WO2001026686A1

WO2001026686A1 - Agents permettant de reguler la fonction immunitaire de la peau

Info

Publication number: WO2001026686A1
Application number: PCT/JP2000/006980
Authority: WO
Inventors: Junichi Hosoi; Toru Tsuchiya
Original assignee: Shiseido Company, Ltd.
Priority date: 1999-10-08
Filing date: 2000-10-06
Publication date: 2001-04-19
Also published as: JP2003206237A; CN1378460A; EP1224944A1; TW539552B; KR100818139B1; US20050287232A1; EP1224944A4; KR20020050230A; CN100384474C

Description

明細書

皮膚免疫機能調節剤

技術分野

本発明は、化粧料および皮膚科学的技術分野に属する。具体的には、本発明は外部の影響から皮膚を保護するための調製剤および方法に関する。

背景技術

芳香植物およびそれらの精油がヒ卜の心および身体に対して各種の心理学的なおよび生理学的な影響を及ぼすことが知られてきた。香りの揮発分子は嗅覚粘膜細胞の織毛上の感覚タンパク質により受容され、嗅球や嗅覚神経系を介して辺縁系や視床下部にシグナルが伝達される（Leon ard and Tuite, Int, Rev. Neurobiol. 22:251-286, 1981) 。

臨床的に香料の向精神効果が試験されており（Komori et al, Neuroi mmunomodulation 2:174-180) 、そして嗅覚の刺激が、抗ヒッジ（anti - sheep) の赤血球中におけるプラーク形成細胞を減少させること（Shiba ta et al, Intern J Neurosience 51 :245-247, 1990) および唾液の s I g Aを増加させること（Komori et al, 前記）をはじめとする全身の免疫系を調節することも明らかにされている。

上記のように全身の免疫系に対する香料の作用が明らかにされつつあるものの、香料の皮膚に対する作用については、皮表の電位変化が解析されているにすぎない (Miltner et al, Psychophysiology 31:107-110, 1994, Alaoui - Iamaili et al, Physiol Behavior 62(4) : 713-720, 199 7) 。皮膚免疫は外敵の侵入を防ぐ防衛機能であると同時に、アレルギ —反応を引き起こす原因である。ランゲルハンス細胞といわれる皮膚免疫担当細胞は、表皮の低部に位置する樹状突起細胞であり、これらの細胞が遭遇した抗原を T細胞に呈示することにより免疫を誘導ないし惹起する。

他方、特定の香料の作用について概観すると、シトラルバ（すなわち、 3， 7—ジメチル _ 2， 6—ォクタジェン二トリル）は、力エルおよびラッ卜の嗅覚細胞においてアデ二ル酸シクラーゼを活性化することが報告されている（それぞれ、 Sklar et al， J. Biol. Chem, 261 : 15538-15543, 1986および Boekhoff et al， EMBO j. 9 : 2453-2458, 1990) 。ライラール（lyral： 4 - ( 4—ヒドロキシ一 4—メチルペンチル）一 3—シク口へキサン一 1 一カルボキシアルデヒド）とリリアール（lilial： 4 - ( 1， 1ージメチルェチル）一 α _メチルベンゼンプロパノール）との混合物が嗅覚レセプター発現細胞でィノシトールリン酸の代謝回転を誘導することも報告されている（Raming et al， Nature 361 : 353-356, 1993) 。

発明の開示

本発明者らは、局所経皮投与では実質的に作用を示さないものの、嗅覚受容体を刺激しうるかもしくは経気道的に体内に吸収されるとき、一定の揮発性物質が皮膚免疫反応を調節することを見出した。本発明はかような知見に基くものである。

また、嗅覚受容体を刺激しうる揮発性物質は、他方では、バルビツール酸誘発睡眠測定法において被験体の睡眠時間を有意に変動させる物質および Zまたは誘発陰性変動（Contingent Negative Variation) (以下、 C N Vと略記する）測定法において、被験体の C N Vの振幅面積を有意に変動させる物質に分類しうることも見出した。したがって、本発明によれば、嗅覚受容体を刺激しうる揮発性物質、より具体的には、バルビツール酸誘発睡眠測定法において被験体の睡眠時間を有意に変動させる物質および Zまたは C N V測定法において被験体の C N Vの振幅面積を有意に変動させうる物質を有効成分とする皮膚免疫機能調節剤が提供される。

別の態様の本発明としては、皮膚免疫機能調節剤を調製するための有効成分としての該揮発性物質の使用が提供される。

また、さらなる別の態様の本発明としては、皮膚免疫機能を調節することが望まれるかまたは必要な被験体に、該免疫機能を調節するのに十分量の該揮発性物質を経気道的に投与することを含んでなる被験体の皮膚免疫機能の調節方法も提供される。

本発明によれば、所望により、皮膚免疫機能を随意に調節できるので. 特に、皮膚免疫機能の異常、例えば、接触過敏症の予防もしくは治療、あるいは皮膚バリアー機能の維持もしくは回復に資すことができる。図面の簡単な説明

図 1は、シトラルバを有効成分として用いた場合の接触過敏の抑制について示すグラフである。 Aは、接触過敏反応を惹起時において香料に暴露した場合の結果を示し、 Bは接触過敏反応の誘発時において香料に暴露した場合の結果を示す。

図 2は、シトラルバと lyralZ lilial との皮膚免疫抑制効果の比較を示すグラフである。

図 3は、香料を局所投与した場合は皮膚免疫抑制効果を示すグラフである。

図 4は、拘束ストレスによる皮膚免疫能力を低下の防止についての香料 D M M Bの効果を示すグラフである。

図 5は、ランゲルハンス細胞に対するストレス負荷の影響および香料 D M M Bによるストレス負荷の影響の緩和もしくは抑制作用を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

本発明に用いることのできる「嗅覚受容体を刺激しうる揮発性物質」は、本発明の目的に沿う作用効果を奏するものであれば、天然物または化学合成品にいずれであってもよく、また、香りをもつ物質（特に、香料）もしくは香りをもたない物質であってもよい。本発明に関して「嗅覚受容体を刺激しうる」とは、例えば、嗅細胞の受容体に結合してサイクリック A M Pなどのセカンドメッセンジヤーを介して中枢へとシグナルを伝達しうる作用を意味する。また、揮発性物質とは、ヒトの生活温度もしくは若干加温した環境下で蒸気として追い出されうる物質をいい、液体または固体状態に保持されうる物質をいう。

かような揮発性物質としては、一般的に香料の分類等に使用できるバルビツール酸誘発睡眠測定法（例えば、 T. Tsuchiya et al.， Brain Re search Bul letin 26 : 397-401、 1991参照）により測定される睡眠時間を有意に変動させるものや誘発陰性変動（Contingent Negative Variat ion) (以下、 C N Vという）測定法（例えば、 W. G. Wal ter et al.， Nature 203： 380-384、 1964； S. Tori i, Cosmetics and Toi letaries 1 02、 1987参照）により決定される C N Vの振幅面積を有意に変動させるものを挙げることができる。

上記の睡眠時間を有意に変動させるとは、揮発性物質が投与されていないかもしくは該物質にさらされない被験体について測定された睡眠時間（対照）に比し、揮発性物質が投与されたかもしくは該物質にさらされた場合の被験体について測定された睡眠時間が少なくとも 1 5 %延長もしくは短縮されることを目安にすることができる。

かような延長させる作用を有する揮発性物質としては、限定されるものでないが、テルピニルアセテート、フエネチルアルコール、リナロール（linalool) およびァニス（種子由来の精油）を挙げることができる。これらは、一般に、低下した皮膚免疫機能を亢進するか、または皮膚免疫機能の異常は低下を防止できる。逆に短縮させる作用を有する揮発性物質としては、限定されるものでないが、シトラルバ、レモンオイル（レモンの果皮由来の精油）、ジャスミン（花由来のアブソリュート）、ィソボルニルアセテート（iso- bornyl acetate) およびフィトールを挙げることができる。これらは、一般に、過剰もしくは過敏な皮膚免疫応答を抑制できる。

他方、 C N Vの振幅面積を有意に変動させるとは、揮発性物質が投与されていないかもしくは該物質にさらされていない被験体について C N V測定を行って測定される C N Vの振幅面積（対照）に比し、揮発性物質が投与されたかもしくは該物質にさらされた場合の被験体に由来する C N Vの振幅面積が少なくとも 1 0 %減少もしくは増大させることを目安にすることができる。

かような振幅面積の減少をもたらす揮発性物質としては、限定されるものでないが、キヤラウヱ一、 1， 3—ジメトキシ一 5—メチルベンゼン（D M M B ) 、びゃくだん（木材由来の精油）、ばら（花由来の精油またはアブソリュート）、ローズマリー（全草由来の精油）、ベルガモット（果皮由来の精油）、ラベンダー（花穂由来の精油）、オレンジ（果皮由来の精油）およびカモミール（乾燥した花由来の精油）を挙げることができる。

これらの揮発性物質は、一般に、上記のような皮膚免疫機能を亢進する。逆に、増大をもたらす揮発性物質としては、限定されるものでないが、レモンオイル（果皮由来の精油）、ジャスミン（花由来のアブソリュ ―ト）、ペパーミント（全草由来の精油）、バジル（全草由来の精油）、クロ一ブ（花蕾由来の精油）およびスターァニス（実由来の精油）を挙げることができる。これらの揮発性物質は、一般に、上記のような皮膚免疫機能を抑制できる（過剰な皮膚免疫応答の抑制）。なお、以上の測定法で言及している被験体は、通常、健常な成人またはヒト以外の哺乳動物、例えばマウス、ラット、等を意味する。

本発明に従う皮膚免疫機能調節剤は、上記揮発性物質の 1種または 2 種以上の混合物を有効成分として使用することができる。上述のように、本発明にいう皮膚免疫機能調節は、皮膚免疫が過剰に亢進した状態にある場合には免疫を鎮静化させ、他方、皮膚免疫が減弱している場合には免疫を亢進もしくは賦活化させることを意味する。さらには、該免疫機能調節には、正常とみなすことのできる免疫機能が過剰に亢進するかまたは減弱することを予防することも包含される。

かような本発明の効果を確実なものにするには、有効成分たる揮発性物質が嗅覚受容体を刺激する状態におかれるかもしくはその有効量が経気道的に体内に吸収されることが必要である。かような有効量は、例えば、後述の試験方法で評価されるような、例えば、ランゲルハンス細胞数が対照（未処置）に比べて有意に減少もしくは増加する量である。上記の睡眠時間を短縮およびまたは C N Vの振幅面積を増大する揮発性物質にあっては、ランゲルハンス細胞数が有意に減少するような量であり、もう一方の揮発性物質にあっては、前記作用の逆の作用を奏する量である。

このような有効量は、被験体の年齢、免疫状態、香料の投与量、投与時期、投与方法、等により最適量が変動する可能性があるので限定できないが、一般的に、後述の試験方法および結果等を参照して、専門家が決定することができ、また、専門家が決定することが望ましい。さらに、接触過敏反応を予防もしくは治療するのに用いた場合、上記の睡眠を短縮および Zまたは C N Vの振幅面積を増大する揮発性物質の有効量の決定には、後述のモデル動物を用いた接触過敏反応の評価方法およびその結果も参照することができる。

本発明に従う調節剤は、香料製剤に通常使用されている担体、希釈剤または他の活性成分をともに含めて製剤化（もしくは製品化）することができる。形態は、香水、コロン、室内芳香剤等のフレグランス製品の他、経気道的な体内への吸収または投与が可能である限り、ローション、クリーム、石鹼、歯磨剤、エアゾール製品等の化粧料、その他の香料一般に用いられるいずれの形態であってもよい。さらに吸入薬などの特定の医薬品の形態であることもできる。例えば、皮膚の接触過敏症を予防および治療するための製剤への特定の揮発性物質の配合量は、吸入により接触過敏症を抑制する効果が充分得られる量であればよい。使用形態および薬剤（香料）によって異なるが、一般に 0 . 0 1重量％以上配合されている。

以上は、主としてヒ卜への使用を考慮して剤形等を説明しているが、本発明の調製剤および調節方法は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、ゥシ、ブ夕、ヒッジ、ゥサギ、ネズミ等への適用をも包含し、これらへの適用は上述の剤形等を必要により若干変更してもよい。

以下の具体例により、本発明をより具体的に説明すると同時に、本発明の奏する作用効果の指標を示すことを意図するが、本発明はこれらの例に限定することを意図するものでない。

試験例 1 ：香料の接触過敏反応等に及ぼす影響

(実験動物）

雌性 C 57 B LZ6マウス（7〜9週齢）を使用した。動物は、 2 1〜25 °Cの温度で相対湿度 40〜70%に維持した室内において、 1 ケージ（225 x 338 x 1 40mm) に各 5匹ずつ飼育した。香料の動物への吸入は、ケージ内に設置した直径 10 c mの金網で覆ったぺトリ皿中に香料を吸収させた濾紙を入れることによって行った（なお、対照は香料未吸収の濾紙を使用）。なお、この動物実験は、日本学術審議会実験動物取扱基準（National Research Council Guide Lines) に沿うものである。

1 - 1. 接触過敏反応

1曰目に、マウスの除毛した背部に抗原として、 2， 4， 6—トリニト口クロルベンゼン（TNC B) (3%ァセトン溶液 50〃 1 ) を塗布することによってマウスを感作した。 5曰後（実験 6日目）に前記抗原の 1 %ァセトン溶液 5 1を動物の右耳の両側にそれぞれ塗布して接触過敏反応を惹起した。接触過敏（以下、 CHという）反応は、 7曰目にマイクロメ一ターで左耳と右耳の腫脹の厚さを測定し、両者の測定値の差によって、評価した。

感作時における香料吸入の効果を調べる際は、上記の香料を吸収させた濾紙を入れたぺトリ皿を 0曰目ないし 2曰目にかけてケージ内に設置した。免疫惹起時における香料吸入の効果を調べる際には、前記ペトリ皿を 5日目ないし 7曰目にかけてケージ内に設置した。香料の直接皮膚への塗布効果を調べる場合は、 0 . 1 %シトラルバ（citralva) もしくはライラル（lyral) /リリアル（lilial) または希釈剤（アセトン中 5 0 %コーン油）を、各 5 0 1ずつ感作の 6時間前に前記抗原を塗布する部位へ塗布した。長期効果は、 0曰目ないし 2曰目にかけて毎日 1 %香料または希釈剤 5 0 β 1 を適用して試験した。 ( 1 ) T N C Bに対する、 C H反応の誘導もしくは惹起時に 2日間シトラルバにマウスを暴露した結果を図 1に示す。図 1によれば、 C H反応の惹起がシトラルバの吸入によつて対照の約 5 0 %まで抑制されることがわかる（A ) 。 C H反応の誘導も約 2 0 %有意に抑制されることがわかる（B ) 。これらの結果は、嗅覚の刺激が皮膚免疫反応を調節することを示唆している。

( 2 ) C H反応の惹起に対する香料の効果について調べた結果を図 2 に示す。この図は、シトラルバ（上記睡眠時間を短縮する香料）と別のカテゴリーに入る香料（Lyral八 ilial) との効果を比較して示す。いずれの香料も C H反応を抑制するが、シトラルバがより有意に強く抑制することがわかる。また、 C H反応の抑制は香料の種類によって左右されることもわかる。

なお、以上の実験結果は、 1群 5匹のマウスに対する測定結果を、 t 検定による統計処理した結果である。

( 3 ) 香料の局所塗布の効果を図 3に示す。この図から、シトラルバも lyral八 ilial のどちらも C H反応に影響を及ぼさないことがわかる。 1 - 2. ランゲルハンス細胞の染色

表皮ランゲルハンス細胞の染色は公知の方法に従った。要約すれば、 3.8%チォイソシアン酸アンモニゥム水溶液中、 37°C20分間インキュベー卜することによりマウスの耳における真皮から表皮を分離採取した。表皮シートをァセトンを用い固定し、マウスハイブリドーマ M 5/丄丄 4. 15. 2 (American Tissue Type Collection Rockville, MD, U S A) の培養上清中でィンキュペートし、抗 I _A I gG を分泌させ、次いで蛍光イソチオシァネート（F I TC) (Sigama, U S A) 標識抗マウス I gG抗体と結合させた。 I一 A抗原に対して陽性の細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡（MRC 600, Bio Rad, U SA) を用い観察し解析した。試料は一群 5匹のマウスから集めた。 3つの領域の各試料を盲検により解析した。

果 - シトラルバに暴露後各試料を採取し、 I一 A抗原について染色し、共焦点レーザ一走査顕微鏡で観察し、解析した結果は、表 Iに示す（表中、カツコ内の数値は標準偏差（S D) である）。

表 I

1 mm ²当りのランゲルハンス細胞数

2) m * p < 0. 05

シトラルバもしくは lyral/lilial存在下で動物を飼育した後に採取した表皮シートの I一 Aに対する染色、および共焦点レーザー走査顕微鏡で解析した結果を表 I Iに示す（表中、カツコ内の数値は標準偏差（S D) である）。

表 I I

η 1 mm²当りのランゲルハンス細胞数

²⁾ m ²

* p < 0. 05

上記表より、シトラルバに暴露後、 L Cの数が有意に減少することがわかる（表 I )

各 I 一 A陽性細胞の面積もシトラルバに暴露することによって有意に低減することがわかる。香料の効果を比較すると、シトラルバは lyral Zlilial よりもより強い効果を示すことがわかる（表 I I )

これらの結果は、嗅覚の刺激が表皮ランゲルハンス細胞に影響を及ぼすことを意味する。

試験例 2 ：ストレス負荷による皮膚免疫反応の抑制に対する香料の効果 (実験動物）

雌性 C 57 B LZ6マウス（ 7 ~9週齢） [Charles River Japanより購入] を使用した。動物は、 2 1〜2 5 °Cの温度で相対湿度 4 0〜7 0 %に維持した室内において、 1ケージ（ 2 2 5 X 3 3 8 X 1 4 0 m m ) に各 5匹ずつ飼育した。香料の動物への吸入は、ケージ内に設置した直径 1 0 c mの金網で覆ったぺトリ皿中に香料を吸収させた濾紙を入れることによって行った（なお、対照は香料未吸収の濾紙を使用）。これらの動物を、うつ伏せにした後、柔軟な細目全網で 6時間くるんだ。なお、この動物実験は、日本学術審議会実験動物取扱基準（Nat ional Researc h Counci l Guide Lines) に従う社内の動物実験委員会の承認を得た。

2— 1 . 接触過敏反応

マウスの左耳の内外両表面に 2， 4， 6 — トリニトロクロルベンゼン（T N C B ) ( 3 %ァセトン溶液 1 0 / 1 を塗布することによってマウスを感作した。 5曰後にマウスの右耳の内外両表面に T N C B ( 1 %ァセトン溶液 5 β 1 ) を塗布して C H反応を惹起した後、 2 4時間目に両耳の厚さをマイクロメーター（三豊製）で測定し、右耳の厚さから左耳の厚さを差し引くことにより腫脹を評価した。動物の香料への暴露は、惹起の 2 4時間前から腫張を測定する時まで続けた。拘束ストレスは、惹起の 2 4時間前に負荷し、惹起直後に再度負荷した。なお実験は 1群 5匹の動物を使用し、香料としては、 1， 3—ジメトキシー 5—メチルベンゼン（D M M B ： Takasago International Inc. より購入）を使用した。結果を下記表 I I I、および図 4に示す。表 I I I

(1)測定値

(2)分散分析：一元配置

表 I I I ： ( 1) 測定値における数値は、各被験動物の測定された右耳の厚さから測定された左耳の厚さを差し引いた値であり、そして（2) は、上記数値を分散分析した結果を示す。

以上の表 I I Iおよび図 4より、無香料の場合には、ストレス負荷によって皮膚免疫反応が抑制されるが、 DMMBを吸入した動物群では、ストレスによる皮膚免疫抑制がみられなかった。このことは、特定の香料がストレスによる皮膚免疫機能の低下を防止できることを意味する。 2 - 2 ランゲルハンス細胞の染色

実施例 1における「 1 一 2、ランゲルハンス細胞の染色」に記したのと同様方法で染色し、そして同様に解析した結果をまとめたものを図 5 に示す。

この図より、表皮中のランゲルハンス細胞数はストレス負荷により約 3 0 %減少したことがわかる。被験動物がストレス負荷時に D MM Bを吸収すると、ランゲルハンス細胞数はストレス負荷のみより有意に増加し、ストレスを負荷しない動物群とランゲルハンス細胞数は同程度であることがわかる。

産業上の利用可能性

本発明によれば、ある一定の揮発性物質を用いる皮膚免疫機能を調節するための製剤および方法が提供される。これらの製剤および方法は、後えば多種多様の化粧料および美容術において実現できるので、化粧品もしくはトイレタリ一製品の製造業および美容業において利用できる。

Claims

請求の範囲

1. 嗅覚受容体を刺激しうる揮発性物質を有効成分とする皮膚免疫機能調節剤。

2. 揮発性物質が、バルビツール酸誘発睡眠測定法において被験体の、睡眠時間を有意に変動させるものである請求項 1記載の調節剤。

3. 揮発性物質が、被験体の睡眠時間を対照に比べて少なくとも 15 %延長させるものである請求項 2記載の調節剤。

4. 揮発性物質が、被験体の睡眠時間を対照に比べて少なくとも 15 %延長させ、そしてテルピニルアセテート、フヱネチルアルコール、リナロール（linalool) およびァニスからなる群より選ばれる請求項 2記載の調節剤。

5. 揮発性物質が、被験体の睡眠時間を対照に比べて少なくとも 15 %短縮させるものである請求項 2記載の調節剤。

6. 揮発性物質が、被験体の睡眠時間を対照に比べて少なくとも 15 %短縮させ、そしてシトラルバ、レモンオイル、ジャスミンオイル、ィソボルニルアセテート（iso- bornyl acetate) およびフィトールからなる群より選ばれる請求項 2記載の調節剤。

7. 揮発性物質が、誘発陰性変動（Contingent Negative Variation) (CNV) 測定法において被験体の CNVの振幅面積を有意に変動させるものである請求項 1記載の調節剤。

8. 揮発性物質が被験体の CNVの振幅面積を対照に比べて少なくとも 10%減少させるものである請求項 7記載の調節剤。

9. 揮発性物質が被験体の CNVの振幅面積を対照に比べて少なくとも 10%減少させ、そしてキヤラウヱ一、 1， 3—ジメトキシー 5—メチルベンゼン（DMMB) 、びゃくだん、ばら、ローズマリ一、ベルガモ、ラベンダー、オレンジおよびカモミールからなる群より選ばれる請求項 7記載の調節剤。

10. 揮発性物質が被験体の CNVの振幅面積を対照に比べて少なくとも 10%増大させるものである請求項 7記載の調節剤。

1 1. 揮発性物質が被験体の CNVの振幅面積を対照に比べて少なくとも 10%増大させ、そしてレモンオイル、ジャスミン、ペパーミント、バジル、クローブおよびスターァニスからなる群より選ばれる請求項 7 記載の調節剤。

12. 皮膚免疫機能調製剤を調製するための有効成分としての、バルビツール酸誘発睡眠測定法において被験体の睡眠時間を有意に変動させる揮発性物質または C NV測定法において被験体の C NV振幅面積を有意に変動させる揮発性物質の使用。

13. 皮膚免疫機能を亢進させることが望まれるかまたは必要な被験体に、該免疫機能を亢進させるのに十分量の揮発性物質であって、バルビツール酸誘発睡眠測定法において被験体の睡眠時間を有意に延長させる物質および Zまたは CNV測定法において被験体の CNV振幅面積を有意に減少させる物質を、経気道的に投与することを含んでなる被験体の皮膚免疫機能の亢進方法。

14. 皮膚免疫機能を抑制させることが望まれるかまたは必要な被験体に、該免疫機能を抑制させるのに十分量の揮発性物質であって、バルビツール酸誘発睡眠測定法において被験体の睡眠時間を有意に短縮させる物質およびノまたは CNV測定法において被験体の C NV振幅面積を有意に増大させる物質を、経気道的に投与することを含んでなる被験体の皮膚免疫機能の抑制方法。

15. ヒトの美容上のスキンケアに向けられる請求項 13または 14記載の方法。