WO2001029550A1

WO2001029550A1 - Puce detecteur de genes, detecteur et methode de detection

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Publication number: WO2001029550A1
Application number: PCT/JP2000/007342
Authority: WO
Inventors: Shigeori Takenaka; Kazuhiko Uchida; Takatoshi Miyahara
Original assignee: Shigeori Takenaka; Kazuhiko Uchida; Takatoshi Miyahara
Priority date: 1999-10-20
Filing date: 2000-10-20
Publication date: 2001-04-26
Also published as: ATE408141T1; CN1223851C; EP1146331A4; EP1146331B1; AU7952700A; KR20010099859A; EP1146331A1; US6916614B1; DE60040205D1; CN1341211A

Description

明細書遺伝子の検出用チップ、検出装置、並びに検出方法技術分野

本発明は、遺伝子の塩基配列のほか、遺伝子 DNAの一塩基置換 SNP (シングル 'ヌクレオチド 'ポリモフイズム：人の遺伝コ一ド中の変種）、数塩基置換、点突然変異、遺伝子の欠損等の遺伝子の異常を検出し解析可能とする遺伝子の検出用チップ、検出装置、並びに検出方法に関する。背景技術

一塩基置換 SNPとは、ヒト DNAの l O O Obpから 2000bpに 1つあると言われている塩基配列の一塩基変化であり、正常人、病気の人問わず人には十万から数百万の SNPがあると考えられており、病因の解明、予防に有効なマ一力一と期待されている。

数塩基置換とは、遺伝子の塩基配列の数塩基変化である。

点突然変異とは、すでに既知である遺伝子における塩基配列の一塩基の変化であり、これにより翻訳されるタンパク質の機能異常がみられ、疾患の原因になる場合がある。

遺伝子の転座とは、塩基配列の順序が一部逆さまになるものであり、疾患の原因となる場合がある。

遺伝子の欠損とは、塩基配列の一部が欠乏したものであり、疾患の原因となる場合がある。

遺伝子の増幅とは、塩基配列の一部が重複したものであり、疾患の原因となる場合がある。

トリプレットリピートとは、 3塩基対がリピートして伸長するものであり、疾患の原因となる場合がある。

遺伝子 DN Aの塩基配列の違いを検出、解析する手段としては、 DNAシーケンス法（塩基配列決定法）、 PCR— S SCP (Polymerase chain reaction -single stranded polymorphism)法、ァレゾレ特異的ノヽィフ、 'リダイセ'——シヨン法、 DN Aチップ法等が用いられている。

DNAシーケンス法は、マキサム 'ギルバート法とサンガ一（ダイデォキシ）法があるが、現在は主にダイデォキシ法が用いられている。ヒトの遺伝子の解析したい領域を PCR法（ポリミラーゼ連鎖反応法）で増幅したのち、 PCR法で用いたプライマー若しくは増幅 DN A内に設定したプライマーを用いてシ一ケンスを行い、当領域内の遺伝子配列を決定する。

P CR— S ^ C P ( Polymerase chain reaction― single stranded polymorphism)法はヒトの遺伝子の解析したい領域を P CR法で増幅した後、熱変性で一本鎖にし、これを非変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行うことで、 PCR法で増幅した 2本鎖 DN Aのそれそれの鎖に 2次構造（分子内水素結合）を形成させる。一塩基配列の違いによってとる 2次構造（分子内水素結合）がことなるため、電気泳動距離の違いによって遺伝子の一塩基置換 SNPと点突然変異等を検出する。

アレル特異的ハイブリダィゼ一シヨン法では、解析したい領域を PC R法で増幅した後、メンブレン（ナイロンフィルター）の領域内に 20塩基程度の PC R 産物もしくはオリゴヌクレオチドプローブを作成し、そこに放射性同位元素 32 Pなどで標識したサンプル DNA (被検出 DNA) をハイブリダィゼーシヨンさせるものである。その際の温度等のハイブリダィゼ一シヨン条件を調節することで、遺伝子の一塩基性 SNPと点突然変異を放射性同位元素の強度の差で検出する ο

D N Aチップ法は、原理的にはアレル特異的ハイブリダイゼーション法とほぼ同じであるが、 20塩基程度の PC R産物もしくはオリゴヌクレオチドプローブを固定相（基盤上）に並べ、そこに蛍光標識したサンプル DNA (被検出 DN A) をハイブリダィゼーシヨンさせるものである。温度等のハイブリダィゼーシヨン条件を調節することで、ヒ卜の遺伝子の一塩基置換 SNP等を蛍光強度の差によって検出するものである。

アレル特異的ハイプリダイゼ一ション法におけるハイプリダイゼーションの場合は、 DN Aを放射性同位元素で標識するために、放射性同位元素の取り扱いと管理に多大な費用が有することが問題である。又、 DNAチヅプ法の場合は、蛍光色素で標識すると、蛍光色素の大きな分子構造のために十分な頻度で蛍光が D NAにとりこまれないために、蛍光標識プローブの蛍光強度が高くないこと、さらに蛍光の退色及びガラス等の基盤の有する蛍光（背景部分の蛍光）が問題になる。

このような問題点を解決するために、 DNAハイプリヅド形成の検出、二本鎖 DN Aを検出する簡単で感度の優れた方法として、プローブ DNAを電極に固定し、このプローブ DNAを、インターカレー夕存在下においてサンプル DNAと反応させて、二本鎖 DNAの検出、ハイブリッド形成体の検出を電気化学的に行う方法が開示されている（特開平 9一 288080号公報及び第 57回分析化学討論会予稿集、 P 137— 138、 1996年、参照）。

しかしながら、遺伝子の一塩基置換 S N Pや遺伝子の突然変異等の数は莫大であり、例えばヒトの場合 15KBの密度（解像度）の一塩基置換 SNP地図を作成するためには、すくなくとも 200万の一塩基置換 SNPを同定しなければならない。又、既知の疾患に関係する遺伝子の点突然変異の数もきわめて多い。一塩基置換や点突然変異を網羅的に解析することは従来の方法では現実的に不可能に近い。

本発明は、上記従来の問題点を解決することを目的とするものであり、複数のサンプル DN Aを対象に、大量の遺伝子を検出、解析することが可能な、すなわちハイスループット（高速大量）の処理ができ、しかも高感度に検出と解析が可能な遺伝子の同定装置を提供する。要するに、本発明は、特開平 9一 28808 0号公報に記載された二本鎖 DN Aの検出、ハイプリッド形成体の検出を電気化学的に行う原理に基づいて、大量かつ高感度な遺伝子の検出 ·解析装置として実現しようとするものである。

さらに、本発明は、実際の検出等の作業において、取り扱いが簡単で、作業しやすい、遺伝子の検出方法、検出装置及び検出用チップを実現しょうとするものである。発明の開示本発明は、上記課題を解決するために、測定極である複数のピン電極を有し、前記ビン電極と前記ピン電極の対極である共通電極との間に電圧を印加し、電流を検出することが可能であることを特徴とする、遺伝子の検出用チップを提供する。

本発明ではアレイ状に複数配列されたピン電極を用いているので、大量の遺伝子を同時に解析することができる。

また、ピン先端部および側面部に遺伝子を固定することができ、固定する面積を多く取ることができるという利点がある。

また、平面電極上に遺伝子を分注する場合では平面電極の表面に凹凸があると均一に固定することができないのに比べて、ビン電極を遺伝子を含む液体の中に挿入することにより固定するので、ビン電極の表面に凹凸があっても均一に一定量の遺伝子を固定することができるという利点もある。一定量の遺伝子を固定できることにより、定量分析する上で精度 ·感度が高まる。

さらに、本発明では、遺伝子を含む液体を分注する操作が不要であり、操作が簡便であるという利点もある。

本発明では、ビン電極に固定されたプローブ遺伝子とサンプル D N Aとのハイブリダィゼ一シヨンにより検出を行った後に、サンプル D N Aを除去して、再度別のサンプル D N Aをハイブリダ一ゼ一シヨンさせることができるので、繰り返してチップを使用することができる。あるいは、プローブ遺伝子を除去する処理を行い、再度別のプローブ遺伝子をビン電極に固定することができるので、異なる検出用途にて繰り返してチップを使用することができる。

本発明における検出用チップは、さらに、前記ビン電極の対極であって前記ビン電極と接触しないように配置された共通電極を有していてもよい。

本発明における検出用チップは、さらに前記ビンを受容し得るとともに、サンプル D N Aを充填し得る窪みを有していてもよい。

前記ビン電極には、異なる遺伝子配列を有する遺伝子がそれそれ固定されて t、てもよい。

前記ピン電極には、異なる遺伝子配列を有する複数の P C R産物、オリゴヌクレオチド、 mR N A、 c D N A、 P N A (peptidic nucleic acid) 、または L N A (locked nucleic acid) が固定されていてもよい。

本発明に係る他の検出用チップは、前記ピン電極には、同一の遺伝子配列を有する遺伝子がそれそれ固定されていてもよい。

前記ビン電極には、同一の遺伝子配列を有する P C R産物、オリゴヌクレオチド、 mR N A、 c D N A、 P N A (peptidic nucleic acid) 、または L N A (locked nucleic acid； Proligo LLC社商標）が固定されていてもよい。当該検出用チップは、さらに前記ビン電極をそれそれ受容し得るとともに、サンプル D NAを充填し得る複数の窪みを有してなり、当該複数の窪みに異なるサンプル D NAをそれそれ充填し得るようにしてもよい。

前記遺伝子の検出用チップは、例えば、遺伝子の塩基配列、一塩基置換 S N P、数塩基置換、点突然変異、転座、欠損、増幅、またはトリプレットリビートを検出するのに有用である。

前記ビン電極は、表面に金がメツキされていてもよい。

前記ビン電極は、表面の一部が樹脂でコーティングされていてもよい。

前記樹脂は、 P E E K (ポリエーテルエ一テルケトン）または P T F E (ポリテトラフルォロエチレン）であってもよい。

前記遺伝子の検出用チップは、さらにビン電極を支持する支持部材を有してなり、前記ピン電極は、当該支持部材上に突設されていてもよい。

ここで突設とは、ピン電極が支持部材を土台として支持部材から突出するように配置されていることを意味する。

前記ビン電極は、前記支持部材上にスポット電極を介して突設されていてもよい。

スポット電極とは、支持部材上にスポット上に配置された電極を意味する。前記遺伝子の検出用チップは、さらにピン電極を支持する支持部材を有してなり、前記ピン電極の一の端部が、当該支持部材上に植設されていてもよい。

ここで植設とは、ピン電極の一の端部が支持部材に設けられた凹部に嵌合され、ビン電極が支持部材から突出するように配置されていることを意味する。

前記支持部材は回路基板であってもよい。

前記ピン電極は、前記支持部材上に接触または植設されている端部がエポキシ樹脂または P T F Eにより包囲され支持部材上に固定されていてもよい。

前記ピン電極においては、前記支持部材上に接触または植設されている端部ではない側の端部にのみ遺伝子が固定されていても、あるいは、ビン電極の全体にわたり遺伝子が固定されていてもよい。

ビン電極の表面の所定の場所に樹脂コ一ティングをすることにより、コーティングされず露出している部分にのみ遺伝子が固定されるようにしてもよい。前記遺伝子の検出用チップが内部に空隙を有してなり、前記ビン電極は、当該空隙内へ突出するように前記支持部材上に設けられ、前記共通電極の一部または全部が当該空隙内に露出していてもよい。

チップに当該空隙内へ通じる注入口を設けて、当該空隙内へサンプル遺伝子や電解質等を注入 ·排出できるようにしてもよい。

前記遺伝子の検出用チップは、本体部と当該本体部と結合し得るフレーム部とを有しており、前記本体部は、その内側面に前記ビン電極を有し、前記フレーム部は、その内側面に、当該本体部と結合した際に前記ビン電極を受容し得るとともにサンプル D N Aを充填し得る窪みを有していてもよい。

前記本体部と前記フレーム部とは着脱自在であってもよい。

本体部とフレーム部とを着脱自在に結合する構成としては、本体部またはフレームのいずれか一方に凸部を設け他方に凹部を設け当該凸部と凹部とを係合できるようにした構成や、両者をクリップやクランプで止める構成や、一方を他方に対してスライドさせながら嵌着させる構成や、磁石により互いに吸着させる構成など、公知の方法が適宜採用され得る。

本発明は、上記課題を解決するために、互いに着脱自在な本体部とフレーム部とを有する遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出用チップであって、前記本体部は、その内側面にマトリックス状に配列されて突出した測定極である多数のビン電極を有し、前記フレーム部は、その内側面に、前記本体部を装着した際に前記多数のピン電極を受け入れることができるとともに、サンプル D N Aを充填することのできる窪みを有し、前記窪みには前記ピン電極と接触しないように配置された対極である共通電極が配設されており、前記ピン電極は、異なる遺伝子配列から成る P C R産物もしくはオリゴヌクレオチドが固定されており、前記共通電極と前記ビン電極間に電圧が印加され、電流が検出されることが可能であることを待徴とする追伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出用チップを提供する。

なお、本発明においてマトリックス状とは、多数のピン電極が互いに平行になるように所定の面から突出するように配列されている状態を意味する。

上記ピン電極は、夫々マトリックス状に多数配列され、異なる遺伝子配列から成る P C R産物もしくはォリゴヌクレオチドを収容する収容部の各々に、揷入されることにより、上記異なる遺伝子配列から成る P C R産物もしくはオリゴヌクレオチドが固定されているものとしてもよい。

上記検出用チップは、遺伝子診断用であってもよい。本発明の検出用チップを用いて遺伝子診断することにより、筋ジストロフィー、血友病、フエ二ルケトン尿症等の単一遺伝子病、糖尿病、がん、高血圧、心筋梗塞、肥満症等の多因子遺伝子病に関する遺伝子を持っているか否かを診断したり、発症前の遺伝子を診断したり、適切な治療法や薬を選択するための判断材料にすることができる。又、本発明は、上記課題を解決するために、前記遺伝子の検出用チップ、ならびに該検出チップを装入及び取り出し可能な測定装置を有する遺伝子の検出装置を提供する。

上記検出用チップにおいては、温度制御手段として、ベルチェ素子を用いて温度をコントロール可能としてもよい。

さらに、本発明は、上記課題を解決するために、前記遺伝子の検出用チップを用いた検出方法であって、前記窪み内に、サンプル D N A又はサンプル D N A から遺伝子増幅された D N Aを充填し、ハイブリダィゼーシヨンを行わせて二本鎖を形成し、その後、前記サンプル D NA又はサンプル D NAから遺伝子増幅された D N Aを前記窪みから除去し洗浄してから、前記窪み内に、電気化学活性分子を含む電解質を充填して、前記二本鎖に前記電気化学活性分子を結合させ、そして、前記共通電極と前記ピン電極間に電圧を印加して流れる電流値を検出することを特徴とする検出方法を提供する。

あるいは、前記遺伝子の検出用チップを用いた検出方法であって、前記窪み内に、サンプル D N A又はサンプル D N Aから遺伝子増幅された D N Aと、電気化学活性分子を含む電解質とを充填し、ハイプリダイゼ一シヨンを行わせて二本鎖を形成しながら、前記二本鎖に前記電気化学活性分子を結合させ、そして、前記共通電極と前記ピン電極間に電圧を印加して流れる電流値を検出することを特徴とする、検出方法を提供する。

このように、前記チヅプを用いて、ハイブリダィゼ一シヨンをした後に電気化学活性分子を結合させたり、あるいは、電気化学活性分子の存在下にハイブリダィゼーシヨンを行わせることにより、大量の遺伝子を同時にかつ極めて高精度 · 高感度に、極めて簡便な操作で解析することができる。

前記検出方法においては、温度をコントロールしながら前記二本鎖に前記電気化学活性分子を結合させるようにしてもよい。

前記電気化学活性分子を含む電解質は、フエ口セン、カテコールアミン、金属ビビリジン錯体、金属フエナンスリン錯体、ピオ口一ゲン、またはこれら化合物を導入した縫い込み型ィンターカレー夕を有効成分とするものであってもよい。特に好ましくは、フエ口セン縫い込み型インターカレ一夕である。

特に好ましくは、フエ口セン縫い込み型イン夕一カレ一夕である。

前記電気化学活性分子を含む電解質としては、上記の他に、ェチジュゥム、ェチジュゥムブロマイド、ァクリジン、アミノアクリジン、ァクリジンオレンジ、プロフラビン、エリブチシン、ァクチノマイシン D、ド一ノマイシン、マイ卜マイシン C、トリス（フエナント口リン）亜鉛錯体、トリス（フエナント口リン）ルテニユウム錯体、トリス（フエナン卜口リン）コバルト錯体、ジ（フエナント口リン）亜鉛錯体、ジ（フエナント口リン）ルテニユウム錯体、ジ（フエナント口リン）コバルト錯体、ビビリジンプラチナ錯体、夕一ビリジンプラチナ錯体、フエナント口リンプラチナ錯体、トリス（ビビリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニユウム錯体、トリス（ビビリジル）コバルト錯体、ジ（ビビリジノレ）亜鉛錯体、ジ（ビビリジル）ルテニユウム錯体、ジ（ビビリジル）コバルト錯体を有効成分としてもよい。図面の簡単な説明

図 1は、本発明に係る遺伝子の検出装置の全体構成を説明する斜視図である。図 2は、本発明に係る遺伝子の検出用チップの全体構成を説明する斜視図である。

図 3 (a) は図 2 (c) の A— A断面図、図 3 (b) は図 3 (a) の要部拡大図、図 3 (c) 〜（e) は、ビン電極を回路基板に設けるいろいろな構造を示している。

図 4は、本発明に係る遺伝子の検出装置及び検出用チップの電極、配線等の構成を説明するための図である。

図 5は、図 2の検出用チップの断面図及びその要部拡大図である。

図 6は、本発明に係る遺伝子の検出用チップの使用状態を説明する斜視図である。

図 7は、実験例 3の測定結果である。

図 8は、実験例 4の測定結果である。発明を実施するための最良の形態

本発明に係る遺伝子の検出方法、並びに検出装置及び検出用チップの実施の形態を図面を参照しながら以下に説明する。なお、図面は本発明の一実施の形態にすぎず、これに限定されるものではない。

図 1において、本発明に係る遺伝子の検出装置 1は、検出用チップ 2と、この検出用チップ 2を差し込み可能な装入口 29を有し、ハイブリダィゼーシヨンにより生じる二本鎖 DNAを検出し解析可能とする測定装置 3と、パソコン 35とから構成される。

図 2は、検出用チップ 2の構造を示す図であり、図 2 (a) は、検出用チップ 2の全体斜視図を示しており、これは、カードあるいはカセット状のチップとして形成されている。図 2 (b) に分解斜視図として示すように、検出用チップ 2 は、セラミックスや合成樹脂材等により形成されたフレーム 4と、該フレーム 4 に着脱可能に装着される本体部 5とから構成される。

フレーム 4に対して本体部 5を着脱自在に結合する構成は、例えば、互いに弾性的に嵌合する凹凸をフレーム 4と本体部 5の当接面に夫々形成することにより可能である。本実施例では、図 2 (b) 、（c) 、図 3 (a) 、図 5 (a) に示すように、本体部 5およびフレーム 4に、ピン電極の配列を避けた箇所にそれそれ凸部 6および凹部 7を設け着脱可能とした。

フレーム 4と本体部 5とを互いに着脱自在に結合する構成としては、両者をクリップやクランプで止めたり、磁石により互いに吸着させたり、公知の方法が適宜採用され得る。

フレーム 4のほぼ中央には、矩形の窪み 8が形成されている。この窪み 8の周囲には、シール 9が付設されている。この窪み 8内には後述するように、溶液 (サンプル DNA、縫い込み式イン夕一カレー夕、洗浄液等）を充填することができ、本体部 5をフレーム 4に装着することにより封止される。又、本体部 5をフレーム 4からはずすことにより、窪み 8内の溶液の交換や混合、洗浄等を迅速に行うことができる。

一方、本体部 5には、図 2 (c) に示すように、フレーム 4の窪み 8に対応する領域に、多数のビン電極 10が均等に突設されている。ピン電極 10の突出長さは、本体部 5をフレーム 4に装着した際、窪み 8内に収まる長さである。

図 3 (a) は、図 2 (c) の A— A断面を示す図であり、本体部 5の構成と、ビン電極 10の突設されている状態を示している。本体部 5は、内側壁 11と外側壁 12との間に回路基板 13が設けられて構成される。回路基板 13の端部が露出し、当該露出部分にビン電極用のターミナル端子 20および共通電極用の夕 —ミナル端子（図 4において示す 27) が設けられている。また、回路基板 13 には配線（図 4において示す 21、 22、 23) 等を含む回路が形成されている _c 図 3 (a)、 (b) に示すように、ビン電極 10は、回路基板 13から内側壁 11を貫通して突出するように構成される。

ビン電極 10は、図 3 (c) に示すように、外側壁 12から回路基板 13及び内側壁 1 1を貫通して突出するように構成されてもよい。

ピン電極 10は、図 3 (d) に示すように、本体部 5を、基台 14上に回路基板 13を設け、その上にピン電極 10を突設するような構成としてもよい。

あるいは、図 3 (e) に示すように、予め回路基板 13上に多数のスポヅト電極 15を蒸着して、多数のスポット電極 15を形成しておき、ビン電極 10をこのスポット電極 15上に電気的に接触した状態で突設してもよい。ピン電極 10の表面には、図 6 (b) でその拡大図を示すように、 PCR産物、オリゴヌクレオチドの 5，末端にチオール化して SH基を導入した SH化オリゴヌクレオチド 16が固定されている。 P CR産物は二本鎖 DNAであるが、一方の鎖の 5，末端をチオール化し、 SH基を導入してあるこのオリゴヌクレオチドは、 20〜50塩基含む長さを有し、その基端に導入したチオール基を介してピン電極 10上に固定されている。

このオリゴヌクレオチドの固定は、図 6 (a) に示すように、ビン電極 10を、ビン電極 10と同じピッチ配列された DNA収容部 18を有するマイクロブレート 17の各収容部 18内に、挿入することにより、同時に種類の異なる DN Aを同時に修飾して行うことが可能である。ビン電極 10の表面は金がメツキされており、金に SH基を介して SH化オリゴヌクレオチド 16を固定する手法は公知である。

ビン電極の表面に金メツキをする前の前処理方法や SH—金結合に関しては、例えば J.Am. Chem.Soc 111号 P321〜 1989年 C. D. Bain著や、 Anal. Chem. 70号 P2396〜1998年 JJ. Gooding著に記載がある。なお、プローブ遺伝子の除去は、 J.Am. Chem.Soc 111号 P321〜 1989年 C. D. Bain著に記載の方法等で行う。

多数のビン電極 10は、回路基板 13の上に設けられ、電気的にも回路基板の一部となるように構成されている。そして、図 2 (c) に示すように、本体部 5 の先端部には、ターミナル端子 20、 27が並設されている。

図 4 (a) 、図 3 (a) 、 (b) に示すように、ピン電極 10は、夫々回路基板上の配線 2 1に接続され、該配線 21の他端はターミナル端子 20とそれそれ独立して接続されている。

図 4は、遺伝子の電気検出回路を示すものであり、図 4 (a) に示すように、ビン電極 10に対する己線 21は、ビン電極 10それそれに対応して一本づっ接続してそれそれ夕一ミナル端子 20に接続してもよいが、図 4 (b) に示すように、 T FTからなるスィヅチング素子を設けたアクティブマトリヅクス型の TF T液晶表示装置等のマトリックス電極のように、多数の縦及び横の導線 22、 2 3から成るマトリックス配線の交差部で、夫々マトリックス配線の導線 22、 2 3とビン電極 1 0が F E T (電界効果型トランジスタ） 2 4を介して接続するような構成としてもよい。このような構成とすると、縦及び横の導線 2 2、 2 3が走査され、選択された T F Tが 0 Nし特定のビン電極が夕一ミナル端子に電気的に接続されるようになる。

本実施例では、さらに、図 4で示す共通電極 2 5を有する。図 4で示す共通電極は、あくまでも回路構成を説明するために模式的に記載しているものであり、実際は、窪み 8に配設されることが好ましい。例えば、共通電極 2 5は、図 5 ( a ) に示すように、窪み 8の底面の一部（例えば周縁等）又は全面、或いは窪み 8の底面近くの内周側面等に、ビン電極 1 0の対極として配設されている。そして、共通電極 2 5は、ビン電極 1 0と接しない位置に設けられている。共通電極 2 0は、本体部 5をフレーム 4に装着すると、図 5 ( b ) に拡大図で示すように、本体部 5の共通電極用の端子 2 6と接触するように構成されている。そして、この共通電極用の端子 2 6は、共通電極用ターミナル端子 2 7に配線 2 8を介して接続されている。

なお、それそれのビン電極 1 0と対極である共通電極 2 5の間の電流値は、窪み 8内の空間に後述する電解質溶液を充填した場合にこの電解質溶液に接するように配線された参照電極（図示せず）の値を基準に測定され、測定ごとに正確な電流値が得られる構造としてもよい。

測定装置における検出用チップの装入口（図 1 の 2 9 ) の内部には、図 4 ( c ) で示すように、共通電極用ターミナル端子 2 7及び各ビン電極用ターミナル端子 2 0に接続して、共通電極用ターミナル端子 2 7及び各ピン電極用ターミナル端子 2 0間に電圧を印加する回路 3 0が配設されている。

そして、共通電極用ターミナル端子 2 7と各ビン電極用ターミナル端子 2 0間に電圧 Eが印加された際に、共通電極 2 5と各ビン電極 1 0の間に流れる電流を、回路 3 0に設けられた検出器 3 1で検出して測定できるような構成とされている。なお、ビン電極 1 0のターミナル端子 2 0を選択的に接続するためには、測定装置 3には、検出用チップ 2を装入口 2 9から差し込んだ場合に、各ピン電極用ターミナル端子 2 0と接続するための受け端子 3 2と、受け端子 3 2を回路 3 0 に選択的に接続するための走査端子 3 3とが設けられている。この検出した電流に基づく測定データは、検出器 3 1に接続する A— D変換器 34等でデジタル化され、パソコン 35によりサンプル DN Aの解析、同定等の処理データとして利用される。

さらに、測定装置 3には、ペルチェ素子から成る温度コントロール装置（図示せず）が装備されている。この温度コントロール装置により、後述するハイプリダイゼ一シヨンの温度条件をコントロールすることができる。

以上のような構成から成る本発明に係る検出装置 1の作用について説明する。図 6 (a) は、ビン電極 10と同じビヅチで収容部 18がアレイ状に配列されたマイクロプレート 17である。このマイクロプレート 17の各収容部 18内に、種類の同じ又は異なる DNAを収容しておく。

そして、図 6 (a) に示すように、検出用チップ 2の本体部 5の多数の電極ピン 10を、夫々収容部 18に挿入する。これにより、図 6 (b) にその一部拡大図を示すように、夫々の電極ビン 10に種類の同じ又は異なる DNAを修飾することができる。

一方、フレーム 4の窪み 8内にサンプル DN A溶液を注入し充填する。そして、この窪み 8内に、上記 DN Aの修飾された多数のビン電極 10を挿入するように、本体部 5をフレーム 4に、凸部と凹部を係合して装着する。すると、窪み 8内はシール 9で封止され、共通電極 25は、本体部 5の共通電極用の端子 26と接触する。

なお、サンプル DNAは、生物材料から抽出した DNAを、 DNA分解酵素もしくは超音波処理で分解したもの、又は特定の遺伝子から PCR (ポリメラーゼ連鎖反応法）によって増帽した DNAを用いる。これらのサンプル DNAは、ノ、イブリダィゼーションの直前に熱処理によって変性しておく。

ビン電極に固定された P C R産物もしくはオリゴヌクレオチドの D N A (—本鎖の体態）にサンプル DN A (—本鎖の状態）が添加されると、互いに相補的な塩基配列を持つ P CR産物もしくはオリゴヌクレオチドの DNAとサンプル DN Aは、ハイブリダィゼ一シヨンが行われる。

このハイブリダイゼ一ションの際、検出用チップ 2を測定装置 3内の装入口 2 9に装入して装着し、測定装置 3内に装備されたペルチェ素子から成る温度コントロール装置により、ハイブリダィゼーシヨンの温度条件をコントロールする。このハイブリダイゼ一ションが行われた後、検出用チヅプ 2を測定装置 3から抜いて、本体部 5をフレーム 4から外す。そして、窪み 8内のサンプル D N A溶液を除去して、窪み 8内に洗浄液を注入し、ハイブリダィゼ一シヨンしなかったサンプル D N Aを洗い流して洗浄する。

このような洗浄を行った後に、電気化学活性分子を含む電解質溶液を窪み 8内に充填し、本体部 5をフレーム 4に装着する。電気化学活性分子は、ハイブリダィゼーシヨンにより二本鎖 D N Aの抵抗値等の電気的特性を変化させる機能を奏する。この点については、特開平 9一 2 8 8 0 8 0号公報に詳細に説明されている。

このような処理を行った検出用チップ 2を測定装置 3に再度装着し、検出用チヅプ 2の共通電極用ターミナル端子 2 7及び各ビン電極用ターミナル端子 2 0を、測定装置の受け端子 3 2に接続し、選択スィツチを介して電圧回路 3 0に接続し、共通電極 2 5と各ビン電極 1 0の間に弱い電圧をかけると、ハイブリダィゼ一シヨンにより生じた二本鎖 D N Aと接続されたピン電極 1 0には、電圧回路 3 0及び共通電極 2 5を通して微弱電流が流れる。測定装置 3内に装備されたペルチェ素子により温度をコントロールし、異なる温度での電流値を測定する。

測定装置 3では、図 4 ( c ) に示すように、各ビン電極用ターミナル端子 2 0 及び受け端子 3 2に対して走査端子 3 3を切り替える（切り替えは、自動又は手動で行うことが可能であるが、その構成はこの発明の要旨ではないので説明は省略する。）ことにより、順次ハイブリダィゼ一シヨンの後の二本鎖 D N Aに電流が流れて、検出器 3 1で検出される。

この検出結果が、 A— D変換器 3 4によりデジタルデータに変換されて、パソコン 3 5で測定データとしてメモリ等に蓄積される。この測定データにより、サンプル D N Aの同定や解析が行われる。例えば、予め蓄績されている各種類の D N Aデータ等と比較することにより、サンプル D N Aの解析や同定が可能となる。次に本発明に係わる遺伝子の電気化学的検出装置の実験例を説明する。

(実験例 1 )

遺伝子 p53の 72番目のコドンにおける一塩基置換 S N Pの検出の実験例を示す。以下の 2種類のポリモルフィズム（遺伝的多型）に相当する塩基配列をもつオリゴヌクレオチドをビン電極 10それそれにスポッ卜することにより固定化した。

p53Pro (コドン 72番目が Pro)

p53Arg (コドン 72番目が Arg)

これに p53のコドン 72番目が Proであるの正常人の未梢血から採取した DN A、及びこの DN Aから p53のェキソン 4に存在するコドン 72 を含む領域を増幅した P C R産物を熱変性後ノ、イブリダィゼ一シヨン反応を行つた。測定用電解質溶液（0.1M AcOH-AcO (pH5.6) ， 0.1 KC1, 0.05mM NFc) 中で 20 度で 470m V (Ag/AgCl 参照電極基準）のハイプリダイゼ一シヨン前後の電流値変化を測定した。

末梢血から採取した DN A

p53Proの電流変化 ( ) 52%

p53Argの電流変化（％) 15%

P CR産物

p53Proの電流変化 (%) 65%

p53Argの電流変化（％) 13%

さらに p53のコドン 72番目が Argである正常人の末梢血から採取した DNA、及びこの DN Aから p53のェキソン 4に存在するコドン 72を含む領域を増幅した P CR産物を同様にハイプリダイゼーシヨン反応を行った。

末梢血から採取した DN A

p53Proの電流変化 (%) 46%

P53Argの電流変化（％) 17%

P CR産物

p53Proの電流変化 (%) 53%

p53Argの電流変化（％) 11%

これらの電流変化は、完全にマッチした塩基配列の場合とミスマツチの場合では明らかな差が認められた。

(実験例 2) 塩基置換の数によって測定する電流値が異なり、これによりミスマッチの量が測定できることを示した実験例を説明する。 dT20 , dT10dAdT9， dT8dA4dT8， dAdT19, dA3dT17, dT19dA, dT17dA3 の 7種のオリゴヌクレオチドをビン電極 1 0それそれにスポットすることにより固定化した。これに dA20 をハイブリダィゼーション反応を亍った。

これを、測定電解質用溶液（0.1M AcOH-AcOK (pH5.6) 、 0.1M KC1, 0.05mM NFc) 中で 20度で 470m V (Ag/AgCl参照電極基準）のハイブリダィゼーシヨン前後の電流値変化を測定した。

この測定結果を表 1に示す。

表 1

表 1における電流変化は、ほぼミスマッチ塩基の量に依存した変化であった。特に末端部にミスマッチが存在する場合は、 Tm値より大きな変化が見られた。従来の S S CPでは、このような系は検出できなかったが本手法で初めて明らかとなつた。

(実験例 3)

mRNA発現量の定量について実験例を示す。大腸菌ラクトースォペロン上の 1 ac z遺伝子上に存在するユニーク配列 40量体（高次構造を形成しないように設計している）のオリゴヌクレオチドの 5，末端にチオール基（HS) を導入したものを、ビン電極 10のそれそれに固定化した（HS_ml ： 60 f m o 1 ) o

また、異なった発現量の mRNAを含む大腸菌からの mRNA抽出液をタイ夕一プレート上の異なったゥエルに入れた。このタイ夕一プレートのゥエルに先に調製したビン電極 10を浸し、 2 xS SC、室温、 1時間の条件下でハイブリダィゼーシヨン反応を行った。これを、測定用電解質溶液（0.1M AcOH-AcOK (pH5.6) , 0.1M KC1, 0.05mM NFc) 中で 20度で 470mV (Ag/AgCl参照電極基準）のハイプリダイゼーシヨン前後の電流値変化を測定した。

得られた測定結果を図 7に示す。図 7から分かるように、 mRNA量が 6 O f mo 1までは mRNA量の増加に伴って電流変化△ i (%) が直線的に増加した _c このように、本実施例では、 mRNAの発現量を f mo 1レベルで定量化することができることが分かった。

(実験例 4)

遺伝子の検出について実験例を示す。ァフリカツメガエルの卵細胞由来シトクロム Cの遺伝子検出用 DNAプローブ（ 5， -HS-AAGGTTGATTAC TGGAATGGGGACCTGTTA— 3， ) を、ビン電極 10のそれそれに固定化した。また、異なった DNA量の目的遺伝子（DNAプローブと相補する DNA) を含む溶液を夕イタ一プレート上の異なったゥエルに入れた。このタイ夕一プレートのゥエルに先に調製したビン電極 10を浸し、 2 xSSC、室温、 1時間の条件下でハイブリダィゼ一シヨン反応を行った。これを測定用電解質溶液（0.1M AcOH-AcOK (pH5.6) ， 0.1M KC1, 0.05mM NFc) 中で 20度で 470m V (Ag/AgCl 参照電極基準）のハイブリダイゼーション前後の電流値変化を測定した。

得られた結果を図 8に示す。図 8から分かるように、数 10〜数 100 f mo 1の目的遺伝子が検出できた。一方、シトクロム Cを含まない DNAサンプルの電流変化はほとんど観察されなかった。

以上、本発明に係る遺伝子の検出方法、並びに検出装置及び検出用チップについて、その実施例で説明したが、本発明は、特にこのような実施例に限定されることはなく、特許請求の範囲の技術的事項の範囲内で、いろいろな実施の態様があることは言うまでもない。産業上の利用の可能性

本発明に係る遺伝子の検出方法、並びに検出装置及び検出用チップは、以上のような構成であるから、高感度でもって、高速大量に、簡便に遺伝子を検出 -解析することができる。

このように、高感度、ハイスル一プット（高速大量）の処理ができる本発明に係る検出装置は、生物学、医学分野での遺伝子、表現形質との相関の解析に有効な手段である。薬剤代謝酵素、がん抑制遺伝子などの特定の遺伝子を、本発明に係る遺伝子の塩基配列、一塩基置換 SNP、数塩基置換、点突然変異、転座、欠損、増幅、またはトリプレットリピートの検出 '解析装置よつて、解析することにより、遺伝子診断にも利用できる。

例えば、本発明に係る検出装置では、高感度、ハイスル一プット（高速大量）の処理が可能であるから、日本人の遺伝子に関するデータを収集し、病気の発症と関連する遺伝子を同定し、将来発症するのを予測 ·予防することに役立てることができる。

また、遺伝子を診断することにより、適切な治療法を選択したり、副作用の少ない薬を選択したりする上で役立てることができる。

さらに、病気の遺伝子解析の結果を利用して、臨床実験等を繰り返すことなく、新薬を開発することもできる。

本発明では、検出用チップを互いに着脱自在な本体部とフレーム部とで構成し、フレーム部にサンプル D N A溶液等を充填できる窪みを形成したので、サンプル D N A、縫い込み式インターカレ一夕等の溶液を、極めて簡単な作業で充填したり取り出したりできるとともに、窪み内を洗浄液で簡単に洗浄をすることができる ο

本発明では、検出用チップの測定極として、本体部の内側にマトリックス状に配列したビン電極を突出して設けたので、ビン電極を、異なる D N Aを収容したマイクロプレートの収容部内に挿入することにより、同時に種類の異なる D N A を一度に修飾（固定）させることができる。

Claims

請求の範囲

1. 測定極である複数のピン電極を有する、遺伝子の検出用チップであって、前記ビン電極と、前記ビン電極の対極である共通電極との間に電圧を印加し、電流を検出することが可能であることを特徴とする、遺伝子の検出用チップ。

2. さらに、前記ピン電極の対極であって前記ビン電極と接触しないように配置された共通電極を有することを特徴とする、請求項 1に記載の遺伝子の検出用チップ。

3. さらに、前記ビン電極を受容し得るとともに、サンプル DNAを充填し得る窪みを有することを特徴とする、請求項 1に記載の遺伝子の検出用チップ。

4. 前記ピン電極には、異なる遺伝子配列を有する遺伝子がそれそれ固定されてなることを特徴とする、請求項 1に記載の遺伝子の検出用チップ。

5. 前記ビン電極には、異なる遺伝子配列を有する複数の PCR産物、オリゴヌクレオチド、 mRNA、 cDNA、 P N A (peptidic nucleic acid)、または LNA (locked nucleic acid； Proligo LLC社商標）が固定されてなることを特徴とする、請求項 1に記載の遺伝子の検出用チップ。

6. 前記ピン電極には、同一の遺伝子配列を有する遺伝子がそれそれ固定されてなることを特徴とする、請求項 1に記載の遺伝子の検出用チップ。

7. 前記ビン電極には、同一の遺伝子配列を有する P CR産物、オリゴヌクレオチド、 mRNA、 cDNA、 P NA (peptidic nucleic acid) 、または

LNA (locked nucleic acid； Proligo LLC社商標）が固定されてなることを特徴とする、請求項 1に記載の遺伝子の検出用チップ。

8. さらに、前記ビン電極をそれそれ受容し得るとともに、サンプル DNA を充填し得る複数の窪みを有してなり、

当該複数の窪みに異なるサンプル D N Aをそれそれ充填し得るようにしたことを特徴とする、請求項 6に記載の遺伝子の検出用チップ。

9. 遺伝子の塩基配列、一塩基置換 SNP、数塩基置換、点突然変異、転座、欠損、増幅、またはトリプレッ卜リビートを検出するための、請求項 1に記載の遺伝子の検出用チップ。

10. 前記ビン電極は、表面に金がメツキされてなることを特徴とする、請求項 1に記載の遺伝子の検出用チップ。

11. 前記ビン電極は、表面の一部が樹脂でコーティングされてなることを特徴とする、請求項 1に記載の遺伝子の検出用チップ。

12. 前記樹脂が、 PEEKまたは PTFEであることを特徴とする、請求項 11に記載の遺伝子の検出用チップ。

13. さらにピン電極を支持する支持部材を有してなり、

前記ピン電極は、当該支持部材上に突設されてなることを特徴とする、請求項 1に記載の遺伝子の検出用チップ。

14. 前記ピン電極は、前記支持部材上にスポット電極を介して突設されてなることを特徴とする、請求項 13に記載の遺伝子の検出用チップ。

15. さらにビン電極を支持する支持部材を有してなり、

前記ピン電極の一の端部が、当該支持部材上に植設されてなることを特徴とする、請求項 1に記載の遺伝子の検出用チップ。

16. 前記支持部材が回路基板である、請求項 13に記載の遺伝子の検出用チップ。

17. 前記ビン電極は、前記支持部材上に接触または植設されている端部がエポキシ樹脂または P T F Eにより包囲され支持部材上に固定されていることを特徴とする、請求項 13に記載の遺伝子の検出用チップ。

18. 前記ピン電極においては、前記支持部材上に接触または植設されている端部ではない側の端部にのみ遺伝子が固定されてなることを特徴とする、請求項 13に記載の遺伝子検出用チップ。

19. 前記ピン電極においては、ビン電極の全体にわたり遺伝子が固定されてなることを特徴とする、請求項 1に記載の遺伝子検出用チップ。

20. 内部に空隙を有してなる請求項 13に記載の遺伝子の検出用チップであって、

前記ビン電極は、当該空隙内へ突出するように前記支持部材上に設けられ、前記共通電極の一部または全部が当該空隙内に露出していることを特徴とする、請求項 13に記載の遺伝子の検出用チップ。

2 1 . 本体部と当該本体部と結合し得るフレーム部とを有してなる請求項 1 に記載の遺伝子の検出用チップであって、

前記本体部は、その内側面に前記ピン電極を有し、

前記フレーム部は、その内側面に、当該本体部と結合した際に前記ピン電極を受容し得るとともにサンプル D N Aを充填し得る窪みを有することを特徴とする、請求項 1に記載の遺伝子の検出用チップ。

2 2 . 前記本体部と前記フレーム部とが着脱自在である、請求項 2 1に記載の遺伝子の検出用チップ。

2 3 . 互いに着脱自在な本体部とフレーム部とを有する遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出用チップであって、

前記本体部は、その内側面にマトリックス状に配列されて突出した測定極である多数のビン電極を有し、

前記フレーム部は、その内側面に、前記本体部を装着した際に前記多数のピン電極を受け入れることができるとともに、サンプル D N Aを充填することのできる窪みを有し、

前記窪みには、前記ビン電極と接触しないように配置された対極である共通電極が配設されており、

前記ピン電極は、異なる遺伝子配列から成る P C R産物もしくはオリゴヌクレォチドが固定されており、

前記共通電極と前記ビン電極間に電圧が印加され、電流が検出されることが可能であることを特徴とする遺伝子の一塩基置換 S N Pと点突然変異の検出用チップ。

2 4 . 前記ビン電極は、夫々マトリックス状に多数配列され、異なる遺伝子配列から成る P C R産物もしくはオリゴヌクレオチドを収容する収容部の各々に、挿入されることにより、前記異なる遺伝子配列から成る P C R産物もしくはオリゴヌクレオチドが固定されているものであることを特徴とする請求項 2 3に記載の遺伝子の検出用チップ。

2 5 . 遺伝子診断用である、請求項 1〜2 4のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップ。 2 6，請求項 1 ~ 2 4のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チヅプ、ならびに当該検出用チップを装入および取り出し可能な測定装置を有する遺伝子の検

2 7 . 前記遺伝子の検出用チップの温度をペルチェ素子を用いコントロール可能としたことを特徴とする、請求項 2 6記載の遺伝子の検出装置。

2 8 . 請求項 1 ~ 2 4のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップを用いた検出方法であって、

前記窪み内に、サンプル D N A又はサンプル D N Aから遺伝子増幅された D N Aを充填し、ハイブリダィゼーシヨンを行わせて二本鎖を形成し、

その後、前記サンプル D NA又はサンプル D N Aから遺伝子増幅された D N A を前記窪みから除去し洗浄してから、前記窪み内に、電気化学活性分子を含む電解質を充填して、前記二本鎖に前記電気化学活性分子を結合させ、

そして、前記共通電極と前記ビン電極間に電圧を印加して流れる電流値を検出することを特徴とする、検出方法。

2 9 . 請求項 1〜2 4のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップを用いた検出方法であって、

前記窪み内に、サンプル D N A又はサンプル D N Aから遺伝子増幅された D N Aと、電気化学活性分子を含む電解質とを充填し、ハイブリダィゼ一シヨンを行わせて二本鎖を形成しながら、前記二本鎖に前記電気化学活性分子を結合させ、そして、前記共通電極と前記ピン電極間に電圧を印加して流れる電流値を検出することを特徴とする、検出方法。

3 0 . 温度をコントロールしながら前記二本鎖に前記電気化学活性分子を結合させることを特徴とする、請求項 2 8に記載の検出方法。

3 1 . 前記電気化学活性分子を含む電解質が、フエ口セン、カテコールアミン、金属ビビリジン錯体、金属フエナンスリン錯体、ピオ口一ゲン、もしくはこれら化合物を導入した縫い込み型ィン夕一力レー夕を有効成分とすることを特徴とする、請求項 2 8に記載の検出方法。

3 2 . 請求項 1 ~ 2 4のいずれか一項に記載の遺伝子の検出用チップを用いた遺伝子の診断方法。