JPS6356281A - 組換え遺伝子産物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は組換え遺伝子産物の製法及びその製造の際に使
用する新規培地に関する。

〔従来技術〕

組換え遺伝子産物の生錘性を向上させる事を目的とした
培地、培養法の改良に関する報告は少なく、わずかに菌
の高濃度培養を主眼におきデービス培地を改変させた培
地を用いて、ｐＨコントロールしなからグルコースを分
割して添加する培養法が報告されている。（ＨｏＭｅｒ
ｊｅｔａｌ　、。

Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ　　１　２．　３
　１　３−３１９（１９７９ハＴ−Ｋｏｂａｙａｓｈｉ
　ｅｔａｌ−Ｐｒｏｃ・−Ｐａｃ・Ｃｈｅｍ−Ｅｎｇ−
Ｃｏｎｇｒ、、３ｒｄ４．１４７−５０（１９８３））
しかし、こわらでは、菌の高濃度培養は達成されている
が、大ｍ菌全菌体蛋白に対する目的産物の割合か明記さ
れていない。

〔発明か踏決丁べき問題点〕

前記培養法では本発明者らの実験、によると確かに菌１
度は上昇するが、全大腸菌蛋白当りの目的産物の量は通
常の培養法に比し逆に著しく低下し、その生産性は何ら
改善されないことが判明した。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで本発明者らは組換え遺伝子産物の生産性を向上さ
せる方法につき種々検討した結果。

カゼイン塀水分解物、酵母エキス、無機塩及び大腸菌資
化性炭素源を必須成分とする培地中にチオ硫酸塩を添加
し、組換え遺伝子をもつ大腸菌を培養すると遺伝子産物
の生産性が大巾に向上することを見い出した。

本発明は上記知見に基づいて完成されたものである。

即ち本発明は、カゼイン加水分解物、酵母エキス、無機
塩及び大腸菌資化性炭素源を必須成分とする培地中にチ
オ硫酸塩を添加し、組換え遺伝子を持つ大腸菌を培養し
、その培養物より組換え遺伝子産物を採取する事を特徴
とする組換え遺伝子産物の製法及びこの製法に使用する
上記培地に関する。

本発明で使用するカゼイン加水分解物はカゼインを加水
分解したものなら特に制限ないが、カゼインをトリプシ
ン、ペプシン、パパイン等のプロテアーゼで加水分解し
たものが好１しく例えばバクトートリブトン（ディフコ
社製）やペプトンなどが好ましい。この使用量は培地１
ｐ当り１〜１００ｇ好１しくは５〜５０ｇ、さらに好１
しくは１０〜３０ｇ程度である。

酵母エキスの使用量は培地１ノ当り１〜１００ｇ、好１
しくは２〜３０ｇ、さらに好−ＥＬ＜は５〜１５ｇ程度
である。

無機塩としては例えばＮａ　Ｃ１、ＫＣＩ　、　Ｎａｚ
　Ｓ　Ｏ４＋　ＣａＣｌ２１　ＣａＣＯ３，ＭｇＳＯ４
，ＣｕＳＯ４，Ｆｅ　Ｓｏａ、　Ｚｎ　８０＜、　Ｍｎ
Ｃｌ２゜リン酸塩などが好１しくはＮａＣ１があげられ
、それらの使用量は培地１２当り０．１〜５０ｇ、好１
しくは１〜３０ｇ、さらに好１しくは２〜１０ｇ程度で
ある。

又、大腸菌資化性の炭素源としては例えば。

グリセロール、グルコース、アラビノース、マンニトー
ル、マルトース、トレハロース、ソルビトールなどがあ
げられ、グリセロール、ソルビトール、トレハロースが
好ましい。その使用量は培地１２当り５％以下、好１し
くは０．００１〜３％、さらに好１しくは０．０１〜２
．５％程度である。

本発明で使用する培地には他の成分も添加することがで
きる。他の成分としては例えば炭酸カルシウムなどのｐ
Ｈ調節剤や産生される遺伝子産物に取り込１れる微量元
素の供給源例えば遺伝子産物がＣｕ−Ｚｎ−スーパーオ
キシドディスムターゼ（ＳＯＤ）の場合における硫酸鋼
や硫酸亜鉛などがあげられる。

又、チオ硫酸塩としては特に制限はなく、例えばチオ硫
酸ソーダ（Ｎａ２ＳｚＣｈ）−チオ硫酸カリウム（Ｋ２
８２０３　）、チオ硫酸アンモニウム（ＮＨａ　）ｚＳ
２０３、チオ硫酸カルシウム（Ｃａ　Ｓｚ　Ｏａ　）な
どがあげられ、なるべく特級試薬のものが好ましい。

この使用濃度は、０．０１％〜１％、好１しくは。

０．０５％〜０．３５％、さらに好１しくは、０．２〜
０、３％程度である。

本発明で使用する培地は固体培地でもよいが上記培地成
分を蒸留水に溶解した液体培地の方が実用的で好ましい
。

本発明の製法を実施するには、上記培地中で組換え遺伝
子を持つ大腸菌を培養し、その培養物より組換え遺伝子
産物を採取すればよい。

組換え遺伝子としては大腸菌にその遺伝子産物を産生さ
せるものであれば特に制限なく１例えば、ヒトＳＯＤ遺
伝子、牛ＳＯＤ遺伝子、酵母ＳＯＤ遺伝子などに適用で
きる。

培養は常法によりおこなうことができ、例えば空気を吹
き込みながら２０〜５０℃好１しくは２５〜４０℃で３
〜１２０時間好１しくはｌＯ〜３６時間程度振盪培養な
どの方法でおこなえばよい。°。

培養物よりの組換え遺伝子産物の採取は常法によりおこ
なうことができ、例えば培養物を遠心処理して集菌し、
遺伝子産物がその上清中に存在する場合は、その上清液
なりロマトグラフィー処理などの処理によりおこなうこ
とができる。

又、遺伝子産物が菌体中に存在する場合は、集菌した菌
体な緩衝液に懸濁した後例えば超音波処理などで破菌し
、・次いで遠心処理して得られる上清をクロマトグラフ
ィーなとで処理することによりその遺伝子産物を得るこ
とができる。

〔効　果〕

次に本発明の効果を実験例により説明する。

実験例１゜ ３ｕ　　実験方法 り培地（培地１２中バクトドリプトン１０ｇ。

酵母エキス５ｇ１食塩５ｇ含有）にＯ，ｌ　ｍＭ　Ｃｕ
ＳＯ４，Ｏ，ｌ　ｍＭＺｎ　ＳＯ４，２０ｔｔｇ　／ｌ
ｎｌアンピシリン及び下記表１の成分を添加した培地を
用い、後記実施例１記載の形質転換した大腸菌を実施例
１と同様に培養して培萎物を得、集菌、破菌した後遠心
分離し、上清を得た。この上清につきＳＯＤの産生量を
Ｆｒ１ｄｏｖｉｃｌｒ法で測定し、又総蛋白債をＬｏｗ
ｒｙ　−Ｆｏｌｉｎｅ法（０−Ｈ−Ｌｏｗｒｙ、　ｅｔ
ａｌ、　Ｊ−Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｍ。

１９３．２６５（１９５１））で測定し、全菌体蛋白に
対するＳＯＤ蛋白の比を算出した。

（２）結果 結果を表１に示す。

表１　チオ硫酸塩の添加によるＳＯＤ産生量の増大 （Ｌ培地）　　　　−−１９ ０，５％　　　０．０５　　６．６６　　　２８．９０
．５　％　　　０．１　　　　６．４９　　　２９．０
０．５　　％　　　０．２　　　　６．５６　　　３０
．００．５　％　　　０．３５　　６．６６　　　２９
．３＊Ｌ培地に０．１　ｍＭｃｕｓＯａと０．１　ｍＭ
Ｚｎｓｏ＜、　２０μｇ　／　ｍｌアンピシリンを添加
した培地を用いた時の生産性を１として算出した。

この表から明らかなようにチオ硫酸塩を添加するとＳＯ
Ｄの産生量は増大し、又、全菌体蛋白あたりのＳＯＤ蛋
白の割合も増大する。

実施例１゜ 後記参考例の７）で得られたｐＲＴａｃ　ＳＯＤ　８〜
１３を大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）にＨ
ａｎｊａｔｉｓらの方法（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＪｏ
ｎｉｎｇ　：　ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎｇ　ｈａｒｂｏｒ
　Ｊａｂｏｒａｔｏｒｙ２５４−２５５（１９８２））
で挿入し、形質転換した大腸菌を２０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンと０．１　ｍＭＣｕＳＯ４及びＯ，ｌ　ｍＭＺ
ｎｓＯ４，５ｇ　／　４３のグリセロールを含みかつ、
別殺菌したチオ硫酸ソーダを終１度０．２％となる様に
添加したＬ培地（他に培地ｌ！中バクトドリプトン１０
ｇ、酵母エキス５ｇ。

食塩５ｇ含有）に接種し、３０℃で振盪培養し。

５５０　ｎｍにおける吸光度が０．２となったところで
培養温度を３７℃に上昇した。更に振盪培養を約２４時
間続けた。

こうして得た培養液１９Ａを６０００　ｒｐｍ　ｌ　０
分間の遠心沈降にかけ集菌した。菌は培養液のｌ／１０
容の５０　ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣｌ　（７，５）　−１
ｍＭｃｕｓＯ４−１ｍＭ　Ｚｎ　Ｓ　Ｏ４緩衝液に懸濁
した。これを水冷下で超音波処理し、菌を破砕した。処
理液の５５０　ｎｍにおける吸光度が、処理前の１／１
０に１で減少したところで処理を終了した。

最後に、この処理液を３０００　Ｏｒｐｍ　　３０分間
超遠心沈降し、上清を得た。この上清には、ＳＯＤが抽
出されている。

得られた溶菌上清液７１５ｍ１（総活性：５８１５Ｋｕ
、比活性１８８．２　ｕ／ｌ！Ｉｇ　・ｐ）を用いてＳ
ＯＤの精製を行った。

■　ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー予め５０　ｍ
Ｍの食塩水で平衡化したダイアイオンＩ（Ｆ’−２０を
５．８０Ｘ３９ｃｍＨのカラムに充填し充分平衡化する
。溶菌上清液７１５ｍｌＩＣ５０ｍＭの食塩水５６０ｍ
１を加えこの混合液をカラムに吸着後、直ちに５０　ｍ
Ｍ酢酸ソーダ緩衝液、ｐＨ５でカラム容量の約９倍洗滌
する。ついでＯ，１ＭりＩＪシン−苛性ソーダ緩衝液の
６０％メタノール溶液、ｐＨ１０，０で俗出しＳＯＤ活
性を示す画分を集めた。（画分Ａ、３８２ｍ１） この両分を約０．５Ｎの塩酸でｐＨ７，ＯＫ調節後、４
０℃の水浴上でエバボレートにより濃縮乾個する。乾個
物を１００ｍ１の水に浴屏後、４０ｍＭ食塩を含む５　
ｍＭ　！Ｊン酸緩衝液、ｐＨ７，５に対し透析チューブ
を用いて透析を行う。

■　ＤＥＡＥ−トヨパールカラムクロマトグラフィ透析
されたＳＯＤを含む溶液を予め４０　ｍＭ　　食塩を含
む５　ｍＭ　＋７ン酸緩衝Ｗ　ｐＨ７，５で平衡化され
たＤＥＡＥ　−）ヨパールの充填されたカラム（３’Ｘ
２８ｃｍＨ）に通導する。ついで同じ緩衝液で溶出させ
てＳＯＤを吸着させずに通過液として得る。（画分８．
１７６ｍ１） ■　セファデックスＧ−１００ゲルクロマトグラフ　　
ィ　　− 画分Ｂ１７６ｍ１を限外濾過膜（ＹＭ−５）を用いてＢ
　ｍｉに濃縮した液を予め１％食塩を含んだ５　ｍＭ　
リン酸緩衝Ｗ　、　ｐＨ７，０で平向化したセファデッ
クスＧ−１００（２ダＸ１５９ｃｍＨ）カラムに吸着さ
せ、平衡化緩衝液で溶出しＳＯＤ活性を示す画分を得た
（画分Ｃ，８０ｍ１） 溶菌上清ｌＶｉ　　５８１７　　　１００　　　　　９
９．６画分Ａ　　４８３５　８３．１　１４１８画分Ｂ
画分４７３１　　８１．３　３６１４画分Ｃ画分４１５
０　　７１．４　３８１１これを、ミリフォアフィルタ
ーでろ過した後、限外濾過で濃縮し、次いで凍結乾燥し
た。この結果、比活性３８１０　Ｕｎｉｔ／ｑ−ｐのＳ
ＯＤ粉末１．０７ｇ力価を得た。

参考例 （１）　　ヒト胎盤からのｍ　ＲＮＡの分離とＳＯＤｍ
ＲＮＡの同定： 新生児誕生より１時間以内の新鮮な胎盤約３００ｇをリ
ン酸生理食塩水（ＰＢＳ浴液）で洗い、グアニジン・チ
オシアネート法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１８．５２９４−５２９９　（１９
７９））によって細胞質の全ＲＮＡを抽訃した。この抽
出した全ＲＮＡを高塩濃度の緩衝液（Ｔｒｉｓ、　０．
５　Ｍ　Ｎａ　Ｃ１を含む、ｐＨ７，４）に溶かし、こ
れをオリゴ（ｄＴ）セルロース（ファルマシア社製）カ
ラムに通導。

ポ！ｊ　Ａ　ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を吸着させた後、低
塩濃度の緩衝液（Ｔｒｉｓ、　ＮａＣ１を含１ず％ｐＨ
７，４）で溶出してエタノール沈澱させた。全ＬＮＡ　
１５０■より１．７■のｍＲＮＡを得た。沈澱を２００
μｍの減菌水に溶かし、８０℃２分間加温後急冷して、
５〜２０％シヨ糖密度勾糖蜜心法により分子量の大きさ
の順に分離した。

実際には日立ＲＰＮ　４０　Ｔローターを用い、３５Ｋ
ｒｐｍ、１７時間０℃で遠心した。

次いで分離した各画分（０，５ｍ１）の一部゛を、ウサ
ギ網状赤血球ライセード（アマジャム社Ｍ）の糸で翻訳
させ、合成された蛋白質を免疫学的方法（エンザ・イム
・イムノアッセイ法）　（Ｊ。

Ｐｈａｒｍ、Ｄｙｎ−、５３９４−４０２（１９８２）
　）で調べた。このようにしてｍ　ＲＮＡの１０〜１２
Ｓ画分にＳＯＤ　ｍＲＮＡの存在が認められた。

（２１ｍＲＮＡのアニーリングとｃＤＮＡの合成：（１
）で得られた分画を用い、岡山−Ｂｅｒｇの方法（Ｍｏ
１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌｏ、２．１６１−１７０（１９
８２）　：］に従って以下のように合成した。

あらかじめ５０　ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８，３）、　３０
ｍＭＫＣ。

０．３ｍＭジチオスレイトール（Ｉ）’ｒＴ’）、８　
ｍＭ　Ｍｇ　ＣＩ２．４０μｇ／＋ｎｌアクチノマイシ
ンＤ、各２　ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ
、ＴＴＰ、３０μＣＩ　（α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ　（６
００Ｃｉ　／ｍｍｏｌ　）　（ＮＥＮ社製）、２８０単
位のりボヌクレアーゼインヒビター（和光純薬社２裂）
、および２．８μｇのプラスミドプライマー〔大腸菌プ
ラスミドｐｓＶ７１８６（ファルマシア社Ｍ）を用い、
岡山−Ｂｅｒｇ法に順じて合成したＴ−テーリング約６
０塩基のプライマー〕を含む溶液１０μｌを調製し、３
７℃に保つ。次に１０　ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１　
ｍＭＥＤＴＡと　３μｇのｍＲＮＡを含む溶液１０μｍ
を調製し、・６５℃で５分間加温後直ちに３７℃に移し
た後、上記溶液ｌＯμＩと混合して、さらに５分間加温
した。つづいて５単位の逆転写酵素（ライフサイエンス
社製）を加え、３７℃で２０分間加温した。２μｍの２
５０　ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）と１μｍの１０％
ＳＤＳ溶液を加えて反応を停止させた後、フェノ−ル・
クロロホルム抽出、エタノール沈澱をそれぞれ２回経て
次の段階へ進んだ。

（３）式（１］の塩基配列を含有するプラスミドの合成
＝（２）で得られた沈澱物を１４０ｍＭカコジル酸ナト
　　リ　　ウ　　ム　−３０ｍＭＴｒｉｓ　　　（ｐＨ
６，８）、　　　　１　　　ｍＭｃｏｃ１２．０、１　
ｍＭ　ＤＴＴ、１　ｍＭ　ｄＣＴＰおよび５０　μｃｉ
　Ｃα−３２Ｐ　］　ｄＣＴＰを含む溶液に溶かビ、３
７℃で２〜３分間加温後、１８単位のターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ファルマシア社
製〕を加え、全体を１５μｌとした。３７℃で３分間加
温した後、逆転写反応と同様な後処理を行ってエタノー
ル沈澱物を得た。

次に該沈澱物を５０　ｍＭ　Ｎａ　Ｃ１，５０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ（ｐＨ８，０）　、　　１０　ｍＭＭｇｃ１２．
　１００　ｐｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、　　お
よび１２単位のＨｉｎｄｌｌＩにッポンジーン社製２を
含む浴液に溶かして３７℃、２〜４時間加温した。フェ
ノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱後、これを
１０μ！の１０　ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７，３）、１　ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡを含む溶液に溶かし、さらに３μｍのエタ
ノールを加えて全体を１３μｍとした。この箔版１μｍ
に０、０４　ｐｍｏｌのオリゴ（ｄＧ）リンカ−〔大腸
菌プラスミドｐｓＶ１９３２（ファルマンア社製〕を用
い、岡山−Ｂｅｒｇ法に順じて合成したｄＧ−テーリン
グ約１２塩基のリンカ−〕、１０　ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ
７，５）、０．１　ＭＮａＣｌ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡの
１０倍濃縮版１μＩと蒸留水８μｌを加えて全体を１０
μｍとし、該溶液を６５℃５分間、４２℃３０分間と経
時加温後０℃に保った。これに２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
（ｐＨ７８５）、４　ｍＭＭｇｃ１ｚ％１０　ｍＭ硫酸
アンモニウム。

０、１　ＭＫ　ＣＩ、５０　μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、０．
１　ｍＭβ−ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチド
（ＮＡＤ）および０．６μｇの大腸菌ＤＮＡリガーゼ（
ファルマシア社製）を含む濃縮液を加えて最終的に該濃
度溶液１００μｍとし、１２℃で一夜加温した。次いで
、各２０　ｍＭを含んだｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧ
ＴＰおよびＴＴＰを０．４　μｌ、　１．５　ｍＭβ−
ＮＡＤ’（ｌ　μｌ、大腸菌ＤＮＡリガーゼを０．４μ
ｇ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１を０．３μｇ、そして
大腸菌リボヌクレアーゼＨを１単位それぞれ添加して（
全体とじて１０４μｌ）、さらに１２℃で１時間、２５
℃で１時間加温した。

（４）大腸菌への形質転換： 大腸菌としてχ１７７６（ＡＴＣＣ３１２４４）を使用
した。コンピテントセルはＭａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏ１
ｅｃｕｊａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉｎ
ｇ　ｈａｒｂｏｒ　ｈａｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ％２５４−２５５（１９８２）］と全く同様の方法で
調製し、０．２　ｍｌづつ分注した。該ＤＮＡ　溶液を
２０μＩづつ５本形質転換し、バクトドリブトンｌ。

ｇ／ｊｌ　、イーストエクストラクト５ｇＡ−ジアミノ
ピメリン酸０，０１％、チミジン０．００４％およびア
ンピシリン（Ａｐ）５０μｇ　／　ｍｌを含む１．５％
寒天培地上にコロニー約３万個を得た。

（５１：＋ロニーハイプリダイゼーション：得られたコ
ロニーのうち約１万個を同組成の寒天培地上に移し換え
（５１２個／１４Ｘ１０ｃｍプレート；２枚１組とし、
１枚をマスタープレートとして保存した。）、直径約３
ｒｒａＲに成長するでで培養した。これにワットマン５
４１０紙をゆっくりとのせ、コロニーを完全に口紙に移
行させてから、クロラムフェニコール２５０μｇ／　ｍ
ｌを含む同組成寒天培地上に該口紙を密着させ一昼夜培
養した。口紙へのＤＮＡ固定は次のように行った。

培養後の口紙な０．５　Ｍ　Ｎａ　ＯＨで５分間、２回
処理し、０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，４）で中性
にもどし、２ＸＳＳＣ（ｐＨ７）　（１ｘｓｓｃ　：　
０．１５ＭＮａＣｌ。

０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）処理を経、９５％エ
タノール水溶液で軽く洗浄した後風乾した。プローブと
して（Ａｌ１７ヌクレオチド：ＡＡ（ＴｏｒＣ）ＴＴ（
ＴｏｒＣ）ＧＡ（ＡｏｒＧ）ＣＡ（ＡｏｒＧ）ＡＡ（Ａ
ｏｒ　Ｇ　）　ＧＡの３２種類（Ｂ１１４ヌクレオチド
：ＧＡ（ＴｏｒＣ）ＣＡ（ＴｏｒＣ）ＴＧ（ＴｏｒＣ）
ＡＴ（Ｔ、　ＣｏｒＡ）ＡＴの２４種類をそれぞれトリ
エステル法で化学合成し、以下に述べるノ・イブリダイ
ゼーションに使用した。

（イ）　プレハイプリダイゼーション ロ紙を６ＸＳＥＴ（ｌＸ５ＥＴ：０．１５ＭＮａＣ＋。

０．０　１　　５ＭＴｒｉｓ　　（ｐＨ７，５）、　　
　１　　　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）、　　ｏ、５％ソニデッ
）Ｐ２Ｏ（半井化学社製ン２よび１００μｇ　／　Ｊｌ
ｌの変性大腸菌ＤＮＡ　（ファルマシア社製の大腸菌Ｄ
ＮＡを５分間煮沸後急冷したもの］を含む溶液で５５℃
、２時間加温した。

（ロ）　ハイプリダイゼーシロン 次に変性大腸菌ＤＮＡの代りに１００μｇ　／　ｍｌの
醪母ｔＲＮＡ　（ＢＲＬ社製）と、　（ｒ　−”Ｐ　）
ＡＴＰ（５０００Ｃｉ　／　ｍｍｏｌ　ＮＥＮ社りとポ
リヌクレオチドキナーゼＣＮＥＢ社製）を用いて５位を
Ｃ”Ｐ）標識Ｌ　７’ｖプローブ０．２　ｎｇ　／　Ｉ
ＩＩＪとを用いて２９℃、２時間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。

−１式（１１の塩基配列を含むプラスミドの単離洗浄は
各々（４）３９℃で５分間（Ｂ１２９℃で２０分間、α
いて室温で１０分間の処理を６ｘ　ｓｓｃ溶液を用いて
各段階３回づつ繰返した。

口紙を風乾後、Ｘ線フィルム（コダックＸＡ　Ｒ５）を
用いてオートラジオグラフィーを行ない、ｔＡｌ、ｌＢ
１両方にポジティブなコロニーを１個選別し、その国体
よりプラスミドを取り出し、そのプラスミドをｐＨ８３
２３７と命名した。

（６）発現ベクターの構築 大腸菌プラスミドｐＵＣ１３（ファルマシア社製）上の
ラクトース・プロモーターに最近接したＨａｅ■部位を
切断後、エキソヌクレアーゼＢａ１３１　（ＮＥＢ社！
！）で両端を約１００　ｂｐ削除し、Ｔ４　ＤＮＡ　リ
ガーゼ（全酒造社製）で再閉環させたプラスミドｐΔＵ
Ｃｌ３を調製した（このプラスミドバラクドース・プロ
モーターとしての機能を失っている）。次いでこのプラ
スミドのＨｉｎｃ　Ｕ切断部位にＴｒｐＡターミネータ
−（ファルマシア社製）を挿入し、プラスミドｐｊＵｃ
Ｔ＋ｘを得た。

囚　ＳＯＤをコードするＤＮＡの調製 前記（５）の（ハ）で得られたｐＨ３２３７をＰｖｕ　
Ｔｌで消化し、Ｘｂａ　Ｔリンカ−ＣＮＥＢ社製）をＴ
４ＤＮＡリーガーゼで連結してＸｂａ　Ｉ部位を設けこ
のプラスミドをｐＨ８Ｘ３２３７と命名した。

ｐＨ８Ｘ３２３７をＰｓｔ　Ｉで消化し、エキソヌクレ
アーゼＢａｌ　３１で遂次消化した。さらにＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで末端を平滑にそろえ、ＢａｍＨＩリンカ
−（全酒造社製）を連結してＢａｍＨＩとＸｂａ　Ｉ　
（いずれもニラポン・ジーン社製）で消化後約６３０〜
７００　ｂｐのＤＮＡを２−１６％グラジェントポリア
クリルアミドゲルで回収した。

（ＢＩ　　ＴａｃプロモーターおよびＳＯＤ　ＤＮＡを
挿入したプラスミドの調製 プラスミドＩ）ＤＲ５４Ｇ　（ファルマシア社ｆｆ）ヲ
ＥｃｏＲＩ　（二ｙボアージーン社調）とＢａｍＨＩで
消化しＴａｃプロモーターを含む１２１ｂｐをポリアク
リルアミドゲルで回収し、ｐΔＵＣＴ＋ｓのＥｃｏＲＩ
　−ＢａｍＨＩ間に挿入して得られた約３Ｋｂのプラス
ミドをｐＴａｃ　Ｉと命名した（第３図）。

ｐＴａｃ　ＩのＢａｍＨＩ　−Ｘｂａ　Ｉ間に（７）囚
で得られた約６３０−７００　ｂｐのＤＮＡを挿入して
得られたプラスミドを大腸菌ＤＨＩ　（ＡＴＣＣ３３８
４９）に形質転換した。得られた種々のプラスミドの塩
基配列を決定し、ＳＤ配列（ＡＧＧＡ）から開始コドン
ＡＴＧ　’！での距離が８〜１３ヌクレオチド長のプラ
スミドをｐＴａｃ　ＳＯＤ　８〜１３と命名した。

（７）　　ランナウェイ型ＳＯＤ発現ベクターの構築Ａ
ＴＣＣより購入したランナウィイプラスミドｐＭＯＢ　
４５　（ＡＴＣＣ３７１０６）　ＣＭ−Ｂｉｔｔｅｒ　
ａｎｄＤ、Ｖａｐｎｅｋ、Ｇｅｎｅ１５．３１９−３２
９．　（１９８１））をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ　
（全酒造、以下すべて同社製品）で切断し、ランナウェ
イ複製起点を含む６．７ＫｂのＤＮＡ断片を切り出した
。このＤＮＡを精製し、Ｂａｌ　３１酵素で処理し１両
端各々０．３　Ｋｂぐらい消化後、ＤＮＡポリメラーゼ
で処理してＤＮＡ末端を平滑にした。一方、ＡＴＣＣよ
り購入したｐＢＲ３２２を’ｒｔｈ　ｔ　ｔ　ｔ　ｎで
切断しアンピシリン耐性遺伝子を含む１．３　Ｋｂ　（
７）　ＤＮＡを切り出した。このＤＮＡも精製後、上記
方法と同様にＢａｌ　３１酵素。

ＤＮＡポリメラーゼで順次処理した。こうして得られた
２本のＤＮＡ断片を等モルで混合し、更に１−１ｉｎｄ
　ＩＩＩリンカ−及びＥｃｏＲＩリンカ−（全酒造）を
１０倍モル量加えてから、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼで処
理し、　ＤＮＡを連結した。

次に、このＤＮＡ試料を大腸菌Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣ
２７３２５）株へＭａｎｉａｔｉｓらの方法で（〜Ｉｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉ
ｎｇ　ｈａｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　２５４−
２５５（１９８２）、形質転換し、アンピシリン耐性株
を選別した。任意に選んだ１２株について、その保有す
るプラスミドの制限醪素解析を行った。

この結果、上記２本のＤＮＡ断片が連結し、かつひとつ
の連結部にのみ２種のリンカ−（Ｈｉｎｄ　ｌ［とＥｃ
ｏＲＩ　）が挿入されたプラスミドｐＲ４が得られた。

次にｐＲ４をＥｃｏＲＩと）ｌｉｎｄＩＩＩで切断して
開裂し、この部位間にｐΔＵＣＴ１３　（前記（６）囚
参照ンに白米し、マルチクローニング部位と転写終結因
子を含む０．４　ＫｂのＥｃｏ　ＲＩ　−Ｈｉｎｄ　Ｉ
ＩＩ断片を挿入してｐＲ３を構築した。更に、このｐＲ
３をＥｃｏ　ＲＩとＸｂａ　Ｉで切断開裂し、この部位
間にｐＴａｃ　５ＯＤ８〜１３（前記（６１（Ｂｌ参照
）に白米しｔａｃプロモーターとヒトＳＯＤ遺伝子を含
む約０．７　ＫｂのＥｃ。

ＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉ　ＤＮＡ断片を挿入し、　ｐＲＴａ
ｃ　Ｓ０４８〜１３を構築した。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）カゼイン加水分解物、酵母エキス、無機塩及び大
   腸菌資化性炭素源及びチオ硫酸塩を必須成分とする培地
   中で組換え遺伝子を持つ大腸菌を培養し、その培養物よ
   り、組換え遺伝子産物を採取する事を特徴とする組換え
   遺伝子産物の製法
2. （２）カゼイン加水分解物、酵母エキス、無機塩及び大
   腸菌資化性炭素源及びチオ硫酸塩を必須成分とする組換
   え遺伝子をもつ大腸菌用の新規改良培地