WO2001038528A1

WO2001038528A1 - Proteine inhibitrice de la proliferation cellulaire, polynucleotide, polynucleotide antisens de ce polynucleotide, inhibiteurs de proliferation cellulaire, diagnostics de cancers, remedes anticancereux et composition pour therapie genique les utilisant

Info

Publication number: WO2001038528A1
Application number: PCT/JP2000/005879
Authority: WO
Inventors: Masayoshi Namba; Toshiya Tsuji
Original assignee: Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 2000-08-30
Publication date: 2001-05-31
Also published as: US20060275263A1; EP1234877B1; DE60044503D1; JP4509018B2; EP1234877A1; EP1234877A4; JP2010163440A; US20100204308A1; AU6865600A; JP3813872B2; CN1402784A; US9243048B2; JP2006158399A

Description

明細書

細胞増殖抑制夕ンパク質、ポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド、並びにそれらを用いる細胞増殖抑制剤、癌診断薬、癌治療剤、および遺伝子治療用組成物

技術分野

本発明は、癌等の細胞の不死化が原因である疾病の治療および診断に有効となり得る遺伝子情報およびその使用に関する。より詳しくは、本発明は、癌細胞を含む不死化細胞に発現され、該細胞の増殖を抑制することにより、癌等の疾病の治療に有用なタンパク質を発現しうる遺伝子情報およびその使用に関する。特に、本発明は、癌細胞を含む不死化細胞でその発現が低下、または消失している細胞増殖抑制夕ンパク質をコードする遺伝子並びにそれらの診断薬または治療薬としての使用に関する。

背景技術

ヒト正常細胞はきわめて不死化し難く老化する。ヒト正常細胞は、細胞分裂回数カウント機構（老化機構）に従って、老化を運命づけられている。通常、生体組織から採取した初代細胞は、 2 0 ~ 8 0回の継代培養（分裂）を繰り返すことによって次第に増殖能を喪失し、老化形態を示す。細胞は老化すると、巨大化、扁平化、細胞外マトリックス成分の変化、有糸分裂促進物質刺激に対する不応答、および成長調節遺伝子発現の機能減退のようないくつかの形態学的および生化学的変化を示し、分裂を停止するため容易に判別される。

しかしながら、継代培養中に発癌剤処理、放射線照射処理等を行うことにより、ごく一部の細胞がこの細胞老化を免れて増殖を続けコロニーを形成する。このようにして無限増殖能を獲得した（または老化機構の破綻した）細胞は、連続培養が可能であり、一定の細胞世代数を経ても死滅することがなく、「不死化細胞」と呼ばれている。

正常細胞と不死化細胞を融合すると生じた雑種細胞は有限分裂能を示す。また、不死ィ匕細胞同士を融合しても有限分裂能を示す雑種細胞が得られる。このことから、ヒト細胞において不死化は、老化に対して遺伝的に劣性であり、細胞分裂回数カウント機構（老化機構）に関連する、ある特定の遺伝子（不死化抑制遺伝子）の欠損、もしくは機能の喪失が細胞の不死化に必要であることが示唆されている。また、ヒト正常細胞から直接癌細胞を作製することは容易でないが、細胞の不死化と細胞の癌化には密接な関係がある。培養条件下で細胞を癌化させる実験系から、ヒト正常細胞は増殖に対して強力に負に働く老化機構を免れて、無限に增殖できる不死化段階に変化し、その後、比較的容易に癌化段階へと多段階に変異することが明らかになつてきた。例えば、変異 p 53および変異 Rb遺伝子等のいわゆる癌遺伝子を、ヒト正常細胞に発現させても癌化のみならず不死化もしないが、一旦不死化した細胞は前述の癌遺伝子によって容易に癌化する（Namb a, M. e t a 1 C r i t . Rev. Onc ogen., 7 ： 19— 3 1， 1996)。このことは、細胞の癌化において、細胞の不死化が重要な段階であることを強く示唆しており、従って、不死化段階の解析はヒト細胞の発癌機構を知る上できわめて重要である。

癌細胞における増殖抑制遺伝子として、網膜芽細胞腫の Rb遺伝子、大腸癌の P 53遺伝子、 Wi 1ms腫瘍の WT遺伝子等 10種類以上の候補が挙げられている。特に、好適な増殖抑制遺伝子は p 53であり、 p 53を用いた遺伝子治療が既に開始されているが（L i， H. e t a l.， C l i ni c a l Cane e r Re s., 5, 637-642, 1999 )、癌化に細胞の不死化が関与している以上、癌抑制遺伝子のみでなく、不死化抑制遺伝子による細胞増殖抑制も癌の有効な治療法となり得る。

現在、細胞老化および不死化に関連した遺伝子としては、 S d i 1 (N o d a, A. e t al., Exp. Ce l l Re s., 2 1 1 : 90-98, 1994 )_N SEN6 (Banga, S. S. e t a l., Onc ogene, 14 : 3 13 - 32 1, 1997)、 SEN6 A (S and hu, A. K. e t a l.， One o gene, 12 : 247-252, 1996)、 I NG 1 (Garkavt s e v， I . and i abowo l, K. , M o 1. Ce l l . B i o l ., 1 7 ： 20 14- 20 19 , 1 997), H i c-5 (Sh i banuma, M. e t a 1., Mo 1. C e l l. B i o l.， 1 7 : 1224- 1235, 1 997) 等が報告されているが、これらの遺伝子とヒト細胞の老化、不死化および癌化との関連はいまだ解明されていない。

発明の開示

本発明は、上記事情に鑑み、不死化抑制遺伝子の完全長 cDN Aを同定し、該不死化抑制遺伝子に関する情報および、それがコードするタンパク質の機能に関する情報を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記遺伝子および前記タンパク質の診断薬および Zまたは治療薬としての用途を開発することを目的とする。

本発明者らは、上記課題解決のため鋭意研究した結果、癌細胞を含む不死化細胞でその発現が低下、または消失しているタンパク質をコードする不死化抑制遺伝子を単離し、 350個のアミノ酸配列を有するタンパク質（配列番号 1) をコ —ドする 1050 bpの翻訳領域（配列番号 2) に対応する DN A配列を含む複数のポリヌクレオチドを同定した。また、配列表の配列番号 1に記載の前記夕ンパク質が細胞増殖抑制活性を有することを見出した。

さらに、本発明者らは、不死化抑制遺伝子は、癌等の不死化細胞が原因である疾病の診断に有用なマーカーとなり、さらに癌等の疾病の治療に有効なタンパク質を発現しうる遺伝子情報であることを見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明に従えば、以下 1〜2に記載のタンパク質およびポリヌクレォチドが提供される。

1. 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列における一若しくは複数のァミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列からなり、且つ細胞増殖抑制活性を有するタンパク質。 2 . 配列表の配列番号 2に記載の D N A配列、配列表の配列番号 3に記載の D N A配列、および配列表の配列番号 4に記載の D N A配列からなる群より選ばれる D N A配列において一若しくは複数の D N Aを置換、欠失、または付加してなる D N A配列からなり、且つ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド。

また、本発明に従えば、以下 3〜 5に記載のいずれか一つの D N A配列からなる D N Aに対するアンチセンス D N A、または 3〜5に記載のいずれか一つの D N A配列がコードする R N Aに対するアンチセンス R N A或いはその誘導体を含むアンチセンスポリヌクレオチドが提供される。

3 . 配列表の配列番号 2に記載の D N A配列。

4 . 配列表の配列番号 3に記載の D N A配列。

5 . 配列表の配列番号 4に記載の D N A配列。

また、本発明に従えば、以下 6〜 9に記載のタンパク質またはポリヌクレオチドからなる細胞増殖抑制剤、或レ、は癌治療剤が提供される。

6 . 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を含む夕ンパク質。

7 . 配列表の配列番号 2に記載の D N A配列を含むポリヌクレオチド。

8 . 配列表の配列番号 3に記載の D N A配列を含むポリヌクレオチド。

9 . 配列表の配列番号 4に記載の D N A配列を含むポリヌクレォチド。

また、本発明は、上記 1または 6に記載のタンパク質をマーカ一として用いることを特徴とする癌診断薬を提供する。

また、本発明は、上記 7〜 9のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドをマ一力一として用いることを特徴とする癌診断薬を提供する。

さらに、本発明は、上記？〜 9のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを治療遺伝子として含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物を提供する。

前記遺伝子治療用組成物において、好ましくは治療遺伝子がウィルスベクターに含まれ、さらに好ましくは該ウィルスベクターがアデノウイルスベクタ一である。最後に、本発明に従えば、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する蛍光標識された抗体を提供すること、癌細胞と疑われる細胞を前記蛍光標識された抗体で染色すること、そして蛍光発色の有無を測定することを特徴とする癌細胞の識別方法が提供される。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明に用いる RE I C(R e du c e d Express i on i n Immortal i zed C e 11 ) タンパク質と、 h D k k 3および R I G 7— 1夕ンパク質とのホモロジ一比較を表す配列ァラインメントを示す図である。

図 2は、各種ヒト細胞株における RE I C遺伝子の発現を比較するためのノーザンブロッ卜の結果を示すオートラジオグラフィー写真に相当する図である。図 3は、本発明で用いる発現プラスミド RE IC/pTracerの構築を模式的に表す図である。

図 4は、本発明に従う不死化 KMST— 6細胞への ³Hチミジンの取り込み試験の結果を示す図である。

図 5は、本発明に従う Sao s 2骨肉腫細胞への ³Hチミジンの取り込み試験の結果を示す図である。

図 6は、本発明で用いる発現プラスミド RE I C/pGEX- 2 Tの構築を模式的に表す図である

図 7は、免疫蛍光法による KMS— 6細胞の二重染色の結果を示す写真に相当する図である。

図 8は、実施例 10で得られた 553 b pの増幅産物を示す電気泳動写真に相当する図である。

図 9は、ヒト 11番染色体マップである。マップ中、 11 p 15に報告されている各種癌組織における LOH頻度（％) と、それそれの LOHに対応する S T Sゲノムマーカー名を示してある。 LOH頻度の値とともに示される、癌組織は、それそれ B (乳癌)、 E (食道癌)、 G (胃癌)、 H (肝細胞癌)、 H N (頭頸部癌)、および P (前立腺癌）である。

図 1 0は、本発明に係る R E I C遺伝子と、図 9に示すマ一力一 D 1 1 S 2 3 8 8とのホモロジ一比較を表す配列アラインメント図である。

図 1 1 Aは、一群の非小細胞肺癌患者の組織中における R E I C遺伝子の発現を調べたノ一ザンブロットの結果を示すォ一トラジォグラフィ一写真に相当する図である。「N」は、非癌組織を示し、「T」は、癌組織を示す。

図 1 1 Βは、一群の肝細胞癌患者の組織中における R E I C遺伝子の発現を調ベたノーザンブロッ卜の結果を示すオートラジオグラフィ一写真に相当する図である。「Ν」は、非癌組織を示し、「Τ」は、癌組織を示す。

図 1 1 Cは、複数の食道癌患者の組織中における R E I C遺伝子の発現を調べたノーザンプロットの結果を示すオートラジオグラフィ一写真に相当する図である。「Ν」は、非癌組織を示し、「Τ」は、癌組織を示す。

図 1 1 Dは、複数の胃癌患者の組織中における R E I C遺伝子の発現を調べたノーザンブロッ卜の結果を示すオートラジオグラフィ一写真に相当する図である。「Ν」は、非癌組織を示し、「Τ」は、癌組織を示す。

図 1 1 Εは、複数の大腸癌患者の組織中における R E I C遺伝子の発現を調べたノーザンブロヅトの結果を示すオートラジオグラフィ一写真に相当する図である。「Ν」は、非癌組織を示し、「Τ」は、癌組織を示す。

図 1 2は、肝臓癌由来の各種細胞株において、 R E I C遺伝子の R F L P解析を行なったサザンブロットの結果を示すオートラジオグラフィ一写真に相当する図である。

図 1 3 Αは、 KM S— 6の細胞周期における R E I C遺伝子の発現量の変化を調べたノーザンプロットの結果を示すォートラジォグラフィ一写真に相当する図である。

図 1 3 Bは、図 1 3 Aと同様に KM S— 6の細胞周期における KM S— 6細胞への³ Hチミジンの取り込み試験の結果を示す図である。

図 14は、 TGF— ?の存在および非存在下、 RE I C遺伝子の発現量の変化を比較したノーザンブロッ卜の結果を示すオートラジオグラフィー写真に相当する図である。

図 15は、本発明で用いる発現プラスミド pUC 119/RE I Cの構築を模式的に表す図である。

図 16は、本発明で用いるコスミド p Ax C Aw tの構築を模式的に表す図である。

図 17は、本発明で用いるコスミドベクター pAx CARE I Cの作製を模式的に表す図である。

図 18は、本発明で用いるアデノウイルスベクタ一を作製するためのアデノウィルスの処理を模式的に示す図である。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の構成および好ましい実施の形態について詳細に説明する。本明細書では、 IUPAC、 IUBの規定、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編)および当該分野における慣用記号に従い、アミノ酸、タンパク質、 DNA配列、核酸等を各種略号によって表示する。

また、本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」は、 1本鎖および 2本鎖のゲノム DNA、 c DNA, mRNA、および c RN A等様々な形で具体化できる。

なお、本明細書では、特に断りがない限り、 DNA (cDNAを含む）は、センス鎖とアンチセンス鎖の二本鎖からなるものを指し、 R N Aは一本鎖からなるものを指し、アンチセンス DN Aまたはアンチセンス RN Aは一本鎖からなるものを指す。

さらに、本明細書において「不死化抑制」という用語は、「細胞増殖抑制」と同義に使用される場合がある。また、本明細書において「不死化細胞」という用語は、癌細胞を含んで用いられる。

また、「アンチセンスポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドに含まれるが、本明細書では、該ポリヌクレオチドがアンチセンス鎖であることを特に明示するときには、アンチセンスポリヌクレオチドと表記する。

(不死化抑制遺伝子および夕ンパク質）

本発明で用いられる不死化抑制遺伝子（以下、本発明に係る遺伝子という）の一つは、細胞増殖抑制活性を有する、配列表の配列番号 1に記載の 3 5 0個のァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D N A配列からなり、単離され且つ精製されたポリヌクレオチド（配列番号 2 ) である。また、本発明に係わる遺伝子は、配列番号 3または 4に記載の D N A配列からなるポリヌクレオチドを包含する。さらに、本発明に係わる遺伝子は、配列番号 2に記載の D N A配列、配列表の配列番号 3に記載の D N A配列、または配列表の配列番号 4に記載の D N A 配列のいずれか一つの D NA配列において一若しくは複数の D N Aを置換、欠失、または付加してなる D N A配列からなるポリヌクレオチドを包含する。

配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質を i n V i V oまたは i n v i t r oで産生させ、本発明に利用するとき、配列番号 2、 3、若しくは 4に記載の D N A配列からなるポリヌクレオチドによる発現には限定されず、前記アミノ酸配列を構成する各アミノ酸に対して対応する任意のコドンを組み合わせ、コドン使用頻度の違う様々な宿主で本発明に係る遺伝子として、発現を効率よく行わせることができる。従って、上記に定義されたポリヌクレオチド以外に、このような縮重コドンを随意に含む遺伝子も本発明に係る遺伝子の範囲に包含される。

本発明で用いられる細胞増殖抑制タンパク質 (以下、本発明に係るタンパク質、または R E I Cタンパク質という）は、配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を含んでなるが、それのみならず該タンパク質の細胞増殖抑制活性と実質的に同様な活性を保持し、且つ配列番号 1に記載のアミノ酸配列中の任意の一若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、付加等により改変してなるアミノ酸配列を有する該タンパク質の変異体も包含する。これらの変異体は、典型的には天然のアレル（a 11 e 1 e) 変異および異種動物間の変異を含み、配列番号 1 に記載のアミノ酸配列に対して高いホモロジ一を有する。本発明において、前記変異体をコードすべくポリヌクレオチドの DN A配列もそれらに対応して改変され得る。望ましい DN A配列の改変は、部位特異的突然変異等、当業者に公知の方法で実施可能である。

配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質は、アフリカヅメガエル (Xenopus) の Dkk lタンパク質（xDkk l) のヒトホモログである hDkk 3タンパク質として報告されている（K rupn i k， V. E. e t a 1., Gene 238, 301— 313, 1999)。 xDkk lは、アフリカヅメガエルにおける胚の中で強力な頭部誘導能を持つ、シュぺ一マン形成体における分泌型のタンパク質で、胚の分化、頭部形成に関与し、分泌型のシグナル分子 Wntファミリー（Cad i gan, K. M. and Nu s s e , R., G e ne s De . 1 1， 3286-3305, 1997) のシグナル伝達阻害因子として報告されている。さらに K rupn i kらは、ヒト Dkkファミリ一（h Dkk l〜4) の内で、 hDkk 1と hDkk 4が Wntファミリーのシグナル伝達系の Wn t活性の阻害活性を有するが、 h D k k 3は W n t活性の阻害活性を持たないと報告している。 Wntファミリ一タンパク質は癌関連遺伝子であることが、示唆されている（Cad i gan前掲）。しかしながら、 Krupnik らの報告は、 hDkk 3と Wntフアミリ一タンパク質との関連について触れていない。従って、本発明以前に、この hDkk 3タンパク質が細胞の不死化或いは癌化に関連があることを示唆する情報は一切なかった。

また、配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質および配列番号 2 に記載の D N A配列からなるポリヌクレオチドにホモロジ一のある分子として、ヒトグリオ一マ細胞で発現が低下している R I Gタンパク質が報告されている ( L 1 g o n , A. H.， e t a 1. , J. Neur oVi ro l o gy 4, 2 17 - 226, 1 998)。しかしながら、： I Gタンパク質は、配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質との間のホモロジ一が低く、本発明に係る後者のタンパク質とは機能および構造ともに異なるものである。

(各種細胞株における不死化抑制遺伝子の発現）

本発明に係る遺伝子は、不死化抑制遺伝子であるのでヒト各種細胞で発現していることが予想される。そこで各種ヒト癌細胞および不死化細胞における発現を調べたところ、肺癌、肝臓癌、リンパ腫、骨肉腫等の種々の組織から得られた 1 0系のヒト癌細胞株中、 9系のヒト癌細胞および、 1系のヒト不死化細胞株で発現が消失し、 3系のヒト不死化細胞株で発現が減少していることが分かった。さらに、ヒト不死化細胞で本発明に係る遺伝子を強制発現させたところ、この細胞の増殖が有意に抑制されることが見出された。従って、本発明に係る遺伝子は、これらの細胞の増殖抑制活性を有することが明らかとなった。

(染色体上へのマヅピング）

本発明に係る遺伝子の染色体上へのマッピングを行ったところ、ヒ卜 1 1番染色体の短腕 15 ( l i p 15) にマッピングされることが分かった。 l i p 15領域には、 Be e kw i t h-W i e d e ma nn症候群、ドーパミン受容体 D 4、へモグロビン · ^グロビン鎖、鎌状赤血球症、 cdk i nhi b i t o r p 57^kip2、 H— r as、 I G F— I I、インシュリン、 Q T延長症候群、副腎皮質癌、 Wi 1ms腫瘍 2、横紋筋肉腫、乳酸脱水素酵素、ニーマン · ピック病、副腎甲状腺ホルモン、ァシャ一症候群などの疾患原因遺伝子が存在することが報告されている。また、非小細胞肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌等の各種固形癌において、 1 1 p 1 5における染色体の不安定性が報告されている（La l and e， M. , Annu. Rev. Gene t ., 30, 1 7 3, 1997 ; Fe i nbe rg, A. P., Canc e r Re s., 59, 1 743 - 1746, 1999)。さらに、肺腺癌、横紋筋腫由来の細胞株にヒト染色体 DN Aを導入する実験で、癌抑制遺伝子が 1 1 p 15にマップされることが報告されている（0， Br i ant， K.， e t a 1 Ant i c anc e r Re s., 17， 3243— 325 1， 1997 ; e i d, L. H.， e t a 1., Hum. Mo 1. Gene t., 5 , 239-247, 1996)。これらの報告から、 l o s s of he t e ro z ygo s i t y (L〇H)、ゲノムィンプリンティングなどの染色体の不安定化が本発明に係る遺伝子の発現低下をもたらし、それが原因で細胞癌化が誘導される可能性が考えられる。さらに該遺伝子は細胞の不死化抑制遺伝子であるだけでなく、癌抑制遺伝子でもあることも強く示唆される。

(不死化抑制遺伝子の入手）

本発明に係る遺伝子は、本明細書に開示される DNA配列情報に基づいて、遺伝子工学的手法（例えば、 Mo 1 e c u 1 a r C l oni ng 2 nd ed.， Co l d S r i ng Harbo r Labo rat o ry Pr e s s： 1989) に従い、得ることができる。

実際には本発明に係る遺伝子は、実施例に示すように、正常細胞で高発現し、不死化細胞で低発現している遺伝子の c DNAを、 Repre s ent at i o na 1 D i f f e r enc e Ana l s i s (RDA) 法により濃縮、選択することにより、得ることができる。さらに、サイズ分画や、オリゴキヤツビング法または Rac e法等により調製された、長鎖 c D N Aライブラリーから、遺伝子の全長 cDNAを選択的に得ることもできる。具体的には、老化した正常細胞である KMS- 6細胞と不死化細胞である KMS T— 6細胞の cDNAから RDA法に従い、不死化細胞で発現が低下している、少なくとも 266 bpの新規 c D N Aを得ることができた。本発明に係る遺伝子に包含されるホモ口グは、種々の不死化細胞とその親株である正常細胞を材料として、同様の処理により得ることが可能である。当業者が材料として必要な細胞株を選択することは容易である。

上記のようにして得られた遺伝子の断片の D N A配列をもとに任意の配列、長さに調製した、特異的プローブを用いて、ヒト心臓 cDN Aライブラリ一をコロニーハイブリダイゼ一シヨン、プラークハイブリダイゼ一シヨン等によりスクリ一二ングし、不死化抑制遺伝子を含有する cDNAを単離することができる。また、オリゴキヤッビング法により調製したヒト心臓 cDNAライブラリーを同様にスクリ一ニングし、不死化抑制遺伝子を含有する c D N Aを単離することもでぎる。

さらに、例えば、市販されている各種ヒト cDNAライブラリ一や、各種培養細胞、組織等から常法に従い、調製された cDNAライブラリ一等からも所望の cDNAクローンを単離することができる。また、前記遺伝子断片の DNA配列に対応するアミノ酸配列をもとにそれに特異的な抗体を用いて、免疫学的なスクリーニング法により、所望の cDNAクロ一ンを選択することもできる。さらに、前記遺伝子断片の DN A配列をもとに、適宜特異的な PCR用のプライマーを設計し、常法に従い PCR反応を行い cDNAライブラリーから、増幅された DN A断片を保持する所望の cDNAクローンを選択することもできる。

(遺伝子発現系）

本発明に係る遺伝子を利用するのに際し、少なくとも配列表の配列番号 2に記載の D N A配列またはそれにコンセンサスな D N A配列を含むポリヌクレオチドを適当な発現カセッ卜および/または発現べクタ一に組み込み、配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質またはその変異体を、標的とするヒ卜細胞内で発現させることが好ましい。

発現カセットは、標的細胞内で本発明に係る遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなくいかなるカセットでも用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内で前記遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で前記遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で前記遺伝子発現が可能な発現カセットである。前記発現カセットには、本発明に係る遺伝子のほか、遺伝子を転写するためのプロモーターゃェンハンサー、ポリ Aシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識および/または選別のためのマ一カー遺伝子、細胞のゲノム DNA配列内に効率良く該遺伝子を挿入するためのウィルス由来の遺伝子配列、遺伝子発現により産生される薬物として作用する物質を細胞外に分泌および Zまたは細胞内の局所に滞留させるためのシグナル配列等、いかなる配列でも用いることが可能である。発現カセットに用いられるプロモーターは、例えばアデノウイルス（Ad)、サイトメガロウィルス（CMV)、ヒト免疫不全ウィルス（H IV)、アデノ随伴ゥィルス（AAV)、シミアンウィルス 40 (SV40)、ラウス肉腫ウィルス（R SV)、単純へルぺスウィルス（HSV)、マウス白血病ウィルス（MoMLV)、シンビスウィルス（S i nb i s vi rus), センダイウィルス（SeV)、 A型肝炎ウィルス（HAV)、 B型肝炎ウィルス（HBV)、 C型肝炎ウィルス（H CV)ヽヒトパピローマウィルス（HPV)、ゥシパピローマウィルス（BPV)、ヒト T細胞白血病ウィルス（HTLV)、水疱性口内炎ウィルス（VSV)、インフルェンザウィルス（I nf luenz a vi rus), 日本脳炎ウィルス（ J apane s e enc epha l i t i s v i r u s )、 J Cウイノレス ( J C vi rus)、パルボウイルス B 19 (Parvov i rus B 19)、ポリオウィルス（P o 1 i o v i r u s ) 等のウィルス由来のプロモ一夕一、 a lph a— subun i t o f t he s i gna l r e c o gni t i on part i c l e re c ept o r (SR_ひ)、 mye l i n ba s i c pro t e i n (MBP)、 gl i a l— s pe c i f i c gl i a l f i b r i 11 a r y ac i a i c r o t e i n (GFAP)、 ?一 ac t i n、 e l ongat i on f act o r l— a l pha (EF l—ひ)、 gl yc e ra l d ehyde— 3— pho s phat e d ehyd r o gena s e (GAP D H)ヽ mu 1 t i d r u g res i st ance gene (M d r 1)、 albumin alpha— f et oprot e in (AFP)ヽ熱ショック蛋白（HSP)、低酸素誘導蛋白（HIP)等の哺乳類由来のプロモーター、および CMV初期ェンハンサ一/ c h i c k e n ？ァクチンプロモー夕一グロビンポリ Αからなるキメラプロモーター（CAG)、 CMV初期ェンハンサ一 /alpha-skeket al act i nプロモ一夕一からなるキメラプロモー夕一等のキヌラ型プロモータ—等を含む。また、遺伝子とそれを発現させるレトロウィルス由来のプロモータ一である L TRは、丁1?_の113領域を例ぇば、 CAG、 CMV、 RSV、 TK、 SV40、 SR-ひ、 MBP、 ?-a c t i n、 E F 1 -ひ等のプロモ一夕一に置換した、キメラ型 LTRとして用いることができる。

また、本発明に係る遺伝子を含む発現カセットをコスミド、プラスミド、またはウィルス由来の任意の宿主細胞適合性組換えべクタ一に組み込むことができるこのような組換えウィルスベクタ一の種類、分子量、形状等には、特に制限はない。具体的には、 DNAおよび/または RNAウィルスが挙げられ、（+ ) 鎖および Zまたは（―）鎖ウィルスが挙げられるが、特に制限を設けるものではない。前記組換えウィルスベクターは、 MoMLVベクタ一、 HSVベクタ一、 Ad ベクター、 AAVベクター、 HIVベクター、 S eVベクター等のいかなるウイルスベクターであっても良い。また、ウィルスベクタ一の構成タンパク質群のうち 1つ以上を、異種ウィルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する核酸配列のうち 1部を異種ウィルスの核酸配列に置換する、シュ一ドタイプ型のウィルスベクタ一も本発明に使用できる。さらに、治療効果を持つウィルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウィルスも組換えウィルスベクターとして使用可能である。

以上、詳細に説明したように、本発明に係る遺伝子は、例えば宿主細胞である微生物または真核生物の発現ベクターに組み込んで形質転換された微生物、または真核生物を培養することによって、配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質等を容易に、かつ安定して製造することができる。上記に列挙したものの中から選択された発現べクタ一は、それ単独で、またはカチォニックリポソ —ム、ポリリジン、ポリリジンセリン等の医学的に許容できる様々な担体と複合体を形成させた上で、宿主細胞に導入することができる。

(アンチセンスポリヌクレオチド）

本発明に係わる遺伝子を構成する DN Aのセンス鎖または該 DN Aがコードする R N Aについては、その塩基配列と相補的な塩基配列からなるアンチセンス D NAまたはアンチセンス RNAがそれぞれ存在する。すなわち、このようなアンチセンス DN Aは、配列番号 2、配列番号 3、または配列番号 4に記載の DN A 配列のすくなくとも一部に相補的な DNA配列を有する。また、このようなアンチセンス RN Aは、配列番号 2、配列番号 3、または配列番号 4に記載の DN A 配列からなる DNAがコ一ドする RN Aのすくなくとも一部に相補的な RN A配列を有する。好ましくは、前記アンチセンス DN Aおよびアンチセンス; N Aは、配列番号 2に記載の D NA配列またはそれに対応する RNA配列の一部に相補的である。従って、前記アンチセンス DNAまたは前記アンチセンス RNAを含む本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明に係る遺伝子から本発明に係わるタンパク質が製造される過程（転写、翻訳等）で、遺伝情報を担う DN Aまたは RN Aにハイブリダィズして、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて、該タンパク質の生合成を阻害する。また、本発明は、アンチセンスポリヌクレオチド誘導体を包含する。該誘導体は、例えば、アンチセンスポリヌクレオチドの 3' 末端、若しくは 5' 末端に他の物質が結合したものや塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか一部において、置換、欠失、または付加等の修飾をくわえたものである。特に、生体に投与するとき、ヌクレアーゼによる分解を防ぐために、ホスホロチォェ一ト型（リン酸基がィォゥ原子で共有結合）のポリヌクレオチド誘導体であることが好ましい。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体は、その塩基数が 1 0〜2 0 0 0であることが好ましい。この範囲で塩基数が比較的少ないォリゴヌクレオチドであれば、 D N A合成機を用いて化学合成することができる。さらに、本発明に係わる遺伝子の c D N Aの一部を錶型として P C R法で合成できる場合もある。

(治療薬としての用途）

本発明に係るタンパク質は、癌細胞を含む不死化細胞の増殖を抑制するので、癌等の細胞の不死化が原因である疾病の治療に治療薬として用いることが可能である。従って、これらのタンパク質をコードする本発明に係る遺伝子も、治療薬として使用可能である。さらに、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体は、本発明に係る遺伝子に拮抗的に作用し、細胞増殖を刺激するので様々な疾患の治療に適用できる。

本発明に係るタンパク質を細胞増殖抑制剤、または癌治療剤として癌等の疾病の治療に使用する場合、該タンパク質を薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤.、安定化剤等とともに錠剤、カプセル剤、注射用懸濁液、その他の製剤として患者に投与することが好ましい。この目的で用いる製剤用の助剤は、当業者に周知である。また、本発明の細胞増殖抑制剤および癌治療剤は、靜脈内投与、経口投与等、好ましい投与経路を設定して、望ましい治療効果を達成することが期待できる。

(遺伝子治療への応用）

本発明に係る遺伝子を細胞増殖抑制剤として、または癌治療剤として癌等の疾病の治療に使用する場合、好ましくは、該遺伝子を治療遺伝子として、前述の治療用にデザィンされた担体と併せて遺伝子治療用組成物を調製し、患者に投与する。

本発明の遺伝子治療用組成物は、まず患者から標的細胞を体外に取り出し、本発明に係る遺伝子を導入した後に、再びその細胞を患者の体内に戻すという自家移植による遺伝子治療（e x v i v o遺伝子治療）に使用可能である。また、本発明に係る遺伝子を直接患者に投与する遺伝子治療（i n v i V o遺伝子治療）にも使用可能である。

本発明に係る遺伝子を遺伝子治療に使用するとき、アデノウィルスベクターが好ましく用いられる。アデノウィルスベクタ一の特徴として、（ 1 )多くの種類の細胞に遺伝子導入ができる、（2)増殖停止期の細胞に対しても効率よく遺伝子導入ができる、（3)遠心により濃縮が可能であり、高タイ夕一（10〜1 1 PFU /ml以上）のウィルスが得られる、（4) i n v i v oの組織細胞への直接の遺伝子導入に適している、といった点が挙げられる。

遺伝子治療用のアデノウイルスとしては、 E 1/E 3領域を欠失させた第 1世代のアデノウイルスベクター（Mi yake， S.， e t a 1 P r o c . N a t 1. Ac ad. S c i. USA., 93， 1320, 1996) から、 E l/ E 3領域に加え、 E 2もしくは E 4領域を欠失させた第 2世代のアデノウィルスべク夕一（L i ebe r， A.， e t al.， J. Vi r o l., 70, 8944, 1996 ； Mi zuguch i, H. &Kay， M. A.， Hum. Gene T he r., 10, 2013, 1999), アデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた（GUTLES S) 第 3世代のアデノウィルスベクタ一（S t e i nwa e r d e r , D. S.， e t a 1 J. Vi ro l., 73, 9303， 199 9) が開発されているが、本発明に係る遺伝子を導入するには、特に限定されずいずれのアデノウィルスベクターでも使用可能である。

さらに、 AAVの染色体に組み込み能を付与したアデノ一 AAVハイブリッドベクタ一 (Re c,chi a， A. , e t a 1. , P r o c . Nat 1. Ac ad. S c i. USA., 96， 26 15, 1999)や、トランスポゾンの遺伝子を用いることにより染色体に組み込む能力を有したアデノウィルスベクターなどを利用すれば、長期的な遺伝子発現にも応用が可能である。

また、アデノウイルスファイバ一の H 1ループに組織特異的な移行性を示すぺプチド配列を挿入することにより、アデノウイルスベクターに組織特異性を付与することも可能である（Mi zuguchi, H. &Hayakawa， T.， Ν i ρ ρ ο η R i η s h ο , 7， 1544, 2000)。

本発明の遺伝子治療用組成物の生体への投与の方法については特に制限はない例えば非経口的投与、例えば靜脈内投与することにより好ましく実施できる。 (対象疾患）

本発明に係る遺伝子によってコードされる本発明に係るタンパク質は、受容細胞の老化または静止状態を誘発するため、癌細胞の非癌性細胞への分化を媒介することができる。例えば、癌、或いは癌原細胞の急性増殖を抑制するための治療に使用できる。

一般的に腫瘍（t umo r) には、良性腫瘍（b e n i gn tumor) と悪性腫瘍（ma 1 i gnan t t umo r) があり、後者を総称して癌（c a n c e r ) という。

本発明に係るタンパク質を用いることにより、治療可能な腫瘍は特に限定されず、良性腫瘍、悪性腫瘍のいずれも治療が可能であるが、特に悪性腫瘍に対して有効である。

悪性腫瘍を発生臓器別に分類すると、脳 ·神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫 ·白血病、結腸癌、脬癌、肛門 ·直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、骨 -骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、その他の癌に分類される。上記のとおり、治瘛可能な腫瘍は特に限定されず、前記の腫瘍、癌、いずれも治療が可能であるが、特に肺癌、肝癌、食道癌、骨 ·骨肉腫、に対して有効である。

さらに各臓器癌を組織学的に分類すると、上皮細胞由来の癌腫（ c a r c i n oma)、非上皮細胞由来の肉腫（sarcoma )、およびそれらの混合腫瘍に大別される。本発明に係るタンパク質を用いることにより、治療可能な腫瘍は特に限定されず、上皮細胞由来の癌腫、非上皮細胞由来の肉腫、混合腫瘍のいずれも治療が可能であるが、特に上皮細胞由来の癌腫に対して有効である。

さらに多くの癌ではない疾病も本発明に係る遺伝子またはタンパク質により治療が可能であり、その代表例として緑内障、乾癬等の細胞の過剰成長による疾患が挙げられる。

また、例えば、レトロウイルスは細胞増殖期の細胞でのみ増殖するため、 H I V等のレトロウイルス感染症、いぼ（性交性いぼを含む)、口頭乳頭腫症、進行性マルチフォーカルロイコセファロパシー等のような疾病に対して、本発明に係る遺伝子は、治療的に有効であることが期待される。これは、該遺伝子が感染細胞増殖を阻害することによってウィルスの増殖を抑制するからである。従って、ィンフルェンザ、肝炎ウィルス（例えば、 B型肝炎または C型肝炎）、 E B V ( E p s t e i n - B a r r v i r u s )、パピローマウィルス等のウィルスの増殖を抑制する抗ウィルス剤としても有用である。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体は、細胞増殖を刺激する活性を有するので、細胞の増殖を必要とする疾患の治療に用いることができる。例えば、創傷、火傷等の治療を目的とした皮膚組織細胞の増殖、心筋梗塞、脳梗塞等の治療を目的とした血管内皮細胞の増殖、肝硬変、腎不全等の治療を目的とした萎縮組織細胞の増殖等、放射線被爆、エイズ等によるリンパ球の減少の治療を目的とした骨髄細胞の増殖が挙げられる。

(診断薬としての用途）

前述のように、本発明に係る遺伝子は、癌細胞を含む不死化細胞でその発現が減少しているので、該不死化細胞の増殖が原因である疾病の広範囲な診断用マー力一となり得る。特に、本発明に係る遺伝子は、癌診断薬として使用可能である。さらに、本発明に係る遺伝子によって発現される本発明に係るタンパク質も、癌細胞を含む不死化細胞でその発現が減少するので、該タンパク質も同様にして、癌診断薬を含む前記診断用マーカーとして用いることが可能である。

本発明に係るタンパク質を癌等の診断に使用する場合、該タンパク質に対する特異的抗体を作製し、これをアツセィに用いる。ここで抗原として、前述の遺伝子工学的手法に従って大量に産生できるタンパク質またはその一部を用いることができ、得られる抗体はポリクロナール抗体およびモノクロナ一ル抗体のいずれでもよい。これら抗体は前記タンパク質の精製、測定、識別等に利用できるが、特に、モノクロナ一ル抗体は、細胞、組織または体液中の該タンパク質の存在を評価するための免疫アツセィに好適に使用できる。このように抗体によって提供される該タンパク質の検出および/または測定の能力は、腫瘍の存在または重症度の評価手段として非常に望ましいものである。

(遺伝子診断）

本発明に係る遺伝子を、癌等の遺伝子診断に使用する場合、該遺伝子を構成する D N A配列に基づき、それとハイプリダイズし得る D N Aまたは該 D N A配列に対応する R N A配列にハイブリダイズし得る R N Aを含むポリヌクレオチドを作製し、これをアツセィに用いる。この目的のために、上記のアンチセンスポリヌクレオチドの全長または一部を用いることができる。このようなポリヌクレオチドの長さは、 1 0〜2 0 0 0塩基が好ましく、より好ましくは 1 5〜 1 0 0 0 塩基である。これらのポリヌクレオチドは、 ³²P等の放射性同位元素、アルカリフォスファタ一ゼ等の酵素、フルォレセイン等の蛍光化合物、またはァクリジニゥムエステル等の化学発光化合物で任意に標識され得る。得られた標識ポリヌクレオチドは、サザンおよびノーザンブロッティングのような従来の分析において、 D NAおよび Zまたは R N Aプローブとしてアツセィに用いることができる。好ましくは、これらのプロ一ブはストリンジェン卜な条件下で前記遺伝子とハイブリダィズし得るものである。また、短い 1 0〜5 0塩基のポリヌクレオチドは、例えば、 P C R法による診断でプライマーとして用いることができる。

実施例

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。

(実施例 1 ) 不死化関連遺伝子のクローニング

1 . 初代線維芽細胞株の培養 9週齢の雌性胚からヒト線維芽細胞を調製し、初代線維芽細胞株（KM S— 6) を得た（Namba， M. e t al.， Int. J. Cancer, 35： 27 5 -280, 1985)。細胞は 10%ゥシ胎仔血清（FBS、三光純薬社製）を含むイーグル最少培地（MEM、 GIBCO社製)、またはダルベッコ改変ィーグル培地（DMEM、 GIBCO社製）を用いて 5%C0₂濃度、 37°C条件下で培養した。細胞はプレート中でほぼ密集するまで 5〜7日間培養した後、 1Z4 倍希釈で継代培養した。

2. ^6Q Co放射線処理による不死化細胞株の樹立

セミコンフルェン卜に培養した KM S— 6細胞に 200— 400 r a d sの線量の ^6flCoァ線を 13回照射し、計 2， 800 r ad sで放射線処理を行った。その後、 1Z2倍ずつ継代を重ね、最終的に約 50回の継代培養を行い、老化形態を示さず、増殖能を有する不死化細胞株 (KMST-6) を得た（Namba ら、前掲）。

3. RD A法による遺伝子のクローニング

45継代し、老化させた KMS— 6細胞から、 Ac id— Guanidium

-Phenol-Chlorof o rm(AGP C)法により全 RNAを抽出し、ダイナビーズ（Dynal社製）を用いて mR N Aを精製した。同様に、不死化している KMST— 6細胞から、 mRNAを抽出、精製した。各々 2〃gの精製した mR N Aを錶型とし a V i a n mye lobast os i s vi rus 逆転写酵素（AMV— RT) を用いて、それぞれ c DNAを調製した。 KMS— 6から調製した cDNA 0. 01〃gと、 KMST— 6から調製した cDNA を 68°Cで 8時間、サブトラクシヨンした。サブトラクシヨンで除かれなかった cDNAを錶型とし、 T4 DNAポリメラ一ゼを用いて 2本鎖 DNAを調製した。これをプラスミドベクター pT7B 1 u e (No vagen社製）に組み込んだ後、大腸菌（DH5ひ）に導入し、約 400クローンからなる大腸菌ライブラリーを得た。 (実施例 2) クローン RE I C

1. 大腸菌ライブラリーのスクリーニング

上記大腸菌ライブラリーから擬陽性クローンを除外するため、別の不死化細胞株である OUMS— 24 F (Bai， L. e t a 1 Int. J. Cane e r, 53 : 451-456, 1993) の mR N Aをもとに作製した ³²P標識 c DNAプローブを用いて、コロニーハイブリダィゼーシヨンを行った。ハイブリダイゼーシヨンの結果、陽性となったクローンを除外し、約 30の不死化抑制遺伝子候補クローンを得た。

2. DNAシークェンシング

スクリーニングにより得られたクローンの DNA配列を、 Sanger法（S anger F . e t al.， Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA 74 : 5463-5467, 1977) を用いて決定した。その結果、フイブ口ネクチン、ひ 2夕ィプ Iプロコラーゲン等の細胞外マトリックスタンパク質、コラゲナーゼ、 WS 9— 14等の酵素タンパク質、 p 21等の細胞周期調節タンパク質等、老化に関連する遺伝子配列を持つクローンが同定された。そのうち、既知の遺伝子とホモロジ一を示さず、新規遺伝子と考えられるクローン RE I C(D 93) が得られていることが判明した。その DN A配列を配列表の配列番号 5に示す。

(実施例 3) クローン RE I C ( 10— 1)

クローン RE IC (D- 93) の D N A配列から該クローンは完全長 c D N A ではないことが予想された。そこで、ヒト心臓 cDN Aライブラリー（BRL社製）から、配列番号 5に記載の DNA配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、より長い DN A配列を有する c DNA断片を持つクローンのスクリー二ングを行った。その結果、 RE I C (D 93) の 5' 領域を含む、全長 cDNA 断片を保持すると予想されるクローン、 RE I C (10-1) を得た。この cD N Aクローンについて DNAシ一ケンシングを行い、その全 DN A配列を決定した。このクローンの DN A配列を配列表の配列番号 3に示す。

(実施例 4) クローン RE IC (10— 2)

オリゴキヤッビング法（Ma r u y ama， K. and S u g a n o , S.， Gene, 138 : 171-174, 1994 ) で調製したヒト心臓 c D N Aライブラリー（日本ジーン社製）を用いて、実施例 2と同様に、配列番号 5に記載の D N A配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、より長い D N A配列を有する cDNA断片を持つクローンのスクリーニングを行った。その結果、 R E I C (D 93) の 5，領域を含む、全長 cDNA断片を保持すると予想されるクローン、 RE IC (10-2) を得た。この cDNAクローンについて DNA シ一ケンシングを行い、その全 DN A配列を決定した。このクローンの DN A配列を配列表の配列番号 4に示す。

(実施例 5) クローニングされた cDNAの解析

実施例 3および 4の結果から、本発明に係る遺伝子は、配列番号 5に記載の D N A配列を完全に含み（配列番号 3の塩基番号 1848— 2113、配列番号 4 の塩基番号 1820— 2095にそれそれ相当）、さらに該配列の 5 '側には 35 0個のアミノ酸を有するタンパク質（配列番号 1) をコードする、配列番号 2に記載の 1050 b pの翻訳領域（配列番号 3の塩基番号 226- 1275、配列番号 4の塩基番号 198— 1247にそれそれ相当）を含むことを確認した。この遺伝子は、不死化細胞で発現が低下していることから前述のように、 Reduc e d Express ion in I mm ortal i zed Cel l (R E I C) と表現し、以下「RE I C遺伝子」または単に「RE I C」と呼ぶ。

本発明に係る RE I C遺伝子のホモログの探索は、 NCB I (Nat i ona 1 Center f or B i o t e c h n o 1 o g y )で We bサイト上に公開されているデ一夕ベースから、相同解析プログラム（BLAST) を用いて行つた。

BLASTの結果から、配列番号 1のァミノ酸配列と同一若しくはホモロジ一を示す配列を有するタンパク質として、 hDkk3と R I G7— 1が得られた。 hDkk3は、 100%の同一性を示し、 R I G 7 _ 1は、部分的には同一であるが、全体で 43%のホモロジ一しか示さなかった。 hDkk3および R IG7 — 1のアミノ酸配列と、 RE I C遺伝子のアミノ酸配列（配列番号 1) とのホモロジー比較を図 1に示す。

(実施例 6) 各種細胞株における RE I Cの発現量の解析

Hep3B (肝細胞癌)、 HuH6 (肝芽腫)、 HuH7 (肝細胞癌)、 HuCC T 1 (胆管癌)、 A549 (肺癌)、 HaCat (不死化ケラチノサイト）、 HeL a (子宮頸部癌)、 Sao s 2 (骨肉腫)、 T24 (膀胱癌)、そして U 937 (組織球性リンパ腫）の 1 1種類の癌細胞株と、 3種類の正常線維芽細胞（OUMS 24、 KMS— 6、 HSF412) およびそれそれ対応する不死化細胞（OUM S 24F、 KMST— 6、 SUSM1) とから調製した全 RNA ( 10 /g) を 1%ホルムアルデヒドノァガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースフィルタ一 (Hyb r i bondN+、 Ame r s ham Pharmac i a B i o t e ch社製）に固定化した。次に、（ひ-³² P) — d CT Pでラベルしたプローブを用いて、： E I C cDNA断片のノーザンハイブリダィゼ一シヨン（42°C、 12時間）を行った。メンブレンを 5xSSC；、 50%ホルムアミド、 lxデンハールト水溶液、 0. 2%SDS、 10%硫酸デキストラン、そして熱変性させた 20 O zg/mlのサケ精巣 DNAを含むバッファ一中に入れ、ラジオァイソト一プで標識したプローブ DNAを加え、 65°Cでハイブリダィズした。その後、フィルターを 55。Cの 2xSSC/0. 5 %SD Sバッファ一中で洗浄し、さらに 55°Cの 0. lxSSC/0. 5 %S D Sバッファ一中でもう一度洗浄した。 X線フィルム上でォ一トラジォグラフィ一にかけた結果を図 2に示す。正常細胞でサイズが約 2. 6 kbの mRNAが検出され、この転写産物の大きさは配列番号 3または配列番号 4に記載の RE I C cDNAの DNA配列の大きさに矛盾しないことが明らかとなった。各不死化細胞株でも RE I C遺伝子の発現は認められたが、正常細胞株と比較して発現量が減少していた。さらに、 T 24株を除く各癌細胞株で RE I C遺伝子の発現が消失していることが確認された。

(実施例 7) 細胞増殖阻害試験

1. 発現プラスミドの作製

遺伝子発現プロモーターとして、 E F— 1ひを保持するプラスミドベクター p

Tracer A (Invit roge n社製）を用いた。 E F 1—ひプロモ一夕一の下流の E c oR I— Xba I部位に、配列番号 3に記載の D N A配列を含む、 E c oR I— Xba Iで切り出した、 2. 6 k bの R E I C c D N A断片をサブクロ一ニングし、発現プラスミド RE I C/pT r a c e r (図 3)を得た。 2. ³Hチミジンの取り込み（不死化 KMST— 6細胞）

不死化 KM S T- 6細胞を 24ゥエルプレートに 2 X 104細胞 Zゥエルとなるように播種した。トランスフエクシヨン試薬として L ipof ectamin e (GIB CO社製）を用いて、 5〃gの発現プラスミド RE I CZp T r a c e rをリポフエクシヨンした。 1 /C i/ゥエルとなるように、メチル一 ³Hチミジン（ 1 C iZmmo 1)を調製し、細胞への取り込みを行った。 12時間後、得られた細胞を冷却した PBS (-) で洗浄した。さらに 5%トリクロ口酢酸中に固定し、 95%エタノールで洗浄した。こうして得られた細胞を 0. 3M a OHで溶解した後、 HC1で中和し、取り込まれた³ Hチミジンの放射活性を、液体シンチレーシヨンカウン夕一で測定した。その結果、 RE I C遺伝子が細胞増殖抑制効果を有することが確 ¾^r、された（図 4)。対照として、ベクター PTra c e r Aのみを KM ST— 6細胞にリポフエクシヨンした。

3. ³ Hチミジンの取り込み（Sao s 2骨肉腫細胞）

Sao s 2骨肉腫細胞を 24ゥエルプレートに 5 x 10⁴細胞/ゥエルとなるように播種した。リン酸カルシウム法を用いて、 2 zgの発現プラスミド RE I CZp T r a c e rをトランスフエクシヨンした。 1 C i/ゥエルとなるように、メチル— ³ Hチミジン（I Ci/mmo l) を調製し、細胞への取り込みを行った。 12時間後、細胞を冷却した PBS (―) で洗浄した。さらに 5%トリクロ口酢酸中に固定し、 95%エタノールで洗浄した。こうして得られた細胞を

0. 3M NaOHで溶解した後、 HC1で中和し、取り込まれた³ Hチミジンの放射活性を、液体シンチレ一シヨンカウン夕一で測定した。その結果、 RE I C遺伝子が細胞増殖抑制効果を有することが確認された（図 5)。対照として、ベクタ一 PT race r Aのみを S a o s 2細胞にリポフエクシヨンした。

(実施例 8) RE I Cタンパク質を認識する抗体の作製

1. RE I Cタンパク質の in vit ro 翻訳

RE I Cタンパク質を GST融合タンパク質として発現させるために、 i n v i t r o発現系で翻訳させた。、

配列番号 3に記載の DN A配列をもとに、プライマー： 5'— TGGATCCA TGCAGCGGCTTGGGGC CAC - 3'および 5'— TGAATT CAA TCTCTTCCCCTCCCAGCAG— 3'を用いて RE I Cの ORF領域を PCRで選択的に増幅した。増幅した DNA断片を B amH I、 E c oR Iで消化して、 GST融合夕ンパク発現べクタ一 pGEX-2 T(Ame r s ham P ha rma c i a Biot ec h社製）の BamHI、 EcoR I部位に: E I Cが融合ダンパク質として発現するようにサブクロ一ニングし、発現プラスミド RE I C/pGEX-2 T (図 6) を得た。

常法に従い、プラスミド RE I CZpGEX_2 Tで形質転換した大腸菌に I PTG誘導処理を施し、融合タンパク質を産生させた。集菌した大腸菌を PBS に懸濁し、超音波処理後、遠心して得られた上清をグル夕チオンセファロ一ス 4 Bカラム（Ame r s ham P h a rma c i a Biot ec h社製）にかけて、融合タンパク質を精製した。カラムに吸着した前記融合タンパク質をトロンビンで消化し、溶出した。その後、再度グル夕チオンカラムで未消化の融合タンパク質を取り除き、数個の余分なアミノ酸を有する RE I Cタンパク質を得た。 2. 抗体上記 1で得られ、精製されたタンパク質を生理食塩水で希釈し、その lmgをゥサギ耳静脈に 2週間おきに投与することによりゥサギを免疫した。 2回の免疫後、抗体価を E CLウエスタンプロッティング検出システム（Amersham Pharmac ia B i o t e c h社製）を用いて測定した。その結果、 1/2 000希釈した抗体が前記タンパク質 0. 0 l gに対して反応することを確認したので、さらに 2回の追加免疫を行った。全採血により得られた血液を、 37°C で 30分間インキュベートし、凝固した血餅を取り除いた後、ポアサイズが 0. 45〃mのフィルタ一を用いて無菌濾過し、所望の抗血清を得た。

(実施例 9 ) 抗体による細胞核染色

RE I C遺伝子の細胞内局在を検討するために、実施例 8で作製した抗 RE I

C抗血清と、コントロールとして、染色体を特異的に蛍光染色する色素である H oechst 33258 (Molecular P r o b e社製）とを用いて、細胞の 2重染色を行った。まず、 KM S_ 6細胞を 6ゥヱルシャーレで培養した。 Hoechst 33258を培地中に 100 ngZmlとなるように添加した後、 1時間培養した。 Ho e c hs t 33258で染色した細胞を 1 %バラフオルムアルデヒドで固定し、前記抗血清で処理した後、 FIT C標識したャギ抗ゥサギ抗体 ( S i gma社製）で染色した。 Hoechst 33258を励起波長 36 Onmで励起し、 F I TC標識した抗体は励起波長 488 nmで励起した。この免疫蛍光法による測定結果を図 7に示す。これより前記抗血清が核を特異的に染色し、 RE I Cタンパク質が細胞内で核に局在することを確認した。

(実施例 10) R E I C遺伝子の染色体マッビング

RE I C遺伝子の染色体マップは、ヒトーハムス夕一雑種細胞由来のパネル（S tandf ord G 3 Human Hams t e r R H Pane l； R e search Genet i cs社製）を用いて、ラジェ一シヨン 'ハイブリッド地図（RHマップ）を解析することにより決定した。 PCR用のプライマ一は、 5'— GATTTAGATCTGGACCAGGC— 3' (配列番号 4の塩基番号 1244— 1263) および 5' -CTGAGCAACACTGCTGGA TG— 3，（配列番号 4の塩基番号 1777— 1796に相当する配列のアンチセンス鎖）を用いた。 PCRは、 94°C3分のプレヒート後、 94°C30秒、 6 3°C30秒、 72°C1分で 30サイクル反応を行った。反応溶液を 2%ァガロースゲルで電気泳動後、 ethidium bromide (E t B r)染色した結果、 553 bpの増幅産物が確認された（図 8)。 PCRの結果をもとに、スタンフォード大学の RHデ一夕ベースから、 RE I C遺伝子がヒト 11番染色体の短腕 15 ( 11 p 15) に位置することを確認した。

また、その情報をもとに GeneBankの STSゲノムマ一力一と、 RE I C遺伝子の塩基配列を比較したところ、： RE IC遺伝子の 3' 非翻訳領域がマー力一の D 11 S 2388 ( 11 p 15のゲノムマ一力一）と一致することを確認した。（図 9，図 10)。これらの結果から、 RE I C遺伝子が 11 p 15に位置することが明らかとなつた。 .なお、図 9中に示した各種癌組織における L 0 H頻度は、以下の文献から引用した。乳癌（B)： Wi nq V i s t， R.， e t a 1., Cancer Res., 53, 4486, 1993 ;食道癌 (E) : D o 1 an,K.， e t al., Br. J. Cancer, 78, 950, 1998 ; 胃癌（G) : Baf f a, R.， e t al.， Cancer Res., 56, 2 68， 1996 ;肝細胞癌（H) : Sheu， J— C.， e t a 1., Br. J. Cancer, 80， 468, 1999；頭頸部癌（HN):E1— Naggar*， A. K., et al., Cl in. Cancer Res., 2, 903, 199 6；および前立腺癌（P) : Dahiya， R.， e t a 1 Int. J. Ca ncer, 72, 283, 1997.

(実施例 11) 臨床サンプル中の RE I C遺伝子の発現

1. 臨床サンプルの入手

各種癌および非癌組織は、岡山大学医学部で手術を受けた、 34人の患者からィンフォームドコンセントを得て入手した。 2. RE I C遺伝子の発現

上記 1で入手した癌、および非癌組織から、グァニジン—チオシァネート法により全 RNAを回収した。回収した全 RNA ( 1 O^g) を 1%ホルムアルデヒド /ァガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースフィル夕一（Hybrib ondN Amersham Pharmac i a B i o t e c h社製) に固定化した。次に、（ひ一³² p) —dCTPでラベルしたプローブを用いて、 R E I CcDN A断片のノーザンハイブリダィゼーシヨン（42°C、 12時間）を行った。メンブレンを 5xSSC、 50%ホルムアミド、 IXデンハールト水溶液、 0. 2%SDS、 2 OmMリン酸ナトリウム、そして熱変性させた 100 / g/mlのサケ精巣 DNAを含むバッファ一中に入れ、ラジオアイソトープで標識したプローブ DNAを加え、 65°Cでハイブリダィズした。その後、フィルタ —を 55°Cの 2xS S CZO. 5%SD Sバッファ一中で洗浄し、さらに 55°C の 0. lxSSCZO. 5 %SDSバッファ一中でもう一度洗浄した。 X線フィルム上でオートラジオグラフィ一にかけた。その結果、非小細胞肺癌患者 11例中 10例（図 11 A：ケース 1〜6 , 8〜： 11)、肝細胞癌患者 13例中 4例（図 11B：ケース 8, 9, 11, 13)、食道癌患者 2例中 1例（図 11 C：ケース 2)、胃癌患者 4例中 1例（図 11D :ケース 4)、で RE I C遺伝子の発現量が減少していた。一方、.大腸癌患者 3例では、 RE I C遺伝子の発現量の低下は見られなかった（図 11 E)。

(実施例 12) RE I C遺伝子の RFLP解析

RE I C遺伝子の変異解析を行うために、制限酵素断片長多型（Re s t r i ct ion f ragment length po lymorphi sm; FLP)解析を行った。まず、肝細胞癌由来の JHH_ 1、 HuH— 6、 Hep G2、 HLE、 HuH— 7、 PL C/PRC/5, H e p 3 B、 JHH— 7、 J HH— 2、 JHH— 6、 JHH— 4、 J H H— 5細胞株から染色体 D N Aを下記の方法に従い、回収した。また、ポジティブコントロールとして、正常線維芽細胞株 KMS— 6から染色体 DNAを回収した。

1. 染色体 DNAの回収

培養皿 2枚からコンフルェントに培養した各細胞をトリブシン処理により回収した。回収した細胞を 1 X TEN buf f er (TEN : 50 mM T r i s — HCl (pH8. 0)、 lmM EDTA、 100mM Nac l) 中に懸濁しホモジナイズした。ホモジナイズした懸濁液に 750〃 1の SD S (10%) と 500 /g// 1となるように p r o t e i na s e K (MERCK社製、 2 Omg/ml) とを加え、緩やかに転倒混和し、 55 °Cで 1時間インキュベート後、 37°Cでー晚インキュベートした。フエノール 'クロロフオルム抽出を 2回行い、回収した上清からさらにクロ口ホルム抽出を 2回行い上清を回収した。回収した上清にあらかじめ一 20°Cで保冷した 10. 2 mlのエタノールを加えて混和し、得られる糸状の DNAをパスツールピペットでとり、余分のエタノールを取り除いて乾燥させた。乾燥させた DN Aに適量の TE buf f er (10 mM T r i s— HC 1 (pH 8. 0)、 1 mM E D T A)を加え、室温で 1〜 2日混和して DNAを溶解した。

2. imp解析

上記 1で回収した D N Aを制限酵素 P s t Iで消化後、 1 %ァガロースゲルに電気泳動し、ニトロセルロースフィル夕一（Hy b r i b o ndN+、 Ame r s ham Pharmac ia B i o t e c h社製）に固定化した。次に、（ひ -³² p)—d CTPで配列番号 3の RE I C c D N A断片の全長をラベルしたプローブを用いて、サザンハイブリダィゼ一シヨン（42°C、 12時間）を行った。メンブレンを 5xSSC、 50%ホルムアミド、 IXデンハールト水溶液、 0. 2%SDS、 2 OmMリン酸ナトリウム、そして熱変性させた 100〃 g7m 1 のサケ精巣 DNAを含むバッファ一中に入れ、ラジオァイソトープで標識したプローブ DNAを加え、 65°Cでハイブリダィズした。その後、フィル夕一を 55°C の 2xSSC/0. 5%SDSバッファ一中で洗浄し、さらに 55°Cの 0. lx SSC/0. 5%SDSバッファ一中でもう一度洗浄した。 X線フィルム上でォ一トラジオグラフィーにかけた。その結果、' HepG2、 Hep3B、 JHH- 4の 3個の癌細胞株でアレルが消失していることが確認された。癌細胞では、 R E I C遺伝子の発現が低下しているだけでなく、 RE I C遺伝子自体に LOHが起きている可能性が示唆される（図 12)。

(実施例 13 ) 細胞周期への R E I C遺伝子の関与

細胞周期における RE I C遺伝子の発現量の変化を確認するために、以下の実験を行った。 KM S— 6細胞を 10 cmシャーレに 2 x 10⁶細胞/シャーレとなるように播種した。播種する際の培地中の血清濃度を 0. 5%となるように調製し、 · 72時間培養して、細胞周期を GO期（休止期）に同調させた。次に血清濃度を 10%となるように血清を添加し、細胞を刺激することにより細胞周期を開始させた。添加後 0、 0. 5、 1、 3、 6、 12、 24、 48時間の全 RNA と、通常の培養条件の全 RN Aを回収し、ノーザンハイブリダィゼ一シヨンで R E I C遺伝子の発現量の変化を解析した。その結果、血清添加後 12時間で RE I C遺伝子の発現が最も低下し、その後再び RE I C遺伝子の発現が上昇することが確認された。コントロールとして、 GAP DH遺伝子の発現量の変化を解析した結果、細胞周期には関係なく一定の発現量であることが確認された（図 13 A)。同時に、実施例 7— 2に従って³ Hチミジンの取り込みを確認したところ、血清添加後 24時間で ³ Hチミジンの取り込みが増加し、その後再び³ Hチミジンの取り込みが減少することが確認された。（図 13B)。

以上の結果から、 RE IC遺伝子は、細胞周期の GO期に強く発現し、細胞増殖を停止する方向に働き、一方その発現が減少することにより、細胞周期を G1 期に向かわせる方向に働くと考えられる。

(実施例 14) 細胞増殖抑制剤による、 RE I C遺伝子の発現誘導

JHH- 1細胞を 10 c mシャーレに 2 X 10⁶細胞ノシャーレとなるように播種した。上皮細胞増殖抑制剤である、 TGF—/?を 2. 5ng/mlとなるように J HH— 1細胞の培養液に添加した。 TGF— 添加前、添加後 3、 6、 1 2、 24、 48時間の全RNAと、通常の培養条件の全 R N Aを回収した。回収した R N Aをノーザンハイプリダイゼ一ションで解析したところ、 TGF— 3添加後、 24時間後に RE I C遺伝子の発現が上昇することが確認され（図 14)、細胞増 ¾t抑制に; E I C遺伝子の発現が関与することが示唆された。

以上の結果から、 RE I C遺伝子の発現を誘導する化合物は、細胞増殖抑制効果が期待できるため、癌治療用候補低分子化合物のスクリーニングに RE I C遺伝子の発現を用いることが有用であると考えられる。

(実施例 15) コスミドべク夕一 pAxCARE I Cの作製

RE I Cの開始コドン前に BamH Iサイトをデザインしたプライマ一（RE

I CS； 5 ' -GGAT CCAGAGCGGAAATGCAGCGG- 3 ' (配列番号 4の塩基番号 190— 206に相当する配列の 5，側に BamH Iサイ卜である GGATCCを繋げた配列））と、終止コドンの後に E c oR Iサイトをデザインしたプライマ一（RE ICA ; 5 ' -GAATT CTAAAT CT CTT C CCCTCCCAG—3' (配列番号 4の塩基番号 1230— 1249に相当する配列のアンチセンス鎖の 5 ' 側に E c oR Iサイトである GAATTC配列を繋げた配列））を設計した。次に、 pT ra c e r/.RE I Cを鍩型にして、 RE I Cのコーディング領域を PCRにより増幅した。 PCR条件は、 94°C30秒、 63°C30秒、 72°C1分を 30サイクルで行った。約 1. lkbの増幅産物をゲルから回収し、 EcoRI、 BamHI消化した後、 pUC 119にサブクロ —ニングした。これを大腸菌 DH 5ひに導入し、アンピシリン耐性クローンから抽出したプラスミドの塩基配列の解析を行い、インサートの配列に変異が入っていないことを確認した（pUC l 19/RE IC；、図 15)。 pUC l 19/RE I Cを E c oR I、 B amH I消ィ匕し、約 1. 1 kbの RE I C断片を回収した。回収した RE I C断片を DNA Blunt ing Ki t (夕カラ社製）を用いて末端を平滑化し、 C AGプロモー夕一が含まれるコスミド（pAxCAwt、図 1 6) の Swa I部位にサブクローニングした。得られたコスミド（pAx C ARE I C、図 1 7)を C l a I消化してィンサー卜の有無を確認した。さらに、 S t u l、 S p e I消化してインサートの向きが 5 ' —プロモー夕一、インサート、ポリ Aシグナルであることを確認した。.

(実施例 1 6) RE I C発現組換えアデノウイルスベクタ一の作製

RE I C発現組換えアデノウイルスべク夕一は、 CO S— TP C法（Mi ya k e, S.， e t a l .， P r o c . Na t l . Ac ad. S c i . USA., 9 3 , 1 3 2 0， 1 9 9 6) に従って作製した。

実施例 1 5で作製した pAxCARE I C ( 8j g) と E c o T 2 2 I処理した COS— TP C (図 1 8) ( 5 /g)とをリン酸カルシウム法にて 2 9 3細胞にトランスフエクシヨンした。 3 7° 5%C0₂条件下で 1 2時間培養した後、細胞を 9 6穴プレートに播種し、さらに 1 0~ 1 5日間培養を続けた。細胞が死減したゥエルから死滅細胞ごと培養液を回収し、凍結融解 6回後、 5， 000 r pm、 5 m i n遠心した上清を 1次ウィルス液として一 8 0°Cにて保存した。 1 次ウィルス液を 2 9 3細胞、 He L a細胞に感染させ、 3日後に He L a細胞では変性が認められず、 2 9 3細胞が完全に死滅したクローンの 2 9 3細胞から死滅細胞ごと培養液を回収し、凍結融解を 6回行った後の上清を 2次ウィルス液として— 80°Cにて保存した。 2次ウィルス液を調製した際の細胞から実施例 1 2 — 1に記載の方法に従って、染色体 DNAを調製した。この DNAを Xh o I、 C l a I消化後、ァガロースゲル電気泳動を行い、アデノウイルスゲノムおよび、 RE I C遺伝子の有無を確認した。

この操作で選択したクローンの 2次ウィルス液から、 2 9 3細胞に感染させ、細胞が死滅したら、死滅細胞ごと培養液を回収し、凍結融解 6回後、 3， 000 r pm、 1 0 mi n遠心した上清を 3次ウィルス液として一 80°Cにて保存した。同様の操作でスケールアップを行い、最終的に 4次ウィルス液を調製し、— 8 0°C にて保存した（Ad e no— RE I C )。 (実施例 17 ) 野生型アデノウィルス混入の有無の確認

実施例 16で得られた 4次ウィルス液を HeLa細胞に感染させ、 3日後に実施例 12— 1に記載の方法に従って、染色体 DN Aを調製した。調製した DNA を鎵型にして、 E 1 A遺伝子の開始コドンから第 1ェクソン 3' 端までを増幅するように設計したプライマーセット（5' — ATGAGACATATTATCT GCCACGGAGGTGTTATTAC— 3，、 5'— CCTCTTCATCC TCGTCGTCACTGGGTGGAAAGCCA-3⁵)を用いて、 25サイクル PCR反応を行った。 PCR後、ァガロースゲル電気泳動を行い、 E 1A遺伝子増幅断片（214 bp) の有無を確認した。

(実施例 18) Adeno— RE I Cの遺伝子導入効率の確認

TCID₅。（50% Ti ssue Cul ture inf ect i ous Dose)法により Adeno— RE I Cの力価を測定した。実施例 16で調製した Ad e no— RE I Cを 10倍ずつ段階希釈し、 10⁴倍希釈ウィルス液を用意した。 96ゥエルプレートの 1列目に 10⁴倍希釈ウィルス液を移した後、 11列目まで 3ⁿ希釈を行い、最終的に 10⁴から 3¹¹希釈ウィルス液を調製した。 12列目は非感染細胞のコントロールとした。 3 X 10⁴細胞/ゥエルとなるように 293細胞を播種後、 11〜13日間、 37°C、 5 % C 0₂条件下で培養し、細胞変性の有無を判定した。 K a r b e rの式を用いて統計学的に T C I D₅₀を計算した結果、前記 Ad e no— RE I Cの力価は 6. 6 x 10⁹pf u/ml であることを確認した。

産業上の利用可能性

以上説明したように、本発明に係る遺伝子およびそれがコードする本発明に係るタンパク質はいずれも、癌細胞を含む不死化細胞で発現が低下、または消失しているので、これらの細胞の増殖が原因である疾病の診断に有効なマーカーとなり、癌診断薬等の診断薬として用いることができる。

また、本発明に係るタンパク質は、細胞増殖抑制活性を有するので、癌等の細胞の異常増殖が原因となる疾病の治療に有用である。

さらに、本発明に係る遺伝子は、細胞増殖抑制活性を有する前記タンパク質を細胞内で発現するので、遺伝子療法に応用して、癌等の細胞の異常増殖が原因となる疾病の治療に用いることができる。

加えて、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞増殖を刺激するので、細胞の増殖を必要とする疾病の治療に用いることができる。

Claims

請求の範囲

1. 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列における一若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列からなり、且つ細胞増殖抑制活性を有するタンパク質。

2. 配列表の配列番号 2に記載の D N A配列、配列表の配列番号 3に記載の D N A配列、および配列表の配列番号 4に記載の D N A配列からなる群より選ばれる DNA配列において一若しくは複数の DNAを置換、欠失、または付加してなる D N A配列からなり、且つ細胞増殖抑制活性を有するポリヌクレオチド。

3. 配列表の配列番号 2に記載の D N A配列、配列表の配列番号 3に記載の D N A配列、および配列表の配列番号 4に記載の D N A配列からなる群より選ばれる DN A配列がコードする RNA。

4. 配列表の配列番号 2に記載の D N A配列、配列表の配列番号 3に記載の D N A配列、および配列表の配列番号 4に記載の DNA配列からなる群より選ばれる DNA配列からなる DNAのアンチセンス DNA、またはその誘導体を含むァンチセンスポリヌクレオチド。

5. 請求項 3に記載の RNAのアンチセンス RN Aを含むアンチセンスポリヌクレオチド。

6. 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質からなることを特徴とする細胞増殖抑制剤。

7. 配列表の配列番号 2に記載の DNA配列を含むポリヌクレオチドからなることを特徴とする細胞増殖抑制剤。

8. 配列表の配列番号 3に記載の D N A配列を含むポリヌクレオチドからなることを特徴とする細胞増殖抑制剤。

9. 配列表の配列番号 4に記載の D N A配列を含むポリヌクレオチドからなることを特徴とする細胞増殖抑制剤。

10. 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質からなることを特徴とする癌治療剤。

1 1 . 配列表の配列番号 2に記載の D N A配列を含むポリヌクレオチドからなることを特徴とする癌治療剤。

1 2 . 配列表の配列番号 3に記載の D N A配列を含むポリヌクレオチドからなることを特徴とする癌治療剤。

1 3 . 配列表の配列番号 4に記載の D N A配列を含むポリヌクレオチドからなることを特徴とする癌治療剤。

1 4 . 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をマーカーとして用いることを特徴とする癌診断薬。

1 5 . 請求項 1に記載の夕ンパク質をマーカーとして用いることを特徴とする

1 6 . 配列表の配列番号 2に記載の D N A配列、配列表の配列番号 3に記載の D N A配列、および配列表の配列番号 4に記載の D N A配列からなる群より選ばれる D N A配列を含むポリヌクレオチドをマ一力一として用いることを特徴とする癌診断薬。

1 7 . 配列表の配列番号 2に記載の D A配列、配列表の配列番号 3に記載の D NA配列、および配列表の配列番号 4に記載の D N A配列からなる群より選ばれる D N A配列を含むポリヌクレオチドを治療遺伝子として含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物。

1 8 . 前記治療遺伝子がウィルスベクターに含まれることを特徴とする、請求項 1 7に記載の遺伝子治療用組成物。

1 9 . 前記ウィルスベクターがアデノウイルスベクターであることを特徴とする、請求項 1 8に記載の遺伝子治療用組成物。