WO2001059448A1

WO2001059448A1 - Procede de criblage d'un agent antiandrogene

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Publication number: WO2001059448A1
Application number: PCT/JP2001/000936
Authority: WO
Inventors: Kyoji Ikeda; Makoto Nakanishi; Shigeaki Kato
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2000-02-10
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2001-08-16
Also published as: EP1258727A4; US20030175817A1; EP1258727A1; AU2001230606A1

Description

明細 ΐ 抗アンドロゲン剤のスクリーニング方法技術分野

本発明は、サイクリン Εとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング方法、並びに該スクリーニングにより単離し得る化合物およびその医薬用途に関する。背景技術

アンドロゲンは、前立腺肥大症、男性型脱毛症、性的早熟、尋常性座瘡、脂漏症及び多毛症と深く関わっていることが知られてきている。またアンドロゲンは、男性の癌による主要な死因の一つである前立腺癌の発症と進行に重要な役割を果たしている（Parker, S. L. et al .， CA Cancer J. Cl in. 46, 5-27 ( 1996))。前立腺癌は、初期にはアンドロゲン感受性で、転移性疾患に対する標準的な治療法として広く用いられるアンドロゲン除去療法 (W.J. Catalona, N. Engl . J. Med. 331, 996 ( 1994) )によく反応する。

抗アンドロゲン剤、すなわちアンドロゲン受容体のアン夕ゴニストとしては、例えば、酢酸シプロテロン、酢酸クロルマジノン、フル夕ミド、ビカル夕ミドなどが用いられている。酢酸シプロテロンは、十代の人の座瘡の進行や禿頭の発生を抑制することが知られている。また、酢酸シプロテロンは、女性においては、男性化と脱毛症の治療に用いられている。フルタミド、ビカルタミドは、前立腺癌治療薬として使用されている。

これらの抗アンドロゲン剤を用いたホルモン除去療法は、前立腺癌における薬物治療を始めとする多くの例で奏効し、有効な治療剤の一つとなっているが、問題点の一つとして、抗ァンド口ゲン剤が奏効しても 2年から 5年後にはほとんどの場合再発症してしまうこと、つまり抗アンドロゲン剤抵抗性になつてしまうことが知られている。ホルモン除去療法に対するこの抵抗性の基礎となる分子メカ二ズムは未だほとんどわかっていない。

アンドロゲンおよびエストロゲンは、それぞれ核受容体スーパーフアミリーに属するアンドロゲン受容体およびエストロゲン受容体を通じて、それぞれホルモン応答性の前立腺癌および乳癌の増殖を調節する（Mangelsdorf, D.J. et al . , Cell 83, 835-839 (1995))。アンドロゲン受容体遺伝子の変異は、転移性のホルモン非依存性前立腺癌において報告されており (Taplin, M.-E. et al . , N. Engl. J. Med. 332, 1393-1398 ( 1995))、これが、ホルモン環境に対するアンドロゲン受容体の反応の変化の原因となっている可能性がある。しかし、これは比較的まれな事象であって、ほとんどの前立腺腫瘍の内分泌療法に対する適応的変化を説明するための一般的な手がかりとはならない。 SCIDマウスに対して外科試料を移入した最近の実験から、アンドロゲン非依存性の転移性腫瘍が、異なる宿主においてホルモン反応性を回復することができることが示されたが（Klein, .A. et al . , Nat. Med. 3, 402-408 (1997))、このことは、核におけるアンドロゲン受容体機能の制御には、アンドロゲン受容体そのものではなく、外因性の細胞因子 (群）が関与していることを示唆している。

アンドロゲンの細胞分裂誘発シグナルは、最終的に細胞周期機構に対して影響を及ぼすと考えられている。細胞周期の G1から S期への進行の間に、サイクリン依存性キナーゼ（Cdk)群の一連の協調した活性化が起こるが、それらの活性はサイクリンサブュニヅトによって正の調節を受け、 Cdk阻害因子によって負の調節を受. ける（Hartweli, L. H. & Kastan, Μ. Β·， Science 266, 1821-1828 (1994) ; Sherr, C. J. , Science 274, 1672-1677 (1996); Hunter, T. & Pines, J. , Cell 79,573 (1994))。エストロゲン (Prall, 0. W. et al . , J. Steroid Biochem. Mol. Biol . 65, 169-174 (1998) ; Planas-Siva, M. D. & Weinberg, . , Mol. Cell. Biol . 17， 4059-4069(1997)) およびアンドロゲン（Lu, S. et al . , Cancer Res. 57, 4511-4516 (1997); Men jo, M. et al.， Oncogene 17, 2619-2627 (1998); Kokontis, J. M. et al., Mol. Endocrinol. 12, 941-953 (1998)) は、サイクリンおよび/ または Cdk阻害因子の発現を制御することによつて Cdk活性を調節し、それによつて G1から S期への移行を刺激する。さらに、 ERがサイクリン D1に直接結合するという証拠が得られている (Zwijsen, R. M. L. et al., Cell 88, 405-415 (1997); Neuman, E. et al., Mol. Cell. Biol. 17, 5338-5347 (1997))。乳癌ではサイクリン Dl遺伝子の過剰発現と増幅が頻繁に見られることを考慮すると（Buckley, M. F. et al., Oncogene 8, 2127-2133 (1993); Keyomarsi, . & Pardee, A. B., Pro Natl. Acad. Sci. USA 90， 1112-1116 (1993))、サイクリン Dlは、乳房腫瘍におけるエストロゲン受容体の Cdk非依存的活性化に何らかの役割を果たしていることが示唆される。しかし、アンドロゲン受容体が細胞周期機構の要素に直接結合するか否か、そしてこの相互作用が前立腺癌におけるアンドロゲン受容体の転写活性をどのように制御するかに関しては、ほとんど知られていない。発明の開示

本発明は、細胞周期機構の成分であるサイクリン Eがアンドロゲン受容体に結合し、その転写活性を増強するという本発明者等により得られた知見に基づくものである。

より詳しくは、本発明は、サイクリン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。さらに、本発明は、該スクリーニングにより単離し得る化合物およびその医薬用途、特に前立腺癌を含むァンドロゲンが閧与する疾患の予防や治療のための新規な抗ァンドロゲン剤としての用途を提供する。

上記のように、アンドロゲンは、前立腺癌の増殖に重要な役割を果たしているが、抗アンドロゲン療法に対する耐性の基礎となる分子メカニズムについては依然として判明していない。そこで、本発明者等は、アンドロゲン受容体（「A i と略す）と細胞周期機構の要素であるサイクリンとの物理的および機能的相互作用の検討を行なった。

まず、 AR陰性細胞にて ARとサイクリンを一過的に発現させ、 ARの活性に及ぼすサイクリンの効果を調べた。その結果、サイクリン E (特表平 7- 502164号公報）が、 ARのリガンド非依存的転写活性とリガンド依存的転写活性の両方を増強し、これらが抗アンドアロゲン剤である 5-ヒドロキシフタルイミドによって十分に阻害されていないことを突きとめた（図 1 )。サイクリン Eが ARの ABドメインの C末端部位に直接結合することを見出した（図 3 )。さらに、本発明者等は、共免疫沈降および GSTプル ·ダウンァヅセィによって、サイクリン Eが、 Cdk2やホルモンの結合とは無関係に、 ARの ABドメインに直接結合することを見出した (データー省略)。これらの結果は、サイクリン Eが ARのコアクチべ一夕一として機能すること、そして腫瘍におけるサイクリン Eの異常な発現によって、アンドロ'ゲン除去療法の際でも AR機能の持続的な活性化が起こる可能性があることを示唆するものである。即ち、サイクリン Eによる ARの不適当な活性化が、ホルモン除去療法の際の前立腺癌の抵抗性発症の根底にある可能性を示唆している。

従って、 ARとサイクリン Eとの相互作用を阻害する化合物の提供により、前立腺癌を含むアンドロゲンが関与する疾患の予防や治療における新規かつ魅力的な治療戦略が提供されると考えられる。

本発明は、このような新規な治療戦略のための薬剤としての応用が期待される、サイクリン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物をスクリー二ングするための方法、並びに該スクリーニングにより単離し得る化合物およびその医薬用途を提供するものである。

より詳しくは、本発明は、

( 1 )サイクリン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物のスクリ —ニング方法であって、

( a )被検試料存在下、サイクリン Eとアンドロゲン受容体とを接触させる工程 (b)該サイクリン Eと該アンドロゲン受容体との結合を検出する工程、および

(c)被検試料非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該結合を低下させる化合物を選択する工程、を含む方法、

( 2 )サイクリン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物のスクリ一二ング方法であって、

(a)サイクリン Eを発現するべクタ一、アンドロゲン受容体を発現するべク夕一、およびアンドロゲン受容体応答配列の下流にレポ一夕一遺伝子が機能的に結合されたベクタ一が導入された細胞に、被検試料を接触させる工程、

(b) 該細胞におけるレポ一夕一活性を検出する工程、および

(c)被検試料を接触させない場合と比較して、該レポ一夕一活性を低下させ. る化合物を選択する工程、を含む方法、

(3)サイクリン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物若しくはその薬学上許容しうる塩またはそれらのプロドラッグ、

(4) (1) または（2) に記載の方法により単離しうる、（3) に記載の化合物若しくはその薬学上許容しうる塩またはそれらのプロドラッグ、

(5) (3)または（4)に記載の化合物若しくはその薬学上許容しうる塩またはそれらのプロドラッグを有効成分とする医薬組成物、

(6) 抗アンドロゲン剤である、（5) に記載の医薬組成物、

( 7 ) 前立腺癌、前立腺肥大症、男性型脱毛症、性的早熟、尋常性座瘡、脂漏症及び多毛症から選択される疾患の予防または治療のための、（5)または（6)に記載の医薬組成物、を提供するものである。

本発明は、サイクリン Eと ARとの相互作用を阻害する化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法の 1つの態様は、サイクリン Eと AR との結合活性の阻害を指標とした方法である。この方法の 1つの態様は、（a)被検試料存在下、サイクリン Eとアンドロゲン受容体とを接触させる工程、 (b) 該サイクリン Eと該アンドロゲン受容体との結合を検出する工程、および、（c)被検試料非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該結合を低下させる化合物を選択する工程、を含む。

このスクリ一ニングに用いられるサイクリン Eおよび ARは組換え夕ンパク質であっても、天然由来のタンパク質であってもよい。また、「サイクリン E」としては、サイクリン Eの完全な蛋白質に限られず、 ARとの結合活性を有する限りその部分ペプチドが含まれる。また、「AR」としては、完全な蛋白質に限られず、サイクリン Eとの結合活性を有する限りその部分ペプチドが含まれる。例えば、 ARの AB ドメインは、サイクリン Eと直接結合することが示されたことから、 ARの ABドメインを含むぺプチドは、このスクリーニングに好適に利用し得る。サイクリン Eの AB ドメイン（1から 544位のアミノ酸残基）および EFドメイン（624から 918位のアミノ酸残基）については、文献 (Doesburg, P. et al .， Biochemistry 36, 1052- 1064 (1997)、 Elizabeth, L. et al . , J. Biol . Chem. 270, 29983-29990 (1995)) 参照のこと。

本発明において「接触」および「結合」には、直接的「接触」および「結合 j のみならず、間接的な「接触」および「結合」も含まれる。例えば、サイクリン E 部分ペプチドが、他の蛋白質因子を介して ARと間接的に結合する場合でも、該部分ぺプチドを用いてこのスクリーニングを行うことは可能である。

サイクリン Eや AIUま、後述するスクリーニングの手法に応じて、例えば、担体に結合させた形態や他の蛋白質との融合蛋白質として用られる。

被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製または粗精製タンパク質、ぺプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物、遺伝子ライブラリーが挙げられる。サイクリン Eと ARとの接触は、後述するスクリーニングめ手法に応じてインビトロで行なうこともできるし、またインビボで行なうこともできる。

以下に具体的なスクリーニングの手法について例示する。本発明のスクリーニングは、例えばプルダウンアツセィにより行なうことができる。被検試料の存在下または非存在下、サイクリン Eと ARとを接触させ、両者の複合体をサイクリン Eまたは ARに対する抗体などで回収し、その結合を測定する。蛋白質は上記のように他のペプチドや蛋白質との融合蛋白質とすることができる c サイクリン Eまたは ARの抗体を用いる場合は、複合体を Protein A Sepharose や Protein G Sepharoseを用いて沈降させることができる。また、サイクリン Eまたは ARを、例えば、 GSTなどのェピト一プとの融合タンパク質として調製した場合には、グルタチオン- Sepharose 4Bなどのこれらェピト一プに特異的に結合する物質を利用して、サイクリン Eまたは Αβに対する抗体を利用した場合と同様に、複合体を回収することができる。

サイクリン Εまたは ARは、適宜標識してもよい。標識方法としては、ピオチンとアビジンの結合性を利用する方法、サイクリン^ AR又はこれらに融合したぺプチ. ド又はポリペプチド（例えば GSTなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオァイソト一プを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。プルダウンアツセィにおいては精製したサイクリン Εと ARとを用いてインビト口でこれら蛋白質を接触させることもできるが、インビボにおいて接触させることも可能である。

インビボ法においては、例えば、外来性のサイクリン Εおよびを発現するべク夕一を細胞に導入し、該細胞に被検試料を接触させて、その後、該細胞の溶解物を調製する。この溶解物に対し、サイクリン Εまたは ARに対する抗体などを接触させて、形成された複合体の沈降を行なう。

外来性のサイクリン Εおよび ARを発現するべクタ一が導入された細胞ではなく、内因性のサイクリン Εとアンドロゲン受容体とを発現する細胞を用いて、これに被検試料を接触させ、同様に解析を行なうことも可能である。

また、本発明のスクリーニングは、例えば、ァフィ二ティクロマトグラフィーを用いて行うことができる。例えば、サイクリン Εまたは ARの一方をァフィ二ティ一力ラムの担体に固定し他方の蛋白質をカラムに流して結合させる。ここに被検試料を適用し、サイクリン Eと ARの結合を阻害する化合物を検索する。カラムの代わりにマイクロプレート上などに蛋白質を固定してスクリーニングを行ってもよい。

本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面ブラズモン共鳴現象を利用したバイォセンサーを使用することもできる。表面ブラズモン共鳴現象を利用したバイォセンサーはサイクリン Eと ARとの間の相互作用を標識することなく、表面ブラズモン共鳴シグナルとしてリアル夕ィムに観察することが可能である（例えば BIAcore、 Pharmacia製）。したがって、 BIAcore等のバイオセンサ一を用いることによりサイクリン Eと ARとの結合を評価することが可能であ^ o

また、 2 -ハイブリヅドシステム（Fields, S. and Sternglanz, R. _} Trends. Genet. 10， 286-292 (1994); Dalton, S. and Treisman, R.， Characterization of SAP - 1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element. , Cell 68, 597-612 (1992); 「MATCHMAKER Two-Hybrid Systemj ，「Ma匪 al ian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit」，「MATCHMAKER One-Hybrid Systemj (いずれも Clontech社製）、「Hyb ZAP Two-Hybrid Vector Systemj (Stratagene 社製））を用いて本発明のスクリーニングを行うことも可能である。例えば酵母の 2 -ハイプリヅドシステムにおいては、サイクリン Eまたは ARの一方を SRF DNA結合領域または GAL4 DNA結合領域など、特定の DNA配列に結合するべプチドと融合させ、他方の蛋白質を VP16または GAL4転写活性化領域などの転写活性化べプチドと融合させ、それそれを酵母細胞中で発現させる。被検試料非存在下では、サイクリン E と ARの結合によりレポ一夕一遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる。被検試料存在下で同様の試験を行い、レポーター遺伝子の発現を低下させる化合物を選択する。 2-ハイプリッドシステムにおいて用いられるレポ一ター遺伝子としては、例えば、 HIS3遺伝子の他、 Ade2遺伝子、 LacZ遺伝子、 CAT遺伝子、ルシフエラ一ゼ遺伝子、 PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor typel) 遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。 2 -ハイブリッドシステムは、酵母細胞に限らず、実施例に記載のような哺乳動物細胞を用いて行うことも好適である。スクリーニングに用いるサイクリンE、 Allとしては、両者が結合活性を示す限り特に制限はない。例えば、 ARの ABドメインは、サイクリン Eと直接結合することが示されたことから、 ARの ABドメインを含むペプチドは好ましい一例である。哺乳動物細胞としては、例えば、 COS細胞、 HeLa細胞、 CH0細胞、 MDAH041細胞などを用いることができるが、用いられる細胞に特に条件はなく、他の多くの細胞が対象になり得る。

スクリーニングの結果、被検試料を接触または導入しない場合（対照）と比較して、被検化合物によりレポ一夕一遺伝子の発現が有意に低下すれば、用いた被検化合物はサイクリン Eとアンド口ゲン受容体との相互作用を阻害する化合物の候補となる。

また、本発明のスクリーニングにおいては、スクリーニングの効率を高めるためにレポ一夕一系を用いることも可能である。即ち、本発明のサイクリン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物のスクリーニングの他の態様は、 ( a )サイクリン Eを発現するベクター、アンドロゲン受容体を発現するべクタ一、およびァンドロゲン受容体応答配列の下流にレポ一夕一遺伝子が機能的に結合されたベクターが導入された細胞に、被検試料を接触させる工程、（b )該細胞におけるレポ一夕一活性を検出する工程、および（c ) 被検試料を接触させない場合と比較して、該レポ一夕一活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む方法により実施することができる。

サイクリン Eの発現ベクター、およびアンドロゲン受容体の発現べクタ一は、例えば、サイクリン E遺伝子およびアンドロゲン受容体遺伝子等を pSG5や pcDNA3などの哺乳動物発現べクタ一に挿入することにより作製することが可能である。また、アンドロゲン受容体応答配列の下流にレポ一夕一遺伝子が機能的に結合されたべクタ一の構築は、 AREまたは HREをレポ一夕一遺伝子の組込まれた発現べクタ一に揷入することにより行うことができる。 ARE配列としては、例えば、 AR/GR/PR/MRに共通する配列である「5' -AGAACANNNTGTTCT-3'」（配列番号： 1 ) を用いることができる。また、レポーター遺伝子としては、例えば、 CAT遺伝子、ルシフヱラーゼ遺伝子などが挙げられるがこれらに制限されない。スクリーニングに用いられる細胞としては、例えば C0S7細胞、 C0S1細胞、 HeLa細胞、 MDAH041 細胞、 PC- 3細胞、 LNCaP細胞、 DU- 145細胞などが挙げられる。

レポ一夕一遺伝子の発現の測定の結果、被検試料を接触または導入しない場合 (対照）と比較して、被検試料の接触または導入により検出されたレポ一夕一活性が有意に低下すれば、用いた被検化合物はサイクリン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物の候補となる。本発明のスクリーニング系は、既存のアンドロゲン阻害剤に抵抗性を有する AR活性化に対する阻害剤をスクリ一ニングすることを可能にする。

上記した本発明のスクリーニングにより、サイクリン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する活性を有する化合物を単離するこどができる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物の構造の一部を、付加、欠失及び/又は置換により変換される物質も、本発明のスクリーニングにより得られる化合物に P5 れ。

サイクリン Eと ARとの相互作用を阻害する化合物は、抗アンドロゲン剤の候補となり、例えば、前立腺癌、前立腺肥大症、男性型脱毛症、性的早熟、尋常性座瘡、脂漏症及び多毛症を含む ARが関与する各種疾患の治療への応用が期待される。また、該化合物を予め投与しておけば、前立腺癌、前立腺肥大症、男性型脱毛症、性的早熟、尋常性座瘡、脂漏症及び多毛症等の疾患を予防したり、または遅延させることが期待できるので、これらの疾患の予防への応用も期待できる。

スクリーニングにより得られた化合物が、抗アンド口ゲン効果を有するか否かの評価は、実施例に記載したような AR遺伝子を用いたレポ一夕一アツセィに加え、例えば、以下の測定法を必要に応じて適宜組み合わせることによって、さらに詳細に測定することができる。

<ラヅ卜での in vivo実験によるアン夕ゴニスト作用の測定法 >

去勢ラヅトにテストステロンゃジヒドロテストステロンを投与すると前立腺、及び精嚢腺重量が増加する。テストステロンゃジヒドロテストステロンによる前立腺、及び精嚢腺の重量増加作用を被検化合物が抑制するか否かを検討することにより、被検化合物のアン夕ゴニスト作用を調べることができる。測定にあたつては、文献 (J. Med. Chera. 41 : 623-639, 1998)や文献 (基礎と臨床 29(4) : 877-885, 1995) 等を参考にできる。

本発明のサイクリン Eと ARとの相互作用を阻害する化合物またはその薬学上許容しうる塩あるいはそれらのプロドラッグをヒトゃ哺乳動物等、例えばマウス、ラヅト、モルモット、ゥサギ、ニヮトリ、ネコ、ィヌ、ヒヅジ、ブ夕、ゥシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、これら化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。本発明のサイクリン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物を有効成分とする医薬組成物は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによつて製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。

錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セル口ースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ぺパ一ミント、ァカモノ油又はチェリ一のような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、プドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、塩化ナトリゥムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非ィオン性界面活性剤、例えばポリソルベート 80 (TM)、 HC0-50と併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロ力イン、安定剤、例えばべンジルアルコール、フヱノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

かかる製剤中のサイクリン Eと ARとの相互作用を阻害する化合物の含有量は、その剤型によって異なるが、一般に 5〜100重量％の濃度で含有していることが望ましい。

患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物が DNAによりコードされうるものであれば、該 DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。本発明のサイクリン Eと ARとの相互作用を阻害する化合物またはその薬学上許容しうる塩あるいはそれらのプロドラッグの投与量は、対象とする人間をはじめとする温血動物の種類、症状の軽重、医師の診断などに応じて、広範囲に変えることができるが、一般に有効成分として、 1日あたり l g〜 500mg/kg、好ましくは 1日あたり 20 g〜 100mg/kgである。また、上記投与量は 1日〜 1ヶ月あたり 1回または数回に、まとめて又は分けて投与することができ、症状の軽重、医師の判断により適宜変更することができる。図面の簡単な説明

図 1は、サイクリン Eが、 ARの転写活性を増強することを示す図および写真であ

Ό

a . AR陰性 MMH041細胞に AR発現べクタ一（l^g)、 ARE- CATリボー夕一構築物（8 Adg)、およびサイクリン Eをコードする発現ベクターを量を変えて共トランスフエクトした。細胞をジヒドロテストステロン（10—⁹ M) 存在下で 18時間培養し、 CAT ァヅセィを ί亍った。

b . AR、 GR、または PRをコードする発現ベクター（l〃g)、 ARE-CATリポーター構築物（8〃g)、そしてサイクリン E、サイクリン A、またはサイクリン D1をコードする発現べクタ一（8〃g)を MDAH041細胞にトランスフエクトした。ジヒドロテストステロン（図中 "T")、デキサメタゾン（図中 "D")、またはプロゲステロン（図中 "P") (各 1(Γ⁹ Μ)存在下で 18時間細胞を培養した後、細胞の抽出液を用いて CAT ァヅセィを行った。場合によっては、 10—⁵ Mの 5-ハイドロキシフル夕ミド（5- 0H- F) を添加した（図中 5-0H-F "+")。

c . EEの発現べク夕一（1 zg) と ERE-CATレポ一夕一構築物（8 zg) をサイクリンサイクリン Dlfeるいはサイクリン E (各 8〃g) の存在下あるいは非存在下で MDAH041細胞にトランスフエクシヨンし、 17 ? -エストラジオール（E₂、 10"⁸M) の存在下（+) あるいは非存在下（-) で 18時間培養した細胞の抽出液を用いて CAT ァヅセィを行つた。

トランスフヱクション効率の違いを調べる内部対照として、上記 a〜 cのすベてのトランスフエクシヨンは^ -ガラクトシダーゼ発現べクタ一（3〃g)も含めて行い、 CAT活性を/? -ガラクトシダーゼ活性で補正した。

図 2は、 ARの ABドメインとサイクリン Eとの機能的相互作用を示す図である。 a .サイクリン Eと ARの ABドメインあるいは EFドメインとの相互作用を哺乳動物 2ハイプリヅド系を用いて調べた。 HeLa細胞に GAI 結合配列を持つ CATリポーター構築物、 GAL4 DNA結合ドメインと融合させた ARの ABまたは EFドメインをコードする発現ベクター（GAL4- AR)、およびサイクリン E発現べクタ一を共トランスフエクトした。一部の培養は、ジヒドロテストステロン（10— ¾) で 18時間処理し（図中 DHT "+"；)、その後、 CAT活性を決定した。

b . GAL4-サイクリン Eと VP16-AR (AB) との相互作用を同様の方法で検討した。図 3は、サイクリン Eはィンビボで ARに結合することを示す図および写真である _c MDAH041細胞にサイクリン E発現ベクター、および、全長 AR発現べクタ一（a )、 ARの AB領域発現ベクター（b )、または ARの EF領域発現べクタ一（c ) をトランスフエクトし、ジヒドロテストステロン（DHT、 10"⁹ M) の非存在下（-）または存在下 (+)で培養した。細胞は TNE緩衝液中で溶解させ、抗サイクリン E免疫沈降物中の AR ( a )、 AR(AB) ( b )、または AR(EF) ( c ) を、それぞれ ARの ABドメイン（a、 b ) または EFドメイン（c ) に特異的な抗体を用いて検出した。

図 4は、 ARの ABドメイン内にあるサイクリン E結合ドメインの位置決定を示す図および写真である。

a . HeLa細胞に GAL4結合配列を持つ CATリポー夕一構築物と、 GAL4 DNA結合ドメィンを融合させた AR (AB) またはその欠失ミユー夕ントとを、サイクリン Eの発現ベクター存在下（黒）あるいは非存在下（白）で共トランスフヱクトした。

b .全長の ARあるいはサイクリン E結合ドメインと転写活性化ドメインとを欠失した AR (del.E) を、サイクリン E発現べクタ一の存在下または非存在下で ARE-CAT レポ一夕一構築物と共に HeLa細胞に共トランスフエクトし、ジヒドロテストステロン（10— ) の存在下あるいは非存在下で 18時間培養した後、 CAT活性を決定した。

c . サイクリン Eはインビトロで AR (AB) の C末端領域に直接結合することを示す。 GST融合 AR (AB) およびその欠失蛋白をインビトロで翻訳されたサイクリン E とインキュベートした。複合体はグル夕チオンビーズに吸収させ、 SDS- PAGEで分析し、オートラジオグラフィ一で分析した。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書で参照された文献は全て本明細書の一部として組み込まれる。

[実施例 1 ] サイクリン Eはアンドロゲン受容体（AR) の転写活性を増強する ARと細胞周期制御因子との間に機能的なクロストークが存在するか否かを調べるために、 AR陰性ヒト繊維芽細胞 MDAH041細胞 (Nakanis i M. et al . ( 1995) EMBO J. 14: 555-563) に AR発現べクタ一、 ARE-CATリポーター構築物、およびサイクリン Dl、サイクリン E、またはサイクリン Aをコードする発現ベクターで共トランスフエクトし、 AREを介した ARのトランス活性化機能を、そのリガンドであるジヒド口テストステロン（DHT)の非存在下または存在下で測定する実験を以下のように =1 "了った。

全長のヒトサイクリン E、サイクリン Dl、およびサイクリン Aを pcDNA3ベクタ一に揷入した。全長のヒト AR、エストロゲン受容体 α ( ), グルココルチコィド受容体（GR) およびプロゲステロン受容体（PR) を哺乳動物発現ベクターである pSG5、 pSGl pKCR2および pSG5にそれそれ揷入した。リポ一夕一構築物 pARE2tk- CAT、 pGRE-tk-CAT, pPRE-tk-CAT, および pBL-CAT8+/EREは既に記述されている（Tsai , S.Y. et al . ( 1989) Cel l 57 : 443-448) o HeLa細胞及び MDAH041細胞は、 10%ゥシ胎児血清（FBS) を含むダルベッコ改変ィーグル培地（DMEM)で維持した。トランスフエクションの 24時間前、培地を 5 % 活性炭処理 FBSを含むフエノール 'レツド不含 DMEM培地に交換した。リン酸カルシゥム沈殿技法を用いて、細胞を ARE-CATリポーター構築物（pARE2tk- CAT) 8〃g、 ^ -ガラクトシダ一ゼ発現ベクター（トランスフエクシヨン効率を調べる内部対照として） 3〃g、 AR発現べクタ一 l〃g、そしてサイクリン E、サイクリン Dl、またはサイクリン A発現べクタ一をトランスフエクトした。トランスフエクションの 18時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩液（PBS) ですすいで、リガンドまたは溶媒を含む新鮮な培地に再度交換した。場合により、リガンド（テストステロンまたはジヒドロテストステロン（DHT) ) を添加した。 18時間後、細胞を回収して CATおよび 5 -ガラクトシダーゼ活性をァヅセィした。 CAT活性はガラクトシダ —ゼ活性で補正した（図 1 )。後述（図 2 a) の実験では、 AR発現べクタ一の代わりに GR発現ベクターまたは PR発現ベクターを用い、リガンドにはそれぞれデキサメタゾンまたはプロゲステロンを用いた。このとき、リポータープラスミドには、 GRに対しては pGRE- tk-CAT、 ΠΙに対しては pPRE- tk-CATを用いた。また、 ER発現べクタ一、およびリポータープラスミドとして pBL- CAT8+/EREを用いて、エストロゲン（17 ?-エストラジオール； 10—⁸ M) の効果も調べた。

図 l aは、サイクリン Eは DHTによる ARの転写活性を増強し、その効果はサイクリン Eの発現ベクターに用量依存的であることを示す。サイクリン Eは ARの共トランスフエクシヨンがなければ、 AREを介した転写を増加させなかった（データ省略）ことから、サイクリン Eは ARを介して作用することが示唆される。サイクリン Aではこの作用はなく、サイクリン D1では AR転写活性がわずかに抑制されたことから、この作用はサイクリン Eに特異的であることが判明した（図 1 b)。これらの実験では、 AR蛋白質のレベルはサイクリン Eの過剰発現によって増加されなかったことから（デ一夕省略)、サイクリン Eによる ARの機能の増加は、 ARの発現レベルを変化させた結果によるものではないことが示唆される。 Cdk2をコ一ドする発現べクタ —をサイクリン Eと組み合わせて加えても、 AREを介した転写はさらには増強されなかった（データ省略）ことは、サイクリン Eと Cdk2との複合体形成は必要でなく、サイクリン E/Cdk2複合体よりもむしろ遊離のサイクリン Eが ARの活性化に関与しているという考えと一致する。

重要なことは、 ARE- CATリポ一夕構築物の DHTによる活性化は、抗アンドロゲン剤である 5-ヒドロキシフルタミド（5- 0H-F)によって完全に阻止されるのに対し、サイクリン Eを共トランスフヱクシヨンすると、 5- 0H-Fの 1000モル過剰量によっても AR機能は完全には抑制されず、かなりの CAT活性が残った（図 l b)。

グルココルチコィド受容体（GR) およびプロゲステロン受容体（PR) は、 ARと同じ DNA配列を介して作用することが知られている（Cato，A. et al . EMBO J. 7: 1403-1440 ( 1988))。しかし、サイクリン Eは、それぞれデキサメサゾンまたはプロゲステロンに応答するまたは PRを介した転写活性を増強することができなかつたことから、サイクリン Eによる AREを介した転写増強は、 ARシグナル伝達に特異的であることが判明した（図 l b)。ヒトのエストロゲン受容体 a (ERa ) を導入した MDAH041細胞は、 17 ? -エストラジオール（E₂) に反応して CAT活性を増強した（図 l c)。サイクリン Eはエストロゲンにより誘導される EREを介した ERの転写活性能には影響を及ぼさなかった。このとき、サイクリン D1は、既に報告されているように (文献 Zwijsen, R. M. et al . , Cel l 88: 405-15, 1997; Neuman, E. et al . , Mol . Cell . Biol . 17: 5338-47, 1997)、 ERひの機能を増加させた (図 1 c)。図 1に示した結果は、 HeLa細胞を用いた場合でも同様に認められた（データ省略)。

[実施例 2 ] サイクリン Eは主に ARの AF- i機能を活性化する

ERと同様に、 ARは 2つの転写活性化機能、すなわち、リガンド非依存的活性化ドメイン（AF- 1) およびリガンド依存的活性化ドメイン（AF-2) を有し、それらはそれぞれァミノ末端の AB領域およびカルボキシ末端のリガンド結合 EFドメインに存在する (Lang ley, E. et al . ( 1995 ) J. Biol . Chem. 270 : 29983-29990、 Doesburg, P. et al . (1997) Biochemistry 36 : 1052-1064)。サイクリン Eと相互作用し、転写活性を増強させる ARのドメインを特定するために、 ARの AB領域または EF領域のいずれかを GAL4 DNA結合ドメイン（DBD) と融合させ、 VP16-サイクリン E融合蛋白またはサイクリン E単独との機能的相互作用を、 GAL- 4f衣存的リポー夕 —による哺乳動物細胞の 2ハイプリッド系で調べた。

哺乳動物細胞の 2ハイブリヅドアヅセィにおいては、 GAL4- AR (AB) および GAL4-AR (EF) を pMベクターに、そして VP16-サイクリン Eを pVP16ベクタ一（クロンテヅク · ラボラトリーズ ·ィンク）にそれぞれ構築した（ABドメイン： 1-554 ァミノ酸残基、 EFドメイン： 624- 918ァミノ酸残基）。 17M2-G- CATおよび 17M5- TATA-CATリポータープラスミドはそれぞれ、グロブリンプロモ一夕一の上流に位置する 2つの GAL4 17M結合部位およびアデノウィルス- 2-主要後期プロモ一夕一の最小プロモータ一領域を含む。

ァヅセィには、 10%ゥシ胎児血清（FBS) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (MEM)で維持した HeLa細胞および MDAH041細胞を用いた。HeLa細胞または MDAH041 細胞を、 GAL4- AR (AB) または GAL4-AR (EF) 発現ベクター 2〃g、 VP16-サイクリン E 4〃g、そして 17M₂-G- CATリポ一夕一遺伝子 8〃gによって共トランスフエクトし、ジヒドロテストステロン（10—⁸ M) の非存在下または存在下で培養した。 CAT ァヅセィは上記のように実施した。

図 2 aに示すように、 GAL4- AR (AB) 単独では、リガンドが存在しなくとも、その AF1機能のために恒常的な活性を示し、 GAL4- AR (AB) を VP16-サイクリン E (デ一夕一省略）あるいはサイクリン E (図 2 a) と共トランスフエクトすると、 CAT 活性はさらに増加した。

しかしながら、 DHT存在下において AR (EF) とサイクリン Eとの間には有意な相互作用は認められなかった（図 2 a)。サイクリン E単独、あるいは GAL4DBDとの融合蛋白で転写の刺激が可能である（図 2 b) ことは、サイクリン Eは単に ARの ABドメインと相互作用するのみならず、 ARのコファクタ一として機能することを示唆する。

[実施例 3 ] サイクリン Eは ARの ABドメインに直接結合する

ィンビボでのサイクリン Eと ARとの物理的会合の証拠を得るために、 AR陰性 MDAH041細胞に、 AR単独、あるいは、 AR+サイクリン E、サイクリン Dl、またはサイクリン Aをコードする発現ベクターをトランスフエクトした。サイクリン複合体を各々のサイクリンサブュニヅトに対して特異的な抗体で免疫沈降させた後、抗 AR抗体を用いたウエスタンプロットによって、サイクリンに結合した ARを検出し

/ o

まず MDAH041細胞に、サイクリンE、および全長 AR、 ARの ABドメイン、または AR の EFドメインをコードする発現ベクターをトランスフエクトし、テストステロンの非存在下または存在下で培養した。 150 mM NaCl、 2.5 mM EGTA, I mM EDTA, 0. 1% ヅィ一ン 20、 10%グリセロール、 50 mM HEPES、 pH 8.0およびプロテアーゼ阻害剤 (ロイぺプチン 2 g/ml、 PMSF 100〃g/ml、ァプロチニン 2 g/ml、およびトリプシン阻害剤 20 g/ml )を含む IP緩衝液中で細胞を溶解した。ブラッドフォード法（バイオラヅド ·ラボラトリーズ、リヅチモンド、 CA) によって、細胞溶解物の蛋白濃度をアツセィし、等量の蛋白を免疫沈降またはウエスタンプロット分析に用いた。

免疫沈降は、細胞溶解物を抗サイクリン E抗体（サン夕クルズ ·バイォテクノロジ一社）と共にインキュベートして、その後プロテイン Aァガロース ·ビーズ（ベ一リンガ一 'マンハイム社、マンハイム、ドイツ）と 4 °Cでインキュベートして行った。 1時間後、軽く遠心してビーズを回収し、レムリ緩衝液中で煮沸した。試料を 10% SDSポリァクリルァミドゲル上で分離して二トロセルロース膜に移した。 5 %ミルクおよび 0. 1 %ヅィ一ン 20を含む PBSでブロッキングを行った後、ヒト ARに対するポリクロ一ナル抗体（サン夕クルズ ·バイオテクノロジー社）およびペルォキシダーゼ結合ャギ抗マウス IgGによって、蛋白を検出した。ブロヅトを 0. 1%ヅィ一ン 20を含む PBSで洗浄して、増強ケミルミネッセンス（ECL)反応（ァマシャム社）によって現像した。

図 3 aに示すように、細胞を全長の ARおよびサイクリン E発現べクタ一で共トランスフェクトすると、抗サイクリン E免疫沈降物において ARの強いバンドが検出され、これは DHT処理によってバンドの幅の広がりが観察された。単独でトランスフエクトした細胞からの抗サイクリン E免疫沈降物でも、 ARのかすかなバンドを検出したが、これはおそらく内因性サイクリン Eと、トランスフエクトした ARとの会合を反映している。この場合も、 DHTによる処理によって ARのバンドの幅が広がり、これは ARのリン酸化による可能性が高い（Pral l， O.W. et al .， J. Steroid Biochem. Mol . Biol . 65， 169-174 ( 1998) ; Blok, L. J. et al .， Endocr. Res. 3, 197-219 ( 1996 ) )。これらのトランスフエクタントにおいて、 AR蛋白の発現レベルは同等であつたため（データ一省略)、サイクリン Eの過剰発現によって ARレベルが増加し、それによつて AREを介した転写が刺激された可能性は除外される。抗サイクリン A または抗サイクリン D1免疫沈降物では、 DHTの有無にかかわらず ARは検出されないことから（デ一夕省略)、 ARの結合はインビボにおいてもサイクリン Eに特異的であることが示された。

インビボで ARのどの領域がサイクリン Eと物理的に相互作用するかに関して手がかりを得るために、 MDAH041細胞を、サイクリン E発現ベクターと、 ARの N-末端 AB領域または C末端 EF領域の発現べクタ一のいずれかとを共トランスフエクトし、抗サイクリン E免疫沈降物に対し、それぞれ Mの N-末端領域または C-末端領域に特異的な抗体を用いて、各々の AR断片の共沈降を評価した。 Mの N-末端 AB領域（ァミノ酸 1〜554位）および C末端 EF領域（アミノ酸 624〜918位）を pGEX (4T-1) ベクタ一にクロ一エングして実験に用いた。

図 3 bに示すように、 ARの ABドメインはサイクリン Eと共免疫沈降したが、の EFドメインは共沈降せず（図 3 c)、このことは、サイクリン Eがリガンド結合とは無関係にの AB領域に主に結合することを示している。

最後に、サイクリン Eが AR (AB) に直接結合するか否か、もしそうだとすれば AR (AB) のどの領域かを GSTプル .ダウンアツセィにより調べた。

GST蛋白、 GST- AR (AB)融合蛋白質、および ABドメインの一部を様々に欠失させたミュータントと GSTとの融合タンパク質を大腸菌で産生させ、先に記述したように (Nakanishi , M. et al . ( 1995) EMBO J. 14: 555-563、 Hashimoto, Y. et al . ( 1998) J. Biol . Cheni. 273 : 16544-16550; Yanagisawa, J. et al . Science 283, 1317-1321 ( 1999) )、グル夕チオン 'セファロ一ス . ビーズ（フアルマシア社）を用いて精製した。

サイクリン E蛋白質はインビトロで [³⁵S]メチォニン存在下で網状赤血球ライセート系（プロメガ社）によって翻訳した。ラベルされたサイクリン E蛋白は、 GST、 GST融合 AR (AB) あるいはその部分アミノ酸欠失ミュータントと 1時間インキュべートし、その混合物にグル夕チオンビーズを加え更に 1時間ィンキュベ一トした。結合した蛋白質を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、ォ一トラジオグラフィーにより検出した。

GST- AR(AB)蛋白質または種々の欠失ミュータント蛋白質（図 4 a中の" dell3" 〜"del l5"および" del62"〜"del82") をインビト口で翻訳されたサイクリン Eと混合した。

GSTプル .ダウンアツセィによって、サイクリン Eは ARの ABドメインに直接結合するが（図 4 c；)、 ARの EFドメインにはほとんど結合しないことが明らかになった

(データ省略）。サイクリン Eは AR (AB)の N末端部分の欠失ミュータント蛋白である del62、 del72、 del82には結合するが、 C末端部分の欠失ミュータント蛋白である dell3、 del 14, del l5には結合しない（図 4 c) ことから、サイクリン E結合ドメイン領域は AR (AB) の C末端部分であることが示唆された。

予め形成させたサイクリン E/Cdk2複合体は、 ARの ABドメィンまたは EFドメインに結合しなかった。サイクリン D1もサイクリン Aも、 ARとの結合は認識できるほどではなかった（デ一夕省略）。

AR (AB)の欠失ミュータント蛋白の転写能をサイクリン Eの発現ベクターの存在下あるいは非存在下で一過性の発現系で CATァヅセィにより検討した。その結果、インビトロの結合活性と同様の結果が得られ（図 4 c)、サイクリン Eは AR (AB)の N末端部分の欠失ミュータント蛋白である del62、 del 72, del82の転写活性を増強し、 C末端部分の欠失ミュータント蛋白である dell3、 del 14, dell5の転写活性はサイクリン Eの発現に応答せず、 CAT活性の増加反応は認められなかった（図 4 a , 黒いバー）。特に、 AR (AB) の 418から 566番目の領域のアミノ酸を除くと（del l3)、サイクリン Eによる転写増加能は著しく減弱した（図 4 a)。これらの結果から、 AR (AB)の C末端部分（ァミノ酸 418から 566番目）へのサイクリン Eの結合が ARの AF-1 機能を増強するために不可欠であることが示唆される。また、全長の ARからサイクリン E結合領域と転写活性ドメインを共に除去すると（del E 図 4b)、 DHTによる ARの転写活性のみならず、 DHT存在下におけるサイクリン Eによる ARの転写活性の増加が完全に抑制された（図 4b)。産業上の利用の可能性

本発明により、サイクリンン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害することによる抗アンドロゲン剤の新たな作用機序が見出され、これを基にした抗アンドロゲン剤のスクリーニング方法が提供された。本発明のサイクリンン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物は、既存の抗アンドロゲン剤に抵抗性となるようなアンドロゲン受容体の活性化をも抑制することが期待される。従つて本発明は、これまで限界があった抗アンドロゲン剤による疾患治療に新たな可能性を開くものである。

本発明のサイクリンン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物は、例えば、前立腺癌、前立腺肥大症、男性型脱毛症、性的早熟、尋常性座瘡、脂漏症及び多毛症等の疾患の治療剤として有用な医薬組成物となることが期待される。また、該化合物を予め投与しておけば、前立腺癌、前立腺肥大症、男性型脱毛症、性的早熟、尋常性座瘡、脂漏症及び多毛症等の疾患の発生を防ぐか遅延させることが期待できるので、これらの疾患の予防剤となることも期待できる ,

Claims

請求の範囲

1 .サイクリン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、

( a ) 被検試料存在下、サイクリン Eとアンドロゲン受容体とを接触させる工程

( b ) 該サイクリン Eと該アンドロゲン受容体との結合を検出する工程、および

( c ) 被検試料非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該結合を低下させる化合物を選択する工程、を含む方法。

2 .サイクリン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、

( a )サイクリン Eを発現するべクタ.一、アンドロゲン受容体を発現するベクター、およびァンドロゲン受容体応答配列の下流にレポ一夕一遺伝子が機能的に結合されたベクタ一が導入された細胞に、被検試料を接触させる工程、

( b ) 該細胞におけるレポ一夕一活性を検出する工程、および

( c ) 被検試料を接触させない場合と比較して、該レポーター活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む方法。

3 .サイクリン Eとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害する化合物若しくはその薬学上許容しうる塩またはそれらのプロドラッグ。

4 . 請求項 1または 2に記載の方法により単離しうる、請求項 3に記載の化合物若しくはその薬学上許容しうる塩またはそれらのプロドラッグ。

5 . 請求項 3または 4に記載の化合物若しくはその薬学上許容しうる塩またはそれらのプロドラッグを有効成分とする医薬組成物。

6 . 抗アンドロゲン剤である、請求項 5に記載の医薬組成物。

7 . 前立腺癌、前立腺肥大症、男性型脱毛症、性的早熟、尋常性座瘡、脂漏症及び多毛症から選択される疾患の予防または治療のための、請求項 5または 6に記載の医薬組成物。