WO2001025449A2 - Neue immobilisierbare amylosucrase und dessen verwendung sowie verfahren zur herstellung von poly(1,4-alpha-glucan) - Google Patents

Neue immobilisierbare amylosucrase und dessen verwendung sowie verfahren zur herstellung von poly(1,4-alpha-glucan) Download PDF

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WO2001025449A2
WO2001025449A2 PCT/EP2000/009695 EP0009695W WO0125449A2 WO 2001025449 A2 WO2001025449 A2 WO 2001025449A2 EP 0009695 W EP0009695 W EP 0009695W WO 0125449 A2 WO0125449 A2 WO 0125449A2
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nucleic acid
seq
glucan
alpha
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Holger Bengs
Thomas Polakowski
Anja Held
Karl-Christian Gallert
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Celanese Ventures Gmbh
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    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the invention relates to a new immobilizable amylosucrase and its use and a process for the production of poly (1,4-alpha-glucan).
  • Amylosucrase (enzyme class EC 2.4.1.4) is available from microorganisms such as Neisseria polysaccharea, which converts sucrose into poly (1, 4-alpha-glucan) and fructose in a biotransformation. This enzyme activity has been known for a long time (MacKenzie et al., 1977), the corresponding gene is described for the first time in patent application WO 95/31553 and PCT / EP 98/05573. The disclosure content of these applications is expressly referred to below.
  • Poly (1,4-alpha-glucan) has a large number of advantageous properties, which are used, for example, for processing into films, as an additive in the food industry, as a basic material for cyclodextrin production and as an auxiliary in pharmaceutical production and packaging.
  • An overview of various possible uses of polysaccharides can be found in Bücke (1998).
  • the applicant also refers to her own applications with special use of poly (1,4-alpha-glucan), as described for example in PCT / EP / 98/03960, PCT / EP / 98/03920, PCT / EP / 98/05297 , PCT / EP / 99/00473, PCT / EP / 99/02386, PCT / EP / 99/02385, DE 19852826.4.
  • poly (1,4-alpha-glucan) in the context of a biotransformation using the recombinantly obtained amylosucrase is known, as described in WO 95/31553.
  • a wide variety of heterologous host organisms can be used for the biotechnological production of amylosucrase, but the intestinal bacterium Escherichia coli with the best protein yields is preferred.
  • the so The amylosucrase obtained is then used for the enzymatic conversion (biotransformation) of sucrose to fructose and poly (1,4-alpha-glucan).
  • the biotransformation itself is carried out in a batch process, i.e. carried out in a static process.
  • the disadvantage here is that the enzyme used must be discarded with the reaction broth after the product has been separated off.
  • the process management in a batch approach also means that feed or removal of starting materials or products is not carried out. This leads to problems since fructose is suspected to inhibit AmSu.
  • the object of the present invention is therefore to provide an immobilized protein with the activity of an amylosucrase. Furthermore, the invention also relates to an efficient and inexpensive process for the continuous production of poly (1,4-alpha-glucan).
  • nucleic acid coding for an amylosucrase preferably with a nucleic acid according to SEQ ID No. 4, particularly preferably a nucleic acid according to SEQ ID No. 5 is ligated with an anchor sequence whose expression product with the activity of an amylosucrase - a fusion protein - allows immobilization on a solid phase (hereinafter called the fusion protein according to the invention).
  • Such fusion proteins according to the invention - containing an N-terminal glutathione-S-transferase fusion tag (short: "GST-AmSu”) - are particularly preferably obtained for the purpose of bioaffective immobilization on glutathione-Sepharose.
  • fusion protein means a protein which is obtained by connecting the protein-coding parts of two or more nucleic acids can be linked together in the correct reading frame and expressed as a hybrid or fusion gene in a suitable host cell - here: preferably E. coli.
  • E. coli strains DH5, HB101 or BL21 the yeast strain Saccharomyces cerevisiae
  • the insect cell line Lepidopteran e.g. from Spodoptera Frugiperda
  • animal cells such as COS, Vera, 293 and HeLa, all of which are commonly available.
  • Another object of the invention for the expression of a fusion protein is therefore the construction of suitable cloning vectors, so-called fusion vectors according to SEQ ID No. 6 or particularly preferably SEQ ID No. 7, which can be obtained from pGEX-4T-1 (Pharmacia) (see Example 3) and synthesize the desired product intracellularly in a host cell - preferably E. coli.
  • fusion proteins are those with epitopes which are recognized by specific antibodies (HA, FLAG, c-myc and others), with short histidine oligomers (HIS tag) and enzymes or other proteins which have a strong affinity have a binding partner (Protein A, ConA, Glutathione-S-Transferase), all of which are commercially available.
  • HA epitopes which are recognized by specific antibodies
  • FLAG FLAG
  • c-myc and others with short histidine oligomers
  • enzymes or other proteins which have a strong affinity have a binding partner (Protein A, ConA, Glutathione-S-Transferase), all of which are commercially available.
  • Protein A, ConA Glutathione-S-Transferase
  • SEQ ID No. 5 and the associated fusion vector according to SEQ ID No. 7 containing a nucleic acid coding for an amylosucrase function and a GST anchor sequence, including thrombin cleavage, the expression product of which was shortened at the N-terminal compared to the native protein and which surprisingly shows an amylosucrase activity which is above the native protein (see example 4)
  • the N-terminal truncations relate to some N-terminal amino acids of the native protein that act as part of a putative secretion signal in Neisseria polysaccharea, the original organism of the selected AmSu.
  • the inventions therefore preferably relate to functional variants of nucleic acids according to the invention as in SEQ ID No. 5 carried out in conjunction with a suitable anchor sequence via an expression vector - as in SEQ ID. No 7 represents in nucleotides 258 - 2825 - for a fusion protein according to the invention, for example according to SEQ ID No. Encode 8; with the activity of an immobilizable amylosucrase.
  • the term “functional variant” is understood to mean a nucleic acid which is functionally related to an amylosucrase, as disclosed in WO 95/31553 and PCT / EP / 98/05573 or can be selected from these in part or in whole (as given in SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 5).
  • related nucleic acids are also nucleic acids from different cells or tissues (animal, plant, microorganism and corresponding transgenic representatives) or allelic variants.
  • the present invention also encompasses variants of nucleic acids which can originate from different individuals / representatives.
  • the term “variants” according to the present invention means nucleic acids which have a homology, in particular a sequence identity of approximately 60%, preferably approximately 75%, in particular approximately 90% and above all approximately Have 95%.
  • the parts of the nucleic acids according to the invention can be used, for example, for producing individual epitopes, as probes for identifying further functional variants or as antisense nucleic acids.
  • a nucleic acid from at least approx. 8 nucleotides is suitable as an antisense nucleic acid
  • a nucleic acid from at least approx. 15 nucleotides as a primer in the PCR method a nucleic acid from at least approx. 20 nucleotides for the identification of further variants and a nucleic acid from at least approx 100 nucleotides as probe, preferably used in gene libraries.
  • Another object of the present invention is also the fusion protein according to the invention as such with a preferred amino acid sequence according to SEQ ID No. 8 consisting of the functional units of amino acid sequences 1-220 for the preferred anchor sequence glutathione-S-transferase (GST) and amino acids 221-226 for a thrombin interface selected here, including a multiple cloning site (227-229) and 230 - 856 with an amylosucrase activity or a functional variant thereof, and parts thereof with at least six amino acids, preferably with at least 12 amino acids, in particular with at least 65 amino acids and especially with 626 and 856 amino acids.
  • GST glutathione-S-transferase
  • an approximately 6-12, preferably approximately 8 amino acid long polypeptide may contain an epitope which, after coupling to a support, is used to produce specific poly- or monoclonal antibodies (see, for example, US Pat. No. 5,656,435).
  • Polypeptides with a length of at least approx. 65 amino acids can also be used directly without a carrier for the production of poly- or monoclonal antibodies.
  • the invention therefore relates to an immobilizable amylosucrase consisting of the functional units of an amylosucrase and an anchor sequence and, if appropriate, further auxiliary sequences.
  • the term "functional variant” in the sense of the present invention is understood to mean polypeptides which are functionally related to the fusion protein according to the invention, ie which have an immobilizable amylosucrase activity - containing the functional units mentioned, as preferably on the SEQ ID. No 8 explained.
  • Variants are also understood to mean allelic variants or polypeptides derived from other cells or tissues (animal, plant, microorganism and corresponding transgenic representatives). It also means polypeptides that come from different individuals / representatives.
  • this also includes polypeptides which have a sequence homology, in particular a sequence identity of approximately 70%, preferably approximately 80%, in particular approximately 90%, in particular approximately 95%, of the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID No. Have 8.
  • This also includes deletion of the polypeptide, preferably in the region of amino acids 230-856 (amylosucrase unit) of SEQ ID. No 8, in the range from approx. 1 to 60, preferably from approx. 1 to 30, in particular from approx. 1 to 15, especially from approx. 1 to 5 amino acids.
  • An essential feature of the present invention is the repeated use of the fusion protein obtained according to the invention by binding to a matrix and use for continuous biotransformation. It is already known that enzymes can be used for immobilization on solid, inert, insoluble matrices for biocatalysts (Nelson and Griddin, 1916). However, there is always the problem that the immobilized enzyme can be inactivated in whole or in part for steric reasons by covalent coupling to the carrier material (Saleemuddin, 1999). In addition, a covalent bond is usually irreversible and, as a result, cannot be used to purify the soluble protein.
  • the invention further relates to a process for the preparation of poly (1,4-alpha-glucan), the fusion proteins according to the invention being immobilized on a solid phase.
  • a solid phase is, for example, Sepharose (primarily glutathione-Sepharose when using SEQ ID No. 8).
  • the resulting loaded solid phase beads (see FIG. 6) of the active fusion proteins according to the invention have the particular advantage of not permanently blocking with poly (1,4-alpha-glucan), that is to say covered by the product of the biocatalysis and thus " to be inactivated ".
  • the process contains the following steps: Conversion of sucrose to poly (1,4-alpha-glucan) by means of immobilized fusion protein according to the invention under strong Shake, particularly preferably GST-AmSu, on a solid phase. Separation of the solid phase beads from the reaction broth by means of filtration (eg glass frit) when the reaction conversion is reached. Rinsing the solid phase beads with DMSO, the product poly (1,4-alpha-glucan) going into solution. The solid phase bead is then washed free of DMSO with PBS and reloaded with (according to) the fusion protein according to the invention. The solid phase loaded in this way can be used again for a new round of bio-formation.
  • strong Shake particularly preferably GST-AmSu
  • the fusion proteins according to the invention and the related process lead to a number of, sometimes unexpected, advantages in the course of biocatalysis.
  • the specificity of biocatalysis is improved, which is reflected in an increased product yield and less by-product.
  • the by-product palatinose is formed to less than 15% of the expected total amount of product.
  • the conventional batch process shows a product yield of significantly less than 80% of the theoretically possible amount.
  • Another crucial advantage is the acceleration of the reaction. It takes less than 24 hours for all of the substrate from the biosynthesis batch to be used up. In comparison, the batch process requires at least 48 - 72 h. This is probably because, unlike the conventional method, the reaction mixture can be mixed vigorously during the reaction. The batch process is carried out using an approximately non-mixed approach. Experiments with amylosucrase showed that the enzyme foams strongly both in its natural form and as a fusion protein when mixed vigorously and is thereby inactivated. It is only when the fusion protein is bound to a solid phase that it can be mixed thoroughly. There is no foam and the activity is retained.
  • Another object of the invention is therefore a composite stable catalyst containing the fusion protein according to the invention, preferably according to SEQ ID No. 8, immobilized on a solid phase such as Sepharose and possibly other auxiliaries and additives.
  • a possible embodiment is shown in FIG. 6.
  • Another object of the invention relates, according to the method according to the invention, to the production of microparticles from poly (1,4-alpha-glucan), which are obtained in different sizes and distributions in particle form - down to about 5 ⁇ m.
  • Such particles have already been described in the applicant's application WO 99/11695.
  • the microparticles are obtained in the process according to the invention in such a quality that they can now be used particularly advantageously for the applications described there.
  • amylosucrase gene was produced by a standard PCR method.
  • the nucleic acid sequence of amylosucrase from WO 95/31553 served as a template.
  • the PCR was carried out using the "forward" primer AmSu (Seq. ID No. 1) or AmSu5 (Seq. ID No. 2) and the "reverse” primer AmSu Xhol rev (Seq. ID No. 3).
  • the primer was annealed to the 5 'side and an EcoRI at the 3' generates a X ⁇ ol interface -end.
  • the amplificates were given the names AmSu (Seq. ID No. 4) and AmSu5 (Seq. ID No. 5).
  • PCR conditions were used for the amplification: about 1ng template DNA, 1 ⁇ l AmSu or AmSu ⁇ and AmSu Xhol rev primer Oe 100mol / ⁇ l), 4 ⁇ l dNTP 's (2.5mM each), 5 ⁇ l 10x incubation buffer with MgS0 (Boehringer Mannheim), 5 U Pwol DNA polymerase (Boehringer Mannheim), ad 50 ⁇ l water.
  • the following temperature program was used: 5min 94 ° C, then 30 cycles 30s 94 ° C, 30s 55 ° C, 3min 72 ° C, followed by 20min 72 ° C.
  • AmSu represents the complete amylosucrase gene, AmSu ⁇ denotes the shortened version.
  • the amplificates AmSu and AmSu ⁇ were purified by ethanol precipitation and then cut with EcoRI and Xhol.
  • the following volumes were pipetted onto the precipitated DNA: 4 ⁇ l 10 ⁇ restriction buffer 2 (NEB), 0.4 ⁇ l BSA (NEB), 2 ⁇ l EcoRI (NEB, 20 U), 2 ⁇ l Xhol (NEB, 20 U) and 31.6 ⁇ l water.
  • the restriction takes place at 37 ° C for 2 hours.
  • the enzymes were then deactivated at 65 ° C. for 10 minutes. 1 ⁇ g plasmid pGEX-4T-1 (Pharmacia) was cut with EcoRI and Xhol.
  • Cut plasmid and cut AmSu versions were ligated according to the following scheme: 100ng cut plasmid are combined with approximately 100ng cut PCR products (AmSu and AmSu ⁇ ). In addition there were 2 ⁇ l 10x ligation buffer (NEB) and 2 ⁇ l T4 DNA ligase (NEB); made up to 20 ⁇ l with water. The ligation was carried out at room temperature for 2 hours.
  • the pGEX-4T-1 vector carrying the Am-Su gene is shown in Fig. 1 (Seq. ID No. 6); the vector - carrying the AmSu ⁇ fragment is shown in Fig. 2 (Seq. ID No. 7).
  • the entire ligation batches were transformed according to E.coli TOP10 using the CaC method.
  • the transformants were selected for ampicillin resistance and cultured with ampicillin for mini-prep analysis in LB medium.
  • the selected clones were checked by DNA sequencing.
  • the stock must be kept in glycerin at -80 ° C.
  • amylosucrase variants and binding to glutathione-Sepharose 20 ml LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin were inoculated in a 100 ml flask with 100 ⁇ l freezing culture. The culture was incubated overnight at 37 ° C and 240rpm shaking frequency.
  • a main culture with 250 ml LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin (or a correspondingly larger culture volume) was inoculated with the preculture in a 1000 ml flask in such a way that the optical density 600 nm (OD ⁇ oo) of the culture is about 1 after 3 hours of growth.
  • the TAC promoter was then induced by adding IPTG (final concentration 1 mM).
  • the culture was incubated for a further 3 hours. Cultivations were carried out at 37 ° C and 240rpm shaking frequency. The cells were then harvested by centrifugation at 2000 ⁇ g for 10 minutes.
  • the cell pellet was taken up in 10 ml PBS buffer with 0.1 g lysozyme (Sigma) and 250 U benzonase (Merck) and incubated at 37 ° C. for 60 min. Then 100 ⁇ l PMSF (100mM in isopropanol) (Sigma) and 100 ⁇ l Triton X-100 (Sigma) were added. After the Cells are lysed, the cell residues were centrifuged at 10000 g for 10 min and the supernatant was mixed with 2 ml of 50% glutathione-Sepharose (Pharmacia) in PBS. The mixture is shaken gently for 1 h.
  • the Sepharose was then centrifuged off at 500xg for 10min and the Sepharose pellet is washed three times in 10ml PBS. The washed pellet is taken up in PBS such that the total volume was again 2 ml. 200 ⁇ l of glycerol were added and the Sepharose loaded with amylosucrase is stored at -20 ° C. 3 clearly shows the induction of the GST-AmSu and the effectiveness of the purification.
  • Glutathione-Sepharose - described according to Example 3 - was loaded either with a 10mM glutathione solution with 50mM Tris / HCI pH 8 or with thrombin (150mM NaCI, 50mM Tris / HCI pH 8, 2.5mM CaCI 2 , 0.1% Mercaptoethanol and 5.5 mg / ml thrombin) eluted.
  • glutathione elution very pure GST-AmSu protein was eluted from the column.
  • thrombin elution the amyiosucrase fusion part was eluted since there is a thrombin cleavage site between the GST part and the AmSu (FIG. 4).
  • the specific activity of the AmSu versions could be determined by determining the AmSu activity and the protein concentration of the eluates.
  • the genetically unchanged AmSu only has a specific activity of 0.17 U / ⁇ l.
  • FIG. 6 shows the typical course of a biocatalysis with the bound enzyme (GST-AmSu on Sepharose). It was found that all of the sucrose was consumed after about 48 hours. The fructose concentration rose accordingly from 0% to 7.6% within this time. During this time, a water-insoluble amylose precipitate was formed (Fig. 7).
  • Amylose A biocatalysis mixture according to Example 6 was freeze-dried after the end of the reaction and taken up in DMSO.
  • the distribution of the molecular sizes of the amylose molecules was determined by means of a GPC analysis. 8 shows the size distribution of the poly (1,4-alpha-glucan).
  • the poly (1,4-alpha-glucan) obtained can be converted into very small, water-insoluble microparticles, as is special in the application WO 99/11695 Amylose quality required.
  • the amylose obtained in biocatalysis with an immobilized enzyme has this special quality standard. 8 shows microparticles consisting of amylose.
  • Poly (1, 4-alpha-glucan) according to Example 6 was used as an approach.
  • the microparticles were produced as follows: 1 g of poly (1,4-alpha-glucan) were dissolved in 5 ml of DMSO at 60 ° C.
  • the poly (1,4-alpha-glucan) in solution was added to 100 ml of water with stirring.
  • the microparticles were precipitated at 5 ° C. overnight and then washed, frozen and freeze-dried.
  • Sepharose beads and the microparticles formed during the catalysis can be easily separated from one another by filtration with a glass frit.
  • the separated Sepharose beads can be used for new biotransformations.
  • 10 shows the results of repeated uses of GST-AmSu-loaded glutathione-Sepharose. The multiple approaches are comparable to the approach described in Example 6.
  • the biocatalysis forms an amylose layer around the catalysts, which hinders the exchange of materials between the catalyst and the Biotrafo buffer and ultimately even prevents it.
  • GST-AmSu is eluted from a loaded glutathione-Sepharose by means of pH shift (see example ⁇ ) and used for a biotransformation analogous to example 6. After complete conversion, the product poly (1,4-alpha-glucan) is centrifuged gation separated from the reaction supernatant with the GST-AmSu. The GST-AmSu was then bound again to glutathione-Sepharose and consequently isolated. After a washing step, the amylosucrase was eluted (pH shift) and a new bio-transformer buffer was added.
  • Fig. 1 plasmid map of pGEX-4T-1-AmSu
  • Fig. 2 plasmid map of pGEX-4T-1-AmSu5
  • Fig. 3 A) SDS-PAGE stained with Coomassie. Lanes 1 and 2: GST-AmSu eluted with thrombin; Lane 3: Disruption of E. co // cells carrying the plasmid pGEX-4T-1 AmSu after the IPTG induction; Lane 4: Disruption of E. co // cells which carry the plasmid pGEX-4T-1-AmSu before the IPTG induction. The arrows point to the GST-AmSu and to the smaller form that results from the thrombin cleavage. B) SDS-PAGE stained with Coomassie. Lanes 1 and 2 show the GST-AmSu protein eluted with glutathione. Lane 3 shows a solid sample of glutathione-Sepharose loaded with GST-AmSu.
  • Fig. 4 Alternative elution of the GST-AmSu from the glutathione-Sepharose matrix with different pH values. The eluate was collected in 1 ml volume and tested for amylosucrase activity. Fraction # 5 contains about 50% of the total activity.
  • Fig. 5 Course of a biocatalysis with immobilized GST-AmSu.
  • Fig. 6 Microscopic image of a biocatalysis approach with immobilized GST-AmSu (magnification 100 times). In the center of the picture is a Sepharose bead loaded with GST-AmSu. The catalyst is surrounded by NEO amylose beads.
  • Fig. 7 Size distribution of the amylose molecules in the NEO amylose according to GPC analysis. The average molecular weight is 43 ⁇ 0g / mol.
  • Fig. 8 Electron micrograph of microparticles that were made from NEO amylose.
  • Fig. 9 Course of biocatalysts with multiple catalyst.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues biotechnisches kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von linearem Poly(1,4-alpha-glucan), wobei in einer modifizierten Biotransformation mittels immobilisierter Fusionsproteine die eine Amylosucrasektivität inne haben das Poly(1,4-glucan) als Feststoff gewonnen wird.

Description

Beschreibung
Neue immobilisierbare Amylosucrase und dessen Verwendung sowie Verfahren zur Herstellung von Poly(1 ,4-alpha-glucan)
Die Erfindung betrifft eine neue immobilisierbare Amylosucrase und dessen Ver- wendung und ein Verfahren zur Herstellung von Poly(1 ,4-alpha-glucan).
Amylosucrase (Enzymklasse EC 2.4.1.4) ist erhältlich aus Mikroorganismen wie z.B. Neisseria polysaccharea, welches Saccharose in einer Biotransformation in Po- ly(1 ,4-alpha-glucan) und Fruktose umsetzt. Diese Enzymaktivität ist seit langem be- kannt (MacKenzie et al., 1977), das entsprechende Gen, ist erstmals in der Patentanmeldung WO 95/31553 und PCT/EP 98/05573 beschrieben. Auf den Offenbarungsgehalt dieser Anmeldungen wird im weiteren ausdrücklich Bezug genommen.
Poly(1,4-alpha-glucan) weist eine Vielzahl vorteilhafter Eigenschaften auf, welche beispielsweise zur Verarbeitung zu Folien, als Zusatz in der Lebensmittelindustrie, als Grundstoff zur Cyclodextrinherstellung und als Hilfstoff in der Pharmakaherstel- lung und Konfektionierung verwendet werden. Ein Überblick über diverse Anwendungsmöglichkeiten von Polysacchariden ist Bücke (1998) zu entnehmen. Ebenso verweist die Anmelderin auf Ihre eigene Anmeldungen mit spezieller Anwendung von Poly(1 ,4-alpha-glucan), wie beispielsweise beschrieben in PCT/EP/98/03960, PCT/EP/98/03920, PCT/EP/98/05297, PCT/EP/99/00473, PCT/EP/99/02386, PCT/EP/99/02385, DE 19852826.4.
Bekannt ist die technische Gewinnung von Poly(1 ,4-alpha-glucan) im Rahmen einer Biotransformation unter Einsatz der rekombinant gewonnenen Amylosucrase, wie in WO 95/31553 beschrieben. Zur biotechnologischen Gewinnung der Amylosucrase sind verschiedenste heterologe Wirtsorganismen einsetzbar, bevorzugt ist jedoch das Darmbakterium Escherichia coli mit besten Proteinausbeuten. Die derart ge- wonnene Amylosucrase wird anschließend für die enzymatische Umsetzung (Biotransformation) von Saccharose zu Fruktose und Poly(1 ,4-alpha-glucan) eingesetzt.
Der bisher eingesetzte Produktionsprozeß von Poly(1 ,4-alpha-glucan) mittels re- kombinanter Amylosucrase (kurz: AmSu) wird unter Verwendung angereicherter AmSu-Lösungen durchgeführt. Die Gewinnung reiner AmSu mittels konventioneller, chromatographischer Reinigung ist derzeit sehr aufwendig und kostenintensiv.
Die Biotransformation selbst wird im Stand der Technik im Batchverfahren, d.h. in einem statischen Prozeß durchgeführt. Hierbei ist von Nachteil, daß das eingesetzte Enzym nach der Abtrennung des Produkts mit der Reaktionsbrühe verworfen werden muß. Ebenfalls bedeutet die Prozeßführung in einem Batch-Ansatz, daß Zu- oder Abfuhr von Edukten bzw. Produkten nicht betrieben wird. Dies führt zu Problemen, da eine Produktinhibition der AmSu durch Fruktose vermutet wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher ein immobilisiertes Protein mit der Aktivität einer Amylosucrase bereitzustellen. Des weiteren betrifft die Erfindung ebenfalls ein effizientes und kostengünstiges Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von Poly(1 ,4-alpha-glucan).
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß eine Nukleinsäure kodierend für eine Amylosucrase, vorzugsweise mit einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID No. 4, besonders bevorzugt eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID No. 5 mit einer Ankersequenz ligiert wird, dessen Expressionsprodukt mit der Aktivität einer Amylosucrase - ein Fusionspro- tein - die Immobilisierung an einer festen Phase erlaubt (nachstehend erfindungsgemäßes Fusionsprotein genannt).
Besonders bevorzugt werden derartige erfindungsgemäße Fusionsproteine - enthaltend einen N-terminalen Glutathion-S-Transferase-Fusionstag (kurz: "GST- AmSu") - erhalten, zwecks bioaffinitiver Immobilisierung an Glutathion-Sepharose.
Im Sinne der Erfindung bedeutet Fusionsprotein ein Protein, das durch Verbindung der Protein-kodierenden Teile zweier oder mehrerer Nukleinsäuren erhalten werden kann, die derart im richtigen Leseraster miteinander verbunden und als Hybrid- oder Fusionsgen in einer geeigneten Wirtszelle - hier: vorzugsweise E. coli - exprimiert werden.
Als weitere Wirtszellen können sich eignen beispielsweise die E. coli Stämme DH5, HB101 oder BL21 , der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, die Insektenzelllinie Lepidopteran, z.B. von Spodoptera Frugiperda, oder tierische Zellen wie COS, Vera, 293 und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind.
Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung für die Expression eines Fusionsprotein die Konstruktion geeigneter Klonierungsvektoren, sogenannte Fusionsvektoren gemäß SEQ ID No. 6 oder besonders bevorzugt SEQ ID No. 7, welche aus pGEX-4T-1 (Pharmacia) erhalten werden können (siehe Beispiel 3) und in einer Wirtszelle - vorzugsweise E. coli - intrazellulär das gewünschte Produkt syntheti- siert.
Weitere Beispiele möglicher Fusionsproteine sind solche mit Epitopen, die von spezifischen Antikörpern erkannt werden (HA, FLAG, c-myc und andere), mit kurzen Histidin-Oligomeren (HIS-Tag) und Enzymen bzw. anderen Proteinen, die eine star- ke Affinität zu einem Bindungspartner aufweisen (Protein A, ConA, Glutathion-S- Transferase), welche alle kommerziell erhältlich sind. Insbesondere für GST-AmSu konnte gezeigt werden, daß die Amylosucraseaktivität nicht inaktiviert wird (de Montalk et al., 1999).
Eine besondere Ausführungsform ist bevorzugt, hierbei wird erfindungsgemäß aus SEQ ID No. 5 und dem zugehörigen Fusionsvektor gemäß SEQ ID No. 7 enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für eine Amylosucrasefunktion und eine GST- Ankersequenz, inklusive Thrombin-Schnittstelle, dessen Expressionsprodukt gegenüber dem nativen Protein N-terminal verkürzt wurde, und in überraschender weise eine Amylosucraseaktivität zeigt, die über des nativen Proteins liegt (siehe Beispiel 4). Die N-terminalen Verkürzungen betreffen einige N-terminale Aminosäuren des nativen Proteins, die in Neisseria polysaccharea, dem ursprünglichen Organismus der ausgewählten AmSu, als Teil eines putativen Sekretionssignals fungieren. Die gesteigerte Aktivität der AmSu war so nicht zu erwarten, da das Produkt der Biokatalyse Poly(1 ,4-alpha-glucan) in Wasser unlöslich ist und die Gefahr des Verblockens besteht. Biokatalysen mit einem festen, polymeren und wasserunlöslichen Reaktionsprodukt sind im Stand der Technik noch nicht mit erfindungsgemäßen immobilisierten Enzymen durchgeführt worden. Darüber hinaus werden "GST-AmSu- Sepharose-Beads" (siehe Figur 6) erhalten, die in multiplen Biokatalyse-Runden für über Tage stabile, kontinuierliche Umsetzungen ermöglichen und im nachstehenden erfindungsgemäßen Verfahren besondere Vorteile sichert.
Daher betrifft die Erfindungen vorzugsweise solche funktioneile Varianten von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren wie in SEQ ID No. 5 ausgeführt, die in Verbindung mit einer geeigneten Ankersequenz über einen Expressionsvektor - wie in SEQ ID. No 7 repräsentiert in den Nukleotiden 258 - 2825 - für ein erfindungsgemäßes Fusi- onsprotein beispielsweise gemäß SEQ ID No. 8 kodieren; mit der Aktivität einer immobilisierbaren Amylosucrase.
Unter dem Begriff "funktioneile Variante" versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäure, die funktioneil mit einer Amylosucrase verwandt ist, wie in WO 95/31553 und PCT/EP/ 98/05573 offenbart oder aus diesen in Teilen oder im Ganzen ausgewählt werden kann (wie in SEQ ID No. 4 und SEQ ID No. 5 gegeben). Beispiele verwandter Nukleinsäuren sind ebenso Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Zellen bzw. Geweben (Tier, Pflanze, Mikroorganismus und entsprechende transgene Vertreter) oder allelische Varianten. Ebenfalls umfaßt die vorliegende Er- findung Varianten von Nukleinsäuren, die von verschiedenen Individuen/Repräsentanten stammen können.
Im weiteren Sinne versteht man unter dem Begriff "Varianten" gemäß der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren, die eine Homologie, insbesondere eine Sequenziden- tität von ca. 60%, vorzugsweise von ca. 75%, insbesondere von ca. 90% und vor allem von ca. 95% aufweisen. Die Teile der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können beispielsweise zur Herstellung einzelner Epitope, als Sonden zur Identifizierung weiterer funktioneller Varianten oder als Antisense-Nukleinsäuren verwendet werden. Beispielsweise eignet sich eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 8 Nukieotiden als Antisense- Nukleinsäure, eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 15 Nukieotiden als Primer beim PCR-Verfahren, eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 20 Nukieotiden für die Identifizierung weiterer Varianten und eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 100 Nukieotiden als Sonde, vorzugsweise einsetzbar in Genbibliotheken.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls das erfindungsgemäße Fusionprotein als solches mit einer bevorzugten Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 8 bestehend aus den funktioneilen Einheiten der Aminosäuresequenzen 1-220 für die vorzugsweise gewählte Ankersequenz Glutathion-S- Transferase (GST) sowie den Aminosäuren 221-226 für eine hier gewählte Throm- binschnittstelle samt einer multiple cloning site (227-229) und 230 - 856 mit einer Amylosucrasenaktiviät oder einer funktioneilen Variante davon, und Teile davon mit mindestens sechs Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 12 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 65 Aminosäuren und vor allem mit 626 und 856 Aminosäuren. Beispielsweise kann ein ca. 6-12, vorzugsweise ca. 8 Aminosäuren- langes Polypeptid ein Epitop enthalten, das nach Kopplung an einen Träger zur Herstellung von spezifischen poly- oder monoklonalen Antikörper dient (siehe hierzu z. B. US 5,656,435). Polypeptide mit einer Länge von mindestens ca. 65 Aminosäuren können auch direkt ohne Träger zur Herstellung von poly- oder monoklonalen Antikörper dienen.
Daher betrifft die Erfindung eine immobilisierbare Amylosucrase bestehend aus den funktioneilen Einheiten einer Amylosucrase und einer Ankersequenz und ggf. weitere Hilfssequenzen.
Unter dem Begriff "funktionelle Variante" im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man Polypeptide, die funktionell mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein verwandt sind, d.h. eine immobilisierbare Amylosucraseaktivität aufweisen - enthaltend die genannten funktionellen Einheiten, wie vorzugsweise an der SEQ ID. No 8 erläutert. Unter Varianten versteht man auch allelische Varianten oder Polypeptide, die von anderen Zellen bzw. Gewebe (Tier, Pflanze, Mikroorganismus und entsprechende transgene Vertreter) abstammen. Ebenfalls versteht man darunter Polypeptide, die von verschiedenen Individuen/Repräsentanten stammen.
Im weiteren Sinne versteht man darunter auch Polypeptide, die eine Sequenzhomologie, insbesondere eine Sequenzidentität von ca. 70%, vorzugsweise von ca. 80%, insbesondere von ca. 90%, vor allem von ca. 95% zu dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 8 haben. Ferner zählen hierzu auch Deleti- on des Polypeptids, vorzugsweise im Bereich der Aminosäuren 230-856 (Amylosu- craseeinheit) der SEQ ID. No 8, im Bereich von ca. 1 - 60, vorzugsweise von ca. 1 - 30, insbesondere von ca. 1 - 15, vor allem von ca. 1 - 5 Aminosäuren.
Wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist der wiederholte Einsatz des erfindungsgemäß erhaltenen Fusionsproteins durch die Bindung an eine Matrix und ein Einsatz für eine kontinuierliche Biotransformation. Bereits bekannt ist, daß Enzyme durch Immobilisierung an feste, inerte, unlösliche Matrizes für Biokatalysen eingesetzt werden können (Nelson und Griddin, 1916). Hierbei besteht allerdings stets die Problematik, daß das immobilisierte Enzym durch die kovalente Kopplung an das Trägermaterial aus sterischen Gründen ganz oder teilweise inaktiviert werden kann (Saleemuddin, 1999). Zudem ist eine kovalente Bindung meist irreversibel und infolge dessen für eine Reinigung des löslichen Proteins nicht einsetzbar.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Poly(1 ,4-alpha-glucan), wobei die erfindungsgemäßen Fusionsproteine an einer festen Phase immobilisiert werden. Eine solche Festphase ist beispielsweise Sepha- rose (maßgeblich Glutathion-Sepharose bei Verwendung von SEQ ID No. 8). Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahren haben die entstehenden beladenen Festphase-Beads (siehe Fig 6) der aktiven erfindungsgemäßen Fusionsproteine den besonderen Vorteil nicht dauerhaft mit Poly(1 ,4-alpha-glucan) zu verblocken, also von dem Produkt der Biokatalyse bedeckt und somit "inaktiviert" zu werden. Das Verfahren enthält folgende Schritte: Umsatz von Saccharose zu Poly(1 ,4-alpha- glucan) mittels immobilisierten erfindungsgemäßem Fusionsprotein unter starken Schütteln, besonders bevorzugt GST-AmSu, an einer festen Phase. Trennung der Festphasen-Beads von der Reaktionsbrühe mittels Filtration (z.B. Glasfritte), wenn der Reaktionsumsatz erreicht wird. Spülen der Festphasen-Beads mit DMSO, wobei das Produkt Poly(1 ,4-alpha-glucan) in Lösung geht. Anschließend wird der Festpha- sen-Bead mit PBS DMSO-frei gewaschen und erneut mit erfindungsgemäßem Fusionsprotein (nach)beladen. Die derart beladene Festphase ist wieder für eine neue Biotranformationsrunde einsetzbar.
Die erfindungsgemäße Fusionsproteine sowie das in diesem Zusammenhang ste- hende Verfahren führt zu einer Reihe, zum Teil unerwarteter Vorteile im Verlauf der Biokatalyse. Die Spezifität der Biokatalyse wird verbessert, was sich in einer erhöhten Produktausbeute und weniger Nebenprodukt zeigt. Das Nebenprodukt Palatino- se wird zu weniger als 15 % der zu erwartenden Gesamtproduktmenge gebildet. Das herkömmliche Batch-Verfahren zeigt dagegen eine Produktausbeute von deut- lieh weniger als 80% der theoretisch möglichen Menge.
Ein weiterer entscheidender Vorteil ist die Beschleunigung der Reaktion. Man benötigt weniger als 24 h, bis sämtliches Substrat aus dem Biosyntheseansatz verbraucht ist. Im Vergleich dazu, werden im Batch-Verfahren mindestens 48 - 72 h benötigt. Dies liegt wahrscheinlich daran, daß im Gegensatz zu dem herkömmlichen Verfahren der Reaktionsansatz während der Reaktion heftig gemischt werden kann. Das Batch -Verfahren wird mit einem annähernd undurchmischten Ansatz durchgeführt. Experimente mit der Amylosucrase zeigten, daß das Enzym sowohl in der natürlichen Form, als auch als Fusionsprotein bei heftiger Durchmischung stark schäumt und dadurch inaktiviert wird. Erst die Bindung des Fusionsproteins an eine Festphase ermöglicht eine starke Durchmischung. Hierbei entsteht kein Schaum und die Aktivität bleibt erhalten.
Die dadurch gegebene Erhöhung der Raum-Zeit-Ausbeute und die Verringerung an Nebenprodukten ist eine entscheidende Verbesserung des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem Stand der Technik. Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein zusammengesetzter stabiler Katalysator enthaltend das erfindungsgemäße Fusionsprotein, vorzugsweise gemäß SEQ ID No. 8, immobilisiert auf einer festen Phase wie Sepharose und ggf. weitere Hilf- und Zusatzstoffe. Eine mögliche Ausführungsform (sogenannter "Sepharose- bead") ist in Fig. 6 gezeigt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren die Herstellung von Mikropartikeln aus Poly(1 ,4-alpha-glucan), welche in unterschiedlicher Größe und Verteilung in Partikelform - bis zu etwa 5μm - erhalten werden. Solche Partikel sind in der Anmeldung WO 99/11695 der Anmelderin bereits beschrieben. Die Mikropartikel werden jedoch im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahren in einer solcher Qualität erhalten, daß diese nunmehr für die dort beschriebenen Anwendungen besonders vorteilhaft eingesetzt werden können.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung ohne die Erfindung auf diese Beispiele einzuschränken. Beispiele:
Beispiel 1 :
Herstellung des verkürzten Amylosucrase-Gens
Durch eine PCR-Standardmethode wurden verschiedene Formen des Amylosucrase-Gens hergestellt. Als Template diente die Nukleinsäuresequenz der Amylosucrase aus WO 95/31553. Die PCR erfolgte mit den "forward" Primer AmSu (Seq. ID No. 1) bzw. AmSu5 (Seq. ID No. 2) und dem "reverse" Primer AmSu Xhol rev (Seq. ID No. 3). Durch die Primer wurde an der 5'-Seite ein EcoRI- und am 3'-Ende eine XΛol-Schnittstelle generiert. Die Amplifikate erhielten die Bezeichnung AmSu (Seq. ID No. 4) und AmSu5 (Seq. ID No. 5). Folgende PCR-Bedingungen wurden für die Amplifikation verwendet: etwa 1ng Template-DNA, 1μl AmSu- oder AmSuδ- und AmSu Xhol rev-Primer Oe lOOpmol/μl), 4μl dNTP's (2,5mM each), 5μl 10x Inkubationspuffer mit MgS0 (Boehringer Mannheim), 5 U Pwol DNA-Polymerase (Boehrin- ger Mannheim), ad 50μl Wasser. Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet: 5min 94°C anschließend 30 Zyklen 30s 94°C, 30s 55°C, 3min 72°C, es folgten 20min 72°C. AmSu repräsentiert das vollständige Amylosucrase-Gen, AmSuδ be- zeichnet die verkürzte Version.
Beispiel 2:
Klonierung der AmSu-Varianten in ein Expressionsplasmid
Die Amplifikate AmSu und AmSuδ wurden durch Ethanolfällung gereinigt und an- schließend mit EcoRI und Xhol geschnitten. Auf die gefällte DNA wurden folgende Volumina pipettiert: 4μl 10x Restriktionspuffer 2 (NEB), 0,4μl BSA (NEB), 2μl EcoRI (NEB, 20 U), 2μl Xhol (NEB, 20 U) und 31 ,6μl Wasser. Die Restriktion erfolgt bei 37°C für 2h. Anschließend wurden die Enzyme bei 65°C für 10min deaktiviert. 1 μg Plasmid pGEX-4T-1 (Pharmacia) wurde mit EcoRI und Xhol geschnitten. Fol- gende Bedingungen wurden eingestellt: 3μl 10x Restriktionspuffer 2 (NEB), 0,3μl BSA (NEB), 2μl EcoRI (NEB, 20 U), 2μl Xhol (NEB, 20 U) ad 30μl Wasser. Die Re- striktion erfolgte bei 37°C für 2h. Anschließend wurden die Enzyme bei 65°C für 10min deaktiviert.
Geschnittenes Plasmid und geschnittene AmSu-Versionen wurden nach folgendem Schema ligiert: 100ng geschnittenes Plasmid werden mit etwa 100ng geschnittenen PCR-Produkten (AmSu und AmSuδ) vereint. Dazu kamen 2μl 10x Ligationspuffer (NEB) und 2μl T4-DNA-Ligase (NEB); mit Wasser auf 20μl aufgefüllt. Die Ligation wurd bei Raumtemperatur für 2h durchgeführt. Der pGEX-4T-1 Vektor, der das Am- Su-Gen trägt ist in Fig. 1 (Seq. ID No. 6) abgebildet; der Vektor - der das Fragment AmSuδ trägt wird in Fig. 2 (Seq. ID No. 7) gezeigt.
Die gesamten Ligationsansätze wurden nach E.coli TOP10 mit Hilfe der CaC - Methode transformiert. Die Transformanten wurden auf Ampicillin-Resistenz selektiert und für die Minipräp-Analyse in LB-Medium mit Ampicillin angezogen. Die ausgewählten Klone wurden über DNA-Sequenzierung überprüft. Die Stammhaltung hat bei -80°C in Glycerin zu erfolgen.
Beispiel 3:
Expression der Amylosucrase-Varianten und Bindung an Glutathion- Sepharose 20ml LB-Medium mit 100μg/ml Ampicillin wurden in einem 100ml Kolben mit 100μl Gefrierkultur angeimpft. Die Kultur wurde über Nacht bei 37°C und 240rpm Schüttelfrequenz inkubiert.
Eine Hauptkultur mit 250ml LB-Medium mit 100μg/ml Ampicillin (oder ein entsprechend größeres Kulturvolumen) wurde in einem 1000ml Kolben mit der Vorkultur so angeimpft, daß die optische Dichte 600nm (ODβoo) der Kultur nach 3h Wachstum bei etwa 1 liegt. Danach erfolgte die Induktion des TAC-Promotors durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM). Die Kultur wurde weitere 3h inkubiert. Die Kultivierungen erfolgten bei 37°C und 240rpm Schüttelfrequenz. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 2000xg für 10min geerntet. Das Zellpellet wurde in 10ml PBS-Puffer mit 0,1g Lysozym (Sigma) und 250 U Benzonase (Merck) aufgenommen und bei 37°C für 60min inkubiert. Danach wurden 100μl PMSF (100mM in Isopropanol) (Sigma) und 100μl Triton X-100 (Sigma) zugegeben. Nachdem die Zellen lysiert sind, wurden die Zellreste bei l OOOOxg für 10min abzentrifugiert und der Überstand wurde mit 2 ml Glutathion-Sepharose 50%ig (Pharmacia) in PBS versetzt. Der Ansatz wird für 1 h leicht geschüttelt. Danach wurde die Sepharose bei 500xg für 10min abzentrifugiert und das Sepharose-Pellet wird dreimal in 10ml PBS gewaschen. Das gewaschene Pellet wird derart in PBS aufgenommen, daß das Gesamtvolumen wieder 2ml betrug. Es wurden 200μl Glycerol zugegeben und die mit Amylosucrase beladene Sepharose wird bei -20°C gelagert. Fig. 3 zeigt deutlich die Induktion der GST-AmSu und die Effektivität der Aufreinigung.
Beispiel 4:
Bestimmung der spezifischen Aktivität der GST-AmSu
Glutathion-Sepharose - gemäß Bespiel 3 beschrieben - beladen, wurde entweder mit einer 10mM Glutathion-Lösung mit 50mM Tris/HCI pH 8 oder mit Thrombin (150mM NaCI, 50mM Tris/HCI pH 8, 2,5mM CaCI2, 0,1 % Mercaptoethanol und 5,5mg/ml Thrombin) eluiert. Von der Säule wurde im Fall der Glutathion-Elution sehr reines GST-AmSu Protein eluiert. Im Fall der Thrombin-Elution wurde der Amyiosu- crase-Fusionsteil eluiert, da sich eine Thrombinspaltstelle zwischen dem GST-Teil und der AmSu befindet (Fig. 4). Durch die Bestimmung der AmSu-Aktivität und der Proteinkonzentration der Eluate konnte die spezifische Aktivität der AmSu-Versionen bestimmt werden. Die Fusion GST-AmSu5 (Glutathion-Eluat) und das Thrombin- Eluat (entspricht AmSu5) haben beide eine spezifische Amylosucrase-Aktivität von 0,2U/μg. Die gentechnisch unveränderte AmSu besitzt lediglich eine spezifische Aktivität von 0,17 U/μl.
Beispiel 5:
Einfache Elution der GST-AmSu
Von den Herstellern der Glutathion-Sepharose (Pharmacia) wird für die Elution gebundener Fusionsproteine gelöstes Glutathion empfohlen. Für eine großtechnische Produktion gereinigter GST-AmSu ist dieses Elutionsmittel jedoch zu teuer. Auf der Suche nach einem günstigen Elutionsmittels wurden HCI-Lösungen mit unterschiedlichen pH-Werten getestet. Überraschenderweise führte bereits eine relativ geringe Absenkung des pH-Wertes zur Elution funktioneller GST-AmSu. Für diesen Versuch wurden Glutathion-Sepharose Säulen mit 2ml Bettvolumen (Pharmacia) mit einem E. co//-Aufschluß beladen, der GST-AmSu enthielt (siehe oben). Es wurden HCI- Lösungen mit 140mM NaCI und den pH-Werten 6, 5, 4, 3 und 2 hergestellt. Jeweils 4ml eines pH-Wertes wurden auf die Säule gegeben und Fraktionen von 1 ml wurden aufgefangen. Ein Amylosucrase-Aktivitätstest wurde durchgeführt und es wurde deutlich, daß bereits bei einer Absenkung des pH-Wertes auf pH 6 das Protein von der Säule gelöst wurde (Fig. 5). Diese Elutionsmethode ist schonend und billig zugleich. Erst damit wird der industrielle Einsatz der Affinitätsaufreinigung in diesem speziellen Fall möglich.
Beispiel 6:
Biokataiyse mit an Sepharose immobilisierter GST-AmSu
Etwa 50 U GST-AmSu wurden mit δml Biotrafo-Puffer versetzt (20% Saccharose, δOmM NaCitrat pH 6,5, 0,02% NaN3). Der Ansatz wurde unter Schütteln (180rpm) bei 37°C inkubiert. Der Verlauf der Reaktion - und damit der Polymerbildung - wurde an dem Saccharoseverbrauch und der Fructosebildung verfolgt.
Fig. 6 zeigt den typischen Verlauf einer Biokatalyse mit dem gebundenen Enzym (GST-AmSu an Sepharose). Es zeigte sich, daß nach etwa 48h die gesamte Saccharose verbraucht ist. Die Fructose-Konzentration stieg dementsprechend innerhalb dieser Zeit von 0% auf 7,6 % an. Innerhalb dieser Zeit wurde ein wasserunlösli- eher Amylose-Niederschlag gebildet (Fig. 7).
Beispiel 7:
Qualität der durch Biokatalyse mit immobilisierter GST-AmSu hergestellten
Amylose Ein Biokatalyse-Ansatz gemäß Beispiel 6 wurde nach dem Ende der Reaktion gefriergetrocknet und in DMSO aufgenommen. Über eine GPC-Analyse wurde die Verteilung der Molekülgrößen der Amylosemolküle bestimmt. Fig. 8 zeigt die Größenverteilung des Poly(1 ,4-alpha-glucan).
Beispiel 8:
Herstellung von Mikropartikeln aus dem Verfahrensprodukt
Das erhaltene Poly(1 ,4-alpha-glucan) kann in sehr kleine, wasserunlösliche Mikro- partikel umgesetzt werden, wie in der Anmeldung WO 99/11695 ist eine besondere Qualität der Amylose nötig. Die in der Biokatalyse mit einem immobilisierten Enzym gewonnene Amylose weist diesen besonderen Qualitätsstandard auf. In Fig. 8 sind Mikropartikel, die aus Amylose bestehen, zu sehen. Es wurde Poly(1 ,4-alpha- glucan) gemäß Beispiel 6 als Ansatz verwendet,. Die Mikropartikel wurden wie folgt hergestellt: 1g Poly(1 ,4-alpha-glucan) wurden in 5ml DMSO bei 60°C gelöst. Die Poly(1 ,4-alpha-glucan) in Lösung wurde in 100ml Wasser unter Rühren gegeben. Über Nacht wurden die Mikropartikel bei 5°C gefällt und anschließend gewaschen, eingefroren und gefriergetrocknet.
Beispiel 9:
Mehrfache Verwendung der beladenen Glutathion-Sepharose als Katalysator
Die Sepharose-Beads und die während der Katalyse gebildeten Mikropartikel sind aufgrund ihrer unterschiedlichen Größen (siehe Fig. 6) durch Filtration mit einer Glas-Fritte leicht voneinander zu trennen. Die abgetrennten Sepharose-Beads kön- nen für neue Biotransformationen eingesetzt werden. Fig. 10 zeigt die Ergebnisse von mehrmaligen Einsätzen GST-AmSu beladener Glutathion-Sepharose. Die mehrfachen Ansätze sind vergleichbar mit dem unter Beispiel 6 beschriebenen Ansatz.
Beispiel 10:
Regeneration der Glutathion-Sepharose Beads
Durch die Biokatalyse bildet sich eine Amyloseschicht um die Katalysatoren, die den Stoffaustausch zwischen dem Katalysator und dem Biotrafo-Puffer behindert und letztendlich sogar verhindert. Um die Glutathion-Sepharose Beads zu regenerieren, werden die Biokatalysatoren mit DMSO gewaschen und können nach dem Spülen mit PBS wieder neu mit GST-AmSu - z.B. aus einem Aufschluß rekombinanter E. coli's - beladen werden.
Beispiel 11 : Rezyklisierungsansatz
GST-AmSu wird von einer beladenen Glutathion-Sepharose mittels pH-Shift eluiert (siehe Beispiel δ) und für eine Biotransformation analog zu zu Beispiel 6 eingesetzt. Nach vollständigem Umsatz wird das Produkt Poly(1 ,4-alpha-glucan) durch Zentrifu- gation vom Reaktionsüberstand mit der GST-AmSu abgetrennt. Die GST-AmSu wurde danach erneut an Glutathion-Sepharose gebunden und folglich isoliert. Nach einem Waschschritt wurde die Amylosucrase eluiert (pH-Shift) und mit neuem Bio- trafo-Puffer versetzt.
Literatur
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De Montalk, G.P., Remaud-Simeon, M., Willemot, R.M., Planchot, V. and Monsan, P. (1999) Seuquence analysis of the gene encoding amylosucrase from Neisseria polysaccharea and characterization of the recombinant enzyme. J. Bacteriol. 181 ,
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MacKenzie, C.R., Perry, M.B., McDonald., IJ. and Johnson, K.G. (1977) Glycogen synthesis by amylosucrase from Neisseria perflava. Can. J. Microbiol. 23: 1303- 1307.
Nelson, J.M. und Griffin, E.G. (1916) Adsorption of invertase. J. Am. Chem. Soc. 38:
1109-1116.
Saleemuddin, M. (1999) Bioaffinity based immobilization of enzymes. Adv. Biochem.
Eng. Biotechnol. 64: 203-226.
Beschreibung der Figuren Fig. 1 : Plasmidkarte von pGEX-4T-1-AmSu Fig. 2: Plasmidkarte von pGEX-4T-1-AmSu5
Fig. 3:A) Mit Coomassie gefärbte SDS-PAGE. Spuren 1 und 2: Mit Thrombin elu- ierte GST-AmSu; Spur 3: Aufschluß von E. co//-Zellen, die das Plasmid pGEX-4T-1- AmSu tragen nach der IPTG-Inuktion; Spur 4: Aufschluß von E. co//-Zellen, die das Plasmid pGEX-4T-1-AmSu tragen vor der IPTG-Inuktion. Die Pfeile deuten auf die GST-AmSu und auf die kleinere Form, die durch die Thrombinspaltung entsteht, hin. B) Mit Coomassie gefärbte SDS-PAGE. Spuren 1 und 2 zeigen das mit Glutathion eluierte GST-AmSu-Protein. Spur 3 zeigt eine feste Probe der mit GST-AmSu beladenen Glutathion-Sepharose.
Fig. 4: Alternative Elution der GST-AmSu von der Glutathion-Sepharose-Matrix mit unterschiedlichen pH-Werten. Das Eluat wurde in Volumen von 1 ml aufgefangen und auf Amylosucrase-Aktivität getestet. Fraktion Nr. 5 enthält etwa 50% der Gesamtaktivität.
Fig. 5: Verlauf eine Biokatalyse mit immobilisierter GST-AmSu. Fig. 6: Mikroskopische Aufnahme eines Biokatalyse-Ansatzes mit immobilisierter GST-AmSu (Vergrößerung 100fach). In der Bildmitte dominiert ein mit GST-AmSu beladenes Sepharose-Bead. Umgeben wird der Katalysator von NEO-Amylose- Kügelchen.
Fig. 7: Größenverteilung der Amylosemoleküle in der NEO-Amylose gemäß GPC- Analyse. Die mittlere Molekülmasse liegt bei 43δ0g/mol. Fig. 8: Elektronenmikroskopische Aufnahme von Mikropartikeln, die aus NEO- Amylose hergestellt wurden. Fig. 9: Verlauf von Biokatalysen mit mehrfach eingesetztem Katalysator.

Claims

Patentansprüche
1. Immobilisierbare Amylosucrase an einer festen Phase, enthaltend ein Fusionsprotein bestehend aus den funktionellen Einheiten einer Amylosucrase und einer Ankersequenz und ggf. weitere Hilfssequenzen.
2. Fusionsprotein nach Anspruch 1 mit einer Aminosäurensequenz gemäß SEQ ID No. 8 oder eine funktionelle Variante oder Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, wobei SEQ ID No. 8 Teil des Anspruches ist.
3. Nukleinsäure kodierend für eine immobilisierbare Amylosucrase nach Anspruch
1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA mit einer Nu- kleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. δ, erhältlich aus SEQ ID No. 4, ligiert mit einer Ankersequenz oder eine funktioneile Variante oder Teile davon mit minde- stens 8 Nukieotiden, wobei SEQ ID No. δ Teil des Anspruches ist.
4. Expressionsvektor enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in einer Wirtszelle das Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder
2 exprimiert wird.
δ. Wirtszelle nach Anspruch 4 ausgewählt aus E. coli.
6. Expressionsvektor nach Anspruch 4 und δ, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor aus einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 7 enthält.
7. Ankersequenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz für ein Epitop kodiert.
8. Ankersequenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäu- resequenz für ein Bindungspartner mit hoher Affinität kodiert.
9. Ankersequenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz für Glutathion-S-Transferase kodiert.
10. Festphase nach Anspruch 1 und 2 und Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß diese aus Glutathion-Sepharose besteht.
11. Zusammengesetzter stabiler Katalysator enthaltend eine immobilisierte Amylosucrase auf Sepharose gemäß Anspruch 1 und 2 und Anspruch 9 und 10 zur Herstellung von Poly(1 ,4-alpha-glucan).
12. Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von Poly(1 ,4-alpha-glucan) dadurch gekennzeichnet, daß ein immobilisiertes Fusionsprotein auf einer festen Phase mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase nach Anspruch 1 oder 2: a) Saccharose zu Poly(1 ,4-alpha-glucan) unter starken Schütteln umsetzt; b) und nach Trennung von der Reaktionsbrühe mit DMSO unter Lösung von Po- ly(1 ,4-alpha-glucan) gespült und mit PBS DMSO-frei gewaschen wird c) und ggf. (nach)beladen wird.
13. Verwendung des Katalysators nach Anspruch 11 und des Verfahrens nach Anspruch 12 zur Herstellung von Mikropartikeln.
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