WO2001074399A1 - Medicaments a long temps de conservation dans un tissu - Google Patents

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WO2001074399A1
WO2001074399A1 PCT/JP2001/002604 JP0102604W WO0174399A1 WO 2001074399 A1 WO2001074399 A1 WO 2001074399A1 JP 0102604 W JP0102604 W JP 0102604W WO 0174399 A1 WO0174399 A1 WO 0174399A1
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drug
polyethylene
polyethylene glycol
protein
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PCT/JP2001/002604
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Haruya Sato
Eiko Hayashi
Hideyuki Shirae
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol

Definitions

  • polyethylene glycol (polyethylene glycol) is introduced into a ligand that has a binding affinity for a protein such as a specific receptor or an antigen in a target tissue and has an ability to avoid internalization into cells.
  • TECHNICAL FIELD The present invention relates to a polyethylene dalicol-binding ligand, a novel drug in which a drug is introduced into the polyethylene dalicol chain of the ligand, and a pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient.
  • interferon (IFNa) or ⁇ a treatment for chronic hepatitis C, shows antiviral effects on virus-infected hepatic parenchymal cells due to long-term administration of large doses three times a week, Fever, reduction of platelets and granulocytes, interstitial as various functions such as suppression of cell proliferation, regulation of immune response, regulation of MHC antigen expression are exhibited by binding to IFN receptor on normal cells present throughout the body There were problems such as side effects such as pneumonia and thyroid dysfunction.
  • the inventors of the present application have an appropriate binding affinity for an asia oral glycoprotein receptor specifically expressed in hepatocytes and have been internalized.
  • an artificial ligand see Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-22085 having the property of being difficult to use as a liver recognition element, this human ligand is directly bound to interleukin-12, one of the proteinaceous drugs.
  • the protein drug was accumulated in the liver and succeeded in enhancing the pharmacodynamics in the liver (see W098 / 13381).
  • this artificial ligand-modified protein drug enabled the accumulation of bioactive proteins in the liver and the manifestation of pharmacological effects by systemic administration, it was sufficient in that the drug was retained for a long time and the drug effect was maintained for a long time. It was not satisfactory. Therefore, the inventors of the present application have proposed a fusion protein in which a substrate sequence for transdaltaminase is added to the N-terminal of interleukin-2, and A polyethylene dalicol modified protein drug was synthesized. This human Eligand and polyethylene glycol-modified protein drug have a synergistic effect on accumulation in the liver and retention in the blood.
  • An object of the present invention is to suppress the disappearance in the initial stage of administration as much as possible and to accumulate at a high concentration around the cell by its binding affinity to a specific receptor on the cell membrane.
  • An object of the present invention is to provide a novel ligand which can stay for a long time around a specific receptor. Furthermore, by introducing the novel ligand into a drug such as a bioactive protein that is desired to accumulate around specific cells in the target tissue, a certain quality as a drug capable of accumulating the drug around the receptor and retaining it for a long time can be achieved. And a pharmaceutical composition containing the pharmaceutical as an active ingredient.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, as a ligand that highly accumulates a drug in a target tissue, a specific receptor such as a specific receptor existing on the cell membrane of the target tissue or a protein such as an antigen.
  • a ligand having a binding affinity and an ability to avoid internalization into cells is used, and a polyethylene glycol (polyethylene glycol) chain is bound thereto to form a polyethylene glycol-binding ligand.
  • the present invention has been completed by introducing a drug into a polyethylene glycol chain.
  • a polyethylene dalicol chain binds to a ligand having a binding affinity for a protein such as a specific receptor or an antigen present on the cell membrane of a target tissue and having an ability to avoid internalization into cells.
  • a polyethylene glycol binding ligand a polyethylene glycol binding ligand.
  • the present invention A drug in which a drug is bound to the polyethylene daricol chain of the polyethylene dalicol-binding ligand, or a pharmaceutical composition containing the drug as an active ingredient.
  • FIG. 1 shows the results of the pharmacokinetics in Example 9 and illustrates the concentration accumulated in the liver.
  • Figure 1a 3 minutes after administration
  • Figure 1b 60 minutes after administration.
  • FIG. 2 shows the results of pharmacokinetics after intravenous administration in mice in Example 9 and illustrates the concentration in plasma.
  • Figure 2a 3 minutes after administration
  • Figure 2b 60 minutes after administration.
  • each from all four are bars left unmodified iFN a, (Gal) 3 ( 6) _IFN o ;, PEG12 - represents an IFN, and (Ga l) 3 (6) -PEG12- IFN .
  • Polyethylene renderlicol-binding ligands when used in actual use, particularly when used as pharmaceuticals, exhibit their function by binding to drugs whose activity is known so far.
  • the molecular weight of the drug in which the drug is bound to the polyethylene dalicol chain of the polyethylene dalicol-binding ligand actually used as the drug is preferably 60,000 or more for the purpose of preventing excretion in the kidney, but is preferably lower than 60,000 It does not matter.
  • the molecular weight of polyethylene dalicol used in the production may be appropriately determined based on the molecular weight of the drug used and the molecular weight of the ligand used, but is preferably 5 kDa or more.
  • the target tissue of the present invention is an organ constituting a living body, and is a target tissue for treatment.
  • a target tissue for treatment There is no particular limitation as long as it is a target tissue for accumulating a drug at a high concentration, and examples thereof include liver, kidney, bone marrow, and knee.
  • the protein such as a specific receptor or antigen present on the cell membrane of the target tissue of the present invention has affinity with the ligand of the present invention. However, it is preferable that the proteins such as specific receptor or antigen existing on the cell membrane have no affinity with the drug.
  • the receptor is specific to the target tissue, but it is not necessarily required to be specific, and it is not necessary for the receptor to accumulate ligand in the target tissue. It should be in the evening.
  • ASGP-R asialoglycoprotein receptor
  • mannose receptor which is highly selectively expressed in non-parenchymal cells of the liver
  • epithelial cell growth factor (EGF) receptor whose cell density is low but its receptor density is high
  • Insulin receptor evening transferrin receptor evening
  • folate receptor evening folate receptor evening
  • proteins expressed on cell membranes other than Recept Yuichi include, for example, various transphobes. -Targets and antigens can be targeted.
  • these compounds may be located on the target cell membrane. If so, they could also be targets for the ligands of the first day of the month.
  • the ligand in the present invention has a binding affinity for a protein such as a specific receptor or antigen present on the cell membrane of the target tissue, and has an ability to avoid internalization into cells, and binds to the polyethylene dalicol chain.
  • a protein such as a specific receptor or antigen present on the cell membrane of the target tissue
  • the ligand itself may have an action as a drug, but more preferably the ligand itself has no biological activity.
  • the ratio with the internalization rate constant should be 1 or more, and preferably, the affinity and internalization avoidance ability to some extent, that is, the equilibrium dissociation constant is 10 mM or less, or the internalization rate constant is less than 0.1 lmiiT 1 is necessary.
  • Such a ligand may be a known ligand having a binding affinity for a protein such as a specific receptor or an antigen present on the cell membrane of the target tissue, or a specific receptor or a protein such as an antigen of interest.
  • a ligand obtained by screening, and further, a ligand obtained by designing and synthesizing based on the structure of a protein such as a specific receptor or antigen of interest can be obtained by the screening method described below. (See Japanese Patent Application No. 11-186761).
  • the protein for the receptor is easier than for the other expressed proteins.
  • a receptor an antigen
  • the modified substance is incubated in the presence of free cells or cultured cells expressing the receptor, the ligand bound to the cell surface or the substance modified with the ligand is washed, and then the receptor is removed.
  • ligands or ligand-modified substances that increase the amount of binding compared to the initial addition, or A ligand having a binding affinity for a specific receptor or the like, or a substance modified with the ligand, in the presence of free cells or cultured cells expressing the receptor or the like, and then binding to the cell surface
  • the ligand-modified substance is washed with a buffer containing a chelating agent or an acidic buffer, and then a labeled affinity ligand for the receptor is added to suppress uptake into cells.
  • a buffer containing a chelating agent or an acidic buffer a labeled affinity ligand for the receptor is added to suppress uptake into cells.
  • a labeled affinity ligand for the receptor is added to suppress uptake into cells.
  • the amount of binding of the labeled ligand to the cell surface after cupping, when the ratio of the dissociation rate constant to the internalization rate constant after binding with the receptor is 1 or more is added.
  • the sialoglycoprotein Recept which is specifically expressed in hepatic parenchymal cells.
  • Lactose or N-acetylka ”lactosamine which is a ligand for glycerol, has a branched structure.
  • the skeleton used for branching is preferably a branched structure of acidic or basic amino acids. Any other compound that can be branched into two or more branches, such as trishydroxymethylaminomethane, may be used.
  • Examples of such a compound include those represented by the following general formula (I).
  • T 1 , ⁇ 2 , and ⁇ 3 may be the same or different, each representing a force ', lactose (Gal) or N-acetylka “lactosamine (GalNAc),
  • S ⁇ S 2, S 3 may be the same or different, respectively (CH 2) p or (CH 2 CH 2 0) Q , where p is an integer of 1 ⁇ 1 8, Q is:! Indicates an integer from 6 to 6,
  • AA and BB may be the same or different and each represents a basic amino acid or an acidic amino acid
  • X 1 , X 2 , and X 3 may be the same or different, and when bonded to the amino group of the amino acid represented by AA or BB, indicate one CO—; When combining Indicates one NH—,
  • X 4 represents one CO OH when binding to the amino group of the amino acid represented by AA or BB, and represents one NH 2 when binding to the lipoxyl group of the amino acid represented by AA or BB;
  • n 0 or 1.
  • the amino acids represented by AA and BB may have an amide bond at any of the ⁇ -positions, the ⁇ -position, the ⁇ -position and the ⁇ -position.
  • the ligands described in JP-A-5-22085 may be used.
  • Examples of the basic amino acid and acidic amino acid in the above include lysine, dalmic acid, and aspartic acid.
  • the polyethylene glycol used for the polyethylene glycol chain of the present invention must have a reactive functional group at both ends in view of the properties of the present invention.
  • the reactive functional group referred to here may be any functional group capable of chemically bonding to the ligand and drug of the present invention, such as a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, a vinyl group, a vinyl group, an imidazole group, and a mercapto group. And the like.
  • These groups may have an alkylene group such as a methylene group and an ethylene group, a sulfonyl group, a sulfonyl group, an ether group, a disulfide group, and the like interposed between polyethylene dalichol.
  • use the polyethylene glycol derivative shown below be able to.
  • CH 2 CH-S0 2 - (CH 2 CH 2 0) n-CH 2 -C00H
  • the average molecular weight of the polyethylene glycol or polyethylene blend alcohol derivative may be about lk Da to about 100 kDa, and is preferably in the range of 3 kDa to 20 kDa with the smallest possible molecular weight.
  • the polyethylene daricol-binding ligand of the present invention can be prepared using ordinary organic synthesis techniques such as amide bond, ester bond, ether bond, and disulfide bond, depending on the type of the functional group having the polyethylene daricol derivative and the ligand. And condensed.
  • an alkylamine in which an unterminated amino group is protected with a protecting group such as a Boc group is introduced into one end of a polyethylene glycol at both ends of the carboxylic acid Then, by introducing the ligand to the opposite end of the polyethylene glycol molecule and deprotecting the amino-protecting group, the desired polyethylene dalicol-binding ligand can be produced.
  • the ligand is introduced into the opposite end of the polyethylene glycol molecule, other functional groups may be protected in order to bind the polyethylene glycol to the target site of the ligand.
  • a branched chain having two or more functional groups may be introduced into one end of polyethylene dalicol, and a plurality of recands may be introduced.
  • a drug in which a drug is bound to a polyethylene dalicol chain is a drug in which the above-mentioned ligand, polyethylene glycol, and drug are respectively bound in the order of ligand-polyethylene dalicol-drug. It does not matter even if a group which becomes a chain of is introduced.
  • Examples of the drug in a drug in which a drug is bound to the polyethylene dalicol chain of the polyethylene dalicol-binding ligand of the present invention include, for example, plasma components such as imnog'D-furin, blood coagulation factor, and inter-13 kins.
  • cytodynamics such as tumor necrosis factor (TNF), cell growth regulating factors such as hepatocyte growth factor (HGF) and epidermal growth factor, ⁇ ° -oxide
  • TNF tumor necrosis factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • Bioactive proteins such as antioxidant enzymes such as ismuta-se "(SOD), codfish, and thioredoxin
  • hormones such as growth hormone and insulin
  • bioactive peptides such as immune response regulating factors such as thymosin ⁇ ; Is mentioned.
  • physiologically active protein or physiologically active peptide may be derived from animals, plants, or microorganisms regardless of its origin.
  • the protein may be a protein produced by incorporating and expressing a gene of these proteins or a mutant thereof in Escherichia coli, yeast, yeast cells, or the like.
  • the bioactive protein or peptide of the present invention is preferably purified as much as possible before use in order to minimize the influence of the coexisting protein.
  • anti-cancer drugs such as anti-cancer drugs ⁇ , ⁇ , thymicin (AZT), ate ', ninarabinoshi (ara-A), livilin, etc. Can be used.
  • natural proteins such as alph "min-D-furin” that can be used as these carriers, various monoclonal D-nal antibodies, dextran, chitin, chitosan, and inulin Polysaccharides, such as e. E, such as lyridine ', n-, and poly-glutamic acid.
  • Polyamino acids Bikol I-ter maleic anhydride copolymer (DIVE A), styrene maleic anhydride copolymer (SMA), E. Synthetic polymers such as vinyl alcohol, and even Liho. It can also be introduced into the poly (ethylene dalicol-binding ligand) of the present invention via a lipid assembly carrier such as a soft microsphere X-fiber.
  • the above-mentioned polyethylene render glycol-binding ligand may be prepared in advance, and the drug may be bound to the polyethylene glycol chain.
  • a polyethylene glycol may be bound to the drug to produce a polyethylene-bound drug, and a ligand may be bound to the drug.
  • the ligand, polyethylene glycol, and drug can be bound by a usual method.
  • the bond is preferably a covalent bond, but is not limited thereto.
  • the conjugation can be performed by a chemical method or by a method using an enzyme such as transglutaminase.
  • the molar ratio of these does not need to be 1: 1: 1; the ratio of ligand: polyethylene glycol: drug is 2: 1: 1, 2: 2: 1, 3: 1: 1, 3: 3: 1, etc. Can be considered.
  • the following methods can be used to bind the drug to the polyethylene chain of the polyethylene dalicol-binding ligand or polyethylene dalicol.
  • the drug when the drug is a protein, it is desirable for the drug to have a uniform structure and its biological activity is not reduced, so that the polyethylene glycol-binding ligand polyethylene dalicol chain or polyethylene dali
  • An alkylamine can be introduced into coal and reacted with a protein using transdarminase (see W096 / 06181 and W096-No. 10089). It is particularly preferable to use the microorganism-derived transglutaminase described in W096 / 10089 publication in that regioselective modification is performed only on the glutamine residue.
  • a physiologically active protein or peptide in an aqueous solution, more preferably at about pH 7.5, at room temperature for 12 hours, a physiologically active protein or peptide, a polyethylene dalicol-binding ligand, and transdalase, more preferably a microorganism derived from transglutamin. Evening Minase is reacted.
  • the ratio of the concentration of the bioactive protein or peptide to the polyethylene daricolu ligand is preferably in the range of 1: 100 to 1: 2000.
  • the amount of transdalase minase used is 0.01 to 1 ⁇ m per 1 nmol of protein.
  • reaction selectivity is poor, the Tric-D-row S-triazine method (Trichloro-s-triazine), the carbo ', chiimida, li',-(Carboxyl imidazole) method, and the succinimide iruxinate method ( succinimidyl succ inate), etc. It can also be introduced by random modification.
  • binding of these low molecular weight compounds to the polyethylene chain or polyethylene glycol of the polyethylene glycol binding ligand can be performed, for example, as follows.
  • a low molecular weight compound having an amino group or a hydroxyl group the compound can be bonded via an amide bond.
  • a carboxyl group is introduced into a polyethylene glycol chain or polyethylene glycol, and this is condensed by a usual method used in organic synthesis.
  • an amino group is introduced into a polyethylene daricol chain or polyethylene daricol, and these are condensed by an ordinary method used in organic synthesis.
  • Condensation is carried out under dehydration condensation conditions, specifically in a solvent that does not participate in the reaction (eg, acetonitrile, dimethylformamide, methylene chloride, chloride;!: Tylene) in a suitable catalyst.
  • a solvent that does not participate in the reaction eg, acetonitrile, dimethylformamide, methylene chloride, chloride;!: Tylene
  • reaction can be carried out at a reaction temperature of 0 ° C. to room temperature for 1 to 24 hours in the presence of 1-hydroxybenzene, trial, etc.).
  • a low molecular weight compound having a hydroxyl group or a hydroxyl group it can be bonded via an ester bond.
  • a lipoxyl group is introduced into a poly (tallendalicol) chain or polyethylene dalicol, and these are condensed by a usual method used in organic synthesis.
  • a carboxyl group such an operation is not necessary because polyethylene dalicol has a hydroxyl group.
  • Condensation is carried out under dehydration condensation conditions, specifically in a solvent that does not participate in the reaction (eg, acetonitrile, methylformamide, methylene chloride, I-thylene chloride, etc.) in a suitable catalyst (eg, trityl-3_ (3 D-Pyr) carbo ', C', imide, ⁇ -hydroxysuccinimide, N, N, -C ', cyclohexylcarpho', C ', Imi, 1-hydroxy
  • a solvent that does not participate in the reaction eg, acetonitrile, methylformamide, methylene chloride, I-thylene chloride, etc.
  • a suitable catalyst eg, trityl-3_ (3 D-Pyr) carbo ', C', imide, ⁇ -hydroxysuccinimide, N, N, -C ', cyclohexylcarpho', C ', Imi, 1-hydroxy
  • a low molecular compound having a hydroxyl group it can be bonded via an ether bond.
  • Condensation is achieved by introducing an active halogen group such as a chloro group or a promo group, or a leaving group such as a tosyl group into either a low molecular weight compound or a polyethylene glycol chain and reacting the compound to be bonded. Good. Condensation is treated with a hydride reagent such as sodium hydride or potassium hydride as necessary, and then performed at 0 to 100 ° C in a solvent that does not participate in the reaction (for example, thi ', tylformamide, tetrahydrofuran, etc.). It can be obtained by reacting at the reaction temperature for 1 to 48 hours.
  • a hydride reagent such as sodium hydride or potassium hydride
  • the low-molecular compound and the polyethylene dalicol-binding ligand can be synthesized using a general synthesis method of organic synthesis. In these cases, it is not possible to introduce a functional group for bonding that forms a spacer if necessary for bonding. No problem.
  • the medicament of the present invention may be a therapeutic agent for malignant tumors, an antiviral agent, an antiallergic agent, an immunomodulator, a circulatory function, depending on the drug to be bound to the polyethylenedaricol-ligand, that is, a bioactive protein or a low molecular compound. It can be used as an improving agent, an endocrine function improving agent, a therapeutic agent for diseases caused by abnormal expression or dysfunction of protein, a preventive agent, and the like.
  • the medicament of the present invention can be prepared in any of the formulation forms such as injections such as intravenous injection and intramuscular injection, rectal administration, oily suppository, and water-soluble suppository, depending on the use. it can.
  • formulation forms such as injections such as intravenous injection and intramuscular injection, rectal administration, oily suppository, and water-soluble suppository, depending on the use. it can.
  • These various formulations contain commonly used excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizing agents, preservatives , Soothing agent, stabilizer It can be produced by a conventional method by using as necessary.
  • the non-toxic additives that can be used include, for example, lactose, fructose, fructose, starch, ratine, magnesium carbonate, magnesium synthetic carbonate, talc, mag stearate, magnesium, methylcell D-ose, Carpho "Ximethylcell D-ose or its loam, gum arabic, polyethylene glycol, siroff. , Petrolatum, ku ', lyserin, ethanol, fucopyrenk "recol, cunic acid, sodium chloride, sodium sulfite, sodium phosphate and the like.
  • parenteral administration such as intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, or transmucosal administration is preferred, and more preferably, intravenous administration is preferred.
  • oral administration is preferable, but the administration method is not limited.
  • the dose is preferably lower than the amount of saturated binding to the receptor in order to maximize the efficiency of delivery to the target.
  • the dosage of the modified product of the present invention can be smaller (at least 1/2).
  • the dose may vary depending not only on the drug used but also on the basis of the usage, the age, sex, and the degree of symptoms of the patient.
  • Pharmaceuticals of the present invention that is, pharmaceuticals in which a drug is conjugated to the polyethylene glycol chain of a polyethylene glycol-binding ligand, for example, poly (ethylene glycol) -conjugated (Gal) 3 modified IFN ⁇ , polyethylene glycol modified IF ⁇ , (Gal) 3 modified
  • IFN treatment may be enhanced because it accumulates and stays at high concentrations in target tissues and stays at low concentrations in other organs.
  • Polyethylene dalicol conjugate (Gal) 3 obtained in Example 1 was reacted with human interferon ⁇ ( ⁇ ) in the presence of a microorganism-derived transdaltaminase according to the method described in WO96 / 10989.
  • ⁇ human interferon ⁇
  • a polyethylene glycol bond (Gal) 3 modified IFN can be obtained at a high recovery rate.
  • the purified product was confirmed by 1 H-NMR that the signal derived from the ethyl group adjacent to the terminal carboxylate was shifted by half the amount, and that the main signal derived from the ethylene glycol group of the PEG skeleton was retained.
  • the purified product was confirmed by 1 H-NMR that the terminal Boc group had been eliminated from compound (4). Furthermore, its purity was confirmed by thin-layer chromatography (TLC).
  • 10 Omg of the preliminary study product was combined, and the column on the same scale was repeated four times to obtain 295 mg of (Gal (OAc) 4 ) 3 —PEG.
  • Purified product (G al (OA c) 4 ) in 1 H- NMR 3 - was confirmed by desorption of B oc groups from PEG (B oc). Further, its purity was confirmed by TLC.
  • the reaction solution was cooled and neutralized by adding little by little Dowex 5 OWx 8 washed with methanol.
  • the reaction solution was filtered, and the filtrate was concentrated to dryness to obtain (Gal) 3 (6) -PEG 250 mg.
  • the purified product was identified by confirming the elimination of the OAc group from the (Gal (OAc) 4 ) 3 -PEG by 1 H-NMR. In addition, purity was confirmed by TLC.
  • IFN a prepared according to the method described in WO 01 Z 0 285 1), and unmodified IFNa by 19.9 ⁇ g / kg in terms of IFN, and tail vein administration; After a certain period of time (3 minutes, 60 minutes), blood and liver were collected. The plasma was collected by a conventional method, and the concentration of the sample was measured by ELISA. The liver was homogenized by adding a homogenate buffer (MEM, 5% FBS, pH 7.2 to 7.4) to 9 times the organ weight, and centrifuged at 300 r111 for 10 minutes. The supernatant was diluted with the same homogenate buffer, and the concentration in the sample was measured by ELISA.
  • MEM homogenate buffer
  • the drug of the present invention can reduce the dose to about several times lower than that of the unmodified drug due to its target accumulation and long-term retention, and can perform treatment with reduced side effects. it can. Furthermore, since the polyethylene dalicol-binding ligand can be introduced into the drug in one step, the manufacturing process is simple and a polyethylene glycol-bound ligand-modified drug can be obtained at a high recovery rate. In addition, since the drug of the present invention is a modified product of only one polyethylene glycol-binding ligand, it can be easily proved by performing peptide maps and the like, and a certain quality as a drug can be secured. it can.

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Description

明 細 書 標的組織長期滞留性薬物 技術分野
本発明は標的組織中の特定レセプ夕一あるいは抗原等の蛋白質に対 する結合親和性を有し、 かつ細胞内への内在化回避能を有するリガン ドに、 ポリエチレングリコール （ポリエチレングリコール） が導入さ れたポリエチレンダリコール結合リガンド、 及び当該リガンドのポリ エチレンダリコール鎖に薬物を導入した新規医薬品、 及びそれらを有 効成分として含有する医薬組成物に関する。
背景技術
近年、 遺伝子組換え技術や細胞大量培養法による生産により種々の蛋 白性医薬品が開発された。 しかしながら、 これらの医薬品はいずれも
(1)生体内で酵素により分解され易く、 血中滞留性が低いために大量投 与が必要、 （2) 多様な生理活性をもち標的指向性が低いために、 標的 以外の臓器あるいは細胞周辺への分布による副作用が問題となる、 と いう二つの欠点を持ち合わせたまま使用されているのが現状である。 例えば、 C型慢性肝炎に対する治療薬であるインタ-フェロンひ ( IFN a ) ある いは^は、 長期にわたり週 3回、 大量投与するためにウィルス感染した肝 実質細胞に対する抗ウィルス効果を示す一方、 全身に存在する正常細胞上 の IFNレセプ夕一への結合により細胞増殖抑制、 免疫応答調節、 MHC抗 原発現調節など多様な作用を発現するため、 発熱、 血小板や顆粒球の 減少、 間質性肺炎、 甲状腺機能異常などの副作用があるという問題が あった。
このような副作用や週 3回の通院は患者の Q0Lに大きく影響するため、 これら課題を解決する手段として、 近年、 ポリエチレングリコ一ル (ポリチレングリコール） で修飾した長期滞留型のポリエチレングリ コール— IFN o!が開発された。 このポリエチレンダリコール- IFN aはポ リエチレングリコールを導入した結果、 血中半減期が長くなり、 週 1 回の投与でこれまでの週 3回と同等の抗ウィルス効果を示したが、 標的指 向性は低く、 全身に高い濃度で滞留するため、 発熱等の副作用がこれ までの未修飾体に比べ高まってしまうという問題があった。
一方、 癌に対する免疫療法剤として期待されたインタ-ロイキンー2について もそのポリチレンダリコール修飾体の医薬品開発が試みられたが、 そ の多様な作用によりおこる毒性が大きいことから開発中止となってい るのが現状である。
このようにこれまでの蛋白性医薬品のポリエチレングリコールによる 修飾は、 確かに標的部位における薬物の滞留性が高まることからその 投与量や投与回数を減らせるなどの利点があるものの、 標的以外の臓 器においても同様に滞留するためその副作用については未修飾体と変 わらないか、 むしろ高まってしまう等の問題点を抱えている。
このような問題点を解決するため、 本願の発明者らは肝実質細胞にお いて特異的に発現しているァシァ口糖蛋白質レセプターに対し、 適度 な結合親和性を有し、 かつ内在化されにくいという性質を併せ持つた 人工リガンド （特開平 5— 2 0 2 0 8 5号公報参照。 ） を肝認識素子 として用い、 この人エリガンドを蛋白性医薬品の一つであるィンター ロイキン一 2に直接結合させて人エリガンド修飾蛋白性医薬品を合成 し、 これを用いることにより、 蛋白性医薬品を肝臓へ集積させ、 肝局 所での薬効を高めることに成功した （W098/ 13381号公報参照。 ） 。 し かしながら、 この人工リガンド修飾蛋白性医薬品は全身投与による生 理活性蛋白質の肝臓集積と薬理作用発現を可能にしたものの、 薬物を 長時間滞留させ、 薬効を長時間持続させるという点で十分満足できる ものではなかった。 そこで、 本願の発明者らはインタ一ロイキン- 2の N 末端にトランスダルタミナ一ゼに対する基質配列が付与された融合 蛋白質に対し、 人エリガンド及びポリエチレンダリコールがそれぞれ 1分子づっ導入した人エリガンド及びポリエチレンダリコール修飾蛋 白性医薬品を合成した。 この人エリガンド及びポリエチレングリコー ル修飾蛋白性医薬品は、 肝臓への集積性と血中滞留性の相乗効果によ ル修飾蛋白性医薬品は、 肝臓への集積性と血中滞留性の相乗効果によ り肝臓特異的に高い濃度で長時間させることが示されたが、 異なつた 二つの素子を別々のトランスダル夕ミナーゼを用いて結合させるため、 製造工程が複雑で、 最終精製物の回収率が約 1 %と非常に低いという 問題や、 また二つの素子それぞれの結合部位を同定、 証明するのが容 易ではなく医薬品として一定の品質を保証するのが困難といった問題 があった。
発明の課題
本発明の目的は、 投与初期における消失をできるだけ抑え細胞膜上の 特定なレセプターへの結合親和性によってその周辺に高い濃度で集積 させることができ、 かっ血中滞留性が高いために標的組織中の特定レ セプタ一周辺に長時間滞留することが可能な新規リガンドを提供する ことにある。 さらに当該新規リガンドを標的組織中の特定細胞周辺に 集積させたい生理活性蛋白質等の薬物に導入することにより、 レセプ 夕一周辺への薬物の集積及び長時間滞留が可能な医薬品としての一定 の品質が確保された医薬品及び該医薬品を有効成分とする医薬組成物 を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、 薬 物を標的組織に高く集積するリガンドとして標的組織の細胞膜上に存 在する特定レセプ夕一あるいは抗原等の蛋白質に対する結合親和性を 有し、 かつ細胞内への内在化回避能を有するリガンドを用い、 これに ポリエチレングリコール （ポリチレングリコ一ル） 鎖を結合させてポ リエチレングリコール結合リガンドを作成し、 このリガンドのポリエ チレンダリコ一ル鎖に薬物を導入することにより本発明を完成するに 到った。
すなわち、 本発明は標的組織の細胞膜上に存在する特定レセプ夕一 あるいは抗原等の蛋白質に対する結合親和性を有し、 かつ細胞内への 内在化回避能を有するリガンドにポリエチレンダリコール鎖が結合し た、 ポリエチレングリコール結合リガンドである。 また本発明は上記 ポリエチレンダリコール結合リガンドのポリエチレンダリコ一ル鎖に 薬物が結合した医薬品、 または該医薬品を有効成分として含有する医 薬組成物である。 図面の簡単な説明
【図 1】
図 1は、 実施例 9における体内動態の結果で、 肝臓への集積濃度を 図示したものである。
図 1 a ：投与後 3分； 図 1 b ：投与後 6 0分。
【図 2】
図 2は、 実施例 9におけるマウス静脈内投与後の体内動態の結果で、 血漿中の濃度を図示したものである。
図 2 a ：投与後 3分； 図 2 b ：投与後 6 0分。
以上の図において、 4本の棒グラフは全て左からそれぞれ、 未修飾 iFN a , (Gal ) 3 (6) _IFN o;、 PEG12 - IFN 、 及び（Ga l ) 3 (6) -PEG12- IFN を 表す。
実施の形態
本発明の標的組織の細胞膜上に存在する特定レセプ夕一あるいは抗原 等の蛋白質に対する結合親和性を有し、 かつ細胞内への内在化回避能 を有するリガンドにポリエチレングリコ一ル鎖が結合した、 ポリェチ レンダリコール結合リガンドとは、 実際に使用する場合、 特に医薬品 として使用する場合、 これまで活性の知られている薬物と結合させて 機能を発揮するものである。 分子量は、 実際に医薬品として使用する ポリエチレンダリコール結合リガンドのポリエチレンダリコール鎖に 薬物が結合した医薬品における薬物の分子量が、 腎臓における排泄を さける目的で、 6万以上であることが好ましいがそれ以下であっても 構わない。 このためには、 使用する薬物の分子量、 用いるリガンドの 分子量から製造に使用するポリエチレンダリコールの分子量を適宜決 めればよいが、 好ましくは 5 k Da以上であることが好ましい。
本発明の標的組織とは、 生体を構成する臓器で、 治療のために目的の 薬物を高濃度で集積させる標的となる組織であれば特に制限は無いが、 例えば肝臓、 腎臓、 骨髄、 膝臓等を挙げることができる。
本発明の標的組織の細胞膜上に存在する特定レセプターあるいは抗 原等の蛋白質とは、 本発明におけるリガンドと親和性を有するもので ある。 但し、 これらの細胞膜上に存在する特定レセプ夕一あるいは抗 原等の蛋白質について薬物と親和性を有しないものが好ましい。 また、 本発明の目的の医薬品とするためには、 当該レセプ夕一は標的組織に 特異的なものが好ましいが、 必ずしも特異的である必要はなく、 標的 とする組織にリガンドが集積しうるレセプ夕一であればよい。 例えば、 肝臓を標的とする場合には、 肝実質細胞に多数発現するァシァロ糖蛋 白質レセプター （ASGP-R) などが好ましい。 これ以外には、 例えば肝 非実質細胞にかなり選択的に発現しているマンノースレセプ夕一や、 発現の細胞特異性は低いもののそのレセプター密度が高い上皮細胞成 長因子 （EGF) レセプ夕一、 インスリンレセプ夕一、 トランスフェリン レセプ夕一、 フォレートレセプ夕一等が挙げられる。
一方、 レセプ夕一以外の細胞膜上に発現する蛋白質としては例えば、 各種トランスホ。 -タ-や抗原などがその対象となりうる。
これら特定レセプター、 枋原等の蛋白質以外に、 特定の癌細胞での発 現が正常細胞に比べ高まる化合物に対して結合親和性を有するリガン ドが存在する場合、 これらの化合物が標的細胞膜上あれば、 それらも 本発日月のリガンドの対象となり得る。
本発明におけるリガンドは標的組織の細胞膜上に存在する特定のレ セプターあるいは抗原等の蛋白質に対する結合親和性を有し、 かつ細 胞内への内在化回避能を有するものでポリエチレンダリコール鎖と結 合し得る官能基を有しており、 かつ生体内において副作用を示さない ものであれば特に制限はない。 またこのリガンドは、 リガンド自体が 薬物としての作用を有するものであってもよいが、 より好ましくはリ ガンド自体に生理活性が無いものがよい。 その中で、 リガンドが標的 組織の細胞膜上に存在する特定レセプター対して結合親和性を有する ものである場合、 リガンドの特定レセプ夕一に対する解離速度定数と 内在化速度定数との比が 1以上であれば良く、 好ましくはある程度の 親和性と内在化回避能、 すなわち平衡解離定数が 10mM以下であるか、 内在化速度定数が 0. lmiiT1より小さいことが必要である。
このようなリガンドは、 標的組織の細胞膜上に存在する特定のレセ プ夕ーあるいは抗原等の蛋白質に対する結合親和性を有する公知のリ ガンド、 もしくは目的とする特定のレセプターあるいは抗原等の蛋白 質に対するスクリ一二ングにより得られるリガンド、 さらには目的と する特定のレセプ夕一あるいは抗原等の蛋白質の構造を元に設計し、 合成して得られるリガンドを下記に記載のスクリ一二ング方法により 得ることができる （特願平 11- 186761号公報参照。 ） 。
なお、 標的となる細胞膜上の蛋白質に対するリガンドを人工的に合成 する場合、 そのテ"サ'インは、 レセプタ一に対するものの方がそれ以外の 発現蛋白質に比べ容易である。
上記スクリ一二ング方法を具体的に記載すると、 細胞膜上に存在す る特定のレセプ夕一あるいは抗原等の蛋白質 （以下、 レセプ夕一等と いう。 ） に対する結合親和性を有するリガンドまたはリガンドで修飾 された物質を当該レセプターを発現する遊離細胞または培養細胞の存 在下でィンキュベ一卜した後、 細胞表面に結合しているリガンドまた はリガンドで修飾された物質を洗浄した後、 当該レセプ夕一等に対す る標識化されたリガンドを添加して細胞内への取り込みを抑えた低温 下でインキュベートし、 細胞表面への標識化リガンドの結合量が、 当 該親和性リガンドそのものの非標識体を初期に添加した場合の結合量 に比べて高くなるリガンドまたはリガンドで修飾された物質をスク リ一ニングする方法、 または細胞膜上に存在する特定のレセプター等 に対する結合親和性を有するリガンドまたはリガンドで修飾された物 質を、 当該レセプター等を発現する遊離細胞または培養細胞の存在下 でィンキュペートした後、 細胞表面に結合しているリガンドまたはリ ガンドで修飾された物質をキレ一ト剤入りのバッファーまたは酸性 パッファーで洗浄した後、 当該レセプ夕一等に対する標識化された親 和性リガンドを添加して細胞内への取り込みを抑えた低温下でィン キュペートし、 細胞表面への標識化されたリガンドの結合量が、 レセ プ夕一等と結合後の解離速度定数と内在化速度定数の比が 1以上であ るリガンドを添加した場合の結合量に比べ高くなるリガンドまたはリ ガンドで修飾された物質をスクリーニングする方法等が挙げられる。 例えば肝臓に対するリガンドとしては肝実質細胞特異的に発現するァ シァロ糖蛋白質レセフ。タ に対するリガンドである、 力'ラクト -スあるいは N -ァ セチルカ"ラクトサミンが分岐した構造のものが挙げられる。 分岐に用いる骨格と しては酸性あるいは塩基性アミノ酸による分岐構造が好ましいが、 そ れ以外のトリスヒドロキシメチルアミノメタン等、 2分枝以上にできる化合物であれ ば構わない。
このような化合物として例えば下記一般式（ I )で示されるものが挙げ られる。
T3— S3— X3
I
T1— S1— X1— AA— (BB) n-X4 (I) T2-S2-X2
(式中、
T 1 , Τ 2、 Τ 3はそれぞれ同じでも異なっていても良く力'、ラクト -ス (Gal) または N—ァセチルカ"ラクトサミン (GalNAc) を示し、
S \ S 2、 S 3はそれぞれ同じでも異なっていても良く （CH2) p または （CH2 CH20) Q、 ここで pは 1〜 1 8の整数を、 Qは：！〜 6の整数を示し、
AA、 B Bはそれぞれ同じでも異なっていても良く塩基性アミノ酸ま たは酸性アミノ酸を示し、
X1、 X2、 X3はそれぞれ同じでも異なっていても良く、 AAまたは B Bで示されるアミノ酸のアミノ基に結合する場合は一 CO—を示し、 A Aまたは B Bで示されるアミノ酸のカルボキシル基に結合する場合 は一 NH—を示し、
X 4は、 A Aまたは B Bで示されるアミノ酸のアミノ基に結合する場 合は一 C O OHを示し、 AAまたは B Bで示されるアミノ酸の力ルポ キシル基に結合する場合は一 NH2を示し、
nは 0または 1を示す。 また、 n == lの場合、 AAと B Bで示される アミノ酸はそれぞれ、 α位同士、 位とァ位、 ァ位と α位、 ァ位同士 いずれの位置でアミド結合しいても良い。 ）
これらのリガンドは、 特開平 5— 2 0 2 0 8 5に記載されているリガ ンドを用いても構わない。
上記における塩基性アミノ酸、 酸性アミノ酸は例えばリジン、 ダル夕 ミン酸、 ァスパラギン酸等を挙げることができる。
なお、 上記 （ I ) において、 下記式 （II) に示すリガンドが特に好 ましい。
Figure imgf000010_0001
本発明のポ Jエチレンダリコ一ル鎖に用いるポリェチレングリコ一 ルは、 本発明の性質上、 両端に反応性官能基を有することが必用であ る。 ここでいう反応性の官能基としては、 本発明に於けるリガンド及 び薬物と化学結合が可能な官能基であれば良く、 例えば水酸基、 アミ ノ基、 カルボキシル基、 ビニル基、 イミダゾール基、 メルカプト基等 を挙げることができる。 これらの基はポリエチレンダリコールとの間 にメチレン基、 エチレン基等のアルキレン基、 スルホニル基、 力ルポ ニル基、 エーテル基、 ジスルフィ ド基等を間に介在させていてもかま わない。 例えば、 下記に示すポリエチレングリコール誘導体を用いる ことができる。
NH2-CH2CH2-0- (CH2CH20) 11 - CH2C¾ -皿 2
丽 2- CH2- 0- (CH2CH20) n-CH2-NH2
HOOC-0- (CH2CH20) n-C00H
H00C-CH2CH2-C00- (CH2CH20) n-C0-CH2CH2-C00H
H00C-CH2-0- (CH2CH20) n-CH2-C00H
CH2=CH-S02- (CH2CH20) n-CH2CH2-SO CH=CH2
(C5NH4) -S-S- (CH2CH20) n-S-S- (C5丽 J
HS- (CH2CH20) n-CH2CH2-SH
NH2-CH2CH2-0- (CH2CH20) n-COOH
NH2-CH2CH2-0- (CH2CH20) n-CH2-C00H
NH2-CH2CH2-0- (CH2CH20) n- CO- CH2CH2 - C00H
NH2-CH2-0- (CH2CH20) n-COOH
NH2-CH2-0- (CH2CH20) n-CH2-C00H
NH2-CH2-0~ (CH2CH20) n- CO - CH2CH2- C00H
CH2=CH-S02- (CH2CH20) n-COOH
CH2=CH-S02- (CH2CH20) n-CH2-C00H
CH2=CH-S02- (CH2CH20) n - CO- CH2CH2- COOH 上記に於いて nは整数を表す。 ポリエチレングリコール、 ポリェチ レンダリコール誘導体の平均分子量としては l k Daから lOO k Da程度 のものであればよく、 3 k Daから 20 k Daの範囲で、 分子量幅のできるだ け小さいものがより望ましい。
本発明のポリエチレンダリコール結合リガンドは、 ポリエチレンダリ コール誘導体とリガンドをそれぞれ有する官能基の種類に応じて、 ァ ミ ド結合、 エステル結合、 エーテル結合、 ジスルフィ ド結合等、 通常 の有機合成の技術を用いて縮合させ製造することができる。
具体例として、 例えば両端カルホ'ン酸型ポリエチレングリコールの片端 に、 未端アミノ基を Boc基等の保護基で保護したアルキルアミンを導入 し、 次にリガンドをポリエチレングリコール分子の逆端に導入し、. ァ ミノ基の保護基を脱保護することにより、 目的のポリエチレンダリ コール結合リガンドを製造できる。 なお、 リガンドをポリエチレング リコール分子の逆端に導入する場合に於いて、 リガンドの目的の場所 にポリエチレングリコールを結合させるために、 その他の官能基を保 護しておいてもよい。
また、 必要な場合にはポリエチレンダリコールの片端に 2個以上の官 能基を有する分岐鎖を導入し、 リカ"ンドを複数個導入しても構わない。 本発明のポリエチレンダリコール結合リガンドのポリエチレンダリ コール鎖に薬物が結合した医薬品とは上記リガンド、 ポリエチレング リコール、 薬物がそれぞれリガンド—ポリエチレンダリコール一薬物 の順番に結合したものである。 たとえばそれぞれの間に、 これらを結 合させるための鎖となる基が導入されていても何ら構わない。
本発明のポリエチレンダリコール結合リガンドのポリエチレンダリ コール鎖に薬物が結合した医薬品における薬物としては、 具体的には 例えば、 ィムノグ' Dフ"リン、 血液凝固因子などの血漿成分、 インタ- 13ィキン類、 イン 夕-フエロン / )3 /ァ、 腫瘍壊死因子 （TNF) などのサイト力イン類、 肝細胞成長因 子 （HGF) や上皮細胞成長因子等の細胞増殖調製因子、 ス- Λ° -オキサイド ィ スムタ -セ" (SOD) や力タラ- 、 チォレドキシンなどの抗酸化酵素などの生理活性蛋 白質、 成長ホルモンやインスリンなどのホルモン類やサイモシン αなどの免疫反応調 節因子などの生理活性ペプチドなどが挙げられる。 このような生理活 性蛋白質または生理活性ペプチドはその由来を問わず、 動物由来のも のであっても植物由来のものであっても、 微生物由来のものであって もよい。 また、 大腸菌、 酵母、 チヤィニ-ス ' Λムスタ-ォ Λ"リ-細胞などにこれらの 蛋白質の遺伝子またはその変異体を組み込んで発現させて生産された 蛋白質であってもよい。 さらに、 他の蛋白質とのキメラ体であっても構わ ない。 また、 本発明の生理活性蛋白質またはペプチドは、 共存蛋白質 による影響を最小限に抑えるため、 使用前にできる限り精製しておく ことが望ましい。
また、 生理活性蛋白質以外にもアドリアマイシン、 マイトマイシン メトトレキセ-ト等の 抗がん剤ゃァシ Ί、'、チミシ"ン (AZT) 、 ァテ'、ニンァラビノシ (ara-A) 、 リ ビリンな どの抗ウィルス剤のように毒性が強く標的部位以外への分布による副作用 が問題となる低分子化合物の薬物を用いることができる。
このような毒性の高い低分子化合物などの場合、 これらの運搬体とし て使用できるアルフ"ミンゃ Dフ'リンなどの天然蛋白質、 各種モノク D-ナル抗体、 テ "キストラン、 キチン、 キトサン、 ィヌリンなどの多糖類、 ホ。リリシ'、ン、 ホ-リ ルタミン酸など のホ。リアミノ酸、 ビこル I-テル無水マレイン酸共重合体 (DIVE A) 、 スチレン無水マレイ ン酸共重合体 （SMA) 、 ホ。リビニルアルコ-ルなどの合成高分子、 さらにはリホ。ソ- ムゃリピツドマイクロスフ Xァ-などの脂質集合体キャリア-などを介して本発明のポリ エチレンダリコール結合リガンドに導入することもできる。
ポリエチレングリコ一ル結合リガンドのポリエチレングリコール鎖に 薬物が結合した医薬品を製造するためには、 あらかじめ上記ポリェチ レンダリコール結合リガンドを製造し、 このポリエチレングリコール 鎖に薬物を結合させても良いし、 また薬物にポリエチレングリコ一ル を結合させポリエチレン結合薬物を製造し、 これにリガンドを結合さ せてもよい。
本発明においてリガンド、 ポリエチレングリコール、 薬物は通常の方 法により結合させることができる。 結合は共有結合が好ましいが、 こ れに制限されるものでない。 その結合も化学的な方法で行なうことも できるし、 トランスグル夕ミナーゼなどの酵素を用いた方法により行 なうこともできる。
また、 これらのモル比は 1: 1:1である必要はなく、 リガンド：ポリチレ ングリコール：薬物が 2:1:1, 2:2:1, 3:1:1, 3:3:1等の組み合わせが考 えられる。
薬物とポリエチレンダリコール結合リガンドのポリエチレン鎖、 ま たはポリエチレンダリコールとの結合方法としては次のようなものを 挙げることができる。
まず薬物が蛋白質の場合には、 その構造が均一で、 その生物活性が 低下しないことが医薬品として望ましいため、 ポリエチレングリコー ル結合リガンドのポリエチレンダリコール鎖またはポリエチレンダリ コールにアルキルアミンを導入し、 これにトランスダル夕ミナーゼを 用いて蛋白質と反応させることができる （W 09 6/06 1 8 1号、 及び W096ノ 1 00 8 9号公報参照。 ） が、 特定のグルタミン残基 のみへの位置選択的修飾を行うという点で W09 6 / 1 00 8 9号公 報記載の微生物由来トランスグルタミナーゼを用いることが特に好ま しい。
具体的には水溶液中、 より好ましくは pH7.5前後で、 室温 1 2時間、 生理活性蛋白質またはべプチド、 ポリエチレンダリコール結合リガン ド、 及びトランスダル夕ミナ一ゼ、 より好ましくは微生物由来トラン スグル夕ミナーゼを反応させる。 生理活性蛋白質またはべプチドとポ リエチレンダリコ一ルーリガンドとの濃度比は 1:100から 1:2000の範 囲がよい。 またトランスダル夕ミナーゼの使用量は蛋白質 1 nmolあ たり 0.01から 1ュ；:ツトである。
他の導入法としては SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate ) , SMPT (Succinimidyloxycarbonyl-a-methyl- a - (2- pyridyldithio) toluene) , SMCC (Succ inimidyl-4- (N- ma 1 eimi dome thy 1) cyclohexane-1 -carboxyl ate) 等をポリエチレング リコール結合リガンドのポリエチレンダリコール鎖またはポリェチレ ングリコールに導入し、 これに蛋白質を反応させて蛋白質中の Cys 残 基のみを選択的修飾する方法を用いることもできる （Goodson and Katre, 1990, Biothcnology 8, 343-346, Benhar et al. , J. Biol. Chem. 269, 13398- 13404参照。 ) 。
その他、 蛋白質の N末端アミノ酸がセリンあるいはスレオニンである 蛋白質に対し、 pHなどの反応条件をコントロールすることにより、 ァ ミノキシ誘導体を N末端アミノ基特異的に導入する方法 （Bioconjugate Chem. 1996, 7, 38 - 44参照。 ） 等が挙げられる。
また、 反応選択性が乏しいが、 トリク Dロー S—トリア ン法 （Trichloro - s - triazine)、 カルホ'、キイミダ、リ'、 -ル（Carboxyl imidazole)法、 サクシンイミドイルァクシネ-ト 法（succinimidyl succ inate)等の官能基を導入した ポリエチレンダリ コ一ル結合リガンドによるリジン残基側鎖アミノ基修飾法などへのラ ンダム修飾によっても導入することができる。
一方、 薬物が低分子化合物の場合、 臭化シアン法、 過ヨウ素酸酸化法、 力 ルビシ"イミド法、 ルタルアル ヒド法、 混合酸無水物法、 SPDP試薬法など種々 の方法が挙げられる。 なおこの場合、 薬理作用を細胞内外で効率よく '発揮させるための分解のしゃすさ、 つまりプロ ドラッグ的なリガンド のはずれやすさについても考慮する必要がある。
これらの低分子化合物とポリエチレングリコール結合リガンドのポリ エチレン鎖、 またはポリエチレングリコ一ルとの結合は、 例えば次の ようにして行なうことができる。
アミノ基または力ルポキシル基を有する低分子化合物の場合、 アミ ド 結合を介して結合することができる。 アミノ基を有する低分子化合物 に対しては、 ポリエチレングリコ一ル鎖またはポリエチレングリコー ルにカルボキシル基を導入し、 これを有機合成で用いられる通常の方 法でこれらを縮合する。 一方、 カルボキシル有する低分子化合物に対 しては、 ポリエチレンダリコール鎖またはポリエチレンダリコールに アミノ基を導入し、 これを有機合成で用いられる通常の方法でこれら を縮合する。
縮合は脱水縮合条件下、 具体的には反応に関与しない溶媒 （例えば、 ァセトニトリル、 シ"メチルホルムアミド、 塩化メチレン、 塩化；!:チレンなど） 中で、 適当な触媒
(例えば、 1 -ェチル—3 - (3，一シ'、メチルアミノフ ° ϋピル）カルホ' イミド、 Ν -ヒドロキシスクシ ンイミド、 Ν, Ν' -シ'、シクロへキシルカルホ'、 ィミト'、、 1ーヒドロキシへ"ンソ'、トリア -ルなど ) の 存在下、 0 °Cから室温の反応温度で 1から 24時間反応させて得ること ができる。
水酸基または力ルポキシル基を有する低分子化合物の場合、 エステ ル結合を介して結合することができる。 水酸基を有する低分子化合物 に対しては、 ポリチレンダリコール鎖またはポリエチレンダリコール に力ルポキシル基を導入し、 これを有機合成で用いられる通常の方法 でこれらを縮合する。 一方、 カルボキシル基を有する低分子化合物に 対しては.、 ポリエチレンダリコールが水酸基を有するためこのような 操作は不要である。 縮合は脱水縮合条件下、 具体的には反応に関与しない溶媒 （例えばァセ トニトリル、 シ チルホルムアミド、 塩化メチレン、 塩化 Iチレンなど） 中で、 適当な触 媒 （例えば 卜ヱチル— 3 _ (3 '—シ、、ヌチルアミノフ。 Dピル）カルホ'、シ'、イミド、 Ν-ヒドロキシスクシ ンイミド、 N, N，—シ'、シクロへキシルカルホ'、シ '、イミ 、 1ーヒドロキシへ"ン、,トリア -ルなど） の 存在下、 0 °Cから室温の反応温度で 1から 24時間反応させて得ること ができる。
また、 水酸基を有する低分子化合物の場合、 エーテル結合を介して結 合することができる。
縮合は低分子化合物もしくポリエチレンダリコ一ル鎖のいずれかにク ロル基、 プロモ基等の活性なハロゲン基、 トシル基等の脱離基を導入 し、 これ結合させる化合物を反応させればよい。 縮合は必要に応じて 水素化ナトリウム、 水素化カリウムなどのヒドリド試薬で処理し、 反応に関与しな い溶媒 （例えばシ'、 チルホルムアミド、 テトラヒドロフランなど） 中で、 0 °Cから 100 °C の反応温度で 1から 48時間反応させて得ることができる。
上記以外にも、 また結合がシ"スルフイド結合、 ウレタン結合等用いる低分子化 合物の構造に応じて、 有機合成の通常の合成方法を用いて、 低分子化 合物とポリエチレンダリコール結合リガンドのポリエチレン鎖、 また はポリエチレンダリコールとを結合することができる。 これらの場合 に於いて、 結合のために必用であればスぺーサ一となる結合のための 官能基を導入することは何ら差し支えない。
本発明の医薬品はポリエチレンダリコール-リガンドに結合させる薬 物、 すなわち生理活性蛋白質あるいは低分子化合物に応じて、 悪性腫 瘍治療剤、 抵ウィルス剤、 抗アレルキ' -剤、 免疫調節剤、 循環機能改善剤、 内 分泌機能改善剤、 蛋白質の異常発現あるいは機能異常によって生じる 疾患に対する治療薬、 予防薬などとして使用することができる。
本発明の医薬品は、 例えばその用途に応じて、 静注及び筋注などの注 射剤、 直腸投与剤、 油脂性坐剤、 水溶性坐剤などのいずれかの製剤形 態に調製することができる。 これらの各種製剤は、 通常用いられてい る賦形剤、 増量剤、 結合剤、 湿潤化剤、 崩壊剤、 表面活性剤、 潤滑剤、 分散剤、 緩衝剤、 保存剤、 溶解補助剤、 防腐剤、 無痛化剤、 安定化剤 など必要に応じて用いて常法により製造することができる。 使用可能 な無毒性の上記添加剤としては、 例えば乳糖、 果糖、 フ"ドウ糖、 でんぷ ん、 ラチン、 炭酸マゲネシゥム、 合成ケィ酸マゲネシゥム、 タルク、 ステアリン酸マグ、ネシゥム、 メチルセル D-ス、 カルホ"キシメチルセル D-スまたはその壌、 アラビアゴム、 ポリエチレング リコール、 シロッフ。、 ワセリン、 ク'、リセリン、 エタノ-ル、 フ°口ピレンク"リコール、 クェン酸、 塩 化ナトリウム、 亜硫酸ソ-ダ'、 リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
本発明の医薬品の投与方法は、 薬物が蛋白質またはべプチドの場合に は静脈内投与、 皮下投与、 筋肉内投与、 経粘膜投与などの非経口投与 が好ましく、 より望ましくは静脈内投与がよい。 また、 低分子医薬の 場合には経口投与の方が望ましいが、 その投与方法は限定されない。 また投与量としては、 標的への送達効率を最大にするため、 レセプ ターへの飽和結合量より低い量であることが望ましい。 従来の修飾さ れていない薬物に比べ、 本発明の修飾体の投与量はより少量 （少なく とも 1/2) とすることができる。
その投与量は使用する薬物によっても異なるのみならず、 用法、 患者 の年齢、 性別、 症状の程度などを考慮して適宜決定することができる。 本発明の医薬品、 すなわちポリエチレングリコール結合リガンドのポ リエチレングリコール鎖に薬物が結-合した医薬品、 例えばポリチレン ダリコール結合型（Ga l ) 3修飾 I F N α、 ポリエチレングリコール修飾 I F Ν 、 （Ga l ) 3修飾 I F N αとをそれぞれマウスに静脈内投与し、 体内動態の測定を行うと、 本発明の化合物はリガンドのみによる修飾 体 （（Ga l ) 3修飾 I F N α ) に比べ、 腎臓における糸球体濾過の回避に より投与初期における消失が抑えられ、 さらに循環血液中での他臓器 における消失をも回避できるため、 その肝臓における滞留性が大幅に 向上する。 さらに他臓器での濃度推移については、 ホ。リエチレン リコ-ルのみ の修飾体 （ポリエチレングリコール修飾 I F N ひ ） に比べ低い濃度で 滞留する。
これにより標的組織においては高い濃度で集積'滞留し、 他臓器にお いては低濃度で滞留するため、 IFN の治療係数を高めうることが示唆 される。 好適な実施の形態
(実施例 1)
ポリエチレングリコール結合リガンドの合成
両端カルホ"ン酸を有するホ。リエチレン リコ-ル （平均分子量 9000Da, H00C - CH2 - (OCH2CH2) n-0-CH2-C00H) の片端にトランスダル夕ミナ一ゼの基質とな るようアルキルァミンの Boc 保護体 （H00C- (CH2)5- NHBoc)を導入した 誘導体を合成する。 該 Bocアルキルアミン導入ポリエチレングリコ一ル の逆端カルボキシル基に、 WO 9 6 Z0 6 1 8 1号公報記載の方法に 従って合成した （Gal)3 より末端アルキルアミンを取り除き、 力'ラクト-ス の 水酸基を 0—ァセチル化したゲルタミン酸による 3分枝型 ラクト -スリカ"ンド誘導 体を活性 Iステル法により導入する。 該リカ'ンに、 アルキルアミン導入ポリ エチレングリコールの 末端 Boc 基、 OAc基を順次除去することによ り、 ポリチレングリコール結合 （Gal)3 を得る。
(実施例 2)
ポリエチレングリコール結合リガンドのポリエチレングリコール鎖に 薬物が結合した医薬品の合成
実施例 1で得られるポリエチレンダリコール結合（Gal)3 を微生物由 来トランスダルタミナーゼ存在下、 ヒトインタ-フエロン α (ΙΗ )と WO 9 6 / 1 0 0 8 9号公報記載の方法により反応させ、 ポリエチレングリコ一 ル 結合（Gal) 3修飾 I FN を高回収率で得る。
(実施例 3)
片端アルキルアミン導入ポリエチレンダリコールの合成
片端アルキルアミン導入ポリエチレンダリコールの合成は佐藤らの 方法 （B i o c h e m i s t r y、 3 5 (4 0 ) 、 1 3 0 7 2 ( 1 9 9 6 ) 参照。 ） により行なった。 ジカルボン酸型ポリエチレングリ コール （日本油脂社製、 平均分子量 1 2 0 0 ODa) ( 1 ) 5. 0 0 gに 乾燥 DMF 5 5 mLを加え、 少し加熱し溶解した。 2 5 まで冷却し、 1 一ハイ ドロキシベンゾトリアゾ一ル （ H O B t ) 1 0 1 m g ( 0. 7 5 mm o 1 ) 、 E D C I ( 1 —ェチルー 3— （ 3—ジメチルァミノ プロピル） カルポジイミ ド） 1 44mg (0. 7 5 mm o 1 ) を添加 した。 同温度で 3 0分撹拌後、 N— （ 5—アミノアミル） 力ルバミン 酸 t 一プチノレ （2 ) 1 5 2 ra g (0. 7 5mmo l ) の DMF ( 5 m L) 溶液を滴下した。 反応液を 3 5°Cに加熱し、 1 6時間反応した。 HOB t l O l mg (0. 7 5 mm o 1 ) 、 及び E D C I 1 44 m g (0. 7 5 mm o 1 ) を追加した。 さらに 1 1時間反応後、 H〇 B t l O l mg ( 0. 7 5mmo l ) 、 及び ED C I 1 44mg ( 0. 7 5mmo 1 ) を追加した。 添加後、 さらに 1 1時間反応した後、 反応 液を濃縮して 8. 3 7 gの粗製品を得た。 該粗製品をカラム精製 （シ リカゲル 3 0 0 g、 展開溶媒 クロ口ホルム/メタノール = 9 5 / 5→ 9 2/ 8 ) し、 0. 8 3 gの留分と 1. 46 gの留分に分けた。 0. 8 3 gの留分を再度カラム精製 （シリカゲル 3 0 0 g、 展開溶媒クロ 口ホルムノメタノール = 9 5ノ 5→ 5 0Z 5 0) し 5 0 0mgの精製 品を得た （精製品 1 ) 。 1. 46 gの留分を再度カラム精製 （シリカ ゲル 3 0 0 g、 展開溶媒クロ口ホルムノメタノール二 9 5 / 5→ 5 0 / 5 0) し 1 0 5 8 mgの精製品を得た （精製品 2 ) 。 精製品は1 H— NMRにより末端カルボン酸隣接ェチル基由来のシグナルが半量分の みシフトし、 P E G骨格部分のエチレングリコール基由来のメインシ グナルが保時されていることより確認した。
(実施例 4)
化合物 （ 5) の合成
WO 0 1 / 0 2 8 5 1号公報記載の方法により合成した化合物（4) 1. 4 1 g ( 0. 8 1 mm o 1 ) をアルゴン気流下、 ジクロロメタン （ 1 0 m L ) 溶液に 0 °Cでトリフルォロ酢酸 6. 5 5 mLを 3 0分で滴下 した。 滴下終了後、 2 0 Cまで昇温し、 3 0分反応した。 反応液を濃 縮し、 さらにエタノールで 3回共沸し、 できるだけトリフルォロ酢酸 を除去した。 得られた粗製品をカラム精製 （シリカゲル 8 0 g、 展開 溶媒 クロ口ホルム→クロ口ホルム /メタノール = 5 Z 1 ) し、 1. 3 5 gのカラム精製品を得た。 これを再度カラム精製 （シリカゲル 5 0 g、 展開溶媒 クロ口ホルム→クロロホルム メタノール = 8ノ 1 ) し、 4 5 7 mgの （ 5 ) を得た （ 3 4 %収率） 。 精製品は1 H— NMRによ り化合物 （4 ) に対し末端 B o c基が脱離されていることにより確認 した。 さらに、 その純度は薄層クロマトグラフィー （T L C) で確認 した。
(実施例 5 )
(G a l (OA c ) 4) 3— P E G (B o c ) の合成
アルゴン気流下、 化合物 （3) 6 7 O m g , E D C I 5 1 . 4 m g
( 2 6 8 mm o 1 ) 、 及び乾燥 D M F 3 5 mLを加え、 さらに HO B t 3 6 . 2 m g ( 2 6 8 mm o 1 ) を加えた。 この溶液に化合物
( 5 ) 2 2 0 m g ( 1 3 4mm o 1 ) の乾燥 DMF ( 3 0 mL ) 溶液 を滴下した。 反応液を昇温し、 3 3 °Cで 1 4時間反応した。 反応液を 濃縮し、 1 . 0 8 gの粗製品を得た。 これをカラム精製 （シリカゲル 1 0 0 g、 展開溶媒 クロ口ホルム メタノール = 9 5 / 5→ 9 3 / 7 ) 6 9 7 mgの （G a l (OA c ) 4) 3 - P E G (B o c ) を得た。 同様に、 6 1 0 mg、 1 0 2 m gの （3) からそれぞれ 6 1 9 m g、 1 0 9 m gの （G a l (OA c ) 4) 3— P E G (B o c ) を得た。 精製 品は1 H- NMR (溶媒 C D C 1 3) により末端 B o c基及び G a 1保護基で ある OA c基の同定、 さらに P E G骨格部分のエチレンダリコール基 由来のメインシグナルが保時されていることにより構造確認した。 さ らにその純度は T L Cで確認した。
(実施例 6 )
(G a l (OA c ) 4) 3— P E Gの合成
アルゴン気流下、 該 （G a l (OA c ) 4) 3— P E G (B o c ) 1. 1 8 gの乾燥ジクロロメタン （ 1 0 O mL) 溶液に 1 °Cでトリフルォ 口酢酸 2 0 m Lのジクロロメタン （ 2 0 m L ) 溶液を 1. 2時間で滴 下した。 反応液を 1時間で 1 4でまで昇温し、 濃縮した。 乾燥エタ ノール 1 0 0 mLを加えて濃縮し、 卜リフルォロ酢酸を除く操作を 2 回繰り返した。 残渣をメタノール 1 0 mLに溶解し、 2 8 % N a 0 C H3メタノール溶液を 1 0倍に希釈した溶液で中和した。 反応液を濃縮 し得られた粗製品をカラム精製 （シリカゲル 1 0 0 g、 展開溶媒 クロ 口ホルム メタノール = 9 5 / 5→ 1 / 1 ) し 6 0 6mgのカラム精 製品を得た。 これに予備検討品 1 0 Omgを合わせ、 同じスケールで のカラムを 4回繰り返し、 2 9 5mgの （G a l (OA c ) 4) 3— P E Gを得た。 精製品は1 H- NMRにおける （G a l (OA c ) 4) 3— P E G (B o c ) からの B o c基の脱離により確認した。 さらにその 純度は T L Cで確認した。
(実施例 7 )
(Gal) 3 (6) -PEG の合成
該 （G a l (OA c) 4) 3— P E G 2 9 0 m gのメタノール溶液に 3°Cで 2 8 %1^ &〇01^3メタノ一ル溶液 2 3 m gをメタノール 1 5m Lで希釈した溶液を滴下した。 滴下後、 1 5〜 2 1 °Cで 3. 5時間反 応した。 TL Cによる反応追跡で原料と同じ位置のスポッ卜が減少し なくなつたため、 2 8 %N a O CH3メタノール溶液 2 2m gをメタ ノール 1 5 mLで希釈した溶液を滴下した。 滴下後、 2 0~ 2 1 °Cで 1. 5時間反応した。 反応液を冷却し、 メタノールで洗浄したダウ エックス 5 OWx 8を少しづつ加え中和した。 反応液を濾過し、 濾液 を濃縮乾固して （Gal)3(6)- PEG 2 5 0 m gを得た。 精製品は1 H— N MRにより該 （G a l (OAc ) 4) 3— P E Gからの OA c基の脱離 を確認することにより同定した。 さらに、 純度については TL Cで確 認した。
(実施例 8)
(G a l ) 3 (6) — PE G— I FN aの調製
凍結乾燥されたヒ卜 I FNひ (2 b) (生化学工業社製） 1 0 0 g を 7 44〃 1の 2 0 OmMトリスー塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) に溶解さ せた後、 実施例 7で得られた （Gal) 3 (6) -; PEG 5 7. 3mgを添加し た。 該反応液に微生物起源トランスグルタミナーゼ約 0 . 7 Uを添加 し、 室温で一晩インキュベートした。 反応液を S D S — P A G E (h om o g e n i o u s 2 0 ((フアルマシア社製）） ) により未反応 I F N の消失を確認した後、 「S E P — P AK」 カラム （ミリポア 社製） を用いて、 未反応の （G a l ) 3— P E G及び M- TGを除去した。 分取画分を S p e e d V a cにて濃縮し、 P B S ( + ) で中和した。 本反応により約 4. 4： β gの (6&1)3 (6) -1)£6- 0；を得た。 以下に、 上記実施例 3〜 8に記載した反応について反応式を用いて 示した。
HO,C (OCH2CH2)n \
OCH2CH2H
(1)
BocHN(CH,)5NH2 (2) H02C (OCH2CH2)n
ヽ OCH2CONH(CH2)5NHBoc
(3)
Gal(OAc)4-(OCH2CH2)2-NI-ICO.
- NHCOヽ
Gal(OAc)4-(OCH2CH2)2-NHCO
-NI-ICO ' HBoc
Gal(OAc)4-(OCI¾CH2)2-NHCO
(4)
Figure imgf000023_0001
(5)
EDCI HOBt
(3)
Figure imgf000023_0002
(Gal(OAc)4)3-PEG(Boc) TFA
. OCH2CH2)nOCH2COM-I(CH2)5NH2
Figure imgf000024_0001
(Gal(OAc)4)3-PEG
1. NaOCH3
2. Do 50W
. ' (OCH2CH2)nOCH2CONH(CH2)5NH2
Figure imgf000024_0002
(Gal)3(6)-PEG
(実施例 9 )
(G a l ) 3 ( 6) — P E G— I FNひの体内動態
6週齢の雄マウス（C 5 7 B L/6、 CR J社）に （G a l ) 3 ( 6 ) - P E G— I FN a、 P E G 1 2— I F N CK (平均分子量 1 2 k D aの P E G 1分子修飾体、 日本油脂社製片端メ トキシ P E Gカルボン酸を活 性エステル法により化学的に修飾した後、 逆相 H P L Cにより 1分子 修飾体のみ分取したもの （佐藤ら、 B i o c o n j u g a t e C h e m、 1 1 ( 4 ) 、 5 0 2 ( 2 0 0 0 ) 参照。 ） 、 （G a l ) 3
( 6 ) — I F N a (W〇 0 1 Z 0 2 8 5 1号公報記載の方法に従って 調製。 ) 、 及び未修飾 I FN aについて I F Nひ換算で 1 9. 9β g /k g尾静脈投与し、 一定時間 （ 3分、 6 0分） 経過後、 採血及び肝 臓の採取を行なった。 なお、 血漿は常法により採取し、 検体濃度を E L I S Aにより測定した。 肝臓はホモジネートバッファー （MEM、 5 % F B S、 p H 7. 2〜 7. 4 ) を臓器重量の 9倍量添加してホモ ジナイズし、 3 0 0 0 r 111で 1 0分間遠心分離した後、 上清を同ホ モジネートバッファーで希釈し E L I S Aで検体中濃度を測定した。 なお、 E L I S Aは H um a n E L I S A I F N aキッ ト （END OG E N社製） を用いて行なった。 その結果、 図 1及び図 2に示すよ うに投与初期において （G a l ) 3 ( 6) — P E G— I FN o!は P E G 1 2— I FN と同様、 血漿中濃度が非常に高く （図 2 a参照。 ） 肝 臓への集積濃度は （G a l ) 3 ( 6 ) - I FNひに比べ低かった （図 1 a参照。 ） が、 投与 1時間後において肝臓中濃度が最も高く保たれ ており （図 1 b参照。 ） 、 その濃度は P E G 1 2 - I F N αに比べ約 2. 6倍、 （G a 1 ) 3 ( 6 ) — I F Ν 0；に比べ約 6. 2倍程度高かつ た。 これはリカ"ンドによる肝集積能と P E Gによる滞留性効果により、 長時間経過しても肝臓での濃度が高く保たれていることを意味する。 以上の結果、 肝認識素子である （G a l ) a ( 6) リカ"ンドに加え P E Gを付与させることにより、 肝集積性に加え肝での滞留性が付与され ることが証明され、 新規リカ"ンドの有用性が明らかとなった。
発明の効果 本発明の医薬品は未修飾の医薬品と比較し、 その標的集積及び長時間 滞留性により投与量を未修飾体の数分の一程度まで下げることができ、 副作用を低減させた治療を行うことができる。 さらに、 ポリエチレン ダリコール結合リガンドの薬物への導入が 1工程で行えるため、 その 製造工程が簡便で、 かつ高回収率でポリエチレングリコール結合リガ ンド修飾薬物を得ることができる。 また、 本発明の医薬品はポリェチ レングリコ一ル結合リガンド 1分子のみによる修飾体であるので、 ぺ プチドマップ等を行なうことにより容易に証明することができ、 医薬 品としての一定の品質を確保することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 標的組織の細胞膜上に存在する特定レセプ夕一あるいは抗原 等の蛋白質に対する結合親和性を有し、 かつ細胞内への内在化回避能 を有するリガンドにポリエチレングリコール鎖が結合した、 ポリェチ レンダリコ一ル結合リガンド。
2 . リガンドが標的組織の細胞膜上に存在する特定レセプ夕一に 対して結合親和性を有するものである請求の範囲 1に記載のポリェチ レンダリコール結合リガンド。
3 . リガンドの特定レセプ夕一を介した解離速度定数と内在化速 度定数との比が 1以上である請求の範囲 2に記載のポリエチレンダリ コール結合リガンド。
4 . リガンドの特定レセプターに対する平衡解離定数が 10mM以下 である請求の範囲 2または 3に記載のポリエチレンダリコール結合リ ガンド。
5 . リガンドの特定レセプタ一に対する内在化速度定数が 0. lm iir1 より小さいものである請求の範囲 4に記載のポリエチレングリコール 結合リガンド。
6 . 標的組織の細胞膜上に存在する特定レセプ夕一がァシァ口糖 蛋白質レセプター （ASGP- R) である請求の範囲 1〜 5のいずれかに記 載のポリエチレンダリコール結合リガンド。
7 . 標的組織が肝臓である請求の範囲 1〜 6のいずれかに記載の ポリエチレングリコール結合リガンド。
8 . 請求の範囲 1〜 7のいずれかに記載のポリエチレンダリコー ル結合リガンドのポリエチレンダリコール鎖に薬物が結合したことを 特徴とする医薬品、 または該医薬品を有効成分として含有する医薬組 成物。
9 . 薬物が生理活性蛋白質、 または生理活性ペプチドである請求 の範囲 8に記載の医薬品、 または該医薬品を有効成分として含有する 医薬組成物。
1 0. 生理活性蛋白質がィムノゲロフ "リン、 血液凝固因子、 インタ- Dィキン類、 ィ ンタ-フ ロン、 腫瘍壌死因子、 肝細胞成長因子、 上皮細胞成長因子、 ス- Λ。-才 キサイドテ'、イスムタ-セ'、 カタラ-セ'、 チォレドキシンのいずれかである請求の範囲 9に 記載の医薬品、 または該医薬品を有効成分として含有する医薬組成物。
1 1. 生理活性蛋白質がグルタミン 残基を有し、 かつ分子量が I X 103 から 2 X 105である請求の範囲 9乃至 10に記載の医薬品、 または 該医薬品を有効成分として含有する医薬組成物。 ·
1 2. 生理活性蛋白質がインタ-フェロン《、 インタ-フェロン ]3、 及びインタ-ロイキン一 2 のいずれかである請求の範囲 10に記載の医薬品、 または該医薬品を有 効成分として含有する医薬組成物。
1 3 . ポリエチレンダリ コール結合リガンドのポリエチレングリ コール鎖の末端がアミノ基であり、 該ァミノ基と生理活性蛋白質とを トランスグルタミナ一ゼの存在下に反応せしめてアミ ド結合を形成さ せることにより製造することができるものである請求の範囲 1 1乃至 12 に記載の医薬品、 または該医薬品を有効成分として含有する医薬組成 物。
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