WO2001058943A1

WO2001058943A1 - Nouvelle proteine clac du type collagene, precurseur de ladite proteine, et genes codant pour cette proteine

Info

Publication number: WO2001058943A1
Application number: PCT/JP2001/001014
Authority: WO
Inventors: Takeshi Iwatsubo; Tadafumi Hashimoto; Yasuo Nagai
Original assignee: Bf Research Institute, Inc.
Priority date: 2000-02-14
Filing date: 2001-02-14
Publication date: 2001-08-16
Also published as: US7888076B2; CN1241940C; US20040250304A1; CA2400117A1; US20110137013A1; US7514542B2; ATE490979T1; EP1270588A1; DE60143608D1; JP4249927B2; AU2001232275A1; CN1422280A; US8173775B2; CA2400117C; EP1270588A4; US20100004433A1; US20090280530A1; EP1270588B1

Description

明細書コラーゲン様新規蛋白 C L A Cおよびその前駆体、ならびにそれらをコードする遺子技術分野

本発明は、アルツハイマー病患者の脳に老人斑を形成して蓄積するアミロイド物質中に存在するヒト型のコラーゲン様新規蛋白（以下、 CLACと称する）おょぴ CL AC前駆体（以下、 CLAC— Pと称する）、ならびにそれらをコードする遺伝子に関する。さらに本発明は、マウス型 CLAC— Pの cDNA配列およびアミノ酸配列にも関する。また本発明は、これらを応用して、アミロイド蛋白の蓄積促進機序を阻害することによる治療法おょぴ細胞障害を抑制することによる治療法、ならびにアルツハイマー病の診断法の開発にも関する。背景技術

アルツハイマー病は、神経細胞変性 ·脱落とともに、老人斑の形成および神経原線維変化の出現を特徴とする痴呆性神経変性疾患である。最も特徴的な老人斑は /3アミロイド前駆体蛋白質（]3- amyloid precursor protein、以下、 jSAPP と略すこともある）に由来するアミロイド /3ペプチド（以下、 AjSと略すこともある）を主成分として（Biochem Biophys Res Commun 122， 1131 (1984)) 、ァポリポ蛋白 E (Brain Res 541, 163 (1984) ) や補体成分 C 1 q (Acta

Neuropathol 57, 239 (1982) ) などの生体成分が沈着したものである。 A はそれ自体が凝集性を有するが、前記の非 A アミロイド成分、すなわちアポリポ蛋白 E (Nature 372, 92 (1994) ) や C 1 q (J Neurosci Res 46, 58 (1996)) の作用によりアミロイド線維の形成が促進される。アミノ酸 40〜42個からなる A ]3は、神経細胞を含め種々の細胞から分泌されており、通常の濃度では顕著な毒性を細胞に与えることはない。し力し、高濃度になると A は凝集し、神経細胞に対して毒性を示すようになる（Science 250, 279 (1990)) 。この際に細胞表面に存在し、凝集した Aj3の受容体として作用ずる分子としては RAGE (Nature 382， 685 (1996) ) ゃスカベンジャー受容体 A (Nature 382， 716

(1996) ) などが知られている。アルツハイマー病の神経細胞障害過程には、アミロイドの凝集と蓄積、細胞に対する毒性が極めて重要視されており、両過程の阻害はアルツハイマー病の治療法として有効と考えられる。

A /3のアミロイドとしての蓄積はアルツハイマー病にきわめて特徴的ではある、 A の蓄積のみでは神経細胞に対する毒性の発揮、アルツハイマー病の発症には不十分であることが明らかになりつつある（J. Neurosci. 17, 7053

(1997) ) 。一方でアポリポ蛋白 Eのように、と結合し、老人斑アミロイド蓄積過程を促進する蛋白質の遺伝的多型性が、アルツハイマー病発症の危険因子として作用する例（Science 261， 921 (1993) ) からも推察されるように、老人斑アミロイド中の未知蛋白成分がアミロイドの蓄積性および神経細胞障害性に重大な影響を与えている可能性が注目されてきたが、その成分の同定は未だなされてこなかった。発明の開示 ·

力かる状況に鑑みて、本発明者らは、アルツハイマー病患者脳から抽出したァミロイド画分に対するマウスモノクローナル抗体を作成した結果、意外なことに、これらのモノクローナル抗体の中から、老人斑アミロイドを選択的に染色し、生化学的に 5 0ないし 1 0 0キロダルトンの新規蛋白を認識する抗体を見レ、だした。さらに本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに鋭意研究を進めた結果、アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に存在する、新規なヒト ·コラーゲン様アルツハイマーアミロイド構成蛋白 C L A C (collagen-like Alzheimer amyloid plaque component) を見いだし、その全構造ならびにその前駆体 C L A C - P ( C L A C precursor protein) をコードする新規遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完成するに至った。さらに本発明者らは、マウス型の C L A C— Pの c D N A配列を決定し、ァミノ酸配列を推定した。

すなわち、本発明は、

( 1 ) 配列表の配列番号： 1に記載のヌクレオチド 8 6 8からヌクレオチド 2 4 9 3までの塩基配列からなる C L A C D NA、 (2) 配列表の配列番号： 2に記載のアミノ酸 113からアミノ酸 654までのアミノ酸配列からなる CLAC、

(3) 上記 (2) に記載の蛋白において 1もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ以下の特性 (a) および（b) を有する蛋白をコードする DNA :

(a) アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積する、

(b) A 凝集を促進する機能を有する、

(4) 上記 (1) 記載の DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイゼーシヨンし、かつ以下の特性 (a) および（b) を有する蛋白をコードする DN A：

(a) アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積する、

(b) A /3凝集を促進する機能を有する、

(5) 上記 (3) または（4) のいずれかに記載の DNAがコードする蛋白、

( 6 ) 配列表の配列番号： 1に記載のヌクレオチド 532からヌクレオチド 2493までの塩基配列からなる CLAC— P DNA、

(7) 配列表の配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる CL AC— P、

(8) 上記（7) に記載の CLAC— Pにおいて 1もしくは複数のアミノ酸が揷入、欠失もしくは置換されており、かつ細胞表面において A β受容体として機能する蛋白をコードする DNA、

(9) 上記（6) 記載の DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイゼーションし、かつ細胞表面において A ]3受容体として機能する蛋白をコードする DNA、

(10) 上記 (8) または（9) のいずれかに記載の DN Aがコードする蛋白、

(1 1) 配列表の配列番号： 2のァミノ酸配列のァミノ酸番号 141〜 146 または 589〜 597において 1もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失もしくは置換されている上記（10) 記載の蛋白、

(12) 上記 (1) 、 (3) または（4) のいずれかに記載の DN Aを含有する発現ベクター、

(13) 上記（12) に記載のベクターによって形質転換された形質転換体、 . (14) 上記（13) 記載の形質転換体を、上記（12) 記載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法、

(15) 上記 (6) 、 (8) または（9) のいずれかに記載の DN Aを含有する発現ベクター、

(16) 上記（15) に記載のベクターによって形質転換された形質転換体、

(17) 上記（16) 記載の形質転換体を、上記（15) ff己載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法、

(18) 経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号 F ERM BP— 7438として寄託されている形質転換体、

(19) 上記（18) に記載の形質転換体中に含まれる CLAC— P遺伝子、

(20) 上記（18) に記載の形質転換体を、その中に含まれる CL AC— P 遺伝子を含有するべクターが発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法、

(21) 上記（2) または（5) に記載の蛋白に特異的に結合する抗体、 ( 22 ) モノクローナル抗体 9 D 2である上記（21) 記載の抗体、

(23) 上記 (2) または（5) に記載の蛋白を用いることを特徴とする、 C LACの活性阻害剤のスクリ一ユング方法、

(24) 上記（23) のスクリーニング方法により得られる、 CLACの活性阻害剤、

(25) 上記（21) 記載の抗体を用いることを特徴とする CLACの検出方法、

(26) 上記（21) 記載の抗体または上記（24) 記載の CLACの活性阻害剤を用いることを特徴とする、アルツハイマー病の治療、進行遅延または予防方法、

(27) 該抗体がモノクローナル抗体 9 D 2である上記（25) 記載の方法、

(28) 該抗体がモノクローナノレ抗体 9 D 2である上記（26) 記載の方法、 (29) モノクローナル抗体 9 D 2を用いる CLACの精製方法、

(30) 上記 (7) 、 (10) または（1 1) に記載の蛋白に特異的に結合する抗体、 (31) モノクローナル抗体 9 D 2である上記（30) 記載の抗体、

(32) 上記 (7) 、（10) または（11) に記載の蛋白を用いることを特徴とする、 CLAC— Pの活性阻害剤のスクリ一ユング方法、

(33) 上記（32) のスクリーニング方法により得られる、 CLAC— Pの活性阻害剤、

(34) 上記（30) 記載の抗体を用いることを特徴とする CLAC— Pの検出方法、

(35) 上記（30) 記載の抗体または上記（33) 記載の CLAC— Pの活性阻害剤を用いることを特徴とする、アルツハイマー病の治療、進行遅延または予防方法、

(36) 該抗体がモノクローナル抗体 9 D 2である上記 (34) 記載の方法、 (37) 該抗体がモノクローナル抗体 9 D 2である上記（35) 記載の方法、 (38) モノクローナル抗体 9D 2を用いる CLAC— Pの精製方法、 (39) 検知可能に標識されたモノクローナル抗体 9 D 2を構成成分とするァルツハイマー病診断用キット、ならびに

(40) 上記 (1) 、 (3) 、（4) 、 (6) 、 (8) または（9) のいずれかに記載の D NAを人為的に染色体中に導入するカゝ、あるいはレ、ずれかを染色体力欠損させたトランスジエニック動物、に関する。図面の簡単な説明

図 1Aおよび図 I B CLAC— Pの c D N Aの塩基配列および対応推定ァミノ酸配列を示す図である。

図 2 CLAC-Pを発現した H EK293細胞の 9 D 2免疫染色像（左パネル A) ならびに C L A C— Pを発現した H E K 293細胞 B莫画分のウェスタンプロット（右パネル B) である。

図 3 マウス CLAC— Pの c DNAの塩基配列を示す図である。

図 4 マウス CLAC— Pの推定ァミノ酸配列を示す図である。発明の詳細な説明本榮明の第 1の態様は、配列表の配列番号： 1に記載のヌクレオチド 868力らヌクレオチド 2493までの塩基配列からなる DNAであって、 CLACをコ ―ドする DN Aである。

本発明の第 2の態様は、配列番号： 2に記載のアミノ酸 1 13からアミノ酸 654までのアミノ酸配列を有する CLACである。

本発明の新規ァミロイド分子 CLACおよび CLAC— Pは、実施例 2に詳述するように、抗体との特異的相互作用を利用して検出することができ、その部分アミノ酸配列、 cDNA配列おょぴアミノ酸配列を決定することができる。以下に、これらの手にっき簡単に説明する。

C L ACおよび CLAC— Pは、例えば、以下の方法により検出することがでさる。

アルツハイマー病患者脳よりショ糖密度勾配遠心法、尿素抽出法等の公知の方法により不溶性画分として粗精製した老人斑アミロイド成分を、例えば、 BAL B— Cマウスに免疫して抗体、好ましくはモノクローナル抗体を得る。得られた抗体を用いて、下記（i) または（i i) のいずれかの方法により検出することができる。

( i ) ァルツハイマー病患者大脳皮質を 24時間 10 %ホルマリンにて固定後作成した組織切片の免疫学的化学染色によりアミロイド斑として検出、あるいは

(i i) アルツハイマー病患者大脳皮質をトリス緩衝液、ドデシル硫酸ナトリゥム溶液で抽出後の沈殿物を 70 %ギ酸で溶解したァミロイド画分の S D S電気泳動 .ウェスタンブロット解析により、 50ないし 100キロダルトンのポリぺプチドとして検出。

使用する抗体としては、実施例 1にて詳述するモノクローナル抗体 9 D 2が好ましい。

本発明の CLACの部分アミノ酸配列は、例えば、以下の工程（ィ）〜（ホ）を含む方法により決定することができる。

(ィ）アルツハイマー病患者大脳皮質をトリス緩衝液、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、 S D Sという）溶液で抽出後の沈殿物を 70 %ギ酸で溶解したァミ口イド成分を逆相高性能液体クロマトグラフィー（以下、 HPLCという）にて分画、 A ペプチドと分離し、

(口）ゲル濾過カラムにて 50および 100キロダルトンのポリペプチドをそれぞれ単離し、

(ハ）蛋白分解酵素、例えば、リシルェンドぺプチダーゼ、 As p— Ν、トリプシン等により限定分解を加え、

(二）逆相 HP LCによりペプチド断片を分離し、

(ホ）アミノ酸配列分析装置によりべプチドのアミノ酸配列を決定する。 CLAC蛋白質の前駆体、すなわち CLAC— Pの cDNA核酸配列は、例えば、以下工程（ィ）、（口）を含む方法にて得ることができる。

(ィ）上述のごとく得られた C L A Cの部分ァミノ酸配列、例えば Gly Glu

Gin Gly Asp Gin Gly Pro Arg Met Val Phe Pro Lys lie Asn His Gly Phe Leu Ser Ala Asp Gin Gin Leu lie Lys配列番号： 11) の一部分をコードする核酸配列に対応しうる合成オリゴヌクレオチド混和物（degenerate primer) をプライマ一として、ヒト脳由来の相補 DN A (cDNA) ライプラリーからポリメラ —セ 'チェーン ' リアクション (polymerase chain reaction; PCRJ 法用いて、 CLAC蛋白の一部分をコードする cDNAをクローユングし、

(口）（ィ）で得られた核酸配列を錶型として、 PCR法を用いた「rapid amplification of cDNA endsj 法（当業者に公知）を反復して施行する。

また CLAC— Pの全予想ァミノ酸配列は、上記核酸配列を常法に従ってァミノ酸に翻訳することにより得ることができる。

力べして得られたヒト CLAC— Pの c D N A配列を配列表の配列番号： 1に示す。この配列は 654個のアミノ酸からなる CLAC— Pをコードする OR F (オープンリーディングフレーム）を有し (ヌクレオチド 532〜 2493) 、その 654個のアミノ酸からなる CLAC— P蛋白の全予想アミノ酸配列を配列表の配列番号： 2に示す。

また、マウスもしくはラット脳由来 cDNAライプラリーを用いて、上記ヒト C L AC— Pの核酸配列から適切に選択した核酸配列に相当するオリゴヌクレオチドを化学合成し、それをプライマーとして PC R法を施行することにより、マウスもしくはラットの CLAC— P c DNAおよびそれらのアミノ酸配列を得ることもできる。

本発明の CLACは、（a) アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積し、かつ (b) A 凝集を促進する機能を有する。

本発明の CLACの AjS凝集を促進する機能を種々の方法により評価することができる力例えば、次の方法（ィ）または（口）により評価することができる。

(ィ）合成 A (1-42) ペプチド [アミロイド 3ペプチドの N末端から 1 番目〜 42番目のアミノ酸からなることを意味する] 115μΜと適量の精製 C L ACを混和し、室温で 0〜 5日インキュベーションする。反応液を 15， 00 0 X g、 15分遠心し、沈殿物を 10 μ 1の PBS液に懸濁する。チオフラビン Tを適量加え、蛍光光度計で分析する。 λ Θ χは 440nm、； L emは 482η mで行う。得られた測定値を、精製 CLACを加えない A （1—42) ぺプチドのみを同様にインキュベーションした場合の値と比較する。あるいは、

(口）ヒト CLAC— P遺伝子を過剰発現したトランスジエニックマウスとァルツハイマー変異型 i3 APP遺伝子を過剰発現したトランスジエニックマウスを交配して生まれたマウスの脳のアミロイド斑がアルツハイマー変異型 j3 APP 遺伝子のみを過剰発現したトランスジエニックマウス脳のそれよりも増加していることを免疫糸且織化学もしくは生ィ匕学的に確認することにより、あるいはマウス CLAC— P遺伝子をノックアウトしたマウスにアルツハイマー変異型 jS APP 遺伝子を過剰発現したトランスジエニックマウスの脳の ]3アミロイド斑が、アルッハイマー変異型 j8 APP遺伝子を過剰発現したトランスジエニックマウスのそれょりも減少していることを免疫組織化学もしくは生化学的に確認する。

本発明の第 3の態様は、 C L A Cのァミノ酸配列にぉレ、て 1もしくは複数のァミノ酸が挿入、欠失もしくは置換された、いわゆる CLAC変種蛋白であって、 (a) アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積し、力つ (b) 凝集を促進する機能を有する CLAC変種蛋白をコードする DNAである。

ここで、 1もしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換は、人為的に生じたものであってもよく、自然発生的に生じたものであってもよい。例えば、部位特異的突然変異誘発（M. J. Zoller et al. , Methods in Enzymology, 100， 468 (1983)) あるいは PC R法（Molecular Cloning 2nd Ed. Ch. 15, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) 等の公知の方法により遺伝子工学的に行うことができる。また、力かるアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換は生体内で生じるものであってもよく、スプライスバリアント、対立遺伝子による変種等も本発明の CL AC変種蛋白に包含される。さらに、上記機能（a) および (b) を有する C LACの部分ペプチドも本発明の C LAC変種蛋白に包含される。また、 1または複数のアミノ酸において、化学的修飾（人為的であっても自然発生的であってもよい）がなされたものも、本発明の CL AC変種蛋白に包含される。力かる化学修飾としては、例えば、ァセチル化、アミド化、ァシル化、糖鎖付加、リン酸化、硫酸化、脂質付加、ハロゲン化、塩の形成等がある。さらに、天然の L一型の 20種以外のアミノ酸（D—型、人工アミノ酸等）が CLA C変種蛋白中に存在していてもよい。かかる CLAC変種蛋白をコードする DN A配列の、元の CLACをコードする DNA配列（本発明の第 1の態様）に対する相同性は、少なくとも 50%、好ましくは少なくとも 70%、より好ましくは少なくとも 80 %、最も好ましくは少なくとも 90 %である。

ここに、相同性とは、 2つの DNAまたはポリペプチドのヌクレオチド配列またはァミノ酸配列間の一致の度合レヽをパーセントで表現したものをいう。今日では、相同性の検索にはコンピュータープログラムが使用されており、 Smith- Waternmanアルゴリズム、 FASTAまたは BLASTプログラム等が使用されている。

また、本発明の第 4の態様は、配列番号： 3記載の DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイゼーシヨンし、（a) アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積し、かつ (b) A 凝集を促進する機能を有する蛋白をコードする DNAである。ここに、ストリンジヱントな条件とは、例えば、塩基配列間に少なくとも 90%以上の相同性がある場合にのみハイプリダイゼーションが起こるような条件を意味し、例えば、 50%ホルムアミド、 5 xSSC (150 mM NaC l、 1 5 mMクェン酸三ナトリウム）、 5 OmMリン酸ナトリウム（pH

7. 6) 、 5 Xデンハーツ溶液、 10%硫酸デキストラン、および

1の変性し、剪断されたサケ精子 DN Aを含有する溶液中、 42°Cで一晩インキュベーシヨンし、ついで、 0. 1 X S S C中 65°Cで洗浄を行う条件が拳げられる。ハイプリダイゼーションおよび洗浄については周知の手法で行うことができ、 Molecular Cloning 2nd Ed. Ch. 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に示されている。

本発明の第 5の態様は、

( i) 配列番号： 4に記載の CLAC蛋白において 1もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換された、いわゆる CLAC変種蛋白であって、（a) アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積し、かつ（b) A β凝集を促進する機能を有する CLAC変種蛋白をコードする DNA；あるいは

( i i ) 配列番号： 3記載の D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィゼーシヨンし、（a) アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積し、かつ（b) A 凝集を促進する機能を有する蛋白をコードする DNA

のいずれかによりコードされる蛋白である。かかる蛋白としては、 CLAC変種蛋白または CLACに対して高いアミノ酸配列相同性を有する蛋白であって、上記（a) 、 (b) の機能を有するものが挙げられる。例えば、上記の CLAC変種蛋白や、 CLACの部分ペプチド、ラットやマウスの CLAC等が具体例として挙げられる。

本明細書において、第 2の態様の C L A Cならびに第 5の態様の C L A C変種蛋白をまとめて、「CLAC」と称することがある。

本発明の第 6の態様は、配列表の配列番号： 1に記載のヌクレオチド 53 2からヌクレオチド 2493までの塩基配列からなる CLAC— P DNAである。本発明の第 7の態様は、配列番号： 2に記載のァミノ酸配列からなる C L A C 一 Pである。

本発明の C L A C— Pは細胞表面にぉレ、て Αβ受容体として機能する。

本発明の C L A C— Ρの細胞表面におけるアミロイド受容体としての機能を種々の方法により評価することができるが、例えば、次の方法により評価することができる。

CLAC— Pを恒常的に発現した HEK 293細胞およびコントロール細胞をコンフルェントな状態まで培養し、予め 60分間試験管内でィンキュベーションした 10 mM A ]3 (1 -42) を加え、 60分間インキュベーションする。回収した細胞を、 SD Sサンプルバッファーを加えて超音波破碎により可溶ィ匕し、 SDSポリアクリルアミド電気泳動により蛋白を分解し、抗 A j3抗体を用いたゥエスタンプロッティングを行い、細胞に結合した A β量を検出することができる。

C L A C— Ρを介して細胞に結合した A j3の細胞毒 1"生にっレ、ては、次の方法により評価することができる。例えば、 NGFにより神経細胞に分化誘導した PC 12細胞に、リポフエクシヨン法により CLAC— Pを一過性に発現させ、予め 1時間インキュベーションした A ]3 (1-42) を加え、 1時間インキュベーシヨンする。その後、細胞を 10%ホルマリンで固定し、 TUNEL染色性により、ァポトーシスによる細胞死過程を示す細胞核を染色し、陽性細胞の比率を C L A C —Pを発現しない PC 12細胞と比較する。あるいは、各ゥヱルに臭化 3— [4， 5—ジメチルチアゾール _ 2—ィル ] —2, 5—ジフエノルテトラゾリゥム（M

TT) 試薬を加え、生存細胞に取り込まれた MTT試薬の量を吸光光度計により測定し、比較してもよい。

本発明の第 8の態様は、 CLAC— Pの 1個もしくは複数のァミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ細胞表面において A 受容体として機能する蛋白、いわゆる CLAC— Ρ変種蛋白をコードする DNAである。

ここで、 1もしくは複数のアミノ酸の揷入、欠失もしくは置換は、人為的に生じたものであってもよく、自然発生的に生じたものであってもよい。例えば、部位特異的突然変異誘発（M. J. Zoller et al.， Methods in Enzymology, 100， 468 (1983)) あるいは PCR法（Molecular Cloning 2nd Ed. Ch. 15， Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) 等の公知の方法により遺伝子工学的に行うことができる。また、かかるアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換は生体内で生じるものであってもよく、スプライスバリアント、対立遺伝子による変種等も本発明の CL AC— P変種蛋白に包含される。さらに、細胞表面において A 受容体として機能する C L A C— Pの部分ぺプチドも本発明の C L A C— P変種蛋白に包含される。また、 1または複数のアミノ酸において、化学的修飾（人為的であっても自然発生的であってもよい）がなされたものも、本発明の CLAC _P変種蛋白に包含される。力かる化学修飾としては、例えば、ァセチル化、ァミド化、ァシル化、糖鎖付加、リン酸化、硫酸化、脂質付加、ノ、ロゲン化、塩の形成等がある。さらに、天然の L一型の 20種以外のアミノ酸（D—型、人エアミノ酸等）が CLAC— P変種蛋白中に存在していてもよい。かかる CLAC— P変種蛋白をコードする DNA配列の、元の CLAC— Pをコードする DNA配列（本発明の第 6の態様）に対する相同性は、少なくとも 50%、好ましくは少なくとも 70 %、より好ましくは少なくとも 80 %、最も好ましくは少なくとも 90%である。

また、本発明の第 9の態様は、配列番号： 1記載の D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーシヨンし、細胞表面にぉレ、て A 受容体として機能する蛋白をコードする DNAである。

本発明の第 10の態様は、

(i) CLAC— Pの 1個もしくは複数のアミノ酸が揷入、欠失もしくは置換されており、かつ細胞表面において A ]3受容体として機能する蛋白、いわゆる C LAC—P変種蛋白をコードする DNA；あるいは

( i i ) 配列番号： 1記載の D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィゼーシヨンし、細胞表面にぉ、て Αβ受容体として機能する蛋白をコードする DNAのいずれかによりコードされる蛋白である。かかる蛋白は、 CLAC— P 変種蛋白または C L A C— Ρに対して高いァミノ酸配列相同性を有する蛋白であつて、細胞表面において A 受容体として機能するものである。例えば、上記の CLAC— P変種蛋白や、 CLAC— Pの部分ペプチド、ラットやマウスの CL AC— P等が具体例として挙げられる。

さらに本発明の第 1 1の態様は本発明の CLAC— Pのスプライスバリアントである。本発明の CLAC— Pのスプライスバリアントとしては、例えば、酉己歹番号： 2のアミノ酸番号 14：!〜 146において 1個もしくは 6個のアミノ酸が欠失もしくは置換されたもの、あるいは配列番号： 2のアミノ酸番号 589〜 597において 1個もしくは 9個のアミノ酸が欠失もしくは置換されたもの、上記のアミノ酸の欠失または置換が同時に起っているものが挙げられる。かかる多様性は選択的スプライシングによる複数種のメッセンジャー RN A形成によるものと考えられる。

本明細書において、第 7の態様の CLAC— P、第 10の態様の CLAC— P 変種蛋白ならびに第 1 1の態様の CLAC— Pのスプライスバリアントをまとめて、「CLAC— P」と称することがある。

本発明の第 12の態様は、本発明の第 1、第 3または第 4のいずれかの態様の DNAを含有する発現ベクターである。本発明の第 13の態様は、該発現べクタ一により形質転換された形質転換体である。本発明の第 14の態様は、該形質転換体を、該発現べクタ一の発現可能条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法である。このようにして製造された組み換え蛋白も本発明に包含される。かかる組み換え蛋白は、本発明の CL ACである力あるいは（a) アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積し、かつ（b) AjS凝集を促進する機能を有する CL AC変種蛋白である。

本発明の第 15の態様は、本発明の第 6、第 8または第 9のいずれかの態様の

DNAを含有する発現ベクターである。本発明の第 16の態様は、該発現べクタ一により形質転換された形質転換体である。本発明の第 17の態様は、該形質転換体を、該発現べクタ一の発現可能条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法である。このようにして製造された組み換え蛋白も本発明に包含される。かかる組み換え蛋白は、本発明の CL AC— Pであるか、あるいは細胞表面において A 受容体として機能する CL AC— P変種蛋白である。これらの態様に関連した態様において、本発明は、 C L AC— Pをコードする遺伝子を含むベクターを入れた HEK 293細胞形質転換体（経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号 F ERM BP— 7438として寄託されている）に関する。したがって本発明は、上記寄託株中に含まれる CL AC— P遺伝子にも関する。さらなる態様において、該寄託形質転換株を、その中に含まれる C L AC— P遺伝子を含有するベクターが発現可能な条件下で培養することを特徴とする組み換え蛋白の製造方法にも関する。このようにして製造された組み換え蛋白も本発明に包含される。

力、かる組み換え法による蛋白の製造は当業者に公知の方法、例えば Molecular

Cloning 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載された方法により行うことができるが、以下に典型例を示す。

上記 DNAを組み込むのに適したベクターとしては、例えば大腸菌由来の p B R 322 (Gene, 2, 95 (1977)) 、 p BR 325 (Gene, 4, 121 (1978)) 、 p UC 12 (Gene, 19， 259 (1982)) 、 pUC 13 (Gene, 19， 259 (1982)) 、 p UC 1 18、 pUC 1 19 (Methods in Enzymology, 153, 3 (1987)) 、枯草菌由来の pUB 1 10 (Biochemical and Biophysical Research Communication, 112， 678 (1983)) 等が挙げられる。その他のものであっても、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれをも用いることができる。

プラスミドに上記 DN Aを組み込む方法としては、例えば、 Molecular Cloning p.239, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982)等に記載の方法がある。

このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主、例えばェシエリシァ

(Escherichia) 属菌、バチルス (Bacillus) 属菌等に導入する。

上記ェシェリシァ属菌の例としては、ェシェリシァ ·コリ（Escherichia coli) K12DH1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1986)) 、 M10 3 (Nucleic Acids Research, 9， 309 (1981)) 、 JA221 (Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)) 、 HB 101 (Journal of Molecular

Biology, 41， 459 (1969)) 、 C600 (Genetics, 39, 440 (1954) ) 等が挙げられる。

形質転換する方法としては、例えば、 Molecular Cloning p.249, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982)に記載の塩ィ匕カルシウム法あるいは塩化カルシゥム /塩ィ匕ルビジウム法等が挙げられる。

このようにして得られた形質転換体の中から自体公知の方法、例えばコ口ニーハイプリダイゼーシヨン法（Gene, 10, 63 (1980)) および DNA塩基配列決定法 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 560 (1977)； Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)) 等を用い、所望クローンを選出する。

このようにして、クローン化された本発明の組み換え蛋白の遺伝子を含む DN

Aを有するベクターを保持する微生物が得られる。

次に、該微生物からプラスミドを単離する。

該単離法としては、アルカリ法（H. C. Birmbiom et al. , Nucleic Acids Research, 1, 1513 (1979) ) 等が挙げられる。

上記のごとくクローンィ匕された本発明の組み換え蛋白の遺伝子を含む組み換え D NAを有するプラスミドは、そのまま、あるいは所望により制限酵素で切り出して利用することができる。

クローン化された本発明の組み換え蛋白の遺伝子を、発現に適したビークル

(ベクター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクターを得ることができる。発現型ベクターにて形質転換される宿主としては動物細胞が好ましく、好ましいベクターとしては、動物細胞発現用プラスミド（例えば、 p c D NA I、 p d K C R—d h f r等）が挙げられる。また、本発明の組み換え蛋白の生成に適したものであれば、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞ならびにそれらに適したベクターでも使用可能であり、これらは当業者によく知られている。該遺伝子はその 5，末端に翻訳開始コドンとしての AT G (所望により適当なシグナルペプチドをコードする塩基配列）を有し、また 3，末端には翻訳開始コドンとしての T AA、 T GAまたは ATA G (好ましくは T GA) を有していてもよい。さらに該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。

宿主が動物細胞である場合には、 S V 4 0由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター等が挙げられ、とりわけ S V 4 0のプロモーターが好ましい。動物細胞としては、例えばサル細胞 C O S— 7、チャニーズハムスタ一卵巣細胞（C H O細胞）、諸種動物の神経芽細胞腫、グリア芽細胞腫、線維芽細胞等が挙げられるが、本発明の組み換え蛋白の発現ならぴに分泌量が多い細胞が好ましく、中でもヒト胎児性腎線維芽細胞 2 9 3が好ましく用いられる。

動物細胞を形質転換するには、例えば、 Virology, 52， 456 (1973)に記載の方法に従って行われる。

このようにして本発明の組み換え蛋白をコードする D NAを含有するベクターで形質転換された形質転換体が得られる。

宿主がェシエリシァ属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機質その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えばアンモニゥム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ ' リカー、コンスターチ、ベプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば塩ィ匕カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩ィ匕マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地の p Hは約 6〜 8が好ましい。

ェシェリシァ属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含む M 9培地 (Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433,

Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972) ) が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働力せるために、例えば 3 ]3—インドアクリル酸のような薬剤をカロえることができる。

宿主がェシェリシァ属菌の場合、培養は通常約 1 5〜 4 3 °Cで約 3〜 2 4時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。

宿主がバチノレス属菌の場合、培養は通常約 3 0 - 4 0 °Cで約 6〜 2 4時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば MEM 培地 (Science, 122, 501 (1952) ) 、 DMEM培地 (Virology, 8, 396

(1959) ) 、 R P M I 1 6 4 0培地（The Journal od American Medical

Association, 199, 519 (1967) ) 、 1 9 9培地 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73 1 (1950) ) などが挙げられる。これらに約 5 〜 2 0 %の胎児牛血清を添加してもよレ、。 p Hは約 6〜 8であることが好ましヽ。培養は通常約 3 0〜4 0 °C、必要に応じて通気や撹拌を加える。

上述のような本発明の C L A C— Pまたは C L A Cの遺伝子を組み込んだ誘導発現ベクターは、大腸菌などの細菌に導入してベクターの大量調製、あるいは種々の細胞における本発明の組み換え蛋白の調製に使用できるほか、後述するト ,ジエニック動物の作成にも利用することができる。上述のごとく、 CLAC— Pは、その断片型である C LACの前駆体であり、配列番号： 2で示されるアミノ酸配列を有する。

CLAC— Pの、その断片型 CL ACへのプロセッシングは、配列番号： 2のアミノ酸配列の 1 12番目のアミノ酸 A r gと 113番目のアミノ酸 G 1 uとの間で起こる開裂による。したがって、配列番号： 2の 1 13番目のアミノ酸 G 1 uから 654番目のアミノ酸 Ly sまでが C LACのアミノ酸配列である。また、通常は、 CLACの第 1番目のアミノ酸 G 1 uは環ィ匕してピログルタミン酸残基となっている。

0し〇ー？から。1^ A Cへの転換は生体内に存在するプロセッシング酵素の作用による。かかるプロセッシング酵素は本発明に包含される。かかるプロセッシング酵素は、例えば以下の（ィ）〜（ホ）のいずれかのようにして同定することができる。

(ィ） C L A C— Pを発現する培養細胞が分泌あるいは産生する C L A Cにつき、細胞培養液もしくは細胞周囲に産生された細胞外マトリックスを回収し、了ミノ酸配列解析に供し、 CL AC— Pと比較して切断部位を決定すること、あるレ、は

(口） CLAC— Pを発現する細胞に既知の蛋白分解酵素阻害剤を添加し、培養液もしくは細胞外マトリックスに出現する C L A C蛋白の量の減少を指標とする、

(ハ） CLAC— P遺伝子に公知の蛋白分解酵素による切断に必須とされるァミノ酸に変異をもたらす核酸配列変異を導入し、培養細胞に発現させ、培養液もしくは細胞外マトリックスに出現する CLAC蛋白の量の減少を指標とする、

(二） CLAC-Pを発現する培養細胞に公知の蛋白分解酵素をコードする c DNAをさらに導入し、培養液もしくは細胞外マトリックスに出現する CLAC 蛋白の量の増加を指標とする、

(ホ）公知の蛋白分解酵素を欠損する培養細胞に CLAC— Pをコードする c DNAを発現させ、培養細胞に発現させ、培養液もしくは細胞外マトリックスに出現する CLAC蛋白の量の減少を指標とする。上記の方法により同定されるプロセッシング酵素としては、 furin変換酵素等があるが、これ以外のプロセッシング酵素を同定することも可能である。

上記の蛋白分解酵素阻害剤としては、フリン（furin) の競合阻害剤であるデカノィルー RVKR—クロロメチルケトンおよぴ類似の化合物が挙げられるが、 CL AC— Pを発現する培養細胞は、 CL ACを多量に産生 ·分泌するため、 C

L A Cの産生ないし分泌を阻害する物質を効率よく高感度にスクリーニングすることができる。力かる阻害剤のスクリーニング法としては、例えば、被検物質を含有する培地中で、本発明の形質転換細胞を培養し、 CL ACの産生ないし分泌の阻害を検出または定量することにより行うことができる。該スクリ一ユング法においては、 CLACに特異的な抗体を用いるウェスタンブロッテイング法などの方法を適宜利用して、被検物質による細胞からの C L A Cの産生ないし分泌の変化を検出し、定量することができる。

具体的には、例えば、本発明の形質転換細胞をマルチプレートに蒔き、血清を含む DMEM培地で細胞がコンフルェントになるまで培養する。その細胞を無血清培地（0. 5%ゥシ血清アルブミン含有 DMEM) で洗浄後、同培地に被検物質を添加し、一定時間（例えば 24時間）培養する。その培養上清もしくはマルチプレート上に付着した細胞外マトリッタスに含まれる CL AC量をウェスタンプロッティング法により定量し、被検物質非添加群に対する C L AC量の割合おょぴ C L ACの産生 ·分泌促進低下作用を惹起する濃度で被検物質の C L AC産生 ·分泌阻害作用を評価する。

本発明の形質転換細胞は継代培養でき、大量の CLAC— Pおよび CLACを産生ないし分泌、できるので、再現良く、かつ高感度にスクリーニングに用いることができる。したがって、本発明の形質転換細胞を用いると、 CLACの産生ないし分泌を阻害する物質のスクリーニングを有利に行うことができる。また、常にクローン化された安定な細胞を多量に得ることができるので、スクリーニングの安定性と効率の点で有用である。このようなスクリーニングにより同定される CLACの産生ないし分泌を阻害する物質は本発明に包含される。

CLACは、培養細胞を用いて、例えば、次の（ィ）、（口）または（ハ）に記載したような方法で大量発現し、精製することができるが、これら以外の方法を用いてもよい。

(ィ） CLAC— Pを恒常発現する HEK293 (ATCC CRL—157 3 ) 細胞を 10 % F B Sを含む DMEM培地中で 3日間培養し、細胞がセミコンフルェントの状態になったら、 FB Sを除いた DMEM培地中で 48時間培養し、培養液を回収する。培養液を 50 mM Tr i s—HC l (pH8. 6) に対しー晚、 4°Cで透析し、その後 25， 0000 X g、 30分遠心分離する。沈殿物を 0. 1M齚酸に溶解させ、 DEAEカラムにアプライする。溶出は 0Mから 0. 1 Mおきに 1 Mまで順に濃度を変えた N a C 1で行う。全画分を 0. 1 M酢酸に対し透析し、例えば、特異抗体 9 D 2を用いたィムノブロッテイングで確認、し、陽性画分を精製 CL AC画分として用いる（一般的操作については Fichard et al.， J. Biol. Chera. , 272, 30083 (1997)参照) 。

(口）〇1^八〇_?を恒常発現する11£1：293細胞を 10%FB Sを含む D MEM倍地中で 3日間培養し、細胞がセミコンフェントの状態になったら、 F B Sを抜いた DMEM倍地中で 48時間培養し、培養液を回収する。培養液を 5

OmM Tr i s— HC 1 (pH8. 6) に対して一晚、 4°Cで透析し、その後 250， 000 x gで 30分遠心分離する。沈殿物を 0. 15 M酢酸に溶解させる。さらに 2M尿素を含んだ 2 OmM Na ₂HP0₄— NaH₂PO₄ (pH7. 2 ) (P BZU液）に対してー晚透析後、 250, 000 x gで 30分遠心分離し、上清をへパリンカラムにアプライする。溶出は OMから 0. 1おきに 1Mまで順に濃度を変えた NaC Iで行う。全画分を PBZUに対し透析し、特異抗体 9D2を用いたィムノブ口ッティングで確認し、陽性画分を精製 CL AC画分として用いる（一般的操作については Mizuno et al.， J. Biol. Chem. , 120, 934 (1996)参照）。

あるいは（ハ）あらかじめ CLAC特異抗体（例えば、 9D2) (lmg/m

1) をァフィゲル 10 (Bio- Rad) などの NH S †生型担体に結合させ、抗体力ラムを作製する。 CLAC— Pを恒常発現する HE K 293細胞を 10%FBS を含む DMEM倍地中で 3日間培養する。細胞がセミコンフルェントの状態になつたら、 F B Sを抜、た DMEM培地中で 48時間培養し、培養液を回収する。培養液に対し、 50%飽和硫安で蛋白を沈殿させる。 I Pノッファー（0. 5% SDS、 0. 5 % N P - 40を含んだ T S I液 [50 mM Tris (Gibco BRL)， 150 niM NaCl (関東化学）， 0.5 mM DIFP (和光純薬）， 0.5 mM PMSF (Boehringer Mannheim), 1 mM EGTA (和光純薬）， 1 μ g/ml アンチパイン（Sigma), 1 μ g/ l ロイぺプチン（和光純薬)， 1 βΕ/ lぺプスタチン（Sigma), 1 /ig/ml TLCK (Sigma)]) に溶解させ、 0. 45 μ mフィルターに通し、上記抗体カラムにァプライする。溶出は 0. 1% T r i t o n X— 100を含む 0. 2Mグリシン一 HC 1 (pH2. 6) で行う。溶出画分を精製 CLACとして用いる（一般的操作については Hirako et al. , J. Biol. Chem. , 273, 9711 (1998)参照) 。

したがって、本発明のさらなる態様は、モノクローナル抗体 9 D 2を用いる C L ACの精製方法である。

なお、モノクローナル抗体 9 D 2を産生するハイプリドーマは、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号 F ERM BP— 7437 として寄託されている。

本発明のさらなる態様は、本発明の CLAC— Pまたは CLACに特異的に結合する抗体である。

CL AC— Pならびに CLACに対する特異的抗体は、例えば、以下の方法により得ることができる。

CLACならびに CLAC— Pのァミノ酸配列に基づき、

NC - 1: Glu Pro Arg Ser Glu Asp Pro Thr Pro Ala Glu Gin His Cys (配列番号： 2のアミノ酸 14〜27) (配列番号： 3)

NC2-1： Gly Cys Asn His Gly Phe Leu Ser Ala Asp Gin Gin Leu lie Lys (配列番号： 2のアミノ酸 171〜 183、アミノ酸 171の前に G 1 yおよび Cy sを付加）（配列番号： 4)

NC2-2: Cys Lys Gly Glu Gin Gly Asp Gin Gly Pro Arg Met Val Phe Xaa Lys (配列番号： 2のァミノ 155〜 169、アミノ酸 155の前に C y sを付加） (Xaaはヒドロキシプロ.リンを意味する）（配列番号： 5) NC3: Asp Tyr Asn Gly Asn Leu His Glu Ala Leu Gin Arg lie Thr Cys (配歹 lj 番号： 2のアミノ酸 430〜443、アミノ酸 443の後に Cy sを付加）（配列番号： 6)

NC4: Leu Gly Pro Asp Gly Leu Pro Met Pro Gly Cys Trp Gin Lys (配列番号： 2のアミノ酸 641〜 654) (配列番号： 7)

等のペプチドを合成し、ついで、 KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) と結合させたこれらのぺプチドを抗原としてゥサギに免疫し、得られた血清の抗原ぺプチドに対する反応性を ELISA法により評価しつつ抗血清を得る。抗血清は抗原べプチドを結合したァフィゲルに結合させ、特異抗体のみをァフィニティ精製することもできる。

本発明の第 1 1態様の CLAC— Pのスプライスバリアントに関しても、上記のように利用することができる。

本発明の CL AC— Pまたは CL ACに特異的に結合する抗体としては、ポリクローナル、モノクローナルいずれであってもいが、モノクローナル抗体が好ましく、上記 9 D 2モノクローナル抗体が特に好ましい。

かかる抗体の中にはは CL ACまたは CL AC— Pに特異的に結合する。また、それらの作用機能を阻害するものも存在する。したがって、本発明のさらなる態様は、かかる抗体を用いた CL ACまたは CL AC— Pの検出方法である。この検出方法をアルツハイマー病の診断に使用してもよく、これらの抗体を当業者公知の標識、例えば、放射性標識（例えば、 ⁹⁹Tc) または蛍光標識、酵素標識等で標識することができ、生きた動物に注入してイメージをスキャンすることにより、あるいは生検または剖検試料中の CL ACまたは CL AC— P蛋白との結合を検知し定量することができる。

よって、本発明のさらにもう 1つの態様は、検知可能に標識した CL ACまたは C L A C— Pに対する特異的抗体を構成成分とするァルツハイマー病診断用キットである。生きたヒトに直接キット成分を注入し、イメージをスキャンするものであってもよく、生検試料または剖検試料にキット成分を作用させるものであつてもよい。抗体としてはモノクローナル抗体 9 D 2が好ましい。標識としては、放射性標識（例えば、 ⁹⁹Tc等）、蛍光標識、酵素標識等があり使用方法、用途、部位等に応じて選択される。力かる標識は当業者によく知られている。本発明の診断キットは、各成分を別個の容器に入れたものであってもよく、いくつかの成分をまとめて数個の容器に入れたものであってもよい。一般的には、適切な説明書をキットに添付する。

また、本発明のもう 1つの態様は、 CLACまたは CLAC— Pの作用機能を阻害する活性阻害剤のスクリーニング法である。力、かる活性阻害剤は、結果として A の蓄積を阻害する等の効果を有するので、アルツハイマー病の治療薬として使用することができる。

力かる活性阻害剤は、例えば、次の（ィ）（口）または（ハ）に記載したような方法を用いてスクリーニングすることができる。

(ィ） CLACと /3アミロイドの結合或いはそれに起因するアミロイド凝集促進に影響を与える物質については、合成 A (1-42) ペプチドと適量の精製 C L ACに加えて被検物質を混和し、室温で 0〜5日インキュベートし、チオフラビン Tによる蛍光を発するアミロイド線維の形成の抑制を評価する。或いは、ヒト CLAC— P遺伝子を過剰発現したトランスジエニックマウスとアルッハイマ一変異型 β ΑΡΡ遺伝子を過剰発現したトランスジエニックマウスを交配して産まれたマウス、もしくはアルツハイマー変異型 (SAP Ρ遺伝子を過剰発現したトランスジェエックマウスに被検物質を経口的、もしくは経静脈的、もしくは繊¾ 室的に投与し、脳の /3アミロイド斑が被検物質を投与しないマウスに比して減少することを免疫組織化学的もしくは生ィ匕学的に評価する。

(口） CLAC— Pを介したアミロイドの細胞への結合を抑制する物質については、 C L A C— Pを恒常的に発現した H E K 293細胞及びコントロール細胞を培養し、予め 60分間試験管内でインキュベートした 1 0 ^uMの A ]3 (1 -4 2 ) と被検物質を加え、さらに 60分間ィンキュベートし、回収した細胞に結合した A β量を検出することにより評価する。

(ハ） C L A C— Ρを介して細胞に結合した A βの細胞毒性を抑制する物質については、例えば、 NGFにより神経細胞に分化誘導した PC 1 2細胞に、リボフェクション法により CLAC— Pを一過性に発現させ、予め 1時間インキュベートした A β (1—42) ならびに被検物質を加え、その後細胞を TU EL染色してアポトーシスの抑制を評価する、或いは MTT試薬により生存細胞の増加を評価する。

したがって、本発明のさらなる態様は、 CLACまたは CLAC— Pを用いることを特 ί敷とする、かかる活性阻害剤のスクリーニング方法である。

かかる活性阻害剤としては、 CLACまたは CLAC— Ρに対するアンタゴニスト、 CLACまたは CLAC— Pに類似した構造を有するポリペプチド、あるいは他の低分子ィ匕合物等がある。

また、本発明の CLACまたは CLAC— Pに特異的に結合する抗体には C L ACまたは CLAC— Pの作用効果を阻害するものもあり、これらの抗体は結果として脳中の A ]3蓄積を抑制し、アルツハイマー病を治療、進行遅延または予防することができる。

したがって、本発明のさらにもう 1つの態様は、かかる活性阻害剤またはかかる抗体を投与することを特徴とするアルツハイマー病の治療、進行遅延または予防方法である。かかる活性阻害剤またはかかる抗体をそのまま、あるいは精製水もしくは生理食塩水のごとき適当な担体とともに投与することができ、その投与経路としては、経静脈的、経脳脊髄腔経路等があるが、経静脈的経路が好ましい。または、その投与量は通常 1 μ g〜l 0 OmgZキログラム体重であるが、投与経路、処置すべき疾病の重さ、患者の状態等により適宜増減される。

上記方法に適した抗体はモノクローナル抗体 9 D 2である。

さらに CLACまたは CLAC— P自体の産生を抑制することによりアルッハイマ一病の治療効果を発揮する物質も本発明に包含される。かかる物質のスクリ一二ング方法としては、例えば、次の方法がある。

CLACもしくは CLAC— Pの産生の低下を介して治療効果を発揮する物質については、被検物質を含有する培地中で、本発明の形質転換細胞を培養し、 C L ACの産生ないし分泌の阻害を検出又は定量することにより行いうる。該スクリーニング法にぉレ、ては、 CLACに特異的な抗体を用いるウェスタンブロッティング法などの方法を適宜利用して、被検物質による細胞からの C L A Cの産生ないし分、の変化を検出し、定量することができる。

具体的には、例えば、本発明の形質転換細胞をマルチプレートに蒔き、血清を含む DMEM培地で細胞がコンフルェントになるまで培養する。その細胞を無血清培地（0. 5%ゥシ血清アルブミン含有 DMEM) で洗浄後、同培地に被検物質を添加し、一定時間（例えば 24時間）培養する。その培養上清もしくはマルチプレート上に付着した細胞外マトリッタスに含まれる CL AC量をウェスタンブロッテイング法による定量し、被検物質非添加群に対する CL AC量の割合おょぴ CL ACの産生 ·分泌低下作用を惹起する濃度で被検物質の C L AC産生 · 分泌阻害作用を評価する。このようなスクリーニング方法も本発明に包含される。さらに、上記のような、 CLAC— Pおよび CLACと相互作用し、生理学的に有用なペプチド性分子については、例えば、以下の工程（ィ）、（口）または (ハ）のいずれかを含む方法により取得 ·同定することができる。

(ィ）ヒト CLAC— Pと DNA結合蛋白の融合遺伝子、ならびにヒト脳由来 cDNAに転写活性ィ匕蛋白を融合させた遺伝子ライブラリーを、 two hybrid法を利用して酵母細胞に発現し、陽性反応を示す遺伝子を取得する。

(口）ヒト CLAC— Pあるいは CLACリコンビナント蛋白を結合したカラムにヒト脳抽出物を通し、結合した蛋白を溶出してアミノ酸配列解析を^う。

(ハ）ヒト CLAC— P抗体を固定したカラムにヒト脳抽出物を通し、ヒト CL A C—Pあるいは CLACとともにカラムに結合する蛋白を溶出してアミノ酸配列解析を行う。

かかるペプチド性分子もまた、アルツハイマー病の治療、進行遅延または予防に有用である。したがって、力かるペプチド性分子ならびにその取得'同定方法も、本発明に包含される。

CLAC— P及び CLACの分泌、産生に影響を与える蛋白も、本発明の治療、進行遅延または予防方法において有用である。かかる蛋白は、例えば、 CLAC —Pを発現する培養細胞にヒト cDNAライプラリーを発現し、限界希釈法によつて単一 cDNAを発現したクローンを選択し、その細胞クローンから分泌される CLAC量の変化をウェスタンブロット法により評価した後、導入された遺伝子を同定することにより同定することができる。したがって、かかる蛋白ならびにその同定方法も本発明に包含される。

本発明のさらにもう 1つの態様は、本発明の CLAC DNAまたは CLAC -P DN Aのいずれかを人為的に染色体中に導入する力あるいはいずれかを染色体から欠損させたトランスジエニック動物である。トランスジエニック動物とは、遺伝子組み換えにより外来遺伝子を導入された動物であって、通常の交雑育種では不可能な形質を持つた動物をいう。トランスジエニック動物の製造方法は、当業者によく知られており、一般的には、導入したい DN Aを含む遺伝子をクローン化し、発現を所望する時期に所望臓器で特異的に発現するプロモーターを該遺伝子に連結し、ヒれを受精卵に導入し、ついで、借腹に移植する工程を含む方法により製造される。発現調節配列を適宜選択あるいは変異させることにより、本発明の CLACまたは CLAC— Pの発現を人為的に調節されたトランスジエニック動物を得ることができる。また、正常な遺伝子の機能を破壌したノックァゥト動物もトランスジエニック動物に含まれる。かかるトランスジエニック動物は、本発明の CLACまたは C LAC— Pの機能または発現調節、それらが関与する疾病の発症機構の解明、医薬品の開発 ·スクリーニング等に利用価値がある。好ましくは、かかるトランスジエニック動物はヒト以外のものである。ヒト以外の C LAC— Pおよび CLACをクローニングすることもできる。例えば、所望の動物の cDNAライブラリーを用いて、本質的には上記の方法と同様にして遺伝子増幅を行うことにより、所望の動物の CLACTPおよび CLA C遺伝子をクローエングし、そのアミノ酸配列を推定することができる（マウスの C L A C _ P遺伝子のクローニングについては本明細書の実施例 7参照）。実施例

以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例 1 ：モノクローナル抗体 9D2の作製

(1)老人斑アミロイドの部分精製

アルツハイマー脳大脳皮質より灰白質を切り出し、 1 Mしょ糖 (関東ィ匕学)を含んだ TSI液 [50 mM Tris (Gibco BRL), 150 mM NaCl (関東化学）， 0.5 mM DIFP (和光純薬）， 0.5 mM PMSF (Boehringer Mannheim), 1 mM EGTA (和光純薬）， 1 μ / l アンチパイン（Sigma) , 1 μ g/ l ロイぺプチン（和光純薬)， 1 μ g/ml ぺプスタチン（Sigma) , 1 ^ g/ml TLCK (Sigma) ]中でポッターエルべジェム型ホモジナイザー (Matsushita Electric Industrial)でホモジナイズし、遠心機 (日立ェ機）で 4 °C、 30分、 260, 000 x gで遠心分離した。

得られた沈殿物を 1Mしょ糖を加えた TSI液に懸濁し、しょ糖密度勾配法 [Am. J.

Pathol. , 148 1517 (1996) ]により分画して 1. 5 Μしょ糖 /2. 2 Μしょ糖界面を集めた。

得られた界面を DNase I (和光純薬）で 37 °C、 3時間処理し 1 °/。 Triton-X 100 及び、 5 M尿素 (nacalai tesque)を含んだ TSI液中に懸濁させ、毛細血管を除去し [J. Neurochem. , 58 1953 (1992) ]、遠心機で 4 °C、 30分、 100, 000 x gで遠心分離した。

得られた沈殿物を老人斑アミロイド画分とする。

(2)抗体の作製

老人斑アミロイド画分を 1 % SDSを含んだ 50 mM Tris液中に懸濁し、フロイント完全アジュパント（Sigma)でェマルジヨン化し、マウス（BALB- C、 7週齢、ォス）足底に免疫した [J. Exp. Med. , 169 1693 (1989) ]。

免疫後 25日目に下肢リンパ節を摘出し RPMI培地中でリンパ球を取り出し、電気融合法により、マウス骨髄腫由来のミエ口一マ細胞 PAI株と融合させ、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマを HAT培地に懸濁し、 96穴プレート（Greiner) に分注し 10日間培養した。

(3)モノクローナル抗体のスクリーユング

ハイプリドーマを培養したゥエルから培養上清を回収し、老人斑アミロイド画分を塗沫したスメァ標本上で、アミロイドを陽性に染色する抗体をを選択した [Am. J. Pathol. , 148 1517 (1996) ]。

2 8 8個のハイプリドーマクローンから、最も陽性の結果を示したモノクロ一ナル抗体 9D2を選択した。モノクローナル抗体のアイソタイプは Mouse antibody isotype kit (アマシャム）により IgGlと確認した。 9D2抗体を最も多く産生するハイブリドーマをハイブリドーマ 9 D 2と命名して、茨城県つくば巿東 1丁目 1 番 3号の経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に寄託し、 2 0 01年 1月 30日に受託番号 FERM BP— 7437を付与された。

偶然にも、力かる抗体は、性質等が明らかにされていない、アルツハイマー病脳由来の未知蛋白（本発明において、 C L AC— Pおよび CLACと命名）に特異的に強く結合することがわかった。特に、モノクローナル抗体 9 D 2は、 CL AC— Pおよび CLACへの特異的結合が強力である。さらにモノクロ一ナノレ抗体 9 D 2は、 C L A C— Pのァミノ酸番号 1 13の G 1 uがピログ/レタミン酸化されたペプチド断片 Xaa Ala Pro Ser Glu Cys (配列番号： 29) と強く反応するという特徴を有する。

これらの未知蛋白遺伝子（CLAC— Pおよび CLAC) のクローニング、配列決定等について実施例 2で説明する。実施例 2 ：ヒト CLAC— P遺伝子のクローニング

アルツハイマー脳大脳皮質より 20 gの灰白質を切り出し、 TSI液中でポッターエルべジェム型ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、遠心機で 4 °C、 20分、 260, 000 xgで遠心分離した。得られた沈殿物を 1 Mしょ糖を含んだ TSI液中でホモジナイザーを用いてホモジナイズし、遠心機で 4 °C、 20分、 260,000 xgで遠心分離した。得られた沈殿物を 0.32 Mのしよ糖を含んだ TSI液中に懸濁し、毛細血管を除去し、遠心機で 4°C、 20分、 260,000 xgで遠心分離した。得られた沈殿物を 2。/。の SDS (nacalai tesque社）を含んだ TSI液中でホモジナイザーを用いてホモジナイズし、遠心機で 4 。じ、 20分、 260,000 xgで遠心分離した。得られた沈殿物を 70 %ギ酸 (和光純薬社）中で超音波破辟機 (Branson社）により破砕し、遠心機で 4°C、 20分、 260,000 xgで遠心分離した。得られた上清を凍結乾燥機 (Tomy社）で乾固後 6 Mグァニジン塩酸 (nacalai tesque社)水溶液に懸濁し、遠心機で 4°C、 20分、 260,000 xgで遠心分離した。得られた上清に対し 100分の 1倍容の 70 %ギ酸カロ ¾ϋ相 HPLC (high - performance liquid chromatography, Hewlett- Pachard 社）で、 Aquapore RP300カラム（2.1 X 30 mm, Applied Biosystems社）を用いて分画した [J. Biol. Chem. , 267 17047 (1992)]。

モノクローナル抗体 9D2に対し陽性を示す画分を SDS- PAGE (SDS

polyacrylamide gel electrophoresis^)を用レヽ 7こィムノプロツァイング法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 2025 (1997) ]により選んだところ、ァセトニトリル (和光純薬)濃度約 30%の画分であった。 9D2陽性画分を凍結乾燥機で乾固後 6 Mグァ-ジン塩酸水溶液に懸濁して還元カルボキシメチルイ匕法 [J. Biol. Chem. , 238 622 (1963) ]で還元し、ゲル濾過 HPLCで TSKgel SuperSW3000力ラム（4. 6 X 600 mm, Tosoh)を用いて分画した。ィムノブロッテイング法で 9D2抗体が強く反応した分子量約 35 kDaの画分をリシルエンドぺプチダーゼである API (achromobacter lyticus protease I)ま 7こは、 Asp- N (Boehringer Mannheim社)で消化 [J. Biol. Chem. , 267 17047 (1992) ]した。消化物を逆相 HPLCで Superspher Select Bカラム（2. 1 X 125 mm, Merck社）を用いて分画しぺプチドマップを得た。

ペプチドマップで得られた画分を T0F (time of flight)型質量分析機（Bruker-

Franzen Analytik社)及びアミノ酸配列解析機 (Applied Biosystems社）で解析し [J. Biol. Chem. , 274 7368 (1999) ]、質量分析機による分子量と一致する部分アミノ酸配列を選び出した。

以下に得られた配列をァミノ末端側から示す。

消化酵素 APIにより

He Asn His Gly Phe Leu Ser Ala Asp Gin Gin Leu lie Lys (配列番号： 8 ) Gly Glu Gin Gly Asp Gin Gly Hyp Arg Met Val Phe Pro Lys (配列番号： 9 ) が得られた（Hypはヒドロキシプロリンを意味する）。

消化酵素 Asp- Nにより

Asp Gin Gly Pro Arg Met Val Phe Pro Lys lie Asn His Gly Phe Leu Ser Ala

(配列番号： 1 0 )

が得られた。

結果、 9D2抗原の部分アミノ酸として、次の 28アミノ酸が得られた。

Gly Glu Gin Gly Asp Gin Gly Pro Arg Met Val Phe Pro Lys lie Asn His Gly Phe Leu Ser Ala Asp Gin Gin Leu lie Lys (配列番号： 1 1 )

この配列をもとに縮重プライマーを用いた PCR (polymerase chain reaction)法による 9D2抗原部分 cDNAクローユングを行った。用いたプライマーは次のように設計した。

5，一 aar ggi gar car ggi gay car ggi cc_3， (酉己列 ¾· ： 1 2 ) 5，- age tgc tgr tci gcd gav agr aab cc - 3， (酉己列番号： 1 3)

5，一 age tgc tgr tci gcr ctv agr aab cc一 3' (酉 G歹 (J番号： 1

ただし iはイノシン、 rは aもしくは gを、 yは cもしくは tを、 dは a, g もしくは tを、 Vは a， gもしくは cを表す。

Human brain Marathon-Ready cDNA Library (CLONTECH社）をとして LA

Taq (宝酒造)により PCR機 (宝酒造)で 95 °C、 30秒間熱変性、 58 °C、 30秒、間ァニーリング、 72 °C、 1分間 DNA合成を 40回繰り返し、 80bpの cDNAフラグメントを増幅させた。 pBluescript II KS+(Stratagene社）にこのフラグメントをサブクロー二ングし、 Thermo sequencing kit (アマシャム社）により自動シーケンサー（Li- COR 社)で塩基配列を確認した。

その配列を元に PCRを用いた RACE (rapid amplification of cDNA ends)法を繰り返すことにより CLAC— Pの ORF (オープンリーディングフレーム）を含む CLAC-P DNAのクローユングに成功した。用いた特異プライマーを以下に示す。

5， - tag ctg ctg gtc ggc get gag gaa gcc a - 3， (酉己歹' J番号： 1 ο)

5'-aag ggg gaa cag ggg gac cag ggg ccg a - 3, (配歹 'J番号 : 1 6)

5， - tcg gaa aca cca tec tcg gcc cct ggt c - 3， (酉己列番号 : 1 7)

5'- cat ggc ttc etc age gcc gac cag cag c - 3' (酉己列番号： 1 8)

5， - cgc cgc ctg att aag ggt gac caa gga c - 3 (gti列番号： 1 9)

5'-aag agg gcc acc tgg gga cac agg gaa a - 3， (酉己列番号 : 20)

5， - acc ctt ggg gcc gtt etc tec age gtc t - 3， (si歹 (i番号 : 21)

5，- cac ctt gtt etc cag gtt etc cct tag g - 3' (酉 5歹 (J番号： 22)

5， - gaa tac cag gac cta agg gag aac ctg g - 3， (酉己列番号： 23)

5， - ggc ccc aag ggt gac aca ggc gaa aag g - 3， (酉 ΰ列畨"^： 2 ノ

5， - ccc tec ttt ccc tgc gtg ctt ctt cag c - 3' (酉己歹 'J番"^： 25；

5' - tct egg ctt cgc ttc cca ccc tct aca c - 3， (酉己列番号 : 26)

5， - gga gat tct gga atg ccg ggt cca cag g - 3， (酉己列备： 2 / )

5， ctt cta tea tag gcc cac cag gcc cac c一 3， (酉 ti列畨"^ : 28)

Human brain Marathon-Ready cDNA Library (CL0NTECH社）を翻として LA Taq (宝酒造)により PCR機 (宝酒造)で 95 °C、 30秒間熱変性、 58 °C、 1分間ァニーリング、 72 °C、 5分間 DNA合成を 35回繰り返し、その後反応液にさらに nested プライマーを加え 95 °C、 30秒間熱変性 60。C、 1分間アニーリング、 72 °C、 5分間 DNA合成を 30回繰り返してフラグメントを増幅させた。得られたフラグメントを pBluescript II KS+にサブクローユングし、 Thermo sequencing kitにより自動シーケンサーで塩基配列を確認した。

その結果新規蛋白 CL AC— Pの cDNAを得ることに成功した（配列番号： 1) 。これより ORFのアミノ酸配列を推定した（配列番号： 2) 。これらの DNA配列おょぴァミノ酸配列を図 1に示す。

CLAC— Pの cDNAは全長 654アミノ酸をコードする ORFを含む（図

1、配列番号： 1および配列番号： 2参照）。 CL AC— Pはァミノ末端を細胞質側、カルボキシ末端を細胞外側に持つタイプ II型の新規な 1回膜貫通蛋白であり、細胞外領域に 3回のコラーゲン様 Gly- Xa_ai- Xaa₂ (Gはグリシンを意味し、 Xaa Xaa^ 任意のアミノ酸を意味する）繰り返し配列を有している。 RT— P CR法を用いて各種ヒト組織における mRNA発現を調べたところ、脳と精巣に特異的な発現が認められた。予想されるアミノ酸配列をもとに作製したぺプチド抗体は、アルツハイマー病の脳において老人斑を染色し、得られた cDNAに由来する蛋白断片が老人斑ァミロイドに蓄積していることが確認された。実施例 3 ：ヒト C L AC— P恒常発現形質転換細胞を用いた C L AC— Pのアミロイドペプチド受容体機能の検定

CL AC— P遺伝子を組み込んだプラスミド DNAを以下のようにして調製した。すなわち、 CLAC— Pの 5' UTR領域の一 40位に Hindlllで切断され、

3， UTR領域の最初の停止コドンより + 100位の所に BamHIで切断されうる配列になるように CL AC— P遺伝子を改良し、 CMVプロモーターを持つ pcDNA3.1/Hygro (+) (invitrogen) のマルチクローユングサイト中の Hindlll -

BamHI領域に組み込んだ。

HEK 293細胞を 6ゥエルプレート（Nunc) に 3. 0〜5. 0 x 10⁵個/ ゥェルの密度で蒔き、 24時間培養した。次に、 1ゥエルあたり溶液 A： 1 g プラスミド DNAZl 00 μ \ Op t i—MEM (Gibco BRL) 、溶液 B ： 1 0 μ 1 LipofectAMINE (Gibco BRL) /1 0 0 1 O p t i—MEMを作製し、溶液 Aと溶液 Bを混合し、室温で 30分間ィンキュベーションした後に、この混合物に 800 1の O p t i—MEMを加えて l m lとした（DNA-リボフエタタミン複合体）。細胞から DMEMを取り除き、 O p t i— MEMで 1回洗浄後、各ゥエルに 1 m 1の DNA -リボフヱクタミン複合体を加え 6時間培養した。続レ、て 1 m lの 20% FB Sを含んだ DMEMを加え、さらに 24時間培養し、 DME Mに培地を交換後さらに 24時間培養した。次に各ゥエルの細胞を 1 0 c mディッシュに蒔き直し、ヒグロマイシン（和光純薬） 1 3 3 g/m 1を含む DME M中で選択培養した。 1 0〜1 4日間選択培養を行った後、増殖してきた細胞を、目的のプラスミドを導入したポリクローン細胞株として取得した。ポリクローン細胞株はさらに限界希釈法によりクローニングし、モノクローン細胞株を 1 5株取得した。取得したモノクローン細胞株は CLAC— P蛋白特異抗体を用レヽたィムノブロッテイングにより発現を解析し、最も発現の高い 3株を選んで、 9D 2 一 1、 9 D 2— 2、 9D 2— 1 1と命名し、以後の実験に使用した。なお、 HE

K 29 3細胞ヒト C L A C— P恒常発現形質転換細胞 9 D 2— 1株は茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に寄託され、 200 1年 1月 3 0日に受託番号 FERM B P— 74 3 8を与えられた。

予めポリ一 L一リジン（Sigma、 1 0 μ g/m 1 ) をコートしたカバーグラス

(Matsunami) を 1 0 c mディッシュ上に並べ、その上に細胞を蒔き、培養、遺伝子導入後、カバーグラスを回収した。カバーグラスを PB S液で 2回洗浄後、 4%パラホルムアルデヒド（TAAB) を含んだ PB S液で室温、 3 0分間固定した。さらに P B S液で 2回洗浄後、 0. 5% Triton X-100、 0. 3% B SA (ゥシ血清アルブミン、 Sigma) を含んだ P B S液で室温、 3 0分間パーメァビリゼーシヨン（permeabilization) とブロッキングを行った。溶液を取り除き、 0. 3% B S Aを含んだ P B S液で抗体を 1 00 0倍に希釈して加え、室温で 2時間反応させた。 PB S液で 3回洗浄、さらに 0. 3% 83 を含んだ？8 S液で二次抗体として F I TC結合抗ゥサギ抗体（Jackson) を希釈して加え、遮光し室温で 1時間反応させた。 PBS液で 3回洗浄後、封入剤を用いて封入し、蛍光顕微鏡（AX- 80、ォリンパス製）で観察した。図 2左パネル（A) に示すように、〇〇ー？細胞膜系、ことに小胞体、ゴルジ装置ならぴに細胞表面膜に分布していた。

10 cmディッシュで培養したモノクローン CL AC— P恒常発現 HEK 29

3株を TS液で洗浄後、 TS I液中でセルスクレイパーを用いて回収した。細胞をポリトロンホモジナイザー（日立ェ機）で破碎後、遠心機で 4°C、 1, 000 x g、 7分間遠心分離した。その上清を回収し、遠心機で 4°C、 2, O O Ox g, 30分間遠心分離した。この沈殿物を膜性画分とした。上清をさらに超遠心機で 4°C、 10, 0000 x g、 60分間遠心分離した。この沈殿物をマイクロソーム画分として、上清を細胞質画分として回収し、解析に用いた。図 2右パネル (B) に示すように、 CL AC— P発現細胞の膜性画分に特異的に 80キロダルトンの全長 CLAC— P蛋白の発現が検出された。

ヒト CLAC— P恒常発現 HEK293細胞と pcDNA3.1 べクターのみを恒常発現した対照細胞を 10cm dishで培養し、コンフルェントになったところで予め 37°Cで

60分インキュベートした 10 μΜ Aj8 (l- 42) (Bachem) を加え、インキュベートした。一定時間後、 A3を含む培養上清を除き、 PBSで 3回洗浄した後、細胞をスクレイパーで回収し、微量遠心機 (T0MY) で 7，000rpm、 5分遠心して細胞を沈降させ、サンプルバッファーを加えて超音波処理して可溶化し、 BCA protein assay kit (Piearce) を用いて蛋白量を定量した。

上記の細胞抽出液を各サンプルが一定蛋白量となるように調整し、最終濃度 1% となるよう 2-メルカプトエタノール（nacalai tesque) を加え、 10分間熱処理した。 15%の Tris-Tricine ゲルを用いた SDS-PAGEにより蛋白を分離し、 3時間 150mA の条件で、ニトロセルロースメンブレン（Hybond- ECL、 Amersham) に転写した。転写したメンプレンは PBS中で 10分間熱処理を加えた後、 1%スキムミルク

(Difco) -PBSで室温で 30分間ブロッキングし、同様のプッロッキング液で希釈した各種抗体と室温 2時間又は 4°C一晩反応させた。 PBS-T (Tween20を 0.1%含む PBS) で 10分間 3回の洗浄を行い、続いて同様のブロッキング液で希釈した二次抗体（抗-マウスまたは抗-ゥサギ I_g、セィヨウヮサビペルォキシダーゼ結合全抗体（Araersham) ) と室温で 1時間反応させた。 PBS - Tで 10分間 3回の洗浄後、 ECL kit (Amersham)を用いて Hyperfilm- ECL (Amersham) に感光させ、 A ]3の結合を検出した。ヒト CLAC— Pを発現した細胞は、細胞由来蛋白 1 mg当たり 30 ng の A ]3 (1-42)を結合したが、ベクターのみを発現した細胞では 6 ngであった。即ち A ]3 (1-42)の結合は 5倍に增カ卩しており、細胞表面に発現したヒト CLAC— Pが A を結合する受容体として働くことが示された。実施例 4 ：ヒトァルツハイマー脳ァミロイド由来 CLACのァミノ酸配列解析ならびに 9 D 2抗体との反応性

実施例 2の（1) の方法により精製したヒトアルツハイマー脳由来の CLAC をアミノ酸配列解析に供すると、ァミノ末端がブロックされており、解読不能であった。そこで CLAC— Pのアミノ酸番号 1 13〜1 18に相当し、第 1 13 ァミノ酸の G 1 uをピログルタミン酸（X a a ) に置換したべプチド Xaa Ala Pro Ser Glu Cys (配列番号： 29) を合成し、 Cy sを介して KLHと結合した後、これを抗原として抗体を作製した（以下、該抗体を Py r oGと称する）。 Py r oG抗体は、文献の記載（Neuron, 14457 (1995)) から推定できるように、合成ぺプチドの KLH結合側と反対側のァミノ末端切断端構造を特異的に認識した。すなわち、 Py r oG抗体は実施例 3の方法で培養細胞に発現させて取得した全長リコンビナント CLAC— P蛋白とは SDS— PAGEを用いたィムノブロッティング法にて反応しなかったが、 Xaa Ala Pro Ser Glu Cysペプチドをマイクロウェルプレートに固着させ（EMB0 J.， 11， 2895 (1992)の方法に準じて行った）、 P y r o G抗体を 1次抗体として間接ペルォキシダーゼ法で酵素抗体反応法（EL I SA) を施行すると陽性反応を呈し、また上記方法でヒトアルッハイマー脳より得た C L A Cとィムノブロッテイング法で陽性に反応した。さらに 9 D 2抗体とアルツハイマー脳由来 CLACのィムノブ口ッティング法による陽性反応、およびァルツハイマー脳組織標本の老人斑との免疫組織化学による染色性は、'上記べプチド Xaa Ala Pro Ser Glu Cysを予め 9 D 2抗体に混和し、抗体活性を吸収することにより（Neuron, 13, 45 (1994)の方法に準じて行つた）消失した。これらの事実から、アルツハイマー脳アミロイド由来 CLACは C LAC— Pの第 113アミノ酸より始まり、当該第 1 13アミノ酸はピロダルタミン酸化されていること、 9 D 2抗体はかかる修飾を受けた C L AC蛋白を認識することが示された。実施例 5 : CLACとアミロイド（Α]3) の試験管內結合実験

CL ACと Α の試験管内結合実験については We b s t e rらの方法（Am. J. P a t h o l . , 150， 1531 (1997) ) に従った。

実施例 3で得られたヒト CLAC— P恒常発現形質転換細胞（9D2— 1株）を 10 % F B S、ヒグロマイシンを含む DMEM培地中で 4日間選択培養し、その培養上清を回収した。予め 37 °Cで 1日放置しておいた 0. lmgZmlの合成 A j81— 42 (B a c h em) を 50 /i 1ずつ 96穴マイクロウェルプレート（Gr e i n e r) に固着させ、デシケーターで乾固させた。続いてブロッキング液として 1%ゼラチン（和光純薬）を含んだ PBS— Tで 1時間ブロッキング後、 PBS— Tで 10分間 3回の洗浄を行い、回収した培養上清をアプライした。同様に実施例 3で用いた対照 HEK293細胞の培養上清もアプライした。 1時間室温で反応後 P B S— Tで 10分間 5回洗浄し、同様のプロッキング液で 5000倍に希釈した抗 C L AC抗体と室温で 1時間反応させた。 P B S— Tで 10分間 5回洗浄後、同様のプロッキング液で 5000倍に希釈した二次抗体 (抗ーゥサギ I g、セィヨウヮサビペルォキシダーゼ結合全抗体（Ame r s h a m) ) と室温で 1時間反応させた。 P B S— Tで 10分間 5回洗浄後、 TM B 発色薬 (K i r k e g a r d&P e r r yLa b o r a t o r i e s) で発色させた。

10回の試行の結果、 CLACを分泌している CLAC— P恒常発現形質転換細胞の培養上清は分泌していない対照 HEK 293細胞の培養上清よりも約 50 0倍強く発色し、有意に（p<0. 0001) CLACは A ;3と試験管内で結合していることが示された。実施例 6 ： CLACが A /3の凝集に及ぼす影響の検討

実施例 3で得られたヒト CLAC— P恒常発現形質転換細胞（902— 1株）をヒグロマイシン、 10 % F B Sを含む DMEM培地中で 3日間選択培養し、セミコンフルェントな状態から F B Sを含まない DMEM培地中で 4日間培養し、その培養上清を回収した。培養上清を 2000 X gで遠心後上清を ΰΕΑΕカラム（Wh a tma n) にアプライし、素通り画分をさらにへパリンカラム（Am e r s h a m) にアプライする。 2 M尿素（Nacalai tesque) を含んだ PBS液 ( P B— U液）で力ラムを十分に洗浄後、 1 MN a C 1を含んだ P B— U液で溶出し、溶出液を PBS液に対し透析する。このようにして得られた溶液を粗精製 C L A Cとし、比較として対照 H EK293細胞からも同様にして得ておく。

A βの凝集実験については L e V i n eの定法に従う（Me t h o d s i nE n z ymo l o g y, 309， 274) 。

上記で得られた粗精製 C LACあるいは、 HEK293細胞から得られた溶液を 3. 6 μ Μ合成 A j31 -42 (B a c h em) にそれぞれ 100 1ずつ加え、 0. 22 ^umのフィルターを通した後 37°Cで 1日反応させる。反応液に 3μΜ チオフラビン Τを含んだ 1 OmMグリシン一NaOH溶液（ρΗ=8. 5) を 4 00 μ 1加え、蛍光光度計（H i t a c h i F-2000) で測定する。蛍光は 442nmで励起し、 496 nmの蛍光を測定した。

18回の試行の結果、粗精製 CL ACは、対照 HEK 293細胞から得られた溶液よりも約 60倍を凝集させるという結果が得られ、これは有意（ρ<0· 0001) であった。実施例 7 ：マウス CLAC- P cDNAのクローユング

mouse brain Marathon-Ready cDNA Library (CLONTECH) を錡型とし、 PCR (Polymerase chain reaction) 法によりマウス CLAC— P cDNAのクローニングを行つた。ヒト CLAC- P cDNA配列をもとに以下にあげるプライマーを作製した。

5-GGG ATC AAG GAG CCA CTA AGA TCA TAG A— 3，プライマ、 ®己列番号： 30)

5-GGG CCT ATG ATA GAA GGA CCC TGT GGA C - 3，プライマー： 2 (配列番号： 31) 5-CTA C CGG C CCT CCA CGA AGC CTT- 3，プライマー 3 (配列番号： 32) 5-TCT CCC TTT ATC CCC GGA AGT C- 3，プライマー 4 (配列番号： 33) プライマー 1、 2を用い、 PremixTaq (宝酒造）により PCR機（宝酒造）で 95°C、 45秒間熱変性、 42°C、 45秒間アニーリング、 72°C、 3分間 D A合成を 40サイクル繰り返し、約 330 bpの cDNAフラグメントを増幅させた。次にこの反応液を鎵型として 1:50となるように PremixTaqに加え、プライマー 2、 3を用いて 95°C、 45秒間熱変性、 51°C、 45秒間アニーリング、 72°C、 3分間 DNA合成を 35サイクル繰り返す nested PCRを行つた。その結果約 300 bpのフラグメントを得た。このフラグメントを精製し、 TAクローニング法により pBluescript Π KS+ (Stratagene) にサブクローエングし、自動シーケンサー（Li- _C0R) により塩基配列を確認した（配列番号： 50) 。

また、ヒト CLAC - P cDNAをもとに検索した結果、 GenBankより約 70 bpの adult mouse testis由来のヒト CLAC- Pに相同性の高い配列を見出した（AV264752、配列番号： 5 1) 。この配列と、先に得られた配列をもとに新たに次のプライマーを合成した。

5， - CGA ATA TAT GGC TAA AAT AAG AAC GGT C- 3，プライマー： 5 (配列番号： 34)

5-CTG GCA AAC CGG TGT CTC CTT TCT CTC- 3，プライマー： 6 (配列番号： 35)

5，-ACG GTC AGG GAG GCA CCT TTA GAG TGC A - 3，プライマー： 7 (配列番号： 36)

5-CTC TCC TTT TAC TCC ATT GGC ACC CGG C- 3，プライマー： 8 (配列番号： 3 7)

5， - ACG GTC AGG GAG GAA GCT TTA GAG TGC A- 3' プライマー： 9 (配列番号： 38)

5， - TCA ACT CCG GGG ATC CCT GGA GAG CCT T-3，プライマー： 10 (配列番号： 39) まずプライマー 5、 6を用いて 95°C、 45秒間熱変性、 55°C、 45秒間アニーリング、 72°C、 3分間 DNA合成を 38サイクル繰り返し、この反応液を铸型とし、プライマー 7、 8を用いて同条件にて nested PCRをレ、、約 1200 bpのフラグメントを増幅させた。フラグメントを精製し、ダイプライマーとして合成したプライマー 4を用いて自動シーケンサーにより塩基配列を得た。この塩基配列をもとに次のプライマ一を作製した。

5し GGG ACC ATT TTC TCG AGC ATC TCC CTT T- 3' プライマー： 11 (配列番号： 4 0 )

5， - AM ATG GTC CCA AAG GTG ATA CAG GAG- 3，プライマー： 12 (配列番号： 4 1 ) プライマー 5、 6により PCRを行った反応液を铸型としてプライマー 9、 11を用いて 95°C、 45秒間熱変性、 56°C、 45秒間アニーリング、 72°C、 3分間 DNA合成を 38 サイクル,橾り返した。約 560 bpのフラグメントを増幅させ、 Xho I - HindHI消化した断片として pBluescript Π KS +にサブクローニングし、塩基配列を確認した

(配列番号： 5 2 ) 。また、プライマー 5、 6により PCRを行った反応液を铸型としてプライマー 10、 12を用いて 95°C、 45秒間熱変性、 56°C、 45秒間アニーリング、 72°C、 3分間 DNA合成を 38サイクル繰り返した。約 550 bpのフラグメントを増幅させ、 TAクローニング法により pBluescript Π KS+にサブクローユングし、塩基配列を確認した（配列番号： 5 3 ) 。

次にこれらの酉 B列をもとに RACE (rapid amplification of cDNA ends) 法を行つた。用いたプライマーを以下に示す。

5' - TGC ACT CTA AAG GTG CCT CCC TGA CCG T- 3' プライマー： 13 (配列番号： 4 2 )

5， - GAC CGT TCT TAT TTT AGC CAT ATA TTC G- 3' プライマー： 14 (配列番号： 4 3 )

5 -TGG TAA CCT CCA TGA GGC CTT ACA GAG A— 3，プライマー： 15 (配列番号： 44)

5' - GAG AGA AAG GAG ACA CCG GTT TGC CAG - 3' プライマー： 16 (配列番号： 45)

5-GGC TGG ATG CTC CTT GCC AAT TGG GA- 3，プライマー： 17 (配列番号： 45)

5， - TGG GAC CTG ATG GGT TAC CTA TGC CTG-3，プライマー： 18 (配列番号： 46) mouse brain Marathon-Ready cDNA Library (CLONTECH) を铸型とし、 95°C、 45秒間熱変性、 59°C、 45秒間アニーリング、 72°C、 5分間 DNA合成を繰り返し、その反応液を鍚型に 95°C、 45秒間熱変性、 60°C、 45秒間アニーリング、 72°C、 5分間 DNA合成を繰り返し、 nested PCRを行い、フラグメントを増幅させた。これを TAクローニング法により pBluescript Π KS+にサブクローユングし、塩基配列を確認した（配列番号： 54、 55、 56) 。

これらの DNA断片の配列からマウス CLAC-P cDNA配列を決定した（図 3および配列番号： 48) 。この c D N A配列より 0RFのァミノ酸配列を推定した（図 4およぴ配列番号： 49) 。マウス CLAC- P cDNAは全長 666ァミノ酸をコードしており、ヒト CLAC - P cDNAとの相同性は約 83%、アミノ酸では約 90%であった。分子構造は基本的にヒト CLAC - Pと同様で、 Π型の一回膜貫通蛋白であり、細胞外領域に 3力所のコラーゲン様繰り返し配列を有していた。また、コラーゲン様配列内に alternative splicingを受ける配列も見出した（図 4、配列番号： 49中の下線部）。産業上の利用の可能性

本発明において得られた新規コラーゲン様蛋白 CLACは、アルツハイマー病患者脳老人斑ァミロイドに蓄積し、その主成分であるアミロイドの凝集を促進し、 CLACの前駆体である CLAC— Ρは膜貫通蛋白として細胞膜表面に分布し、；3アミロイドを細胞表面に結合する受容体として作用するため、ァルツハイマー病の進行に関与しており、その予防、進行遅延、治療に用いることができる。配列表フリーテキスト

SEQ ID NO: 5

Xaa is hydroxyproline.

SEQ ID NO: 9

Xaa is hydroxyproline.

SEQ ID NO: 12

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC-P cDNA fragment, r is g or a. i is inosine. y is t or c.

SEQ ID NO: 13

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC- P cDNA fragment, r is g or a. i is inosine. v is a, g or c. d is a, g or t.

SEQ ID NO: 14

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC - P cDNA fragment. r is g or a. i is inosine. v is a, g or c.

SEQ ID NO: 15

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC- P c纖 fragment. SEQ ID NO: 16

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC- P cDNA fragment. SEQ ID NO: 17

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC- P cDNA fragment. SEQ ID NO: 18

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC - P cDNA fragment. SEQ ID NO: 19

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC - P cDNA fragment.

SEQ ID NO: 20

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC - P cDNA fragment. SEQ ID NO: 21

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC - P cDNA fragment. SEQ ID NO: 22

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC-P cDNA fragment. SEQ ID NO: 23 ，

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC-P cDNA fragment. SEQ ID NO: 24

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC-P cDNA fragment. SEQ ID NO: 25

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC-P cDNA fragment. SEQ ID NO: 26

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC-P cDNA fragment.

SEQ ID NO: 27

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC-P cDNA fragment. SEQ ID NO: 28

Designed oligonucleotide primer to amplify human CLAC-P cDNA fragment. SEQ ID NO: 29

Xaa is pyroglutamic acid.

SEQ ID NO: 30

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC-P DNA fragment. SEQ ID NO: 31

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC-P DNA fragment.

SEQ ID NO: 32

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC-P DNA fragment. SEQ ID NO: 33

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC-P DNA fragment. SEQ ID NO: 34

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC-P DNA fragment. SEQ ID NO: 35

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC-P DNA fragment. SEQ ID NO: 36 Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC-P DNA fragment. SEQ ID NO: 37

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC—P DNA fragment. SEQ ID NO: 38

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC—P DNA fragment.

SEQ ID NO: 39

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC-P DNA fragment. SEQ ID NO: 40

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC-P DNA fragment. SEQ ID NO: 41

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC-P DNA fragment. SEQ ID NO: 42

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC-P DNA fragment. SEQ ID NO: 43

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC—P DNA fragment.

SEQ ID NO: 44

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC—P DNA fragment. SEQ ID NO: 45

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC-P DNA fragment. SEQ ID NO: 46

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC-P DNA fragment. SEQ ID NO: 47

Designed oligonucleotide primer to amplify mouse CLAC—P DNA fragment.

Claims

請求の範囲

I . 配列表の配列番号： 1に記載のヌクレオチド 868からヌクレオチド 2493までの塩基配列からなる CL AC DNA。

2. 配列表の配列番号： 2に記載のアミノ酸 113からアミノ酸 654までのアミノ酸配列からなる CLAC。

3. 請求項 2に記載の蛋白において 1もしくは複数のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、かつ以下の特性 (a) および（b) を有する蛋白をコードする DNA：

(a) アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積する、

(b) A 凝集を促進する機能を有する。

4. 請求項 1記載の D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーシヨンし、かつ以下の特个生 (a) および（b) を有する蛋白をコードする DNA：

(a) アルツハイマー病老人斑アミロイド成分中に蓄積する、

(b) A 凝集を促進する機能を有する。

5. 請求項 3または 4のいずれかに記載の DNAがコードする蛋白。

6. 配列表の配列番号： 1に記載のヌクレオチド 532からヌクレオチド 2493までの塩基配列からなる CL AC— P DNA。

7. 配列表の配列番号： 2に記載のァミノ酸配列からなる CLAC— P。

8. 請求項 7に記載の CLAC— Pにおいて 1もしくは複数のアミノ酸が揷入、欠失もしくは置換されており、カ^)細胞表面において A /3受容体として機能する蛋白をコードする DNA。

9. 請求項 6記載の D NAとストリンジ工ントな条件下でハイブリダイゼーシヨンし、かつ細胞表面において A ]3受容体として機能する蛋白をコードする DN A。

10. 請求項 8または 9のいずれかに記載の DNAがコードする蛋白。

I I. 配列表の配列番号： 2のァミノ酸配列のァミノ酸番号 141〜 146または 589〜 597において 1もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失もしくは置換されている請求項 10記載の蛋白。

12. 請求項 1、 3または 4のいずれかに記載の DN Aを含有する発現べクタ

13. 請求項 12に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。

14. 請求項 13に記載の形質転換体を、請求項 12記載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法。

15. 請求項 6、 8または 9のいずれかに記載の DN Aを含有する発現べクタ

16. 請求項 15に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。

17. 請求項 16記載の形質転換体を、請求項 15記載の発現ベクターの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法。

18. 経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に受託番号 FE RM BP— 7438として寄託されている形質転換体。

19. 請求項 18に記載の形質転換体中に含まれる CLAC— P遺伝子。

20. 請求項 18に記載の形質転換体を、その中に含まれる CLAC— P遺伝子を含有するべクターが発現可能な条件下で培養することを特徴とする、組み換え蛋白の製造方法。

21. 請求項 2または 5に記載の蛋白に特異的に結合する抗体。

22. モノクローナノレ抗体 9 D 2である請求項 21記載の抗体。

23. 請求項 2または 5に記載の蛋白を用いることを特徴とする、 CLACの活性阻害剤のスクリ一二ング方法。

24. 請求項 23記載のスクリーニング方法により得られる、 CLACの活性阻害剤。

25. 請求項 21記載の抗体を用いることを特徴とする CLACの検出方法。

26. 請求項 21記載の抗体または請求項 24記載の CLACの活性阻害剤を用いることを特徴とする、アルツハイマー病の治療、進行遅延または予防方法。

27. 該抗体がモノクローナル抗体 9 D 2である請求項 25記載の方法。

28. 該抗体がモノクローナル抗体 9 D 2である請求項 26記載の方法。

29. モノクローナル抗体 9 D 2を用いる CLACの精製方法。

30. 請求項 7、 10または 11に記載の蛋白に特異的に結合する抗体。

31. モノクローナル抗体 9 D 2である請求項 30記載の抗体。

32. 請求項 7、 10または 11に記載の蛋白を用いることを特徴とする、 C

LAC-Pの活性阻害剤のスクリ一ユング方法。

33. 請求項 32記載のスクリーニング方法により得られる、じ1^ じー卩の活性阻害剤。

34. 請求項 30記載の抗体を用いることを特徴とする CLAC— Pの検出方法。

35. 請求項 30記載の抗体または請求項 33記載の C L A C— Pの活性阻害剤を用いることを特徴とする、アルツハイマー病の治療、進行遅延または予防方法。

36. 該抗体がモノク口ーナル抗体 9 D 2である請求項 34記載の方法。

37. 該抗体がモノクローナル抗体 9 D 2である請求項 35記載の方法。

38. モノクローナル抗体 9D2を用いる CLAC— Pの精製方法。

39. 検知可能に標識されたモノクローナル抗体 9 D 2を構成成分とするアルッハイマー病診断用キット。

40. 請求項 1、 3、 4、 6、 8または 9のいずれかに記載 DN Aを人為的に染色体中に導入するか、あるいは染色体から欠損させたトランスジヱニック動物。