WO2000077014A1 - Phosphates d'aryle - Google Patents

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WO2000077014A1
WO2000077014A1 PCT/JP2000/003761 JP0003761W WO0077014A1 WO 2000077014 A1 WO2000077014 A1 WO 2000077014A1 JP 0003761 W JP0003761 W JP 0003761W WO 0077014 A1 WO0077014 A1 WO 0077014A1
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WO
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group
salt
compound
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physiologically acceptable
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Application number
PCT/JP2000/003761
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Inventor
Masayuki Kawakami
Akihiko Ikegawa
Tamio Mizukami
Takeshi Takahashi
Yoshinori Yamashita
Yuko Kanda
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Fuji Photo Film Co., Ltd.
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/12—Esters of phosphoric acids with hydroxyaryl compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/572—Five-membered rings

Definitions

  • the present invention relates to an aryl compound having a phosphoric acid ester and a medicament containing the compound as an active ingredient.
  • RNR ribonucleotide reductase
  • Hydroxyperia is known as a compound that exhibits antitumor activity by inhibiting RNR, and is used clinically as an anti-leukemia drug.
  • its inhibitory effect is weak, and it is necessary to maintain a high blood concentration for a long time in order to sufficiently inhibit RNR.
  • this drug is not a satisfactory treatment because it has strong side effects such as bone marrow toxicity. For this reason, it has high RNR inhibitory activity.
  • low-molecular-weight RNR inhibitors include polyhydroxybenzoic acid derivatives (JP-A-60-501409), alkoxyphenol compounds (Mol. Pharmacol., 45, pp. 792-796), and thiosemicarbazone. Derivatives (Biochem. Pharmacol., 48, pp. 335-344), viviridyl derivatives (Cancer Research, 53, pp. 19-26) and the like have been reported. W098 / 52551 discloses a cancer therapeutic agent containing a bisaryl derivative.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. H10-507462 discloses an epipodophyllotoxin derivative having a phosphate monoester group. There are no reports on aryl derivatives and their RNR inhibitory activity or anticancer activity. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel compound useful as a water-soluble low-molecular-weight RNR inhibitor.
  • Another object of the present invention is to provide a medicine containing, as an active ingredient, an aryl compound having a phosphate ester having RNR inhibitory activity.
  • the present inventors have the following formula (I): It has been found that such compounds have an RNR inhibitory activity and an anticancer activity, and also have a high water solubility that can be dissolved in a water-soluble diluent such as physiological saline / glucose injection. In addition, they have found that the above-mentioned compounds are useful as active ingredients for pharmaceuticals, and particularly useful as active ingredients for therapeutic agents for cancer. The present invention has been completed based on these findings. That is, the present invention provides the following general formula (I):
  • R 2 and R 3 each independently represent a divalent, trivalent, or tetravalent group
  • X 1 represents —CH 2 —
  • the two or three groups selected may be bonded to each other to form a cyclic structure
  • Ar 1 is an aryl group having 1 to 3 hydroxyl groups on its ring, the following formula (A): Or a monocyclic heteroaryl group having 1 to 3 heteroatoms selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom, and a sulfur atom as a ring-constituting atom, these groups r 1 indicates is to provide a compound represented by the ring on the may have one or more substituents].
  • phosphorus Sane ester represented by one hundred and one P_ ⁇ (OH) (OH) is A ri- S- R 1 - substituted on the para position with respect to the group represented by S-
  • X 1 is a group represented by —N (R 4 ) 1 (R 4 represents a monovalent or divalent group) or a salt thereof; and R 4 is The aforementioned compound or a salt thereof, which is an optionally substituted C 1 -C 4 alkyl group, is provided.
  • the salt of the compound represented by the above formula (I) is preferably Alkali metal salts or ammonium salts, particularly preferably sodium salts in the phosphate moiety.
  • the present invention provides a medicament comprising a compound represented by the above general formula (I) or a physiologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • This medicament is useful, for example, as a medicament for preventing and / or treating a disease caused by overexpression of ribonucleotide reductase, or as a medicament for treating cancer.
  • a ribonucleotide reductase inhibitor comprising the compound represented by the above general formula (I) or a salt thereof; and a cancer cell comprising the compound represented by the above general formula (I) or a salt thereof.
  • a selective growth inhibitor is provided.
  • aryl group as used herein is used, for example, to include aryl groups having 6 to 12 carbon atoms.
  • the aryl group represented by Ar 1 is preferably, for example, a phenyl group or a naphthyl group, and the same applies to other aryl groups unless otherwise specified.
  • the aryl group represented by A r 1 is The ring has 1 to 3, preferably 1 to 2, particularly preferably 1 hydroxyl groups on the ring, but the substitution position of the hydroxyl groups is not particularly limited.
  • the phosphoric ester represented by 1 O—P ⁇ ( ⁇ H) (OH) is preferably substituted at the para-position (4-position).
  • a r 1 As the monocyclic heteroaryl group represented by A r 1 , for example, a heteroaryl group having 1 to 3 hetero atoms selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom, and a sulfur atom as a ring-constituting atom is used. be able to. When it has two or more hetero atoms, they may be the same or different.
  • heteroaryl group examples include a 5- to 6-membered heteroaryl group, and more specifically, for example, a pyrrolyl group, a furyl group, a cyenyl group, a pyrazolyl group, an imidazolyl group, a thiazolyl group, an oxazolyl group , A triazolyl group, a thiadiazolyl group, an oxadiazolyl group, a tetrazolyl group, a pyridyl group, a virazyl group, a pyrimidinyl group, a pyridazinyl group, a pyridonyl group, and the like.
  • a monocyclic heteroaryl group having one or two hetero atoms as ring-constituting atoms selected from the group consisting of a nitrogen atom and a sulfur atom can be used.
  • Ryl or imidazolyl groups can be used.
  • a r 1 represents Ariru group, group represented by Formula (A) or on the ring of the monocyclic to Teroari Le group, the optional substituents are 1 or 2 or more, preferably in the presence of four 1 It may be.
  • a substituent include a hydroxyl group; a halogen atom (in the present specification, a “halogen atom” or “halogen” may be a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom); C—C 6 alkyl groups such as methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group and tert-butyl group; halogenated mono-C 6 alkyl groups such as trifluoromethyl group C ⁇ -Ce alkoxy groups such as methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group, isopropoxy group, n-butoxy group
  • R 2 and R 3 include, for example, linear or branched ⁇ . And an alkylene chain.
  • the alkylene chain may have one or more unsaturated bonds.
  • the unsaturated bond may be either a double bond or a triple bond, and may contain both.
  • alkylene chain examples include, for example, a linear or branched linear C 10 alkylene group such as a methylene group, an ethylene group, a propylene group, a butylene, and a pentylene group; an ethenylene group, a propenylene group, an 11-butenylene group; A cis or trans 1-2-butenylene group; Alkenylene group; C — C such as ethinylene group and propynylene group. Alkynylene groups and the like can be mentioned. These alkylene chains may have one or more substituents.
  • Examples of preferred alkylene chains having a substituent include, for example, oxo C—C 10 alkylene groups such as a oxoethylene group, an oxo-2-methylethylene group, and an oxopropylene group; Examples thereof include, but are not limited to, an oxy Ci_C 0 alkylene group such as -oxypropylene group.
  • an ethylene group or a propylene group can be particularly preferably used.
  • the term “divalent group” refers to a group containing at least one carbon atom among groups capable of forming two independent covalent bonds.
  • the term “trivalent group” means a group containing at least one carbon atom of three groups capable of forming independent covalent bonds, and the term “tetravalent group” It means a group containing at least one carbon atom among groups capable of forming four independent covalent bonds.
  • the divalent group may be either a chain or a ring, and may be a group in which a chain partial structure and a cyclic partial structure are combined.
  • a cyclic divalent group is a group or atom capable of forming two independent covalent bonds with a cyclic structure and one or more other linking groups (herein, "linking group” means: For example, it may be a combination of a divalent group such as an alkylene group and an alkyleneoxy group, as well as an oxygen atom and a sulfur atom. Further, the cyclic divalent group may preferably be constituted by an atom selected from the group consisting of a carbon atom, a hydrogen atom, an oxygen atom, a nitrogen atom, a sulfur atom, and a phosphorus atom.
  • the cyclic divalent group may include a carbon-carbon bond, a carbon-oxygen bond, a sulfur-oxygen bond, and a carbon-nitrogen bond. It may contain, as a partial structure, one to three covalent bonds containing any heteroatom, such as a carbamoyl bond, a sulfamoyl bond, an ether bond, a disulfide bond, etc., and a chain-like partial structure or a branched chain. May be provided.
  • One or more optional substituents may be present on the above-mentioned ring constituting the cyclic divalent group. When two or more substituents are present, they may be the same or different.
  • substituents include a halogen atom such as a fluorine atom, a chlorine atom, and a bromine atom; a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, a t-butyl group, and the like.
  • R 2 and R 3 be bonded to each other to form a divalent group containing a cyclic structure together with X 1 , in which case X
  • the group represented by 1 is 1 N (R 4 ) 1.
  • the ring formed by combining R 2 and R 3 with X 1 include a pyrrolidine ring, an imidazolidine ring, an oxazolidin ring, and a thiazolidine ring.
  • R 4 represents a monovalent or divalent group.
  • R 4 is, for example, a hydrogen atom; an amidino group; an amino group; a halogen atom such as a chlorine atom; a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group a substituted or unsubstituted alkyl group amino group substituted for; substituted young properly alkyl group unsubstituted ⁇ amino carbonyl group is substituted; single C 6 alkyl group such as Asechiru group; phenyl group, Ariru group such as a naphthyl group C 1 -C 6 alkanoyl group such as propionyl group; alkoxy-substituted C-Ce alkanol group such as methoxymethylcarbonyl group; substituted or unsubstituted aminocarbonyl
  • R 4 is a substituted or unsubstituted alkyl group
  • the alkyl group may be linear or branched, and may have a cyclic structure or an unsaturated bond.
  • the number of carbon atoms is preferably 20 or less including a substituent. Particularly preferred are those having 1 to 4 carbon atoms.
  • Particularly preferred as R 4 is an amino group substituted with a substituted or unsubstituted aminocarbonyl. Is a alkyl group. Most preferably, it is an unsubstituted aminocarbonylmethyl group.
  • the compound of the present invention may have one or more asymmetric carbons depending on the type of the substituent. In some cases, the sulfur atom acts as an asymmetric center.
  • any optically pure optical isomer based on one or more asymmetric centers any mixture of the above optical isomers, racemate, diastereoisomer based on two or more asymmetric carbons, above Any mixture of the diastereoisomers of the above is included in the scope of the present invention.
  • geometric isomers exist, and any geometric isomer or any mixture thereof is also included in the scope of the present invention.
  • an alkali metal salt or an ammonium salt is formed at the phosphate moiety represented by -0-PO (OH) (OH) present in the group represented by the formula (I). Is preferred.
  • an alkali metal salt or an ammonium salt in the phosphate ester portion represented by O—P ⁇ (OH) (OH) present in the group represented by the formula (A).
  • the alkali metal include sodium, potassium, lithium, rubidium, and cesium.
  • the ammonium salt include ammonium; mono, di, or trialanol ammonium; or mono, di, tri, or tetraalkyl ammonium.
  • a sodium salt or a potassium salt is preferable, and a sodium salt is particularly preferable.
  • an acidic group or a basic group other than the phosphate ester may form a salt.
  • salts include mineral salts such as hydrochloride, sulfate, and nitrate; paratoluene sulfonate, methane sulfonate, acetate, chloroacetate, oxalate, and trifluoromethane sulfonate.
  • organic salts such as quinoline sulfonates; metal salts such as sodium salts and potassium salts; and ammonium salts such as ammonium salts and triethylammonium salts.
  • any hydrate of the compound in the free form represented by the above formula (I) or a salt thereof, or any solvate of the compound in the free form represented by the above formula (I) or the salt thereof is also used in the present invention. Included in the scope of the invention. Solvents that can form solvates are not particularly limited. However, for example, a solvate may be formed by a solvent such as methanol, ethanol, acetone, tetrahydrofuran, dichloromethane, chloroform and dimethylformamide.
  • the method for producing the compound represented by the general formula U) is not particularly limited, and the compound can be synthesized according to various synthetic routes. Since the examples of the present specification disclose specific methods for preparing typical examples of the compounds of the present invention, those skilled in the art can refer to the methods described in the examples, and The compounds included in the above general formula (I) can be easily produced by appropriately modifying or modifying the methods and appropriately selecting starting materials and reagents. In the synthesis, various condensation reactions, addition reactions, oxidation reactions, reduction reactions and the like can be combined in one step or in multiple steps. These are well documented. For example, various methods and raw material compounds described as unit operations in “Experimental Chemistry Course” (published by Maruzen Co., Ltd., each volume included in each edition from the first edition to the fourth edition can be used) are suitable. Available to
  • a thio compound or a diamine compound as a starting material in terms of reaction operation and yield.
  • synthesis of thioether (sulfide), Unit operations such as ester synthesis; reaction between reactive functional groups such as vinyl group, halogen atom (including haloalkyl group), epoxy group, aziridine ring, acyl halide group, isocyanate group and thio group; and amination reaction Reactions such as amidation and alkylation are well known to those skilled in the art, and an appropriate method can be selected from conventional methods according to the yield, the difficulty of the reaction, and the like.
  • the desired process can be performed efficiently by applying protection, deprotection, or other means, or by subjecting it to treatment such as oxidation, reduction, or hydrolysis [for example, Protective 'Group's in Organic] ⁇ Synthesis
  • the production intermediate and the target compound in the above step are subjected to purification methods commonly used in organic synthetic chemistry, for example, filtration, extraction, washing, drying, concentration, recrystallization, various types of mouth chromatography, etc. It can be purified. Further, the production intermediate can be subjected to the next reaction without isolation.
  • the compound of the present invention represented by the above general formula (I) has a ribonucleotide reductase inhibitory action and can selectively suppress the growth of cancer cells, it can be used in mammals including humans.
  • the type of cancer to which the medicament of the present invention can be applied can be used as an active ingredient of a cancer therapeutic agent that can be administered to an animal, and is not particularly limited. Gastric cancer, lung cancer, colon cancer, liver cancer, kidney cancer, breast cancer, uterus
  • the present invention is applicable to any of solid cancers such as cancer, skin cancer and brain tumor, and non-solid cancers such as leukemia and lymphoma.
  • ribonucleotide reductase of the animal itself viruses, bacteria, etc.
  • herpes syndrome caused by abnormal growth of herpes simplex virus
  • herpes syndrome caused by abnormal growth of herpes simplex virus
  • the use of the compound of the present invention is for pharmaceutical use Without limitation, for example, it can be used as a ribonucleotide reductase inhibitor as a reagent in fields such as biochemistry, pharmacology and genetic engineering.
  • the active ingredient of the medicament of the present invention it is possible to use a compound selected from the group consisting of the compounds included in the above general formula (I) and salts thereof, and hydrates and solvates thereof. However, two or more substances selected from these groups may be used in combination. It is preferable to use a substance in the form of a salt as an active ingredient of the medicament of the present invention, and particularly preferable is a sodium salt.
  • the above-mentioned substances can be administered as pharmaceuticals themselves, but usually, a drug in the form of a pharmaceutical composition is prepared using one or more pharmaceutically acceptable excipients for pharmaceutical preparations. It is preferred to manufacture and administer.
  • compositions suitable for parenteral administration include, for example, injections, drops, rectum (suppositories), ointments, and the like suitable for intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or intrathoracic administration. Creams, inhalants, transdermal absorbents, transmucosal absorbents, nasal drops, ear drops, eye drops, and the like.
  • Pharmaceutical compositions suitable for oral administration include, for example, tablets, capsules, Granules, powders, syrups and the like can be mentioned, but the form of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited to these. It is possible to select and use the composition.
  • injections are produced by dissolving the above active substance in a diluent (for example, saline, lactose injection, lactose injection, mannitol injection, etc.) available to those skilled in the art, and then filtering.
  • a diluent for example, saline, lactose injection, lactose injection, mannitol injection, etc.
  • a sealed container such as an ampule.
  • an injection in a lyophilized form or a powder injection mixed with sodium chloride may be produced based on the Japanese Pharmacopoeia.
  • additives for pharmaceutical preparations for example, auxiliary agents such as polyethylene glycol and HC0-60 (surfactant; manufactured by Nikko Chemical Co., Ltd.), and carriers such as ethanol and ribosome, cyclodextrin and the like may be included.
  • Preparation of a pharmaceutical composition suitable for oral administration or a pharmaceutical composition suitable for rectal administration is performed by appropriately preparing excipients, disintegrants, binders, lubricants, suspending agents, isotonic agents, emulsifiers, etc. It can be carried out by mixing and molding the additive for an agent and the above-mentioned substance by a conventional method.
  • the dose and frequency of administration of the medicament of the present invention are not particularly limited.
  • the medicament of the present invention When the medicament of the present invention is used for treating cancer, for example, 0.01 to 100 mg / kg (as the weight of the active ingredient) is administered once a week. It can be administered intravenously at intervals of about once every three weeks.
  • the dose and the frequency of administration depend on various conditions such as the method of administration, the type of the compound of the above formula (I) as the active ingredient, the age, weight, and symptoms of the patient, and the degree of side effects such as bone marrow suppression. It is desirable to adjust appropriately.
  • Compound 2 Compound 3 was prepared as follows. Cis-N-benzyl-2,5-bis (ethoxycarbonyl) pyrrolidine (6.10) synthesized according to the method described in Chemische Bericite, vol. 56B, pp. 1923. To a solution of g) in tetrahydrofuran (60 mL) was added lithium tetrahydroborate (3.12 g) under ice-cooling, and the mixture was stirred and gradually heated to room temperature. After standing overnight, the reaction solution was ice-cooled again, water (50 mL) and 6N hydrochloric acid (20 mL) were carefully added, and the mixture was heated on a water bath at 40 ° C for 15 minutes.
  • the remaining aqueous layer was purified by reversed-phase silica gel column chromatography (C0SM0SIL 75C 18-0PN, water ⁇ water: methanol 1: 1), and lyophilized to obtain a crude product.
  • the crude product was purified twice by gel column chromatography (Sephadex G-10, water) and freeze-dried to obtain 2.5 g of compound 1 as a white solid (yield 64%).
  • Nde I and Bam HI restriction enzyme fragments containing the region encoding the R1 subunit in this DNA were inserted between Nde I and Bam HI of plasmid pET3a (Novagen) to construct plasmid pETRl.
  • This plasmid was transformed into the Eschelichia coli BL21 (ADE3) plysS strain (Novagen) according to the method described in the second edition of Molexura Cloning, and the BL21 ( ⁇ DE3) plysSpETRl strain was transformed.
  • ADE3 plysS strain Novagen
  • This plasmid was transformed into Eschelichiacoli BL21 (ADE3) plysS strain (Novagen) in the same manner as described in Molecular-Cloning 2nd edition to construct BL21 (ADE3) plysSpETR2 strain.
  • IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM, and the culture was continued for another 20 hours.
  • Cells were collected from this culture by centrifugation at 7,000Xg for 10 minutes at 4 ° C, and the obtained cells were ice-cooled in Buffer A [50 mM HEPES-NaOH (pH7.6), 1 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 1 mM PMSF].
  • Buffer A 50 mM HEPES-NaOH (pH7.6), 1 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 1 mM PMSF].
  • the suspension was sonicated to disrupt the cells, and then centrifuged at 12,000 Xg for 20 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant was recovered, streptomycin sulfate was added to a final concentration of 2% (W / V), the mixture was kept on ice for 20 minutes, and then centrifuged at 12,000 xg for 20 minutes at 4 ° C. The supernatant was recovered, an equal volume of a saturated aqueous solution of ammonium sulfate was added thereto with stirring, and the mixture was kept on ice overnight. After collecting the precipitate by centrifugation at 15, OOOXg for 20 minutes at 4 ° C, dissolve it in 2 ml of buffer — A, desalt and buffer with PD-10 (Pharmacia Biotech) according to the usual method. Buffer replacement with A was performed.
  • the FPLC system (Pharmacia Biotech) was used for all subsequent separation and purification.
  • the desalted fraction was applied to Q-sepharoseFF (Pharmacia Biotech), flow rate 5.0 ml / min, separation time 50 minutes, eluent lOmM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 0 M force, 0.5 M KC1 Separation was performed under a linear gradient condition up to.
  • the fractions eluted between 10 and 20 minutes are collected, ammonium sulfate is added to a final concentration of 0.5 M, then applied to phenyl sepharoseHP (Pharmacia Biotech), and 10 mM phosphorous is added at a flow rate of 3.0 ml / min.
  • the fractions eluted in the last 15 minutes are collected, applied to 1 ml of resource Q (Pharmacia Biotech), washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), and then at a flow rate of 1 ml / min. Elution was performed by flowing 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) and 0.3 M KC1 for 10 minutes.
  • the eluted fractions for the first 3 minutes were collected, desalted with PD-10, and replaced with buffer A to obtain a purified R1 standard.
  • BL21 E DE3 plysSpETR2 strain was transformed with Terrific Broth 40 ml (containing ampicillin lOO ig / ml and chloramphenicol 20 g / ml and containing no glycerol: molecular cloning No. 2 Described in the edition)
  • the gold ear was inoculated and cultured with shaking at 28 ° C overnight.
  • 30 ml of this culture was transferred to a 2 L Erlenmeyer flask containing 400 ml of the same medium, and cultured with shaking at 28 ° C.
  • IPTG IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the culture was continued for another 6 hours.
  • Cells were collected from this culture by centrifugation at 7,000 X g for 10 minutes at 4 ° C, and the obtained cells were suspended in 20 ml of ice-cold buffer A. The suspension was sonicated to disrupt the cells, and then centrifuged at 12,000 xg for 20 minutes at 4. The supernatant was collected, streptomycin sulfate was added to a final concentration (w / v), kept on ice for 20 minutes, and centrifuged at 12,000 X g for 20 minutes at 4 ° C.
  • the FPLC system (Pharmacia Biotech) was used for all subsequent separation and purification.
  • the desalted fraction was applied to Q-Sepharose FF (Pharmacia Biotech), flow rate 5.0 ml / min, separation time 50 minutes, eluent 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 0 M Separation was performed under the condition of a linear concentration gradient from 0.5 to 0.5 M KC1.
  • the fraction eluted between 10 and 25 minutes is collected, ammonium sulfate is added to a final concentration of 0.5 M, applied to Resource ETH, and 10 mM phosphoric acid is added at a flow rate of 0.5 ml / min.
  • the fraction eluted in the last 15 minutes is collected, passed through 1 ml of resource Q (Pharmacia Biotech), and at a flow rate of 1 ml / min for 10 minutes with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). After washing, elution was performed by flowing 10 mM potassium phosphate buffer and 0.5 M potassium chloride for 10 minutes.
  • the eluted fractions for the first 3 minutes were collected, desalted with PD-10, and replaced with buffer A to obtain a purified R2 sample.
  • the reaction solution was heat-treated at 95 ° C for 5 minutes, and centrifuged at 10,000Xg for 5 minutes at 41:41. 180 1 acetonitrile was added to the supernatant 201, and the mixture was centrifuged again at 10, OOOXg for 5 minutes at 4 ° C, and the supernatant was used as an analysis sample.
  • the analysis was performed by high performance liquid chromatography. The analysis conditions are shown below.
  • 0.1 ml of HeLa S3 cells prepared at 1 ⁇ 10 4 Zml in a MEM medium containing 10% fetal bovine serum and 2 mM glumin were dispensed. After culturing at 37 ° C for 24 hours in a carbon dioxide incubator, add 0.05 ml of the test compound appropriately diluted in the above medium to each well, and culture in a carbon dioxide incubator at 37 T for 72 hours. did. After removing the culture supernatant, each well was washed twice with 0.1 ml of PBS buffer, and 0.1 ml of the above medium was added to each well again.
  • cell proliferation kit II Boe ringer Mannheim
  • IC 50 the cell growth inhibitory effect of Compound 1 was 9.37 M.
  • the compound of the present invention represented by the above formula (I) or a salt thereof has a strong ribonucleotide reductase inhibitory activity, is highly water-soluble, and is a water-soluble diluent such as a physiological saline / glucose injection. Can be dissolved without auxiliary agents.
  • the compound of the present invention is useful as an active ingredient of a medicament such as a therapeutic agent for cancer.

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Description

明 細 書 リン酸エステルを有するァリール化合物 技術分野
本発明は、 リン酸エステルを有するァリール化合物及び該化合物を有効成分と して含む医薬に関するものである。 背景技術
細胞の増殖過程においては、 一群の核酸合成関連酵素によって D N Aの複製過 程が調節されているが、 これらのなかで、 リボヌクレオチドレダク夕一ゼ（以下、 本明細書において 「R N R」 と記載する場合がある。） は D N Aの前駆体である d N T Pの生合成に関与しており、 特に重要な酵素であることが報告されている (Ann. Rev. Biochem, 57, pp. 349-374)。
癌細胞では一部の酵素群の過剰発現等により際限のない細胞増殖が繰り返され ており、 その結果として宿主は死に至るが、 癌細胞内では癌細胞の高い細胞増殖 能を維持するために R N Rが過剰発現していることが報告されている （Cancer Research, 43, pp. 3466-3492)。 また、 R N Rの発現に伴って癌の悪性化が引き起 こされる可能性についても報告がある （Pro Nat l. Acad. Sc i. USA, 93, p. 14036-14040)。 従って、 R N Rを選択的に阻害する薬物は、 癌細胞に対して高 い選択毒性を発揮することができ、 癌細砲の増殖を選択的に抑制する癌治療剤と して有用であることが期待される。
R N Rを阻害することにより抗腫瘍活性を示す化合物としてヒドロキシゥレア が知られており、 抗白血病薬として臨床で用いられている。 しかしながら、 その 阻害効果は弱く、 十分に R N Rを阻害するためには長時間にわたって高い血中濃 度を維持する必要がある。また、この薬剤は骨髄毒性等の副作用が強いことから、 満足すべき治療剤とはいえない。 このような理由から、 高い R N R阻害活性を有 するとともに、 骨髄毒性などの副作用が軽減され、 有効域の広い R N R阻害剤の 開発が望まれている。
従来、 低分子の R N R阻害剤としては、 ポリヒドロキシ安息香酸誘導体 （特表 昭 60-501409 号公報）、 アルコキシフエノール類化合物 （Mol. Pharmacol. , 45, pp. 792- 796)、チォセミカルバゾン誘導体（B iochem. Pharmacol. , 48, pp. 335-344) , ビビリジル誘導体 (Cancer Research, 53, pp. 19-26)等が報告されている。 また、 W098/52551にはビスァリール誘導体を含む癌治療剤が開示されている。 これらの 化合物はいずれも非水溶性であり、 癌治療を目的とし注射剤として使用する場合 には製剤用添加物としてポリエチレングリコールや HC0 (界面活性剤： 日光ケミ カル社製） 等の補助剤を用いる必要があるが、 これらの補助剤を多量にもちいる と副作用を生じる懸念があり、 望ましくない毒性を生じる場合もあることから、 生理食塩水ゃブドウ糖注射液等の水溶性希釈液に補助剤なしで溶解可能な水溶性 R N R阻害剤が必要とされていた。
水溶性希釈液に溶解可能な癌治療剤として、 例えば、 特表平 10- 507462号公報 にはリン酸モノエステル基を有するェピポドフィ口トキシン誘導体が開示されて いるが、 リン酸エステルを有する水溶性ァリール誘導体、 及びその R N R阻害活 性や制癌活性に関する報告はない。 発明の開示
本発明の課題は、 水溶性の低分子 R N R阻害剤として有用な新規化合物を提供 することにある。 また、 本発明の別の課題は、 R N R阻害活性を有するリン酸ェ ステルを有するァリール化合物を有効成分として含む医薬を提供することにある 本発明者らは、 下記の式 （ I ) で表される化合物が R N R阻害活性及び制癌活 性を有しており、 しかも生理食塩水ゃブドウ糖注射液等の水溶性希釈液に溶解可 能な高い水溶性を有していることを見出した。 また、 上記の化合物が医薬の有効 成分として有用であり、 特に癌治療剤の有効成分として有用であることを見出し た。 本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。 すなわち、 本発明は、 下記の一般式 （I) ：
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〔式中、 R S—RS— X1— !^3— [式中、 R 2及び R 3はそれぞれ独立に二価、 三価、 又は四価の基を示し； X1は— CH2—、 一 O—、 又は一 N (R4) 一 (R4 は一価又は二価の基を示す） で表わされる基を示す] を示すが、 R2、 R3、 及び R 4からなる群から選ばれる 2又は 3個の基は互いに結合して環状構造を形成し てもよく ； A r 1は 1から 3個の水酸基をその環上に有するァリール基、 下記の 式 （A) ：
Figure imgf000005_0002
で表される基、 又は酸素原子、 窒素原子、 及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1から 3個のへテロ原子を環構成原子として有する単環性へテロァリ一ル基を示 すが、 A r 1が示すこれらの基はその環上に 1又は 2個以上の置換基を有してい てもよい〕 で表される化合物又はその塩を提供するものである。
上記発明の好ましい態様として、 一〇一 P〇（OH) (OH)で表されるリン酸ェ ステルが A r i— S— R 1— S—で表される基に対してパラ位に置換した上記化 合物又はその塩； A r 1が 4 -ヒドロキシフエニル基である上記化合物又はその 塩； R 2及び R 3が互いに結合して X 1とともに飽和の 5員の単環性環状構造を形 成する上記化合物又はその塩； X1が— N (R4) 一 （R4は一価又は二価の基を 示す） で表される基である上記化合物又はその塩；及び R4が置換基を有してい てもよい 一 C4のアルキル基である上記化合物又はその塩が提供される。 上記 式 （I ) で表される化合物の塩としては、 好ましくはリン酸エステル部分におけ るアルカリ金属塩又はアンモニゥム塩、 特に好ましくはリン酸エステル部分にお けるナ卜リゥム塩が提供される。
別の観点からは、 本発明により、 上記の一般式 （ I ) で表される化合物又は生 理学的に許容されるその塩を有効成分として含む医薬が提供される。この医薬は、 例えば、 リボヌクレオチドレダクターゼの過剰発現に起因する疾患の予防及び/ 又は治療のための医薬、 又は癌治療のための医薬として有用である。 また、 上記 の一般式 （ I ) で表される化合物又はその塩を含むリボヌクレオチドレダク夕一 ゼ阻害剤；及び上記の一般式 （ I ) で表される化合物又はその塩を含む癌細胞に 対する選択的増殖抑制剤が提供される。
さらに別の観点からは、 上記の医薬の製造のための上記一般式 （ I ) で表される 化合物又は生理学的に許容されるその塩の使用 ；癌治療剤の製造のための請求の 上記一般式 （ I ) で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩の使用 ； リ ボヌクレオチドレダクタ一ゼ阻害剤の製造のための上記一般式 （ I ) で表される 化合物又は生理学的に許容されるその塩の使用 ；癌細胞に対する選択的増殖抑制 剤の製造のための上記一般式 （ I ) で表される化合物又は生理学的に許容される その塩の使用 ； リボヌクレオチドレダク夕ーゼの過剰発現に起因する疾患の予防 及びノ又は治療方法であって、 上記の一般式 （ I ) で表される化合物又は生理学 的に許容されるその塩の予防及び 又は治療有効量をヒトを含む哺乳類動物に投 与する工程を含む方法；及び癌の治療方法であって、 上記の一般式 U ) で表さ れる化合物又は生理学的に許容されるその塩の治療有効量をヒトを含む哺乳類動 物に投与する工程を含む方法が提供される。 発明を実施するための最良の形態
本明細書において用いられる 「ァリール基」 という用語は、 例えば、 炭素数 6 〜 1 2個のァリール基を包含するものとして用いる。 A r 1が示すァリール基と しては、 例えば、 フエニル基又はナフチル基などが好適であり、 特に言及しない 場合には、 他のァリール基についても同様である。 A r 1が示すァリール基は、 その環上に 1〜3個、 好ましくは 1〜2個、 特に好ましくは 1個の水酸基を有し ているが、 水酸基の置換位置は特に限定されない。 例えば、 A r 1が示すァリー ル基がフエニル基である場合には、 一個の水酸基がパラ位 （4-位） に置換してい る場合が好ましい。 式 （A) で表される基において一 O— P〇（〇H) (O H)で表 されるリン酸エステルはパラ位（4-位）に置換していることが好ましい。
A r 1が示す単環性へテロァリール基としては、 例えば、 酸素原子、 窒素原子、 及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1から 3個のへテロ原子を環構成原子とし て有するヘテロァリール基を用いることができる。 ヘテロ原子を 2個以上有する 場合には、 それらは同一でも異なっていてもよい。 ヘテロァリール基としては、 例えば、 5〜 6員環のへテロアリール基を挙げることができ、 より具体的には、 例えば、 ピロリル基、 フリル基、 チェニル基、 ピラゾリル基、 イミダゾリル基、 チアゾリル基、 ォキサゾリル基、 トリァゾリル基、 チアジアゾリル基、 ォキサジ ァゾリル基、 テトラゾリル基、 ピリジル基、 ビラジル基、 ピリミジニル基、 ピリ ダジニル基、 ピリドニル基などを用いることができる。 より好ましくは、 窒素原 子及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1又は 2個のへテロ原子を環構成原子と して有する単環性へテロァリール基を用いることができ、 さらに好ましくは、 ピ 口リル基又はィミダゾリル基を用いることができる。
A r 1が示すァリール基、 式 （A) で表される基、 または単環性へテロァリー ル基の環上には、 任意の置換基が 1又は 2個以上、 好ましくは 1から 4個存在し ていてもよい。 このような置換基としては、 例えば、 水酸基；ハロゲン原子 （本 明細書において「ハロゲン原子」 又は「ハロゲン」 という場合には、 フッ素原子、 塩素原子、 臭素原子、 又はヨウ素原子のいずれでもよい） ； メチル基、 ェチル基、 n-プロピル基、 イソプロピル基、 n-ブチル基、 sec-ブチル基、 tert-ブチル基など の C — C 6アルキル基； トリフルォロメチル基などのハロゲン化 一 C 6アル キル基； メトキシ基、 エトキシ基、 n-プロポキシ基、 イソプロポキシ基、 n-ブト キシ基、 sec-ブトキシ基、 tert-ブトキシ基などの C^— C eアルコキシ基； メチ レンジォキシ基やエチレンジォキシ基などの Cェ一 C 6アルキレンジォキシ基；力 ルポキシル基； C^— c 6アルコキシカルボニル基；無置換アミノ基；メチルアミ ノ基、 ジメチルァミノ基、 若しくはェチルァミノ基などの 一 c 6アルキル置換 アミノ基；又はシァノ基などを用いることができるが、 これらに限定されること はない。なお、本明細書において、アルキル基又はアルキル部分を含む置換基は、 直鎖状、 分岐鎖状、 環状、 又はそれらの組み合わせのいずれであってもよい。
R 2及び R 3の好ましい例として、 例えば、 直鎖状又は分岐鎖状の ^— 。ァ ルキレン鎖を挙げることができ、 該アルキレン鎖は 1個又は 2個以上の不飽和結 合を有していてもよい。 不飽和結合は二重結合又は三重結合のいずれでもよく、 両者を含んでいてもよい。 好ましいアルキレン鎖の例として、 例えば、 メチレン 基、 エチレン基、 プロピレン基、 ブチレン、 ペンチレン基などの直鎖又は分岐鎖 の 一 C 1 0アルキレン基；ェテニレン基、 プロぺニレン基、 1一ブテニレン基、 シス又はトランス一 2—ブテ二レン基などの 一 。アルケニレン基；ェチニ レン基、 プロピニレン基などの C — C 。アルキニレン基などを挙げることがで きる。 これらのアルキレン鎖は 1個又は 2個以上の置換基を有していてもよい。 置換基を有する好ましいアルキレン鎖の例としては、 例えば、 卜ォキソエチレン 基、 卜ォキソ -2-メチルエチレン基、 卜ォキソプロピレン基などのォキソ C — C 1 0アルキレン基； 卜ォキシプロピレン基、 2-ォキシプロピレン基などのォキシ C i _ C 0アルキレン基などを挙げることができるが、 これらに限定されることは ない。 R 2及び R 3が示す二価の基としては、 特に好ましくはエチレン基又はプロ ピレン基を用いることができる。
本明細書において、 「二価の基」 という用語は、 2個の独立な共有結合を形成で きる基のうち少なくとも 1個の炭素原子を含む基のことを意味している。 「三価 の基」 という用語は、 3個の独立な共有結合を形成できる基のうち少なくとも 1 個の炭素原子を含む基のことを意味しており、 「四価の基」 という用語は、 4個の 独立な共有結合を形成できる基のうち少なくとも 1個の炭素原子を含む基を意味 している。 本明細書において、 二価の基は鎖状又は環状のいずれでもよく、 鎖状 の部分構造と環状の部分構造とが組み合わされた基であってもよい。 環状の二価の基は、 環状構造と 1又は 2個以上の他の連結基 （本明細書におい て 「連結基」 とは 2個の独立な共有結合を形成できる基又は原子を意味する ：例 えばアルキレン基、 アルキレンォキシ基などの二価の基の他、 酸素原子や硫黄原 子など）との組み合わせからなるものであってもよい。また、環状の二価の基は、 好ましくは炭素原子、 水素原子、 酸素原子、 窒素原子、 硫黄原子、 及びリン原子 からなる群から選ばれる原子により構成されていてもよい。 さらに、 環状の二価 の基は、 炭素一炭素結合、 炭素一酸素結合、 硫黄一酸素結合、 炭素一窒素結合を 含んでいてもよい。 力ルバモイル結合、 スルファモイル結合、 エーテル結合、 ジ スルフィ ド結合など、 任意のへテロ原子を含む 1〜 3個の共有結合を部分構造と して含んでいてもよく、 鎖状の部分構造又は分岐鎖を有していてもよい。
環状の二価の基を構成する上記の環の環上には、 任意の置換基が 1個又は 2個 以上存在していてもよい。 2個以上の置換基が存在する場合には、 それらは同一 でも異つていてもよい。 置換基としては、 例えば、 フッ素原子、 塩素原子、 臭素 原子などのハロゲン原子；メチル基、 ェチル基、 n-プロピル基、イソプロピル基、 n-ブチル基、 sec-ブチル基、 t ert-ブチル基などの 一 C 6アルキル基； メトキ シ基、 エトキシ基、 n-プロポキシ基、 イソプロポキシ基、 n-ブトキシ基、 sec-ブ トキシ基、 te r t-ブトキシ基などの C — C 6アルコキシ基； メチレンジォキシ基 やエチレンジォキシ基などの C アルキレンジォキシ基；カルボキシル基； C J 一 C 6アルコキシカルボニル基；無置換アミノ基； メチルァミノ基、 ジメチルァ ミノ基、 若しくはェチルァミノ基などの 一 C 6アルキル置換アミノ基；水酸 基； フエニル基などのァリール基； — C 6アルキル置換スルホニル基；ァセチ ル基、プロピオニル基などの C^— C 6アルカノィル基； トリフルォロアセチル基、 モノクロロアセチル基などのハロゲン化 d— C 6アルカノィル基；メトキシメチ ルカルポニル基などのアルコキシ置換 アルカノィル基； シァノ基； 一 C 6アルキル置換若しくは無置換力ルバモイル基；スルファモイル基；スルホ 基； 4〜 8個の構成原子からなるラクトン環；及び 4〜 8個の構成原子からなる ラクタム環からなる群から選ばれる 1又は 2個以上の置換基を有していてもよい。 — R2— X1— R3—で表される基において、 R 2と R 3とが互いに結合して X1 と共に環状構造を含む二価の基を形成することが好ましく、 この場合に X 1で表 される基が一 N (R4) 一であることが好ましい。 R2と R3とが結合して X1と共 に形成される環としては、 例えば、 ピロリジン環、 イミダゾリジン環、 ォキサゾ リジン環、 チアゾリジン環などが挙げられる。
R 4は一価又は二価の基を示す。 R4として、 例えば、 水素原子；アミジノ基； アミノ基；塩素原子などのハロゲン原子； メチル基、 ェチル基、 n—プロピル基、 イソプロピル基、 n—ブチル基、 sec—ブチル基、 tert—ブチル基などの 一 C6 アルキル基；置換若しくは無置換のァミノ基が置換したアルキル基；置換若しく は無置換のァミノカルボニル基が置換したアルキル基； フエニル基、 ナフチル基 などのァリール基； ァセチル基、 プロピオニル基などの Ci一 C6アルカノィル 基； メトキシメチルカルボニル基などのアルコキシ置換 C — Ceアルカノィル 基；置換若しくは無置換のァミノカルボニル基；置換若しくは無置換のアミノス ルホニル基； ヒドロキシメチル基、 ヒドロキシェチル基などのヒドロキシ C卜 6 アルキル基；ベンジル基、 フエネチル基などの C 7 - C 5ァラルキル基；水酸基； Cj— Ceアルコキシ基；ァリールォキシ基； 一 C6アルキルスルホニル基；ァ リ一ルスルホニル基； C 一 C6アルコキシカルボニル基；ァリールォキシカルボ ニル基；ヒドロキシフエ二ルチオ 一 C6アルキル基； ヒドロキシフエ二ルチオ Cj— C6アルカノィル基； ひーヒドロキシチォ 一 C6アルカノィル基；置換若 しくは無置換のへテロアリール基；置換若しくは無置換のへテロアリールで置換 されたアルキル基；置換若しくは無置換のへテロアリールで置換されたアルカノ ィル基；又は置換若しくは無置換のへテロアリールで置換されたスルホニル基な どを用いることができる。
R 4が置換又は無置換のアルキル基の場合、 該アルキル基は直鎖又は分岐鎖の いずれでもよく、 環状構造や不飽和結合を含んでいてもよい。 炭素数は置換基を 含めて 20個以下が好ましい。 特に好ましいのは炭素数 1〜4個である。 R4と して特に好ましいのは、 置換若しくは無置換のァミノカルボニルで置換されたァ ルキル基である。 最も好ましくは、 無置換のァミノカルボニルメチル基である。 本発明の化合物は、 置換基の種類により、 1個又は 2個以上の不斉炭素を有す る場合がある。 また、 硫黄原子が不斉中心として作用する場合もある。 1個又は 2個以上の不斉中心に基づく光学的に純粋な任意の光学異性体、 上記の光学異性 体の任意の混合物、ラセミ体、 2個以上の不斉炭素に基づくジァステレオ異性体、 上記のジァステレオ異性体の任意の混合物などは、 いずれも本発明の範囲に包含 される。 また、 二重結合を含む化合物については、 幾何異性体が存在するが、 い ずれかの幾何異性体又はそれらの任意の混合物も本発明の範囲に包含される。 本発明の化合物が塩を形成する場合には、 式 （ I ) で表わされる基に存在する - 0 - P O (O H) (O H)で表わされるリン酸エステル部分においてアルカリ金属 塩またはアンモニゥム塩を形成することが好ましい。 また、 式 （A) で表わされ る基に存在する一 O— P〇（O H) (O H)で表わされるリン酸エステル部分におい てアルカリ金属塩またはアンモニゥム塩を形成することも好ましい。 アルカリ金 属としては、 例えば、 ナトリウム、 カリウム、 リチウム、 ルビジウム、 セシウム が挙げられる。 アンモニゥム塩としては、 アンモニゥム ；モノ、 ジ、 若しくはト リアルカノ一ルアンモニゥム ；又はモノ、 ジ、 トリ、 若しくはテトラアルキルァ ンモニゥムなどが挙げられる。 リン酸エステル部分で形成される塩としてはナト リゥム塩又は力リゥム塩が好ましく、 ナトリゥム塩が特に好ましい。
また、 リン酸エステル以外の酸性基又は塩基性基が塩を形成する場合もある。 このような塩としては、 例えば、 塩酸塩、 硫酸塩、 硝酸塩などの鉱酸塩；パラト ルエンスルホン酸塩、 メタンスルホン酸塩、酢酸塩、 クロ口酢酸塩、 シユウ酸塩、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸塩、 キノリンスルホン酸塩などの有機酸塩；ナ卜 リウム塩、 カリウム塩などの金属塩；アンモニゥム塩、 トリェチルアンモニゥム 塩などのアンモニゥム塩などを挙げることができる。
さらに、上記の式 ( I )で表される遊離形態の化合物若しくはその塩の水和物、 又は上記の式 （ I ) で表される遊離形態の化合物若しくはその塩の溶媒和物はい ずれも本発明の範囲に包含される。 溶媒和物を形成可能な溶媒は特に限定されな いが、 例えば、 メタノール、 エタノール、 アセトン、 テトラヒドロフラン、 ジク ロロメタン、 クロ口ホルム、 ジメチルホルムアミドなどの溶媒により溶媒和物が 形成される場合がある。
本発明の化合物のうち、 特に好適な化合物をナ卜リゥム塩の形態で以下に示す が、 本発明の化合物又はその塩は下記のものに限定されることはない。
化合物 1
化合物 2
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上記一般式 U ) で示される化合物の製造方法は特に限定されず、 各種の合成 ルートに従って合成することができる。 本明細書の実施例には本発明の化合物の 代表例についての具体的製造方法が開示されているので、 当業者は、 実施例に記 載された方法を参照することにより、 また、 必要に応じてそれらの方法に適宜の 改変や修飾を加え、 さらに、 出発原料や試薬を適宜選択することによって、 上記 一般式 （ I ) に包含される化合物を容易に製造することが可能である。 合成にあ たっては、 各種の縮合反応、 付加反応、 酸化反応、 又は還元反応などを 1工程な いし複数工程組み合わせることができる。 これらについては成書に詳しい。 例え ば、 「実験化学講座」 （丸善株式会社発行、 初版から第 4版までの各版に含まれる それぞれの分冊を利用できる） に単位操作として記載されている各種の方法や原 料化合物を好適に利用できる。
例えば、 チォ化合物ゃァミン化合物などを出発原料に用いると反応操作や収率 の点で好ましい場合がある。 また、 例えば、 チォエーテル（スルフィ ド） の合成、 エステルの合成などの単位操作； ビニル基、 ハロゲン原子 （ハロアルキル基を含 む）、 エポキシ基、 アジリジン環、 ァシルハライド基、 イソシァネート基などの反 応性官能基とチォ基との反応；及び、 アミノ化反応、 アミド化あるいはアルキル 化などの反応は当業者に周知であり、 従来法のなかから収率や反応の難易度など に応じて適宜の方法を選択することが可能である。
例えば、 これらの製造法において、 定義した基が反応工程の条件下で変化する 力、 または反応工程を実施するのに不適切な場合には、 有機合成化学で常用され る方法、 例えば官能基の保護や脱保護等の手段、 あるいは、 酸化、 還元、 加水分 解等の処理に付すことにより、 所望の工程を効率よく行うことができる場合があ る [例えば、 プロテクティブ ' グループス ·イン ·オーガニック · シンセシス
(Protec t ive Groups in Organic Synthes i s)、 グリーン (T. W. Greene)著、 ジョン ' ワイリー ·アンド ·サンズ'インコーポレイテッド（John Wi l ey & Sons, Inc. ) ( 1 9 8 1年） 参照]。 上記工程における製造中間体および目的化合物は、 有機合成化 学で常用される精製法、 例えば濾過、 抽出、 洗浄、 乾燥、 濃縮、 再結晶、 各種ク 口マトグラフィ一等の処理に付することにより単離精製することができる。また、 製造中間体は特に単離することなく次の反応に供することも可能である。
上記一般式 （ I ) で表される本発明の化合物はリボヌクレオチドレダク夕ーゼ 阻害作用を有しており、 癌細胞の増殖を選択的に抑制することができるので、 ヒ 卜を含む哺乳類動物に投与可能な癌治療剤の有効成分として用いることができる 本発明の医薬の適用対象となる癌の種類は特に限定されず、胃癌、肺癌、大腸癌、 肝臓癌、 腎臓癌、 乳癌、 子宮癌、 皮膚癌、 脳腫瘍などの固形癌や、 白血病、 リン パ種などの非固形癌のいずれに対しても適用可能である。 また、 ヒトを含む哺乳 類動物において、 その動物自身、 ウィルス、 細菌などのリボヌクレオチドレダク ターゼの異常発現を伴う各種疾患、 例えば、 ヘルぺス単純ウィルスの異常増殖に よって引き起こされるヘルぺス症候群やエイズウイルスの異常増殖によって引き 起こされる後天性免疫不全症候群などの疾患の予防及びノ又は治療のための医薬 の有効成分としても有用である。 もっとも、 本発明の化合物の用途は医薬用途に 限定されることはなく、 例えば、 リボヌクレオチドレダク夕ーゼ阻害剤として生 化学、 薬理学、 遺伝子工学などの分野の試薬として用いることもできる。
本発明の医薬の有効成分としては、 上記の一般式 （ I ) に包含される化合物及 びその塩、 並びにそれらの水和物及び溶媒和物からなる群から選ばれる物質の 1 種を用いることができるが、 これらの群から選ばれる 2種以上の物質を組み合わ せて用いてもよい。 本発明の医薬の有効成分として塩の形態の物質を用いること が好ましく、 特に好ましいのはナトリウム塩である。 上記の物質はそれ自体を医 薬として投与することも可能であるが、 通常は、 製剤学上許容される製剤用添加 物の 1種又は 2種以上を用いて医薬組成物の形態の医薬を製造して投与するのが 好適である。 本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、 経口投与又は非経口投 与のいずれかの投与経路を選択することが可能である。 非経口投与に適する医薬 組成物としては、 例えば、 静脈内投与、 動脈内投与、 腹腔内投与、 又は胸腔内投 与に適する注射剤、点滴剤、直腸内投与剤（座剤）、軟膏剤、 クリーム剤、 吸入剤、 経皮吸収剤、 経粘膜吸収剤、 点鼻剤、 点耳剤、 点眼剤などを挙げることができ、 経口投与に適する医薬組成物としては、 例えば、 錠剤、 カプセル剤、 粒剤、 粉剤、 シ口ップ剤などを挙げることができるが、 本発明の医薬組成物の形態はこれらに 限定されることはなく、 当業者が利用可能な医薬組成物から適宜の形態の組成物 を選択して用いることが可能である。
例えば、 注射剤の製造は、 当業者が利用可能な希釈剤 （例えば生理食塩水、 ブ ドウ糖注射液、 乳糖注射液、 マンニット注射液等） に有効成分である上記物質を 溶解し、 濾過滅菌などの適宜の滅菌処理を施してアンプル等の密封容器に充填す ればよい。 また、 日本薬局方に基いて凍結乾燥した形態の注射剤や塩化ナトリウ ムと混合した粉末注射剤を製造してもよい。また、製剤用添加物として、例えば、 ポリエチレングリコール、 HC0- 60 (界面活性剤； 日光ケミカル社製）等の補助剤、 エタノール及びノ又はリボソーム、 サイクロデキストリン等の担体を含んでいて もよい。経口投与に適する医薬組成物又は直腸投与に適する医薬組成物の製造は、 賦形剤、 崩壊剤、 結合剤、 滑沢剤、 懸濁化剤、 等張化剤、 乳化剤などの適宜の製 剤用添加物と上記物質とを常法により混合成形することにより行うことができる。 本発明の医薬の投与量及び投与回数は特に限定されないが、 本発明の医薬を癌 の治療に用いる場合には、 例えば 0. 01〜100 mg/kg (有効成分重量として） を週 1回〜 3週間に 1回程度の間隔で静脈内投与することが可能である。 もっとも、 投与量及び投与回数は、投与方法、有効成分である上記式（ I ) の化合物の種類、 患者の年齢、 体重、 症状、 骨髄抑制などの副作用の発現程度などの種々の条件に 応じて適宜調節することが望ましい。 実施例
以下、 本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲はこ れらの実施例に限定されることはない。 なお、 実施例中の化合物番号は前記の好 ましい化合物の番号に対応させてある。 例 1 ：化合物 1及び 2の合成
Figure imgf000016_0001
化合物 2 化合物 3を以下のようにして製造した。 へミシェ · ベリヒテ （Chemische Beric i te),第 56B巻、測頁（1923年）に記載された方法により合成した、 cis - N - ベンジル- 2， 5-ビス （エトキシカルボニル） ピロリジン （6. 10 g) のテトラヒドロ フラン （60 mL) 溶液に、 氷冷下でテトラヒドロホウ酸リチウム （3. 12 g) を加え て撹拌し、徐々に室温まで昇温した。終夜放置後、再び反応液を氷冷し、水（50 mL) 及び 6規定塩酸（20 mL) を注意深く加えた後、 40°Cの水浴上で 15分間加温した。 再び、 反応液を氷冷し、 2規定水酸化ナトリウム水溶液を加えて、 pH 9〜10にし た。 この反応液を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食塩水で洗浄し、 有機層を無水硫酸 マグネシウムで乾燥し、 濃縮すると c is- N-ベンジル- 2， 5-ビス （ヒドロキシメチ ル） ピロリジンが得られた。 収量： 2. 79 g (63¾) 室温にて、 cis-N-ベンジル- 2, 5-ビス （ヒドロキシメチル） ピロリジン （1.22g) とギ酸 （0.5 mL) をメタノール （8 mL) に溶解し、 パラジウム黒 （0.12 g) を加 えて、 2 時間激しく撹拌した。 終夜放置後、 反応液を濾過し、 残渣をメタノール 及び水で洗浄し、濾液を濃縮して cis- 2， 5-ビス（ヒドロキシメチル） ピロリジン · ギ酸塩を得た。 収量： 0.86 g (88¾)
室温にて、 cis- 2, 5-ビス （ヒドロキシメチル） ピロリジン 'ギ酸塩 （0.85 g) をァセトニトリル （10 mL) に溶解し、 この溶液に二炭酸ジ -t-ブチル （1.80 g) を加えて、 3時間撹拌した。 反応液を減圧濃縮し、 残渣に酢酸ェチルを加えて、 10%クェン酸水溶液及び飽和食塩水で洗浄した。 有機層を無水硫酸ナトリウムで 乾燥後、 濃縮して cis-N-t-ブトキシカルボニル -2， 5-ビス （ヒドロキシメチル） ピロリジンを得た。 収量： 0.97 g (87%)
氷冷下において cis-N-卜ブトキシカルボニル -2, 5-ビス （ヒドロキシメチル） ピロリジン （0.97 g) 及び p-トルエンスルホニルクロリ ド （2.00 g) をピリジン (15 mL)に溶解し、徐々に室温まで昇温した。終夜放置後、反応液を減圧濃縮し、 残渣に酢酸ェチルを加えて、 10%クェン酸水溶液及び飽和食塩水で洗浄した。 有 機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 減圧濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロ マトグラフィ一 （酢酸ェチル -へキサン） で精製して cis- N-t-ブトキシカルボ二 ル- 2， 5-ビス（P-トルエンスルホニルォキシメチル）ピロリジンを得た。収量： 1.54 g (68 % )
窒素雰囲気下で、 cis-N-t-ブトキシカルボニル- 2, 5-ビス （P-トルエンスルホニ ルォキシメチル） ピロリジン （1.48g)、 p-ヒドロキシベンゼンチオール （0.90g) 及び無水炭酸カリウム （2.30 g) にジメチルホルムアミド （5. O mL) を加えて、 70 の油浴上で、 3時間撹拌した。 反応液を水 （50 mL) に注ぎ、 酢酸ェチルで抽 出した。 有機層を飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 減圧濃縮 し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （塩化メチレン -メタノール） で 精製して化合物 Aを得た。 収量： 1.02 g (83¾)
NMR (CDC13) δ (ppm) 1.36 (s， 9H) , 1.90-2.10 (m, 4H) , 2.65-2.90 (πι, 2Η)， 3. 10-3. 42 (m, 2H) , 3. 80-4. 05 (m, 2H) , 6. 76 (d, 4H) , 7. 32 (d, 4H) , 8. 04 (s， 2H)
化合物 A (0. 92 g) をジォキサン （9. 0 mL) に溶解し、 氷冷下で 4規定塩酸- ジォキサン （9. O mL) を加えて、 終夜放置した。 反応液を半量に減圧濃縮し、 酢 酸ェチルを加えてデカンテーシヨンした。 残渣を減圧濃縮し、 減圧乾燥して化合 物 Bを得た。 収量： 0. 62 g (81¾)
NMR (DMS0-d6) δ (ppm) 1. 60-1. 83 (m, 2H) , 2. 05-2. 24 (in, 2H) , 3. 00-3. 60 (m, 6H)， 6. 78 (d, 4H) , 7. 35 (d, 4H) , 9. 60 (broad, 1H)， 9, 80 (broad, 1H) 化合物 B (0. 45 g) 及びクロロアセトアミド（0. 12 g) をジメチルホルムアミド ( 1. 3 mL) に溶解し、 炭酸水素ナトリウム （0. 47 g) 及びヨウ化カリウム （0. 19 g) を加えて、 70°Cの油浴上で 2時間撹拌した。 反応液に酢酸ェチルを加えて、 水で 洗浄後、 有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 減圧濃縮した。 残渣をシリカゲ ルカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン-メタノール）で精製すると化合物 3 が得られた。 収量： 0. 12 g (25¾)
NMR (DMS0-d6) δ (ppm) 1. 46-1. 57 (m, 2H) , 1. 77-1. 88 (m, 2H) , 2. 67 (dd, 2H) ,
2. 93 (dd, 4H) , 3. 12 (s, 2H) , 6. 66 (d, 4H)， 7. 17 (d, 4H)， 9. 7 (s， 2H) 化合物 3 6. 6 g (16 mmol)、 ジイソプロピルェチルァミン 4. 4 g (33 mmol)、 ジメチルァミノピリジン 0. 2 g (2 廳 ol)をテトラヒドロフラン 60 mLに加え氷冷 した。 これにジメチルクロ口フォスフェート 2. 5 g (17 mmol)を徐々に加えた後、 室温で 3時間反応させた。 これを 0. 5 Mリン酸水素 1カリゥム水溶液 200 mLに あけ、 酢酸ェチル 200 mL で 3回抽出した。 酢酸ェチル層を飽和食塩水で洗浄し 硫酸ナトリウムで乾燥した後、 溶媒を減圧留去した。 この残渣をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィー （酢酸ェチル—酢酸ェチル： メタノール =95 : 5) で精製し
3. 7 gの化合物 4を無色の油状物として、 1. 6 gの化合物 5を褐色の油状物として 各々得た （収率；化合物 4 46%、 化合物 5 16¾) 0
FABMS (Pos i、 ニトロべンジルアルコール） 化合物 4 ; 513、 化合物 5 ； 621 Ή-NMR (CDC13) 化合物 4 ; (5 (ppm) 1. 68-1. 78 (氣 2H) , 1. 94-2. 02 (m, 2H) , 2. 81-3. 07 (m, 6H) , 3. 25 (s, 2H) , 3. 84 (s, 3H) 3. 87 (s 3H) , 6. 75 (d, 2H) , 7. 11 (d 2H) , 7. 21 (d, 2H) , 7. 28 (d 2H) . 化合物 5 ; 1. 72-1. 83 (m, 2H) , 1. 94-2. 08 (m, 2H) , 2. 82 (brs, 2H) , 2. 92-3. 10 (m, 6H) , 3. 85 (s, 3H) , 3. 88 (s, 3H) , 7. 13 (d 2H) , 7. 32 (d, 2H) .
化合物 4 3. 8 g (7 mmol)に氷冷した 1 M トリメチルシリルブロミド /チオア 二ソ一ル トリフルォロ酢酸溶液 146 mL (146 mmol)を加えた後、 室温で 1晚反 応させた。 溶媒を減圧留去した後、 飽和炭酸水素ナトリウムで pH を約 9に調整 した。 これにジェチルエーテル 10 mLを加え撹拌した後静置し、 ジェチルエーテ ル層を分離した。 残った水層を逆相シリカゲルカラムクロマ卜グラフィー (C0SM0SIL 75C 18-0PN, 水→水：.メタノール 1 : 1) で精製した後、 凍結乾燥によ り粗生成物を得た。 この粗生成物をゲルカラムクロマトグラフィー （Sephadex G- 10、 水） により 2回精製した後、 凍結乾燥により 2. 5 gの化合物 1を白色固体 として得た （収率 64%)。
FABMS (Nega、 グリセリン） 527, 505, 483
Ή-NMR (D20) δ (ppm) 1. 59-1. 63 (m, 2H) , 1. 94-2. 09 (m, 2H) , 2. 86-3. 14 (m, 6H) 6. 83 (d, 2H) , 7. 15 (d, 2H) , 7. 30-7. 45 (m, 4H) .
化合物 5から化合物 1と同様の方法で化合物 2を白色固体として得た。
'H-NMR (D20) δ ( pm) 1. 60-1. 78 (m 2H) 1. 95-2. 10 (m, 2H) , 2. 91-3. 14 (m, 6H) , 7. 13 (d, 4H) , 7. 39 (d, 4H) . 例 2 ：水溶性の測定
例 1で合成した化合物 1について、 水、 生理食塩水、 5 グルコースに対する溶 解度を測定した。 その結果、 化合物 1は水、 生理食塩水、 及び 5%グルコースのい ずれに対しても 100 mg/ml以上の溶解度を有していた。 試験例 1 ： RNR阻害活性測定試験
(a) ヒト由来 RNR R1及び R2サブユニットの調製 ヒト RNR 蛋白質の Rl サブュニットをコードする cDNA を含むプラスミド p3I (Nucleic Asids Research, 19, p.3741, 1991 に記載） を基にして、 それぞれ、 R1 サブユニット翻訳開始部位の直前に Nde I 制限部位、 翻訳終了部位の直後に Bam HI制限部位を R1サブュニッ卜のアミノ酸配列の変化を全く伴わない形で導 入した DNA を取得した。 DNAの調製は、 モレキュラー ' クロ一ニング第 2版に記 載されている方法に準じて、 合成 DNA 断片を用いた PCR による変異導入法及び DNA 増幅法により行った。 この DNA 中の R1サブユニットをコードする領域を含 む Nde I 及び Bam HI制限酵素断片を、 プラスミド pET3a (Novagen 社） の Nde I 及び Bam HI 間に挿入し、 プラスミド pETRl を造成した。 このプラスミドを、 同 じくモレキユラ一 ·クロ一ニング第 2版に記載の方法に準じて、 Eschelichia col i BL21 (ADE3)plysS 株 (Novagen 社） に形質転換して、 BL21 (λ DE3) plysSpETRl 株を造成した。
同様に合成 DNA断片を用いた PCRによる変異導入法及び DNA増幅法を用いて、 ヒト細胞株 HL60 cDNA ライブラリ一から、 それぞれ R2サブュニット翻訳開始部 位の直前に Nde I 制限部位、 翻訳終了部位の直後に Bam HI制限部位を R2 サブ ュニットのアミノ酸配列の変化を全く伴わない形で導入した DNA断片を取得した。 この DNA 中の R2 サブユニット断片をコードする領域を含む Nde I 及び Bam HI 制限酵素断片を、 プラスミド pET3a (Novagen 社） の Nde I 及び Bam HI間に挿 入し、 プラスミド PETR2 を造成した。 このプラスミドを、 同じくモレキュラー - クロ一ニング第 2版記載の方法に準じて、 Eschelichiacoli BL21 (ADE3)plysS株 (Novagen 社） に形質転換して、 BL21 (ADE3) plysSpETR2株を造成した。
300 ml容三角フラスコ中で、 BL21 (ADE3) plysSpETRl株を Terrific Broth 40 ml (アンピシリン 100 /xg/ml及びクロラムフエ二コール 20 _^/1111を含み、 ダリ セロ一ルを全く含まないもの：モレキュラー ·クローニング第 2版に記載） に一 白金耳接種し、 28°Cで一晩振盪培養した。 この培養液 30 ml を 400 ml の同培地 を含む 2 L容三角フラスコに移植し、 16°Cで振盪培養した。培養開始 2時間後に、 終濃度が 0.1 mMになるように IPTG を添加し、 さらに 20時間培養を継続した。 この培養液より 7, 000Xg、 10分間、 4°Cの遠心分離によって菌体を集め、 得られ た菌体を氷冷したバッファー A [50 mM HEPES-NaOH (pH7.6) , 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, 1 mM PMSF] 20 mlに懸濁した。 この懸濁液を超音波処理して菌 体を破砕した後、 12， 000Xg、 20 分間、 4°Cで遠心分離を行った。 上清を回収し、 硫酸ストレプトマイシンを終濃度 2% (W/V)となるように添加し、 氷上で 20分間 保持した後、 12，000xg、 20分間、 4°Cで遠心分離を行った。 上清を回収し、 等量 の飽和硫酸ァンモニゥム水溶液を撹拌しながら添加した後、氷上で一晩保持した。 15, OOOXg, 20分間、 4°Cで遠心分離を行って沈殿を回収した後、 2mlのバッファ — Aに溶解し、 PD- 10 (Pharmacia Biotech社） を用いて常法に従って脱塩及びバ ッファー Aへのバッファ一置換を行った。
以後の分離精製には、 全て FPLCシステム （Pharmacia Biotech社） を用いた。 脱塩画分を Q- sepharoseFF (Pharmacia Biotech社） にアプライし、 流速 5.0 ml/ 分、 分離時間 50分、 溶離液 lO mMリン酸カリウムバッファー （pH7.0)、 0 M力、ら 0.5 M KC1 までの直線的濃度勾配条件下で分離を行った。 10分から 20分の間に 溶出してきた画分を集め、 終濃度 0.5 Mになるよう硫酸アンモニゥムを添加した のち、 phenyl sepharoseHP (Pharmacia Biotech社） にアプライして、 流速 3.0 ml/ 分で 10 mM リン酸カリウムバッファー （pH7.0 ) /0.5M 硫酸アンモニゥムを 15 分間、 10 mM リン酸カリゥムバッファー （pH7.0 ) を 15分間、 10 mM リン酸カリ ゥムバッファー （pH7.0)、 0.3¾ Tween 20 を 15分間流した。 最後の 15分間で溶 出されてきた画分を集めて resource Q (Pharmacia Biotech社） 1 mlにアプライ し、 10 mM リン酸カリウムバッファー （pH7.0) で洗浄した後、 流速 1 ml/分 で 10 mMリン酸カリウムバッファ一（pH 7.0)、 0.3MKC1を 10分間流して溶出した。 最初の 3分間の溶出画分を集め、 PD-10 にて脱塩及びバッファー A への置換を行 い、 精製 R1標品を得た。
300 ml容三角フラスコ内で、 BL21 (え DE3)plysSpETR2株を Terrific Broth 40 ml (アンピシリン lOO ig/ml及びクロラムフエ二コール 20 g/mlを含み、 グリセ ロールを全く含まないもの：モレキュラー ·クローニング第 2版に記載） に一白 金耳接種し、 28°Cで一晩振盪培養した。 この培養液 30 mlを 400 mlの同培地を含 む 2L容三角フラスコに移植し、 28°Cで振盪培養した。 O. D. (600 nm) が 0. 8付近 に達した時に、 終濃度が 1 mM になるように IPTG を添加し、 さらに 6時間培養 を継続した。 この培養液より 7， 000 X g、 10分間、 4 °Cの遠心分離によって菌体を 集め、 得られた菌体を氷冷したバッファー A 20 ml に懸濁した。 この懸濁液を超 音波処理して菌体を破砕した後、 12, 000 x g、 20分間、 4でで遠心分離を行った。 上清を回収し、 硫酸ストレプトマイシンを終濃度 (w/v) になるよう添加し、 氷上で 20分間保持した後、 12， 000 X g、 20分間、 4 °Cで遠心分離を行った。 上清 を回収し、等量の 100%飽和硫酸アンモニゥム水溶液を撹拌しながら添加した後、 氷上で一晩保持した。 15, 000 X g、 20 分間、 4 °Cで遠心分離を行って沈殿を回収 した後、 2 mlのバッファー Aに溶解し、 PD- 10 (Pharmac i a B iotech社） を用いて 常法に従って脱塩及びバッファー A へのバッファー置換を行った。
以後の分離精製には、 全て FPLCシステム （Pharmac i a B iotech 社） を用いた。 脱塩画分を Q- sepharose FF (Pharmac ia Bio tech社） にアプライし、 流速 5. 0 ml/ 分、 分離時間 50 分、 溶離液 10 mM リン酸カリウムバッファー （pH7. 0)、 0 Mか ら 0. 5 M KC1 までの直線的濃度勾配条件下で分離を行った。 10分から 25分の間 に溶出してきた画分を集め、 終濃度 0. 5 M になるよう硫酸アンモニゥムを添加し た後、 Resource ETHにアプライして、 流速 0. 5 ml/分で 10 mM リン酸カリゥムバ ッファー （ρΗ7. 0) /0· 5M硫酸アンモニゥムを 15分間、 10 mM リン酸カリウムバッ ファー （pH7. 0) を 15分間、 10 mMリン酸カリゥムバッファー（pH7. 0)、 0. 3% Tween 20 を 15分間流した。 最後の 15 分間で溶出されてきた画分を集め、 resource Q (Pharmac ia B iotech社） 1 mlに通し、 流速 1 ml/分で、 10 mM リン酸カリウム バッファー （pH 7. 0)で 10分間洗浄した後、 10 mM リン酸カリウムバッファー、 0. 5M塩化カリウムを 10分間流して溶出した。 最初の 3分間の溶出画分を集め、 PD-10 にて脱塩及びバッファー A への置換を行い、 精製 R2 標品を得た。
(b) 試験管内ヒト RNR活性阻害の測定
取得したヒト RNRサブュニットを用い、 試験管内ヒ卜 RNR活性阻害試験を行つ た。 反応液の組成を以下に示す。
50 mM HEPES-NaOH (pH7.6)
5 mM MgCl2
10 mM dit iot reitol
100 CDP
1 mM ATP
40 ng/ml 精製ヒト RNR Rlサブュニット
40 ng/ml 精製ヒ卜 RNR R2サブュニット 適当な終濃度の試験化合物を含む上記反応液 25 n\を調製し、 37°Cで 30分間、 RNR による CDP から dCDPへの変換反応を行った。 引き続き 95でで 5分間熱処理 した後、 10， 000Xg、 5分間、 4°Cで遠心した。 上清 20 1を回収後、 25 mg/mlの snake venom (Sigma社） を 5^1添加し、 37でで 60分間脱リン酸化反応を行い、 反応液中に存在する CDP、 ATP及び反応生成物の dCDPをそれぞれ CR、 AR、 CdRに 完全に変換した。 反応液を 95°Cで 5分間熱処理し、 10， 000Xg、 5分間、 41：で遠 心した。上清 20 1に 180 1のァセトニトリルを加え、再度 10, OOOXg, 5分間、 4°Cで遠心し、その上清を分析サンプルとした。分析は高速液体クロマトグラフィ 一で行った。 分析条件を以下に示す。
カラム： licrospher NH2 (Merck社）
流速： 1.5 ml/分
検出： 270 nm
溶出液：ァセトニトリル—水 （90： 10、 V/V ) 既知濃度の CdRの溶出時間及びピーク面積値と比較することで、 分析サンプル 中の CdRを同定し、 その濃度を算出した。 薬剤無処理時の反応から得られたサン プル中の CdR濃度を、 既知濃度の試験化合物を添加した反応から得られたサンプ ル中の CdR濃度と比較することにより、 上記条件下での RNR活性を 50% 阻害す る試験化合物の濃度を算出し、その値を IC5()とした。この結果、化合物 1の RNR阻 害活性（IC5。）は 6. 28 であった。 試験例 2 ： HeLa S3細胞生育阻害試験：
96穴マイクロタイ夕一プレートの各ゥエルに、 10% 牛胎児血清及び 2 m グル 夕ミンを含む MEM 培地で 1 X 104個 Zml に調製した HeLa S3 細胞を 0. 1 mlずつ 分注した。 炭酸ガスインキュベータ一内で 24時間、 37°Cで培養後、 上記培地によ り適宜希釈した試験化合物を各ゥエルに 0. 05 ml ずつ加え、 炭酸ガスィンキュベ —ター内で 37 T：、 72時間培養した。 培養上清を除去後、 各ゥエルを 0. 1 ml の PBS バッファーで 2度洗浄し、 改めて各ゥエルに 0. 1 mlの上記培地を添加した。 各ゥエルの細胞数の測定には、 ce l l prol i ferat ion ki t I I (Boe ringer Mannhe im社） を用いた。 発色反応試薬を添加後炭酸ガスインキュベーター内で 3 時間、 37でで保温した後、 マイクロプレートリーダーにより 490 mn及び 655 nm の吸光度を測定し、 各ゥエルごとの 490 nmの吸光度から 655 nmの吸光度を減じ た値 （差吸光度） を算出した。 無処理細胞と既知濃度の試験化合物で処理した細 胞から得られた差吸光度を比較することにより、 細胞の増殖を 50%阻害する試験 化合物の濃度を算出し、 それを I C5Qとした。 この結果、 化合物 1の細胞増殖阻害 作用 (IC50)は 9. 37 Mであった。 産業上の利用可能性
上記式 （ I ) で表される本発明の化合物又はその塩は強いリボヌクレオチドリ ダクタ一ゼ阻害作用を有しており、 水溶性が高く、 生理食塩水ゃブドウ糖注射液 等の水溶性希釈液に補助剤なしに溶解することができる。 本発明の化合物は、 癌 治療剤などの医薬の有効成分として有用である。

Claims

1. 下記の一般式 （ I ) ：
Figure imgf000025_0001
〔式中、 R1は一 R2— X1— R3— [式中、 R2及び R3はそれぞれ独立に二価、
ニコ α青
三価、 又は四価の基を示し； X1は— CH2—、 一〇—、 又は—N (R4) — (R4
の
は一価又は二価の基を示す） で表わされる基を示す] を示すが、 R2、 R 及び R 4からなる群から選ばれる 2又は 3個の基は互いに結合して環状構造を形成し 囲
てもよく ； A r 1は 1から 3個の水酸基をその環上に有するァリール基、 下記の 式 （A) ：
Figure imgf000025_0002
で表される基、 又は酸素原子、 窒素原子、 及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1から 3個のへテロ原子を環構成原子として有する単環性へテロァリ一ル基を示 すが、 A r 1が示すこれらの基はその環上に 1又は 2個以上の置換基を有してい てもよい〕 で表される化合物又はその塩。
2. -0-PO (OH) (〇H)で表されるリン酸エステルが A i^— S— R1— S— で表される基に対してパラ位に置換した請求の範囲第 1項に記載の化合物又はそ の塩。
3. A r 1が 4ーヒドロキシフエニル基である請求の範囲第 1項に記載の化合物 又はその塩。
4. R 2及び R 3が互いに結合して Xュとともに飽和の 5員の単環性環状構造を形 成する請求の範囲第 1項から第 3項のいずれか 1項に記載の化合物又はその塩。
5 . X 1がー N ( R 4 ) ― ( R 4は一価又は二価の基を示す） で表される基である 請求の範囲第 1項から第 4項のいずれか 1項に記載の化合物又はその塩。
6 . R 4が置換基を有していてもよい C i— C 4のアルキル基である請求の範囲第 5項に記載の化合物又はその塩。
7 . 請求の範囲第 1項から第 6項のいずれか 1項に記載の化合物又は生理学的に 許容されるその塩を有効成分として含む医薬。
8 . リボヌクレオチドレダクターゼの過剰発現に起因する疾患の予防及び Z又は 治療に用いる請求の範囲第 7項に記載の医薬。
9 . 癌治療剤である請求の範囲第 7項に記載の医薬。
1 0 . 請求の範囲第 1項から第 6項のいずれか 1項に記載の化合物又はその塩を 含むリボヌクレオチドレダクタ一ゼ阻害剤。
1 1 . 請求の範囲第 1項から第 6項のいずれか 1項に記載の化合物又はその塩を 含む癌細胞に対する選択的増殖抑制剤。
1 2 . 請求の範囲第 7項又は第 8項に記載の医薬の製造のための請求の範囲第 1 項から第 6項に記載の化合物又は生理学的に許容されるその塩の使用。
1 3 . リボヌクレオチドレダクターゼの過剰発現に起因する疾患の予防及び/又 は治療方法であって、 請求の範囲第 1項から第 6項のいずれか 1項に記載の化合 物又は生理学的に許容されるその塩の予防及び Z又は治療有効量をヒトを含む哺 乳類動物に投与する工程を含む方法。
1 4 . 癌の治療方法であって、 請求の範囲第 1項から第 6項のいずれか 1項に記 載の化合物又は生理学的に許容されるその塩の治療有効量をヒトを含む哺乳類動 物に投与する工程を含む方法。
1 5 . 癌治療剤の製造のための請求の範囲第 1項から第 6項のいずれか 1項に記 載の化合物又は生理学的に許容されるその塩の使用。
1 6 . リボヌクレオチドレダクタ一ゼ阻害剤の製造のための請求の範囲第 1項か ら第 6項のいずれか 1項に記載の化合物又は生理学的に許容されるその塩の使用。
7 . 癌細胞に対する選択的増殖抑制剤の製造のための請求の範囲第 1項から第 項のいずれか 1項に記載の化合物又は生理学的に許容されるその塩の使用。
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US4287189A (en) * 1976-04-26 1981-09-01 Rohm And Haas Company O,S-Dialkyl O-oxysulfonylphenyl phosphorothiolates and phosphorodithioates
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