CN114199838B - 环境污染中环境雌激素干扰物的检测方法 - Google Patents
环境污染中环境雌激素干扰物的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，包括如下步骤：提供对数期的细胞，所述细胞包含雌激素膜受体；将所述细胞置于添加有待测环境污染物和荧光标记的雌激素的无酚红完全培养基中进行暴露试验，检测所述暴露试验的初始荧光强度；所述暴露试验结束，将所述完全培养基换成细胞培养缓冲液，检测所述暴露试验的终止荧光强度；根据所述初始荧光强度和所述终止荧光强度的差值实现所述环境污染物中所述环境雌激素干扰物的定性检测。本发明是基于雌激素膜受体干扰效应进行环境雌激素干扰物检测，将细胞同时充分暴露于荧光标记的雌激素与环境污染物之后即可进行荧光检测，耗时短。
Description
技术领域
本发明属于污染物的检测技术领域，特别涉及一种环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法。
背景技术
世界卫生组织(WHO)指出环境内分泌干扰物是指能够影响动物的内分泌系统机能，对个体及其后代或者群体(部分亚群体)造成损害的外源性化学物质或混合物。目前，已经有上千种环境物质被确定为内分泌干扰物，随着其作用机制的阐明，被确定为内分泌干扰物的种类和数量可能还会有所增加。其中，环境雌激素干扰物是最重要的一种内分泌干扰物，可以引起种群退化和人体内分泌系统的损害。
对环境雌激素干扰物作用机制的研究发现，其可以通过与核受体相互作用干扰生物体内的分泌系统。因此，传统的检测环境雌激素干扰物的方法主要包括化学分析技术以及雌激素核受体干扰效应检测技术，例如：MCF-7细胞增殖实验(E-SCEEN)，激素受体转录激活实验(Receptor Transcriptional Activation)，酵母雌激素筛选试验(核受体双杂交酵母技术检测环境污染物的雌激素干扰效应。基于雌激素核受体干扰效应的检测技术报道还例如：201510025917.1公开的一种检测雌激素或类雌激素化合物浓度的方法，期刊中的文献(Cao et al.,Environ.Sci.Technol.2017,51,11423-11430.Bisphenol AF andBisphenol B Exert Higher Estrogenic Effects than Bisphenol A via G Protein-Coupled Estrogen Receptor Pathway.DOI:10.1021/acs.est.7b03336 Yeast estrogenscreen assay,YES)报道的利用流式细胞仪检测雌激素膜受体干扰物的检测技术。
传统的环境雌激素干扰物的检测主要是基于雌激素核受体干扰效应开展，不够全面。
发明内容
基于以上技术问题，本发明的主要目的是基于雌激素膜受体干扰效应进行环境雌激素干扰物检测，从而提供一种新的环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
提供对数期的细胞，所述细胞包含雌激素膜受体；
将所述细胞置于添加有待测环境污染物和荧光标记的雌激素的无酚红完全培养基中进行暴露试验，检测所述暴露试验的初始荧光强度；
所述暴露试验结束，将所述完全培养基换成细胞培养缓冲液，检测所述暴露试验的终止荧光强度；
根据所述初始荧光强度和所述终止荧光强度的差值实现所述环境污染物中所述环境雌激素干扰物的定性检测。
在其中一些实施例中，所述暴露试验的时长为0.5小时-1.5小时。
在其中一些实施例中，所述荧光标记的雌激素的终浓度为1×10-5mol/L-10-7mol/L。
在其中一些实施例中，所述待测环境污染物的浓度以对所述细胞的细胞急性毒性＜10％。
在其中一些实施例中，所述暴露试验采用的细胞密度为1×105个/mL-2×105个/mL。
在其中一些实施例中，所述细胞包含SKBR3细胞。
在其中一些实施例中，所述雌激素包含雌二醇、双酚A和壬基酚中的一种或者几种。
在其中一些实施例中，所述细胞培养缓冲液包含磷酸盐缓冲液和TRIS缓冲液中的一种或者两种。
在其中一些实施例中，荧光标记采用荧光染料为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、羟基荧光素和四氯荧光素中的一种或者多种。
在其中一些实施例中，检测所述初始荧光强度和所述终止荧光强度的吸收光波长为490nm-495nm、发射光波长为520nm-530nm。
在其中一些实施例中，所述暴露试验在96孔细胞培养板中进行。
在其中一些实施例中，所述检测方法还包括制备荧光标记的雌激素的梯度浓度溶液、绘制荧光标准曲线并根据所述荧光标准曲线对所述环境雌激素干扰物进行半定量检测的步骤。
与传统技术相比，本发明具备如下有益效果：
传统检测技术忽略了环境雌激素干扰物对雌激素膜受体的干扰途径。基于此，本发明主要通过检测雌激素膜受体干扰效应进行环境雌激素干扰物的检测，从而提供一种新的环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，弥补了传统技术存在单一性、不够全面的缺陷，填补了环境雌激素干扰物领域一项空白。同时，本发明提供的检测方法灵敏度较高，线性范围宽，可以广泛用于环境污染物雌激素膜受体干扰效应的检测。本发明的检测方法为环境监测部门对内分泌干扰物的监测提供了新技术，为环境及相关部门化学品安全性评价以及新化学物质环境管理提供技术平台。
本发明提供的检测方法的技术原理包括：将携带雌激素膜受体的细胞同时暴露于荧光标记的雌激素与环境污染物中，荧光标记的雌激素与环境污染物中的环境雌激素干扰物共同竞争细胞表面的雌激素膜受体，检测暴露初始与暴露结束后结合在细胞表面的荧光标记的雌激素的浓度，即可推测被环境污染物竞争结合的量。本发明提供的检测方法将细胞同时充分暴露于荧光标记的雌激素与环境污染物(1小时左右)之后即可进行荧光检测，耗时短。
本发明提供的检测方法，还区别于传统的化学分析技术，克服了其只能分析少量的靶标污染物的局限性。
本发明提供的检测方法，能在细胞培养板上结合酶标仪检测技术进行，有助于增加实验通量，提升检测效率，从而满足对大量环境样品筛查的需要。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中检测的环境污染物双酚A(BPA)对雌激素膜受体的结合作用图；
图2为本发明一个实施例中检测的不同的饮用水样本对雌激素膜受体的结合作用图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
对环境雌激素干扰物作用机制的研究发现，其除了通过与核受体相互作用干扰生物体内分泌系统，与雌激素膜受体(GPER)也会产生干扰作用。但是现有的检测环境雌激素的方法主要包括化学分析技术分析少量的靶标污染物，以及雌激素核受体干扰效应检测技术。针对雌激素膜受体干扰效应的检测技术还比较欠缺。
本发明提供一种环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
提供对数期的细胞，所述细胞包含雌激素膜受体；
将所述细胞置于添加有待测环境污染物和荧光标记的雌激素的无酚红完全培养基中进行暴露试验，检测所述暴露试验的初始荧光强度；
所述暴露试验结束，将所述完全培养基换成细胞培养缓冲液，检测所述暴露试验的终止荧光强度；
根据所述初始荧光强度和所述终止荧光强度的差值实现所述环境污染物中所述环境雌激素干扰物的定性检测。
本发明所述的定性检测主要是，根据所述初始荧光强度和所述终止荧光强度的差值判断待测环境污染物中是否存在环境雌激素干扰物，以及环境雌激素干扰物与雌激素膜受体结合强度大小。
在其中一个示例中，所述暴露试验的时长为0.5小时-1.5小时。本发明的暴露试验的时长可以选自，包括但不限于：0.5小时、0.6小时、0.7小时、0.8小时、0.9小时、1.0小时、1.1小时、1.2小时、1.3小时、1.4小时、1.5小时。
在其中一个示例中，所述荧光标记的雌激素的浓度为10-5mol/L-10-7mol/L。本发明所述荧光标记的雌激素的浓度，可以选自，包括但不限于：10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L。优选地为10-6mol/L。
本发明检测方法，是基于细胞进行的，待测环境污染物在暴露试验中的浓度较优地对细胞不产生明显的毒性，例如其浓度可以控制在但不限于：对所述细胞的细胞急性毒性＜10％的范围内。
在其中一些实施例中，所述暴露试验采用的细胞密度为1×105/mL-2×105/mL。本发明暴露试验采用的细胞密度，可以选自，包括但不限于：1×105/mL、1.2×105/mL、1.4×105/mL、1.5×105/mL、1.6×105/mL、1.8×105/mL、2×105/mL。
本发明提供的检测方法，主要是基于雌激素膜受体途径进行检测，相应地，选用的细胞需要包含雌激素膜受体，不包含雌激素核受体。本发明采用的乳腺癌SKBR3细胞，不含有雌激素核受体，仅在细胞表面含有雌激素膜受体GPER，因此适合于此检测体系，避免雌激素核受体的干扰，专一性得检测由雌激素膜受体介导的雌激素干扰效应。
本发明提供的检测方法，雌激素主要是与待测环境污染物中的雌激素干扰物竞争结合雌激素膜受体，可以选自，包括但不限于：雌二醇、双酚A和壬基酚等多种雌激素干扰物。
本发明提供的检测方法对细胞缓冲液不做特别限定，可以选自，包括但不限于：磷酸盐缓冲液和TRIS缓冲液。
本发明提供的检测方法，对荧光标记的染料种类不做特别限定，可以选自，包括但不限于：异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、四乙基罗丹明(RB200)等。
本发明提供的检测方法，可以根据所选用的荧光标记的染料种类，选取合适的检测波长，例如选用的染料为异硫氰酸荧光素(FITC)，对应选择的吸收光波长为490nm-495nm、发射光波长为520nm-530nm。
本发明提供的检测方法，对荧光强度检测所采用的设备不做特别限定，包括但不限于酶标仪。
在其中一些示例中，所述暴露试验在96孔细胞培养板中进行。
本发明提供的检测方法，采用96孔细胞培养板进行暴露试验，利用酶标仪进行荧光强度检测，实现了高通量筛选。
在其中一个示例中，所述检测方法还包括制备荧光标记的雌激素的梯度浓度溶液、绘制荧光标准曲线并根据所述荧光标准曲线对所述环境雌激素干扰物进行半定量检测的步骤。
实施例1、环境污染物双酚A(BPA)的检测
1、细胞培养
将人乳腺癌细胞系SKBR3细胞培养在37℃、5％(v/v)CO2的细胞培养箱中，SKBR3的细胞培养基为含有10％(v/v)胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,Gibco)和1％(w/v)青霉素-链霉素(penicillin/streptomycin，Gibco)的RPMI 1640培养基。
细胞培养过程中，细胞培养基2d-3d更换一次，当细胞汇合度达到85％以上，采用0.05％(w/v)胰酶(Trypsin-EDTA，Gibco)消化细胞，按实验需要调整传代细胞密度。
2、环境污染物96孔板暴露
(1)细胞孵育
将SKBR3细胞以1.5×104/孔的密度接种在96孔板中，在有酚红的完全培养基中孵育24小时后，到达对数期。
(2)试验
1)待测环境污染物的稀释：以99％纯度以上的DMSO(分析纯级)为溶剂，将双酚A制备成10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L的双酚A稀释液。
2)暴露组：更换细胞培养基为无酚红的完全培养基(细胞密度控制在1×105个/mL-2×105个/mL)，加入双酚A的各个浓度的稀释液(每孔加入1μL，保证有机溶剂DMSO的终浓度小于0.1％)以及荧光标记(FITC)的雌二醇小分子探针(终浓度为10-6mol/L)，在细胞培养箱中暴露1小时，每个环境污染物浓度具有3个平行；
3)对照组：96孔板中设置阳性对照和溶剂对照组，阳性对照组分别向无酚红的完全培养基加入终浓度分别为10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L的荧光标记的雌二醇，每个浓度具有3个平行；溶剂对照组向无酚红的完全培养基加入终浓度为0.1％的DMSO。
3、利用酶标仪进行荧光强度检测
利用酶标仪在490/520nm检测荧光标记的雌二醇小分子探针与环境污染物共同暴露的初始荧光强度(记作A0)，然后1小时之后弃去上清，加入磷酸盐缓冲液，再一次在490/520nm检测荧光强度(记作A1)，两次荧光强度之差(△A)代表着环境污染物与荧光标记的雌二醇小分子探针对雌激素膜受体的竞争结合能力。
Binding rate(％)＝A1/A0×100％。
4、数据处理
使用OriginPro2016进行统计分析。所有实验重复至少三次，结果均以平均值±SD(标准偏差)表示。采用Levene检验分析所有数据方差的均一性，并使用单因素方差分析(ANOV A)检验各组差异的显著性，当p值<0.05时，被认为具有统计学意义的差异。
结果见图1，根据图1的曲线，可以看出随着双酚A暴露浓度的增加，荧光标记的雌二醇小分子与雌激素膜受体的结合量越来越低，说明无荧光标记的双酚A取代了荧光标记的雌二醇小分子的位置，导致在酶标仪490/520nm检测出来的荧光强度变低，即荧光标记的雌二醇小分子的Binding rate(％)变低。通过建立荧光标记的雌二醇小分子或者双酚A的暴露浓度与Binding rate(％)的标准曲线，可以形成检测环境样品及其它环境污染物的半定量方法，即其它环境污染物可以依靠双酚A的剂量效应关系曲线转化成双酚A的当量浓度。
本实施例的技术原理：利用荧光(FITC)标记的雌二醇小分子探针与环境污染物共同竞争细胞表面的膜受体，通过将荧光标记的雌二醇小分子探针与环境污染物在96孔细胞培养板内共同暴露，在酶标仪490/520nm波长下，检测暴露开始与暴露结束后，结合在细胞表面的荧光(FITC)标记的雌二醇小分子探针的浓度，即可推测被环境污染物竞争结合的量。
实施例2、不同的饮用水样本的检测
1、细胞培养
将人乳腺癌细胞系SKBR3细胞培养在37℃、5％CO2的细胞培养箱中，SKBR3的细胞培养基为含有10％胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,Gibco)和1％青霉素-链霉素(penicillin/streptomycin，Gibco)的RPMI 1640培养基。
细胞培养过程中，细胞培养基2d-3d更换一次，当细胞汇合度达到85％以上，采用0.05％胰酶(Trypsin-EDTA，Gibco)消化细胞，按实验需要调整传代细胞密度。
2、环境污染物96孔板暴露
(1)细胞孵育
将SKBR3细胞以2×104/孔的密度接种在96孔板中，在有酚红的完全培养基中孵育24小时后，到达对数期。
(2)试验
1)更换细胞培养基为无酚红的完全培养基(细胞密度控制在1×105个/mL-2×105个/mL)，加入饮用水样本(每孔加入1μL)以及荧光标记的雌二醇小分子探针(终浓度为10- 6mol/L)，在细胞培养箱中暴露1小时；
其中，bottled1、bottled2、bottled3、bottled4、bottled5、bottled6均为市场上购买的瓶装水，blank为milli-Q水，作为空白对照。所有的饮用水样本利用液液萃取的方法(有机溶剂为二氯甲烷)，经过浓缩和溶剂替换(置换为99％纯度以上的DMSO)，最终1L水浓缩在10μLDMSO中。
2)对照组：96孔板中设置阳性对照和溶剂对照组，阳性对照组分别向无酚红的完全培养基加入终浓度分别为10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L的雌二醇，每个浓度具有3个平行；溶剂对照组向无酚红的完全培养基加入终浓度为0.1％的DMSO。
3、利用酶标仪进行荧光强度检测
利用酶标仪在490/520nm检测荧光标记的雌二醇小分子探针与环境污染物共同暴露的初始荧光强度(记作A0)，然后1小时之后弃去上清，加入磷酸盐缓冲液，再一次在490/520nm检测荧光强度(记作A1)，两次荧光强度之差(△A)代表着环境污染物与荧光标记的雌二醇小分子探针对雌激素膜受体的竞争结合能力。
4、数据处理
使用OriginPro2016进行统计分析。所有实验重复至少三次，结果均以平均值±SD(标准偏差)表示。采用Levene检验分析所有数据方差的均一性，并使用单因素方差分析(ANOV A)检验各组差异的显著性，当p值<0.05时，被认为具有统计学意义的差异。
结果见图2，根据图2可以发现不同浓度的瓶装水可以与荧光标记的雌二醇小分子竞争结合雌激素膜受体，导致Binding rate(％)有不同程度的降低，每一个bottle样品中，从左到右依次为500倍水样浓缩到31.2倍水样浓缩，从图中可以看出随着水样浓缩倍数的升高，Binding rate(％)有不同程度的降低，意味着水中含有能够与荧光标记的雌二醇小分子竞争结合雌激素膜受体的小分子物质，而且随着小分子物质浓缩倍数的升高，其竞争结合能力增强。
实施例3、环境污染物双酚A(BPA)的检测
1、细胞培养
将SKBR3细胞培养在37℃、5％(v/v)CO2的细胞培养箱中，SKBR3的细胞培养基为含有10％(v/v)胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,Gibco)和1％(w/v)青霉素-链霉素(penicillin/streptomycin，Gibco)的RPMI 1640培养基。
细胞培养过程中，细胞培养基2d-3d更换一次，当细胞汇合度达到85％以上，采用0.05％(w/v)胰酶(Trypsin-EDTA，Gibco)消化细胞，按实验需要调整传代细胞密度。
2、环境污染物96孔板暴露
(1)细胞孵育
将SKBR3细胞以1.0×104/孔的密度接种在96孔板中，在有酚红的完全培养基中孵育24小时后，到达对数期。
(2)试验
1)待测环境污染物的稀释：以分析纯级DMSO为溶剂，将双酚A制备成10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L的双酚A稀释液。
2)暴露组：更换细胞培养基为无酚红的完全培养基(细胞密度控制在1×105个/mL-2×105个/mL)，加入双酚A的稀释液(每孔加入1μL)以及荧光标记四乙基罗丹明(RB200)的壬基酚小分子探针(终浓度为10-6mol/L)，在细胞培养箱中暴露0.8小时，每个环境污染物浓度具有3个平行；
3)对照组：96孔板中设置阳性对照和溶剂对照组，阳性对照组分别向无酚红的完全培养基加入终浓度分别为10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L的荧光标记的双酚A，每个浓度具有3个平行；溶剂对照组向无酚红的完全培养基加入终浓度为0.1％的DMSO。
3、利用酶标仪进行荧光强度检测
利用酶标仪在570/600nm检测荧光标记的壬基酚小分子探针与环境污染物共同暴露的初始荧光强度(记作A0)，然后1小时之后弃去上清，加入磷酸盐缓冲液，再一次在570/600nm检测荧光强度(记作A1)，两次荧光强度之差(△A)代表着环境污染物与荧光标记的双酚A小分子探针对雌激素膜受体的竞争结合能力。
4、数据处理
使用OriginPro2016进行统计分析。所有实验重复至少三次，结果均以平均值±SD(标准偏差)表示。采用Levene检验分析所有数据方差的均一性，并使用单因素方差分析(ANOV A)检验各组差异的显著性，当p值<0.05时，被认为具有统计学意义的差异。
结果发现双酚A显示与图1(实施案1)类似的剂量效应关系。
对比例1
本对比例1是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别包括选择稳定期的细胞进行暴露试验且暴露时长为2小时。主要步骤如下：
1、细胞培养
将人乳腺癌细胞系SKBR3细胞培养在37℃、5％(v/v)CO2的细胞培养箱中，SKBR3的细胞培养基为含有10％(v/v)胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,Gibco)和1％(w/v)青霉素-链霉素(penicillin/streptomycin，Gibco)的RPMI 1640培养基。
细胞培养过程中，细胞培养基2d-3d更换一次，当细胞汇合度达到85％以上，采用0.05％(w/v)胰酶(Trypsin-EDTA，Gibco)消化细胞，按实验需要调整传代细胞密度。
2、环境污染物96孔板暴露
(1)细胞孵育
将SKBR3细胞以1.5×104/孔的密度接种在96孔板中，在有酚红的完全培养基中孵育3天以上至稳定期。
(2)试验
1)待测环境污染物的稀释：以0.1％DMSO为溶剂，将双酚A制备成10-4mol/L、10- 5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L的双酚A稀释液。
2)暴露组：更换细胞培养基为无酚红的完全培养基(细胞密度控制在1×105个/mL-2×105个/mL)，加入双酚A的稀释液(每孔加入1μL)以及荧光标记(FITC)的雌二醇小分子探针(终浓度为10-6mol/L)，在细胞培养箱中暴露2小时，每个环境污染物浓度具有3个平行；
3)对照组：96孔板中设置阳性对照和溶剂对照组，阳性对照组分别向无酚红的完全培养基加入终浓度分别为10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L的荧光标记的雌二醇，每个浓度具有3个平行；溶剂对照组向无酚红的完全培养基加入终浓度为0.1％的DMSO。
3、利用酶标仪进行荧光强度检测
利用酶标仪在490/520nm检测荧光标记的雌二醇小分子探针与环境污染物共同暴露的初始荧光强度(记作A0)，然后1小时之后弃去上清，加入磷酸盐缓冲液，再一次在490/520nm检测荧光强度(记作A1)，两次荧光强度之差(△A)代表着环境污染物与荧光标记的雌二醇小分子探针对雌激素膜受体的竞争结合能力。
4、数据处理
使用OriginPro2016进行统计分析。所有实验重复至少三次，结果均以平均值±SD(标准偏差)表示。采用Levene检验分析所有数据方差的均一性，并使用单因素方差分析(ANOV A)检验各组差异的显著性，当p值<0.05时，被认为具有统计学意义的差异。
结果binding rates只有高浓度(10-4mol/L、10-5mol/L)有统计学差异，低浓度(10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L)无统计学差异细胞状态影响了检测的灵敏度和检测范围。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
提供对数期的细胞，所述细胞包含雌激素膜受体；
将所述细胞置于添加有待测环境污染物和荧光标记的雌激素的无酚红完全培养基中进行暴露试验，检测所述暴露试验的初始荧光强度，所述暴露试验的时长为0.5小时-1.5小时；所述暴露试验结束，将所述完全培养基换成细胞培养缓冲液，检测所述暴露试验的终止荧光强度；
根据所述初始荧光强度和所述终止荧光强度的差值实现所述环境污染物中所述环境雌激素干扰物的定性检测。
2.根据权利要求1所述的环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，其特征在于，所述暴露试验的时长为1小时。
3.根据权利要求1所述的环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，其特征在于，所述荧光标记的雌激素的浓度为10-5mol/L-10-7mol/L。
4.根据权利要求1所述的环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，其特征在于，所述待测环境污染物的浓度以对所述细胞的细胞急性毒性＜10％计。
5.根据权利要求1所述的环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，其特征在于，所述暴露试验采用的细胞密度为1×105个/mL-2×105个/mL。
6.根据权利要求1至5任一项所述的环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，其特征在于，所述细胞包含SKBR3细胞。
7.根据权利要求1至5任一项所述的环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，其特征在于，所述雌激素包含环境中的雌二醇、双酚A和壬基酚中的一种或者多种；
或/和，所述细胞培养缓冲液包含磷酸盐缓冲液和TRIS缓冲液中的一种或者两种；
或/和，荧光标记采用荧光染料包含异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、羟基荧光素和四氯荧光素中的一种或者多种。
8.根据权利要求1至5任一项所述的环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，其特征在于，检测所述初始荧光强度和所述终止荧光强度的吸收光波长为490nm-495nm、发射光波长为520nm-530nm。
9.根据权利要求1至5任一项所述的环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，其特征在于，所述暴露试验在96孔细胞培养板中进行。
10.根据权利要求1至5任一项所述的环境污染物中环境雌激素干扰物的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括制备荧光标记的雌激素的梯度浓度溶液、绘制荧光标准曲线并根据所述荧光标准曲线对所述环境雌激素干扰物进行半定量检测的步骤。
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