WO2001027619A1

WO2001027619A1 - Methode de detection d'un agent chimique exogene de perturbation endocrine et appareil de detection

Info

Publication number: WO2001027619A1
Application number: PCT/JP2000/001813
Authority: WO
Inventors: Naoya Omura; Steve Lackie
Original assignee: Central Research Institute Of Electric Power Industry; Sapidyne Instrument Inc.
Priority date: 1999-10-14
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2001-04-19
Also published as: JP2001116753A; EP1231468A4; JP3483246B2; EP1231468A1

Description

明細書

外因性内分泌撹乱物質の検出方法および検出装置

技術分野

本発明は外因性内分泌撹乱物質の検出方法および検出装置に関し、より詳しくはいわゆる環境ホルモンと呼ばれる外因性内分泌撹乱物質を高感度で、かつ簡便に検出する方法および装置に関するものである。

背景技術

近年、社会的な問題となっている外因性内分泌撹乱物質、いわゆる環境ホルモンは、体内の天然ホルモンの作用を撹乱することで生体に悪影響を及ぼすと考えられている。その撹乱作用は現在未だ十分には解明されていないが、以下に示すような、ある種の女性ホルモン作用の撹乱メカニズムが提案されている。女性ホルモン作用は通常生体内で女性ホルモンが対応するホルモン受容体に結合することにより誘発される。ホルモンとその受容体の結合体は二量体化し、さらに D N Aの特定の配列に結合する。これによりホルモン作用に必要な遺伝子の転写が始まり、結果として生理作用が起こる。ここで外因性内分泌撹乱物質は、天然の女性ホルモンの代わりに受容体に結合することによって、上記のホルモン作用を撹乱する。

このような外因性内分泌撹乱物質は環境中への拡散を防止し、かつ環境中から除去する必要があるが、そのためにはまず該撹乱物質の存在を検出しなければならない。しかしながら、ナノモルないしピコモル単位という極めて希薄な濃度で環境中に存在するだけで、生体への悪影響が危惧されている上記撹乱物質を検出する必要があるため、検出にはできるだけ感度の高い特殊な方法を採用する必要があった。

外因性内分泌撹乱物質を検出するための従来の方法には、放射受容体検定法（ラジォレセプタ—アツセィ）〔Endocrine, 138(3);863-870( 1997)〕、免疫検定法（ィムノアッセィ ) " Reproductive Toxicology", del Mazo eds" Plenum Press, Wew York( 1998 )〕、蛍光偏向解消法（Environmental Health Respectives., 106(9 ) ;551-557( 1998 )〕の他、組換え酵母を使用する方法や受容体との複合体と遺伝子との結合を指標として放射活性を用いて使用する方法等が知られている。

しかしながら、これら従来の方法は、放射性物質や組換え酵母を利用するため操作が煩雑であったり、しかもいずれの方法も環境中の外因性内分泌撹乱物質の検出のためには感度が十分ではなかった。このため、上記外因性内分泌撹乱物質の簡便で高感度の検出系の開発が望まれている。

発明の開示

本発明は、新規な外因性内分泌撹乱物質の検出方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、極く低濃度で環境中に存在する環境ホルモンと呼ばれる外因性内分泌撹乱物質を高感度で、かつ簡便に検出できる方法および装置を提供することを目的とする。

かかる目的を達成するために、本発明者は鋭意研究を重ねた結果、環境ホルモンの疑いのある化学物質の多くが女性ホルモンに類似の作用を有することに着眼し、女性ホルモン受容体と蛍光標識した女性ホルモンとを組み合わせ、該女性ホルモンと環境ホルモンとの上記受容体への競合的結合の結果を蛍光強度の差で検出することにより、被試料中の環境ホルモンの存在の有無が高感度で、かつ簡便に検出し得ることを見出し、本発明を完成させたものである。

すなわち、上記諸目的を達成する本発明は、試料中における外因性内分泌撹乱物質の存在を検出する方法であって、固定化された女性ホルモン受容体と蛍光標識された女性ホルモンとを用い、既知量の前記固定化女性ホルモン受容体に対する既知量の前記蛍光標識女性ホルモンと前記試料中の存在未知なる外因性内分泌撹乱物質との競争的結合反応を行い、固定化女性ホルモン受容体に結合した蛍光標識女性ホルモンの標識蛍光の蛍光強度を測定することを特徴とする外因性内分泌撹乱物質の検出方法である。

また、発明の上記外因性内分泌撹乱物質の検出方法は、その第 1の実施態様において、固定化女性ホルモン受容体を充填した検出容器にある濃度の蛍光標識された女性ホルモンを導入した場合に検出される蛍光強度を検出値 F。とし、試験すべき試料を混合した上記と同濃度の蛍光標識された女性ホルモンを上記検出容器に導入した場合に検出される蛍光強度を検出値 F！とし、検出値 F iが検出値 F 0に比べ小さいならば、上記試験すべき試料中に外因性内分泌撹乱物質が存在するものとすることを特徴とする。これにより、定性的な検出が容易に行い得る。

本発明の上記外因性内分泌撹乱物質の検出方法は、その第 2の実施態様において、固定化女性ホルモン受容体を充填した検出容器にある濃度の蛍光標識された女性ホルモンを導入した場合に検出される蛍光強度を検出値 F。とし、試験すベき試料を混合した上記と同濃度の蛍光標識された女性ホルモンを上記検出容器に導入した場合に検出される蛍光強度を検出値 F！とし、検出値 F iと検出値 F。との比を算出し、予め作製しておいた検量線によって、上記試験すべき試料中に存在する外因性内分泌撹乱物質の量を求めることを特徴とする。これにより、定量的な検出も可能となる。

本発明はまた、女性ホルモン受容体がエストロゲン受容体である上記外因性内分泌撹乱物質の検出方法を示すものである。エストロゲン受容体を用いることによって、環境中に存在するより多くの女性ホルモン様作用を持つ化学物質を検出することが可能となる。

本発明はまた、検出容器が容積 1 0 0 mm³以下のセルである上記外因性内分泌撹乱物質の検出方法を示すものである。このようなセルを用いることで、少量の固定化女性ホルモン受容体でより迅速に検出を行うことができる。

本発明はさらに、試料が固定化女性ホルモン受容体に連続的に接触しうるように検出容器がフロー式である上記外因性内分泌撹乱物質の検出方法を示すものである。検出容器をフロー式のものとすると、試料中に外因性内分泌撹乱物質が極く微量しか存在しない場合でも、該撹乱物質が検出容器中の固定化女性ホルモン受容体に蓄積され、検出限界をより向上させることができる。

上記諸目的を達成する本発明はまた、固定化女性ホルモン受容体を充填した検出容器、該検出容器内を励起する光源、および励起後の検出容器内の蛍光強度を検出する検出器とからなり、蛍光標識された女性ホルモンと組み合わせて用いるものであることを特徴とする外因性内分泌撹乱物質の検出装置である。

本発明はまた、女性ホルモン受容体がエストロゲン受容体である上記外因性内分泌撹乱物質の検出装置を示すものである。

本発明はまた、検出容器が容積 1 0 0 mm³以下のセルである上記外因性内分泌撹乱物質の検出装置を示すものである。

本発明はさらに、試料が固定化女性ホルモン受容体に連続的に接触しうるように検出容器がフロー式である上記外因性内分泌撹乱物質の検出装置を示すものである。

本発明者はさらに前記した女性ホルモン受容体を用いる方法と同様の着眼点から、固定化女性ホルモンと、該女性ホルモンに対する抗ホルモン抗体とを組み合わせ、試験すべき試料中に上記抗ホルモン抗体を導入して環境ホルモンと抗ホルモン抗体との抗原抗体反応を生じさせ、その後この反応混合物を固定化女性ホルモンに接触させて反応混合物中に存在する未反応の抗ホルモン抗体を固定化女性ホルモンに結合させ、その結果を当該抗ホルモン抗体に結合させた標識蛍光の蛍光強度の差で検出することにより、被試料中の環境ホルモンの存在の有無が高感度で、かつ簡便に検出し得ることを鋭意研究の結果見出し、さらに検討を加え、本発明を完成させた。

すなわち、上記諸目的を解決する第 2の発明は、試料中における外因性内分泌撹乱物質の存在を検出する方法であって、固定化された女性ホルモンと、当該女性ホルモンに対する抗ホルモン抗体とを用い、既知量の抗ホルモン抗体を前記試料に導入して存在未知なる外因性内分泌撹乱物質と抗原抗体反応に供し、その後、この抗ホルモン抗体と試料との反応混合液を、既知量の前記固定化女性ホルモンと接触させ、固定化女性ホルモンに結合した抗ホルモン抗体量を、当該抗ホルモン抗体に結合させた標識蛍光の蛍光強度を測定することで検出することを特徴とする外因性内分泌撹乱物質の検出方法である。このように、抗体を用いて環境ホルモンを検出する場合には、抗体が結合しうる全ての環境ホルモンを特定すると共にその濃度を定量的に検出できる。

当該第 2発明の外因性内分泌撹乱物質の検出方法は、その第 1の実施態様において、前記抗ホルモン抗体が蛍光標識抗ホルモン抗体であり、固定化女性ホルモンに結合した抗ホルモン抗体量を、当該蛍光標識抗ホルモン抗体の標識蛍光の蛍光強度を測定することで検出することを特徴とする。

当該第 2発明の外因性内分泌撹乱物質の検出方法は、第 2の実施態様において、前記抗ホルモン抗体を無標識一次抗体とし、固定化女性ホルモンに結合した抗ホルモン抗体量は、二次抗体として当該一次抗体に特異的に結合する蛍光標識抗ー次抗体抗体を用い、固定化女性ホルモンに結合した一次抗体に該二次抗体を特異的に結合させ、この結合二次抗体の標識蛍光の蛍光強度を測定することで検出することを特徴とする。

第 2発明の外因性内分泌撹乱物質の検出方法は、さらに別の実施態様において、前記固定化女性ホルモンを充填した検出容器にある濃度の前記抗ホルモン抗体を導入した場合に検出される蛍光強度を検出値 F。とし、試験すべき試料を混合した上記と同濃度の抗ホルモン抗体を上記検出容器に導入した場合に検出される蛍光強度を検出値とし、検出値が検出値 F。に比べ小さいならば、上記試験すベき試料中に外因性内分泌撹乱物質が存在するものとすることを特徴とする。

第 2発明の外因性内分泌撹乱物質の検出方法は、さらに別の実施態様において、固定化女性ホルモンを充填した検出容器にある濃度の抗ホルモン抗体を導入した場合に検出される蛍光強度を検出値 F oとし、試験すべき試料を混合した上記と同濃度の抗ホルモン抗体を上記検出容器に導入した場合に検出される蛍光強度を検出値とし、検出値と検出値 F。との比を算出し、予め作製しておいた検量線によって、上記試験すべき試料中に存在する外因性内分泌撹乱物質の量を求めることを特徴とする。

本発明はまた、検出容器が容積 1 0 0 mm³以下のセルである上記外因性内分泌撹乱物質の検出方法を示すものである。このようなセルを用いることで、少量の試料間の蛍光強度の差を検知できるようになる。

本発明はさらに、試料が固定化女性ホルモン受容体に連続的に接触しうるように検出容器がフ口一式である上記外因性内分泌撹乱物質の検出方法を示すものである。

上記諸目的はまた、固定化女性ホルモンを充填した検出容器、該検出容器内を励起する光源、および励起後の検出容器内の蛍光強度を検出する検出器とからなり、蛍光標識された前記女性ホルモンに対する抗ホルモン抗体と組み合わせて用いるものであることを特徴とする外因性内分泌撹乱物質の検出装置によっても達成される。

上記諸目的はさらに、固定化女性ホルモンを充填した検出容器、該検出容器内を励起する光源、および励起後の検出容器内の蛍光強度を検出する検出器とからなり、前記女性ホルモンに対する抗ホルモン一次抗体およびこの抗ホルモン抗体と特異的に結合する蛍光標識された二次抗体と組み合わせて用いるものであることを特徴とする外因性内分泌撹乱物質の検出装置によっても達成される。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明の外因性内分泌撹乱物質の検出装置を模式的に示す図面である。図 2は、エストロゲン受容体に女性ホルモン試料が結合した際の蛍光蓄積検出を示すグラフである。図 3は、天然ホルモンの共存による蛍光強度の変化を示すグラフである。天然ホルモンは（A )が 17 ?—エストラジオール、（B )がエストリオール、（C )がテストステロンである。図 4は、各種ホルモンの濃度による結合阻害率の変化を示すグラフである。図 5は、化学物質の共存により蛍光強度の変化を示すグラフである。化学物質は（A )が夕モキシフェン、（B )がビスフエノール八、（〇）が0 £ 3、（D )がノニルフエノールである。図 6は、各種化学物質の濃度による結合阻害率の変化を示すグラフである。図 7は、本発明の別の外因性内分泌撹乱物質の検出方法および装置を模式的に示す図面であり、（A) は用いられる装置構成の一例、（B ) は検出操作の一連のステップにおいて検出される蛍光強度の変化の典型例、（C ) は検出操作の一連のステップにおける抗原固定化ビ一ズ表面近傍での変化の模式図である。図 8は、抗ホルモン抗体を蛍光標識した系において測定したエストリオールの定量結果を示すグラフ。図 9は、蛍光標識二次抗体を用いた系において測定したエストリオールおよびエストラジオールの定量結果を示すグラフ。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施態様に基づきより詳細に説明する。

尚、本発明において固定化女性ホルモン受容体とは、不溶性担体に女性ホルモン受容体を固定化したものを意味する。

女性ホルモン受容体としては、例えばエストロゲン受容体、ゲス夕一ゲン受容体等を用いることができる。多種多様の外因性内分泌撹乱物質を結合しうる点でエストロゲン受容体が好ましい。ここでエストロゲン受容体とは卵胞ホルモン受容体とも呼ばれ、生体内ではエストロゲンの標的細胞核に存在し、エストロゲンと結合して特異的な遺伝子に依存するタンパク質合成の活性化を媒介するものである。

一方、このような女性ホルモン受容体を固定化するための不溶性担体としては、例えばポリメチルメ夕クリル酸、ガラス等からなる固定化用ビーズ、アルギン酸カルシウム粒子等の微細粒子などを用いることができるが、特にこれらに限定されるものではなく、種々の形状、材質のものを使用することができる。このうち、ビーズないし微粒子形状、特に平均粒径 5 0〜 1 0 0 /m程度のビーズないし微粒子形状のものであることが好まれる。

このような不溶性担体に対する女性ホルモン受容体の固定化方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、自然吸着法、イオン結合法、共有結合法などを用いて結合させることができ、また直接結合させる方法のみならず、適当な化学物質あるいはタンパク質などのスぺ一サ一を介して間接的に結合させることも可能である。

本発明において蛍光強度の基準を得るために使用される女性ホルモンは、発情作用を有するものであれば、あらゆるものが使用でき、エストラジオール、エストロン、エストリオール、ェキリン、エレキニン等のステロイドホルモンまたはその代謝物、これらの化学誘導体、例えばホモエストロン、ェチニルエストラジオール、ドヮシノール酸、または合成エストロゲン等を挙げることができる。これら女性ホルモンの蛍光標識は慣用の手段により行い得、標識のための蛍光色素には、 C Y 5、フルォレセインイソチオシァネート、テトラメチルローダミンィソチオシァネ一ト等がある。

本発明は、外因性内分泌撹乱物質の存在を試験すべき環境中の種々の試料、すなわち試験すべき試料中に該撹乱物質が存在する場合に、それが上記女性ホルモン受容体に結合する現象を利用して、該撹乱物質を検出しょうとするものである。そのためにまず、ある濃度の蛍光標識された女性ホルモンを上記女性ホルモン受容体に結合させた場合の蛍光強度を測定する（この値を検出値 F。とする）。次に試験すべき試料を混合した上記と同濃度の蛍光標識された女性ホルモンを上記女性ホルモン受容体に結合させた場合の蛍光強度を測定する（この値を検出値とする）。ここで、上記試料中に外因性内分泌撹乱物質が存在するならば、女性ホルモンの上記エストロゲン受容体への結合が阻害されるため、その結果が検出値 F ! おける蛍光強度の低下となって示される。従って、検出値が検出値 F。に比べ小さい場合（ F i < F。）、上記試験すべき試料中に外因性内分泌撹乱物質が存在すると判断できる。

このように本発明においては、固定化女性ホルモン受容体に結合した蛍光標識女性ホルモンの標識蛍光を測定するために、固定化女性ホルモンを内部に保持してなる検出容器を用いることが、迅速な測定を行う上で好ましい。

検出容器は固定化女性ホルモン受容体を内部に保持し、かつ該受容体に結合された蛍光標識女性ホルモンからの蛍光の検出を阻害しないことが必要であり、例えば透明ガラスまたは透明ブラスチック等からなる。検出容器は底部が閉じられ、導入される試料が流出しないような形状であってもよいが（この場合、蛍光強度の各々の測定はバッチ形式で行われる）、解放された底部に、固定化受容体は通さないが導入される試料は通すスクリーン等の保持材を設置するといつた手法により、解放容器内の所定部位に固定化受容体を通液可能な状態で保持拘束した形態（いわゆるフロー式の検出容器とすると）、該試料を検出容器に連続的に導入することができ、それにより、受容体に結合する目的物質を極く微量含む試料であっても、目的物質が検出容器中に蓄積 ·濃縮され、結果的に目的物質の検出限界濃度が向上することとなるので好ましい。なお、フロー式の検出容器内における固定化受容体の保持方法としては、上記したようなスクリーンのような保持材を用いる方法に限定されるものではなく、これ以外にも例えば、受容体を固定化する担体として通液性を有する塊状物を用い、この塊状物で検出容器の流路断面を塞ぐように配置するといつた方法も採択し得る。

また、検出容器は少量の試料間でも極くわずかの蛍光強度の差を検知しうるように、微小セルの形状であることが好ましい。微小セルは例えば 1 0 0 mm³以下、特に 2 0〜7 0 mm³の容積を有することが望ましい。

蛍光強度は、上記受容体に捕捉された女性ホルモン上の標識蛍光を適当な光源からのレ一ザ光、水銀灯等の照射により励起した際に発生する蛍光を検出器により検出される。本発明は、外因性内分泌撹乱物質の女性ホルモン受容体への結合能力を直接利用しているため、該撹乱物質と結合しなかった受容体の抗体を間接的に測定する免疫検定法等に比較して、検出感度は格段に向上し、しかも、蛍光強度の測定により検出が行われるため、放射線や組換え酵母等を利用する従来法に比較して操作が極めて容易である。このため、本発明によれば、天然の女性ホルモンの代わりにホルモン受容体に結合して体内のホルモン作用を撹乱することが知られている外因性内分泌撹乱物質、いわゆる環境ホルモンを高感度で、かつ容易に検出することができる。

本発明は、蛍光標識された女性ホルモンのみの場合の蛍光強度 F。と被試料と上記女性ホルモンとの混合物の場合の蛍光強度 F！とを比較し、 F ,が F。より小さレ、、すなわち数式 1で表される差が正であるならば被試料中には外因性内分泌撹乱物質が存在すると判断する、いわゆる定性試験を主とするものである。

F o - F 1 … ( 1 )

しかし、の F。に比べた低下の割合が、被試料中に含まれる外因性内分泌撹乱物質の量にある程度比例することから、既知の濃度の外因性内分泌撹乱物質を用いて予め検量線を作成することにより、 F！の低下の割合に応じて被試料中に含まれる外因性内分泌撹乱物質の定量を行うこともできる。

次に第 2の発明に関して説明する。

第 2の発明においては、上記に説明した第 1の発明とは異なり、女性ホルモンを不溶性担体へと固定化する。使用される不溶性担体および女性ホルモンとしては、上記したようなものと同様なものが例示できる。また担体への女性ホルモンの固定化方法としては、ホルモンを失活化させない方法であれば特に限定されるものではない。例えば、ホルモンを直接自然吸着法、イオン結合法、共有結合法などを用いて担体に結合させることができ、また直接結合させる方法のみならず、適当な化学物質あるいはタンパク質などのスぺ一サ一を介して間接的に結合させることも可能である。例えば、ホルモンの活性に影響のない部位に官能基を導入し共有結合を介して結合させること、長鎖のスぺーサーを配するといつた態様を取ることが望ましい。具体的には例えば、芳香族アミノ基を持つ担体をジァゾ化し、ホルモンなどの抗原となる化学物質をジァゾカップリングする方法、あるいは、セファロ一スなどの多糖類を BrCNで活性化してアミノ基を持つホルモンなどの化学物質のァミノ基と共有結合させる方法などを例示できる。また、ホルモンをタンパク質に化学結合により結合させ、この結合体をさらに担体に固定化することもできる。この固定化法についても、ホルモンとタンパク質の結合体を直接自然吸着法、イオン結合法、共有結合法などを用いて担体に結合させることができ、また直接固定させる方法のみならず、適当な化学物質、例えばグル夕ルァルデヒド架橋などのスぺーサーを介して固定させることも可能である。

そして使用した女性ホルモンに対する抗ホルモン抗体に蛍光標識したものを別途調製する。抗体としては、各種動物を起源とする免疫グロブリンのどのクラスに属するものであってもよく、一般に市販されるものを用いることも、あるいは適当な免疫系を該女性ホルモンで刺激し産生される該女性ホルモンに対する特異性の高い抗体を別途調製したものを用いてもよい。またモノクローナル抗体を用いることも可能である。例えば、抗ェストラジオ一ル抗体は、アメリカ合衆国のバイオデザイン社、バイオスぺシフィック社、フィヅァ一アルド社、コーテックスバイオケミストリ一社などから、また抗エストリオール抗体はバイオストライド社などから入手可能である。このような抗体の蛍光標識化は、慣用の手段により行い得、また使用される蛍光色素としても上記したものと同様のものが例示できる。

あるいはまた、女性ホルモンに対する抗ホルモン抗体には蛍光標識付けせず、これを一次抗体として使用するとともに、別途この一次抗体に対して特異的に結合する抗体（抗一次抗体抗体）を用意し、これを蛍光標識したものを二次抗体として用いることも可能である。この場合、固定化女性ホルモンに結合した抗ホルモン抗体（一次抗体）に蛍光標識された二次抗体が特異的に結合するため、蛍光標識した抗ホルモン抗体を用いる上記態様と同様に、固定化女性ホルモンに結合した抗ホルモン抗体を蛍光標識により識別化できるものである。

本第 2発明は、外因性内分泌撹乱物質の存在を試験すべき環境中の種々の試料、すなわち試験すべき試料中に該撹乱物質が存在する場合に、それが上記女性ホルモンに対する抗ホルモン抗体に結合する現象を利用して、該撹乱物質を検出しようとするものである。そのためにまず、ある濃度の抗ホルモン抗体を上記固定化女性ホルモンに結合させた場合の蛍光強度を測定する（この値を検出値 F。とする）。次に試験すべき試料を上記と同濃度の抗ホルモン抗体と接触させ、その後、この接触混合物を上記固定化女性ホルモンに接触させ、固定化女性ホルモンに結合した抗ホルモン抗体の蛍光強度を測定する（この値を検出値 F iとする）。ここで、上記試料中に外因性内分泌撹乱物質が存在するならば、上記抗ホルモン抗体の一部は上記試料との最初の接触において、外因性内分泌撹乱物質と結合し、この外因性内分泌撹乱物質と結合した抗ホルモン抗体は、続く固定化女性ホルモンとの接触において、もはや固定化女性ホルモンと結合しようとはせず、反応混合物中に遊離状態で残ることとなるため、その結果が検出値 F！における蛍光強度の低下となって示される。従って、検出値が検出値 F _Qに比べ小さい場合（F ! F o 上記試験すべき試料中に外因性内分泌撹乱物質が存在すると判断できる。

なお、本第 2発明においても、前記した第 1発明と同様に、迅速な測定を行う上で、固定化女性ホルモンを内部に保持してなる検出容器を用いることが好ましレ、。検出容器の構成等に関しては、その内部に保持されるものが固定化女性ホルモンと固定化女性ホルモン受容体という相違以外は、前記第 1発明において説明したものと同様のものを好ましく例示できる。また蛍光の検出方法についても前記と同様である。

本第 2発明は、外因性内分泌撹乱物質と結合しなかった抗体量を検定することで間接的に外因性内分泌撹乱物質を測定する方法ではあるが、当該未結合の抗体を、担体上に固定化されたことにより高密度で存在する抗原（女性ホルモン）に結合させることで、該固定化担体上に蓄積することができるために、検出感度は格段に向上し、しかも、蛍光強度の測定により検出が行われるため、放射線や組換え酵母等を利用する従来法に比較して操作が極めて容易である。このため、本発明によれば、天然の女性ホルモンの代わりにホルモン受容体に結合して体内のホルモン作用を撹乱することが知られている外因性内分泌撹乱物質、いわゆる環境ホルモンを高感度で、かつ容易に検出することができる。

本第 2発明も前記第 1発明と同様に、定性試験を主とするものであるが、前記したように既知の濃度の外因性内分泌撹乱物質を用いて予め検量線を作成することにより、被試料中に含まれる外因性内分泌撹乱物質の定量を行うこともできる。上記したような第 1および第 2の発明に係る外因性内分泌撹乱物質の検出方法および検出装置は、原理的に受容体あるいは抗体の種類に関われず、これらに結合性を持つ物質を検出ならびに定量できるものであり、その検出可能な外因性内分泌撹乱物質としては特に限定されるわけではなく多種多様な物質が含まれ得る。例えば、夕モキシフェン、ノニルフエノール、ビスフエノール A、ジェチルスチルベストロール、ェストラジオ一ル一 3—スルフェート、エストラジオール一 1 7—グルクロニド、エストラジオール _ 3—グルクロニド、エストリオ一ル一 3 —スルフェート、エストリオ一ル一 1 7—グルクロニド、エストリオール一 3— グルクロニドなど化学物質が例示できるが、もちろん、これら数種の化学物質に限定されるものではない。

実施例

次に、図面を参照して本発明の実施例について説明するが、これらの実施例は、本発明のより具体的でかつ容易な理解を助けるためのみの目的をもって挙げられたものであり、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。

A . 材料と方法

( 1 ) 受容体、ホルモンおよび化学物質

エストロゲン受容体としてヒトエストロゲン受容体ひ〔ァメリ力合衆国ゥイスコンシン州ドライブ ·マジソンのパンベラ社製〕を使用した。天然ホルモンの標準品として 17 ?—エストラジオール（日本国の和光純薬工業社製)、エストリオ —ル（和光純薬工業社製）およびテストステロン（和光純薬工業社製）を使用した。また、測定対象としてホルモン作用を有する可能性が示唆されている数種の化学物質：夕モキシフェン、ノニルフエノール、ビスフエノール Aおよびジェチルスチルベストロール、エストラジオール一 3—スルフェート、エストラジオール一 1 7—グルクロニド、エストラジオール一 3—グルクロニド、エストリオ一ルー 3—スルフェート、エストリオ一ル一 1 7—グルクロニド、エストリオ一ル— 3 —グルクロニド〔以上、いずれもアメリカ合衆国ミズ一リ州のシグマ社製〕を使用し/ (2) 固定化エストロゲン受容体の調製

エストロゲン受容体の担体（ビーズ）への固定は自然吸着により行った。固定化用ビーズは平均粒径 95〃mのポリメチルメ夕クリル酸の粒子（ガンツ化成社製）を使用した。ビーズ 0. 2 gを小型の試験管に入れ、結合用緩衝液（ 50 mMトリス HC1， 500 mM KC1， 2 mM DDT, 1 mM EDTA， 10%グリセロール， pH7. 8) lmlに懸濁した。この懸濁液に 70 p m o 1のェストロゲン受容体を投入し、 30分間室温で混和した。この後、終濃度 lmg/ml になるようにゥシ血清アルブミン 100 1を添加した。添加後、さらに 30分間室温で混和した。この後、同じ緩衝液で粒子を洗浄し、次いで同じ緩衝液 30 ml中に再懸濁して測定に使用した。なお、エストロゲン受容体を固定化していない比較のためのビーズとしてビーズにゥシ血清アルブミンのみを添加したものも同様の操作で調製した。

(3) 蛍光標識された女性ホルモンの調製

17 ?一ェストラジオ一ルーゥシ血清アルブミンの粉末試料〔シグマ社（上掲）製〕を lmg/mlになるように結合用緩衝液に溶解した。蛍光色素には、ステロイドホルモン等の吸収波長を考慮して 650 nmに吸収波長を有する CY 5を使用した。この蛍光色素の付与には CY5ラベリングキット〔アメリカ合衆国ィリノィ州アーリントンハイトのァマルシャム ·ライフサイエンス社製〕を使用した。蛍光色素の付与された 17 5—エストラジオール—ゥシ血清アルブミンと遊離の蛍光色素とはゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。結果として、 17 ?一エストラジオール—ゥシ血清アルブミン 1分子に対し約 10個の蛍光色素が付与された蛍光標識女性ホルモンを得た。

( 4 ) 蛍光検出装置

蛍光強度の測定には、フロー式蛍光光度計〔アメリカ合衆国アイダホ州ボイシのサピダイン ·インストルメント社製〕を組み込んだ検出装置を使用した。この検出装置を模式的に図 1に示すが、該装置は液相反応における分子間相互作用を蛍光強度の測定により解析できる。直径 1. 5mm、長さ 30mmのガラスセル 1を挟んで配置された励起光源 3と検出器 4により、蛍光強度は電気信号単位で測定される。ビーズ形状の固定化エストロゲン受容体 2はガラスセル 1内に設置された 50 zmのナイロンメッシュからなるスクリーン Sによりせき止めて積層することによりガラスセル 1中に充填した。該積層は 6. 7mg/mlの固定化エストロゲン受容体懸濁液 0. 7mlを 1. 5ml/分の速度で送液して行った。

17 ?—エストラジオ一ルーゥシ血清アルブミン— CY 5(以下、 E2—BSA 一 CY5と略記する）単独、または E 2— BSA—CY5と化学物質もしくは天然ホルモンとの混合試料の送液は吸引ポンプにより制御され、矢印 aの方向から 0. 5 ml/分の速度で連続的にガラスセル中に導入される。この時、物質はガラスセル 1内の固定化エストロゲン受容体 2との結合により蛍光強度として測定される。受容体 2と結合していないビーズ間に残留する物質は、緩衝液のみを 1. 5 ml/分の速度で導入することにより、矢印 bの方向から排出される。この後、残留する蛍光強度を結合量として評価した。具体的には、約 400 ng/mlとなるように結合用緩衝液に E2— BSA— CY5を希釈した。なお、この濃度は E 2—B SA—CY 5の蛍光の付与率に応じて適宜調節した。希釈液に既知の濃度の天然ホルモンまたは化学物質を溶解した結合用緩衝液を等量添加して室温で 30分間放置した。なお、難水溶性物質の場合はジメチルスルホキシドに完全に溶解させた後、適宜希釈し、放置後、測定に供した。

B. 結果

(1)標識女性ホルモンの固定化受容体への結合

固定化エストロゲン受容体を充填したガラスセル中に E 2— B S A— C Y 5のみを含有する試料を連続的に導入した場合、経時的に蛍光強度の増加が観察された。また、対照として行った受容体を固定していないビーズを充填したガラスセル中に同様の試料を連続的に導入した場合も、同様に蛍光強度の増加が見られた力、強度は受容体を固定したビーズの場合に比べ、明らかに低かった。結果を図 2に示すが、この結果から E 2 -B S A- C Y 5がエストロゲン受容体に結合していることが判明した。また、蛍光強度が試料流量に伴って経時的に増加することから、検出には標識女性ホルモンの蓄積効果が反映されることも判明した。

( 2 ) 天然ホルモンによる標識女性ホルモンの固定化受容体への結合阻害次に、上記測定系をエストロゲン受容体に結合できる天然の女性ホルモンである 1 7 5—エストラジオ一ルおよびエストリオ一ルを使用して検証した。まず、一定濃度の E 2—BSA— CY 5に 17 ?—エストラジオールを種々の濃度で添加して蛍光強度を同様に測定した。その結果、図 3 (A) に示すように、共存する 17 ?—エストラジオールの濃度が高くなるに従って蛍光強度が低下した。また、一定の濃度以上の 17 ?—エストラジオールを含有する場合、蛍光強度の一定以上の低下は観察されなくなり、この時の蛍光強度は対照として行った受容体を固定ィ匕していないビーズの場合と同等であった（図 3 (A) の最も下側の曲線参照）。なお、図 3 (A) 中、グラフ曲線上から、 17 ?—エストラジオール添加量が 0pM、 0. 05 pM、 0. 5 pM、 5 pM、 50 pM、 500 pM、および受容体も 17 ?—エストラジオ一ル添加もない場合の結果を示す。このことから、受容体に結合できる 17 エストラジオールは E 2—BSA— CY5の受容体への結合を競合的に阻害することが確認された。

そこで、同様の検討をエストリオールについても行ったところ、図 3 (B) に示すように、エストリオールも E 2— BSA— CY5の受容体への結合を競合的に阻害することが確認された（図中、グラフ曲線上から、エストリオール添加量が 0pM、 0. 5 pM、 5pM、 50pM、 500 pM、および受容体もエストリオール添加もなし）。これらに対し、男性ホルモンであるテストステロンの場合、図 3 (C) に示すように、測定を行った濃度では E 2— B SA— CY5の受容体への結合を阻害しなかった（図中、グラフ曲線上から、テストステロン添加量が 0 pM、 50 pM, 500pM、 5000pM、 500000 pM および受容体もテストステロン添加もなし）。

上述の天然ホルモンの添加濃度と蛍光強度の低下率との関係を図 4に示す。ここで、蛍光強度の低下率は、天然ホルモンを添加していない場合を 100%とし、ホルモンの添加により E 2— B SA— CY 5の受容体への結合が阻害された割合 (結合阻害率，単位％)として表した。その結果、 17 ?—エストラジオールの場合 10— ¹³〜 10— ⁹ Mの濃度範囲で、そしてエストリオ一ルの場合 10— ¹²〜 10 Mの濃度範囲で蛍光強度の低下が確認できることがわかる。従って、上記測定系において、 17 ?—ェストラジオ一ルは 10— ¹³〜 10— ⁹Mの濃度範囲で、そしてエストリオールは 10— ^I2〜l 0—⁹Mの濃度範囲で検出され得る。

( 3 ) 化学物質による標識女性ホルモンの固定化受容体への結合阻害前項と同様の検討を化学物質について行った。化学物質として外因性内分泌撹乱作用を有することが疑われている夕モキシフェン、ビスフエノール A、ジェチルスチルベストロール（DE S) およびノニルフエノールを選択した。これらの物質を一定濃度の E 2— B SA— CY 5に種々の濃度で添加し、蛍光強度の低下を測定した。その結果、いずれの場合も共存する化学物質の濃度が高くなるに従つて蛍光強度が低下した〔図 5 ：共存する化学物質は（A) が夕モキシフェン、 (B) がビスフヱノール A、 (C) が DE S、 (D) がノニルフエノールであり、それそれの添加量はグラフ曲線上から、（A) が添加なし、 0. 5 pM、 5pM、 50 pM、 500 pM、 5000 pM、 50000 pM、そして受容体も夕モキシフェン添加もなし、（B) が添加なし、 5 pM、 50pM、 500 pM、 500 0pM、 50000 pM、 500000 pM、そして受容体もビスフエノール A 添加もなし、（C) が添加なし、 0. 05 pM、 0. 5 pM、 5 pM、 500pM、 5000 pM そして受容体も DE S添加もなし、（D) が添加なし、 0. 5 pM、 5 pM、 50pM、 5000 pM、 50000 pM、そして受容体もノニルフエノール添加もなし〕。また、一定の濃度以上の化学物質の添加では一定以上の蛍光強度の低下は観察されなくなり、この時の蛍光強度は対照として行った受容体を固定化していないビーズの場合と同等であった。

以上の結果から、これらの化学物質は E 2— B S A—C Y 5の受容体への結合を競合的に阻害することが認められた。また、蛍光強度の低下率を E 2— B SA —CY 5の受容体への結合阻害率とし、その時の各化学物質の添加濃度との関係を図 6に示した。

その結果、 E 2— B SA—CY 5の受容体への結合阻害を蛍光強度の変化として測定することにより、夕モキシフェン、 DE S、ノニルフエノール、ビスフエノール Aをそれそれ 10— ¹²〜： L 0— ⁹M、 10— ¹²〜： L 0— ⁹M、 10— ⁹〜： 10— ⁵M、 10— ⁸〜 10— ⁶Mの濃度範囲で検出することができる。このように、本発明の検出方法に従って女性ホルモン受容体結合性を有する化学物質を簡便かつ高感度に検出することができる。

また別途、エストラジオ一ル一 3—スルフエ一ト、エストラジオール一 17— グルクロニド、ェストラジオ一ルー 3—グルクロニド、エストリオール一 3—スルフェート、エストリオール一 17—グルクロ二ドおよびエストリオ一ル— 3— ダルクロニドに対しても同様な操作を行ったところ、いずれの化学物質に対しても前記と同様に高感度に検出することが可能であった。

(4) 従来法との比較

外因性内分泌撹乱物質を検出するための従来の方法には、上記したように放射受容体検定法、免疫検定法、蛍光偏向解消法、組換え酵母を使用する方法、受容体との複合体と遺伝子との結合を指標として放射活性を用いて使用する方法等が知られている。これらの方法および本発明の方法に従い、エストラジオールを検出物質とした場合の検出範囲を下の表 1にまとめて示す。この結果から、従来の方法による化学物質（エストラジオール）の検出範囲は 50〜1000 OpMであるのに対し、本発明の方法では 1〜10 O pMであり、外因性内分泌撹乱物質検出感度における本発明の有効性が明白である。方法検出範囲（pM)

放射受容体検定法 50〜： L 000

免疫検定法 370〜37000

蛍光偏向解消法 1000〜 100000

組換え酵母を使用する方法 100

本発明の方法 1〜 100 実験 II

A. 材料と方法

( 1) ホルモン、抗ホルモン抗体

固定化するおよび試料中に添加するホルモンとして 17 —エストラジオール (和光純薬工業社製)およびエストリオール (和光純薬工業社製）を使用した。また、抗エストラジオール抗体としては、バイオデザイン社、バイオスパシフィック社、フィツアーアルド社、およびコ一テックスバイオケミストリ一社のものを、また抗エストリオール抗体はバイオストライド社のものを使用した。さらに二次抗体を用いる場合は、前記抗女性ホルモン抗体に対する特異的抗体（Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.,ペンシルバニア州，ァメリ力合衆国）を準備した。

( 2 ) ホルモン固定化担体の調製

エストラジオ一ルおよびエストリオールの担体（ビーズ）への固定は自然吸着法により行った。具体的には、エストラジオールあるいはエストリオールを結合させた牛血清アルブミン（アメリカ合衆国、シグマ社製）を用いた。 1 0 0マイクログラムのエストリオ一ル結合牛血清アルブミンを 1 m lの生理食塩水に溶解し、溶解液に 2 0 0ミリグラムの平均粒径 9 5 /zmのポリメチルメ夕クリル酸の粒子 (ガンツ化成社製）を加えた。この後、 1時間震盪して自然吸着を促した。自然吸着後、さらに 1 0 0マイクロリツトルの牛血清アルブミン（ 1 0 0ミリグラム/ m

1 ) を添加し、震盪した。最後に、生理食塩水で担体を洗浄し、ホルモン固定化担体とした。

( 3 ) 蛍光標識抗体の調製

前記抗エストラジオ一ル抗体、あるいは抗エストリオール抗体の蛍光標識付けは、 C Y 5ラベリングキット〔アメリカ合衆国イリノイ州ァ一リントンハイトのァマルシャム ·ライフサイエンス社製〕を用いて行った。またこれら抗女性ホルモン抗体に対する蛍光標識二次抗体は、前掲のジャクソンイミユーノリサ一チラボラトリーズ社から購入した。

( 4 ) 蛍光検出装置

蛍光強度の測定は、蛍光標識された抗ホルモン抗体を用いる場合、実験 Iと同様にフロー式蛍光光度計〔米国アイダホ州ボイシのサピダイン ·インストルメント社製〕を組み込んだ検出装置を使用しほぼ同様の手順にて行った。

一方、抗ホルモン抗体は無標識のもの（一次抗体）とし、抗ホルモン抗体に特異的に結合する抗体を蛍光標識したものを二次抗体として用いる場合の検出方法の概要を図 7に示す。検出装置としては図 7 ( A) に示すように、実験 Iと同様にフ口一式蛍光光度計〔米国アイダホ州ボイシのサピダイン ·インストルメント社製〕を組み込んだ検出装置を使用し、ガラスセル 1 1の前面に配置された集束光学レンズ 1 6により励起光源（図示せず）からの励起光をガラスセル 1 1内に充填された女性ホルモン固定化ビーズ（抗原固定化ビーズ） 1 2に入射し、当該入射光により励起されて発光した蛍光を前記光学レンズ 1 6により検出器（図示せず）へ向かわせ、検出器により、蛍光強度を電気信号単位で測定する。女性ホルモン固定化ビーズ 1 2はガラスセル 1 1内に設置されたスクリーン Sによりせき止めて積層することによりガラスセル 1 1中に充填した。また、このガラスセル 1 1の上流側には、ビーズ、試料、洗浄液および蛍光標識二次抗体の供給源に接続されたロータリ一バルブ 1 7が配してあり、下流側に配されたシリンジボンブ（図示せず）と共働して操作することにより、ガラスセル内にこれらの物質を順次供給した。

測定操作は、図 7 ( C ) に示すように、予めある既知量の一次抗体と混合した試料を、抗原（女性ホルモン）固定化ビーズに接触させる（ステップ 1 )。ここで、試料中に含まれる遊離女性ホルモンと反応していない余剰の未反応一次抗体がビーズ上の固定化抗原と反応し、捕捉される。セル内に洗浄液を流し前記試料をセル内から除去した後、セル内に十分な量の蛍光標識二次抗体を流す（ステップ 2 )。この操作において、蛍光標識二次抗体は、固定化抗原に捕捉された一次抗体に特異的に反応し、結合一次抗体の量に応じた量のみが固定化ビーズ上に結合する。最後に、洗浄液を流して未結合の蛍光標識二次抗体をセル内から除去すると (ステップ 3 )、抗原固定化ビーズに結合した一次抗体に二次抗体を介して結合した標識蛍光物質のみがセル内に残り、その蛍光強度を測定することで抗原固定化ビーズに結合した一次抗体量を検知し、試料中に存在していた遊離抗原量を知ることができる。なお、図 7 ( B ) は、これら一連のステップにおいて検出される蛍光強度の変化の典型例を示すものである。

B . 結果

図 8は、抗ホルモン抗体を蛍光標識した系において測定したエストリオールの定量結果を示すものであり、また図 9は蛍光標識二次抗体を用いた系において測定したエストリオールおよびエストラジオールの定量結果を示すものである。一定濃度の蛍光標識抗体にエストリオ一ルを種々の濃度で添加した場合に、検出容器で検出される蛍光強度の低下率を固定化ホルモンへの結合阻害率とし、その時の遊離エストリオールの添加濃度との関係を図 7に示した。いずれにおいても、このように固定化ホルモンへの結合阻害を蛍光強度の変化として測定することにより、従来の酵素結合ィムノソルベント法（E L I S A) で同様にエストリオールおよびエストラジオールを検出した場合と比べて、 5 0〜 1 0 0倍程度の検出限界が達成でき、本発明の検出方法が高感度であることが示された。

産業上の利用可能性

以上詳細に説明したように、本発明の外因性内分泌撹乱物質の検出方法および検出装置は、原理的に受容体あるいは抗体の種類に関われず、これらに結合性を持つ物質を検出ならびに定量できるものであり、外因性内分泌撹乱物質を従来の最高感度の方法に比べ数十倍の高い感度で検出することができるものである。しかも本発明における外因性内分泌撹乱物質の検出は蛍光強度の測定により行い得、操作が極めて簡便である。

外因性内分泌撹乱物質、いわゆる環境ホルモンはナノモルないしはピコモル程度の極めて低濃度で存在する場合でも、生体に悪影響を及ぼすとされているが、本発明は上記のように極めて低濃度で含有する試料でも環境ホルモンを高い感度で検出し得、しかもその操作が極めて容易であるため、環境保護の分野、ひいては生態系の維持に対する寄与は多大である。

Claims

請求の範囲

1 . 試料中における外因性内分泌撹乱物質の存在を検出する方法であって、固定化された女性ホルモン受容体と蛍光標識された女性ホルモンとを用い、既知量の前記固定化女性ホルモン受容体に対する既知量の前記蛍光標識女性ホルモンと前記試料中の存在未知なる外因性内分泌撹乱物質との競争的結合反応を行い、前記固定化女性ホルモン受容体に結合した前記蛍光標識女性ホルモンの標識蛍光の蛍光強度を測定することを特徴とする外因性内分泌撹乱物質の検出方法。

2 . 前記固定化女性ホルモン受容体を充填した検出容器にある濃度の前記蛍光標識された女性ホルモンを導入した場合に検出される蛍光強度を検出値 F。とし、試験すべき前記試料を混合した上記と同濃度の前記蛍光標識された女性ホルモンを前記検出容器に導入した場合に検出される蛍光強度を検出値 F！とし、前記検出値が前記検出値 F。に比べ小さいならば、上記試験すべき試料中に前記外因性内分泌撹乱物質が存在するものとすることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の検出方法。

3 . 前記固定化女性ホルモン受容体を充填した前記検出容器にある濃度の蛍光標識された前記女性ホルモンを導入した場合に検出される蛍光強度を検出値 F o とし、前記試験すべき試料を混合した上記と同濃度の蛍光標識された女性ホルモンを上記検出容器に導入した場合に検出される蛍光強度を検出値とし、検出値 F iと検出値 F。との比を算出し、予め作製しておいた検量線によって、上記試験すべき試料中に存在する外因性内分泌撹乱物質の量を求めることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の検出方法。

4 . 前記女性ホルモン受容体がエストロゲン受容体である請求の範囲第 1項から第 3項のいずれかに記載の検出方法。

5 . 前記検出容器が容積 1 0 0 mm³以下のセルである請求の範囲第 2項から第 4項のいずれかに記載の検出方法。

6 . 前記試料が固定化女性ホルモン受容体に連続的に接触しうるように検出容器がフロー式である請求の範囲第 2項から第 5項のいずれかに記載の検出方法。

7 . 固定化女性ホルモン受容体を充填した検出容器、該検出容器内を励起する光源および励起後の前記検出容器内の蛍光強度を検出する検出器とからなり、蛍光標識された女性ホルモンと組み合わせて用いるものであることを特徴とする外因性内分泌撹乱物質の検出装置。

8 . 前記女性ホルモン受容体がエストロゲン受容体である請求の範囲第 7項に記載の検出装置。

9 . 前記検出容器が容積 1 0 0 mm³以下のセルである請求の範囲第 7項または第 8項に記載の検出装置。

1 0 . 試料が前記固定化女性ホルモン受容体に連続的に接触しうるように前記検出容器がフロー式である請求の範囲第 7項から第 9項のいずれかに記載の検出

1 1 . 試料中における外因性内分泌撹乱物質の存在を検出する方法であって、固定化された女性ホルモンと、当該女性ホルモンに対する抗ホルモン抗体とを用い、既知量の前記抗ホルモン抗体を前記試料に導入して存在未知なる外因性内分泌撹乱物質と抗原抗体反応に供し、その後、この抗ホルモン抗体と前記試料との反応混合液を、既知量の前記固定化女性ホルモンと接触させ、前記固定化女性ホルモンに結合した抗ホルモン抗体量を、当該抗ホルモン抗体に結合させた標識蛍光の蛍光強度を測定することで検出することを特徴とする外因性内分泌撹乱物質の検出方法。

1 2 . 前記抗ホルモン抗体が蛍光標識抗ホルモン抗体であり、前記固定化女性ホルモンに結合した抗ホルモン抗体量を、当該蛍光標識抗ホルモン抗体の標識蛍光の蛍光強度を測定することで検出することを特徴とする請求の範囲第 1 1項に記載の外因性内分泌撹乱物質の検出方法。

1 3 . 前記抗ホルモン抗体を無標識一次抗体とし、前記固定化女性ホルモンに結合した抗ホルモン抗体量は、二次抗体として当該一次抗体に特異的に結合する蛍光標識抗一次抗体抗体を用い、前記固定化女性ホルモンに結合した前記一次抗体に前記二次抗体を特異的に結合させ、この結合二次抗体の標識蛍光の蛍光強度を測定することで検出することを特徴とする請求の範囲第 1 1項に記載の外因性内分泌撹乱物質の検出方法。

1 4 . 前記固定化女性ホルモンを充填した検出容器にある濃度の前記抗ホルモン抗体を導入した場合に検出される蛍光強度を検出値 F。とし、試験すべき試料を混合した上記と同濃度の前記抗ホルモン抗体を上記検出容器に導入した場合に検出される蛍光強度を検出値 F iとし、前記検出値 F 1が前記検出値 F。に比べ小さいならば、上記試験すべき試料中に外因性内分泌撹乱物質が存在するものとすることを特徴とする請求の範囲第 1 1項から第 1 3項のいずれかに記載の検出方法。

1 5 . 前記固定化女性ホルモンを充填した検出容器にある濃度の前記抗ホルモン抗体を導入した場合に検出される蛍光強度を検出値 F。とし、試験すべき試料を混合した上記と同濃度の前記抗ホルモン抗体を上記検出容器に導入した場合に検出される蛍光強度を検出値 F とし、前記検出値 F ,と前記検出値 F。との比を算出し、予め作製しておいた検量線によって、上記試験すべき試料中に存在する外因性内分泌撹乱物質の量を求めることを特徴とする請求の範囲第 1 1項から第 1 3項のいずれかに記載の検出方法。

1 6 . 前記検出容器が容積 1 0 0 mm³以下のセルである請求の範囲第 1 4項または第 1 5項に記載の検出方法。

1 7 . 前記試料が前記固定化女性ホルモンに連続的に接触しうるように前記検出容器がフロー式である請求の範囲第 1 2項から第 1 6項のいずれかに記載の検出方法。

1 8 . 固定化女性ホルモンを充填した検出容器、該検出容器内を励起する光源および励起後の前記検出容器内の蛍光強度を検出する検出器とからなり、蛍光標識された前記女性ホルモンに対する抗ホルモン抗体と組み合わせて用いるものであることを特徴とする外因性内分泌撹乱物質の検出装置。

1 9 . 固定化女性ホルモンを充填した検出容器、該検出容器内を励起する光源および励起後の前記検出容器内の蛍光強度を検出する検出器とからなり、前記女性ホルモンに対する抗ホルモン一次抗体およびこの抗ホルモン抗体と特異的に結合する蛍光標識された二次抗体と組み合わせて用いるものであることを特徴とする外因性内分泌撹乱物質の検出装置。