WO2001055722A1 - Detection d'une cible biologique - Google Patents

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WO2001055722A1
WO2001055722A1 PCT/JP2001/000436 JP0100436W WO0155722A1 WO 2001055722 A1 WO2001055722 A1 WO 2001055722A1 JP 0100436 W JP0100436 W JP 0100436W WO 0155722 A1 WO0155722 A1 WO 0155722A1
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micelle
hydrophilic
analyte
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PCT/JP2001/000436
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Kazunori Kataoka
Yukio Nagasaki
Yuka Hori
Masayoshi Akiyama
Original Assignee
Kazunori Kataoka
Yukio Nagasaki
Yuka Hori
Masayoshi Akiyama
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/5432—Liposomes or microcapsules

Definitions

  • the present invention relates to a composition for detecting an analyte present in a biological sample and a method for detecting the analyte.
  • the present invention utilizes polymer micelles and biological specific binding. Background art
  • the present inventors have explored the provision of various parent-hydrophobic block polymers and their characterization and use. From the study of the stability of the polymer micelles formed by the block polymer as a part of such research, the change in the structure of individual polymer micelles due to aggregation of polymer micelles under certain conditions ( (Which ultimately leads to micelle disintegration) can be quickly and sensitively tracked by certain compounds placed in polymeric micelles. More specifically, when a plurality of polymer micelles specifically aggregate or bind via an analyte in a sample, the presence of the analyte is indirectly determined through a structural change in the polymer micelle. It can be detected. The present invention has been completed based on the above findings.
  • composition comprising a parent-hydrophobic block polymer for detecting an analyte present in a biological sample
  • the analyte can be one of the members forming a specific binding pair non-covalently,
  • the block polymer forms a core-shell type polymer micelle, and another member capable of forming a specific binding pair with the analyte in the hydrophilic block forming the shell of the polymer micelle.
  • Another member capable of forming a specific binding pair with the analyte in the hydrophilic block forming the shell of the polymer micelle. Are covalently bonded, and a compound whose physical properties change in accordance with a change in the structure of the micelle is arranged in a core portion of the polymer micelle.
  • a composition is provided.
  • a sample suspected of containing an analyte suspected of containing an analyte.
  • a core-shell type polymeric micelle formed from a hydrophilic-hydrophobic block polymer, wherein one member capable of forming a specific binding pair with the analyte is covalently bonded to the hydrophilic block.
  • step (B) Incubating the mixture obtained in the step (A), and forming a structure of the polymer micelle through formation of a complex between the analyte and a member capable of forming a specific binding pair in the polymer micelle.
  • the process of making a change
  • (C) a step of relating the change in physical properties caused by the structural change of the polymer micelle to the abundance of the analyte
  • Also provided is a method for detecting an analyte in an aqueous solution comprising:
  • FIG. 1 shows the fluorescence spectra before (a) and after (b) contacting a polymeric micelle (a micelle of biotin-PEG_PLA-pyrene) with avidin.
  • the hydrophilic-hydrophobic block polymer that can be used in the present invention may be any hydrophilic-hydrophobic block polymer as long as it forms high molecular micelles in an aqueous medium and meets the purpose of the present invention.
  • the aqueous medium include pure water, a buffered aqueous solution, an aqueous solution containing an inorganic salt, and an aqueous solution containing a water-miscible organic solvent such as ethanol, acetate, and dimethylformamide.
  • the polymer micelle referred to in the present invention is a so-called copolymer micelle, which forms a core (mainly composed of a hydrophobic segment) and a single shell (mainly composed of a hydrophilic segment) in an aqueous medium.
  • a block polymer for the purpose of the present invention is at least individually and stably present in an aqueous medium, but two or more polymeric micelles indirectly interact with each other via an analyte. When aggregated, it means a polymer micelle capable of causing a structural change in at least one aggregated polymer micelle.
  • Such a hydrophilic-hydrophobic block polymer can be selected from those known in the art, and particularly includes those which have been studied for the carrier of poorly water-soluble drugs. .
  • the block polymer has a structure including a linear hydrophilic polymer block (or segment) and a hydrophobic polymer block (or segment), respectively.
  • the hydrophilic polymer block is preferably, but not limited to, a polymer block which essentially contains an uncharged segment such as polyethylene oxide or polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, or polyvinyl pyrrolidone. Among them, those composed of only polyethylene oxide segments are preferred.
  • hydrophobic polymer blocks include poly (lactide), poly ( ⁇ -force prolacton), poly ((5-valerolactone), poly (abtyrolactone), poly (yS-benzylapartate), Preferred are those which essentially comprise poly ( ⁇ -benzyl glutamate), poly (grease), poly (leucine), poly (methacrylic acid ester), poly (acrylic acid ester), etc.
  • the polymer is composed of only poly (lactide) segments.
  • the term “contains essentially” means that at least 95% of each block is a polymer segment as exemplified. A place where birds occupy ⁇ means.
  • a block polymer comprising any combination may be used as long as it meets the purpose of the present invention. It is a functional block polymer.
  • the term “poly” used to indicate each segment of a block polymer also means “oligo” as long as a block polymer for the purpose of the present invention can be formed. It is understood to include.
  • the block polymer as described above is, for example, a block polymer described in WO 93/16687, US Pat. No. 5,410,01.6, JP-A-6-107565, W096 33233, W096Z32434, or WO97Z06202, or Use it with further qualification.
  • Z is a residue having various functional groups
  • R is an alkyl group
  • m and n are not limited, but independently take an integer of 5 to 2,000.
  • the size of the block polymer is such that polymer micelles can be formed in an aqueous medium. It is preferable to use a modified block polymer described in WO 96/33233, WO 96/32434 or WO 97/06202.
  • such a block polymer is used in a state of a core-shell type polymer micelle, and a member capable of forming a specific binding pair with an analyte is formed on a hydrophilic block forming a shell. Has a covalent bond (to the subject).
  • one member of the specific binding pair exists in the shell region or surface of the polymer micelle.
  • a specific binding pair consists of at least two members that can form a biochemical complex or conjugate due to hydrogen bonds, hydrophobic bonds, or other non-covalent bonds, and can bind specifically. Any pair of members may be used. Specific examples of such pairs include, but are not limited to, an antigen-antibody, a biotin-avidin, a sugar-lectin, a hormone or a signal transducer, a corresponding receptor, an enzyme-a substrate or an inhibitor.
  • the block polymer used in the present invention has any one of the members forming the pair covalently bonded thereto through the hydrophilic block, particularly, the functional group present in the portion A of the general formula. ing.
  • Such covalent bonds can be formed in a manner known per se, for example, by condensation, addition substitution, If necessary, it can be formed utilizing an oxidation or reduction reaction.
  • the analyte present in the biological sample according to the present invention is one of the members capable of forming the above-described specific binding pair, and therefore, any one of the members listed as a specific pair, for example, , An antigen or an antibody, a nucleic acid or a fragment thereof, and the like.
  • the biological sample may be a natural sample or an artificial sample as long as the sample may contain the above-described analyte.
  • natural sources include blood, urine, sweat, saliva, and diluents or concentrates thereof
  • artificial sources include cultures of animals, organisms or microbial cells, Examples include crushed cells, synthetic mixtures of peptides or nucleic acids, and the like.
  • Such a biological sample can be an aqueous solution buffered with a suitable buffer, if necessary.
  • a compound whose physical properties change according to a structural change of the micelle is disposed in a core portion (or region).
  • Physical properties can be absorption and emission intensities and other energies that are affected by changes in the environment surrounding the compound, such as changes in the electronic state of the molecule, structural changes, and interactions with the medium.
  • Typical examples of the compound whose physical properties change include a fluorescent compound and a polycyclic aromatic compound such as pyrene or a derivative thereof, which can form an excimer in a state where two or more molecules are adjacent to each other.
  • Compounds can be mentioned. Fluorescent compounds are commonly used in the field of immunoassay, and any lipophilic compounds can be used.
  • these compounds are distributed in the core portion of a polymer micelle by coexisting in a treatment solution for forming a polymer micelle from the above-described block polymer. Can be placed.
  • two or more polymer micelles aggregate through the analyte from the state in which the above-mentioned compound is concentrated or adjacent to the polymer micelle core.
  • the physical properties referred to in the present invention also include electron spin resonance (ESR) absorption intensity, 13 C nuclear magnetic resonance (NMR) absorption intensity, and the like.
  • ESR electron spin resonance
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • examples of substances exhibiting ESR absorption include substances that can serve as probes used in spin labeling. Specifically, it forms stable nitroxide radicals, such as 2,2,6,6-tetramethylpiperidine N-oxide derivative and 4,4-dimethyloxazolidine N-year-old derivative. Can be mentioned. Normally, when these probes are present in the core of a polymer micelle, little ESR signal is emitted, but a signal is observed as micelles collapse. On the other hand, NMR probes (eg, 13 C-enriched acetyl groups) also exhibit similar absorption behavior to ESR probes.
  • a compound whose physical properties change in accordance with the structural change of the polymer micelle is covalently bonded to, for example, the hydrophobic segment of the block polymer via a functional group present in the Z portion of the above general formula. Then, by forming a polymer micelle from such a block polymer, a portion derived from the compound is arranged in a state of being covalently bonded to a core portion of the micelle. It can also be done.
  • Such a covalent bond binds, via a functional group present in the Z moiety, the above compound having a functional group capable of being covalently bonded to the functional group or a compound into which such a functional group is introduced as necessary. It can be formed by a reaction known per se.
  • the polymer micelle as described above can be formed, for example, by a method known per se such as the method described in WO 96Z33233 and WO 96/33234.
  • the polymer micelle thus formed can be used as a composition of the present invention as a desalted, deorganized solvent or a buffered aqueous solution, if necessary.
  • Such compositions generally consist of nano-sized micelles and are transparent, resulting in a reduced background.
  • a method for detecting an analyte in a biological sample using the above composition is provided.
  • a biological sample suspected of containing a subject is mixed with the above composition, and the mixture is incubated. This mixing can be performed in a cuvette microtiter well attached to the analyzer equipped with an absorbance or fluorescence intensity measurement function.
  • an analyte in the sample that can bind to one of the members capable of forming a specific binding pair present in the shell portion of the polymer micelle, two or more polymer micelles will be formed.
  • An agglutination reaction occurs indirectly via the analyte, and as a result, individual micelles undergo structural changes.
  • a structural change for example, a fluorescent compound or a polycyclic aromatic compound such as pyrene, an ESR probe, an NMR probe, etc.
  • Changes in physical properties such as an increase in fluorescence intensity or loss of excimer emission, generation of an ESR signal, generation of a 13 C-derived signal, etc., can be measured and the measured value can be correlated with the abundance in the sample. .
  • any one of the antigens or antibodies in a biological sample, or any other member capable of forming a biologically specific complex or conjugate Can be detected quickly and with high sensitivity.
  • the solvent was distilled off, the residue was dissolved in benzene, and lyophilized to recover the polymer.
  • the yield after purification was about 85%.
  • the molecular weights of the polyethylene segment (PEG) and borylactide segment (PLA) were 5,000 and 5,500, respectively.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • Acetal_PEGZPLA-Py micelle solution was adjusted to pH2 with hydrochloric acid, and a deprotection reaction was performed for 2.5 hours. Then, the pH was adjusted to 5 using sodium hydroxide and desalted dialysis (dialysis membrane: molecular weight cut-off 12000-1)
  • the collection was performed at 50 ° C for 3 days.
  • Example 2 biotin—PEG—PLA—Py block polymer 100 mg was dissolved in 20 ml of DMAc and dialyzed against 2 L of water for 24 hours (change water after 3, 6, 9 hours).
  • MWCO 12K ⁇ 14K
  • a PBS solution of the same amount of avidin was added to 3 ml of this solution was added a PBS solution of the same amount of avidin, and the fluorescence was measured. As a result, the fluorescence intensity at 4 201101 increased from 1.2 to 6. The excimer emission at 500 nm disappeared.
  • Fig. 1 shows the fluorescence spectrum before and after mixing avidin.
  • Example 4 A micelle was prepared in the same manner as in Example 2 except that galactose-PEG-PLA-Py was used. To 3 ml of this solution, a 10-fold molar amount of a lectin protein (castor bean) PBS solution was added. When the fluorescence was measured, the fluorescence intensity at 420 ⁇ m increased from 1.2 to 6.3. Excimer emission at 500 nm disappeared.
  • a lectin protein castor bean
  • a member of any one of a specific binding pair capable of forming a biochemical complex or a conjugation (for example, an antibody or an antigen, a polynucleotide or an oligonucleotide having a sequence complementary thereto) ) Can be detected in samples containing them with high sensitivity.
  • a specific binding pair capable of forming a biochemical complex or a conjugation for example, an antibody or an antigen, a polynucleotide or an oligonucleotide having a sequence complementary thereto.

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Description

明 細 書
生物学的な被検体の検出
技術分野
本発明は生物学的試料中に存在する被検体を検出するための組成物お よび該被検体の検出方法に関する。
本発明では、 高分子ミセルおよび生物学的な特異的結合が利用される。 背景技術
例えば、 血清学的診断の分野では、 間接凝集反応 （または受動凝集反 応） を利用した試験方法が存在しており、 ここでは、 一般的に、 特異的 抗体または特異的抗原の検出のために、 抗体または抗原のキャリア一と してベン トナイ ト、 ポリスチレンラテツクスまたは赤血球もしくは細菌 細胞等が使用されている。 これらのうちポリスチレンラテツクスは均一 な大きさの粒子を作成しやすく、 粒子自体に抗原性がない等の理由で間 接凝集反応に広く利用されている。 このポリスチレンラテックスはタン パク質等を強く吸着するという点で抗原または抗体を固定するのに優れ ているものの、 逆に、 反応系に混在する各種成分を非特異的に吸着して 誤った結果を生じる可能性もある。 さらに、 このような系を利用して正 確な検出を可能にするには、 試料中の抗体または抗原とラテツクス粒子 上の対応する抗原または抗体との免疫複合体の形成を介するラテツクス 凝集反応にある程度の時間をかける必要もある。 また、 このような系で は、 粒子の凝集体を検出対象とするため、 測定方法によってはバックグ ランドが高くなることもある。
したがって、 生物学的試料中の被検体の検出に際し、 上述の間接凝集 反応系を初めとする各種測定系に利用でき、 しかも、 上記ポリスチレン ラテツクスの使用に伴う短 が存在しないか、 あるいは解消された検出 手段に対するニーズは依然として存在するであろう。
発明の開示
本発明者らは、 各種の親-疎水性ブロックポリマーの提供と、 それら の特徴付けおよび使用について検討してきた。 このような研究の一環と しての該ブロックポリマーの形成する高分子ミセルの安定性の検討から、 ある一定条件下での高分子ミセルの凝集に伴う個別の高分子ミセルの構 造の変化 （究極的にはミセルの崩壊に至る） が高分子ミセル中に配置し た一定の化合物により、 迅速かつ感度よく追跡できることを見出した。 さらに敷衍すれば、 試料中の被検体を介して複数の高分子ミセルどう しが特異的に凝集または結合する場合には、 高分子ミセルの構造変化を 通して、 被検体の存在を間接的に検出できることになる。 本発明は、 以 上のような知見に基づき完成されたものである。
したがって、 本発明によれば、 生物学的試料中に存在する被検体を検 出するための親-疎水性ブロックポリマーを含む組成物であって、
該被検体が非共有結合的に特異的結合対を形成する構成員の 1員とな りうるものであり、
該ブロックポリマーがコア-シェル型高分子ミセルを形成しており、 そして該高分子ミセルのシェルを形成する親水性プロックに被検体と特 異的結合対を形成しうる構成員の他の 1員が共有結合していて、 かつ該 高分子ミセルのコア部分に該ミセルの構造変化に応じて物理的特性が変 化する化合物が配置されている、
ことを特徴とする組成物が提供される。
さらに別の態様の本発明として、 （A ) 被検体を含有することが疑わ れる水性溶液と、 親-疎水性プロックポリマーから形成されたコア-シェ ル型高分子ミセルであって、 親水性プロックに被検体と特異的結合対を 形成しうる 1員が共有結合しており、 そしてコア部分に該ミセルの構造 変化に応じて物理的特性が変化する化合物が配置されている高分子ミセ ルとを混合する工程、
( B ) 工程 （A ) で得られる混合物をィンキュベー 卜し、 該高分子ミ セルにおける特異的結合対を形成しうる 1員と被検体との複合体の形成 を介して該高分子ミセルの構造変化をもたらす工程、
( C ) 高分子ミセルの構造変化により生じる物理的特性の変化を被検 体の存在量と関連づける工程
を含んでなる水性溶液中の被検体の検出方法も提供される。
図面の簡単な説明
図 1は、 高分子ミセル （ピオチン一 P E G _ P L A -ピレンのミセル） とアビジンを接触させる前 （a ) および後 （b ) における蛍光スぺク 卜 ルを示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明で使用できる親一疎水性ブロ ッ クポリマーは、 水性媒体中で高 分子ミセルを形成し、 本発明の目的に沿うものであれば、 いかなる親- 疎水性ブロックポリマーであってもよい。 水性媒体としては、 純水、 緩 衝化された水溶液、 無機塩含有水溶液、 エタノール、 アセ ト ン、 ジメチ ルホルムァミ ド等の水混和性有機溶媒を含有する水溶液等を挙げること ができる。 本発明にいう高分子ミセルは、 所謂、 共重合体ミセルであつ て、 水性媒体中でコア （主として、 疎水セグメ ントからなる） 一シェル (主として、 親水性セグメ ン トからなる） を形成するようにポリマー分 が会合して形成した分子集合体を意味する。 また、 本発明の目的に沿う ブロックポリマーとは、 少なく とも、 個別には水性媒体中で安定に存在 しているが、 2個以上の高分子ミセルどう しが、 被検体を介して間接的 に凝集した場合、 凝集した高分子ミセルの最低 1個に構造変化が生じう るような高分子ミセルを形成できるものを意味する。
このような親一疎水性プロックポリマ一としては、 当該技術分野で周 知のものから選ぶことができ、 特に、 水に対して難溶性の薬物のキヤリ ヤー用に検討されてきたものが挙げられる。 該ブロックポリマーは、 具 体的には、 それぞれ線状の親水性ポリマーブロック （またはセグメ ント） と疎水性ポリマーブロック （またはセグメ ン ト） とを含んでなる構造を 有するものである。
限定されるものでないが、 親水性ポリマーブロックとしては、 ポリエ チレンォキシ ドもしくはポリェチレングリ コール、 ポリ ビニルアルコー ル、 ポリ ビニルピロリ ドン等の非荷電性のセグメ ン トを本質的に含んで なるものが好ましく、 これらのうち特に、 ポリエチレンォキシ ドセグメ ントのみからなるものが好ましい。 他方、 疎水性ポリマーブロックとし ては、 ポリ （ラクチ ド） 、 ポリ （ ε —力プロラク トン） 、 ポリ （ (5—バ レロラク トン） 、 ポリ （ァーブチロラク トン） 、 ポリ （yS—ベンジルァ スパラテー ト） 、 ポリ （ァ—ベンジルグル夕メー ト） 、 ポリ （ノくリ） 、 ポリ （ロイシン） 、 ポリ （メタクリル酸エステル） 、 ポリ （アク リル酸 エステル） 等を本質的に含んでなるものが好ましい。 これらのうち、 限 定されるものでないが、 特にポリ （ラクチド） セグメ ントのみからなる ものが好ましい。 本質的に含んでなるとは、 各ブロックの少なく とも 9 5 %が例示されているようなポリマーセグメ ン卜が占めるような場^を 意味する。 このような親水性プロックと疎水性プロックとの組み合せと しては、 いずれの組み合せを含んでなるブロックポリマーであっても、 本発明の目的に沿うものである限り、 本発明にいう親-疎水性プロック ポリマーである。 なお、 本明細書で、 ブロックポリマーの各セグメ ント を表示する際に使用している 「ポリ」 の語は、 本発明の目的に沿うブロッ クポリマーを形成しうる限り、 「オリゴ」 の意味をも包含するものと理 解されている。
以上のようなプロックポリマーは、 例えば、 WO 93/ 16687、 米国特許第 5， 410, 01.6号、 特開平 6— 107565号、 W096 33233、 W096Z32434、 または WO97Z06202に 記載されているブロックポリマーをそのまま、 あるいはさらに修飾して、 使用する。 特に、 一般式
A— 6CH2CH20 — ^Y— Z
n m (式中、 Aは各種官能基を有する残基であり、 Yは
-CH-0C— CH-0- ，または 一 C"fCH2)"0
II II 4
0 0 であり、 Zは各種官能基を有する残基であり、 Rはアルキル基であり、 そして mおよび nは限定されるものでないが、 独立して、 5〜2， 00 0の整数をとり、 当該プロックポリマーが水性媒体中で高分子ミセルを 形成しうる大きさである。 ） で表される、 上記 WO 96/33233. WO 96/32434または WO 97/06202に記載のプロックポ リマーを修飾して使用するのが好ましい。 修飾は、 例えば、 上記 Aまた は Z部分に存在しうる官能基、 アルデヒ ド基 （一 CHO) 、 アミノ基 （一 NH2) 、 メルカプト基 （― SH) 、 水酸基 （一 OH) 、 カルボキシル 基 （_COOH) 、 ビニル基 （- CH=CH2) を介して行うことがで きる。
本発明に従えば、 このようなブロックポリマーはコア-シェル型高分 子ミセルの状態で使用され、 そしてシェルを形成する親水性プロックに 被検体と特異的結合対を形成しうる構成員の他の 1員 （被検体に対して） が共有結合している。 こう して、 高分子ミセルのシェル領域または表面 に特異的結合対の 1員が存在することになる。
特異的結合対は、 水素結合、 疎水結合、 その他の非共有結合によって、 生化学的な複合体やコンジユゲー ト等を形成しうる少なく とも 2種の構 成員からなり、 特異的に結合しうるものであればいかなる構成員からな る対であってもよい。 限定されるものでないが、 このような対の具体的 なものとしては、 抗原一抗体、 ピオチン一アビジン、 糖ーレクチン、 ホ ルモンもしくはシグナル伝達物質一対応する受容体、 酵素一その基質も しくは阻害剤、 一定のヌクレオチド配列からなる （DNAもしくは RN A) 断片ー該配列とス ト リ ンジェン卜な条件下 （例えば、 H ame r s および H i g g i n s、 編、 Nu c l e i c Ac i d Hy b r i d i s a t i o n, I R L, P r e s s, Ox f o r d, U. K. 参照） でハイプリ ッ ドを形成する DNAもしくは RNA断片、 等を挙げること ができる。 したがって、 本発明で使用されるブロックポリマーは、 それ らの親水性ブロック、 特に、 上記一般式の A部分に存在する官能基を介 して、 上記対を形成するいずれかの一員が共有結合されている。 このよ うな共有結合は、 それ自体既知の方法、 例えば縮合、 付加置換、 さらに 必要により酸化もしくは還元反応を利用して形成することができる。 本発明にいう生物学的試料中に存在する被検体は、 上記の特異的結合 対を形成しうる構成員の 1員であるから、 対の具体的なものとして列挙 したもののいずれか一方、 例えば、 抗原もしくは抗体、 核酸もしくはそ の断片等であることができる。 生物学的試料とは、 上記のような被検体 を含有する可能性のあるものであれば、 天然由来のものまたは人工的な ものであってもよい。 天然由来のものとしては、 血液、 尿、 汗、 唾液、 あるいはこれらの希釈的もしくは濃縮物等を挙げることができ、 人工的 なものとしては、 動物、 生物もしくは微生物細胞の培養物、 これらの細 胞の破砕物、 ペプチドもしくは核酸の合成混合物等を挙げことができる。 このような生物学的試料は、 必要により、 適当な緩衝剤を使用して緩衝 化した水性溶液であることができる。
本発明で使用するコア-シェル型高分子ミセルは、 コア部分 （または 領域） に該ミセルの構造変化に応じて物理的特性が変化する化合物が配 置される。 物理的特性は、 化合物をとりまく環境の変化による、 例えば 分子の電子状態、 構造変化、 媒質との相互作用の変化に影響を受ける吸 光や発光の強度、 その他のエネルギーであることができる。 このような 物理的特性が変化する化合物の代表的なものとしては、 発蛍光化合物や、 2分子以上が隣接した状態でエキシマーを形成することができる、 ピレ ンもしくはその誘導体等の多環芳香族化合物を挙げることができる。 発 蛍光化合物は、 免疫測定法の分野で常用されているものであって、 特に、 脂溶性の高いものであれば、 いずれも使用できる。 これらの化合物は、 一般に、 上述のようなプロックポリマーから高分子ミセルを形成する際 の処理液中に共存させておく ことにより、 高分子ミセルのコァ部分に配 置することができる。 理論に拘束されるものでないが、 高分子ミセルの コア部分に上記のような化合物が濃縮しまたは隣接して存在している状 態から、 2個以上の高分子ミセルが被検体を介して凝集することにより 個々の高分子ミセル構造が変化 （究極的にはミセルの崩壊に至る） し、 上記化合物が分散もしくは放出されると、 蛍光強度の変化ないしはェキ シマ一発光が消失するなどの変化が生じる。
また、 電子スピン共鳴 （E S R) 吸収強度、 13C核磁気共鳴 （NMR) 吸収強度等も、 本発明にいう物理的特性に包含される。 E S R吸収を示 す物質としては、 一般に、 スピン標識法に用いるプローブとなりうるも のを挙げることができる。 具体的には、 安定なニトロキシ ドラジカル類 を形成する、 例えば、 2, 2, 6， 6—テ トラメチルピペリ ジン N— ォキシ ド誘導体、 4, 4ージメチルォキサゾリ ジン N—才キシ ド誘導 体を挙げることができる。 通常、 これらのプローブは、 ポリマーミセル のコア中に存在するときは、 ほとんど E S Rシグナルが発せられないが、 ミセルの崩壊に伴ってシグナルが観測されるようになる。 他方、 NMR プローブ （例えば、 13C濃縮ァセチル基など） も、 E S Rプローブと同 様な吸収挙動を示す。
本発明に従えば、 通常、 このような変化は室温 （18~27°C) で迅 速に生じ、 かつ顕著であるため極めて高感度である。
好ましい態様では、 高分子ミセルの構造変化に応じて物理的特性が変 化する化合物を、 例えば、 上記一般式の Z部分に存在する官能基を介し てブロックポリマーの疎水性セグメ ントに共有結合させておき、 その後、 かようなブロックポリマーから高分子ミセルを形成することにより、 該 ミセルのコア部分に共有結合した状態で該化合物に由来する部分を配置 させることもできる。 このような共有結合は、 Z部分に存在する官能基 を介して、 その官能基と共有結合しうる官能基を有する上記化合物また は、 必要によりそのような官能基を導入した化合物を結合させるそれ自 体既知の反応により形成できる。
以上のような高分子ミセルは、 例えば、 上述の WO 96Z33233、 WO 96/33234. WO 97/06202に記載されている方法を 初めとするそれ自体公知方法によって形成することができる。 こう して 形成された高分子ミセルは、 必要により、 脱塩、 脱有機溶媒または緩衝 化された水溶液として本発明の組成物とすることができる。 このような 組成物は、 一般にナノサイズのミセルからなり、 透明であるので、 バッ クグランドの低下がもたらされる。
本発明によれば、 上記組成物を使用する生物学的試料中の被検体の検 出方法が提供される。 該方法によれば、 まず、 被検体を含有することが 疑われる生物学的試料と上記組成物とを混合し、 インキュベー トする。 この混合は、 吸光ないしは蛍光強度測定機能を設えた分析装置に付属す るキュべッ トゃマイクロタイターのゥエル内で行うことができる。 これ らの装置は当該技術分野で常用されているものを普通の様式でそのまま 使用することができる。
こう して、 試料中に、 高分子ミセルのシェル部分に存在する特異的結 合対を形成しうる構成員の 1員と結合しうる被検体が存在すれば、 2つ 以上の高分子ミセルが被検体を介して間接的に凝集反応を起こし、 その 結果、 個々のミセルは構造変化を起こす。 次に、 このような構造変化に より、 例えば、 高分子ミセルのコア部分に配置した発蛍光化合物ないし はピレン等の多環芳香族化合物、 E S Rプローブ、 NMRプローブの物 理的特性、 例えば蛍光強度の上昇ないしはエキシマー発光の消失、 ES Rシグナルの発生、 13 Cに由来するシグナルの発生等の変化を測定し、 その測定値を試料中の存在量と関連付けることができる。
こう して本発明の被検体の検出方法によれば、 生物学的試料中の抗原 もしくは抗体、 その他の生物学的に特異的な複合体もしくはコンジュゲ - トを形成しうるいずれか一方の構成員を迅速、 かつ高感度で検出する ことができる。
以下、 本発明を、 特定の例を用いて説明するが、 本発明はこれらに限 定されるものでない。
例 1 ： ブロックポリマーの調製
(1) A c e t a 1一 P E G Z P L A— 0 Hの調製
アルゴン下の受器中にテトラヒ ドロフラン （THF) 20m lを加え、 開始剤として 3， 3—ジエトキシー 1一プロパノール （0. lmmo l ) 、 メタル化剤としてカリウムナフタレン （0. 1 mmo 1 ) を用いて 1 0分間メタル化した。 この溶液にエチレンォキシ ド （1 14mmo 1 ) を加え、 室温で 2日間撹拌し、 次いでラクチド （35 mmo 1 ) を加え 室温で 3時間撹拌した後、 開封して反応を停止した。 ポリマーの精製は、 反応液を冷ィソプロパノールに加えてポリマ一 （A c e t a l— PEG /P L A-OH) を沈殿させ、 さらに冷イソプロパノールを用いる再沈 により行った。 溶媒を留去し、 残渣をベンゼンに溶かし、 凍結乾燥を行つ てポリマーを回収した。 精製後の収率は約 85%であった。 ポリエチレ ンセグメ ント （PEG) およびボリラクチ ドセグメ ン ト （P L A) の分 子量は、 それぞれ 5， 000および 5, 500であった。
(2) Ac e t a l -PEG/PLA-Py (ピレン） の調製 ァセトニトリル 1 00m lの入った受器に A c e t a 1 - P E G/P LA— OH (0. 03 mm o 1 ) 、 キヌク リ ジン （ポリマーに対して約 50倍量） 、 ピレン一 1一カルボ二ルシアニド （ポリマーに対して約 1 7倍量） を加え 60°Cで 1時間撹拌した後、 ジメチルスルホキシ ド （D MS O) 透析 （透析膜 ： 分画分子量 1 000、 1日当り一回 DMS Oを 交換） を 4日間、 水透析 （透析膜： 分画分子量 1 200— 1 4000、 蒸留水を 2回交換） を 1曰行い、 凍結乾燥で溶媒を除去し、 TH Fに溶 解させエーテル再沈を行ない沈殿物を吸引濾過により回収し、 ベンゼン に溶かし凍結乾燥し、 標題のポリマーを回収した。 収率は約 70%であつ た。
(3) A c e t a 1 - P E G/P LA- P y ミセルの調製
ジメチルァセトアミ ド （DMA c ) 30m l に A c e t a 1 — P E G /P LA- P yを溶かし、 水透析 （透析膜 ： 分画分子量 1 2000— 1 4000、 蒸留水を、 2、 5および 8時間後に交換） を 1回行った。
(4) B i o t i n— P E GZP LA— P y ミセルの調製
上記 A c e t a l _ P EGZP LA— P y ミセル溶液を塩酸により p H 2に調整し、 2時間半脱保護反応を行った。 その後、 水酸化ナトリウ ムを用いて、 p H 5とし脱塩透析 （透析膜 ： 分画分子量 1 2000— 1
4000、 蒸留水を 2時間後に交換） を 1日行った。 回収したアルデヒ ド化したミセル濃度を 2 m gZm 1 に調整した後、 ピオチン一ヒ ドラジ ド （ポリマーに対して 1. 5倍量） を加え、 50°Cで 5時間反応させ、 水透析 （透析膜 ： 分画分子量 1 000、 蒸留水を 1日当り一回交換） を
50°Cで 3日間行い回収した。
例 2 ： b i o t i n— P E G— P L A— P yブロックポリマー 1 00 mgを 20m lの DMAcに溶解させ、 2 Lの水に対して 24時間透析 した （3、 6、 9時間後に水を交換） 。 （MWCO= 12K〜14K) このようにして得られた表面にビォチンを有し、 コアにピレンを有する P E G— P L Αコア一シェルミセルをリ ン酸緩衝液 （p H=7. 4、 ィ オン強度 0. 2M) で 0. 1 mgZm 1に調製した。 この溶液 3m 1に 同サイ ト量のアビジンの PB S溶液を加え、 蛍光を測定したところ、 4 201101の蛍光強度が1. 2から 6に上昇した。 また、 500 nmのェ キシマー発光が消失した。 アビジンの混合前後における蛍光スぺク トル を図 1に示す。
例 3 ： 例 2と同様にして調製した b i o t i n - P EG-P LA- P yブロックポリマ一ミセル溶液 3 m 1に 30〃 1の抗ビォチン抗体 （5 0mM、 PBS p H= 7. 4 ) を加え、 蛍光を測定したところ、 42 0 11111の蛍光強度が1. 2から 6. 5に上昇した。 また、 500 nmの エキシマー発光が消失した。
例 4 ： ガラク トースー P E G— P L A— P y用いる以外は例 2と同様 にしてミセルを調製し、 この溶液 3 m 1に 10倍モル量のレクチン夕ン パク （ヒマ豆） の P B S溶液を加え、 蛍光を測定したところ、 420 η mの蛍光強度が 1. 2から 6. 3に上昇した。 また、 500 nmのェキ シマー発光が消失した。
産業上の利用分野
本発明によれば、 生化学的な複合体またはコンジユゲー トを形成しう る特異的結合対のいずれか一方の一員 （例えば、 抗体もしくは抗原、 ポ リヌクレオチドもしくはそれに相補な配列をもつォリゴヌクレオチド） を、 それらを含む試料中で感度よく検出できる組成物および検出方法が 提供される。 したがって、 本発明は、 診断薬または検査薬の製造業等で 利用できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 生物学的試料中に存在する被検体を検出するための親一疎水性ブ ロックポリマーを含む組成物であつて、
該被検体が非共有結合的に特異的結合対を形成する構成員の 1員とな りうるものであり、
該ブロックポリマーがコア—シェル型高分子ミセルを形成しており、 そして該高分子ミセルのシェルを形成する親水性プロックに被検体と特 異的結合対を形成しうる構成員の他の 1員が共有結合していて、 かつ該 高分子ミセルのコア部分に該ミセルの構造変化に応じて物理的特性が変 化する化合物が配置されている、
ことを特徴とする組成物。
2 . 親一疎水性プロックポリマーがポリェチレンセグメ ン 卜からなる 親水性プロックを有する請求項 1記載の組成物。
3 . 親一疎水性プロックポリマーがポリラクチドセグメ ントからなる 疎水性プロックを有する請求項 1記載の組成物。
4 . 親一疎水性ブロックポリマーがポリェチレンセグメ ン トおよびポ リラクチドセグメ ン トを含んでなる請求項 1記載の組成物。
5 . 高分子ミセルの構造変化に応じて物理的特性が変化する化合物が 親一疎水性ブロックポリマーの疎水性ブロックに共有結合している請求 項 1に記載の組成物。
6 . 高分子ミセルの構造変化に応じて変化する物理的特性が蛍光強度、 電子スピン共鳴吸収強度及び1 3 C核磁気共鳴吸収強度から選ばれる請求 項 1記載の組成物。
7 . 高分子ミセルの構造変化に応じて変化する物理的特性が蛍光強度 である請求項 6記載の組成物。
8 . 特異的結合対が、 抗原と抗体との対、 ピオチンとアビジンとの対、 糖とレクチンとの対、 ホルモンもしくはシグナル伝達物質と対応する受 容体タンパク質との対、 酵素とその基質もしくは阻害剤との対、 および 一定のヌクレオチド配列からなる核酸断片と該配列とス ト リ ンジェント な条件下でハイブッ ドを形成する核酸断片もしくはォリゴヌクレオチド との対からなる群より選ばれる請求項 1に記載の組成物。
9 . 親水性ブロックに共有結合している、 特異的結合対を形成しうる 構成員の他の 1員が、 抗体もしくは抗原またはポリヌクレオチドもしく はォリゴヌクレオチ ドのいずれかである請求項 1記載の組成物。
1 0 . ( A ) 被検体を含有することが疑われる生物学的試料と、 親一疎 水性プロックポリマーから形成されたコア—シェル型高分子ミセルであつ て、 親水性プロックに被検体と特異的結合対を形成しうる 1員が共有結 合しており、 そしてコア部分に該ミセルの構造変化に応じて物理的特性 が変化する化合物が配置されている高分子ミセルとを混合する工程、 ( B ) 工程 （A ) で得られる混合物をィンキュベー 卜し、 該高分子ミセ ルにおける特異的結合対を形成しうる 1員と被検体との複合体の形成を 介して該高分子ミセルの構造変化をもたらす工程、
( C ) 高分子ミセルの構造変化により生じる物理的特性の変化を被検 体の存在量と関連づける工程
を含んでなる生物学的試料中の被検体の検出方法。
1 1 . 親一疎水性プロックポリマーがポリエチレンセグメ ントを親水性 プロックとして、 そしてボリラクチドセグメ ン ト疎水性プロックとして 含んでなる請求項 1 0記載の検出方法。
12. 高分子ミセルの構造変化に応じて変化する物理的特性が蛍光強度、 電子スピン共鳴吸収強度及び13 C核磁気共鳴吸収強度から選ばれる請求 項 11記載の検出方法。
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