WO2000017345A1 - Gene ly6h - Google Patents

Description

明 細 書

L Y 6 H遺伝子

技 術 分 野 - 本発明は、 特に脳に特異的に強く 発現している遺伝子、 よ り 詳 し く は、 血液幹細胞の精製、 血液細胞の分化の研 究、 免疫細胞の活性化、 活性型免疫細胞の産生抑制、 腫 瘍治療などに利用 されてきている L y 6 フ ァ ミ リ 一 （後 記文献参照） に属する新しい蛋白質をコー ドする遺伝子 に関する。 また本発明は、 該遺伝子によ り コー ド される 新規な蛋白質およびその特異抗体にも関する。 更に本発 明は、 アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療およ び予防剤な どにも関している。

背 景 技 術

L y 6 フ ァ ミ リ 一に属する蛋白質は、 低分子 G P I ァ ンカ一構造を持ち、 マウス 1 5 番染色体上にク ラス夕一 を構成する細胞表面の糖蛋白質群と して同定された

C Proc. Nat 1. Acad. Sc i. , USA. , 84. 1638-1643 ( 1987)〕 。 該 L y 6 フ ァ ミ リ 一は、 骨髄細胞や リ ンパ球系細胞に 特異的に強い発現を示すこ とか ら、 T細胞の分化や造血 幹細胞のマーカ一と して利用 されている ，〔 Immunol, Cel 1 Biol. , 73, 277-296 ( 1995)〕 。 その生体内での機能は 未だ不明な点が多いが、 リ ンパ球系において高度に発現 の調節がなされている こ とよ り、 免疫系、 と り わけ T細 胞の分化や機能に重要な役割を果たしている と考え られ る。 例えば L y 6 c は、 イ ンテグリ ン依存的な接着によ一 る C D 8 ⁺ T細胞の リ ンパ節への誘導を媒介している との 報告がある 〔Pro Nat 1. Acad. Sc i. , USA. , 94. 6898- 6903 (1997) 。

また、 多く の G P I アンカー蛋白質は、 プロテイ ンキ ナ一ゼと相互作用する こ とが知 られている 〔 Sc ience, 254, 1016- 1019 ( 1991 ) 。 例えば、 p 5 6 lckや p 5 9 fynと L y 6 とが相互作用する こ とか ら T細胞のシグナル ト ラ ンスダク シ ョ ンに関与する可能性が示唆されている C Eur. J. Irnmuno 1. , U, 825-831 (1993)〕 。 L y 6 a を 欠いたマウスか ら得られる T細胞は抗原性刺激に対する 増殖能が増長される とい う報告もなされている 〔 J. Exp. Med. , Ι_86. 705-717 ( 1997)〕 。 Τ細胞のみな らず、 Β細 胞の活性化を調節している可能性も示唆されている 〔 J. Immunol. , 1_44, 2197-2204 (1990)〕 。

更に、 いく つかの G P I ア ンカー蛋白質は、 リ ンパ球 系および神経系のいずれにも発現し、 機能している こ と が知 られている [Nature, 371, 826-829 (1996)； Curr. Biol. , 7, 705-708 (1997)〕 。 L y 6 フ ァ ミ リ 一では、 L y 6 a . 2 と L y 6 E とがいずれに も発現、 機能して レ る こ と力 s報告されてレ る [Proc. Nat 1. Acad. Sc i. , USA. ,

81. 2255-2259 (1996) ; J. Immunol. , 157. 969-973 (1996)〕 。 一 かかる L y 6 フ ア ミ リ 一に属する蛋白質およびこれを コー ドする遺伝子の生理的役割の解明 とそれによ り 得ら れる情報は、 基礎科学研究の分野はも とよ り、 医薬品分 野においても、 血液幹細胞の精製、 血液細胞分化の研究、 免疫細胞の活性化、 免疫細胞の活性化の抑制、 腫瘍の治 療な どの面で有用である と考え られる。

近年、 アルツハイ マー病患者において、 加齢に伴う脳 の萎縮に比べて、 大脳の側頭葉における過剰な萎縮が報 告されてお り （Jobst, K. A. , et al. , Lancet, 343. 829- 830 ( 1994))、 この大脳側頭葉部位に影響する遺伝子がァ ルツハイ マー病の発症および進展に何 らかの関連がある と考え られる。 かかる遺伝子が解明できれば、 アルッハ イ マ一病の治療および予防分野に有効な情報を与える こ とができる。

従っ て、 本発明の目的は、 斯界で要望される上記情報、 殊に L y 6 フ ア ミ リ ーに属する新規なヒ 卜蛋白質および これを コ一 ドする遺伝子を提供する こ とにある。

また本発明の目的は、 アルツハイ マー病を初めとする 各種神経変性疾患の治療および予防剤を提供する こ と に ある。

上記目的よ り、 本発明者は、 各種ヒ ト組織由来の遺伝 子につき検索を重ねた結果、 該目的に合致する新しい脳 - 特異的遺伝子の単離、 同定に成功する と共に、 この新し く 単離した遺伝子の発現がアルツハイ マー病患者の海馬 や嗅内皮質を含む側頭葉において顕著に減少してお り、 これがアルツハイ マー病の発症、 進行或いは痴呆などの —因であ り、 該遺伝子およびその発現産物の利用が、 ァ ルツハイマ一病治療および予防に有用である こ とを見出 した。 本発明は之等の知見に基づいて完成されたもので ある。

発 明 の 開 示

本発明によれば、 以下の （ a ) または （ b ) の蛋白質 をコー ドする塩基配列を含む遺伝子が提供される。

( a ) 配列番号 ： 1 で示される アミ ノ酸配列か らなる蛋 白質、

( b ) 配列番号 ： 1 で示されるア ミ ノ酸配列において 1 または複数のア ミ ノ酸が欠失、 置換または付加されたァ ミ ノ酸配列か らな り、 且つ神経生存維持作用、 神経伸長 作用、 神経再生作用、 グリ ア細胞活性化作用および脳に おける記憶形成作用か ら選ばれる少な く と も 1 種の生理 作用を有する蛋白質。 本発明によれば、 特に、 配列番号 ： 2 で示される塩基 配列を含む当該遺伝子およびヒ ト遺伝子である当該遺伝 子が提供される。 - また本発明によれば、 以下の （ a ) および （ b ) のい ずれかのポ リ ヌ ク レオチ ドか らなる遺伝子、 特にヒ ト遺 伝子である当該遺伝子が提供される。

( a ) 配列番号 ： 3 で示される塩基配列を含むポ リ ヌ ク レオチ ド、

( b ) 配列番号 ： 3 で示される塩基配列か らなる D N A とス ト リ ンジヱ ン 卜な条件下で八イ ブリ ダィ ズするポ リ ヌ ク レオチ ド。

更に本発明によれば、 上記遺伝子を含む遺伝子発現べ ク タ一 ； 該遺伝子発現べク タ一を含む宿主細胞 ； 該宿主 細胞によっ て発現される遺伝子発現産物 ； 本発明遺伝子 によってコー ドされる蛋白質 ； およびこれら遺伝子発現 産物乃至蛋白質に結合性を有する抗体が提供される。

更に本発明によれば、 上記蛋白質も し く はその同効物 または上記遺伝子発現産物を有効成分と し、 これを製剤 学的担体と共に含む神経変性疾患治療および予防剤、 よ り 詳し く は配列番号 ： 1 で示されるア ミ ノ酸配列か らな る蛋白質も し く はその同効物または配列番号 ： 2 で示さ れる塩基配列を含む遺伝子の全部または一部の発現産物 であって且つ神経生存維持作用、 神経伸長作用、 神経再 生作用、 グリ ア細胞活性化作用および脳における記憶形 成作用か ら選ばれる少なく と も 1 種の生理作用 を有する— 遺伝子発現産物を有効成分とする上記神経変性疾患治療 および予防剤、 特に、 アルツハイ マー病、 アルッハイマ 一型痴呆症、 脳虚血、 パーキンソ ン病治療および予防剤 が提供される。

加えて本発明によれば、 配列番号 ： 2 で示される塩基 配列の少な く と も 2 0個の連続するポ リ ヌ ク レオチ ド配 列か らなるセ ンス鎖オリ ゴヌ ク レオチ ド ； 該セ ンス鎖ォ リ ゴヌ ク レオチ ドを有効成分と し、 これを製剤学的担体 と共に含む遺伝子治療剤 ； および配列番号 ： 2 で示され る塩基配列の少なく と も 1 0 個の連続するオリ ゴヌ ク レ ォチ ド配列か らなる遣伝子特異的プローブが提供される。

また本発明によれば、 上記蛋白質も し く はその同効物 または上記遺伝子発現産物を用いる、 之等蛋白質乃至遺 伝子発現産物に結合するかまたはこれらの活性に影響を 与える候補化合物のスク リ ーニング方法 ； スク リ 一ニン グ用キッ ト ； およびスク リ ーニングされた上記化合物が 提供される。

以下、 本明細書におけるア ミ ノ酸、 ペプチ ド、 塩基配 列、 核酸な どの略号による表示は、 I U P A C — I U B の規定 C IUPAC-IUB Communication on Biological

Nomenclature, Eur. J. Bi ochem. , j_38： 9 (1984) 、

「塩基配列又はア ミ ノ酸配列を含む明細書等の作成のた一 めのガイ ド ライ ン」 （特許庁編） および当該分野におけ る慣用記号に従う もの とする。

本発明遺伝子の一具体例 と しては、 後述する実施例に 示される 「 L Y 6 H」 と名付け られた P C R産物の

D N A配列か ら演繹される ものを挙げる こ とができる。 その塩基配列は、 配列番号 ： 3 に示される とお り である。

該 L Y 6 H遺伝子は、 配列番号 ： 1 に示される 1 4 0 ア ミ ノ酸配列の新規な脳特異的蛋白質 （ L Y 6 H蛋白質 とい う ） をコー ドする 4 2 0 のオープン リ ーディ ングフ レーム （ O R F ) を含む c D N Aであ り、 全長 8 5 4塩 基カゝ らなっ てレ る。

本発明遺伝子の発現産物である L Y 6 H蛋白質は、 F A S T Aプロ グラム （Person W. R. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sc i. , USA. , , 2444-2448 (1988) ) を禾 'J用 し た GenBank/EMBLデ一ターべ一スの検索の結果、 マウス L y 6 フ ァ ミ リ 一蛋白質 〔 Immunol. Cel 1 Biol. , H,

277-296 (1995)〕 と高い相同性が認め られた。 また、 遺 伝子相互においても高い相同性が認め られた。 こ の こ と か ら、 本発明遺伝子は、 新規なヒ トの L y 6遺伝子と考 え られる。

本発明 L Y 6 H遺伝子は、 ヒ ト胎児脳 c D N A ライ ブ ラ リ ーか ら無作為に選択した 2 8 0 0 0 以上の c D N A- ク ローンの配列解析によ り、 脳に特異的に発現する遺伝 子と して同定された。 その染色体上の位置は、 R Hによ る染色体マッ ピング 〔Hum. Mol. Geneし， 5, 339-346 ( 1996)〕 の結果、 8 q 2 4. 3 上に位置する こ とが判つ た。

従っ て、 本発明に係わる遺伝子およびその発現産物の 提供によれば、 該遺伝子の各種組織での発現の検出や、 ヒ ト L Y 6 H蛋白質の遺伝子工学的製造およびそれを用 いた抗体の作成が可能であ り、 これら によ り、 血液幹細 胞の精製、 血液細胞の分化の研究、 免疫細胞の活性化や その抑制、 腫瘍の治療などが可能となる と考え られる。

加えて、 本発明に係わる遺伝子発現産物 （ポ リ べプチ ド） の提供によれば、 アルツハイ マー病、 アルッハイ マ —型痴呆症、 パーキンソ ン病、 脳虚血な どの神経変性疾 患に対する予防および治療剤を提供する こ とが可能とな る。 また、 本発明に係わる遺伝子のセンス鎖は、 遺伝子 治療剤と して利用する こ とができ、 これによつて上記神 経変性疾患の発症の抑制、 進展の抑制な どを行う こ とが できる。 更に本発明によれば、 本発明遺伝子発現産物 （ポ リ べ プチ ド） に結合するかまたはその活性に影響を及ぼす化 合物のス ク リ ーニング方法およびそのスク リ ーニング用- キッ トが提供でき、 これによつて、 ス ク リ ーニングされ た該化合物も提供できる。 かかるスク リ ーニング化合物 の特定には、 本発明遺伝子の発現産物に結合する抗体を 利用する こ とができる。

本明細書において、 「遺伝子」 なる用語は、 2本鎖 D N Aのみな らず、 それを構成するセ ンス鎖およびア ン チセンス鎖といった各 1本鎖 D N Aを包含する趣旨で用 い られている。 その長さ は何ら制限される ものではない。 従って、 本発明遺伝子（DNA) には、 特に言及しない限り、 ヒ トゲノ ム D N Aを含む 2本鎖 D N Aおよび c D N Aを 含む 1 本鎖 D N A (センス鎖） 並びに該センス鎖と相補 的な配列を有する 1 本鎖 D N A (ア ンチセンス鎖） およ びそれら の断片のいずれもが含まれる。

本発明遺伝子（DNA) は、 また リ ーダ配列、 コー ド頜域、 ェキソ ン、 イ ン ト ロ ンを含むこ とができる。 ポリ ヌ ク レ ォチ ド には、 R N Aおよび D N Aが包含される。 該

D N Aには、 c D N A、 ゲノ ム D N A、 合成 D N Aが含 まれる。 ポ リ ペプチ ド には、 その断片、 同族体 （ホモ口 グ） 、 誘導体、 変異体が包含される。 上記変異体には、 天然に存在するア レル変異体、 天然に存在しない変異体、 欠失、 置換、 付加および挿入によって改変されたァ ミ ノ 酸配列を有する変異体、 同 じ機能を有する改変されたァ- ミ ノ酸配列を有する変異体が包含される。

尚、 これら アミ ノ酸配列の改変 （変異など） は、 天然 において、 例えば突然変異や翻訳後の修飾などによ り 生 じる こ と もあるが、 天然由来の遺伝子 （例えば本発明の 具体例遺伝子） を利用 して人為的にこれを行う こ と もで さる。

上記変異体は、 変異のないポ リ ペプチ ド と、 少な く と も 7 0 %、 好ま し く は 8 0 %、 よ り好ま し く は 9 5 %、 さ ら によ り好ま し く は 9 7 %相同なものである こ とがで きる。 また、 上記ポ リ ペプチ ドは、 変異体、 ホモロ グな どを含めて、 いずれも共通に保存する構造的な特徴があ り、 本発明遺伝子発現産物の生物活性、 例えば神経生存 維持作用、 神経伸長作用、 神経再生作用、 グリ ア細胞活 性化作用 を有 している ものである こ とができる。 なお、 ポ リ ペプチ ドの相同性は、 配列分析ソ フ ト ウェア、 例え ば F A S T Aによる S W I S S P L O T S データベース の検索によって解析する こ とができる （ Clustal, V.， Me thods Mol. Bi ol. , 25, 307-318 ( 1994))。

上記変異体をコー ドする遺伝子は、 ア ミ ノ酸置換につ いてサイ レ ン ト または保存されている。 即ち、 塩基配列 によってコー ド されるア ミ ノ酸残基は変 らない。

保存的な置換ア ミ ノ酸残基、 即ち、 元のア ミ ノ酸残基- を他のア ミ ノ酸残基に置換しても、 元のア ミ ノ酸残基を 有するポ リ ペプチ ドの活性が保存されているであろ う置 換可能なア ミ ノ酸残基は、 各アミ ノ酸残基 （元のァミ ノ 酸残基） に対して以下に示される とお り である ：

元のア ミ ノ酸残基 保存的な置換ア ミ ノ酸残基

Ala Ser

Ar g Ly s

As n Gin, His

Asp Gl u

Cys Ser

Gin Asn

Glu Asp

Gly Pro

His A s nまたは G 1 n lie Leuまたは Val

Leu l ieまたは Val Lys Arg, Alnまたは Glu

Met Leuまたは lie

Phe Me t, Leuまたは Tyr Ser Thr

Thr Ser

Trp Ty r

Ty r T r pまたは P h e

Val 11 eまたは L e u

また、 システィ ン残基 （ Cys) は、 これを他のア ミ ノ酸 残基、 例えばセ リ ン残基 （ Ser) 、 ァラニン残基 （Ala) 、 パ リ ン残基 （Val) などに置換する こ とが可能である。

本発明遺伝子およびその発現産物の提供は、 アルッハ イ マ一病、 脳虚血、 パーキンソ ン病などの神経変性疾患 の解明、 把握、 診断、 予防および治療に極めて有用な情 報乃至手段を与える。 また、 本発明遺伝子は、 上記神経 変性疾患の処置に利用される本発明遺伝子の発現を誘導 する新規薬剤の開発の上でも好適に利用できる。 更に、 個体或は組織における本発明遺伝子の発現またはその発 現産物の検出や、 該遺伝子の変異 （欠失や点変異） 乃至 発現異常の検出は、 上記神経変性疾患の解明や診断にお いて好適に利用できる。

本発明遺伝子は、 具体的には配列番号 ： 1 で示される ア ミ ノ酸配列か らなる蛋白質をコー ドする配列番号 ： 2 の塩基配列を含む遺伝子、 例えば配列番号 ： 3で示され る塩基配列を有する遺伝子 （ L Y 6 H遺伝子） と して示 されるが、 特に これに限定されない。 例えば、 本発明遺 伝子は、 上記特定のア ミ ノ酸配列において一定の改変を 有するア ミ ノ酸配列をコー ドする遺伝子や、 上記特定の- ア ミ ノ酸配列 と一定の相同性を有するア ミ ノ酸配列をコ ー ドする遺伝子や、 之等遺伝子の塩基配列 と一定の相同 性を有する塩基配列の遺伝子である こ とができる。

上記特定のア ミ ノ酸配列や塩基配列に対 して、 一定の 相同性とは、 例えば、 少な く と も 7 0 %以上、 好ま し く は 9 0 %以上、 よ り好ま し く は 9 5 %以上、 更に好ま し く は 9 7 %以上の相同性である こ とができる。 本発明は かかる相同性を有する相同物 （遺伝子相同物および蛋白 相同物） を包含する。

本発明遺伝子には、 また 「配列番号 ： 1 で示されるァ ミ ノ酸配列において 1 も し く は複数のア ミ ノ酸が欠失、 置換または付加されたアミ ノ酸配列 （改変されたァ ミ ノ 酸配列） か らなるポ リ ペプチ ド をコー ドする遺伝子」 も 包含される。 こ こで、 「アミ ノ酸の欠失、 置換または付 加」 の程度およびそれらの位置な どは、 改変されたア ミ ノ酸配列のポ リ ペプチ ドが、 配列番号 ： 1 で示されるァ ミ ノ酸配列か らなるポ リ ペプチ ド （ L Y 6 H蛋白質） と 同様の生物学的機能を有する同効物であれば、 特に制限 されない。 上記 「同様の機能」 と しては、 例えば神経生 存維持作用、 神経伸長作用、 神経再生作用、 グリ ア細胞 活性化作用、 脳における記憶形成作用などの生理活性を 例示する こ とができ、 「同効物」 とは、 之等の機能を有- する ものをい う。 従っ てこの改変されたア ミ ノ酸配列か らなる蛋白質には、 配列番号 ： 1 で示される アミ ノ酸配 列の一部 （連続する もの） であって且つ上記該ア ミ ノ酸 配列の全部と同様の上記生理活性を有する もの （同効物） が包含される。 また、 上記改変されたア ミ ノ酸配列か ら なるポ リ ペプチ ドをコー ドする遺伝子は、 その利用 によ つて、 改変前のア ミ ノ酸配列のポリ ペプチ ド をコー ドす る本発明遺伝子が検出できる ものであってもよい。 なお、 上記改変における複数は、 通常 2 以上、 数個を意味する が、 これに限定されない。

本発明の L Y 6 H遺伝子の相同物 （および該遺伝子産 物の相同物） とは、 本発明遺伝子 （またはその発現産物） と配列相同性を有し、 構造的特徴、 遺伝子発現パターン における共通性、 上記したよ う な生物学的機能の類似性 な どによ り、 ひとつの遺伝子フ ァ ミ リ ー と認識される一 連の関連遺伝子 （およびその発現産物） を意味する。 こ れには本発明遺伝子のア レル体 （対立遺伝子） も当然含 まれる。

尚、 これらア ミ ノ酸配列の改変 （変異） な どは、 天然 において、 例えば突然変異や翻訳後の修飾などによ り 生 じる こ と もあるが、 天然由来の遺伝子 （例えば本発明の 具体例遺伝子） に基づいて人為的に改変する こ と もでき- る。 本発明は、 このよ う な改変 · 変異の原因および手段 な どを問わず、 上記特性を有する全ての改変遺伝子を包 含する。

前記ア ミ ノ酸配列の改変 （変異） のための人為的手段 と しては、 例えばサイ トスぺシフ ィ ッ ク · ミ ュータゲネ シス [Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382

(1987) ； 同 100, 468 (1983) ； Nucleic Ac ids Res. , ϋ, 9441 (1984) ； 続生化学実験講座 1 「遺伝子研究法 II」 、 日本生化学会編， P 105 ( 1986)〕 な どの遺伝子工学的手法、 リ ン酸 ト リ エステル法や リ ン酸ア ミ ダイ ト法などの化学 合成手段 U. Am. Chem. Soc. , 89, 4801 U 967) ; 同 91, 3350 ( 1969) ； Science, ϋθ, 178 ( 1968) ；

Tetrahedron Let t. , 22, 1859 (1981) ； 同 H， 245

( 1983)〕 およびそれらの組合せ方法などが例示できる。 よ り具体的には、 D N Aの合成は、 ホスホルア ミ ダイ ト 法または ト リ エステル法による化学合成による こ と もで き、 市販されている 自動オ リ ゴヌ ク レオチ ド合成装置上 で行う こ と もできる。 二本鎖断片は、 相補鎖を合成し、 適当な条件下で該鎖を共にァニ一リ ングさせるかまたは 適当なプライ マー配列と共に D N Aポ リ メ ラ一ゼを用い て相補鎖を付加するかによって、 化学合成した一本鎖生 成物か ら得る こ と もできる。 - 本発明遺伝子の具体的態様と しては、 配列番号 ： 3 に 示される塩基配列を有する遺伝子を例示できる。 この塩 基配列中のコーディ ング領域 （配列番号 ： 2 に示す配列） は、 配列番号 ： 1 に示されるア ミ ノ酸配列の各ア ミ ノ酸 残基を示すコ ド ンの一つの組合せ例を示している。 本発 明の遣伝子は、 かかる特定の塩基配列を有する遺伝子に 限らず、 各ア ミ ノ酸残基に対して任意のコ ド ンを組合せ、 選択した塩基配列を有する こ と も可能である。 コ ド ンの 選択は、 常法に従う こ とができ、 例えば利用する宿主の コ ド ン使用頻度などを考慮する こ とができる 〔 Nc 1 e i c Acids Res. , 9, 43 (1981) 3 。

また、 本発明遺伝子には、 前記のとお り、 配列番号 ： 3 に示される塩基配列と一定の相同性を有する塩基配列 か らなる ものも包含される。 上記相同性は、 配列番号 ： 3 に示される塩基配列 と少な く と も 7 0 % の同一性、 好 ま し く は少な く と も 9 0 %の同一性、 よ り好ま し く は少 な く と も 9 5 %の同一性を有するポ リ ヌ ク レオチ ドおよ びその相補鎖ポ リ ヌ ク レオチ ドを言う。 かかる相同性を 有する遺伝子は、 例えば、 上記配列番号 ： 3 で示される 塩基配列か らなる D N Aとス ト リ ンジェ ン トな条件下で ノ、イ ブリ ダィ ズするポ リ ヌ ク レオチ ド と して特定される。 よ り詳し く は、 6 X S S C 中 6 5 °C—夜の条件または - 5 0 %ホルムアミ ドを含む 4 X S S C 中 3 7 で一夜の条 件下で、 該配列番号 ： 3 に示される塩基配列の D N A と 八イ ブリ ダィ ズする塩基配列を有する遺伝子が、 上記相 同性を有する遺伝子に包含される。 こ こで、 S S C は、 標準食塩一 クェン酸緩衝液である （ standard sal ine ci trate; 1 x SSC = 0. 15M NaCl, 0.015M sodium

ci trate) ₀

本発明遺伝子は、 本発明によ り 開示された本発明遺伝 子の具体例についての配列情報に基づいて、 一般的遺伝 子工学的手法によ り 容易に製造 · 取得する こ とができる [Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press ( 1989) ； 続生化学実験講座 「遺伝子研究法 I 、

II、 III」 、 日本生化学会編 （ 1986) など参照〕 。

具体的には、 本発明遺伝子が発現される適当な起源よ り、 常法に従っ て c D N Aライ ブラ リ 一を調製し、 該ラ イ ブラ リ ーか ら、 本発明遺伝子に特有の適当なプローブ や抗体を用いて所望ク ローンを選択する こ とによ り 実施 できる [ Proc. Nat 1. Acad. Sc i. , USA. , 18- 6613 ( 1981 ) ；

Science, 222, 778 ( 1983)など〕 。 上記において、 c D N Aの起源と しては、 本発明の遺 伝子を発現する各種の細胞、 組織や これ ら に由来する培 養細胞な ど、 特に脳組織が例示される。 また、 これ らか- ら の全 R N Aの分離、 m R N Aの分離や精製、 c D N A の取得とそのク ローニングなどはいずれも常法に従っ て 実施する こ とができる。 また、 c D N Aライ ブラ リ 一は 巿販されてもお り、 本発明においてはそれら c D N Aラ イ ブラ リ ー、 例えばク ローンテッ ク社 （ C 10 n t e c h Lab. Inc. ) な どよ り市販されている各種 c D N Aライ ブラ リ —などを用いる こ ともできる。

本発明の遺伝子を c D N Aライ ブラ リ 一か らス ク リ ー ニングする方法も、 特に制限されず、 通常の方法に従う こ とができる。 具体的には、 例えば c D N Aによっ て産 生される蛋白質に対して、 該蛋白質の特異抗体を使用 し た免疫的スク リ ーニングによ り対応する c D N Aク ロ一 ンを選択する方法、 目的の D N A配列に選択的に結合す る プローブを用いたプラークハイ ブリ ダイ ゼ一ショ ン、 コ ロニ一ハイ ブリ ダィゼーシ ヨ ンなどや これら の組合せ な どを例示できる。

こ こで用 い られる プローブと しては、 本発明の遺伝子 の塩基配列に関する情報をも とに して化学合成された D N Aなどが一般的に使用できるが、 既に取得された本 発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。 また、 本発 明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス · ブラ イ マ一、 ア ンチセンス ' プライ マーをス ク リ ーニング用- プローブと して用 いる こ と もできる。

前記プローブと して用い られるヌ ク レオチ ド配列は、 配列番号 ： 2 に対応する部分ヌ ク レオチ ド配列であって、 少なく と も 1 0 個の連続した塩基、 好ま し く は 2 0 個の 連続した塩基、 よ り好ま し く は 3 0 個の連続した塩基、 最も好ま し く は 5 0個の連続した塩基を有する ものであ る こ とができる。 また、 配列番号 ： 2 で示されるオリ ゴ ヌ ク レオチ ド配列を有する陽性ク ローンそれ自体をプロ —ブと して用 いる こ ともできる。

本発明遺伝子の取得に際しては、 P C R法 [Science, 230, 1350 ( 1985)] による D N A R N A増幅法が好適 に利用できる。 殊に、 ライ ブラ リ 一か ら全長の c D N A が得 られ難いよ う な場合には、 R A C E法 〔 Rap id ampl if ication of cDNA ends ； 実験医学、 ϋ(6), 35 (1994)] 、 特に 5 ' -R A C E法 [ M. A. Fr ohman, e tal. , Proc. Nat ]. Acad. Sci. , USA. , 8, 8998 ( 1988) などの採用が好 適である。

かかる P C R法の採用に際して使用 されるプライ マー は、 本発明によっ て明 らかにされた本発明の遺伝子の配 列情報に基づいて適宜設定でき、 これは常法に従って合 成できる。 尚、 増幅させた D N A / R N A断片の単離精 製は、 前記の通 り常法に従う こ とができ、 例えばゲル電- 気泳動法などによればよい。

上記で得 られる本発明遺伝子或いは各種 D N A断片は、 常法、 例えばジデォキシ法 〔Proc. Nat 1. Acad. Sci. , USA.， 74, 5463 (1977) ) やマキサム 一ギルバー ト法

C Methods in Enzymo 1 ogy, 61. 499 ( 1980)〕 などに従つ て、 また簡便には市販のシークェンスキッ トなどを用 い て、 その塩基配列を決定する こ とができる。

このよ う に して得られる本発明の遺伝子によれば、 例 えば該遺伝子の一部または全部の塩基配列を利用する こ と によ り、 個体も し く は各種組織における本発明遺伝子 の発現の有無を特異的に検出する こ とができる。

かかる検出は常法に従って行う こ とができ、 例えば R T — P C R (Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E. S. Kawasaki , e t al. , Ampl i f ication of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and appl icat ions, Academic Press, Inc. , SanDiego, 21-27 ( 1991 ) ] による R N A増幅やノ ーザンブロ ッ テイ ング解 析 [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab.

( 1989)〕 、 in si tu R T — P C R [Nucl. Acids Res. , ϋ, 3159-3166 ( 1993) ] や in si tu ハイ ブリ ダィゼーシ ョ ンなどを利用 した細胞レベルでの測定、 N A S B A法 [ Nucleic acid s equence - based ampl i f ication, - Nature, 35_0. 91 -92 ( 1991 ) ) およびその他の各種方法を 挙げる こ とができる。 好適には、 R T — P C R による検 出法を挙げる こ とができる。

尚、 こ こで P C R法を採用する場合に用い られるブラ イ マ一と しては、 本発明遺伝子のみを特異的に増幅でき る該遺伝子特有のものである限り、 特に制限はな く、 本 発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定する こ とができ る。 通常プライマーと して 1 0 〜 3 5程度のヌ ク レオチ ド、 好ま し く は 1 5 〜 3 0 ヌ ク レオチ ド程度の長さ を有 する本発明遺伝子の部分配列を有する ものを挙げる こ と ができる。

このよ う に、 本発明遺伝子には、 本発明にかかる L Y 6 H遺伝子を検出するための特異プライ マーおよび Zま たは特異プローブと して使用される D N A断片もまた包 含される。

当該 D N A断片は、 配列番号 ： 2 で示される塩基配列 のポ リ ヌ ク レオチ ド とス ト リ ンジェ ン 卜な条件下でハイ ブリ ダィ ズするポ リ ヌ ク レオチ ド と して規定する こ とで きる。 こ こで、 ス ト リ ンジェ ン 卜な条件と しては、 ブラ イ マ一またはプローブと して用い られる通常の条件を挙 げる こ とができ、 特に制限はされないが、 例えば、 前述 するよ う な 6 X S S C中 6 5 で一夜の条件または 5 0 %- ホルムア ミ ド を含む 4 X S S C中 3 7 °C—夜の条件を例 示する こ とができる。

本発明遺伝子はこれを通常の遺伝子工学的手法に利用 する こ とによ り、 該遺伝子の発現産物 （ポ リ ペプチ ド） またはこれを含む蛋白質を容易に大量に、 安定 して製造 する こ とができる。

従って本発明は、 本発明遺伝子のコー ドするア ミ ノ酸 配列のポ リ ペプチ ド （本発明遺伝子の発現産物） をも提 供する ものであ り、 また該ポ リ ペプチ ドの製'造のための、 例えば本発明遺伝子を含有するベクター、 該ベク ターに よって形質転換された宿主細胞、 該宿主細胞を培養して 本発明ポ リ ペプチ ド を製造する方法などを も提供する も のである。

本発明ポ リ ペプチ ドの具体的態様と しては、 配列番号 ： 1 で示されるア ミ ノ酸配列のポ リ ペプチ ド （ L Y 6 H蛋 白質） を挙げる こ とができるが、 本発明ポ リ ペプチ ド に は、 該 L Y 6 H蛋白質のみな らず、 その相同物も包含さ れる。 該相同物 と しては、 上記配列番号 ： 1 で示される ア ミ ノ酸配列において、 1 も し く は複数のア ミ ノ酸が欠 失、 置換または付加されたア ミ ノ酸配列か らな り且つ L Y 6 H蛋白質と同様の機能を有するポ リ ペプチ ド を挙げ る こ とができる。 具体的には、 前記 L Y 6 H遺伝子の相- 同物 （ア レル体を含む L Y 6 H同等遺伝子） の発現産物 を挙げる こ とができる。

また、 本発明 L Y 6 H蛋白質の相同物には、 配列番号 ： 1 で示されるア ミ ノ酸配列のポ リ べプチ ド と同一活性を 有する、 哺乳動物、 例えばゥマ、 ヒッジ、 ゥシ、 ィ ヌ、 サル、 ネコ、 クマなどや、 ラ ッ 卜、 マウス、 ゥサギなど のげつ歯類動物の蛋白質も包含される。

本発明ポ リ ペプチ ドは、 本発明によ り提供される遺伝 子の配列情報に基づいて、 常法の遺伝子組換え技術 〔例 えば、 Science, 224, 1431 (1984) ； Biochem. Biophys. Res. Comm. , 130. 692 ( 1985) ； Proc. Nat 1. Acad. Sci. , USA. , 80, 5990 ( 1983)など参照〕 に従っ て調製する こ と ができる。

該ポ リ ペプチ ドの製造は、 よ り詳細には、 所望の蛋白 をコ一 ドする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換え

D N A (発現ベク ター） を作成し、 これを宿主細胞に導 入して形質転換し、 該形質転換体を培養し、 次いで得 ら れる培養物か ら回収する こ とによ り行われる。

上記宿主細胞と しては、 原核生物および真核生物のい ずれも用 いる こ とができ、 例えば原核生物の宿主と して は、 大腸菌や枯草菌といっ た一般的に用い られる ものが 広 く 挙げられ、 好適には大腸菌、 と り わけェシエ リ ヒ

• コ リ （Escherichia col i) K 1 2株に含まれる ものを 例示できる。 また、 真核生物の宿主細胞には、 脊椎動物、 酵母などの細胞が含まれ、 前者と しては、 例えばサルの 細胞である C O S 細胞 〔Cel l, 21： 175 ( 1981 )〕 やチヤ ィ ニーズ · ハムスター卵巣細胞およびそのジヒ ド ロ葉酸 レダク 夕一ゼ欠損株 〔Pro Nat l. Acad. Sci.， USA. , 77: 4216 (1980) ] などが、 後者と しては、 サッ カ ロ ミ セ ス属酵母細胞な どが好適に用い られる。 勿論、 これら に 限定される訳ではない。

原核生物細胞を宿主とする場合は、 該宿主細胞中で複 製可能なベク タ一を用いて、 このべク 夕一中に本発明遺 伝子が発現できるよ う に該遺伝子の上流にプロモーター および S D (シャ イ ン · ア ン ド ， ダルガー ノ ） 塩基配列、 更に蛋白合成開始に必要な開始コ ド ン （例えば A T G ) を付与 した発現プラス ミ ド を好適に利用できる。 上記べ ク タ一 と しては、 一般に大腸菌由来のプラス ミ ド、例えば p B R 3 2 2、 p B R 3 2 5、 p U C 1 2、 p U C 1 3 などがよ く 用い られるが、 これら に限定されず既知の各 種のベク タ一を利用する こ とができる。 大腸菌を利用 し た発現系に利用される上記ベク ターの市販品と しては、 例えば p G E X— 4 T ( Amer sham Pharmacia Biotech社） 、 p M A L - C 2 , p M A 1 - P 2 (New England - Biolabs社） 、 p E T 2 1 , p E T 2 1 / l a c q

( Inv rogen社） 、 p B A D /H i s ( Invitrogen社） な どを例示できる。

脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベク ターと して は、 通常、 発現しょ う とする本発明遺伝子の上流に位置 する プロモータ一、 R N Aのスプライ ス部位、 ポ リ アデ ニル化部位および転写終了配列を保有する ものが挙げら れ、 これは更に必要によ り複製起点を有していてもよい。 該発現ベク ターの例 と しては、 具体的には、 例えば S V 4 0 の初期プロモーターを保有する p S V 2 dhfr CMol. Cell. Biol. , 丄： 854 ( 1981 ) ) などが例示できる。 上記以 外にも既知の各種の市販べク タ一を用 いる こ とができる。 動物細胞を利用 した発現系に利用されるかかるベクター の市販品と しては、 例えば p E G F P — N, p E G F P — C (Clontrech社） 、 p I N D ( Invitrogen社） 、 p c D N A 3. 1 ノ H i s ( I nv i t rogen社 ) な どの動物 細胞用べク タ一や、 p F a s t B a c H T ( G i b e i B R L社） 、 p A c G H L T (PharMingen社） 、

p A c 5 / V 5 - H i s， p M T /V 5 — H i s， p M T Z B i p / V 5 - h i s (以上 Invitrogen社） な どの昆虫細胞用ベク ターなどが挙げられる。

また、 酵母細胞を宿主とする場合の発現べク タ一の具一 体例 と しては、 例えば酸性ホスファタ一ゼ遺伝子に対す るプロモー夕一を有する ρ A M 8 2 C Proc. Nat l. Acad. Sci. , USA. , 80： 1 ( 1983) 3 などが例示できる。 市販の酵 母細胞用発現べク タ一には、 例えば p P I C Z

( Invi trogen社) 、 p P I C Z a ( Invi trogen社) など が包含される。

プロモーターと しても特に限定なく、 エッ シェ リ ヒァ 属菌を宿主とする場合は、 例えば ト リ ブ ト フ ァ ン （trp)プ ロモ一夕一、 lppプロモ一夕一、 lacプロモ一夕一、 r ec A プロモ一夕一、 PL/PRプ口モー夕一などを好ま し く 利用で きる。 宿主がバチルス属菌である場合は、 SP01プロモ一 ター、 SP02プロモーター、 penPプロモータ一などが好ま しい。 酵母を宿主とする場合のプロモー夕一と しては、 例えば PH05プロモーター、 PGKプロモ一夕一、 GAPプロモ 一夕一、 ADHプ口モーターなどを好適に利用できる。 また、 動物細胞を宿主とする場合の好ま しいプロモ一夕一と し ては、 S V 4 0 由来のプロモ一夕一、 レ ト ロウイ ルスの プロモーター、 メ タ 口チォネイ ンプロモ一夕一、 ヒ一 卜 シ ョ ッ ク プロモーター、 サイ ト メ ガロ ウィ ルスプロモ一 夕一、 S R o; プロモーターなどを例示できる。

尚、 本発明遺伝子の発現ベク ターと しては、 通常の融 合蛋白発現べクタ一も好ま し く 利用できる。 該ベク タ一一 の具体例 と しては、 グル夕チオン一 S — ト ラ ンスフェ ラ —ゼ （ G S T ) との融合蛋白 と して発現させるための p G E X (Promega 社） な どを例示できる。

また、 成熟ポ リ ペプチ ドのコー ド配列が宿主細胞か ら のポ リ ペプチ ドの発現、 分泌を助けるポリ ヌ ク レオチ ド 配列と しては、 分泌配列、 リ ーダ配列が例示でき、 細菌 宿主に対 して融合成熟ポ リ ペプチ ドの精製に使用 される マーカ一配列（へキサヒスチジン ·タグ、 ヒスチジン ·タグ）、 哺乳動物細胞の場合はへマグルチニン （HA) · タ グを例示 できる。

所望の組換え D N A (発現べクタ一） の宿主細胞への 導入法およびこれによる形質転換法と しては、 特に限定 されず、 一般的な各種方法を採用する こ とができる。

また得られる形質転換体は、 常法に従い培養でき、 該 培養によ り所望のよ う に設計した遺伝子によ り コ一 ド さ れる本発明の 目的蛋白質が、 形質転換体の細胞内、 細胞 外または細胞膜上に発現、 生産 （蓄積、 分泌） される。

該培養に用い られる培地と しては、 採用 した宿主細胞 に応 じて慣用 される各種の ものを適宜選択利用でき、 培 養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。

か く して得 られる本発明の組換え蛋白質 （ L Y 6 H蛋 白質） は、 所望によ り、 その物理的性質、 化学的性質な一 どを利用 した各種の分離操作 〔 「生化学データーブッ ク II」 、 1175- 1259 頁、 第 1 版第 1 刷、 1980年 6月 23日株 式会社東京化学同人発行 ； Biochemis y, 21(25) , 8274 ( 1986) ; Eur. J. Biochem. , 163, 313 ( 1987)な ど参照〕 によ り 分離、 精製できる。

該方法と しては、 具体的には、 通常の再構成処理、 蛋 白沈澱剤による処理 （塩析法） 、 遠心分離、 浸透圧ショ ッ ク法、 超音波破碎、 限外濾過、 分子篩ク ロマ ト グラフ ィ 一 （ゲル濾過） 、 吸着ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 イ オン交 換ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 ァフ ィ 二テイ ク 口マ ト グラ フ ィ ―、 高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー （ H P L C ) な どの各 種液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 透析法、 これ ら の組合せが 例示でき、 特に好ま しい方法と しては、 本発明蛋白質に 対する特異的な抗体を結合させたカ ラムを利用 したァフ ィ ニティ ク ロマ ト グラフィ ーなどを例示する こ とができ る。

尚、 本発明ポ リ ペプチ ドをコー ドする所望の遺伝子の 設計に際しては、 配列番号 ： 2 に示される L Y 6 H遺伝 子の塩基配列を良好に利用する こ とができる。 該遺伝子 は、 所望によ り、 各ア ミ ノ酸残基を示すコ ド ンを適宜選 択変更して利用する こ と も可能である。 また、 L Y 6 H 遺伝子でコー ド されるアミ ノ酸配列において、 その一部 - のア ミ ノ酸残基ない しはア ミ ノ酸配列を置換、 欠失、 付 加などによ り 改変する場合には、 例えばサイ トスぺシフ ィ ッ ク · ミ ュー夕ゲネシスなどの前記した各種方法によ り行う こ とができる。

本発明ポ リ ペプチ ドは、 また配列番号 ： 1 に示すア ミ ノ酸配列に従って、 一般的な化学合成法によ り製造する こ とができる。 該方法には、 通常の液相法および固相法 によるべプチ ド合成法が包含される。

かかるペプチ ド合成法は、 よ り詳し く は、 アミ ノ酸配 列情報に基づいて、 各アミ ノ酸を 1 個ずつ逐次結合させ て鎖を延長させてい く 所謂ステッ プワイ ズェロ ンゲーシ ヨ ン法と、 ア ミ ノ酸数個か らなる フ ラグメ ン ト を予め合 成し、 次いで各フ ラグメ ン ト をカ ッ プリ ング反応させる フ ラ グメ ン ト · コ ンデンセ一シヨ ン法とを包含し、 本発 明蛋白質の合成は、 そのいずれによってもよレ、。

上記ペプチ ド合成に採用 される縮合法も、 常法に従う こ とができ、 例えば、 アジ ド法、 混合酸無水物法、

D C C法、 活性エステル法、 酸化還元法、 D P P A (ジ フエニルホスホ リ ルアジ ド） 法、 D C C +添加物 （ 1 — W 5

30 ヒ ド ロキシベンゾ ト リ ァゾ一ル、 N — ヒ ド ロキシサク シ ンアミ ド、 N — ヒ ド ロキシ一 5 — ノルボルネン一 2， 3 ー ジカルボキシイ ミ ドなど） 法、 ウ ッ ド ワー ド法などを 例示できる。

これら各方法に利用できる溶媒も、 この種ペプチ ド縮 合反応に使用される こ とのよ く 知 られている一般的なも のか ら適宜選択する こ とができる。 その例 と しては、 例 えばジメ チルホルムアミ ド （ D M F ) 、 ジメチルスルホ キシ ド （ D M S O ) 、 へキサホスホロア ミ ド、 ジォキサ ン、 テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン （ T H F ) 、 酢酸ェチルなどお よびこれら の混合溶媒などを挙げる こ とができる。

尚、 上記ペプチ ド合成反応に際して、 反応に関与しな いア ミ ノ酸乃至ペプチ ド におけるカルボキシル基は、 一 般にはエステル化によ り、 例えばメチルエステル、 ェチ ルエステル、 第 3 級ブチルエステルなどの低級アルキル エステル、 例えばべンジルエステル、 p —メ トキシベン ジルエステル、 p —二 ト ロべンジルエステルなどのァ ラ ルキルエステルなどと して保護する こ とができる。

また、 側鎖に官能基を有するア ミ ノ酸、 例えばチロ シ ン残基の水酸基は、 ァセチル基、 ベンジル基、 ベンジル ォキシカルボニル基、 第 3 級ブチル基などで保護されて もよいが、 必ずしもかかる保護を行う必要はない。 更に、 例えばアルギニン残基のグァニジノ基は、 ニ ト ロ基、 ト シル基、 p — メ ト キシベンゼンスルホニル基、 メ チ レ ン — 2 —スルホニル基、 ベンジルォキシカルボニル基、 ィ- ソポルニルォキシカルポニル基、 ァダマ ンチルォキシカ ルポニル基などの適当な保護基によ り保護する こ とがで さる。

上記保護基を有するアミ ノ酸、 ペプチ ドおよび最終的 に得 られる本発明蛋白質における これら保護基の脱保護 反応もまた、 慣用される方法、 例えば接触還元法や、 液 体アンモニアノナ ト リ ウム、 フ ッ化水素、 臭化水素、 塩 化水素、 ト リ フルォロ酢酸、 酢酸、 蟻酸、 メ タ ンスルホ ン酸な どを用いる方法などに従って実施する こ とができ る。

か く して得 られる本発明ポ リ ペプチ ド は、 前記した各 種の方法、 例えばイ オン交換樹脂、 分配ク ロマ ト グラ フ ィ 一、 ゲルク ロマ ト グラ フィ ー、 向流分配法などのぺプ チ ド化学の分野で汎用される方法に従って、 適宜精製を 行う こ とができる。

本発明ポ リ ペプチ ドは、 その特異抗体を作成するため の免疫抗原と しても好適に利用できる。 こ の免疫抗原を 利用する こ とによ り、 所望の抗血清 （ポ リ ク ロ一ナル抗 体） およびモ ノ ク ローナル抗体を取得する こ とができる。 該抗体の製造法自体は、 当業者によ く 理解されている と こ ろであ り、 本発明においても これら常法に従う こ と ができる 〔例えば、 続生化学実験講座 「免疫生化学研究- 法」 、 日本生化学会編 （ 1986 ) など参照〕 。

例えば、 抗血清の取得に際して利用される免疫動物と しては、 ゥサギ、 モルモッ ト、 ラ ッ ト、 マウス、 ニヮ ト リ などの通常動物を任意に選択でき、 上記抗原を使用す る免疫方法や採血などもまた常法に従い実施できる。

モノ ク ローナル抗体の取得も、 常法に従い、 上記免疫 抗原で免疫した動物の形質細胞 （免疫細胞） と形質細胞 腫細胞との融合細胞を作成し、 これよ り所望抗体を産生 する ク ローンを選択し、 該ク ローンの培養によ り実施す る こ とができる。 免疫動物は、 一般に細胞融合に使用す る形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択され、 通常 マウスやラ ッ トなどが有利に用い られている。 免疫は、 上記抗血清の場合と同様であ り、 所望によ り通常のアジ ュパン トなど と併用 して行う こ と もできる。

尚、 融合に使用 される形質細胞腫細胞と しても、 特に 限定なく、 例えば p 3 (p3/x63-Ag8) [Nature, 256: 495-497 (1975)〕 、 p 3 — U 1 [ Current Topics in Microbiology and Immunology, 8J.： 1-7 ( 1978)] 、

N S - 1 CEur. J. Immunol. , 6： 511 -519 (1976)〕 、 M P C — 1 1 ( Cel l, 8 : 405-415 (1976)〕 、 S P 2 / 0 [Nature, 276 : 269-271 ( 1978) ) など、 ラ ッ ト における R 2 1 0 ί Nature, 211 · 131 - 133 ( 1979)〕 などおよびそ れら に由来する細胞などの各種の骨髄腫細胞をいずれも 使用できる。

上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合は、 通常の融 合促進剤、 例えばポ リ エチレングリ コール （ P E G ) や セ ンダイ ウィ ルス （H V J ) などの存在下に公知の方法 に準じて行う こ とができ、 所望のハイ プリ ドーマの分離 もまた同様に行い得る 〔Meth. in Enzymol. , 73： 3 (198 1 ) ； 上記続生化学実験講座など〕 。

また、 目的とする抗体産生株の検索および単一ク ロー ン化も常法によ り 実施され、 例えば抗体産生株の検索は、 上記の本発明抗原を利用 した E L I S A法 〔Meth. in Enzymol. , 70： 419-439 ( 1980) 、 プラーク法、 スポ ッ ト法、 凝集反応法、 ォクテロ二一 （Ouchterlony) 法、 ラ ジオイ ム ノ ア ッセィ などの一般に抗体の検出に用い られ ている種々 の方法に従い実施する こ とができる。

か く して得 られるハイ プリ ドーマか ら の本発明抗体の 採取は、 該ハイ ブリ ドーマを常法によ り培養してその培 養上清と して得る、 また、 ハイ プリ ドーマを これと適合 性のある哺乳動物に投与して増殖させその腹水と して得 る方法な どによ り 実施される。 前者の方法は、 高純度の 抗体を得るのに適してお り、 後者の方法は、 抗体の大量 生産に適している。 このよ う に して得られる抗体は、 更- に塩析、 ゲル濾過、 ァフィ 二ティ ク ロマ ト グラ フィ ーな どの通常の手段によ り精製する こ とができる。

かく して得られる抗体は、 本発明の L Y 6 H蛋白質に 結合性を有する こ とによって特徴付け られ、 これは、 前 述した L Y 6 H蛋白質の精製およびその免疫学的手法に よる測定乃至識別な どに有利に利用できる。 また該抗体 は、 本発明遺伝子の発現減少が神経変性疾患である アル ッハイ マー病患者の脳側頭葉部位において確認されてい る こ とか ら、 L Y 6 H蛋白質に対するァゴニス トやアン タ ゴニス 卜のスク リ ーニングに も利用する こ とができる。 本発明はかかる新規な抗体をも提供する ものである。

本発明ポ リ ペプチ ドは、 これを有効成分とする医薬品 と して医薬分野において有用である。 従っ て、 本発明は 本発明ポ リ ぺプチ ド を有効成分とする医薬組成物をも提 供する ものである。

本発明ポ リ ペプチ ドの上記医薬組成物と しての有用性 は、 前記したよ う にその脳特異的ポ リ ペプチ ドが有する 神経生存維持作用、 神経伸長作用、 神経再生作用、 グリ ァ細胞活性化作用、 脳の記憶形^作用 にある。 これらの 活性を確認する方法と しては、 例えば以下の各方法を挙 げる こ とができる。

1 ) 神経細胞生存維持作用 - 本発明ポ リ ペプチ ドの神経細胞生存維持作用を測定す る方法と しては、 例えば、 S D系ラ ッ ト胎仔の全脳よ り 海馬を無菌的に取 り 出し、 酵素処理 して得 られる細胞を 1 0 %牛胎児血清を含む D M E M培地を入れたポ リ L リ ジン （シグマ社） でコーティ ングした 9 6 ゥエルプレ一 卜 に最終的に 2 X 1 0 ⁵細胞 Z c m²になるよう に播く。 次いで細胞を 2 4時間培養後、 培養液を 1 % N 2添加 物 （N2 Supplement, ギブコ社製） を含んだ D M E Mに交 換し、 有効成分と しての本発明ポ リ ペプチ ドを添加する (本発明群） 。 また、 比較のため、 沸縢水浴中で 5分間 加熱処理 した本発明ポリ ペプチ ドの添加 （沸騰蛋白質群） を行う。

上記で調製した各群の細胞 （培養液） を 7 2時間培養 後、 例えばプロ メ ガ社のセルタイ 夕一 9 6 ゥエル ' アツ セィ システムを用いて M T T [3- (4, 5-dimethyl thiazol -2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide]ア ツセィ によ り、 本発明ポ リ ペプチ ドの海馬神経細胞に対する生存維 持効果を調べる こ とができる。

また、 上記 S D系ラ ッ ト胎仔の全脳よ り 中脳腹側部を 無菌的に取 り 出 し、 同様に M T Tア ツセィ によ り、 本発 明ポ リ ペプチ ドの中脳神経細胞に対する生存維持効果を 調べる こ とができる。 - 2 ) ドパ ミ ン神経細胞生存維持作用

本発明ポ リ ペプチ ドの神経細胞生存維持作用 を測定す る方法と しては、 例えば以下の如き ドパミ ン神経細胞の 生存維持作用 を測定する方法を挙げる こ とができる。 即 ち、 先ず上記 1 ) で調製した各群の細胞 （培養液） を 7 2時間培養後、 P B S に溶解した 4 %パラホルムアルデ ヒ ド を用 いて 1 5分間室温で放置して固定し、 その後 1 % ト リ ト ン X 1 0 0 Z P B S を用いて膜を透過させる。

抗体の非特異的な結合を防ぐために、 細胞を 1 0 %ャ ギ血清を含む P B Sで 1 時間イ ンキュベー ト し、 その後、 抗チロ シン水酸化酵素ポリ ク ロナール抗体 （ケミ コ ン社 製、 P B S で 1 0 0 0倍希釈） を用いて 1 6 時間 4 °Cで イ ンキュベー トする。 抗体液を除いた後、 細胞を P B S で洗い、 ペルォキシダ一ゼ標識デキス ト ラ ンポ リ マー結 合ャギ抗ラ ビッ トィ ムノ グロブリ ン （ダコ社製） を加え て室温で 1 時間ィ ンキュベ一 トする。

チロ シン水酸化酵素陽性細胞の検出は、 基質 と してジ アミ ノ ベンチジンを用 いる発色反応の有無によ り 可能で ある。 か く してチロ シン水酸化酵素陽性細胞数を指標と して、 本発明ポ リ ペプチ ドの ドパミ ン神経細胞の生存維 持作用を測定する こ とができる。

3 ) 神経伸長作用 - 本発明ポ リ ペプチ ドの神経伸長作用の測定は、 例えば P C 1 2細胞（A T C C寄託番号 ： C R L 1 7 2 1 :

Science, H9.393-395 ( 1985))を用いて、 次の如く して 実施できる。 即ち、 5 %熱非働化（56°C、 30分）ゥマ血清 と 1 0 % ゥシ胎児血清（FCS)を含むダルベッ コ変法 M E M (D-MEM)培地で継代培養した P C 1 2細胞を、 コ ラーゲン でコー ト した直径 3 5 mmプラスチッ クペ ト リ 皿に 6 x 1 0 ⁴細胞ノ 3 m l 培地の濃度で移植し、 移植 2 日 目 に種 々 の濃度の本発明ポ リ ペプチ ド、 神経成長因子（N G F : 和光純薬社製）および F C Sの各々 を含む D— M E Mに交 換し、 それら のそれぞれについて培養を続け、 3 日 目の 細胞の形態変化を位相差顕微鏡によ り観察する。 かく し て神経線維様突起の形成が観察されるか或いは神経線維 様突起の形成が促進されるかをコ ン ト ロールと対比する こ とによって、 本発明ポ リ ペプチ ドの神経伸長作用 を評 価する こ とができる。

4 ) グリ ァ細胞活性化作用

グリ ア細胞活性化作用は、 クニス （Kn i s s)らゃポク ラ一 (Bogler)らの方法に準じて、 例えば F G F による グリ ア 細胞の活性化に本発明ポ リ べプチ ドが与える影響を測定 する こ と によって、 評価する こ とができる （Kni s s， D. A, and Bur ry, R. W. , Brain Res. , 431. 281 -288 ( 1988)： - Bogl er, 0. , e t aし， Proc. Nat l. Acad. Sc i. , USA. , 87 (16), 6368-6372 (1990))。

5 ) 脳の記憶形成作用

脳の記憶形成作用は、 例えばモー リ スの水迷路実験 (Morris, R. G. M. , J. Neu r o s c i . Me t h. , Π_, 47-60 (1984) ) の方法に準じて測定できる。

また、 例えば変異ベータア ミ ロイ ド前駆蛋白質遺伝子 または変異プレセニ リ ン 1 遺伝子 ト ラ ンスジエニッ クマ ウス （Nature, 373, 523-527 ( 1995) ： Nature Med. , 5,

560-564 ( 1999) ) などのアルッハイ マ一病モデル動物に、 L Y 6 H蛋白質或いはスク リ ーニングによって得 られる L Υ 6 Η蛋白質に対するァゴニス トゃアン夕 ゴニス ト を 投与し、 症状の進行度或いは神経変性の程度を非投与群 と比較する こ とができる。

また、 ヒ ト脳側頭葉で遺伝子を発現 （遺伝子治療） さ せるためには、 アデノ ウイ ルスベクタ一など （ Straus， E. S. , Plenum Press New York, 451-496 ( 1984) , Se t oguch i, Y. , et al. , Blood, 84. 2953-2964 ( 1994) ) を用いる。 即ち、 アデノ ウイ ルスベク タ一に本発明遺伝子を組み込 み、 幹細胞中で培養後、 脳側頭葉に直接投与または末梢 よ り 静脈内投与して、 アルツハイ マー性の痴呆症または アルツハイ マー病の改善が得られる力 進展が抑制 され - るかを判定する こ となどが考え られる。

本発明医薬組成物において、 有効成分とするポ リ ぺプ チ ド には、 その医薬的に許容される塩も また包含される。 かかる塩には、 当業界で周知の方法によ り 調製される、 例えばナ ト リ ウム、 カ リ ウム、 リ チウム、 カルシウム、 マグネシウム、 ゾ、 *リ ゥム、 ア ンモニゥムなどの無毒性ァ ルカ リ 金属塩、 アルカ リ 土類金属塩、 ア ンモニゥム塩な どが包含される。 更に上記塩には、 有効成分と しての本 発明ポ リ ペプチ ド と適当な有機酸ない し無機酸との反応 によって得 られる無毒性酸付加塩も包含される。 代表的 無毒性酸付加塩と しては、 例えば塩酸塩、 塩化水素酸塩、 臭化水素酸塩、 硫酸塩、 重硫酸塩、 酢酸塩、 蓚酸塩、 吉 草酸塩、 ォレイ ン酸塩、 ラウ リ ン酸塩、 硼酸塩、 安息香 酸塩、 乳酸塩、 リ ン酸塩、 p — トルエンスルホン酸塩

( ト シ レー ト） 、 クェン酸塩、 マ レイ ン酸塩、 フマル酸 塩、 コノヽク酸塩、 酒石酸塩、 スルホン酸塩、 グリ コール 酸塩、 マ レイ ン酸塩、 ァスコルビン酸塩、 ベンゼンスル ホ ン酸塩およびナプシレー トなどが例示される。

本発明医薬組成物には、 本発明ポ リ ペプチ ド を有効成 分と して、 その薬学的有効量を、 適当な無毒性医薬製剤 担体ない し希釈剤と共に含有する ものが含まれる。

上記医薬組成物 （医薬製剤） に利用できる医薬製剤担 - ' 体と しては、 製剤の使用形態に応じて通常使用 される、 充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壊剤、 表面活性剤、 滑沢剤な どの希釈剤或は賦形剤などを例示でき、 これら は得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用で きる。

特に好ま しい本発明医薬製剤は、 通常の蛋白製剤な ど に使用 され得る各種の添加剤成分、 例えば安定化剤、 殺 菌剤、 緩衝剤、 等張化剤、 キ レー ト剤、 p H調整剤、 界 面活性剤な どを適宜使用 して調製され得る。

上記安定化剤と しては、 例えばヒ ト血清アルブミ ンや 通常の L 一ア ミ ノ酸、 糖類、 セルロース誘導体などを例 示できる。 これら は必要に応じて、 単独でまたは界面活 性剤な ど と組合せて使用する こ とができる。 界面活性剤 などとの組合せによれば、 特に有効成分の安定性をよ り 向上させ得る場合がある。

上記 L 一ア ミ ノ酸と しては、 特に限定はなく、 例えば グリ シン、 システィ ン、 グルタ ミ ン酸などのいずれでも よい。

上記糖と しても特に限定はな く、 例えばグルコース、 マンノ ース、 ガラ ク ト一ス、 果糖な どの単糖類、 マンニ ト ール、 イ ノ シ ト ール、 キシ リ トールな どの糖アルコ 一 ル類、 シ ョ 糖、 マル トース、 乳糖などの二糖類、 デキスー ト ラ ン、 ヒ ド ロキシプロ ピルスターチ、 コ ン ド ロイ チン 硫酸、 ヒ アルロ ン酸などの多糖類などおよびそれら の誘 導体を使用できる。

上記界面活性剤と しても特に限定はなく、 イ オン性お よび非イ オン性界面活性剤のいずれも使用できる。 具体 例 と しては、 例えばポ リ オキシエチレングリ コールソル ビ夕 ンアルキルエステル系、 ポ リ オキシエチ レンアルキ ルエーテル系、 ソルビタ ンモノ ァシルエステル系、 脂肪 酸グリ セ リ ド系などを使用できる。

セルロース誘導体と しても特に限定はな く、 例えばメ チルセルロース、 ェチルセルロース、 ヒ ド ロキシェチル セルロース、 ヒ ド ロキシプロ ピルセルロース、 ヒ ド ロキ シプロ ピルメチルセルロース、 カルボキシメチルセル口 ースナ ト リ ゥムなどを使用できる。

上記糖類な どの添加剤成分の添加量は、 通常之等の添 加剤が使用 される場合のそれら を参考に して適宜決定で きる。 一般に、 糖類は有効成分 1 g 当 り 0 . 0 0 0 1 m g程度以上、 好ま し く は 0 . 0 1 〜 ； L O m g程度の範 囲内か ら選ばれるのが適当である。 界面活性剤は、 通常 有効成分 l ^ g当 り 0. O O O O l m g程度以上、 好ま し く は 0. 0 0 0 ：! 〜 0. O l m g程度の範囲か ら選択 されるのが適当である。 安定化剤と しての ヒ ト血清ァ ブミ ンは、 有効成分 当 り 0. O O O l m g程度以 上、 好ま し く は 0. 0 0 1 〜 0. l m g程度の範囲内か ら選ばれるのが適当である。 安定化剤と してのア ミ ノ酸 は、 有効成分 当 り 0. 0 0 1 〜 ： L O m g程度の範 囲か ら選ばれるのが適当である。 また、 セルロース誘導 体の添加量は、 有効成分 l g当 り 0. 0 0 0 0 l m g 程度以上、 好ま し く は 0. 0 0 1 〜 0. l m g程度の範 囲か ら選ばれるのが適当である。

本発明医薬製剤中に含ませる有効成分の量は、 広範囲 か ら適宜選択されるが、 通常約 0. 0 0 0 0 1 〜 7 0重 量％、 好ま し く は 0. 0 0 0 1 〜 5重量％程度の範囲内 とするのが適当である。

本発明医薬製剤中には、 更に例えば緩衝剤、 等張化剤、 キ レー ト剤なども添加する こ とができる。 こ こで緩衝剤 と しては、 ホウ酸、 リ ン酸、 酢酸、 クェン酸、 ε —ア ミ ノ カ プロ ン酸、 グルタ ミ ン酸および Ζまたはそれら に対 応する塩 （例えばそれらのナ ト リ ウム塩、 カ リ ウム塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩などのアルカ リ 金属塩や アルカ リ 土類金属塩） などを例示できる。 等張化剤 と し ては、 例えば塩化ナ ト リ ウム、 塩化カ リ ウム、 糖類、 グ リ セ リ ンな どを例示できる。 またキ レー ト剤と しては、 例えばェデ ト酸ナ ト リ ウム、 クェン酸などを例示できる -。 之等の添加量は、 通常用い られるそれら の添加量と同様 の もの とする こ とができる。

本発明医薬製剤は、 溶液製剤 と して調製使用できる他、 これを凍結乾燥化して保存できる状態とする こ と もでき る。 かかる凍結乾燥品は、 用時水、 生理的食塩水などを 含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製した後に使 用する こ とができる。

本発明医薬製剤の投与単位形態と しては、 各種の形態 が治療目的に応じて選択できる。 その代表的なものには、 錠剤、 丸剤、 散剤、 粉末剤、 顆粒剤、 カプセル剤などの 固体投与形態や、 溶液、 懸濁剤、 乳剤、 シロ ッ プ、 エ リ キシルな どの液剤投与形態が含まれる。 これら各種形態 は、 投与経路に応じて経口剤、 非経口剤、 経鼻剤、 経膣 剤、 坐剤、 舌下剤、 軟膏剤などに分類される。 上記各形 態は、 それぞれ、 通常の方法に従い、 調合、 成形乃至調 製する こ とができる。

例えば、 錠剤の形態に成形する に際しては、 前記医薬 製剤担体と して例えば乳糖、 白糖、 塩化ナ ト リ ウム、 ブ ド ウ糖、 尿素、 デンプン、 炭酸カルシウム、 カオ リ ン、 結晶セルロース、 ケィ酸、 リ ン酸カ リ ウムなどの賦形剤 ； 水、 エタ ノ ール、 プロパノ ール、 単シロ ッ プ、 ブ ドウ糖 液、 デンプン液、 ゼラチン溶液、 カルポキシメチルセル- ロース、 ヒ ド ロキシプロ ピルセルロース、 メチルセル口 ース、 ポ リ ビニルピロ リ ド ンな どの結合剤 ； カルポキシ メチルセルロースナ ト リ ウム、 カルボキシメチルセル口 —スカルシゥム、 低置換度ヒ ド ロキシプロ ピルセルロー ス、 乾燥デンプン、 アルギン酸ナ ト リ ウム、 カ ンテン末、 ラ ミ ナラ ン末、 炭酸水素ナ ト リ ウム、 炭酸カルシウムな どの崩壊剤 ； ポ リ オキシエチレンソルビ夕 ン脂肪酸エス テル類、 ラウ リ ル硫酸ナ ト リ ウム、 ステア リ ン酸モ ノ グ リ セ リ ドなどの界面活性剤 ； 白糖、 ステア リ ン、 カカオ バタ一、 水素添加油などの崩壊抑制剤 ； 第 4級ア ンモニ ゥム塩基、 ラ ウ リ ル硫酸ナ ト リ ウムなどの吸収促進剤 ； グリ セ リ ン、 デンプンなどの保湿剤 ； デンプン、 乳糖、 カオ リ ン、 ベン トナイ ト、 コ ロイ ド状ゲイ酸な どの吸着 剤 ； 精製タルク、 ステア リ ン酸塩、 ホウ酸末、 ポリ ェチ レングリ コールなどの滑沢剤などを使用する こ とができ る。

更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、 例え ば糖衣錠、 ゼラチン被包錠、 腸溶被錠、 フ ィ ルムコーテ イ ング錠とする こ とができ、 また二重錠ない しは多層錠 とする こ と もできる。

丸剤の形態に成形する に際しては、 医薬製剤担体と し て例えばブ ド ウ糖、 乳糖、 デンプン、 カカオ脂、 硬化 物油、 カオ リ ン、 タルクなどの賦形剤 ； ア ラ ビアゴム末、 ト ラガン ト末、 ゼラチン、 エタ ノールなどの結合剤 ； ラ ミ ナラ ン、 カ ンテンなどの崩壊剤などを使用できる。

カ プセル剤は、 常法に従い通常本発明有効成分を上記 で例示した各種の医薬製剤担体と混合して、 硬質ゼラチ ンカ プセル、 軟質カ プセルなどに充填して調製できる。

経口投与用液体投与形態は、 慣用 される不活性希釈剤、 例えば水、 を含む医薬的に許容される溶液、 ェマルジ ョ ン、 懸濁液、 シロ ッ プ、 エリ キシルなどを包含し、 更に 湿潤剤、 乳剤、 懸濁剤などの助剤を含ませる こ とができ る。 これら は常法に従い調製できる。

非経口投与用の液体投与形態、 例えば滅菌水性乃至非 水性溶液、 ェマルジヨ ン、 懸濁液な どへの調製に際して は、 希釈剤と して例えば水、 エチルアルコール、 プロ ピ レングリ コール、 ポ リ エチレングリ コール、 エ トキシ化 イ ソステア リ ルアルコール、 ポ リ オキシ化イ ソステア リ ルアルコール、 ポ リ オキシエチレンソルビ夕 ン脂肪酸ェ ステルおよびオ リ ーブ油などの植物油な どを使用できる。 また注入可能な有機エステル類、 例えばォレイ ン酸エヂ ルなどを配合する こ と もできる。 更に通常の溶解補助剤、 緩衝剤、 湿潤剤、 乳化剤、 懸濁剤、 保存剤、 分散剤など を添加する こ と もできる。 - 上記各種形態の医薬製剤は常法に従い滅菌処理される。 該滅菌処理は、 例えばバクテリ ア保留フ ィ ルタ一を通過 させる濾過操作、 殺菌剤の配合、 照射処理および加熱処 理な どによ り 実施できる。 また、 これら は使用直前に滅 菌水ゃ適当な滅菌可能媒体に溶解する こ とのできる滅菌 固体組成物形態に調製する こ と もできる。

坐剤や膣投与用製剤の形態に成形する に際しては、 医 薬製剤担体と して、 例えばポリ エチレングリ コ一ル、 力 カオ脂、 高級アルコール、 高級アルコールのエステル類、 ゼラチンおよび半合成グリ セライ ドなどを使用できる。

ペース ト、 ク リ ーム、 ゲルなどの軟膏剤の形態に成形 する に際しては、 希釈剤と して、 例えば白色ワセ リ ン、 パラ フィ ン、 グリ セ リ ン、 セルロース誘導体、 プロ ピ レ ングリ コール、 ポ リ エチレングリ コール、 シ リ コ ン、 ベ ン ト ナイ 卜およびオリ ーブ油などの植物油な どを使用で きる。

経鼻または舌下投与用組成物は、 周知の標準賦形剤を 用いて、 常法に従い調製する こ とができる。

尚、 本発明医薬薬剤中には、 必要に応じて着色剤、 保 存剤、 香料、 風味剤、 甘味剤などや他の医薬品などを含 有させる こ と もできる。

上記医薬製剤の投与方法は、 特に制限がなく、 各種 剤形態、 患者の年齢、 性別その他の条件、 疾患の程度な どに応じて決定される。 例えば錠剤、 丸剤、 液剤、 懸濁 剤、 乳剤、 顆粒剤およびカ プセル剤は経口投与され、 注 射剤は単独でまたはブ ドウ糖やア ミ ノ酸などの通常の補 液と混合 して静脈内投与され、 更に必要に応じ単独で筋 肉内、 皮内、 皮下も し く は腹腔内投与され、 坐剤は直腸 内投与され、 経膣剤は膣内投与され、 経鼻剤は鼻腔内投 与され、 舌下剤は口腔内投与され、 軟膏剤は経皮的に局 所投与される。

上記医薬製剤の投与量は、 特に限定されず、 所望の治 療効果、 投与法、 治療期間、 患者の年齢、 性別その他の 条件などに応じて広範囲よ り適宜選択される。 一般的に は、 通常、 1 日 当 り患者体重 1 k g 当 り、 有効成分量が 0 . O l g 〜 ： L O m g程度、 好ま し く は約 0 . 1 g 〜 1 m g程度となる量とするのがよい。 該製剤は 1 曰 に 1 回投与する こ と もでき、 また 2 回以上、 数回に分けて 投与する こ と もできる。

また、 後記実施例に示されるよ う に、 本発明遺伝子は、 アルツハイ マー病患者の脳側頭葉部位においてその発現 が消失または低下している こ とか ら、 本発明遺伝子の全 部または一部を含有する任意の遺伝子発現ベク ターを作 成して、 該発現ベク ターを脳側頭葉組織に導入 して、 1^ 組織内で本発明遺伝子を強制的に発現させれば、 脳側頭 葉組織における神経細胞の過剰な萎縮を含む神経変性な どが抑制され、 結果と してアルツハイ マー病の進展など が抑制される こ こ となる。 従って、 本発明はかかる神経 変性抑制作用 を有する遺伝子治療用組成物 （遺伝子治療 剤） を も提供する ものである。

更に、 本発明によれば、 上記遺伝子発現ベクターない . しは遺伝子治療用べクタ一、 該ベク ターによ り本発明遺 伝子を導入した細胞、 これら を有効成分とする医薬組成 物 （遺伝子治療剤） も提供される。

上記遺伝子治療剤を利用 した遺伝子治療は、 例えば本 発明遺伝子の導入、 発現用ベク ターおよび該ベク ターに よ り本発明遺伝子を導入した細胞か ら選ばれる少なく と も 1 種を、 神経変性疾患患者の脳神経細胞または脳側頭 葉組織部位に、 投与する こ とによって実施される。 かく して、 これら組織における神経変性を抑制 し、 アルッハ イ マ一病、 アルツハイマー型痴呆症、 パーキンソ ン病、 脳虚血などの症状を抑制する こ とができる。

以下、 かかる遣伝子治療につき詳述する。 尚、 以下の 遺伝子治療の実施においては、 特記しないかぎり、 化学、 分子生物学、 微生物学、 組換え D N A、 潭伝学および免 疫学の慣用的な方法を用いる こ とができる。 これら は、 - 例えばマニアテイ ス （Man i at i s, T. , et al. , Molecular cloning: A la or tory manual (Cold S ring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)) , サムブ レッ ク (Sam brook, J. , e t al. , Molecular cloning:

A laboratory manual , 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981))、 ァウスベル（Ausbe 1, F. M. , et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley and Sons, New York, ( 1992))、 グローノ 一 （Gl over, D.. DNA Cloning, I and 11 (Oxford Press) (1985) ) アナン ド （Anand, Techn i ques for the Analysis o ί Complex Genomes, (Academic Press (1992) ) , グス リ 一 （Gu t h r i e, G. , et al. , Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, (Academic Press) (1991))およびフィ ンク （Fink, et al. , Hum.

Gene Ther. , 3, 11 - 19 ( 1992 )に記載されている。

遺伝子治療は、 本発明遺伝子の全部または一部を含有 する遺伝子治療用導入用ベクターまたは該ベク タ一によ り 本発明遺伝子を導入された細胞を用 いて実施できる。 該遺伝子治療は、 例えば : L Y 6 H遺伝子の発現が認め ら れない細胞に、 該遺伝子乃至その機能を供給する方法で ある。 かかる遺伝子治療によって、 受容細胞 標的細胞 周囲の神経細胞の変性が抑制される。 - 本発明遺伝子または該遺伝子の一部は、 当該遺伝子を 染色体外に維持するよ う なべクタ一を用いて細胞に導入 する こ とができる。 この場合において当該遺伝子は、 染 色体外の位置か ら細胞によ り発現できる。 また、 L Y 6 H遺伝子の発現が認め られない脳神経の側頭葉部位に遺 伝子部分を導入 して発現させる場合、 当該遺伝子部分は 細胞の生存維持或いは非腫瘍的増殖に必要な L Y 6 H蛋 白質の一部分をコ一 ド してもよい。

遺伝子導入用べク タ一と しては、 後述するよ う に当該 分野において既に知 られている各種のベク ターに本発明 遺伝子を導入 したものである こ とができる。

遺伝子導入用べク タ一の標的細胞への導入は、 当該分 野において既に知 られている各種の細胞に D N Aを導入 する方法、 例えばエレク ト 口ポレーシ ヨ ン、 リ ン酸カル シゥム共沈、 ウィ ルス形質導入などに従い容易に実施で きる。 こ こで本発明遺伝子を導入して形質転換した細胞 は、 脳神経組織の過剰萎縮の抑制を含む脳神経変性抑制 のための医薬や治療研究のためのモデル系と して利用で きる。 前記如 く、 本発明に従う遺伝子治療によれば、 導入さ れた本発明遺伝子やその断片は、 脳神経組織またはその 周囲組織において該遺伝子の発現産物の量を増加させ、 一 かく して遺伝子発現組織における脳神経組織の萎縮を抑 制できる。 かかる遺伝子治療は、 正常細胞に比して、

L Y 6 H遺伝子の発現または L Y 6 H蛋白質がな く なつ ているか、 またはその レベルが減少している脳神経細胞 組織の双方において好適に用 い られる。

本発明 に係わる遺伝子治療は、 以下の如 く して実施さ れる。 即ち まず、 例えば、 アルツハイ マー型痴呆症患者、 アルツハイ マー病患者の脳側頭葉部に測定位置を固定 し たコ ン ビュ一夕 トモグラム （ C T ) スキャ ンにて、 脳側 頭葉部の萎縮が認め られるか否か或いは該萎縮が進行し ている患者を確認する こ とによって、 本発明の遺伝子治 療の対象患者をスク リ ーニングする。

次に、 本発明遺伝子を発現させるベく 標的細胞におい て、 細胞内の L Y 6 Hm R N Aを作 り 出 し、 翻訳を促し、 L Y 6 H遺伝子の発現を促進させる。 そのために好ま し く は遺伝子の m R N Aに対応するセンス · オリ ゴヌ ク レ ォチ ド を製造し、 該センス · ォ リ ゴヌ ク レオチ ドを標的 細胞に供給する。 上記遺伝子治療によって、 L Y 6 H遺 伝子の発現機能を促進する作用 を細胞に供給して、 受容 細胞 Z標的細胞における脳の神経変性を抑制する こ とが できる。

上記セ ンス · オリ ゴヌ ク レオチ ド を用いた遺伝子治 によれば、 レ ト ロウイルス、 アデノ ウイルス、 A A V由 来のベク ターに L Y 6 H遺伝子を組込み、 これを標的と する脳神経細胞に感染させてセンス · オリ ゴヌ ク レオチ ド を発現させる こ とによ り、 所望の脳神経変性抑制効果 およびその結果と しての神経変性症状の軽減または進展 抑制効果を得る こ とができる。

このよ う に脳神経細胞または組織に、 本発明遺伝子の センス · オリ ゴヌ ク レオチ ドを導入して L Y 6 H蛋白質 の発現を増加させる場合、 当該センス · オ リ ゴヌ ク レオ チ ドは、 L Y 6 H遺伝子の全長とする必要はなく、 該 L Y 6 H遺伝子の発現を促進する機能と実質的に同質な 機能を保持する限り において、 前記した改変体であって もよ く、 また該機能を保持した一部配列か らなる遺伝子 であっ てもよい。

かかる組換えおよび染色体外維持の双方のための所望 遺伝子の導入のためのベク ターは、 当該分野において既 に知 られてお り、 本発明ではかかる既知のベクターのい ずれも使用できる。 例えば、 発現制御エ レメ ン ト に連結 した L Y 6 H遺伝子のセンス · オ リ ゴヌ ク レオチ ドのコ ピーを含み、 かつ 目的の細胞内で当該センス · オ リ ゴヌ ク レオチ ド産物を発現できる ウィ ルスベク タ一またはプ ラス ミ ドベク ターを挙げる こ とができる。 かかるベク タ— —と して、 通常、 前述する発現用べク タ一を利用する こ と もできるが、 好適には、 例えば起源ベク ターと して、 米国特許第 5 2 5 2 4 7 9号明細書および P C T国際公 開 W〇 9 3 / 0 7 2 8 2号明細書に開示されたベク ター (具体的には _P W P — 7 A、 p w P — 1 9、 p WU— l、 p W P — 8 A、 p W P — 2 1 および/または p R S V L など） または p R C Z C M V ( Invitrogen社製） などを 用いて調製されたべクタ一を挙げる こ とができる。 よ り 好ま し く は、 後述する各種ウィ ルス ， ベク タ一を挙げる こ とができる。

なお、 遺伝子導入治療において用い られるベク ターに 使用されるプロモーターと しては、 各種疾患の治療対象 となる患部組織に固有のものを好適に利用する こ とがで きる。 その具体例と しては、 例えば、 肝臓に対 しては、 アルブミ ン、 a — フエ 卜 プロテイ ン、 oi l —ア ンチ ト リ プシン、 ト ラ ンスフェ リ ン、 ト ラ ンススチレンな どを例 示できる。 結腸に対 しては、 カルボン酸ア ン ヒ ド ラ一ゼ I、 カルシノ エンブロゲンの抗原などを例示できる。 子 宮および胎盤に対しては、 エス ト ロゲン、 ァ ロマ夕一ゼ サイ ト ク ローム P 4 5 0、 コ レステロール側鎖切断

P 4 5 0、 1 7 ァリレフ ァ一ヒ ド ロキシラーゼ P 4 5 0 な どを例示できる。 - 前立腺に対しては、 前立腺抗原、 g p 9 1 — フ ォ ッ ク ス遺伝子、 前立腺特異的カ リ ク レイ ンな どを例示できる。 乳房に対 しては、 e r b — B 2、 e r b — B 3、 j3 —力 ゼイ ン、 /3 _ ラ ク ト グロ ビン、 乳漿蛋白質などを例示で きる。 肺に対 しては、 活性剤蛋白質 C ゥ ロ グロ ブリ ンな どを例示できる。 皮膚に対しては、 K 一 1 4 — ケラチン、 ヒ トケラチン 1 または 6、 ロイ ク リ ンなどを例示できる。 脳に対しては、 神経膠繊維質酸性蛋白質、 成熟ァス ト ロ サイ ト特異蛋白質、 ミエ リ ン、 チロ シンヒ ド ロキシラー ゼ塍臓ヴィ リ ン、 グルカゴン、 ラ ンゲルハ ンス島ア ミ 口 ィ ドポ リ ペプチ ドな どを例示できる。 甲状腺に対しては、 チロ グロ ブリ ン、 カルシ トニンなどを例示できる。 骨に 対しては、 α ΐ コ ラーゲン、 ォステオカルシン、 骨シァ ログリ コ プロテイ ンなどを例示できる。 腎臓に対しては レニン、 肝臓 Ζ骨 腎臓アルカ リ性ホスフ オ タ一ゼ、 ェ リ ス ロポェチンな どを、 膝臓に対しては、 ア ミ ラーゼ、 P A Ρ 1 などを例示できる。

また、 センス · ォリ ゴヌ ク レオチ ド導入用ベク ターの 製造において、 導入されるセンス · オリ ゴヌ ク レオチ ド (本発明遺伝子の配列に相応する全部または一部の配列 を有する もの） は、 本発明遺伝子の塩基配列情報に基づ いて、 前記の如 く、 一般的遺伝子工学的手法によ り容易 - に製造 · 取得する こ とができる。

かかるセ ンス · オリ ゴヌ ク レオチ ド導入用ベクターの 細胞への導入は、 例えばエレク ト 口ポ レーシヨ ン、 リ ン 酸カルシウム共沈法、 ウィルス形質導入などを始め とす る、 細胞に D N Aを導入する当該分野において既に知 ら れている各種の方法に従って行う こ とができる。 なお、 上記セ ンス · オリ ゴヌ ク レオチ ドで形質転換された細胞 は、 それ自体、 単離された状態で脳神経変性抑制作用を 有し、 結果と して神経変性症状の抑制ない しはその進展 抑制のための医薬や、 治療研究のためのモデル系と して 利用する こ と も可能である。

遣伝子治療において、 上記センス · オ リ ゴヌ ク レオチ ド導入用ベク ターは、 患者の脳側頭葉部位またはその周 辺部位に局所的にまたは全身的に注射投与する こ とがで きる。 また、 幹細胞と共に培養した後に、 局所的にまた は全身的に注射投与する こ とができる。 この投与によ り 上記ベク ターを患者の脳神経細胞内に導入する こ とがで きる。 形質導入された遺伝子が各標的細胞の染色体内に 恒久的に取 り 込まれない場合には、 該投与を定期的に繰 り返すこ とができる。

本発明の遺伝子治療方法は、 前記センス · オ リ ゴヌ ク レオチ ド導入用の材料 （センス · オリ ゴヌ ク レオチ ド擎 入用ベク ター） を直接体内に投与するイ ン ビポ （ i n v i v o ) 法と、 培養幹細胞に遺伝子を導入して培養後、 該細胞 を患者体内に移植または導入するェクス ビボ （ e x v i v o ) 法の両方の方法を包含する。 また、 センス · オリ ゴヌ ク レオチ ド を直接細胞内に導入による遺伝子治療も可能で ある。

本発明遺伝子のセンス · オリ ゴヌ ク レオチ ド を導入す る標的細胞は、 遺伝子治療 （処置） の対象によ り適宜選 択する こ とができる。 例えば、 該標的細胞と しては、 脳 神経細胞や脳神経組織以外に、 リ ンパ球、 線維芽細胞、 肝細胞、 造血幹細胞などを挙げる こ とができる。

上記遺伝子治療におけるセンス · オリ ゴヌ ク レオチ ド 導入方法には、 ウィルス的導入方法および非ウィ ルス的 導入方法が含まれる。

ウィルス的導入方法と しては、 例えば、 導入され ¾セ ンス · オ リ ゴヌ ク レオチ ドが、 特に正常脳細胞に発現す る外来の物質である こ とに鑑みて、 ベク タ一と して レ ト ロウィルスべク タ一を用いる方法を挙げる こ とができる。 その他のウィ ルスベク タ一と しては、 アデノ ウイ ルスべ ク タ一、 H I V ( human immunodef iciency virus) べク 夕一、 アデノ 随伴ウィ ルスベク タ一 （A A V, adeno- associated virus) 、 へ Jレぺス ウイ レスべク タ一、 単純— ヘルぺス ウィ ルス （H S V) ベク タ一、 ェプスタイ ン一 ノ —ウィ ルス （ E B V， Eps ί ein-Barr virus) ベク タ一 などが挙げられる。

以下、 具体的なセンス · オリ ゴヌ ク レオチ ド導入用ゥ ィ ルスべクタ一の作成法並びに標的細胞または標的組織 へのセ ンス · オ リ ゴヌ ク レオチ ド導入法について述べる。

レ ト ロ ウイ ルスベクター · システムは、 ウィ ルスべク 夕一とヘルパー細胞 （パッ ケージング細胞） か らなつ て いる。 こ こでヘルパー細胞は、 レ ト ロウイ ルスの構造蛋 白質 g a g (ウィルス粒子内の構造蛋白質） 、 p o 1 (逆転写酵素） 、 e n v (外被蛋白質） な どの遺伝子を 予め発現しているが、 ウィ ルス粒子を生成していない細 胞を言う。 一方、 ウィルスベク タ一は、 パッ ケージング シグナルや L T R (1 ong terminal r epe a t s)を有している が、 ウィ ルス複製に必要な g a g、 p o 1、 e n vな ど の構造遺伝子を持っていない。 パッ ケージングシグナル はウィ ルス粒子のアセンブリ ーの際にタ グとなる配列で、 選択遺伝子 （ n e o, h y g ) とク ロ一ニングサイ ト に 組込まれた所望の導入用センス · オリ ゴヌ ク レオチ ドが ウィ ルス遺伝子の代 り に挿入される。 こ こで高力価のゥ ィ ルス粒子を得る にはイ ンサー ト を可能な限 り 短く し、 パ ッ ケージングシグナルを g a g遺伝子の一部を含め JT く とる こ と と、 - g a g遺伝子の A T Gを残さぬよ う にす る こ とが重要である。

所望のセ ンス · オリ ゴヌ ク レオチ ド を組込んだベク タ 一 D N Aをヘルパー細胞に移入する こ と によって、 ヘル パー細胞が作っている ウィ ルス構造蛋白質によ り べク タ 一ゲノ ム R N Aがパッ ケージされてウィ ルス粒子が形成 され、 分泌される。 組換えウィルス と してのウィ ルス粒 子は、 標的細胞に感染した後、 ウィルスゲノ ム R N Aか ら逆転写された D N Aが細胞核に組み込まれ、 ベク タ一 内に挿入されたセンス遣伝子が発現する。

尚、 所望の遺伝子の導入効率を上げる方法と して、 フ イ ブロネクチンの細胞接着 ド メイ ンとへパ リ ン結合部位 と接合セグメ ン 卜 とを含む断片を用いる方法

C Hanenberg, H. , e t al. , Exp. Hemat. , 2 , 747 ( 1995)〕 を採用する こ と もできる。

上記レ ト ロ ウイ ルスベク タ一 ' システムにおいて用い られるべク タ一と しては、 例えばマウスの白血病ウィ ル スを起源とする レ ト ロウイルス 〔McLachI in, J. R. , et al. , Proc. Nat l. Acad. Res. Molec. Biol. , 38, 91-135 ( 1990)〕 を例示する こ とができる。

アデノ ウィ ルスベクタ一を利用する方法につき詳述す れば、 該アデノ ウイ ルスベク ターの作成は、 バークネ

[ Berkner, K. L. , Curr. Topics Microbiol. I mmuno 1. , 158, 39-66 ( 1992)〕 、 瀨戸口康弘 ら 〔 S e t o gu c 1 , Y. , e t al. , Blood, 84. 2946-2953 ( 1994)〕 、 鐘カ江裕美ら 〔実験 医学， 11, 28-34 (1994)〕 およびケナ一ら CKetner, G. , et al. , Proc. Nat 1. Acad. Sc i. , USA. , 91, 6186-6190 (1994)〕 の方法に準じて行う こ とができる。

例えば、 非増殖性アデノ ウイ ルスベク タ一を作成する には、 まずアデノ ウイルスの初期遺伝子の E 1 および Z または E 3 遺伝子領域を除去する。 次に、 目的とする所 望の外来遺伝子発現単位 （目的とする導入用センス · ォ リ ゴヌ ク レオチ ド、 該センス · オ リ ゴヌ ク レオチ ド を転 写するためのプロモータ一、 転写された遺伝子の安定性 を賦与するポ リ Aか ら構成） およびアデノ ウイ ルスゲノ ム D N Aの一部を含むプラス ミ ドベクタ一と、 アデノ ウ ィルスゲノ ムを含むプラス ミ ド とを、 例えば 2 9 3 細胞 に同時に ト ラ ンス フエク シ ヨ ンする。 この 2 者間で相同 性組換えを起 こ させて、 遺伝子発現単位と E 1 とを置換 する こ と によ り、 所望のセンス · オリ ゴヌ ク レオチ ドを 包含するべクタ一である非増殖性アデノ ウィ ルスベク タ —を作成する こ とができる。 また、 コス ミ ドベクターに アデノ ウイ ルスゲノ ム D N Aを組み込んで、 末端蛋白質 を付加 した 3 ' 側アデノ ウイ ルスベク ターを作成する こ- と もできる。 更に組換えアデノ ウイ ルスベクターの作成 〖こは、 Y A Cベク タ一も利用可能である。

アデノ 随伴ウィルス （A A V ) ベク タ一の製造につき 概略する と、 A A Vはアデノ ウイ ルスの培養系に混入し て く る小型のウィ ルス と して発見された。 これには、 ゥ ィ ルス複製にヘルパーウィ ルスを必要とせず宿主細胞内 で自律的に増殖するパルポウィ ルス属と、 ヘルパーウイ ルスを必要とするディ ペン ドウィ ルス属の存在が確認さ れている。 該 A A Vは宿主域が広く、 種々 の細胞に感染 するあ り ふれたウィ ルスであ り、 ウィ ルスゲノ ムは大き さが 4 6 8 0塩基の線状一本鎖 D N Aか らな り、 その両 端の 1 4 5塩基力 S I T R (inverted terminal repeat)と 呼ばれる特徴的な配列を持って存在している。 この I T Rの部分が複製開始点とな り、 プライ マーの役割をなす。 更にウィ ルス粒子へのパッ ケージングや宿主細胞の染色 体 D N Aへの組込みにも、 該 I T Rが必須となる。 また、 ウィ ルス蛋白質に関 しては、 ゲノ ムの左半分が非構造蛋 白質、 即ち複製や転写をつかさ どる調節蛋白質の R e p をコ一 ド してレ る。 組換え A A Vの作成は、 A A Vが染色体 D N Aに組み 込まれる性質を利用 して行う こ とができ、 かく して所望 の遺伝子導入用ベクターが作成できる。 この方法はよ り一 詳し く は、 まず野生型 A A Vの 5 ' と 3 'の両端の I T R を残し、 その間に所望の導入用センス · オ リ ゴヌ ク レオ チ ドを揷入したプラス ミ ド （ A A Vベク タ一プラス ミ ド） を作成する。 一方、 ウィルス複製やウィ ルス粒子の形成 に必要と される ウィルス蛋白質は、 別のへルパープラス ミ ド によ り 供給させる。 この両者の間には共通の塩基配 列が存在 しないよ う にし、 遺伝子組換えによる野生型ゥ ィ ルスが出現しないよう にする必要がある。 その後、 両 者のプラス ミ ド を例えば 2 9 3 細胞への ト ラ ンス フ エク シヨ ンによ り 導入し、 さ ら にヘルパーウィ ルス と してァ デノ ウィ ルス （ 2 9 3 細胞を用いる場合は非增殖型の も のでもよい） を感染させる と、 非増殖性の所望の組換え A A Vが産生される。 続いて、 この組換え A A Vは核内 に存在するので、 細胞を凍結融解して回収 し、 混入する アデノ ウイルスを 5 6 で加熱によ り失活させる。 更に必 要に応 じて塩化セシウムを用いる超遠心法によ り組換え A A V を分離濃縮する。 上記のよ う に して所望の遺伝子 導入用の組換え A A Vを得る こ とができる。

E B Vベク タ一の製造は、 例えば清水 ら の方法に準じ て行う こ とができる 〔清水則夫、 細胞工学， 14(3), 280 -287 (1995)〕 。

本発明に係わるセンス · オ リ ゴヌ ク レオチ ドの導入用一 E B Vベク タ一の製造につき概略する と、 E Bウィルス (Epstein-Barr virus: EBV) は、 1964年にェプス夕イ ン (Epstein)ら によ りバーキッ ト （Burki U) リ ンパ腫由来 の培養細胞よ り分離されたへルぺス科に属する ウィルス である C Ki e f f , E. and L i ebow i t z, D. ： Virology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp. 1889- 1920] 。 該 E B Vには細胞を ト ラ ンス フ ォームする活性があるので、 遺伝子導入用べク タ一とするためには、 この ト ラ ンスフ オーム活性を欠いたウィルスを調製しなければな らなレ これは次の如 く して実施できる。

即ち、 まず、 所望の外来遺伝子を組み込む標的 D N A 近傍の E B Vゲノ ムをク ローニングする。 そこ に外来遺 伝子の D N A断片と薬剤耐性遺伝子を組込み、 組換えゥ ィ ルス作製用ベク ターとする。 次いで適当な制限酵素に よ り 切 り 出された組換えウィ ルス作製用べク タ一を

E B V陽性 A k a t a細胞に ト ラ ンス フ エ ク トする。 相 同組換えによ り 生じた組換えウィ ルスは抗表面免疫グロ ブリ ン処理による ウィルス産生刺激によ り野生型

A k a t a E B V と と もに回収できる。 これを E B V陰 性 A k a t a細胞に感染し、 薬剤存在下で耐性株を選択 する こ と によ り、 野生型 E B Vが共存しない所望の組換 えウィルスのみが感染した A k a t a細胞を得る こ とか できる。 さ ら に組換えウィルス感染 A k a t a細胞にゥ ィルス活性を誘導する こ とによ り、 目的とする大量の組 換えウィ ルスベク タ一を産生する こ とができる。

本発明遺伝子治療において、 所望遺伝子の標的細胞ま たは標的組織への導入方法には、 代表的には以下の 2 種 類の方法が含まれる。

その第 1 法は、 治療対象とする患者か ら標的細胞を採 取 した後、 該細胞を体外で、 例えばイ ンタ一ロイ キン一 2 ( I L — 2 )な どの添加の下で培養し、 レ ト ロウイ ルス ベク タ一に含まれる 目的とするセンス · オ リ ゴヌ ク レオ チ ドを導入した後、 得られる細胞を再移植する手法（e x v i vo法）である。 該方法は例えば欠陥遺伝子によって発生 する遺伝子病や癌などの治療に好適である。

第 2 法は、 目的センス ， オ リ ゴヌ ク レオチ ド を直接患 者の体内や脳組織などの標的部位に注入する遺伝子直接 導入法 （直接法）である。

上記遣伝子治療の第 1 法は、 よ り詳し く は、 例えば次 のよ う に して実施される。 即ち、 患者か ら採取した幹細 胞などの単核細胞を血液分離装置を用 いて単球か ら分取 し、 分取細胞を I L 一 2 の存在下に A I M— V培地など の適当な培地で 7 2時間程度培養し、 導入すべきセンス * オリ ゴヌ ク レオチ ドを含有するべク タ一を加える。 セー ンス · オ リ ゴヌ ク レオチ ドの導入効率をあげるために、 プロ夕 ミ ン存在下に 3 21：で 1 時間、 2 5 0 0 回転にて 遠心分離した後、 3 7 で 1 0 %炭酸ガス条件下で 2 4 時間培養してもよい。 この操作を数回繰 り返した後、 更 に I L 一 2存在下に A I M— V培地な どで 4 8時間培養 し、 細胞を生理食塩水で洗浄し、 生細胞数を算定し、 セ ンス · オリ ゴヌ ク レオチ ド導入効率を前記 in situP C R や、 例えば所望の対象が酵素活性であればその活性の程 度を測定する こ とによ り、 目的センス ， オ リ ゴヌ ク レオ チ ド導入効果を確認する。

また、 培養細胞中の細菌 · 真菌培養、 マイ コ プラズマ の感染の有無、 エン ド トキシンの検索などの安全度のチ エ ッ ク を行い、 安全性を確認した後、 予測される効果用 量のセンス · オ リ ゴヌ ク レオチ ドが導入された培養細胞 を患者に点滴静注によ り戻す。 かかる方法を例えば数週 間か ら数力月 間隔で繰 り返する こ とによ り 遺伝子治療が 施される。

こ こでウィ ルスベク ターの投与量は、 導入する標的細 胞によ り 適宜選択される。 通常、 ウィ ルス価と して、 例 えば標的細胞 1 X 1 0 ⁸細胞に対 して 1 X 1 0 ³ c f u力、 ら 1 X 1 0 ⁸ c f uの範囲 となる投与量を採用する こ とが 好ま しい。 ― 上記第 1 法の別法と して、 目的セ ンス · オ リ ゴヌ ク レ ォチ ド を含有する レ ト ロウイルスベクタ一を含有する ゥ ィ ルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養して、 目 的とする細胞へセ ンス · オ リ ゴヌ ク レオチ ドを導入する 方法を採用する こ と もできる。

遺伝子治療の第 2法 （直接法） の実施に当たっ ては、 特に体外における予備実験によって、 遺伝子導入法によ つ て、 実際に目的センス · ォリ ゴヌ ク レオチ ドが導入さ れるか否かを、 予めべクタ一遺伝子 c D N Aの P C R法 による検索や in situP C R法によって確認する力 、 或い は目的センス · オ リ ゴヌ ク レオチ ドの導入に基づく 所望 の治療効果である特異的活性の上昇や標的細胞の増殖增 加や増殖抑制などを確認する こ とが望ま しい。 また、 ゥ ィルスべクタ一を用いる場合は、 増殖性レ ト ロウイルス などの検索を P C R法で行うか、 逆転写酵素活性を測定 するか、 或は膜蛋白 （env)遣伝子を P C R法でモニタ一す るな どによ り、 遺伝子治療に際してセンス · オ リ ゴヌ ク レオチ ド導入による安全性を確認する こ とが重要である こ とはい う までもない。 本発明遺伝子治療法において、 アルツハイ マー病、 ァ ルツハイ マー型痴呆症、 パーキンソ ン病などを対象とす る場合は、 患者から幹細胞または脳神経細胞を採取後、 - 酵素処理な どを施して培養細胞を樹立した後、 例えば A A Vにて所望のセンス · オリ ゴヌ ク レオチ ドを標的と する脳神経細胞に導入し、 G 4 1 8 細胞にてスク リ ー二 ングした後、 I L 一 1 2 などの発現量を測定（ i n v i v o )測 定 し、 次いで放射線処理を施行 し、 患者脳組織内または 脳側頭葉部位に接種する神経変性疾患の治療法を一例 と して挙げる こ とができる。

本発明はまた、 本発明センス · オリ ゴヌ ク レオチ ド導 入用べク タ一または目的センス · オ リ ゴヌ ク レオチ ドが 導入された細胞を活性成分と し、 それらの薬学的有効量 を、 適当な無毒性医薬担体ない し希釈剤と共に含有する 医薬組成物または医薬製剤 （遺伝子治療剤） をも提供す る。

本発明医薬組成物 （医薬製剤） に利用できる医薬担体 と しては、 製剤の使用形態に応じて通常使用 される、 充 填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壊剤、 表面活性剤、 滑沢剤な どの希釈剤ない し賦形剤などを例示でき、 これ らは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用 できる。 本発明医薬製剤の投与単位形態と しては、 前記した本 発明ポ リ ペプチ ド製剤について詳述したもの と同様のも のを挙げる こ とができ、 治療目的に応じて各種の形態力 ら適宜選択する こ とができる。

以下、 本発明神経変性疾患の治療および予防方法につ き詳述する。

本発明は、 過剰および不十分な量の L Y 6 Hポ リ ぺプ チ ドが関連するアルツハイ マー病、 アルツハイ マー型痴 呆症、 脳虚血、 パーキンソ ン病などの神経変性疾患の治 療方法を提供する。 L Y 6 H活性が過剰な場合、 い く つ かの方法を用 いる こ とができる。 1 の方法は、 たとえば、 リ ガン ド、 基質、 レセプ夕一、 酵素などの結合をブロ ッ クする こ とによ り、 ある いは 2 次的シグナルを阻害する こ と によ り、 L Y 6 Hポ リ ペプチ ドの機能を阻害する の に効果的な量の前記した阻害化合物 （アン夕ゴニス ト） を医薬上許容される担体と共に対象に投与 し、 その こ と によ り 異常な症状を改善する こ とを含む。 も う 1 つ別の 方法において、 内在性 L Y 6 H と競争して リ ガン ド、 基 質、 酵素、 レセプ夕一などとの結合能を有する可溶性形 態の L Y 6 Hポ リ ペプチ ドを投与してもよ レ かかる競 争物質の典型例は、 L Y 6 Hポ リ ペプチ ドのフ ラグメ ン ト を含む。 他の方法において、 内在性 L Y 6 Hと競争し て リ ガン ド との結合能を有する可溶性形態の L Y 6 Hポ リ ペプチ ドを投与してもよい。 かかる競争物質の典型例 は、 L Y 6 Hポ リ ペプチ ドのフ ラグメ ン ト を含む。 ― さ ら に他の方法において、 L Y 6 H遺伝子発現産物の 遺伝子発現遮断法を用いて内在性 L Y 6 Hポ リ ペプチ ド をコー ドする遺伝子の発現を阻害できる。 公知のかかる 方法は、 内部生成した、 あるいは別個に投与されたア ン チセンス配列の使用を含む （例えば

01 igodeoxynucleotides as An t i s ens e Inhibi tors of Gene Express ion, CRC Press, Boca Raton, FL ( 1988) 中、 0' Connor, J. Neur ocheni 56 ： 560 ( 1991 ) を参照） 。 別法と して、 遺伝子と共に三重らせんを形成するオ リ ゴ ヌ ク レオチ ド を供給する こ と もできる （例えば Leeら、 Nucleic Ac ids Res. , 6 ： 3073 ( 1979) ； Cooneyら、 Science, 241 ： 56 ( 1988) ； Dervanら、 Science, 251 ： 1360 ( 1991 ) 参照） 。 これら のオリ ゴマーはそれ自体投 与する こ とができ、 あるいは関連するオ リ ゴマーをイ ン ビポで発現させる こ と もできる。

L Y 6 Hおよびその活性の過少発現に関連する異常な 症状を治療するのに、 またい く つかの方法が利用可能で ある。 1 の方法は、 L Y 6 Hを活性化する治療上有効量 の化合物 （すなわち、 前記のァゴニス ト） を医薬上許容 される担体と と もに対象に投与し、 その こ と によ り 異常 な状態を改善する こ とを含む。 別法と して、 遺伝子治療 を用 いて、 対象中の関連細胞による L Y 6 Hの内因的 ^: 成を有効な ら しめてもよい。 例えば、 前記の ごと く、 複 製欠損 レ ト ロ ウイ ルスベク ターにて発現するよ う に、 本 発明のポ リ ヌ ク レオチ ド を操作してもよい。 ついで、 該 レ ト ロウイ ルス発現構築物を単離し、 本発明のポ リ ぺプ チ ド をコー ドする R N A含有の レ ト ロ ウイ ルスプラス ミ ドベク タ一で ト ラ ンスダク シヨ ン したパ ッ ケージング細 胞中 に導入して、 パ ッ ケージング細胞が目的とする遺伝 子を含む感染性ウィルス粒子を生成するよ う に してもよ レ これ ら のプロデューサ一細胞を対象に投与して細胞 をイ ンビポで操作し、 イ ン ビポでポリ ペプチ ド を発現す るよ う に してもよい。 遺伝子治療の概説と しては、 文献 [Human Molecular Genetics, T. Strachan and A. P.

Read, BIOS Scienti f ic Publ ishers Ltd ( 1996) の第 2 0 章、 Gene Therapy and other Molecular Genet ic- based Therapeutic App r o ache sおよびその中の弓 I用文献） が参照される。 別法は、 治療量の L Y 6 Hポ リ ペプチ ド を適当な医薬担体と組合わせて投与する こ とである。

これら は、 リ ン酸緩衝生理食塩液 （ P H 7. 4 ) 、 リ ンゲル液、 細胞内組成液用注射剤中に配合した形態など に調製する こ と もでき、 またプロ 夕 ミ ンなどの遺伝子導 入効率を高める物質と共に投与されるよ う な形態に調製 する こ と もできる。 - 上記医薬製剤の投与方法は、 特に制限がなく、 各種製 剤形態、 患者の年齢、 性別その他の条件、 疾患の程度な どに応じて決定される。

上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量および その投与量は、 特に限定されず、 所望の治療効果、 投与 法、 治療期間、 患者の年齢、 性別その他の条件などに応 じて広範囲よ り 適宜選択される。

一般には、 医薬製剤と しての所望のセ ンス · オ リ ゴヌ ク レオチ ドを含有する レ 卜 ロウィ ルスべク タ一の投与量 は、 1 日 当 り体重 l k g 当 り、 例えばレ ト ロ ウイ ルスの 力価と して約 1 X 1 0 ³ P f u か ら 1 X 1 0 ^{1 5} p f u程度 とするのがよい。

また所望の導入用センス · オリ ゴヌ ク レオチ ドが導入 された細胞の場合は、 1 X 1 0 ⁴細胞 bodyか ら 1 X 1 0 1⁵細胞/ body程度の範囲か ら選ばれるのが適当である。

該製剤は 1 日 に 1 回または数回に分けて投与する こ と もでき、 1 か ら数週間間隔で間欠的に投与する こ と もで きる。 尚、 好ま し く は、 プロ夕 ミ ンなど遺伝子導入効率 を高める物質ま.たはこれを含む製剤と併用投与する こ と ができる。

本発明 に従う遺伝子治療を神経変性疾患の治療に適用 する場合は、 種々 の遺伝子治療を適宜組合わせて行う - (結合遺伝子治療） こ と もでき、 前記した遺伝子治療に、 ァセチルコ リ ン分解酵素阻害剤などを利用する薬物療法 や リ ハ ビリ テーショ ン療法などを組合わせて行う こ と も できる。 さ ら に本発明遺伝子治療は、 その安全性を含め て、 N I Hのガイ ド ライ ンを参考に して実施する こ とが でさ る [Recombinant DNA Advisory Commi ttee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993) ] 。

また本発明によれば、 L Y 6 H遺伝子の存在を検出す るために、 血液または血清のごとき生物学的試料を調製 し、 所望によ り核酸を抽出 し、 L Y 6 H遺伝子が存在す る否かについて分析する こ とが可能である。

該検出方法は、 例えば、 本発明遺伝子の D N A断片を 作成し、 L Y 6 H遺伝子のスク リ ーニングおよび Zまた はその増幅に用 い られるよ う に設計する。 よ り具体的に は、 例えばプラークハイ ブリ ダィゼ一シヨ ン、 コ ロニー ノヽイ ブリ ダィゼーシ ヨ ン、 サザンブロ ッ ト法、 ノ ーザン プロ ッ ト法などにおけるプローブと しての性質を有する もの、 核酸配列をポリ メ ラーゼで増幅するポ リ メ ラーゼ 連鎖反応 （ P C R ) によ り、 増幅した本発明遺伝子の全 部または一部の D N A断片を得る こ とができるためのプ ローブと しての性質を有する ものを作成できる。 そのた めにはまず L Y 6 H遺伝子と同 じ配列を持つプライマー- を作成し、 これをスク リ ーニング用プローブと して用レ 、 生物学的試料 （核酸試料） と反応させる こ と によ り、 当 該 L Y 6 H遺伝子の配列の存在を確認する こ とができる。 該核酸試料は、 標的配列の検出を容易にする種々 の方法、 例えば変性、 制限消化、 電気泳動または ド ッ ト ブロ ッ テ ィ ングで調製してもよい。

前記ス ク リ ーニング方法と しては、 特に P C R法を用 いるのが感度の点か ら好ま し く、 該方法は、 本発明遺伝 子の断片をプライ マーと して用いる方法であればと く に 制限されず、 従来公知の方法（Science, 2_30, 1350-1354 (1985))や新たに開発された、 或いは将来使用 される P C R変法 （榊 佳之、 ほか編、 羊土社、 実験医学、 増刊， 8 (9) ( 1990)； 蛋白質 · 核酸 · 酵素、 臨時増刊、共立出版 (株）， 35 (17) (1990))のいずれも利用する こ とが可能で ある。

プライ マー と して使用される D N A断片は、 化学合成 したオリ ゴ D N Aであ り、 これらオリ ゴ D N Aの合成は 自動 D N A合成装置など、 例えば D N A合成装置 （Marin ac i aLKB Gene Assembler Plus : フ アルマシア社製）を使 用 して合成する こ とができる。 合成されるプライ マ一 （セ ンス プライ マーまたはア ンチセ ンス プライ マ一）の長さ は、 約 1 0 〜 3 0 ヌ ク レオチ ド程度が好ま し く 例示できる。 一 上記スク リ ーニングに用い られるプローブは、 通常は標 識したプローブを用 いるが、 非標識であっ てもよ く、 直 接的または間接的に標識したリ ガン ド との特異的結合に よって検出 してもよい。 適当な標識、 並びにプローブお よびリ ガン ド を標識する方法は、 本発明の従来技術と し て知 られてお り、 例えばニッ ク ， ト ラ ンス レーショ ン、 ラ ンダム · プライ ミ ングム、 キナーゼ処理のよ う な既知 の方法によって取り込ませる こ とができる放射性標識、 ピオチン、 蛍光性基、 化学発光基、 酵素、 抗体などがこ れらの技術に包含される。

検出のために用いる P C R法と しては、 例えば R T — P C R法が例示されるが、 当該分野で用い られる種々 の 変法を適応する こ とができる。

また、 上記測定方法は、 試料中の L Y 6 H遺伝子の検 出のための試薬キッ ト を利用する こ とによって、 簡便に 実施する こ とができる。

故に、 本発明は本発明遺伝子の D N A断片を含有する L Y 6 H遺伝子の検出用試薬キッ ト をも提供する。

該試薬キッ トは、 少なく と も配列番号 ： 2 に示される 塩基配列も し く はその相補的塩基配列の一部または全て にハイ ブリ ダイ ズする D N A断片を必須構成成分と して 含んでいれば、 他の成分と して、 標識剤、 P C R法に必須な試薬 (例えば、 T a q D N Aポ リ メ ラーゼ、 デォキ シヌ ク レオチ ド三リ ン酸、 プライマ一など） が含まれて いてもよい。

標識剤 と しては、 放射性同位元素または蛍光物質な ど の化学修飾物質などが挙げられるが、 D N A断片自身が 予め該標識剤でコ ンジュゲー ト されていてもょレ 更に 当該試薬キッ ト には、 測定の実施の便益のために適当な 反応希釈液、 標準抗体、 緩衝液、 洗浄剤、 反応停止液な どが含まれていてもよい。

更に本発明は、 前記測定方法を用いる神経変性疾患の 診断方法および該方法に用いる診断剤並びに診断用キ ッ ト を も提供する ものである。

また、 前記方法を用いる こ とによ り、 被検試料中か ら 得 られた L Y 6 H遺伝子の配列を直接的若し く は間接的 に配列決定する こ とによ り、 野生型 L Y 6 H遺伝子と相 同性の高い相同物である新たな L Y 6 H遣伝子に関連す る関連遺伝子を見出すこ とができる。

従って、 本発明はかかる測定と被検試料中の L Y 6 H 遺伝子の配列決定によ り、 被検試料中の ヒ ト L Y 6 H遺 伝子に関連する関連遺伝子のス ク リ ーニング方法をも提 供する ものである。

また、 本発明 ヒ ト L Y 6 H'遣伝子によ り コー ド される - 蛋白質 （配列番号 ： 1 で示されるアミ ノ酸配列のポ リ べ プチ ド） または該配列番号 ： 1 において 1 も し く は数個 のア ミ ノ酸が欠失、 置換または付加されたア ミ ノ酸配列 のポ リ ペプチ ド或いはこれらの断片を利用 し、 また これ ら各蛋白質に対する抗体を利用すれば、 野生型 L Y 6 H および /または変異 L Y 6 Hの測定が可能となる。

従って、 本発明は、 野生型 L Y 6 Hおよびノまたは変 異 L Y 6 Hの抗体測定法または抗原測定法を提供する も のである。 該測定法によって脳神経の障害の程度を野生 型 L Y 6 H (ポ リ ペプチ ド） の変化に基づいて検出する こ と も可能である。 かかる変化は、 この分野における前 記慣用技術による L Y 6 Hの配列の分析によっても検出 でき、 更に好ま し く は、 抗体 （ポ リ ク ロ一ナルまたはモ ノ ク ロ一ナル抗体）を甩いて、 L Y 6 Hポ リ ペプチ ド中の相 違または L Y 6 Hポ リ ペプチ ドの有無を検出する こ とに よって検出できる。

上記野生型および または変異 L Y 6 Hの測定の具体 的な例を次に述べる。 即ち、 L Y 6 H抗体は、 血液 ' 血 清などの ヒ ト よ り採取した生体材料試料含有溶液か ら L Y 6 Hポ リ ペプチ ド を免疫沈降し、 かつポ リ アク リ ルァ ミ ドゲルのウエスタ ン · ブロ ッ ト またはィ ムノ ブロ ッ ト 上で L Y 6 Hポ リ ペプチ ド と反応する こ とができる。 ま- た、 L Y 6 H抗体は、 免疫組織化学的技術を用 いてパラ フ ィ ンまたは凍結組織切片中の L Y 6 Hポ リ ペプチ ド を 検出する こ とができる。 抗体産生技術および精製する技 術は当該分野においてよ く 知 られているので、 これらの 技術を適宜選択する こ とができる。

野生型 L Y 6 Hまたはその突然変異体を検出する方法 に関連するよ り好ま しい具体例には、 モノ ク ロ一ナル抗 体および/またはポ リ ク ローナル抗体を用いるサン ドィ ツチ法を含む、 酵素結合ィ ム ノ ソルベン ト ア ツセィ

(E L I S A), 放射線免疫検定法（R I A)、 免疫放射線 検定法 （ I R M A)および免疫酵素法（ I E M A)が含まれ る。

また、 本発明は L Y 6 Hポ リ ペプチ ド に対する結合活 性を有する細胞膜画分または細胞表面上に存在する

L Y 6 H レセプ夕一乃至 L Y 6 Hに対する リ ガン ドを も 提供する こ とが可能である。 L Y 6 H レセプ夕一の取得 は、 細胞膜画分を含む生体材料試料中において標識した L Y 6 Hポ リ ペプチ ド をコ ンジユゲー 卜 させ、 結合反応 物を抽出 ， 単離、 精製し、 単離物のア ミ ノ酸配列を特定 する こ と によっ て達成される。 該 L Y 6 Hレセプターボ リ ペプチ ドの取得並びに配列決定は、 この分野の当業者 にと り 自明である。 - また本発明は、 L Y 6 Hレセプ夕一結合反応物または その結合断片を種々の薬剤のいずれかをスク リ ーニング する技術に用いる こ とによって、 化合物 （L Y 6 Hレセプ 夕一反応物 ： 化合物は低分子化合物、 高分子化合物、 蛋 白質、 蛋白質部分断片、 抗原、 または抗体な ど言う）をス ク リ ーニングする こ とができる。 好ま し く は、 L Y 6 H レセプ夕一を利用する。 かかるスク リ ーニング試験に用 いる L Y 6 Hレセプ夕一ポ リ ペプチ ドまたはその断片は、 固体支持体に付着させるかまたは細胞表面に運ばれてい る溶液中の遊離物であってもよい。

薬剤スク リ ーニングの一例と しては、 例えば L Y 6 H ポ リ ペプチ ド またはその断片を発現する組換え蛋白質で 安定して形質転換した原核生物または真核生物の宿主細 胞を、 好ま し く は競合的結合ア ツセィ において利用する こ とができる。 また遊離のまたは固定した形態のかかる 細胞を標準結合アツセィ に用いる こ と もできる。 よ り 具 体的には、 L Y 6 Hレセプターポ リ ペプチ ド またはその 断片と、 試験する物質との間の複合体の形成を測定し、 L Y 6 Hレセプターポ リ ペプチ ド またはその断片と L Y 6 Hポ リ ぺブチ ド またはその断片との間の複合体の 形成が試験する物質によって阻害される程度を検出する こ と によっ て化合物をスク リ ーニングする こ とが可能で ある。

か く して、 本発明は、 当該分野で既知の方法によって、 かかる物質と L Y 6 Hレセプ夕一ポ リ ペプチ ドまたはそ の断片 と を接触させ、 次いで、 該物質 と L Y 6 Hレセプ ターポ リ ペプチ ド またはその断片との間の複合体の存在、 または L Y 6 Hレセプターポリ ペプチ ド またはその断片 と リ ガン ド との間の複合体の存在について測定する、 薬 剤のスク リ ーニング方法を提供する こ とができる。 さ ら に、 L Y 6 Hレセプター活性を測定して、 かかる物質が L Y 6 H レセプターを阻害でき、 かく して上記定義され た L Y 6 Hの活性、 例えば神経細胞の成長を調節できる か どうか或いは蛋白 —蛋白相互結合の調節または複合体 形成能の調節ができるかどうかを判断できる。 かかる競 合結合ア ツセィ においては、 よ り 具体的には、 L Y 6 H レセプ夕一ポ リ ペプチ ドまたはその断片を標識する。 遊 離の L Y 6 Hレセプ夕一ポリ ペプチ ド またはその断片を、 蛋白質 ： 蛋白質複合体で存在する ものか ら分離し、 遊離 (複合体未形成） 標識の量は、 各々、 試験される因子の L Y 6 H レセプ夕一に対する結合または L Y 6 Hレセプ 夕一 ： L Y 6 Hポ リ ペプチ ド結合の阻害の尺度となる。 L Y 6 Hポ リ ペプチ ドの小さなペプチ ド （ペプチ ド疑似体） を このよ う に分析し、 L Y 6 Hレセプ夕一阻害活性を有- する ものを測定できる。

本発明において、 薬剤ス ク リ ーニングのための他の方 法は、 L Y 6 H レセプ夕一ポ リ ペプチ ド に対して適当な 結合親和性を有する化合物についてのス ク リ ーニング法 であって、 該略する と、 多数の異なるペプチ ド試験化合 物をプラスチッ クの ピンまたは他の物質の表面の ごとき 固体支持体上で合成し、 次いでペプチ ド試験化合物を L Y 6 Hレセプターポリ ペプチ ド と反応させ、 洗浄し、 次いで既知の方法を用いて反応結合 L Y 6 Hレセプ夕一 ポ リ ペプチ ド を検出する方法を例示できる （ P C T特許 公開番号 ： W 0 8 4 — 0 3 5 6 4号） 。 精製された

L Y 6 H レセプ夕一は、 直接、 前記の薬剤スク リ 一ニン グ技術で使用するプレー ト上に被覆する こ とができる。 ポ リ ぺプチ ド に対する非一中和抗体を用 いて抗体を補足 し、 L Y 6 Hレセプ夕一ポ リ ペプチ ドを固相上に固定す る こ とができる。

さ ら に本発明は、 競合薬剤ス ク リ ーニングア ツセィ の 使用をも 目的とする。 これによれば、 L Y 6 H レセプ夕 一ポ リ ぺプチ ド またはその断片に対する結合性につき、 L Y 6 Hレセプ夕一ポ リ べプチ ド に特異的に結合できる 中和抗体と試験化合物とを競合させる。 抗体による該競 合によっ て、 L Y 6 Hレセプ夕一ポ リ ペプチ ドの 1 また- はそれ以上の抗原決定部位を有する いずれのぺプチ ドの 存在を も検出する こ とが可能である。

また、 薬剤スク リ ーニングに関 し、 更なる方法と して、 本発明の L Y 6 Hポ リ ペプチ ドまたは L Y 6 H遣伝子発 現産物は、 本発明 L Y 6 Hポ リ ペプチ ド または L Y 6 H 遺伝子発現産物の活性を活性化 （ァゴニス ト） または阻 害 （アン夕 ゴニス ト または阻害剤という ） する化合物の スク リ ーニングに用いる こ とができる。

本発明の L Y 6 Hポ リ ぺプチ ドまたは L Y 6 H遺伝子 発現産物を用いて、 例えば細胞、 無細胞調製物、 化学ラ イ ブラ リ ーおよび天然物の混合物か らァゴニス 卜 または ア ン夕 ゴニス ト を同定するのに用いる こ と もできる。 こ れらのァゴニス ト またはア ン夕ゴニス 卜 は、 本発明の L Y 6 Hポ リ ペプチ ドの天然または修飾基質、 リ ガン ド、 酵素、 レセプターなどであってもよ く、 あるいは本発明 のポ リ ペプチ ドの構造的または機能的を模倣物であって もよレ、 （Coliganら、 Current Protocols in Immunology 1 (2) Chapter 5 ( 1991) を参照） 。

本発明 L Y 6 H遺伝子は、 イ ン · サイ ト · ハイ ブリ ダ ゼ一シ ョ ン （i n situ hybr i d i zat i on)によ り、 ヒ ト正常脳 の各組織において発現が確認されたが、 アルツハイ マー 病患者で特に大きな障害を受ける海馬や嗅内皮質 - (entorhinal c o r t ex)で強い発現が見られ、 また、 ァルツ ハイ マー病患者の海馬や嗅内皮質を含む側頭葉において、 その発現の顕著な減少が認め られた こ とよ り、 この病気 の発症や進行などに関与している可能性が高い こ とが判 明 した。

したがっ て、 この L Y 6 H蛋白質または L Y 6 H遺伝 子発現産物に対するァゴニス トやアン夕ゴニス ト は、 ァ ルツハイ マー病、 アルツハイ マー型痴呆症、 脳虚血、 パ —キンソ ン病などの神経変性疾患の治療薬および予防薬 と して期待できる。

上記 L Y 6 H遺伝子に関連する各種疾病に対する医薬 候補化合物のスク リ ーニングによって得 られる化合物は、 本発明蛋白質 （本発明遺伝子発現産物） の機能、 例えば、 中枢神経系などにおける神経生存維持作用、 神経伸長作 用や神経再生作用、 グリ ア細胞活性化作用、 脳における 記憶形成作用などの生理活性を促進し、 それ故、 例えば アルツハイ マー病、 アルツハイ マー型痴呆症、 脳虚血、 パーキンソ ン病などの各種神経変性疾患の治療および予 防剤 と して使用できる。 このよ う に、 本発明蛋白質 （遺 伝子発現産物、 その部分ペプチ ドおよび之等の塩を含む） は、 本発明蛋白質の機能を促進する化合物のスク リ ー二 ングのための試薬と して有用である。 - 本発明は、 本発明蛋白質を用いて本発明蛋白質の機能 を促進する化合物 （以下、 本発明蛋白質の機能促進剤と 略記する場合がある） のスク リ ーニング方法をも提供す る。 よ り 具体的には、 本発明は、 （ a ) ( 1 ) 本発明蛋 白質を神経細胞または神経組織に接触させた場合と （ 2 ) 本発明蛋白質および試験化合物を神経細胞または神経組 織に接触させた場合との比較を行う こ とを特徵とする本 発明蛋白質の機能促進剤のスク リ ーニング方法、 および ( b ) ( 1 ) 本発明蛋白質を脊髄動物に投与した場合と ( 2 ) 本発明蛋白質および試験化合物を脊髄動物に投与 した場合との比較を行う こ とを特徴とする本発明蛋白質 の機能促進剤のスク リ ーニング方法を提供する。

上記スク リ ーニング方法 （ a ) は、 よ り詳し く は （ 1 ) と （ 2 ) の場合における中枢神経系などにおける神経生 存維持作用、 神経伸長作用、 神経再生作用、 グリ ア細胞 活性化作用などの生理活性を測定して比較する。 また、 上記スク リ ーニング方法 （ b ) は、 よ り 詳し く は （ 1 ) と （ 2 ) の場合における脳の記憶形成作用などを測定し て比較する。 上記において神経細胞 （神経細胞および神経膠細胞） と しては、 ニューロブラス トーマ、 ダリ オ一マ細胞また はその雑種細胞 （例、 N 1 8 T G— 2、 I M R— 3 2、 - G O T O (例、 G O T O— P 3 ) 、 N B 1、 C 6 B U— 1、 U 2 5 1、 K N S 4 2、 K N S 8 1、 N G 1 0 8 - 1 5細胞、 神経への分化能をもつ P C 1 2細胞な ど） な どが用い られる。 神経組織と しては、 マウス神経上皮細 胞、 ラ ッ ト海馬初代培養細胞、 マウス胎児培養プルキン ェ細胞、 マウス後根神経節などが用い られる。 試験化合 物と しては、 ペプチ ド、 蛋白、 非ペプチ ド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物 組織抽出液、 血漿などが挙げられ、 これら化合物は新規 な化合物であってもよい し、 公知の化合物であってもよ い。

上記ス ク リ ーニング方法 （ a ) を実施する には、 本発 明蛋白質 （その部分ペプチ ド またはその塩を含む） を、 スク リ ーニングに適した緩衝液に溶解または懸濁する こ とによ り 本発明蛋白質の標品を調製する。 緩衝液には、 本発明蛋白質と神経細胞 · 組織との接触を阻害 しない緩 衝液 （例えば p H約 4〜 1 0、 望ま し く は p H約 6 〜 8 ) の リ ン酸緩衝液、 ト リ ス ー塩酸緩衝液など） がいずれも 利用できる。 接触時間は、 通常約 1 日 〜 1 0 日、 好ま し く は約 7 日 〜 1 0 日 である。 接触温度は、 通常約 3 7 °C である。 本発明蛋白質の中枢神経系な どにおける神経生 存維持作用、 神経伸長作用、 神経再生作用、 グリ ア細胞- 活性化作用は、 視覚的神経軸索の伸長の測定、 細胞内 C a ² +濃度の変化の測定な どの常套手段によ り 測定する こ とができる。

上記 （ 2 ) の場合における神経生存維持作用、 神経伸 長作用、 神経再生作用、 グリ ア細胞活性化作用などの生 理活性を、 上記 （ 1 ) の場合に比べて約 2 0 %以上、 好 ま し く は約 3 0 %以上、 よ り好ま し く は約 5 0 %以上、 さ ら に好ま し く は 7 0 %以上促進する試験化合物が、 本 発明蛋白質の機能促進剤と して選択できる。 、

上記スク リ ーニング方法 （ b ) を実施する には、 本発 明蛋白質またはこれと試験化合物とを、 静脈注射、 皮下 注射、 筋肉注射、 経口投与などによ り 供試動物に投与す る。 本発明蛋白質の投与量は、 経口投与の場合、 一般に 哺乳動物 （体重 5 0 k g と して） 一匹、 一日 当た り約 0. 1 〜 1 0 0 m g、 好ま し く は約 1. 0 〜 5 0 m g、 よ り好ま し く は約 1. 0〜 2 0 m gである。 非経口的投与 の場合、 その 1 回投与量は、 投与対象、 投与方法などに よっても異なるが、 例えば注射剤形態では、 通常哺乳動 物 （体重 5 0 k g と して） 一匹、 一日 当た り約 0. 0 1 〜 3 0 m g程度、 好ま し く は約 0. l 〜 2 0 m g程度、 よ り好ま し く は約 0. l 〜 1 0 m g程度を静脈注射によ り 投与するのが好都合 ある。 - 供試動物と しては、 例えばヒ ト、 サル、 チンパ ンジー、 マウス、 ラ ッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィ ヌ などの哺乳動物のほか、 魚類 （例えばコィ、 サケ、 二シン、 ニジマス、 金魚など） な どが用 い られる。 本発明蛋白質の脳における記憶形成作用 は公知の方法、 例えばモ一 リ スの水迷路実験 〔 Morris, R. G. . , J.

Neurosci. Meth, . U, 47-60 (1984) などに従って測定す る こ とができる。 例えば上記 （ 2 ) の場合における記憶 形成作角が上記 （ 1 ) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ま し く は 5 0 %以上、 よ り好ま し く は 7 0 %以上促進 される試験化合物は、 本発明蛋白質の機能促進剤と して 有効である。

また、 本発明の別の態様であるスク リ ーニング用キ ッ 卜 は、 本発明蛋白質 （遺伝子発現産物、 その部分べプチ ド、 それらの塩を含む） を必須の試薬成分と して含有す る。 本発明スク リ ーニング用キッ トの例 と しては、 次の 構成 1 〜 4か らなる ものが挙げられる。

構成 1 ： 測定用緩衝液ハンクス液、

構成 2 ： 蛋白質標品 （本発明蛋白質またはその塩） 構成 3 ： 神経細胞または神経組織 （前記した神経細胞ま たは神経組織を 1 0 ⁴細胞 ウエルでイ ーグル M E M、 ノヽ ンクス液などを用いて 2 4穴プレー トで 5 %炭酸ガス下マ 3 7 °Cで培養したもの） および

構成 4 ： 観察のための検出用倒立顕微鏡

上記ス ク リ ーニング用キッ ト を利用 したス ク リ 一ニン グは以下の如く して実施できる。

〔測定法〕

試験化合物を加えたゥエルの単位視野あた り の神経軸 索を伸ばしている細胞数をカ ウ ン ト し、 試験化合物を加 えていないコ ン ト ロールゥエルの単位視野あた り の神経 軸索を伸ばしている細胞数との有意差検定を行う。

さ ら に本発明のスク リ ーニング方法またはスク リ ー二 ング用キッ ト を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えばペプチ ド、 蛋白、 非べプチ ド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植 物抽出液、 動物組織抽出液などか ら選ばれた化合物であ り、 本発明蛋白質の機能を促進する化合物である。 本発 明の蛋白質などの機能を促進する化合物は、 それ自体が 中枢神経系な どにおける神経生存維持作用、 神経伸長作 用や神経再生作用、 グリ ア細胞活性化作用などの生理活 性を示すこ とによって、 本発明の蛋白質などの機能を相 加的にまたは相乗的に促進する こ と もある し、 あるいは、 それ自体は該生理活性を示さないが、 本発明蛋白質の機 能を促進する作用 を奏する こ と もある。 該化合物の塩と- しては、 生理学的に許容される塩基 （例、 アルカ リ 金属） や酸 （例、 有機酸、 無機酸） との塩が挙げられる。 と り わけ生理学的に許容される酸付加塩が好ま しい。 このよ う な塩と しては、 例えば無機酸 （例えば塩酸、 リ ン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩ある いは有機酸 （例えば酢酸、 ギ酸、 プロ ピオン酸、 フマル酸、 マ レイ ン酸、 コノヽク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リ ンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メ タ ン スルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩が挙げられる。 本発明蛋白質の機能を促進する化合物またはその塩は、 例えばアルツハイ マー病、 アルツハイ マー型痴呆症、 脳 虚血、 パーキンソ ン病などの各種神経変性疾患に対する 安全で低毒性な治療および予防剤と して有用である。

前記ス ク リ ーニング操作は、 L Y 6 Hポ リ ペプチ ド を 細胞表面に発現するかまたは本発明蛋白質に応答する細 胞の使用 を含んでいる。 かかる細胞には、 哺乳動物、 酵 母、 Drosophi または E. col i由来の細胞が包含される。 ついで、 L Y 6 Hポリ ペプチ ド （または発現したポ リ べ プチ ド を有する細胞膜） を発現するかまたは L Y 6 Hポ リ ペプチ ド に応答する細胞を、 試験化合物と接触させて 結合または機能的応答の刺激も し く は阻害を観察する。 L Y 6 H活性について、 候補化合物と接触させた細胞の 能力を接触させない同 じ細胞と比較する。 - 上記ア ツセィ は、 候補化合物に直接または間接的に結 合した標識を用いて、 あるいは標識競争物質との競争を 用 いる ア ツセィ において、 L Y 6 Hポ リ ペプチ ド を有す る細胞への付着を検出する こ とによ り 実施できる。 かく して、 候補化合物の結合を簡単に試験する こ とができる。 さ ら に、 候補化合物が L Y 6 Hポ リ ペプチ ドの活性化に よ り発生するシグナルを生じるかどう かを、 L Y 6 Hポ リ ペプチ ドを有する細胞に適した検出系を用 いて、 これ ら のア ツセィ によ り試験してもよい。 活性化の阻害剤は、 一般に、 既知ァゴニス トの存在下でア ツセィ され、 候補 化合物の存在がァゴニス ト による活性化に及ぼす作用 を 観察する。 さ ら に、 アツセィ は、 簡単に、 候補化合物と L Y 6 Hポ リ ペプチ ドを含む溶液を混合して混合物を形 成させ、 混合物中の L Y 6 H活性を測定し、 混合物の L Y 6 H活性を標準と比較する工程を含んでいてもよい。

L Y 6 H蛋白質に結合する低分子化合物 （ァゴ二ス ト やア ン夕 ゴニス ト） は、 B I A C O R E 2 0 0 0 などを 用 いるスク リ 一ニングによって得る こ とができる （Mark gren, P.0. , e t a 1. , Analytical Biochemistry, 265, 340-350 (1998) ) 。

また本発明によれば、 よ り活性または安定した形態の L Y 6 Hポ リ ペプチ ド誘導体または例えばイ ン · ビポ - (in vivo)で L Y 6 Hポリ ペプチ ドの機能を高めるかも し く は妨害する薬剤を開発するために、 それらが相互作用 する 目的の生物学的に活性なポ リ ペプチ ド またはその構 造的アナロ グ、 例えば L Y 6 Hァゴニス ト、 L Y 6 Hァ ン夕 ゴ二ス ト、 L Y 6 Hイ ンヒ ビ夕一な どを作製する こ とが可能である。 前記構造的アナロ グは、 例えば L Y 6 Hポ リ ペプチ ド と他の蛋白質の複合体の三次元構造を X 線結晶学、 コ ン ピューター · モデリ ングまたはこれら を 組合わせた方法によって決定する こ とができる。 また、 構造的アナロ グの構造に関する情報は、 相同性蛋白質の 構造に基づく ポ リ ペプチ ドのモデリ ングによっても得る こ とが可能である。

上記によ り、 活性なまたは安定した形態の L Y 6 Hポ リ ペプチ ド誘導体を得る方法と しては、 例えばァラニン • スキャ ンによって分析する こ とが可能である。 該方法 はアミ ノ酸残基を Alaで置換し、 ペプチ ドの活性に対する その影響を測定する方法でペプチ ドの各アミ ノ酸残基を このよ う に分析し、 当該ペプチ ドの活性や安定性に重要 な頜域を決定する方法である。 該方法によって、 よ り活 性なまたは安定な L Y 6 Hポリ ペプチ ド 導体を設計す る こ とができる。

また機能性ア ツセィ によって選択した標的一特異的抗ー 体を単離し、 次いでその結晶構造を解析する こ と も可能 である。 原則と して、 このアプローチによ り、 続く 薬剤 の設計の基本となる フ ァーマコア （pharmacore)を得る。 機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗ーィディ オタ イ ブ抗体を生成させる こ と によって、 化学的または生物 学的に生成したペプチ ドのバンク よ り ペプチ ド を同定し た り単離した りする こ とが可能である。 故に選択された ペプチ ド も フ ァーマコアと して作用できる と予測される。

かく して、 改善された L Y 6 H活性も し く は安定性ま たは L Y 6 H活性のイ ンヒ ビ夕一、 ァゴニス ト、 ア ン夕 ゴニス トなどと しての作用を有する薬剤を設計 · 開発す る こ とができる。

かかる薬剤は、 海馬ニューロ ンの初代培養細胞を用い、 その生存維持に対する影響を調べる こ と によ り （ Japan.

J. Pharmaco 1. 53, 221 -227 ( 1990) ) 、 また変異べ一夕ァ ミ ロイ ド前駆蛋白質遺伝子ある いは変異プレセニ リ ン 1 遺伝子の ト ラ ンス ジエニッ クマウス （Nature, 373,

523-527 ( 1995) ： Nature Med. , 5, 560-564 ( 1999) ) な どのアルツハイ マー病モデル動物の神経病変に及ぼす影 響を調べる こ とによ り 評価できる。

このよ う に して得 られた化合物はアルツハイ マー病の みな らず、 脳梗塞その他の神経変性疾患治療薬と して 利用可能である。

また本発明によれば、 L Y 6 H遺伝子含有ノ ッ ク ァゥ ト 'マウス （変異マウス）を作成する こ と によって L Y 6 H 遺伝子配列の どの部位が生体内で上記したよ う な多様な L Y 6 H活性に影響を与えるのか、 即ち L Y 6 H遺伝子 産物、 並びに改変 L Y 6 H遺伝子産物が生体内でどのよ う な機能を有するのかを確認する こ とができる。

該方法は、 遺伝子の相同組換え体を利用 して、 生物の 遺伝情報を意図的に修飾する技術であ り、 マウスの胚性 幹細胞（ E S細胞）を用いた方法を例示できる

( Capeccch i, M. R. , Science, 144. 1288- 1292 ( 1989))。 尚、 上記変異マウスの作製方法はこの分野の当業者に とって既に通常の技術であ り、 この改変技術 （野田哲生編、 実験医学，増刊， (20) ( 1996)、 羊土社）に、 ヒ ト野性 型 L Y 6 H遺伝子および変異 L Y 6 H遺伝子を適応して 容易に変異マウスを作製し得る。 従って前記技術の適応 によ り、 改善された L Y 6 H活性も し く は安定性または L Y 6 H活性のイ ン ヒ ビ夕一、 ァゴニス ト、 ア ンタ ゴニ ス トなどと しての作用を有する薬剤を設計 · 開発する こ とができる。

図面の簡単な説明

第 1 図は、 アルツハイ マー病患者脳の各部位における L - Y 6 H遺伝子の発現状況を示すノ ーザンプロ ッ ト解析図 である。

発明を実施するための最良の形態

以下、 本発明を更に詳し く 説明するため、 実施例を挙 げる。

実施例 1

( 1 ) ヒ 卜 L Y 6 H遺伝子のク ロ一ニングおよび D N A シ一ク ェンシンク

ヒ ト胎児脳よ り抽出 した m R N Aをク ローンテッ ク社 よ り購入して出発材料と した。 上記 m R N Aよ り

c D N Aを合成し、 ベクター λ Ζ Α Ρ ΙΙ (ス ト ラ 夕ジ一 ン社製） に挿入し、 c D N Aライ ブラ リ 一を構築した

(大塚 G E N リ サ一チ * イ ンスティ チュー ト、 大塚製薬 株式会社） 。 イ ンビポ · エキシジョ ン法 （ in vivo excision: Short, J. M. , e t a 1. , Nucleic Acids Res. , 16, 7583-7600 ( 1988)) によ って寒天培地上に ヒ ト遺伝 子を含む大腸菌コ ロニーを形成させ、 ラ ンダムにそのコ ロニ一を ピッ ク ア ッ プし、 9 6 ウェルマイ ク 口 プレー ト に ヒ ト遺伝子を含む大腸菌ク ロー ンを登録した。 登録さ れたク ローンは、 — 8 0 °Cにて保存した。

次に登録した各ク ローンを 1. 5 m 1 の L B培地で一 昼夜培養し、 プラス ミ ド 自動抽出装置 P I — 1 0 0 (ク— ラポゥ社製） を用 いて D N Aを抽出精製した。 尚、 コ ン タ ミ した大腸菌の R N Aは、 R N ase処理によ り分解除去 した。 最終的に 3 0 1 に溶解し、 2 1 はミ ニゲルに よ り おおまかに D N Aのサイ ズおよび量をチェ ッ ク した。 その 7 a 1 をシークェンス反応に用レ 残り の 2 1 a 1 は、 プラス ミ ド D N Aと して 4 °Cに保存 した。 また、 こ の方法は若干のプログラム変更によって後記に示される F I S H ( f 1 uoresence in si tu hyb r i d i z a t i on; のプロ —ブ用 と しても使用可能なコ ス ミ ド を抽出する こ とがで きる。

続いて T 3、 Τ 7 或は合成オ リ ゴヌ ク レオチ ド · ブラ イ マ一を用いるサンガー らのジデォキシ夕一ミ ネ一ター 法 ( Sanger, F. , e t al. , Pr oc. Nat 1. Acad. Sc i. , USA. , 74, 5463-5467 (1977) ) 或はジデォキシターミ ネ一夕一 法に P C R法を加味した方法であるサイ クルシークェン ス法 (Carothers, A. M. , e t a 1. , Bio. Techniques, 7, 494-499 (1989) ) を実施した。 之等の方法は少量のブラ ス ミ ド D N A (およそ 0. 1 — 0. 5 i g ) をテンプレ ー ト （铸型） と して 4種の塩基を特異的に停止する伸長 反応させる方法である。

シークェンスプライ マーと して F I T C (f luorescein isothiocyanate)蛍光標識したものを使用 し、 T a q ポ- リ メ ラーゼによ り約 2 5 サイ クル反応させた。 蛍光標識 した D N A断片につき、 自動 D N Aシークェンサ一、

A L F ^TMD N Aシークェンサ一 （フ アルマシア社製） に よ り c D N Aの 5 ' 末端側か ら約 4 0 0 塩基の配列を決 定した。

3 ' 非翻訳頜域は、 各遺伝子の異質性（heterogenei ty) が高く、 個々 の遺伝子を区別するのに適しているので、 場合によっ ては、 3 ' 側のシークェンス も行っ た。

D N Aシークェンサ一で得られた膨大な塩基配列情報 を、 6 4 ビッ トのコ ン ピュータ一 D E C 3 4 0 0 に転送 し、 コ ン ビユタ一によるホモロ ジ一解析を行っ た。 該ホ モロ ジ一解析は、 1 ¥ 0 〇 0の ？ 八 3 丁八 (Pearson, W. R. and L i praan, D. J. , Proc. Nat l. Acad. Sc i. , USA. ,

, 2444-2448 (1988) ) によるデ一夕べ一ス ( GenBank, EMBL) 検索によ り行っ た。

ヒ ト胎児脳 c D N Aライ ブラ リ ーについての上記解析 方法は、 藤原 ら 〔Fuj iwara, T. , et al. , DNA Res. , 2, 107-111 (1991) ) に詳述されている。

上記と同様な方法で、 構築されたヒ ト胎児脳 c D N A ライ ブラ リ 一か ら無作為に選択した E S T s (expressed sequence t ags：発現遺伝子断片の部分 D N A配列）の配 列決定を実施した。 -

F A S T Aによる Gene Bankと E M B Lの配列検索の中 で、 G E N— 4 2 5 D 0 1 と命名 したク ローンが、 マウ ス L y 6 フ ア ミ リ ー蛋白質をコー ドする遺伝子と高い相 同性を示すこ とを発見した。

テンプレー ト （铸型） と してべク タ一 （pBluescript vector: ス ト ラタジ一ン社製 （ Stratagene) ) 内に挿入さ れたニ本鎖 D N Aと、 プライ マ一と しての合成オ リ ゴヌ ク レオチ ド とを使用 して、 サンガー らのジデォキシ * チ エーン ， タ—ミ ネエーシヨ ン法によって、 上記ク ロ一ン の有する全コ一 ド領域を含む c D N Aの塩基配列を決定 した。

上記で得られたク ローンの c D N A配列は、 A B I

P R I S M T M 3 7 7 自動 D N Aシークェンサ一による 配列決定の結果、 4 2 0塩基の推定アミ ノ酸翻訳領域を 含んでお り、 これによつてコー ドされるア ミ ノ酸配列は、 1 4 0 ア ミ ノ酸残基を有し、 全長 c D N Aク ローンの核 酸配列は、 8 5 4塩基か らなっ ていた。 その全配列は、 配列番号 ： 3 に示す通 り であ り、 オープン · リ 一ディ ン グ · フ レームの核酸配列は配列番号 ： 2 に、 該酸配列で コ一 ド されるアミ ノ酸の推定アミ ノ酸配列は配列番号 ： 1 に示す通 り であった。

他の L y 6 フ ァ ミ リ 一蛋白質と本ヒ ト L Y 6 Hとのァー ミ ノ酸配列を比較検討し、 またア ミ ノ酸翻訳開始領域に 保存されている塩基配列 （Kozak, M.， J. Biol. Chem. , 266, 19867- 19870 ( 1991 )) と該ヒ ト L Y 6 H遺伝子の 5 ' 領域の比較よ り決定された開始コ ド ンは、 配列番号 ： 3 の塩基配列の 2番号の A T G ト リ プレ ツ トである 9 9 — 1 0 1 番目 に位置していた。 また、 ポ リ アデニ レ一シ ヨ ン · シグナル （ A A T A A A ) は、 同塩基配列番号の 8 3 2 - 8 3 7番目 に位置していた。

( 2 ) ノ ーザンブロ ッ ト分析

組織における L Y 6 Hの発現プロ フ ァイ ルを調べるた め、 各種の ヒ ト組織を用いた ノ ーザンプロ ッ ト分析を行 つた。

ノ ーザン · ブロッ ト分析には、 ヒ ト M T N (Multiple — Tissue Northern) ブロ ッ ト I と II (ク ロ一ンテッ ク社 製） を使用 した。

c D N A断片は、 T 3 と T 7 プロモ一夕一配列のプラ イ マ一 · セッ ト を用レ 、 P C Rによって増幅した。

上記 G E N— 4 2 5 D 0 1 c D N Aク ローンの P C R 増幅産物を [ ³²P ] — d C T P (ラ ンダムプライ ム ド D N Aラベ リ ングキッ ト、 ベ一 リ ンガーマ ンハイ ム社） によ り 標識してプローブと した。

増幅産物を含むプロ ッ ト をプレハイ ブリ ダィ ズ （条件- は製品のプロ ト コールに従った） し、 そしてそれか ら製 品のプロ ト コールに従い、 ハイ ブリ ダィゼーシヨ ンを行 つ た。

ハイ ブリ ダィ ゼ一シヨ ンは、 6 5ででー晚、 1 M

N a C l ノ 5 0 mM ト リ ス H C 1 ( p H 7. 5 ) / 2 X デンハルツ溶液 1 0 %デキス ト ラ ンサルフェー ト Z 1 % S D S溶液 （ 1 0 0 z g Zm l 変性サケ精子 D N A含 有） の溶液中で行っ た。 2 X S S C Z 0. 1 % S D S に て室温下にて 2 回洗浄後、 次いで 0. 1 X S S Cノ

0. 1 % S D S にて 6 5 °C下に 4 0分間で 1 回洗净した。 フ ィ ルタ一は一 7 0 °C下に 1 8時間、 X線フ ィ ルム （コ ダ ッ ク社製）に対して露光した。

ヒ ト成人組織と して、 脳 （brain) 、 滕臓 （Pancreas) 、 精巣 ( test is) 、 小腸 （ Smal l intestine) 、 結腸

( Colon) 、 胸腺 （Thymus) 、 前立腺 （prostate) 、 卵巣 ( Ovary) 、 心臓 （Heart) 、 睾丸 （Placenta) 、 肺

( Lung) 、 肝臓 （Liver) 、 骨格筋 （ Skeletal muscle) 腎臓 （Kidney) 、 脾臓 （ Spleen) 、 胎盤 （Test is) およ び末梢血白血球 （Peripheral blood leukocyte) を用 い て上記試験を行っ た結果、 L Y 6 Hに相同する約 1 k b の転写体が、 脳 （brain) 、 脬臓 （Pancreas) 、 精巣

( tes t is) 、 小腸 （Smal l intestine) 、 結腸 （Colon) マ 胸腺 （Thymus) 、 前立腺 （prostate) および卵巣

(Ovary) 、 特に脳において強く 観察された。

( 3 ) F I S Hによる コス ミ ド · ク ローンと染色体の局 染色体の整列のための F I S Hは、 公知の方法

(Takahash i E.， e t al. , Hum. Genet. , 86, 14-16 (1990) ) に従っ て、 各コス ミ ド D N Aの 0. をプローブと して使用 して実施した。 F I S Hはプロ ビア 1 0 0 フ ィ ルム （フ ジ社製、 I S O 1 0 0 ) または C C Dカ メ ラ ' システム （アプライ ド · イ メージング、 サイ ト ビジ ョ ン 社製） によって捕え られた。

その結果、 ヒ ト L Y 6 H遺伝子は、 第 8 染色体のバン ド Q 2 4. 3 上に位置する こ とが判った。 即ち G E N— 4 2 5 D 0 1 は、 染色体バン ド 8 q 2 4. 3 上にマッ プ された。

L y 6 フ ァ ミ リ ーに属する蛋白質に対する抗体は、 遺 伝子治療のターゲッ ト となる血液幹細胞の精製 （van de Ri j , M. , e t a 1. , Proc. Nat 1. Acad. Sc i. , USA. , 86- 4634-4638 (1989) ) 、 血液細胞の分化の研究 （van de Ri j n, M. , e t al. , Proc. Na 11. Ac ad. S c i . , USA. , 86, 4634-4638 (1989) ； C】 a s s o n， B. J . and Coverdal e, L. , Proc. Nat 1. Acad. Sc i. , USA. , 91, 5296- 5300 ( 1994) ) 、 - 免疫細胞の活性化 （Malek， T. R. , et al. , J. Exp. Med. , 114, 709-722 ( 1986)) 、 活性型免疫細胞の産生抑制

( Haque, A. , et al. , Immunology, 61. 558-563 (1990) ) などに利用 されてお り、 また、 抗腫瘍効果も認め られて レ、 る ( Lu, L. , et al. , J. Immunol. , 2, 719-725

(1989)〉 。 本実施例によ り提供される ヒ ト L Y 6 H遺伝 子の利用によれば、 該遺伝子の各組織での発現の検出や、 ヒ ト L Y 6 H蛋白の遺伝子工学的製造およびそれを用い た抗体の作成が可能とな り、 これによ り、 上記のよ う な 血液幹細胞の精製、 血液細胞の分化の研究、 免疫細胞の 活性化、 免疫細胞の活性化の抑制、 腫瘍の治療などが可 能となる。

また、 脳に強く 発現している L Y 6 Hは、 神経細胞の 分化の研究、 神経細胞の活性化、 神経および精神疾患の 治療も可能となる。

ヒ ト L Y 6 H蛋白質を夕ーゲッ ト と した化合物のス ク リ ーニングも可能とな り、 か く して得 られる化合物には、 抗ヒ ト L Y 6 H蛋白抗体と同様の有用性がある。

実施例 2 ( 1 ) アルツハイ マー病疾患の脳組織における ノ ーザン ブロ ッ ト分析

ノ ーザンプロ ッ ト分析は、 実施例 1 ( 2 ) に従って実- 施した。

アルツハイ マー病患者の脳組織における L Y 6 H遺伝 子の発現を調べるために、 アルツハイ マー病患者脳組織 および正常ヒ 卜能組織を用いたノーザンブロ ッ ト分析を 実施した。

ノーザンプロ ッ ト分析は、 ヒ ト正常脳プロ ッ ト I I と ヒ ト アルツハイ マーブロ ッ ト I I (いずれもイ ン ビ ト ロゲ ン社製）を用いて、 前頭葉、 側頭葉、 頭頂葉、 後頭葉、 橋、 視床、 脳梁の各種脳組織、 正常人とアルツハイ マー病患 者の脳の各組織における発現を比較した。

その結果を第 1 図に示す。

実施例 1 で示されたよ う に L Y 6 H遺伝子は脳におい て強く 発現しているが、 本分析の結果、 ヒ ト正常脳の各 組織において発現が確認されたが、 アルツハイ マー病患 者で特に大きな障害を受ける海馬や嗅内皮質

(entorhinal c o r t ex)で強い発現が見られ、 また、 ァルツ ハイ マー病患者の海馬や嗅内皮質を含む側頭葉において、 その発現の顕著な減少が認め られたこ とよ り、 この病気 の発症や進行などに関与している可能性が高い こ とが判 明 した。

したがっ て、 L Y 6 H遺伝子センス鎖、 L Y 6 H遺伝 子発現産物および L Y 6 H蛋白質は、 アルツハイ マー病 アルツハイ マー型痴呆症、 脳虚血、 パーキンソ ン病の治 療薬と して期待できる。

また、 L Y 6 H蛋白質に対するァゴニス トやアン夕ゴ 二ス ト も、 アルツハイ マー病などの治療薬と して期待で さる。

実施例 3

( 1 ) L Y 6 H発現べク 夕一の構築

イ ン ビポ · エキシジ ョ ン法によ り得 られる L Y 6 Hの c D N Aを M v l l および X h o l で切断処理して、 約 8 0 0塩基の断片を得る。 この断片は、 配列番号 ： 1 に 示される L Y 6 H遺伝子の全コー ド領域を含んでお り、 これを、 予め E c o R Vおよび X h o l で.切断した p A c 5. 1 Z V 5 — H i s A ( Invitrogen社） に挿入 して 発現ベクター （ P A C Z L Y 6 H発現ベク ター） を得る。

( 2 ) 本発明有効成分蛋白質の発現と精製

p A C / L Y 6 H発現ベクターと p C o H Y G R Oベ ク タ一 （ Invitrogen社） の D N Aを 1 9 ： 1 の比率で混 合後、 リ ン酸カルシウム法にてショ ウジ ヨ ウバエ

(Schneider 2)細胞へ導入する。 1 0 %牛胎児血清を含む D E S発現培地 ( DES Express ion Medium, Invitrogen社） で 4 8時間 2 3 °Cにて培養後、 3 0 0 gノ m 1 のハイ グロマイ シン B (Hygr omyc i n B, Boer i nger Mannheim社)" を添加 し、 薬剤耐性細胞株の選別を 2週間行う。 得 られ る安定形質導入細胞株を、 5 X 1 0 ⁶細胞 Zm 1 の細胞濃 度、 1 0 %牛胎児血清を含む 0 £ 3発現培地

(Invitrogen社） 2 0 m 1 でフ ァルコ ン 5 0 0 0

(Fal con5000)培養フ ラスコ ( Bee ton Dickinson社） 2 0 枚を用いて静置培養を行い、 細胞を回収する。 リ ン酸塩 緩衝生理食塩液 （ P B S ) で 2 回洗浄後、 2 %牛血清ァ ルブミ ン 、 フ ォスフ ァチジルイ ノ シ トール一特異的ホス ホ リ ゾ ーセ C ^phosphatidyl inositol-specific

hosphol ipase C, PIPLC社） 0. 5単位 Zm l を含む

P B S に懸濁し、 3 7 °Cで一時間培養する。 こ の培養上 清よ り、 イ オン交換カ ラム等にて、 目的蛋白質を精製す る こ とが可能である。

( 3 ) 海馬神経細胞の単離と培養

S D系ラ ッ ト 1 8 日齢胎仔よ り無菌的に全脳を取 り 出 し海馬を切 り 分ける。 メスで細切後、 0, 2 5 % 卜 リ ブ シン、 0. 0 0 2 % D N ase Iを含む P B S 中で 3 7 °C、 2 0分間イ ンキュベー ト して酵素処理する。 牛胎児血清 を添加 し酵素反応を停止させた後、 プラスチッ ク製チッ プを付けた ピぺッ 卜で細胞液を吸い上げて吐き出す操作 を 3 回繰返して、 細胞を分散させる。 レ ンズペーパーを 2枚重ねたフ ィ ルターに細胞液をろ過して消化されなカ つ た組織片を除き、 1 0 0 0 r p mで 5分間遠心する。 D M E M培地 （ギブコ社製） を用いて細胞を洗い、 1 0 %牛胎児血清を含む D M E M培地を入れたポ リ L リ ジン

( Sigma社 ) でコ一ティ ングした 9 6 ゥエルプレー ト に細 胞を最終的に 2 X 1 0 ⁵細胞ノ c m ²になる よう に播く。

( 4 ) 本発明有効成分蛋白質による処理

上記細胞を 2 4時間培養後、 培養液を 1 % N ₂添加物

(N₂ Supplement, GIBC0社製） を含む D M E Mに交換し、 上記 （ 2 ) の本発明有効成分蛋白質を添加する （本発明 群） 。

また比較のため、 沸騰水浴中で 5分間加熱処理した本 発明有効成分蛋白質添加 （沸騰蛋白質群） を行う。

( 5 ) 海馬神経細胞生存維持評価

上記 （ 4 ) で調製した各群の細胞 （培養液） を 7 2時 間培養後、 M T T [3-(4, 5-dimethyl thiazol-2-yl)-2, 5- diphenyl tetrazol ium bromide」ア ツセっ によ り、 本発 有効成分蛋白質の海馬神経細胞に対する生存維持効果を 調べる こ とができる。 この M T Tア ツセィ には、 例えば プロ メ ガ社の 「CellTiter 96」 ア ツセィ システムを用い 5039

104 て実施する こ と もできる。

( 6 ) 中脳神経細胞の単離と培褰

S D系ラ ッ ト 1 4 日齢胎仔よ り無菌的に全脳を取 り 出 - し、 中脳腹側部 （ventral midbrain) を切 り 分ける。 メ スで細切後、 0. 2 5 % ト リ プシン、 0. 0 0 2 %

D N ase Iを含む リ ン酸塩緩衝生理食塩液 （ P B S ) 中で 3 7 °C、 2 0分間イ ンキュベー ト して酵素処理する。 牛 胎児血清を添加 し酵素反応を停止させた後、 プラスチッ ク製チッ プを付けたピぺッ 卜で細胞液を吸い上げて吐き 出す操作を 3 回繰返して細胞を分散させる。 レ ンズべ一 パーを 2枚重ねたフィ ルターに細胞液をろ過して、 消化 されなかっ た組織片を除き、 1 0 0 0 r p mで 5分間遠 心する。 D M E M/ F 1 2培地 （ギブコ社製） を用いて 細胞を洗い、 1 0 %牛胎児血清を含む D M E Mノ F 1 2 培地を入れたポ リ L リ ジンでコ一ティ ングした 9 6 ゥェ ルプレー 卜 に細胞を最終的に 3 X 1 0 ⁵細胞 / c m ²にな るよ う に播く。

( 7 ) 本発明有効成分蛋白質による処理

上記 （ 6 ) で調製した細胞を 2 4時間培養後、 培養液 を 1 % N ₂添加物 （N₂ Supplement, GIBC0社製） を含む D M E MZ F 1 2 に交換し、 上記 （ 2 ) の本発明有効成 分蛋白質を添加する （本発明群） 。 また比較のため、 沸騰水浴中で 5分間加熱処理した本 発明有効成分蛋白質添加 （沸騰蛋白質群） をも行う。

( 8 ) 中脳神経細胞生存維持評価 - 上記 （ 7 ) で調製した各群の細胞 （培養液） を 7 2時 間培養後、 M T T [3-(4， 5-dimethylthiaz( -2-yl)-2, 5- d i pheny 1 t e t r az o 1 i um bromide] 7ッセィ によ り、 本発明 有効成分蛋白質の中脳神経細胞に対する生存維持効果を 調べる こ とができる。 この M T Tア ツセィ には、 例えば プロ メ ガ社の 「Cell Titer 96」 ア ツセィ システムを用い る こ とができる。

( 9 ) ドパミ ン神緙細胞生存維持評価

上記 （ 7 ) で調製した各群の細胞 （培養液） を 7 2時 間培養後、 P B S に溶解した 4 %パラホルムアルデヒ ド を用いて 1 5分間室温で放置 して細胞を固定し、 その後 1 % ト リ ト ン X I 0 0 Z P B S を用いて膜を透過させる。 抗体の非特異的な結合を防ぐために、 細胞を 1 0 %ャ ギ血清を含む P B Sで 1 時間イ ンキュベー ト し、 その後、 抗チロ シン水酸化酵素ポ リ ク ロナ一ル抗体 （CHEMIC0N社 製、 P B Sで 1 0 0 0倍希釈） を用 いて 1 6時間 4 °Cで 細胞をイ ンキュベー トする。 抗体液を除いた後、 細胞を P B Sで洗い、 ペルォキシダ一ゼ標識デキス ト ラ ンポ リ マ一結合ャギ抗ラ ビッ トィ ムノ グロブリ ン （ DAK0社製） を加えて室温で 1 時間ィ ンキュベ一 卜する。

チロ シン水酸化酵素陽性細胞の検出は、 基質と してジ ア ミ ノ ベンチジンを用いる発色反応の有無によ り 可能で - ある。 チロ シン水酸化酵素陽性細胞数を指標と して、 ド パ ミ ン神経細胞の生存維持を評価できる。

産業上の利用の可能性

本発明によれば、 新規な脳特異的遺伝子およびこれに よ り コー ド される蛋白質が提供され、 これらの利用 によ れば、 血液幹細胞の精製、 血液細胞の分化の研究、 免疫 細胞の活性化、 活性型免疫細胞の産生抑制、 腫瘍の治療 な どに有用な技術が提供される。 また、 本発明によれば、 脳組織の神経生存維持作用、 神経伸長作用、 神経再生作 用、 グリ ア細胞活性化作用、 脳における記憶形成作用な どの生理活性を有する新規な遺伝子が提供される。

本発明遺伝子は、 アルッ八イ マ一病患者の脳側頭葉に おいてその発現が著し く 減少している こ とよ り、 之等の 組織における神経変性を抑制する と考え られ、 それ故、 遺伝子治療剤 と して有用であ り、 また本発明遺伝子の発 現産物はかかる神経変性疾患に対する予防おょぴ治療剤 と して有用である。

Claims

請 求 の 範 囲

1. 以下の （ a ) または （ b ) の蛋白質をコー ドする 塩基配列を含む遺伝子 ： - ( a ) 配列番号 ： 1 で示されるア ミ ノ酸配列か らなる蛋 白質、

( b ) 配列番号 ： 1 で示されるアミ ノ酸配列において 1 または複数のア ミ ノ酸が欠失、 置換または付加された ア ミ ノ酸配列か らな り、 且つ神経生存維持作用、 神経 伸長作用、 神経再生作用、 グリ ア細胞活性化作用およ び脳における記憶形成作用か ら選ばれる少なく と も 1 種の生理作用を有する蛋白質。

2. 塩基配列が配列番号 ： 2で示される ものである請 求項 1 に記載の遺伝子。

3. 以下の （ a ) および （ b ) のいずれかのポ リ ヌ ク レオチ ドか らなる遺伝子 ：

( a ) 配列番号 ： 3で示される塩基配列を含むポ リ ヌ ク レオチ ド、

( b ) 配列番号 ： 3 で示される塩基配列か らなる D N A とス ト リ ンジェ ン トな条件下でハイ ブリ ダィ ズするポ リ ヌ ク レオチ ド。

4. ヒ ト遺伝子である請求項 1 〜 3 のいずれかに記載 の遺伝子。 -

5. 請求項 2 または 3 に記載の遺伝子を含む遺伝子発 現べク タ一。

6. 請求項 5 に記載の遺伝子発現べク タ一を含む宿主 細胞。

7. 請求項 6 に記載の宿主細胞によって発現される遺 伝子発現産物。

8. 請求項 1 に記載の遺伝子によってコー ド される蛋 白質。

9. 請求項 7 に記載の遺伝子発現産物または請求項 8 に記載の蛋白質に結合性を有する抗体。

1 0. 配列番号 ： 2 で示される塩基配列を含む遺伝子 の全部または一部の発現産物であって且つ神経生存維 持作用、 神経伸長作用、 神経再生作用、 グリ ア細胞活 性化作用および脳における記憶形成作用か ら選ばれる 少な く と も 1 種の生理作用を有する遺伝子発現産物。 1 . 請求項 8 に記載の蛋白質またはその一部のア ミ ノ酸配列か らなる同効蛋白質または請求項 1 0 に記載 の遺伝子発現産物を有効成分と し、 これを製剤学的担 体と共に含む神経変性疾患治療および予防剤。 2 . 神経変性疾患がアルツハイ マー病、 ァルツハイ マ一型痴呆症、 脳虚血およびパーキンソ ン病か ら選ば れる ものである請求項 1 1 に記載の神経変性疾患治療 および予防剤。 3 . 配列番号 ： 2 で示される塩基配列の少な く と も 2 0 個の連続するオリ ゴヌ ク レオチ ド配列か らなるセ ンス鎖オリ ゴヌ ク レオチ ド。 4 . 請求項 1 3 に記載のセンス鎖オリ ゴヌ ク レオチ ド を有効成分と し、 これを製剤学的担体と共に含む遺 伝子治療剤。 5 . 配列番号 ： 2 で示される塩基配列の少な く と も 1 0 個の連続するオリ ゴヌ ク レオチ ド配列か らなる遣 伝子特異的プローブ。

1 6 . 請求項 8 に記載の蛋白質またはその一部のア ミ ノ酸配列か らなる同効蛋白質または請求項 1 0 に記載 の遺伝子発現産物を用いる こ とを特徴とする、 之等蛋 白質または発現産物に結合するかまたは之等の活性に 影響を与える候補化合物のスク リ 一ニング方法。 1 7 . 請求項 8 に記載の蛋白質またはその一部のア ミ ノ酸配列か らなる同効蛋白質または請求項 1 0 に記載 の遺伝子発現産物の有効量を患者に投与する、 神経変 性疾患の治療および予防方法。 1 8 . 神経変性疾患がアルツハイ マー病、 ァルツハイ マ一型痴呆症、 脳虚血およびパーキンソ ン病か ら選ば れる ものである請求項 1 7 に記載の神経変性疾患の治 療および予防方法。 1 9 . 請求項 1 3 に記載のセンス鎖オリ ゴヌ ク レオチ ドの有効量を患者に投与する遺伝子治療方法。