WO2000017340A1 - Procede de production d'acide poly-3-hydroxyalcanoique - Google Patents

Procede de production d'acide poly-3-hydroxyalcanoique Download PDF

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poly
fatty acid
synthase gene
gene
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Inventor
Kazunori Taguchi
Toshiaki Fukui
Yoshiharu Doi
Original Assignee
Japan Science And Technology Corporation
The Institute Of Physical And Chemical Research
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Definitions

  • the invention of this application relates to a method for producing poly-13-hydroxyalkanoic acid, and a genetically modified organism that produces this poly-13-hydroxyalkanoic acid in large quantities. More specifically, the invention of this application relates to a method for producing a high-purity poly-3-hydroxyalkanoic acid useful as an alternative plastic or the like in a simple, large-scale, and inexpensive manner, and to a novel organism used in this method. It is. Background art
  • Poly-3-hydroxyalkanoic acid (hereinafter sometimes referred to as “P (3HA) J)” is a generic term for compounds in which two or more of 3-hydroxycarboxylic acids are repolymerized through an ester bond or the like. Yes, for example, poly-13-hydroxybutanoic acid, poly-13-hydroxyhexanoic acid, and the like.
  • a host organism such as Escherichia coli that does not accumulate P (3HA) is transformed by introducing a gene for a P (3HA) synthase derived from another organism into the host organism.
  • a method of culturing the transformant in a medium containing a carbon source such as glucose has been attempted. This is because organisms that do not accumulate P (3HA) such as Escherichia coli are considered not to accumulate P (3HA) because they do not produce the polymerizing enzyme.
  • the ability to accumulate P (3HA) in a transformant cannot be increased only by introducing a polymerizing enzyme gene into an organism that does not accumulate P (3HA), non-accumulation of P (3HA) in E. coli etc.
  • Sex is only due to the fact that the organism does not produce P (3HA) polymerase. However, it is speculated that this is due to the extremely low ability to produce 3-hydroxyacyl CoA, which is a substrate for poly-3-hydroxyalkanoate synthase. Thus, attempts have been made to introduce, into a host organism, a fatty acid synthase gene for promoting the production of 3-hydroxyacyl CoA together with the P (3HA) polymerase enzyme gene (Williams et al .: Protein Expr. Purif. 7: 203-21 1, 996).
  • a mutant gene for a fatty acid synthase derived from a rat and a poly-3-hydroxyalkanoate synthase gene derived from Alcaligenes eutrophus are introduced into insect (Spodoptera frugiperda) cells, and the cells are cultured in a medium for insect cells.
  • insect (Spodoptera frugiperda) cells As a result of culturing for 3 days, 600 mg of dry cells and 1 mg of poly-13-hydroxyalkanoic acid were successfully obtained per liter of medium.
  • the obtained P (3HA) is as small as 0.17% per dry cell weight, and is not suitable for mass production on an industrial scale.
  • the host organism was insect cells, there was a problem that required special techniques for culture.
  • the invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and solves the problems of the conventional method, and can produce high-purity P (3HA) easily, in large quantities, and at low cost. It is an object of the present invention to provide a new P (3HA) production method that can be used.
  • Another object of the invention of this application is to provide a genetically modified organism used in this production method. Disclosure of the invention
  • the present invention solves the above-mentioned problems by introducing a P (3HA) synthase gene and a fatty acid synthase gene into a host microorganism and transforming the transformed microorganism, and transforming the transformed microorganism into a carbon source.
  • the present invention provides a method for producing P (3HA), characterized in that P (3HA) is grown from the microorganism and then P (3HA) is isolated and purified from the microorganism.
  • This application also provides a transformed microorganism created by introducing a P (3HA) synthase gene and a fatty acid synthase gene into a host microorganism.
  • the preferred embodiment is that the host microorganism is Escherichia coli.
  • the fatty acid synthase gene is one or more of the genes constituting the group of fatty acid synthase genes derived from microorganisms, and that the microorganism in this case is Escherichia coli.
  • this application provides a broad host range expression vector pJRDTrd for Gram-negative bacteria as an expression vector used in the above method.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of pJ RDTrcl that can be used in the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the relationship between the inserted genes of the fatty acid synthase gene expression vector constructed in the examples.
  • genes derived from various P (3HA) accumulating organisms can be used.
  • examples of such genes include P (3HA) polymerase from Aeromonas caviae, phaCAc (Fukui et al., J. Bacteriol. 179: 4821-4830, 1997), and P (3HA) from Alcaligenes eutrophus.
  • Enzyme gene phbCAe Peoples et al., J. Biol. Chem. 262: 15298-5303, 1989
  • Polymerase gene haC IPa from Pseudomonas aeruginosa Timm et al., Eur. J. Biochem. 209: 15-30) , 1992).
  • P (3HA) synthase gene isolated from genomic DNA of any species can be used as a probe with these known genes.
  • These P (3HA) synthase genes are incorporated into an expression vector for a microorganism, and the resulting recombinant vector is introduced into a microorganism such as Escherichia coli according to a standard method. .
  • An expression vector is a known expression vector for microorganisms having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a gene cloning site, a terminator, and the like that can be replicated in a microorganism (for example, a pUC-based expression vector for Escherichia coli).
  • a pUC-based expression vector for Escherichia coli for example, a pUC-based expression vector for Escherichia coli.
  • pBluescript ⁇ , ⁇ expression system, pGEX expression system and the like can be used.
  • a plasmid vector pJRDTr FIG. 1
  • this pJRDTrcl is a novel vector constructed by combining commercially available pTrc99A and pJRD215, and the P (3HA) polymerase enzyme p / iaC ⁇ c etc. can be connected reliably.
  • the fatty acid synthase gene used in the method of the present invention is a known gene derived from a eukaryote or a microorganism. For example, fatty acid synthase gene fab (Battner et al., Science 277: 1453-1474, 1997) derived from E.
  • Such a fatty acid synthase gene (group) can be introduced into a host cell by being incorporated into a known microorganism expression vector, similarly to the P (3HA) polymerase enzyme gene.
  • the P (3HA) synthase gene expression vector and fatty acid synthase expression vector constructed as described above were prepared by the same method using known methods such as electroporation, calcium phosphate method, liposomal method, and DEAE dextran method. Introduce into host microorganism. Then, a microorganism transformed with both genes can be isolated by using drug resistance or the like of the resistance gene in the expression vector.
  • the P (3HA) can be accumulated in the microorganisms by growing the transformed microorganisms produced in the presence of a carbon source, if necessary, by inducing gene expression. it can.
  • a carbon source sugars such as glucose and fructoses, or fatty acids can be used without limitation.
  • the accumulated P (3HA) can be isolated and purified by a known method.
  • the cells are collected from the culture by centrifugation, freeze-dried, and the dried cells are decomposed with acid and methanol.
  • (3HA) can be isolated. Then, it can be purified by various types of chromatography.
  • the present invention will be described in more detail and specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
  • a P (3HA) synthase gene expression vector (Fig. 1) was constructed by incorporating the P (3HA) synthase gene (phaCAc gene derived from eramonas caviae FA440 strain) into pJ RDTrd.
  • the fatty acid synthase genes fabH, fabD, fabG, acpP and faiF genes derived from the Escherichia coli HB101 strain were successively cloned into pUC118, and as shown in FIG.
  • a fragment containing the gene, a fragment containing the fa-D, and a fragment containing the entire gene group were cut out, and each was incorporated into pBluescriptl KS (+) and the fatty acid synthase gene expression vectors (pXbH 1.0 and pEEv1. 6, pXbSacS.O) was constructed.
  • I PTG Isopropyl- ⁇ -D (-)-thiogalactopyranoside
  • glucose final concentration 10 gZ liter
  • the culture After completion of the culture, the culture is centrifuged to collect the cells, freeze-dried, and the dried cells are decomposed with ethanol, extracted with chloroform, and the P (3HA) is collected by gas chromatography. The amount and its composition ratio were detected.
  • transgenic Escherichia coli into which only the phaCAc gene had been introduced was cultured in the same manner, and the presence or absence of P (3HA) was examined.
  • the results are as shown in Table 1. From the transformed bacterium into which the P (3HA) polymerase enzyme gene and the fatty acid synthase gene group were introduced, 3HB homopolymer having 100% R-3-hydroxybutanoic acid in monomer unit was obtained. Poly_3-hydroxylactic acid was not detected in the transformed cells into which only the phaCAc gene was tested.
  • the yield of 3HB was the highest for the cells into which fabH, fabD, fabG, acpP, and all of the genes were introduced, at 10.3% per dry cell weight, followed by fabH (6.3%) and fabD (4.6%). there were.
  • the invention of this application provides a method for producing P (3HA) by a genetic engineering method, and a genetically modified organism used for the method. According to these inventions, it is possible to produce high-purity poly (3-hydroxycarboxylic acid) useful as a raw material for substitute plastics and the like simply, in large quantities, and at low cost.

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Description

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明細書 ポリ一 3—ヒ ドロキシアルカン酸の製造法 技術分野
この出願の発明は、 ポリ一 3—ヒ ドロキシアルカン酸の製造方法と、 このポリ一 3—ヒ ドロキシアルカン酸を大量に産生する遺伝子組換え生物に関するものである。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 代替プラスチック等として有用な高純度のポ リー 3—ヒ ドロキシアルカン酸を簡便かつ大量に、 しかも安価に製造する方法と、 この方法に用いる新規生物に関するものである。 背景技術
ポリ一 3—ヒ ドロキシアルカン酸 （以下、 「P(3HA)J と記載することがある） は、 3—ヒ ドロキシアル力ン酸の 2以上がエステル結合等によリ重合した化合物の総称 であり、 例えば、 ポリ一 3—ヒ ドロキシブタン酸、 ポリ一 3—ヒ ドロキシへキサン 酸等がある。
この P(3HA)は、 近年、 代替プラスチック等への利用が有望視されているが、 化学 合成による製造はコスト高となるため、 バイオリアクター等による遺伝子工学的製 造方法が検討されている。
この遺伝子工学的方法による P(3HA)の製造では、 P(3HA)を蓄積しない大腸菌等の 宿主生物に他の生物由来の P(3HA)重合酵素の遺伝子を導入して宿主生物を形質転換 し、 この形質転換体をグルコース等の炭素源を含む培地で培養する方法が試みられ てきた。 大腸菌等の P(3HA)非蓄積生物は、 その重合酵素を産生しないために P(3HA) を蓄積しないと考えられるからである。 しかしながら、 P(3HA)非蓄積生物に重合酵素遺伝子を導入しただけではその形質 転換体における P(3HA)蓄積能を増大させることはできないことから、 大腸菌等にお ける P(3HA)の非蓄積性は、 その生物が P(3HA)重合酵素を産生しないことだけでは なく、 ポリ一 3—ヒ ドロキシアルカン酸重合酵素の基質となる 3—ヒ ドロキシァシ ル CoA の産生能が極めて低いことによるものであると推測されている。 そこで、 P(3HA)重合酵素遺伝子とともに、 3—ヒ ドロキシァシル CoA の産生を促進するため の脂肪酸合成酵素遺伝子を宿主生物に導入することが試みが報告されている (Williams 等 ： Protein Expr. Purif. 7:203-21 1 , 996) 。 この従来方法では、 ラッ ト 由来の脂肪酸合成酵素の変異遺伝子と、 Alcaligenes eutrophus 由来のポリ _ 3—ヒ ドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子とを昆虫 ( Spodoptera frugiperda) 細胞に導入 し、 昆虫細胞用培地で 3日間培養した結果、 培地 1 リッ トル当たり 600 mgの乾燥細 胞、 1 mgのポリ一 3—ヒ ドロキシアルカン酸を得ることに成功している。
しかしながら、 Williams 等の従来方法では、 得られる P(3HA)は、 乾燥細胞重量当 たり 0.17%と極めて少量であり、 工業的規模での大量製造には適さない。 また、 宿 主生物が昆虫細胞であるため、 培養に特別な技術を必要とするといつた問題点も存 在した。 この出願の発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、 従来方 法の問題点を解消し、 高純度の P(3HA)を簡便かつ大量に、 しかも安価に製造するこ とのできる新しい P(3HA)製造方法を提供することを課題としている。
またこの出願の発明は、 この製造方法に用いる遺伝子組換え生物を提供すること を課題としている。 発明の開示
この出願は、 前記の課題を解決する発明と して、 P(3HA)重合酵素遺伝子と、 脂肪 酸合成酵素遺伝子とを宿主微生物に導入して形質転換し、 この形質転換微生物を炭 素源存在下で増殖させ、 この増殖微生物から P(3HA)を単離■精製することを特徴と する P(3HA)の製造方法を提供する。 またこの出願は、 P(3HA)重合酵素遺伝子と、 脂肪酸合成酵素遺伝子とを宿主微生 物に導入することによって作出された形質転換微生物を提供する。 „
なお、 これらの発明においては、 宿主微生物が大腸菌であることを好ましい態様 としている。 ' また、 脂肪酸合成酵素遺伝子が微生物由来の脂肪酸合成酵素遺伝子群を構成する 遺伝子の 1種または 2種以上であること、 そしてこの場合の微生物が大腸菌である ことを別の好ましい態様としてもいる。 さらにこの出願は、 前記の方法に使用する発現ベクターと して、 グラム陰性細菌 用広宿主域発現ベクター pJRDTrd を提供する。 図面の簡単な説明
第 1 図は、この発明に用いることのできる pJ RDTrcl の構成を示した模式図である。 第 2図は、 実施例で構築した脂肪酸合成酵素遺伝子発現ベクターの挿入遺伝子の 関係を示した模式図である。 発明を実施するための最良の形態
この発明の方法に使用する P(3HA)重合酵素遺伝子は、 各種の P(3HA)蓄積生物に 由来する遺伝子を用いることができる。 そのような遺伝子と しては例えば、 Aeromonas caviae由来の P(3HA)重合酵素遺伝子 phaCAc ( Fukui et al. , J . Bacteriol . 179:4821 -4830, 1997) , Alcaligenes eutrophus由来の P(3HA)重合酵素遺伝子 phbCAe ( Peoples et al. , J. Biol. Chem.262: 15298- 5303, 1989) 、 Pseudomonas aeruginosa 由来の重合酵素遺伝子 haC IPa (Timm et al. , Eur. J . Biochem. 209: 15-30, 1992 ) 等 である。
あるいは、 これらの公知遺伝子をプローブとして、 任意生物種のゲノム DNA から 単離した P(3HA)重合酵素遺伝子を用いることもできる。 これらの P(3HA)重合酵素遺伝子は、 微生物用の発現ベクターに組み込み、 この組 換えべクタ一を定法に従って大腸菌等の微生物に導入することによって形質転換微 .
4
生物を作出することができる。 発現べクタ一は、 微生物中で複製可能なオリジン、 プロモーター、 リボソーム結合部位、 遺伝子クローニング部位、 ターミネータ一等 を有する公知の微生物用発現べクタ一（例えば、大腸菌用発現ベクターとしては、 pUC 系、 pBluescript Π、 ρΕΤ 発現システム、 pGEX 発現システム） などを用いることが できる。 また、 この出願の発明者らが新たに構築したプラスミ ドベクタ一 pJRDTr (第 1 図） を用いることもできる。 この pJRDTrcl は、 第 1 図に示したように、 市販 の pTrc99Aと pJRD215 とを組み合わせて構築した新規べクタ一であり、 そのマルチ クロ一ニングサイ 卜に前記の P(3HA)重合酵素遺伝子 p/iaC \c等を確実に連結するこ とができる。 この発明の方法に使用する脂肪酸合成酵素遺伝子は、 真核生物や微生物由来の公 知の遺伝子である。 例えば、 大腸菌 £sc/7er/'cWa co//'由来の脂肪酸合成酵素遺伝子 fab ( Battner et al., Science 277: 1453-1474, 1997) 、 Sac/7/"s su讀 s由来の脂肪酸合成 酵素遺伝子 わ ( Kunst et al., Nature 390:249-256, 1997) 等であり、 これらを単独 もしくは複数組み合わせて使用することができる。
このような脂肪酸合成酵素遺伝子 （群） は、 前記 P(3HA)重合酵素遺伝子と同様に、 公知の微生物用発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入することができる。 以上のとおリに構築した P(3HA)重合酵素遺伝子発現べクタ一および脂肪酸合成酵 素発現ベクターは、 電気穿孔法、 リン酸カルシウム法、 リポソ一ム法、 DEAEデキス トラン法など公知の方法により同一の宿主微生物に導入する。 そして、 発現べクタ 一中の耐性遺伝子による薬剤耐性等を用いて両遺伝子により形質転換した微生物を 単離することができる。
このようにして作出した形質転換微生物を、 炭素源存在下で、 必要に応じて遺伝 子の発現誘導処置を施すなどして増殖させることにより、 微生物体内に P(3HA)を蓄 積させることができる。 炭素源は、 グルコースやフラク ト一ス等の糖類、 または脂 肪酸類を制限なく用いることができる。 c
蓄積された P(3HA)は公知の方法により単離■精製することができる。 例えば、 大 腸菌の場合には、 培養液から遠心分離等によリ菌体を集め、 これを凍結乾燥し、 乾 燥菌体を酸一メタノール分解し、 分解物からクロ口ホルム抽出によって P(3HA)を単 離することができる。 そして、 各種クロマ トグラフィ一等により精製することがで さる。 以下、 実施例を示し、 この発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、 こ の発明は以下の例に限定されるものではない。 実施例
P(3HA)重合酵素遺伝子 （ eramonas caviae FA440株由来の phaCAc遺伝子） を pJ RDTrd に組み込み、 P(3HA)重合酵素遺伝子発現ベクターを構築した （第 1 図） 。 —方、 Escherichia coli HB101株由来の脂肪酸合成酵素遺伝子 fabH、 fabD、 fabG、 acpP および fai F遺伝子群を連続して pUC1 18にクローニングし、 このクローンから第 2 図に示したように、 ゎ〃を含む断片、 faね D を含む断片、 および全遺伝子群を含む断 片を切り出し、 各々を pBluescriptl l KS(+)に組み込んで脂肪酸合成酵素遺伝子発現べ クタ一 （それぞれ、 pXbH 1 .0、 pEEv1 .6、 pXbSacS.O) を構築した。
P(3HA)重合酵素遺伝子発現ベクターと脂肪酸合成酵素遺伝子のいずれかを組み合 わせて £sc/?er/'c/7/'a co// H B101株に同時に導入し、 形質転換大腸菌を得た。
これらの形質転換菌を LB ( Luria— Bertani) 培地において 30°Cで 12時間培養した 後、 遺伝子発現誘導剤として I PTG ( Isopropyl - β - D (-) - thiogalactopyranoside ) を最終濃度 1 mM になるように添加して 4 時間培養した。 次いで、 グルコース （最 終濃度 10 gZリッ トル） を添加し、 さらに 24時間培養した。
培養終了後、 培養液を遠心分離して菌体を集め、 凍結乾燥し、 乾燥菌体を酸ーェ タノ一ル分解し、 クロ口ホルム抽出した後、 ガスクロマトグラフィーで P(3HA)の収 量およびその組成比を検出した。
なお、 比較対照として、 phaCAc遺伝子のみを導入した遺伝子組換え大腸菌につい ても同様に培養し、 P(3HA)の有無を調べた。 結果は表 1 に示したとおりである。 P(3HA)重合酵素遺伝子と脂肪酸合成酵素遺伝 子群とを導入した形質転換菌からは、 モノマーュニッ 卜が R— 3—ヒ ドロキシブタン 酸： 100%の 3HBホモポリマーが得られたのに対し、比較対象として試験した phaCAc 遺伝子のみを導入した形質転換菌からはポリ _ 3—ヒ ドロキシアル力ン酸は検出さ れなかった。 また、 3HBの収率は、 fabH、 fabD、 fabG、 acpPおよびお 遺伝子群 を全て導入した菌が乾燥菌体重量当たり 10.3%と最も高く、 次いで、 fabH (6.3%) 、 fabD (4.6%) であった。
表 1 strain CDW PHA content PHA composition【mol%)—
(g/l) (%^ 3HB 3HHx 3HO 3HD 3HDD
E.coli HB101 1.8 N.D. 一
(phaCAc) control
E.coli HB101 2.0 6.5 100
(pJRDTrc:p iaC \c+pXbH1.0)
E.coli HB101 2.1 4.6 100
(pJRDTrc:prtaC>Ac+pEEv1.6)
E.coli HB101 1.7 10.3 100
(pJRDTrc:p/iaC/ c+pXbSac5.0)
N.D.: Not Detected 産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 P(3HA)の遺伝子工学的手 法による製造方法と、 この製造方法に用いる遺伝子組換え生物が提供される。 これ らの発明によって、 代替プラスチック等の原料として有用な高純度のポリ一 3—ヒ ドロキシアル力ン酸を簡便かつ大量に、 しかも安価に製造することが可能となる。

Claims

請求の範囲
1 . ポリ一 3—ヒ ドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子と、 脂肪酸合成酵素遺伝子 とを宿主微生物に導入して形質転換し、 この形質転換微生物を炭素源存在下で増殖 させ、 この増殖微生物からポリ一 3—ヒ ドロキシアルカン酸を単離 . 精製すること を特徴とするポリ一 3—ヒ ドロキシアル力ン酸の製造方法。
2 . 宿主微生物が大腸菌である請求項 1 の製造方法。
3 . 脂肪酸合成酵素遺伝子が微生物由来の脂肪酸合成酵素遺伝子群を構成する遺 伝子の 1種または 2種以上である請求項 1 または 2の製造方法。
4 . 微生物が大腸菌である請求項 3の製造方法。
5 . ポリ一 3—ヒ ドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子と、 脂肪酸合成酵素遺伝子 とを宿主微生物に導入することによって作出された形質転換微生物。
6 . 宿主微生物が大腸菌である請求項 5の形質転換微生物。
7 . 脂肪酸合成酵素遺伝子が微生物由来の脂肪酸合成酵素遺伝子群を構成する遺 伝子の 1種または 2種以上である請求項 5または 6の形質転換微生物。
8 . 微生物が大腸菌である請求項 7の形質転換微生物。
9 . グラム陰性細菌用広宿主域発現べクタ一 pJRDTrc1。
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MARK D. WILLIAMS ET AL.: "Production of a Polyhydroxyalkanoate Biopolymer in Insect Cells with a Modified Eucaryotic Fatty Acid Synthase", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,, vol. 62, no. 7, 1996, pages 2540 - 2546, XP002925768 *

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