、 5%FCS含有 DMEM培地で希釈した各アデノウイルスベクター 0. 3mlを 加え 1時間感染させた （moi 100) 。 感染後、 ウィルス液を除き 5%FCS含有 DMEM培 地 5mlを加え 24時間培養した。 24時間後、 培地を除き細胞を PBS (-)で 2回洗浄後、 IS0GEN (二ツボンジーン社） を用い、 その使用説明書に従い各ウィルス感染細胞 から RNAを調製した。
ノザンブロットに用いたプローブは、 コスミ ドベクター pAxcw (前出） をテン プレートとして PCRにより増幅した DNAを、 BcaBESTT M Label ing Kit (宝酒造） を用いて [ α - 3 2 P] dCTP標識した。 PCRに用いたプライマーの配列を以下に示す
(括弧内の数値は、 アデノウイルス 5型の塩基番号及び配列番号） 。
L1 ： 5'プライマー 5' -ACTGCGGCTAATGGTGACTGAGACA-3' (12, 818 - 12， 842/配列 3) 3'プライマー 5' -CGGCCGCGCGATGCAAGTAGTCCAT-3' (13, 440-13, 416/配列 4) L2 ： 5'プライマー 5' -AGCGGCGCGGAAGAGAACTCCAACG-3' (15， 098-15, 122/配列 5) 3'プライマー 5' -ATGCCCAGGGCCTTGTAAACGTAGG-3' (15， 834 - 15， 810/配列 6) L3： 5'プライマー 5' -GGGCTCCAGTGAGCAGGAACTGAAA-3' (21, 735-21， 759/配列 7) 3'プライマー 5' -CTGCGCACTGTGGCTGCGGAAGTAG-3' (22, 305-22， 281/配列 8) L5： 5，プライマー 5' -GACCCCTCACAGTGTCAGAAGGAAA-3' (31, 484-31， 508/配列 9) 3'プライマー 5' -GCCAAACAGCCTTTAACAGCCAAAA-3' (32, 378-32， 354/配列 10) pIX： 5'プライマー 5' -ATGAGCACCAACTCGTTTGATG-3' (3， 609-3， 630/配列 11) 3'プライマー 5， -TGTTTTAAACCGCATTGGGAGGGGA-3' (4， 035-4， 011/配列 12) Iva2： 5，プライマー 5' - AAGAACTTGGAGACGCCCTTGTGA - 3， (4, 554-4, 577/配列 13) 3'プライマー 5， - TGTGGGACCGCCTGGAACTGCTTG - 3' (5, 181-5， 158/配列 14) E4 : 5'プライマー 5, - GGCAGTGGTCTCCTCAGCGA-3' (33， 301- 33， 320/配列 15) 3'プライマー 5' -TGAGGAAGTGTATGCACGTG-3' (33， 800-33, 781/配列 16) E2A： 5'プライマー 5' -TGCTCAGGGCGAACGGAGTCAACTTTGGTA-3' (22, 769-22, 798/ 配列 17)
3'プライマー 5' -GTATGCGGACGCAAGAGGAAGAGGAAGAGC-3' (23, 584-23, 555/ 配列 18)
RNA各 5 gを 1 %ァガロースゲル電気泳動後、 キヤビラリートランスファー法 でナイロンフイノレター （Hybond- NT、 Amersham社） にブロッテイングし、 UVクロ スリンクを行った。 フィルターを 0. 02%メチレンブルー溶液で染色し 28Sおよび 18Sの RNAの位置を確認した後、 バッファー A ( 0. 5M Na 2 HP0 4 (pH7. 2) /7% SDS/lmM EDTA) 50 mlを加え 65°Cで 2時間プレハイブリダィゼーシヨンを行った。 次いで、 フィルターに3 2 P標識プローブ 12. 5 ngを含む 50mlのバッファー Aを加 え、 65°Cでー晚ハイブリダィゼーシヨンを行った。 さらに、 バッファー B (40mM Na 2 HP04 (pH7. 2) /1% SDS) 200mlを加え、 フィルターを 65°Cで 2回洗浄した後、 オートラジオグラムに供した。
( 3 ) 結果
ノザンプロットの結果の例を図 4 A〜Cに、 また結果のまとめを表 1に示した。 アデノウイルス主要後期プロモーター （major late promoter： MLP) に支配され る主要後期遺伝子、 例えばへキソンを含む L3遺伝子は、 A549細胞では AxCAwt感染 細胞に較べ Axlwl感染細胞での発現が明らかに低下していたが、 AE2A-CAHGH感染 細胞でも同様に低下していた （図 4 A) 。 さらに、 HepG2細胞では、 AE2A-CAHGH 感染細胞でのみ L3遺伝子の発現が低下していた。 データは省略するが、 他の主要 後期遺伝子である L2およびし 5遺伝子でもし 3遺伝子の場合と同様の結果であり、 こ れらの後期遺伝子は CAGプロモーターによる発現誘導は認められなかった。
E2A遺伝子の発現は、 Δ Ε2Α- CAHGH感染細胞では当然ながら低下していたが、 Axlwl感染細胞と AxCAwt感染細胞との間で差はなく、 両ウィルス感染細胞で同程 度発現していた。 E4遺伝子の発現は、 全てのベクター感染細胞間で差は無く、 い ずれのウィルス感染細胞とも同程度発現していた （以上データ省略） 。 従って、 E2A遺伝子および E4遺伝子とも CAGプロモーターにより発現は誘導されないこと力 S 明らかとなった。
MLPに支配されない遅延初期 （delayed early) 遺伝子である IVa2遺伝子の発現 は、 HepG2細胞では Axlwl感染細胞と AxCAwt感染細胞との間で差はなく、 同程度発 現していた。 一方、 A549細胞では Axlwl感染細胞でのみ、 IVa2遺伝子の発現が低 下していた （図 4 B ) 。
また、 MLPに支配される後期遺伝子の一つである L1遺伝子の発現も IVa2遺伝子 と同様な傾向で、 H印 G2細胞と A549細胞とでは異なる結果であった （表 1参照） 。 一方、 IVa2遺伝子と同じく MLPに支配されない遅延初期遺伝子であるタンパク 質 IX遺伝子 （以下、 pIX遺伝子） の発現は、 A549細胞および HePG2細胞とも同じ結 果であった。 すなわち、 AE2A-CAHGH感染細胞では pIX遺伝子の発現は低下せず、 Axlwl感染細胞でのみ、 発現が明らかに低下していた （図 4 C ) 。
以上の結果より、 A549細胞おょぴ H印 G2細胞の両方の細胞株で、 血清 GPT値の変 動と同様の発現パターン、 すなわち AxCAwt、 AxlCAHGH、 A E2A_CAHGH感染細胞で はほぼ同じで Axlwlで感染細胞でのみ発現が低下している遺伝子は、 pIX遺伝子の みであった。 このことから、 CAGプロモーターにより発現が誘導され炎症の原因 となっているのは pIX遺伝子であることが示された。
表 1 ノザンブロッ トの結果
遺伝子 細胞株 Axlwl AxCAwt AxlCAHGH △E2A- CAHGH
L 1 A 5 4 9 + + + Z—
H e p G 2 + + +
L 2 A 5 4 9 + +
H e p G 2 + + +
L 3 A 5 4 9 + +
H e p G 2 + + +
L 5 A 5 4 9 + +
H e p G 2 + + +
E 2 A A 5 4 9 + + +
H e p G 2 + + +
E 4 A 5 4 9 + + + +
H e p G 2 + + + +
I V a 2 A 5 4 9 + + +
H e p G 2 + + + + p 1 X A 5 4 9 + + +
H e p G 2 + + +
Figure imgf000062_0001
実施例 7
CMVプロモーターによる pIX遺伝子の発現誘導の確認
CAGプロモーターと同様に CMVプロモーターでも pIX遺伝子の発現が誘導される か否かについて検討した。 CMVプロモーターが挿入された組換えアデノウイルス は、 アデノウィルス 5型の E1欠失部位に CMVプロモーターと大腸菌 lacZ遺伝子と が右向けに挿入された組換えアデノ ウィルス AdCMVlacZ ( Osada S. et. al. , idney Int. , Vol. 55, 1234-1240. (1999) ) を用いた。 CAGプロモータ 一が挿入された対照ウィルスとしては、 実施例 6で示した AxCAwtを用いた。
AdCMVlacZもしくは AxCAwtを、 実施例 6に示したのと同様の方法により A549細 胞に感染させ、 24時間後に RNAを回収した。 ただし、 感染時の moiは、 AdCMVlacZ は moi 6または moi 2、 AxCAwtは moi 300または moi 100とした。 ノザンブロットは、 実施例 6で示した pIXプローブを用いて行った。
結果を図 5に示す。 AdCMVlacZを moi 6で感染した細胞では、 AxCAwtを moi 100 で感染した細胞と同等かそれ以上の pIX遺伝子が発現していた。 両ウィルス感染 時の moiが異なること、 およびプロモーターの挿入方向が異なりプロモーターか ら pIX遺伝子までの距離が異なるので、 CAGプロモーターと CMVプロモーターの pIX 遺伝子の発現誘導の強さの程度を比較はできないが、 CMVプロモーターを挿入し た AdCMVlacZ感染細胞の方がより低い moiでも pIX遺伝子を発現していたことより、 CMVプロモーターでも pIX遺伝子の発現が誘導されることが明らかに示された。 実施例 8
SR aプロモーター、 EF- 1 aプロモーターによる pIX遺伝子の発現誘導の有無の検
CMVェンハンサーを含まない外来プロモーターにより、 pIX遺伝子の発現が誘導 されるか否かについて検討した。 検討に用いた外来プロモーターは、 SR aプロモ 一ター （Takebe Y. et. al. , Moi. Cel l. Biol. Vol. 8, 466-472. (1988) ) 及 び EF- l aプロモーター （Kim D. W. et. al. , Gene, Vol. 91， 217-223· (1990) ) で、 各々のプロモーターと大腸菌 lacZ遺伝子とが左向きに挿入されたァ デノウィルスベクター （AxSRLacZ -し及び AxEFLacZ-L) を用いた。 陽性対照として、 CAGプロモーターのみが挿入されたアデノウィルスベクター AxCAwt (実施例 5参 照） 及ぴ CAGプロモーターと大腸菌 lacZ遺伝子とが左向きに挿入されたアデノゥ ィルスベクター （ AxCALacZ-し ) を用いた。 AxSRLacZ -し、 AxEFLacZ - L及ぴ AxCALacZ-Lの作製方法は、 斎藤らにより開示されており （特開平 7-298877) 、 資 料中の AdexlSRLacZ -しは AxSRLacZ- L と 、 AdexlEFLacZ-Lは AxEFし acZ_L と 、 AdexlCALacZ-Lは AxCALacZ -しとそれぞれ同一である。 また、 陰性対照としては、 外来プロモーターが挿入されていないアデノウィルスベクター Axlwl (実施例 5 参照） を用いた。 さらに、 実施例 7で用いた CMVプロモーターを有するアデノウ ィルスベクター （AdCMVlacZ) についても再度検討した。
前記 6種類のアデノウイノレスベクター （AxSRLacZ- L、 AxEFLacZ -し、 AxCALacZ -し、 AdCMVlacZゝ AxCAwt , Axlwl ) を A549細胞に moi 30または moi 100で感染させ、 24 時間後に RNAを回収し、 pIXプローブを用いてノザンプロットを行った （方法の詳 細は実施例 6参照） 。
結果を図 6に示す。 CMVプロモーターを有するアデノウイルスベクター (AdCMVlacZ) 感染細胞では、 やはり pIX遺伝子は明らかに発現しており、 その発 現量は陽性対照である CAGプロモーターを有するアデノウィルスベクター (AxCALacZ-L及ぴ AxCAwt) 感染細胞と同等かそれ以上であった。
一方、 EF- 1 αプロモーターを有するアデノウイルスベクター （AxEFLacZ - 感 染細胞では pIX遺伝子の発現は全く認められなかった。 また SR c プロモーターを 有するアデノウイルスベクター （AxSRLacZ- L) 感染細胞では、 pIX遺伝子の発現 が認められた。
以上の結果から、 外来プロモーターによる pIX遺伝子の発現はプロモーターに よる特異性があり、 例えば EF-l aプロモーターのように pIX遺伝子の発現を全く 誘導しない外来プロモーターが存在することが示された。 さらに、 CAGプロモー ターと CMVプロモーターとの構造の共通部分は CMV IEェンハンサーだけであるの で、 pIX遺伝子の発現を誘導しているのは、 主に CMV IEェンハンサーであること が示された。
実施例 9 異なるプロモーターを有するアデノウィルスベクターの炎症惹起能の検討
外来プロモーターによる pIX遺伝子の発現誘導とアデノウィルスベクターを動 物に投与した際に生じる炎症とが相関していることを証明するために、 実施例 8 で用いたアデノウイルスベクターのうち、 AxEFLacZ -し、 AxCALacZ -し、 AdCMVlacZ、 Axlwlの 4種のベクターを C57BL/6マウスに投与し、 血清 GPT値を指標に炎症の程 度を比較検討した。
アデノウイルスベクターは、 1 X 109 PFU (AdCMVlacZ以外） 、 3 x 108 PFU、 1 x 108 PFUを尾静脈投与 （一群 5匹） し、 投与 3日前および投与 3、 5、 7、 10、 14、 21、 28、 35日後に採血し、 GPT値を測定した。 各々の方法の詳細は、 実施例 3に示 した方法に準じた。
結果を図 7に示す。 CMVプロモーターを有する AdCMVlacZ投与マウスでは、 CAG プロモーターを有する AxCALacZ-L投与マウスよりも血清 GPT値が上昇し、 炎症の 程度と実施例 8で示した pIX遺伝子の発現量とが相関していた。 一方、 EF-l aプ 口モーターを有する AxEFLacZ- L投与マウスでは、 血清 GPT値はほとんど上昇せず、 外来プロモーターが挿入されていない Axlwl投与マウスと同レベルであつた。 以上の結果より、 pIX遺伝子の発現と in vivo投与時の炎症とが正の相関をして いること、 すなわち、 pIX遺伝子の発現を誘導しないプロモーターを有するアデ ノウィルスベクターは炎症を惹起しないことが示され、 外来プロモーターからの pIX遺伝子の発現誘導が炎症の原因であることが示された。
実施例 1 0
抗タンパク質 IX抗体の作製ならぴにタンパク質 IXの検出
( 1 ) タンパク質 IX (pIX) 遺伝子のクローユング
ヒ トアデノウイルス 5型 （Ad5) の pIX遺伝子のコーディング領域を PCR法によ りクローニングするため、 以下の操作を行った。 前出のコスミ ドベクター pAxcw をテンプレートとして、 以下の配列のプライマーを用いて PCR反応を行った。 5' 側プライマーは、 Ad5の 3585 - 3605番目の塩基配列および EcoRI認識部位を有す るように、 3' 側プライマーは Ad5の 4034- 4015番目の塩基配列および Xhol認識部 位を含むように各々設計した。
5' 側プライマー 5' -TAGAATTCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCC- 3' (配列番号 19) EcoRI
3' 側プライマー 5' -TACTCGAGGTTTTAAACCGCATTGGGAG-3 ' (配列番号 20)
Xhol End
Pfx DNAポリメラーゼ （GIBCO BRL社） を用いて PCR反応を行い、 pIX遺伝子のコ ーデイング領域を含む 470bpの DNA断片を増幅した。 市販発現プラスミ ドベクター pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen社） には、 CMVプロモーター下流にマルチクローニン グサイトが存在する。 そこで、 PCRで増幅した 470bpの DNA断片を EcoRIおよび Xhol で同時に消化し、 pcDNA3. 1 (+) のマルチクローニングサイ ト内の EcoRI部位と Xhol部位との間に挿入し、 pIX発現プラスミ ド pCMV- IX (5. 9kb) を得た。 この pCMV- IXの pIX遺伝子のコーディング領域を含む部分の塩基配列を解読し、 その配 列が既存の配列 （ジーンバンク ： アクセス番号 M73260) と相違ないことを確認し た。
( 2 ) pIX融合タンパク質の調製
抗 pIX抗体を得るための抗原として、 pIXとダルタチオン S -トランスフェラーゼ (GST) との融合タンパク質 （GST - pIX) を調製した。
① pIX融合タンパク質発現プラスミ ドの構築
まず、 プラスミ ド pCMV-IXを EcoR Iおよび Xho Iで同時に消化し、 pIX遺伝子を 含む 470 bpの DNA断片を得た。 市販の GST融合タンパク質大腸菌発現プラスミ ドべ クタ一 pGEX - 5X- 1 (アマシャム フアルマシア バイオテク社） には、 GSTの C末側 にマルチクローニングサイトが存在する。 そこで、 pCMV_IXより得た 470 bpの DNA 断片を、 pGEX- 5X- 1のマルチクローニングサイ ト内の EcoR I部位と Xho I部位との 間に挿入し、 GST-pIX発現プラスミ ド pGST - IX (5. 4kb) を得た。
② pIX融合タンパク質の調製
大腸菌 JM 109株をプラスミ ド pGST - IXで形質転換した。 形質転換体で発現した GST-pIXは不溶性であったので、 封入体タンパク質の精製法に準じて GST - pIXを精 製した。 まず、 形質転換した大腸菌を 40mlの L B培地で 37°Cで一晩培養後、 LB培 地 800mlを添加してさらに 1時間培養し、 次いで IPTG (isopropyl-l-thio- j3 -D- galactoside) を添カ卩 （終濃度 0. 2 mM) して 6時間培養後、 菌体を回収した。 菌 体を PBSで洗浄後、 リゾチーム （lmg/ml ) を含むリシスバッファー （lysis buffer： 50mM Tris - HCl (pH 8. 0) /lmM EDTA/lOOmM NaCl) 20mlに縣濁し、 室温で 20分ィンキュベーションし、 10%デォキシコール酸ナトリゥムを含むリシスバッ ファー lmlを添加し、 溶菌した。 次いで、 1M MgCl 2溶液 100 μ 1、 1M MnCl 2溶液 100 μ 1及び DNasel (70 U/ μ 1) 溶液 20 1を添加し、 37°Cで 15分インキュベーシ ヨン後、 15分間遠心 （11, 850 X g) した。 遠心後、 上澄を捨て、 沈殿を 0. 5% Triton X- 100/10 mM EDTAを含むリシスバッファー 20mlで 2回洗浄後、 沈殿を PBS lmlに縣濁した。 この溶液に同量の 6M尿素を添加し、 室温で 1時間インキュベー シヨン後、 15分間遠心 （11, 850 X g) した。 遠心後、 上澄を捨て、 沈殿を PBS 2mlに縣濁した。 この溶液に、 8Mグァニジン塩酸を 6ml (終濃度 6M) 添加し、 15分 間遠心 （11, 850 X g) 後、 その上澄を回収した。 この上澄を精製 GST - pIXとして、 抗 pIX抗体の作製に用いた。
( 3 ) 抗 pIX抗体の作製
精製した GST- pIXは、 6Mグァニジン塩酸を含んだまま、 ゥサギ （日本白色種） に免疫した。
免疫、 採血等は全て旭テクノグラス社に依頼した。 0. 2〜0. 4 mgの抗原 （GST- pIX) を 2羽のゥサギに 2週間おきに 5回免疫した。 4回目の免疫の 1週間後に 部分採血し、 GST-pIXに対する抗体価が十分上がったことを ELISA法にて確認した- 後、 5回目の免疫の 1週間後に全採血し、 抗血清 （#1および #2) を得た。
次に、 これらの抗血清が pIXと反応することをウェスタンブロットにより確認 した。 pIXを含む陽性対照として、 次の二つのサンプルを用いた。 一つは、 E3遺 伝子のみを欠失したアデノウィルス 5型野生株由来ウィルス （Ad5- dlX： Saito L et. al. , J. Virol. , Vol. 54, 711-719. (1985) ) を moi 10で A549細胞に感 染させ、 約 1日後に回収した細胞で、 もう一つは精製したアデノウイルス粒子で ある。 陰性対照としては、 アデノウイルスを感染させていない A549細胞を用いた。 各サンプルを還元条件下、 SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （SDS- PAGE) 後、 ニトロセルロースメンブレン （Hybond ECL、 アマシャム ファノレマシア バイ ォテク社） にブロッテイングした。 メンブレンを 5%スキムミルクでブロッキング した後、 1000倍希釈した抗血清もしくは免疫前血清を添加し、 4°Cでー晚ィンキ ュベーシヨンした。 メンブレンを洗浄後、 ペルォキシダーゼ標識ロバ抗ゥサギ Ig 抗体 F(ab' ) 2画分 （アマシャム フアルマシア バイオテク社、 Cat. NA9340) を 添加し、 室温で 1時間インキュベーションした。 さらに、 メンブレンを洗浄後、 化学発光検出試薬 （ECL Plus検出試薬、 アマシャム フアルマシア バイオテク 社） を添加し、 X線フィルムに露光した。
2種類の抗血清のうち、 例として抗血清 #1を用いた場合のウェスタンブロット の結果を図 8に示す。 免疫後の抗血清を用いた場合、 Ad5- dlX感染細胞おょぴ精 製ウィルス粒子をアプライしたレーンでは、 pIXの分子量に一致する約 14kDaのバ ンドが明らかに検出されたが、 ウィルスを感染させていない A549細胞をアプライ したレーンでは、 このバンドは検出されなかった。 また、 免疫前血清を用いた場 合は、 この 14kDaのバンドはいずれのレーンにおいても全く検出されなかった。 データは示さないが、 #2の抗血清も同様の結果であった。 以上の結果より、 これ ら抗血清で検出された 14kDaのバンドは pIX由来であることが確認できた。 そこで、 これらの抗血清を抗 pIX抗体として、 以後の実験に用いた。
( 4 ) CAGプロモーターにより発現が誘導された pIXの検出
実施例 6〜8で、 CAGプロモーターにより pIX RNAの発現が誘導されることをノ ザンブロットにより示したが、 RNAレベルだけでなくタンパク質レベルでも pIXの 発現が誘導されているかどうかをウェスタンプロットにより検討した。
CAGプロモーターのみが挿入されたアデノウィルスベクター AxCAwt (実施例 5 参照） または外来プロモーターが挿入されていないアデノウィルスベクター Axlwl (実施例 5参照） を A549細胞に moi 100で感染させ、 約 1 日後に細胞を回収 した。 陽性対照として、 Ad5- dlXを moi 10で感染させ、 約 1 日後に回収した A549 細胞を用いた。 前述した （3 ) と同様の方法でウェスタンブロッ トを行い、 抗 pIX抗体 （ ) で pIXを検出した。 図 9に示したように、 AxCAwt感染細胞では Ad5 - dlX感染細胞と同様、 14kDaの pIXが検出された。 一方、 Axlwl感染細胞ではこの 14kDaのバンドは全く認められなかった。 このことから、 pIXは、 タンパク質レべ ルでも CAGプロモーターにより発現が誘導されることが確認できた。
実施例 1 1
pIX再配置型アデノウィルスベクターの作製
pIX遺伝子を再配置したアデノウイルスベクターは、 以下の （1 ) 〜 （3 ) の 手順により作製した。
( 1 ) E4遺伝子の上流域と 3' 側 ITRとの間に pIX遺伝子を挿入した組換えアデノ ウィルスベクター （Ax4pIX) の作製
ヒ トアデノウイルス 5型 （Ad5) の pIX遺伝子の全長を含む領域を PCR法により クローユングするため、 以下の操作を行った。 E1遺伝子および E3遺伝子以外のァ デノウィルス 5型ゲノムの大部分を含むコスミ ドベクター pAxcw (前出） をテン プレートとして、 以下の配列のプライマーを用いて PCR反応を行った。 各プライ マーには、 制限酵素認識部位を付加した。
5， 側プライマー 5' -CCTGAATTC GTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTA-3， (配列番号 21) (Ad5： 3513-3536) EcoRI Rsal
3, 側プライマー 5, -CCTGGATCC GTAC ATTAATTGCTTGATCCAAATCCAAACAG _3， (Ad5： 4076-4054) BamHI Rsal Asel (配列番号 22)
PCRにより増幅した pIX遺伝子を含む約 0. 6kbの DNA断片を EcoRIおよび BamHIで同 時に消化し、 市販プラスミ ド pUC19のマルチクローニングサイト内の EcoRI部位と BamHI部位との間に挿入し、 プラスミ ド pUCfpIX (3. 3kb) を得た。 この pUCfpIXの pIX遺伝子を含むィンサート部分の塩基配列を解読し、 その配列が既存の配列 (ジーンバンク ：アクセス番号 M73260) と相違ないことを確認した。
次に、 pIX遺伝子を E4遺伝子の上流域と 3 ' 側 ITRとの間に挿入したコスミ ドべ クタ一を作製するため、 以下の操作を行った。 コスミ ドベクター pAx4wは、 アデ ノウィルス 5型ゲノムの 2. 6 - 98. 0 m. u (E3遺伝子は欠失） とアデノウイルス 2 型ゲノムの 98. 0 - 100 m. u.を含み、 かつ E4遺伝子のプロモーターの上流域と 3' 側 ITRとの間 （99. 3 m. u. ) にクローニング部位である制限酵素 Swal部位を有する ベクターである （Miyake S. et. Al,， Pro Natl. Acad. Sci.， Vol. 93, 1320-1324. (1996)、 当該文献中では pAx4wは pAdex4wと記載） 。 プラスミ ド pUCfpIXを Rsal消化し、 pIX遺伝子を含む約 0. 6kpの DNA断片を得た。 この 0. 6kbの DNA断片をコスミ ドベクター pAx4wの Swal部位に挿入し、 コスミ ド pAx4pIXL及び pAx4pIXRを得た。 pAx4pIXLは pIX遺伝子が左向きに、 pAx4pIXRは ρΠ遺伝子が右向 きに挿入されたベクターである。
最後に、 C0S/TPC法により、 Ε4遺伝子の上流域と 3' 側 ITRとの間に pIX遺伝子が 挿入された組換えアデノウイルスを作製するため、 以下の操作を行った。 組換え アデノウイノレスベクター Adex4SRLacZL (Miyake S. et. Al. , Pro Natl. Acad. Sci.， Vol. 93, 1320-1324. (1996)および図 1 0参照） は、 アデノウイルス 5型 由来で （E1Aおよび E3遺伝子を欠失） 、 かつ pAx4wと同じ 99. 3 m. u.の位置に大腸 菌 lacZ遺伝子の発現単位が左向きに挿入された非増殖型アデノウイノレスベタター である。 Adex4SRLacZLからアデノウイルス DNA—末端タンパク質複合体 （DNA- TPC) を調製し、 次いでこの DNA-TPCを制限酵素 Aselおよび EcoRIで同時に消化し た。 Adex4SRLacZLのゲノム DNAには、 lacZ遺伝子の発現単位を含むゲノム右半分 に、 Asel部位および EcoRI部位が複数箇所存在するので、 Adex4SRLacZLの DNA- TPC を両制限酵素で消化することにより、 ゲノム右半分が消化された DNA-TPCが得ら れる。 この制限酵素消化 DNA- TPCと、 コスミ ド PAx4pIXしまたは pAx4pIXRとで 293細 胞を形質転換した。 出現した組換えアデノウィルスのゲノム DNAを制限酵素 BspEI 消化ならびに Pmll消化することにより、 目的ウィルスクローンを同定し、 Adex4SRLacZLの大腸菌 lacZ遺伝子の発現単位が pIX遺伝子に置換された組換えァ デノウィルス Ax4pIXLまたは Ax4pIXR (図 1 0 ) を得た。 Ax4pIXLおよび Ax4pIXRは、 pIX遺伝子の本来の位置 （9. 7-11. 2 m. u. ) および E4遺伝子の上流域と 3' 側 ITRと の間のニケ所に、 pIX遺伝子を有する組換えアデノウイルスである。 Ax4pIXLと Ax4pIXRの構造の違いは、 E4遺伝子と ITRとの間の pIX遺伝子の挿入方向のみであ り、 Ax4pIXLは pIX遺伝子が左向きに、 Ax4pIXRは pIX遺伝子が右向きに挿入された 組換えアデノウイルスである。
( 2 ) E1A、 E1B、 ρΠ遺伝子を欠失したアデノウイルスゲノムを有するコスミ ド ベクター （pAx ApIXcw) の作製
pIX遺伝子を含むアデノウイルス 5型ゲノムの左端 17 %を含むプラスミ ドを調 製するため、 以下の操作を行った。 前出のコスミ ドベクター pAxcw (図 1 1 ) は、 E1遺伝子 （Δ454- 3328) および E3遺伝子 （ Δ 28592- 30470) 以外のアデノウィル ス 5型ゲノムの大部分を含むベクターである。 pAxcwを Hindlllおよび EcoRVで消 化し、 次いで Klenow酵素で平滑化した後に自己ライゲーシヨンさせ、 プラスミ ド pAxl7cw (6. 5kb :図 1 1 ) を得た。 pAxl7cwは、 E1遺伝子を除くアデノウイルス 5型の左端約 17% (1-453、 3329-6241) を含むプラスミ ドである。 pAxl7cwから pIX遺伝子を欠失させたプラスミ ドを作製するため、 以下の ）〜 (c)の 3種の DNA断片を調製した。
(a) pAxl7cwを Swalおよび Xhol消化した、 pIX遺伝子を含まない約 4. Okbの DNA断片 c
(b) pAxl7cwを AlwNIおよび Xhol消化した、 アデノウイルス 5型ゲノムの 4054- 5788番目に相当する約 1. 7kbの DM断片。
(c) Swal消化断片一 Clal認識部位 Sail認識部位一 Nrul認識部位一 AlwNI消化断 片の配列を有するように設計した、 以下に示す配列の合成 DNAを、 その 5' 末端を リン酸化後、 アニーリングした二本鎖 DNA断片。
(Swal)
Clal Sail Nrul (AlwNI)
5， -AAATCGATT GTCGAC TCGCGA CAGACT-3' (配列番号 23)
3' -TTTAGCTAA CAGCTG AGCGCT GTC- 5' (配列番号 24)
上記 (a) (b) (c)の 3断片をライゲーシヨンし、 E1A、 E1Bおよび pIX遺伝子を欠失 した （Δ454- 4053) プラスミ ド pAxl7 ApIXcw (5. 8kb：図 1 1 ) を得た。
次いで、 コスミ ドベクター pAxcwの BamHI部位から BstZ17I部位間の塩基配列を、 プラスミ ド pAxl7 ApIXcwの BamHI部位から BstZ17I部位間の塩基配列と入れ換えた コスミ ドベクターを作製するため、 以下の（d)〜（f)の 3種の DNA断片を調製した。
(d) pAxl7 ApIXcwを BamHIおよび BstZ17I消化した、 Swal認識部位を含む約 2. 2kbの DNA断片。
(e) pAxcwを BamHIおよび Csp45I消化した、 アデノウイルスゲノム DNAを含まない約 10kbの DNA断片。
(f) pAxcwを Csp45Iおよび BstZ17I消化した、 アデノウィルスゲノム DNAを含む約 30kbの DNA断片。
上記（d) (e) (f)の 3断片をライゲーシヨンし、 E1A、 E1B、 pIX遺伝子を欠失した アデノウイルスゲノムを有するコスミ ドベクター pAxApIXcw (41· 8kb：図 1 1 ) を得た。
最後に、 コスミ ドベクター pAx ApIXcwの E1A、 E1B、 pIX遺伝子欠失部位に、 ヒ ト成長ホルモン （hGH) の発現単位を挿入したコスミ ドベクターを作製するため、 以下の操作を行った。 CAGプロモーター下流に hGH cDNAを連結した hGH発現単位を有するコスミ ド pAxlCAHGH (実施例 1 ) を制限酵素 Pmelで消化し、 hGH発現単位を含む約 3. Okbの DNA断片を得た。 この DNA断片を、 コスミ ドベクター pAx ApIXcwの Swal部位に挿入 し、 コスミ ド pAx ApIXCAHGH (44. 8kb：図 1 1 ) を得た。
( 3 ) pIX再配置型アデノウイルスベクターの作製
( 1 ) に示した組換えアデノウイルス Ax4pIXLまたは Ax4pIXRと、 （2 ) で示し たコスミ ドベクター pAx ApIXCAHGHとの相同組換えにより、 pIX再配置型アデノウ ィルスベクターを作製するため、 以下の操作を行った。 Ax4pIXLおよび Ax4pIXRか らアデノウィルス DNA - TPCを調製し、 次いで各々の DNA-TPCを制限酵素 EcoT22Iで 消ィヒした。 Ax4pIXLならびに Ax4pIXRのゲノム DNAの左半分には EcoT22I部位が複数 箇所存在するので、 EcoT22I消化により、 ゲノム左半分が消化された DNA-TPCが得 られる。 EcoT22I消化した Ax4pIXRの DNA-TPCと、 コスミ ド pAx ApIXCAHGHとで 293 細胞を形質転換した。 出現した組換えアデノウィルスのゲノム DNAを制限酵素消 ィ匕 （XhoI、 Nrul、 BspEIなど） することにより、 目的ウィルスクローンを同定す る。 その結果、 pIX遺伝子の本来の位置 （9. 7-11. 2 m. u. ) には pIX遺伝子が存在 せず、 pIX遺伝子が E4遺伝子の上流域と 3' 側 ITRとの間に再配置された、 pIX再配 置型アデノウイルスベクター （AxRpIXRCAHGH、 図 1 0 ) が得られる。 同様に、 EcoT22I消化した Ax4pIXLの DNA - TPCと、 コスミ ド pAx A pIXCAHGHとで 293細胞を开$ 質転換することにより、 pIX再配置型アデノウイルスベクター （AxRpIXLCAHGH、 図 1 0 ) が得られる。 AxRpIXRCAHGHと AxRpIXLCAHGHとは pIX遺伝子の挿入方向の みが異なり、 AxRpIXRCAHGHは pIX遺伝子が右向きに、 AxRpIXLCAHGHは pIX遺伝子が 左向きに挿入された組換えアデノウィルスである。
実施例 1 2
pIX発現細胞株の作製
pIX欠失型アデノウイルスベクターの産生に用いるため、 293細胞を形質転換し pIX発現細胞株を作製した。
実施例 10— (1) で作製した pIX発現プラスミ ド pCMV- IXを用い、 リボフヱクシ ョン法 （FuGENET M6トランスフエクション試薬： ロシュ · ダイァグノスティッ ク社） により、 293細胞を形質転換した。 pCMV-IXにはネオマイシン耐性遺伝子が 挿入されているので、 形質転換 3日後に、 600 g/mlの G418硫酸塩 （ジヱネティ シン： GIBCO BRL社） を含む培地に交換し、 形質転換細胞をさらに 13日間培養後、 細胞をクローニングした。 G418耐性細胞株のうち任意の 10クローンについて、 pIX遺伝子が発現しているかどうかをノザンブロットにより検討した。 その結果、 4クローン （#2、 #5、 #6、 #10) で pIX遺伝子が発現していることを確認した。 そ こで、 これらの 4クローンの pIX遺伝子の発現の安定性を検討するため、 これら 4クローンを 30継代まで継代し、 その間 5継代ごとに RNAを調製し、 ノザンブロ ットにより pIX遺伝子の発現を確認した （図 1 2 ) 。 その結果、 クローンにより pIX遺伝子の発現量に差があるものの、 4クローンとも少なくとも 30継代までは pIX遺伝子を安定に発現することが確認された。
さらに、 25継代目の細胞を用いて、 実施例 1 0— （3 ) に示したウェスタンブ ロッ ト法により、 pIXの発現をタンパク質レベルでも確認した （図 1 3 ) 。 この 実験および図 1 2の実験では、 陽性対照として外来プロモーターが挿入されてい ないアデノウィルスベクター Axlwlを感染させた 293細胞を用いた。 A549細胞など アデノウィルス E1Aおよび E1B遺伝子を発現していない細胞に Axlwlを感染させて も、 pIXは RNAレベル （図 4、 図 6 ) 、 タンパク質レベル （図 9 ) ともほとんど発 現しない。 しかし、 E1Aおよび E1B遺伝子を発現している 293細胞に Axlwlを感染さ せた場合は、 E1遺伝子を欠失した第一世代アデノウィルスベクターの通常の増殖 サイクルに当てはまり、 十分量の pIXを発現する。 図 1 3に示した結果より、 Axlwl感染 293細胞の pIXの発現量より、 やや少ないものの、 4クローンともタン パク質レベルでも pIXを発現していることが確認できた。
以上の結果は、 pIXを恒常的にかつ安定に発現する pIX発現細胞株が 4クローン (#2, #5、 #6、 #10) 得られたことを明らかに示すものである。
実施例 1 3
pIX欠失型アデノウィルスベクターの作製
実施例 5で用いたアデノウイルスベクター AxCAwtと、 実施例 1 0— ( 2 ) に示 した pIX遺伝子欠失コスミ ドベクター pAx ApIXCAHGHとの相同組換えにより、 pIX 欠失型アデノウィルスベクターを作製するため、 以下の操作を行った。
AxCAwtからアデノウイルス DNA-TPCを調製し、 次いで EcoT22I消化した。 この DNA-TPCとコスミ ドベクタ一 pAx ApIXCAHGHとで、 293細胞もしくは実施例 1 2に 示した pIX発現細胞株を形質転換する。 出現した組換えアデノウィルスのゲノム DNAを制限酵素消化 （Clal、 Nrul、 Sailなど） することにより、 目的ウィルスク ローンを同定し、 pIX欠失型アデノウイルスベクター Ax ApIXCAHGH (図 1 0 ) を 得る。 Ax ApIXCAHGHは、 E1A、 E1B、 pIX遺伝子を欠失し （Δ454- 4053) 、 かつ E3 遺伝子も欠失した （Δ 28592- 30470) 、 アデノウイルス 5型由来の組換えアデノ ウィルスである。
pIX発現細胞株を形質転換して pIX欠失型アデノウィルスべクターを得た場合は、 ウィルスの継代及び大量調製には引き続き pIX発現細胞株を用いる。 一方、 293細 胞を形質転換して pIX欠失型アデノウイルスベクターを得た場合、 pIX発現細胞株 を用レ、てウィルスの大量調製を行う。
次いで、 pIX欠失型アデノウィルスベクターを精製してウィルス粒子を調製し、 抗 pIX抗体を用いたウェスタンブロッティング法により、 ウィルス粒子には正常 量の pIXタンパク質が含まれていることを確認する。
実施例 1 4
ρΠ再配置型アデノウィルスベクター及び pIX欠失型アデノウィルスベクター投与 による炎症の有無の検討
pIX再配置型アデノウィルスべクター及び pIX欠失型アデノウィルスベクターは、 炎症が軽減されていることを確認するため、 実施例 3及び 5と同様に、 血中 GPT 値を炎症の指標とした in vivo実験を行う。 試験するアデノウイルスベクターを 以下に示す。
•hGH発現 pIX再配置型アデノウィルスベクター ： AxRpIXRCAHGH、 AxRpIXLCAHGH (実施例 1 1 )
. hGH発現 pIX欠失型アデノウィルスベクター： Ax ApIXCAHGH (実施例 1 3 ) . hGH発現第一世代アデノウィルスベクター ： AxlCAHGH (実施例 5 )
•外来遺伝子が揷入されていない第一世代アデノウィルスベクター： Axlwl (実 施例 5 )
マウス系統、 アデノウイルスベクターの投与量などの実験方法は、 実施例 3に 示した方法で行う。 その結果、 AxlCAHGH投与マウスでは、 実施例 3及び 5の場合と同様に、 血清 GPT値は有意に上昇する。 しかし、 AxRpIXRCAHGH、 AxRpIXLCAHGH及び Ax Δ pIXCAHGH投与マウスでは、 Axlwl投与マウスと同様、 血清 GPW直は全く上昇しない。 以上の結果より、 pIX再配置型アデノウィルスベクター及び pIX欠失型アデノウイ ルスベクターは、 in vivo投与しても炎症が殆ど起こらないことが示される。
産業上の利用の可能性
本発明により、 ウィルスタンパク質の発現が抑制され、 炎症が軽減した安全性 の高い遺伝子治療用のアデノウィルスベクターを提供することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以下の （1) 〜 （4) の特徴を有する、 i n V i v o投与時に炎症が軽 減される組換えアデノウイルスベクター：
(1) アデノウイルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子が欠失している ；
(2) アデノウィルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されて いる ；
(3) 以下の （A) 及び 又は （B) の特徴を有する ；
(A) 外来プロモーターにより発現誘導を受けるアデノウィルスゲノムの遺伝子 力 正常な位置から外来プロモーターによる発現誘導を受けない位置に再配置さ れているか、 又は欠失している ；
(B) 外来プロモーターにより発現誘導を受けるアデノウィルスゲノム遺伝子の プロモーターの塩基配列が、 外来プロモーターの作用を受けないように置換され ている ；
(4) アデノウイルス野性株と同等の性質を有する正常なウィルス粒子を形成し ている。
2. アデノウイルスゲノムのプロモーターが ML P及び Z又は I V a 2遺伝子 プロモーターである、 請求項 1記載の組換えアデノウィルスベクター。
3. 以下の （5) 〜 （8) の特徴を有する、 請求項 1又は 2記載の組換えアデ ノウイノレスベクター：
(5) アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子が欠失している ；
(6) アデノウィルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されて いる ；
(7) アデノウイルスゲノムのタンパク質 I X遺伝子が、 正常な位置から外来プ 口モーターによる発現誘導を受けない位置に再配置されている ；
(8) アデノウイルス野性株と同等のタンパク質 I Xを含有し、 正常なウィルス 粒子を形成している。
4. アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子欠失部位に、 外来プロモ 一ターを含む外来遺伝子が挿入されている、 請求項 1〜 3いずれか記載の組換え アデノウイノレスベタター。
5. アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子以外の少なくとも一つの 遺伝子の全部又は一部が欠失した、 請求項 1〜4いずれか記載の組換えアデノゥ イノレスベクター。
6. アデノウイルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子、 ならびにタンパク質 I X遺伝子以外の少なくとも一つの遺伝子の全部又は一部が欠失した、 請求項 3〜 5いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター。
7. アデノウイルスゲノムの E 3遺伝子の全部又は一部が欠失した、 請求項 1 〜 6いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター。
8. アデノウイルスゲノムの E 2 A遺伝子の全部又は一部が欠失した、 請求項 1〜 7いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター。
9. アデノウィルスゲノムの E 4遺伝子の少なくとも 1つの〇R Fを保持する、 請求項 1〜8いずれか記載の糸且換えアデノウィルスベクター。
10. アデノウイルスゲノムの E 4遺伝子の O R F 3を保持する、 請求項 9記載 の組換えアデノウィルスベクター。
11. アデノウィルスゲノムの E 4遺伝子の O R F 3以外の他の O R Fの全部又 は一部が欠失した、 請求項 1 0記載の組換えアデノウイルスベクター。
12. 外来プロモーターから 1 8 k b以上離れこ位置にタンパク質 I X遺伝子が 再配置された、 請求項 3〜1 1いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター。
13. アデノウイルスゲノムの L 3遺伝子と E 2 A遺伝子の間にタンパク質 I X 遺伝子が再配置された、 請求項 1 2記載の組換えアデノウイルスベクター。
14. 外来プロモーターから 2 4 k b以上離れた位置にタンパク質 I X遺伝子が 再配置された、 請求項 3〜1 1いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター。
15. アデノウィルスゲノムの E 3遺伝子欠失部位にタンパク質 I X遺伝子が再 配置された、 請求項 1 4記載の組換えアデノウイルスベクター。
16. 外来プロモーターから 3 0 k b以上離れた位置にタンパク質 I X遺伝子が 再配置された、 請求項 3〜1 1いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター。
17. アデノウイルスゲノムの E 4遺伝子上流領域と 3， I T Rとの間にタンパ ク質 I X遺伝子が再配置された、 請求項 1 6記載の組換えアデノウィルスベクタ
18. 外来プロモーターが哺乳動物由来及び Z又は動物ウィルス由来の成分を含 む、 請求項 1〜1 7いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター。
19. 外来プロモーターが CMVェンハンサーを含む、 請求項 18記載の糸且換え アデノウイルスベクター。
20. 外来プロモーターが CMVプロモーターである、 請求項 19記載の糸且換え アデノウィルスベクター。
21. 外来プロモーターが CAGプロモーターである、 請求項 1 9記載の組換え アデノウィルスベクター。
22. 外来プロモーターが RSVプロモーター又は S Raプロモーターである、 請求項 18記載の組換えアデノウイルスベクター。
23. アデノウイルスがヒ トアデノウイルスであることを特徴とする、 請求項 1 〜22いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター。
24. アデノウィルスが 2型又は 5型のアデノウィルスであることを特徴とする、 請求項 23記載の組換えアデノウィルスベクター。
25. 以下の （9) 〜 （1 1) の特徴を有する、 請求項 1又は 2記載の組換えァ デノウィルスベクター：
(9) アデノウイルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子、 ならびにタンパク質 I X遺伝子が欠失している ；
(10) アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入され ている ；
(1 1) アデノウイルス野生株と同等のタンパク質 I Xを含有し、 正常なウィル ス粒子を形成している。
26. アデノウイルスゲノムの E 3遺伝子の全部又は一部が欠失した、 請求項 2 5記載の組換えアデノウイルスベクター。
27. アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子欠失部位、 又は E 3遺伝 子欠失部位に、 外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入されている、 請求項 2 5又は 26記載の組換えアデノウィルスベクター。
28. アデノウイルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子、 E 3遺伝子、 ならびに タンパク質 I X遺伝子以外の少なくとも一つの遺伝子の全部又は一部が欠失した、 請求項 2 5〜2 7いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター。
29. アデノウイルスゲノムめ E 2 A遺伝子の全部又は一部が欠失した、 請求項 2 5〜2 8いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター。
30. アデノウイルスゲノムの E 4遺伝子の少なくとも 1つの O R Fを保持する、 請求項 2 5〜2 9いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター。
31. アデノウイルスゲノムの E 4遺伝子の O R F 3を保持する、 請求項 3 0記 載の組換えアデノウィルスベクター。
32. アデノウィルスゲノムの E 4遺伝子の O R F 3以外の他の O R Fの全部又 は一部が欠失した、 請求項 3 1記載の組換えアデノウイルスベクター。
33. 外来プロモーターが哺乳動物由来及び/又は動物ウィルス由来の成分を含 む、 請求項 2 5〜3 2いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター。
34. 外来プロモーターが CMVェンハンサーを含む、 請求項 3 3記載の組換え アデノウィルスベクター。
35. 外来プロモーターが CMVプロモーターである、 請求項 3 4記載の組換え アデノウィルスベクター。
36. 外来プロモーターが C A Gプロモーターである、 請求項 3 4記載の組換え アデノウィルスベクター。
37. 外来プロモーターが R S Vプロモーター又は S R αプロモーターである、 請求項 3 3記載の組換えアデノウィルスベクター。
38. アデノウイルスがヒトアデノウイルスであることを特徴とする、 請求項 2 5〜3 7いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター。
39. アデノウィルスが 2型又は 5型のアデノウィルスであることを特徴とする、 請求項 3 8記載の組換えアデノウィルスベクター。
40. 以下の （1 2 ) 及び （1 3 ) の特徴を有する、 哺乳動物由来の細胞：
( 1 2 ) アデノウイルスの Ε 1遺伝子及びタンパク質 I X遺伝子を発現する ；
( 1 3 ) 請求項 2 5〜3 9いずれか記載の組換えアデノウイルスベクターを増殖 できる。
41. アデノウイルスのタンパク質 I X遺伝子が、 当該遺伝子の本来のプロモー ター以外の外来プロモーターにより発現制御されている、 請求項 40記載の細胞 c
42. アデノウィルスの E 1遺伝子及ぴタンパク質 I X遺伝子以外の少なくとも 1つ以上のアデノウイルスの遺伝子をさらに発現する、 請求項 40又は 41記載 の細胞。
43. アデノウイルスの E 1遺伝子、 タンパク質 I X遺伝子、 及び E 2A遺伝子 を発現する、 請求項 42記載の細胞。
44. 請求項 40〜43いずれか記載の細胞を用いることを特徴とする、 請求項 25〜39いずれか記載の組換えアデノウィルスベクターの製造方法。
45. 以下の （14) 及び （1 5) の特徴を有する、 i n v i v o投与時に炎 症が軽減される組換えアデノウィルスベクター：
( 14) アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子が欠失している ；
(1 5) アデノウイルスゲノムに、 アデノウイルス遺伝子の発現を誘導しない外 来プロモーターが挿入されている。
46. 以下の （16) 〜 （1 8) の特徴を有する、 請求項 45記載の糸且換えアデ ノウィルスベクター：
(16) アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子が欠失している ；
(1 7) アデノウイルスゲノムのタンパク質 I X遺伝子を本来の位置に保持して いる ；
(18) アデノウイルスゲノムに、 タンパク質 I X遺伝子の発現を誘導しない外 来プロモーターが挿入されている。
47. アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子欠失部位に、 外来プロモ 一ターを含む外来遺伝子が挿入されている、 請求項 45又は 46記載の組換えァ デノウィルスベクター。
48. 外来プロモーターが CMVェンハンサーを含まないことを特徴とする、 請 求項 45〜47いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター。
49. 外来プロモーターを含む外来遺伝子が左向きに挿入されている、 請求項 4 5〜48いずれか記載の組換えアデノウィルスベクター。
50. 外来プロモーターが E F 1 αプロモーターである、 請求項 45〜49いず れか記載の組換えアデノウィルスベクター。
51. 以下の （1 9 ) 〜 （2 1 ) の特徴を有する、 i n v i v o投与時に炎症 が軽減される組換えアデノウイルスベクター：
( 1 9 ) アデノウイルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子が欠失している ； ( 2 0 ) アデノウイルスゲノムに外来プロモーターを含む外来遺伝子が挿入され ている ；
( 2 1 ) 外来プロモーターとアデノウイルス遺伝子との間に、 外来プロモーター によるアデノウィルス遺伝子の発現誘導を抑制する性質を有する塩基配列が挿入 されている。
52. アデノウィルスゲノムの E 1 A及び E 1 B遺伝子欠失部位に、 外来プロモ 一ターを含む外来遺伝子が挿入されている、 請求項 5 1記載の組換えアデノウィ ノレスベクター。
53. 外来プロモーターが CMVェンハンサーを含むことを特徴とする、 請求項 5 1又は 5 2記載の組換えアデノウイルスベクター。
54. 請求項 1〜3 9及び請求項 4 5〜5 3より選択される組換えアデノウィル スベクターを有効成分として含有する、 i n V i V o投与時に炎症を軽減する もしくは誘導しない医薬組成物。
55. 請求項 1〜3 9及び請求項 4 5〜5 3より選択される組換えアデノウィル スベクターを哺乳動物に投与することからなる、 i n V i v o投与時の炎症を 軽減する方法。
56. 請求項 1〜3 9及び請求項 4 5〜5 3より選択される組換えアデノウィル スベクターを哺乳動物に投与することからなる、 i n V i V o投与時の炎症が 軽減される遺伝子治療方法。
57. i n V i V o投与時に炎症を軽減するもしくは誘導しない医薬組成物を 製造するための請求項 1〜3 9及び請求項 4 5〜5 3より選択される組換えアデ ノウィルスベクターの使用。
58. i n v i v o投与時に炎症を軽減するもしくは誘導しない遺伝子治療用 医薬組成物を製造するための請求項 1〜3 9及ぴ請求項 4 5〜5 3より選択され る組換えアデノウィルスベクターの使用。
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