WO2001040463A1

WO2001040463A1 - Nouvelle proteine endoplasmique a reticulum localise, remedes contenant cette proteine destines a des maladies associees a une anomalie glycoproteique, adn codant cette proteine et remedes genetiques contenant cet adn destines au traitement de maladies associees a une anomalie glycoproteique

Info

Publication number: WO2001040463A1
Application number: PCT/JP2000/008529
Authority: WO
Inventors: Hirohumi Kai; Kazuhisa Yoshitake
Original assignee: Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.
Priority date: 1999-12-03
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2001-06-07
Also published as: US20030158092A1; EP1251171A4; CA2394016A1; EP1251171A1; AU1557001A; CN1413251A; JP2001161363A

Description

明細書

新規な小胞体局在夕ンパク質およびそれを含む糖夕ンパク質異常症治療薬、並びに該タンパク質をコードする D N Aおよびそれを含む糖タンパク質異常症治療のための遺伝子治療薬

技術分野

本発明は、糖タンパク質産生制御活性を有する新規な小胞体局在タンパク質 (以下、 E L P (endoplasmic localization protein ) または E L Pタンパク質という）、およびそれをコードする遺伝子に関する。

背景技術

小胞体（endoplasmic reticulum , 以下 E Rともいう）は、新生された分泌性或いは膜結合性糖タンパク質のフォールディングゃアセンブリ一の場となる重要な細胞小器官である。小胞体において、この新生糖タンパク質のフォールディングゃアセンブリ一の機能を担っているタンパク質としてカルネキシン（calnexi n) 、カルレティキュリン（calreticulin) 等が現在までに知られている。

カルネキシンは、粗面小胞体に存在する Ca²⁺結合 I型膜タンパク質であり、ヌクレオチド配列から予想される分子量 65 kDa (573アミノ酸）を有し、基質結合ドメインを含む N末端側の大部分を E R内腔に向け、 C末端 89ァミノ酸の細胞質ドメインを有し、そしてこの C末端細胞質ドメインにリン酸化部位と E R局在化シグナル（RKPRRE) を含むことを特徴とする。 Wada， I . ら， J. Biol . Chem. ， 26 6， 29， 19599— 19610 , 1991を参照。

一方、カルレティキュリンも E Rに存在する Ca²⁺結合可溶性タンパク質であり、分子量 46 kDa (400アミノ酸）、 C末端に E R局在化シグナル (KDEL)を有することを特徴とするカルネキシンの可溶性ホモログである。 Michalak, M.ら， Exp.Ce 11 Res. , 197, 91-99， 1991を参照。

カルネキシンおよびカルレティキュリンは、糖タンパク質のァスパラギン（N-) 結合型糖鎖のモノグルコシル化糖鎖を認識し、フォールディング中間体と結合し、それらを E Rにとどめるが、成熟タンパク質とは結合しないことが明らかにされた。これらのタンパク質は、 E R内で分子シャペロンとして機能する。

これまでの報告から、カルネキシンおよびカルレティキュリンが、 cystic fib rosis (嚢胞性線維症リ transmembrane conductance regulator ( 以下 C F T R という）、ニコチン作動性アセチルコリン受容体、ひ 1-アンチ卜リブシン、ひ卜アンチキモトリブシン、ひ-フエトプロテイン、補体 3 (C3)、アポ - 100、トランスフェリン、 LDL 受容体、 MHCクラス I、 MHCクラス II、インフルエンザへマクルチニン、 T細胞受容体、インテグリン、グルコーストランスポー夕一（Glut 1 ) 等、様々な分泌性或いは膜結合性糖タンパク質のフォールディングゃァセンブリーの制御に関与し、またフォールディング異常を生じた異常タンパク質に対しては、その発現、分泌を抑制する機能を有することが明らかになつている。

このようにカルネキシンおよびカルレティキュリンは、糖タンパク質合成の最初の段階において、その品質管理に係わることから、それらの生理的意義の重要性が広く認識されつつある糖鎖関連機能分子である。従って、カルネキシンおよびカルレティキュリンの機能を制御する内在性物質の発見は、嚢胞性線維症（C F )、若年性肺気腫、ティ一サックス病、先天性スクラーゼイソマルターゼ欠乏症、家族性高コレステロール血症（familial hypercholesterolaemia: FH) 等、変異糖タンパク質がカルネキシン或いはカルレティキュリンから乖離せず、 E R に長時間留まることが原因である糖タンパク質異常症を治療する画期的な治療法になり得る。

例えば、嚢胞性線維症患者は、その約 7 0 %が上皮細胞に発現する C F T Rのアミノ酸の 5 0 8番目のフエ二ルァラニン（AF508 CFTR ) の欠損が見られる。このような場合、 AF508CFTRが、フォールデイング異常のためカルネキシンから乖離できず、 E Rに長時間保持されてしまい、最終的に分解されるので、細胞膜上に C F T Rが発現しない。しかしながら、厶 F508CFTR発現細胞をカルネキシン機能を抑制させる条件である 3 0 °C以下の温度条件下で培養すると細胞膜上に△ F508CFTRの発現が認められている。また、化学シャペロンである DMS0の添加によつても同様の現象が認められている。これらの事実から、糖タンパク質異常症の治療法としてカルネキシン或いはカルレティキュリンの機能を低下させることが有効であると示唆される。

発明の開示

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、糖タンパク質産生制御活性を有する新規なタンパク質、および該タンパク質をコードする遺伝子を提供する。本発明者は鋭意研究を行った結果、カルネキシン或いはカルレティキュリンとは異なる、糖タンパク質産生制御活性を有するタンパク質、およびそれをコードする遺伝子を見出した。

すなわち、本発明は以下 1〜5に記載のタンパク質および D N Aを提供する。 1 . 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。

2 . 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列において一若しくは複数のァミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖タンパク質産生制御活性を有するタンパク質。

3 . 配列表の配列番号 2に記載のヌクレオチド配列からなる D N A。

4 . 配列表の配列番号 2に記載のヌクレオチド配列おいて一若しくは複数のヌクレオチドが置換、欠失、または付加されたヌクレオチド配列からなる D N A。

5 . 上記 3または 4に記載の D N Aに対するアンチセンス D N Aまたはその誘導体。

また、本発明は上記 1または 2に記載のタンパク質を含有する糖タンパク質異常症治療薬を提供する。ここで、該タンパク質は、その薬学的に許容される塩の形態であってもよい。

さらに、本発明は上記 3または 4に記載の D N Aを含有する糖タンパク質異常症治療のための遺伝子治療薬を提供する。

なお、本明細書では、特に断りのない限り、 D N A ( c D N Aを含む）は、センス鎖とアンチセンス鎖の二本鎖からなるものを指し、 RN Aは一本鎖からなるものを指し、アンチセンス DN Aは一本鎖からなるものを指す。

図面の簡単な説明

図 1は、正常な C F T Rを発現している 16HBE140-細胞および E L P遺伝子を導入したものを含む各種 CFTE290-細胞の C F T R発現能をパッチクランプ法によつて調べた結果、得られた電流波形を示す。

発明を実施するための最良の形態

以下に、本発明について詳細に説明する。

(E L P夕ンパク質および E L P遺伝子）

本発明者らは、カルネキシンの全長をクローニングするための 5'末端と 3'末端に対応するオリゴヌクレオチドプライマ一を用いて、ヒ卜癌細胞株由来の c DN Aを铸型に PC Rを行い、その産物を、ァガロースゲル電気泳動により分離した。さらに、該 c DN Aを常法に従いクロ一ニングし、 Original TA Cloning Ki tを用いて P CR2.1ベクタ一にクロ一ニングし、得られた DNAのヌクレオチド配列を決定した。さらに、該ヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列を決定した。このアミノ酸配列からなるタンパク質は、前記 DNAを適当なベクタ一に組み込み、発現させることにより得られる。得られたタンパク質は、予想どおり 256のアミノ酸からなり、その見かけ上の分子量は約 38 kDaである。前者のヌクレオチド配列を配列番号 2として、後者のアミノ酸配列を配列番号 1として、配列表にそれそれ示す。以下、配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を「本発明の ELP」、配列番号 2に記載のヌクレオチド配列からなる DNAを「本発明の DNA」という。

本発明の E LPの生理活性を以下のようにして調べた

まず、正常細胞の ELP発現を ELPのアンチセンス DNA処理により抑制した場合における CFTRの細胞膜上での発現に与える影響を検討した。その結果、 CFTRの細胞膜上での発現が減少した。さらに、 E LP遺伝子（すなわち、本発明の DNA) を正常細胞に導入して、過剰発現させた場合における CF TRの細胞膜上の発現に与える影響を検討した。その結果、 CFTRの細胞膜上での発現が顕著に増大した。これらの実験結果より、本発明の E LPは、糖タンパク質産生を制御する機能を有することが実証された。

また、細胞膜上で正常な機能を有する CFTRを発現することができない Δ50

8CFTR遺伝子を発現するヒト気道上皮細胞に、 E LP遺伝子を導入して過剰発現させた場合における CFTRの細胞膜上での発現に与える影響を検討した。その結果、 CFTRの細胞膜上での発現が顕著に増大し、さらに、発現した CFTR は、正常な機能を有するものであった。この結果より、本発明の ELPは、遺伝子の変異が原因で新生された変異糖タンパク質がカルネキシンから乖離せず、 E Rにとどまることが原因である糖タンパク質産生低下を回復させる働きを有することが実証された。

従って、本発明の E LPおよび本発明の DN Aは、嚢胞性線維症、若年性肺気腫、ティーサックス病、先天性スクラ一ゼイソマルターゼ欠乏症、家族性高コレステロール血症等、変異糖タンパク質がカルネキシンから乖離せず ERに長時間とどまることが原因である糖タンパク質異常症の治療に有用であろう。

また、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において一若しくは複数のアミノ酸が置換、または欠失されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、或いは一若しくは複数のアミノ酸が配列番号 1に記載のアミノ酸配列に付加されたアミノ酸配列からなるポリぺプチドにも上記糖タンパク質産生制御活性を有するものがある。これらのポリペプチドは、本発明の E LPの変異体タンパク質であり、前記糖夕ンパク質産生制御活性を有する限り本発明の E LPに包含される。同様に、配列番号 2に記載のヌクレオチド配列において一若しくは複数のヌクレオチドが置換、または欠失されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、或いは一若しくは複数のヌクレオチドが配列番号 2に記載のヌクレオチド配列に付加されたポリヌクレオチドも前記本発明の E L Pの変異体夕ンパク質をコ一ドする限り本発明の DNAに包含される。

通常夕ンパク質の多くには糖鎖が付加され、アミノ酸を一若しくは複数変換することにより糖鎖付加を調節することができる。配列番号 1に記載のァミノ酸配列において、その糖鎖付加を調節されたポリペプチドも上記糖タンパク質産生制御活性を有する限り、本発明の E LPに包含される。また、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも同様に本発明の DNAに包含される。

(遺伝子治療）

本発明の DN Aは、治療用べクタ一に組み込まれ、先に列挙した様々な疾患に対する遺伝子治療に用いることが可能である。

これまでに、糖タンパク異常症の多くに遺伝子治療が試みられている。例えば、嚢胞性線維症の遺伝子治療において、治療用べクタ一として主に用いられるアデノウイルスベクタ一は、理論上約 7 kbまでの遺伝子を組み込ませることが可能ではあるが、正常 CFTR遺伝子自体で 6.5 kbあり、さらにプロモーターを組み込ませるとそれ以上になり非常に大きな薬物遺伝子を組み込ませなければならないことになる。このような大きな薬物遺伝子（ CFTR)を組み込んだアデノウィルスベクタ一を用いた遺伝子治療が数多く実施されているが、いずれも十分な治療効果は得られていないのが現状である。これは正常 C F T R遺伝子をたとえ細胞に導入しても、 50— 80%の CFTR分子が細胞表面に発現することなく分解されてしまうからである。そこで有効量の C FT Rを発現させるためには、これらを考慮する必要がある。また、毒性が少なく、次世代のウィルスべク夕一として期待されているアデノ随伴ウィルスベクタ一も挿入可能な薬物遺伝子のサイズが 4.5 kb以下であること等の制限がある。

以上、遺伝子治療に用いる薬物遺伝子はサイズが小さい程、汎用性 ·有用性が高く、 CFTR遺伝子を直接使用する従来の方法と比較して、本発明の DNAは 0.8 kb と小さいことから、薬物遺伝子としては有用性が高いといえる。

本発明の DN Aを遺伝子治療に用いるためのベクタ一としては、特に限定はされないが、例えば、組換えワクチンウィルス、ポリオウイルス、インフルエンザウィルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、 HIVゥィルス、センダイウィルス等から誘導されるベクターを用いることができる。さらに、上記べクタ一に適当なプロモーターや複製起源、選択マ一力一、 RNA スプライス部位、ポリアデニル化シグナル等の形質発現に関わる配列を導入する

本発明の DNAは、上記ベクターに組み込まれ、通常の手法により遺伝子治療薬として使用できる。すなわち、遺伝子治療を行なう場合には、該組換えウィルスベクターを治療の標的となる細胞に接触させるか、或いはプラスミドベクタ一等の発現ベクターに挿入し、標的細胞に導入すればよい。このとき遺伝子導入は、リン酸カルシウム法、リボソーム法、電気穿孔法、 DEAE—デキストラン法等、公知の方法により行なうことができる。

(アンチセンス DNA)

本発明において、配列番号 2に記載のヌクレオチド配列からなる D N Aに対するアンチセンス DNAも本発明の DNAに包含される。このようなアンチセンス DNAは、本来転写されるべき mRNAに対して相補的なヌクレオチド配列を有し、 mRNAと塩基対を形成することにより、遺伝情報の流れを遮断、遺伝子の発現を抑制し、最終産物である ELPタンパク質の合成を阻害する。本発明において使用できるアンチセンス DN Aは、配列番号 2に記載のヌクレオチド配列の —部と相補的な配列を有し、それがコードするアンチセンス RNAは前記 mRN Aのヌクレオチド酉己列と特異的にハイブリダィズしうるオリゴヌクレオチドである。

本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」なる用語は、天然に存在する塩基および本来のホスホジエステル結合によって結合した糖部分から生成されたオリゴヌクレオチドおよびその類似体を意味する。従って、この用語が含む第 1の群は、天然に存在する種、または天然に存在するサブユニットまたはそれらの同族体から生成された合成種である。ここで、サブユニットとは隣接するサブュニヅ卜に対してホスホジエステル結合または他の結合によって結合した塩基一糖の組み合わせをいう。またオリゴヌクレオチドの第 2の群はその類似体であり、これらは前記オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在していない部分を有する残基を持つ。これらには、安定性を増加するためにリン酸基、糖部分、 3 ' ， 5 ' 末端に化学修飾を施したオリゴヌクレオチドを含む。例えば、ヌクレォチド間のホスホジエステル基の酸素原子の 1つを硫黄に置換したオリゴホスホ口チォェ一ト、 -CH₃に置換したオリゴメチルホスホネート等が挙げられる。また、ホスホジエステル結合は、非イオン性かつ非キラル性である他の構造で置換されていてもよい。さらに、オリゴヌクレオチド類似体としては、修飾された塩基形態、すなわち天然に通常見いだされるもの以外のプリンおよびピリミジンを含む種を用いてもよい。以上のようなォリゴヌクレオチド類も本発明のアンチセンス D N Aと同様な機能を果たす限り、該 D N Aの誘導体として本発明に含まれる。

本発明においては、前記オリゴヌクレオチドがハイブリダィズする mR N Aの標的部分は転写開始部位、翻訳開始部位、イントロンノェキソン結合部位または 5 ' キャップ部位であることが好ましいが、 mR NAの二次構造を考慮して立体障害のない部位が選択されるべきである。

本発明のアンチセンス D N Aは、当業者に公知の合成法、例えば Applied Bios ystem社製の D N A合成装置を用いて固相合成法により製造できる。その誘導体、すなわち他のオリゴヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチォェ一トゃァルキル化誘導体も同様に、製造することができる。

( E L Pの製造および用途）

本発明の E L Pは、配列番号 2に記載の D N A、およびベクターに適当なプロモーターや複製起源、選択マ一力一、 R N Aスプライス部位、ポリアデニル化シグナル等の形質発現に関わる配列を導入した発現べク夕一により、原核細胞または真核細胞の宿主細胞を形質転換し、各宿主細胞において E L P遺伝子を発現させ、製造することが可能である。また、本発明の D N Aに他のタンパク質をコ一ドする遺伝子を連結して、融合タンパク質として発現させ、 E L Pの精製を容易にしたり、発現量を上げたり、また精製工程において適当な処理を施すことにより、産生する E L Pを切り出し、製造することも可能である。

上記の目的のために、発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌が挙げられる。また、真核生物のうち、真核微生物の宿主細胞としては、例えば酵母菌、粘菌が挙げられる。代わりに、 S f 9等の昆虫細胞を宿主細胞として使用してもよい。さらに、動物細胞由来の宿主細胞としては、例えば、 C O S細胞、 C H O細胞が挙げられる。

上記手法により製造された本発明の E L Pは、宿主細胞内または細胞外から分離し、精製することができる。 E L Pの分離、精製には、通常のタンパク質に用いられる分離、精製法を使用することができる。例えば、各種クロマトグラフィ一、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせて使用することができる。以上のようにして得られる本発明の E L Pは、培養による大量生産が可能であり、医薬用途に使用できる。すなわち、カルネキシン或いはカルレティキュリンが関与する、嚢胞性線維症、若年性肺気腫、ティーサックス病、先天性スクラ一ゼイソマル夕一ゼ欠乏症、家族性高コレステロール血症等の糖タンパク質異常症を治療する治療薬となりうる。

本発明の E L Pを治療に用いる際、静脈内投与、患部への局所投与、経口投与等により治療を必要とする患者に投与可能である。投与の目的で、 E L Pに必要ならば、薬学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤、溶解補助剤等の添加物を加えて前記投与に適した製剤とする。さらに、本発明の E L Pは、その薬学的に許容される塩として塩形態で該製剤に含有されてもよい。このような薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シユウ酸、酒石酸等から誘導されるもののようにタンパク質の遊離のァミノ基と形成されるもの、およびナトリウム、力リウム、アンモニゥム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルァミン、トリェチルァミン、 2—ェチルアミノエ夕ノール、ヒスチジン、プロ力イン等から誘導されるもののようにタンパク質の遊離のカルボキシル基と形成されるものが含まれる。

また、本発明の E L Pのアミノ酸配列（配列番号 1 ) のうち、少なくとも 5個の連続するアミノ酸を有するオリゴぺプチドを認識する抗体を作製することも可能である。具体的には、前記オリゴペプチドを抗原として動物に免役し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗体には、ポリクロ一ナルおよびモノクローナル抗体があり、それぞれの作製方法については当業者に公知である。このようにして得られるいずれの抗 E L P抗体も E L I S A等のェンザィムィムノアツセィ、ラジオィムノアツセィ、免疫蛍光法等、各種免疫学的測定法を用いる E L Pの検出および定量、或いは上述の E L Pのカラムによる精製に用いることができる。

(実施例）

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。

(実施例 1 ) 遺伝子のクローニング

カルネキシンの 5'末端および 3'末端のそれそれの 24塩基対（5， -catgatggacatga tgtgacatg-3，および 5， - ctctcttcgtggctttctgtttct -3，）をプライマーとしてヒト癌細藤 549由来の cDNAをテンプレートに用い、 P C Rを行った。得られた P C R 産物を電気泳動でサイズを確認後、クロ一ニング用キット（Original TA Cloning Kit, Invitron社製）を用いてクロ一ニングした。得られた D N Aは、塩基配列解読キッ卜 (Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Kit , Perkin Elmer社製) を用いてそのヌクレオチド配列を決定した。このようにして決定された配列を配列表の配列番号 2に示す。

(実施例 2) E L Pタンパク質の単離、精製および同定上記の cDNAクロ一ニング時の cDNAライブラリーのソースに用いたヒト癌細服 5 49から常法に従い細胞可溶化物を抽出した。これをゲルろ過により粗精製した後、 Ί. 5¾SDS-PAGEで電気泳動によりさらに精製した。その後、 PVDF膜に転写し、フィル夕一上にブロッ卜された E LPをそのまま気相プロティンシ一クェンサ一を用いてそのアミノ酸配列を決定した。この結果は、 cDNA配列より推定されるァミノ酸配列と完全に一致していた。このようにして決定された配列を配列表の配列番号 1に示す。

(実施例 3 ) CF細胞内への E L P遺伝子の導入

1. CF細胞株の培養

AF508CFTRを発現するヒ卜気道上皮細胞の CF細胞株 (CFTE29o-) を、基礎培養液 (MEM(GIBC0社製）、 pH = 7.4) に 10 % fetal bovine serum (HyClone, Lot. N o.AGB 6235)、抗生物質（penicillin G (100 units/ml)、 streptomycin (100 jug /ml))を添加した細胞増殖用培養液で l.OxlO⁵ cells/ml になるまで懸濁し、 Fib ronectin (ナカライテスク社製）でコ一ティングした 35 塵 dish (Falcon社製）に 1 ml/dishずつ分注後、 5% C0₂、 37 °Cの条件下で静置培養した。

2. 遺伝子導入

まず、 ELPcDNAを組み込んだ発現ベクター（pCB6) 2 gと蛍光標識のためのプラスミド (pE-GFP-Nl(CL0NTECH社製）) 2〃gを EtOH沈殿し、無血清培地 (MEM)30 0 /1に溶解した（溶液 A) 。次に、無血清培地 300//1に 10〃1の Transfectam reag ent(Promega社製）を加えた（溶液 B)。溶液 Aと溶液 Bを混和させ、室温で 10分反応させた（溶液 C)。この溶液 Cを上記 1に記載の方法で培養したサブコンフルェントな CF細胞 (CFTE29o-,70 )に添加し、 5% C0₂、 37°Cの条件下で 2時間培養した。培養後、得られた溶液を除去し、培地 (血清を含む）を加え、 5% C0₂、 37°Cの条件下で 2日間培養した。

遺伝子導入した 2日後に培地を除去し、細胞外液（150 inM NaCl、 2.5 mM CaCl

₂、 2.5 mM gCl₂、 10 mM HEPES、 pH: 7.3(NaOHで調整））で 2回、細胞を洗浄し、さらに lmlの前記細胞外液を加えた。次に、培養皿を蛍光顕微鏡 ( IMT-20, BH2-R FL-T3 , OLYMPUS社製）にセッ卜し、 488 nmの励起光を照射し、細胞を観察した。マーカの GFPが発現している緑色蛍光を発する細胞のみを下記のパッチクランプ法で調べた。

(実施例 4 ) パッチクランプ法（ceU-attached mode)

糖夕ンパク質 (CFTR)に対する E L Pの影響を確認するため、正常な C F T Rを発現している 16HBE140-細胞、上記の E L P遺伝子がトランスフエクトされた CFT E29o-細胞、およびコントロールとしてべクタ一（pCB6)のみを導入した、或いは何も導入していない CFTE290-細胞を用い、 FEBS Letters, 455, 215 -218, 1999に記載のパッチクランプ法を実施した。

パッチクランプ法に用いる電極（パッチ電極）（GC120TF-10、 Clark Electromedi cal Instruments社製）は、微小電極作製装置 (P-97、 Sutter Instruments社製）で作製し、マイクロフォージ（MF-830、 NMISIGE社製）でヒートポリシュしたものを用いた。このパッチ電極に矩形波電圧パルスを与えながら、三次元水圧マイクロマニピュレータ一 (MV- 3、 NMISIGE社製）を用いてパッチ電極を細胞表面に軽く接触させ、軽く電圧をかけることによって、ギガオームシール（G Q seal )を形成した。電流の記録および膜電位の保持には、パッチクランプアンプリファー (AX0PA TCH 1D、 Axon Instruments社製）を用いた。得られた電流波形は、オシロスコープ (DS0450、 GOULD社製）で観察、解析した。

正常な C F T Rを発現している 16HBE140-細胞では、 forskolin (フオルスコリン）（10 M)を投与すると、保持電位 40mVにおいて約 0. 4pAの外向きの C F T R 電流が見られたが、 AF508CFTRを発現している CFTE29o-細胞では見られなかつた。次に、 CFTE290-細胞に、 ELP遺伝子が導入されたものは、 forkolindO M)投与後、外向きの C F T R電流が見られた。また、コントロールとして、ベクタ一 ( pCB6 )を細胞内に導入しても C F T R電流は見られなかった。

これらの実験結果より、 E L Pは、 AF508CFTRの細胞膜上での発現を増大させ、発現した AF508CFTRがその機能を正常に有することが確認された。

産業上の利用可能性

カルネキシンおよびカルレティキュリンは、 CFTR等の膜結合性糖タンパク質のフォールディングゃアセンブリの制御、またはその異常に対してそれらタンパク質の発現、分泌を抑制する機能を示す。本発明の E LPは、カルネキシンの機能を制御することによって、変異糖タンパク質がカルネキシンから乖離せず、 ERに長時間留まることを阻害するので、それが原因である糖タンパク質異常症 (例えば、嚢胞性線維症）の治療法に用いることができる。

また、本発明の DNAも、 E LPタンパク質をコードするので、遺伝子治療に応用すると、細胞内で E LPを産生し、上記糖タンパク質異常症の治療に有用でめ^ )ο

Claims

請求の範囲

1 . 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。

2 . 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列において一若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖タンパク質産生制御活性を有するタンパク質。

5 . 請求項 3または 4に記載の D N Aに対するアンチセンス D N A、またはその誘導体。

6 . 請求項 1または 2に記載の夕ンパク質を含有する糖夕ンパク質異常症治療桌。

7 . 請求項 3または 4に記載の D N Aを含有する糖夕ンパク質異常症治療のための遺伝子治療薬。