BR112015021753B1 - Ácidos nucleicos isolados de pichia pastoris, vetor de expressão, células hospedeiras de levedura e construto de dna, bem como método para produzir uma proteína - Google Patents

Abstract

PROMOTORES DE LEVEDURA PROVENIENTES DE PICHIA PASTORIS Trata-se de ácidos nucléicos isolados, métodos de expressão, células hospedeiras, vetores de expressão, e construções de DNA para produzir proteínas, e proteínas produzidas usando os métodos de expressão. Mais particularmente, trata-se de ácidos nucléicos isolados provenientes de Pichia pastoris em que os ácidos nucléicos têm uma atividade promotora. A invenção também se refere a métodos de expressão, células hospedeiras, vetores de expressão, e construções de DNA, para usar os promotores de Pichia pastoris para produzir proteínas, e às proteínas produzidas usando os métodos de expressão.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório com número de série U.S. 61/774.982, depositado em 8 de março de 2013, aqui incorporado a título de referência.

CAMPO DA REVELAÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a ácidos nucléicos isolados, métodos de expressão, células hospedeiras, vetores de expressão e construções de DNA destinadas à produção de proteínas, e às proteínas que usam os métodos de expressão. Mais particularmente, a invenção se refere a ácidos nucléicos isolados a partir de Pi- chia pastoris em que os ácidos nucléicos têm uma atividade promotora. A invenção se refere, também, a métodos de expressão, células hospedeiras, vetores de expressão e construções de DNA, destinados à utilização dos promotores de Pichia pastoris para produzir proteínas, e às proteínas produzidas usando os métodos de expressão.

FUNDAMENTOS E SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[003] Podem-se usar sistemas de expressão de levedura para produzir efetivamente proteínas, como enzimas, hormônios, e proteínas de vacina, em parte, devido ao fato de algumas leveduras se desenvolverem rapidamente em altas densidades celulares, são desenvolvidas em meios simples e pouco dispendiosos, e são eu- cariotas, logo, podem modificar proteínas de maneira similar a proteínas nativas em mamíferos. Adicionalmente, com uma sequência de sinal apropriada, a proteína expressa pode ser secretada no meio de cultura para isolamento e purificação convenientes. Alguns sistemas de expressão de levedura também são aceitos nas indústrias alimentícia e farmacêutica como sendo seguros para a produção de produtos farmacêuticos e alimentícios, diferentemente de sistemas de expressão fúngica e bacteriana que podem, em alguns casos, ser inseguros, por exemplo, para fabricação de alimentos para humanos.

[004] Logo, é benéfico para uma variedade de indústrias, tais como as indústrias alimentícias e de ração animal, as indústrias de saúde humana e animal, e similares, desenvolver ou aperfeiçoar sistemas de expressão de levedura que possam ser usados para expressar altos níveis de proteínas para aumentar o rendimento, reduzir os gastos de isolamento e purificação de proteínas, e reduzir os custos de produtos de saúde humana e animal e produtos alimentícios.

[005] Desenvolveu-se uma variedade de tipos de sistemas de expressão de levedura que envolvem o uso de expressão induzível ou constitutiva de proteínas usando ácidos nucléicos que codificam proteínas homólogas ou heterólogas, sob o controle de um promotor de levedura. Os promotores são elementos regulatórios que são ligados à extremidade 5’ de um ácido nucléico que codifica uma proteína, e podem interagir com vários fatores regulatórios na célula hospedeira (por exemplo, uma célula hospedeira de levedura) para controlar a transcrição de RNA a partir de DNA. Os promotores também podem controlar a temporização da transcrição de RNA a partir de DNA. Por exemplo, o promotor AOX 1 foi identificado na levedura Pichia pastoris, e é comumente usado em sistemas de expressão de levedura devido ao fato de ser promotor forte estritamente regulado.

[006] Devido à importância de sistemas de expressão de levedura para uma variedade de indústrias, incluindo a indústria farmacêutica para humanos, e as indústrias alimentícia para humanos e de ração para animais, o aperfeiçoamento dos sistemas de expressão de levedura é o foco de muita pesquisa e desenvolvimento. De modo correspondente, os presentes inventores identificaram promotores de Pichia pastoris que sejam particularmente efetivos para uso na expressão de proteínas em levedura. Os promotores descritos no presente documento podem ser usados, por exemplo, em sistemas para a expressão constitutiva de proteínas.

[007] Em uma modalidade ilustrativa da invenção, proporciona-se um ácido nucléico isolado em que a sequência do ácido nucléico isolado compreende uma sequência, por exemplo, pelo menos 90%, 95%, ou 98% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 conforme descrito no presente documento, ou pelo menos 90%, 95%, ou 98% idêntica a um fragmento da mesma, em que o ácido nucléico isolado compreende a sequência de um promotor constitutivo de Pichia pastoris. Em outras modalidades, proporcionam- se vetores de expressão, células hospedeiras, e construções de DNA que compreendem essas sequências promotoras.

[008] Em outra modalidade, proporciona-se um método para produzir uma proteína usando essas sequências promotoras. O método compreende as etapas de cultivar em um meio de cultura uma célula hospedeira que compreende um primeiro cassete de expressão que compreende qualquer uma das sequências promotoras acima operacionalmente ligadas a uma sequência de codificação heteróloga que codifica uma proteína, em que a cultura é realizada sob condições que permitam a expressão da proteína. Em outra modalidade ilustrativa, proporciona-se uma proteína isolada produzida de acordo com esse método.

[009] Todas as modalidades descritas na lista de cláusulas a seguir também são contempladas para uso de acordo com a invenção. Para todas as modalidades descritas nas condições a seguir, considera-se que qualquer combinação aplicável de modalidades esteja de acordo com a invenção.

[010] 1.Ácido nucléico isolado, em que a sequência do ácido nucléico isolado compreende uma sequência pelo menos 90% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou pelo menos 90% idêntica a um fragmento da mesma, em que o ácido nucléico isolado compreende a sequência de um promotor constitutivo de Pichia pastoris.

[011] 2.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 1, em que a sequência do ácido nucléico isolado é pelo menos 95% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou pelo menos 95% idêntica a um fragmento da mesma.

[012] 3.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 1, em que a sequência do ácido nucléico isolado é pelo menos 98% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou pelo menos 98% idêntica a um fragmento da mesma.

[013] 4.Sequência de ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 1, em que a sequência do ácido nucléico isolado é uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou um fragmento da mesma.

[014] 5.Ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 4, operacionalmente ligado a uma sequência de codificação heteróloga.

[015] 6.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 5, em que a sequência de codificação heteróloga codifica uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em uma toxina, um anticorpo, um hormônio, uma enzima, um fator de crescimento, uma citocina, uma proteína estrutural, uma proteína imunogênica e uma proteína de sinalização celular.

[016] 7.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 6, em que a proteína é uma enzima para uso em ração animal.

[017] 8.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 7, em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em uma fitase, uma mananase, uma galactosidase, uma amilase, uma glicanase, uma protease, uma celulase e uma xila- nase.

[018] 9.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 8, em que a proteína é uma fitase.

[019] 10.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 8, em que a proteína é uma galactosidase.

[020] 11.Vetor de expressão que compreende o ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 10.

[021] 12.Célula hospedeira que compreende o vetor de expressão, de acordo com a condição 11.

[022] 13.Célula hospedeira que compreende o ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 10.

[023] 14.Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das condições 12 ou 13, em que a célula hospedeira é uma espécie Pichia.

[024] 15.Célula hospedeira, de acordo com a condição 14, em que a espécie Pichia é Pichia pastoris.

[025] 16.Construção de DNA que compreende o ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 10.

[026] 17.Método para produzir uma proteína, sendo que o método compreende a etapa de

[027] cultivar em um meio de cultura uma célula hospedeira que compreende um primeiro cassete de expressão que compreende o ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 4, operacionalmente ligado a uma sequência de codificação heteróloga que codifica uma proteína, em que a cultura é realizada sob condições que permitam a expressão da proteína.

[028] 18.Método, de acordo com a condição 17, em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em uma toxina, um anticorpo, um hormônio, uma enzima, um fator de crescimento, uma citocina, uma proteína estrutural, uma proteína imunogênica e uma proteína de sinalização celular.

[029] 19.Método, de acordo com a condição 18, em que a proteína é uma enzima para uso em ração animal.

[030] 20.Método, de acordo com a condição 19 , em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em uma fitase, uma mananase, uma galactosidase, uma amilase, uma glicanase, uma celulase, uma protease e uma xila- nase.

[031] 21.Método, de acordo com a condição 20, em que a proteína é uma fi- tase.

[032] 22.Método, de acordo com a condição 20, em que a proteína é uma ga-lactosidase.

[033] 23.Método, de acordo com qualquer uma das condições 17 a 22, em que a proteína é expressa usando o primeiro cassete de expressão em combinação com um segundo cassete de expressão.

[034] 24.Método, de acordo com a condição 23, em que o segundo cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência que compreende a sequência de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 em que SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 têm uma atividade promotora, ou qualquer outra sequência promotora AOX 1 ou AOX 2.

[035] 25.Método, de acordo com a condição 24, em que a proteína é expressa usando o primeiro cassete de expressão, o segundo cassete de expressão, e um terceiro cassete de expressão.

[036] 26.Método, de acordo com a condição 25, em que o terceiro cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência pelo menos 90% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou pelo menos 90% idêntica a um fragmento da mesma.

[037] 27.Método, de acordo com a condição 23, em que o segundo cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência pelo menos 90% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou pelo menos 90% idêntica a um fragmento da mesma.

[038] 28.Proteína isolada produzida em consonância com o método, de acordo com qualquer uma das condições 17 a 27.

[039] 29.Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das condições 12 ou 13, em que a célula hospedeira é uma levedura metilotrófica.

[040] 30.Célula hospedeira, de acordo com a condição 29, em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em uma espécie Hansenula, espécie Pichia e espécie Candida.

[041] 31.Célula hospedeira que compreende a construção de DNA, de acordo com a condição 16, em que a célula hospedeira é uma levedura metilotrófica.

[042] 32.Célula hospedeira, de acordo com a condição 31, selecionada a partir do grupo que consiste em uma espécie Hansenula, espécie Pichia e espécie Candida.

[043] 33.Método, de acordo com qualquer uma das condições 17 a 27, em que a célula hospedeira é uma levedura metilotrófica.

[044] 34.Método, de acordo com a condição 33, em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em uma espécie Hansenula, espécie Pichia e espécie Candida.

[045] 35.Método, de acordo com a condição 25, em que o terceiro cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 em que SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 têm uma atividade promotora, ou qualquer outra sequência promotora AOX 1 ou AOX2.

[046] 36.Método para produzir uma ou mais proteínas, sendo que o método compreende a etapa de

[047] cultivar em um meio de cultura uma célula hospedeira que compreende um primeiro cassete de expressão, um segundo cassete de expressão, e um ou mais cassetes de expressão adicionais, em que cada um dentre um ou mais cassetes de expressão adicionais compreende o ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 4, operacionalmente ligado a uma sequência de codificação heteróloga que codifica uma ou mais proteínas, em que a cultura é realizada sob condições que permitam uma expressão de uma ou mais proteínas.

[048] 37.Método, de acordo com a condição 17, que compreende, ainda, a etapa de purificar a proteína a partir do meio da célula hospedeira culturada.

[049] 38.Método, de acordo com a condição 36, que compreende, ainda, a etapa de purificar uma ou mais proteínas a partir do meio da célula hospedeira cultu- rada.

[050] 39.Ácido nucléico isolado, célula hospedeira, vetor de expressão, proteína isolada, construção de DNA, ou método, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 38, em que o ácido nucléico isolado consiste em qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 2, ou um fragmento da mesma.

[051] 40.Ácido nucléico isolado que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 2, ou um fragmento da mesma.

[052] 41.Célula hospedeira, de acordo com a condição 12 ou 13, em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em uma espécie Han- senula, espécie Pichia, espécie Saccharomyces, espécie Schizosaccharomyces, espécie Torulaspora, uma espécie Candida, uma espécie Yarrowia e espécie Kluve- romyces.

[053] 42.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 5, em que a sequência de codificação heteróloga codifica uma proteína ou polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em uma toxina, um anticorpo, um hormônio, uma enzima, um fator de crescimento, uma citocina, uma proteína estrutural, uma proteína imunogênica e uma proteína de sinalização celular.

[054] 43.Método para produzir uma proteína ou um polipeptídeo, sendo que o método compreende a etapa de

[055] cultivar em um meio de cultura uma célula hospedeira que compreende um primeiro cassete de expressão que compreende o ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 4, operacionalmente ligado a uma sequência de codificação heteróloga que codifica uma proteína, em que a cultura é realizada sob condições que permitam uma expressão da proteína.

[056] 44.Método, de acordo com a condição 23, em que o segundo cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência que compreende a sequência de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 em que SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 têm uma atividade promotora, ou qualquer outra sequência promotora.

[057] 45.Método, de acordo com a condição 25, em que o terceiro cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 em que SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 têm uma atividade promotora, ou qualquer outra sequência promotora.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[058] A Figura 1 mostra a sequência nucleotídica do promotor Chr1-0469 (SEQ ID NO: 1).

[059] A Figura 2 mostra a sequência nucleotídica do promotor UPP (SEQ ID NO: 2).

[060] A Figura 3 mostra a sequência nucleotídica da sequência promotora AOX1 (SEQ ID NO:3).

[061] A Figura 4 mostra a sequência genômica 1000bp a jusante do códon de partida ATG do promotor AOX1 (SEQ ID NO:4).

[062] A Figura 5 mostra o nível de expressão GFP para vários transformantes em placas de reprodução.

[063] A Figura 6 mostra a atividade promotora relativa para os promotores pUPP, TEF2, Chr1-0469, GAP, AOX1 e DAS sob várias condições.

[064] A Figura 7 mostra o mapa de um vetor repórter. Vetores similares foram usados com ORF alfa e beta-Galactosidase, bem como com, ou sem um sinal de secreção (fator alfa de acasalamento)

[065] A Figura 8 mostra a sequência nucleotídica de iniciadores dianteiros usados para isolamento do promotor Chr1-0469 (SEQ ID NO: 1) e do promotor UPP (SEQ ID NO: 2) a partir do DNA genômico Pichia pastoris por PCR. Os fragmentos de DNA correspondentes - produtos dessas reações PCR - são introduzidos no vetor repórter com ORF alfa-Galactosidase (Figura 7).

[066] A Figura 9 (painéis A - C) mostra o nível de expressão de alfa-Galacto- sidase a partir de transformantes isolados com as construções promotor-repórter indicadas.

[067] A Figura 10 mostra a atividade da fitase E.coli appA2 em Pichia pastoris. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS

[068] Em uma modalidade ilustrativa da invenção, proporciona-se um ácido nucléico isolado em que a sequência do ácido nucléico isolado compreende a sequência, por exemplo, pelo menos 90%, 95%, ou 98% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 conforme descrito no presente documento, ou pelo menos 90%, 95%, ou 98% idêntica a um fragmento da mesma, em que o ácido nucléico compreende a sequência de um promotor constitutivo de Pichia pastoris. Em outra modalidade, a sequência de ácido nucléico isolado é uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou um fragmento da mesma. Em outras modalidades, proporcionam- se vetores de expressão, células hospedeiras, e construções de DNA que compreendem essas sequências promotoras.

[069] Os promotores descritos anteriormente foram isolados a partir de uma cepa de levedura (isto é, NRRL Y11430) atualmente classificada como uma cepa de levedura de Pichia pastoris. No entanto, a classificação pode se alterar em algum ponto a uma espécie Komagataella (por exemplo, Komagataella phaffii).

[070] Em outra modalidade, proporciona-se um método para produzir uma proteína usando essas sequências promotoras. O método compreende as etapas de cultivar em um meio de cultura uma célula hospedeira que compreende um primeiro cassete de expressão que compreende qualquer uma das sequências promotoras anteriores operacionalmente ligadas a uma sequência de codificação heteróloga que codifica uma proteína, em que a cultura é realizada sob condições que permitam a expressão da proteína. Em outra modalidade ilustrativa, proporciona-se uma proteína isolada produzida de acordo com esse método.

[071] Todas as modalidades descritas na lista de condições a seguir são contempladas para uso de acordo com a invenção. Para todas as modalidades descritas nas condições a seguir, considera-se que qualquer combinação aplicável de modalidades esteja de acordo com a invenção. Qualquer modalidade descrita na lista de condições a seguir também é contemplada para uso com qualquer modalidade descrita na seção do Sumário da Invenção desse pedido ou na seção da Descrição Detalhada das Modalidades Ilustrativas deste pedido.

[072] 1.Ácido nucléico isolado, em que a sequência do ácido nucléico isolado compreende uma sequência pelo menos 90% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou pelo menos 90% idêntica a um fragmento da mesma, em que o ácido nucléico isolado compreende a sequência de um promotor constitutivo de Pichia pastoris.

[073] 2.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 1, em que a sequência do ácido nucléico isolado é pelo menos 95% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou pelo menos 95% idêntica a um fragmento da mesma.

[074] 3.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 1, em que a sequência do ácido nucléico isolado é pelo menos 98% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou pelo menos 98% idêntica a um fragmento da mesma.

[075] 4.Sequência de ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 1, em que a sequência do ácido nucléico isolado é uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou um fragmento da mesma.

[076] 5.Ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 4, operacionalmente ligado a uma sequência de codificação heteróloga.

[077] 6.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 5, em que a sequência de codificação heteróloga codifica uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em uma toxina, um anticorpo, um hormônio, uma enzima, um fator de crescimento, uma citocina, uma proteína estrutural, uma proteína imunogênica, e uma proteína de sinalização celular.

[078] 7.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 6, em que a proteína é uma enzima para uso em ração animal.

[079] 8.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 7, em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em a fitase, uma mananase, uma galactosidase, uma amilase, uma glicanase, uma protease, uma celulase e uma xilanase.

[080] 9.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 8, em que a proteína é fitase.

[081] 10.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 8, em que a proteína é uma galactosidase.

[082] 11.Vetor de expressão, que compreende o ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 10.

[083] 12.Célula hospedeira que compreende o vetor de expressão, de acordo com a condição 11.

[084] 13.Célula hospedeira que compreende o ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 10.

[085] 14.Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das condições 12 ou 13, em que a célula hospedeira é uma espécie Pichia.

[086] 15.Célula hospedeira, de acordo com a condição 14, em que a espécie Pichia é Pichia pastoris.

[087] 16.Construção de DNA que compreende o ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 10.

[088] 17.Método para produzir uma proteína, sendo que o método compreende a etapa de

[089] cultivar em um meio de cultura uma célula hospedeira que compreende um primeiro cassete de expressão que compreende o ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 4, operacionalmente ligado a uma sequência de codificação heteróloga que codifica uma proteína, em que a cultura é realizada sob condições que permitam a expressão da proteína.

[090] 18.Método, de acordo com a condição 17, em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em uma toxina, um anticorpo, um hormônio, uma enzima, um fator de crescimento, uma citocina, uma proteína estrutural, uma proteína imunogênica, e uma proteína de sinalização celular.

[091] 19.Método, de acordo com a condição 18, em que a proteína é uma enzima para uso em ração animal.

[092] 20.Método, de acordo com a condição 19, em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em uma fitase, uma mananase, uma galactosidase, uma amilase, uma glicanase, uma celulase, uma protease e uma xilanase.

[093] 21.Método, de acordo com a condição 20, em que a proteína é uma fi- tase.

[094] 22.Método, de acordo com a condição 20, em que a proteína é uma ga-lactosidase.

[095] 23.Método, de acordo com qualquer uma das condições 17 a 22, em que a proteína é expressa usando o primeiro cassete de expressão em combinação com um segundo cassete de expressão.

[096] 24.Método, de acordo com a condição 23, em que o segundo cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência que compreende a sequência de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 em que SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 têm uma atividade promotora, ou qualquer outra sequência promotora AOX 1 ou AOX 2.

[097] 25.Método, de acordo com a condição 24, em que a proteína é expressa usando o primeiro cassete de expressão, o segundo cassete de expressão, e um terceiro cassete de expressão.

[098] 26.Método, de acordo com a condição 25, em que o terceiro cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência pelo menos 90% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou pelo menos 90% idêntica a um fragmento da mesma.

[099] 27.Método, de acordo com a condição 23, em que o segundo cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência pelo menos 90% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou pelo menos 90% idêntica a um fragmento da mesma.

[0100] 28.Proteína isolada produzida em consonância com o método, de acordo com qualquer uma das condições 17 a 27.

[0101] 29.Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das condições 12 ou 13, em que a célula hospedeira é uma levedura metilotrófica.

[0102] 30.Célula hospedeira, de acordo com a condição 29, em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em espécie Hansenula, espécie Pichia e espécie Candida.

[0103] 31.Célula hospedeira que compreende a construção de DNA, de acordo com a condição 16, em que a célula hospedeira é uma levedura metilotrófica.

[0104] 32.Célula hospedeira, de acordo com a condição 31, selecionada a partir do grupo que consiste em espécie Hansenula, espécie Pichia e espécie Candida.

[0105] 33.Método, de acordo com qualquer uma das condições 17 a 27, em que a célula hospedeira é uma levedura metilotrófica.

[0106] 34.Método, de acordo com a condição 33, em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em espécie Hansenula, espécie Pichia e espécie Candida.

[0107] 35.Método, de acordo com a condição 25, em que o terceiro cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 em que SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 têm uma atividade promotora, ou qualquer outra sequência promotora AOX 1 ou AOX 2.

[0108] 36.Método para produzir uma ou mais proteínas, sendo que o método compreende a etapa de

[0109] cultivar em um meio de cultura uma célula hospedeira que compreende um primeiro cassete de expressão, um segundo cassete de expressão, e um ou mais cassetes de expressão adicionais, em que cada um dentre um ou mais cassetes de expressão adicionais compreende o ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 4, operacionalmente ligado a uma sequência de codificação heteróloga que codifica uma ou mais proteínas, em que a cultura é realizada sob condições que permitam a expressão de uma ou mais proteínas.

[0110] 37.Método, de acordo com a condição 17, que compreende, ainda, a etapa de purificar a partir do meio da célula hospedeira culturada.

[0111] 38.Método, de acordo com a condição 36, que compreende, ainda, a etapa de purificar uma ou mais proteínas a partir do meio da célula hospedeira cultu- rada.

[0112] 39.Ácido nucléico isolado, célula hospedeira, vetor de expressão, proteína isolada, construção de DNA, ou método, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 38, em que o ácido nucléico isolado consiste em qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 2, ou um fragmento da mesma.

[0113] 40.Ácido nucléico isolado que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 2, ou um fragmento da mesma.

[0114] 41.Célula hospedeira, de acordo com a condição 12 ou 13, em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em espécie Hansenula, espécie Pichia, espécie Saccharomyces, espécie Schizosaccharomyces, espécie To- rulaspora, espécie Candida, espécie Yarrowia e espécie Kluveromyces.

[0115] 42.Ácido nucléico isolado, de acordo com a condição 5, em que a sequência de codificação heteróloga codifica uma proteína ou polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em uma toxina, um anticorpo, um hormônio, uma enzima, um fator de crescimento, uma citocina, uma proteína estrutural, uma proteína imunogênica e uma proteína de sinalização celular.

[0116] 43.Método para produzir uma proteína ou um polipeptídeo, sendo que o método compreende a etapa de

[0117] cultivar em um meio de cultura a célula hospedeira que compreende um primeiro cassete de expressão que compreende o ácido nucléico isolado, de acordo com qualquer uma das condições 1 a 4, operacionalmente ligado a uma sequência de codificação heteróloga que codifica uma proteína, em que a cultura é realizada sob condições que permitam a expressão da proteína.

[0118] 44.Método, de acordo com a condição 23, em que o segundo cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a pro-teína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência que compreende a sequência de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 em que SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 têm uma atividade promotora, ou qualquer outra sequência promotora.

[0119] 45.Método, de acordo com a condição 25, em que o terceiro cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 em que SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 têm uma atividade promotora, ou qualquer outra sequência promotora.

[0120] Os termos “consiste em” ou “que consiste em” significam que a sequência especificada pela SEQ ID NO. não tem sequências nucleotídicas adicionais além daquelas correspondentes a SEQ ID NO.

[0121] Qualquer sistema de expressão de levedura conhecido pelos indivíduos versados na técnica pode ser usado de acordo com a presente invenção. Por exemplo, vários sistemas de expressão de levedura são descritos nas Patentes nos U.S. 6.451.572, 6.841.370, 6.974.690, 7.320.876, 7.078.035, 7.138.260, e na Publicação PCT no WO 2007/112739, estando todas aqui incorporadas a título de referência. Em qualquer uma das modalidades descritas no presente documento, pode-se usar qualquer um desses sistemas de expressão de levedura. Alternativamente, qualquer espécie de levedura ou sistema de expressão de levedura adequado para expressão de uma proteína pode ser usado incluindo espécies de levedura, como espécie Sac- charomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), espécie Kluyveromyces (por exemplo, Kluyveromyces lactis), espécie Torulaspora, espécie Yarrowia (por exemplo, Yarrowia lipolitica), espécie Schizosaccharomyces (por exemplo, Schizosaccha- romyces pombe). Em outra modalidade, pode-se usar uma espécie de levedura meti- lotrófica, como espécie Pichia (por exemplo, Pichia pastoris ou Pichia methanolica), espécie Hansenula (por exemplo, Hansenula polymorpha), espécie Torulopsis, espécie Komagataella, espécie Candida (por exemplo, Candida boidinii), e espécie Karwinskia. Em uma modalidade, a proteína pode ser expressa na levedura metilotró- fica Pichia pastoris. A levedura metilotrófica é capaz de utilizar metanol como a única fonte de carbono para a produção dos recursos de energia necessários para manter a função celular. A levedura metilotrófica contém genes que codificam enzimas para utilização de metanol, tais como genes que codificam álcool oxidase. Qualquer uma dessas células hospedeiras pode ser uma cepa de célula hospedeira que seja hete- róloga ao promoter descrito no presente documento (isto é, a célula hospedeira não contém normalmente por natureza o promotor descrito no presente documento).

[0122] Pode-se usar um sistema de expressão de levedura para produzir uma quantidade suficiente da proteína intracelularmente, ou secretado a partir de células de levedura de modo que a proteína possa ser convenientemente isolada e purificada a partir do meio de cultura. Conforme o uso em questão, o termo “expressão” significa transcrição e/ou translação de um ácido nucléico em uma célula hospedeira. Um sistema de expressão de levedura pode incluir, mas não se limita a, célula hospedeira de levedura e vetor de expressão (por exemplo, uma construção de DNA) usada para expressar a proteína. O vetor de expressão pode conter um promotor descrito no presente documento e, conforme conhecido na técnica, o promotor é heterólogo ao vetor de expressão (isto é, a combinação não ocorre por natureza). Em uma modalidade, a secreção da proteína no meio de cultura é controlada por um peptídeo de sinal (por exemplo, o peptídeo de sinal de α-fator de levedura, o peptídeo de sinal de levedura KILM1, o peptídeo de sinal de levedura PHO1, ou o peptídeo de sinal de levedura SUC2) incorporado no vetor de expressão e que seja capaz de direcionar a secreção da proteína expressa para fora da célula de levedura. Em outras modalidades, outros peptídeos de sinal adequados para facilitar a secreção da proteína a partir das células de levedura são conhecidos pelos indivíduos versados na técnica. Em um aspecto, o peptídeo de sinal é tipicamente clivado a partir da proteína após a secreção.

[0123] Em várias modalidades, pode-se usar qualquer vetor de expressão conhecido por um artesão versado na técnica (por exemplo, um vetor que replique autonomamente ou se integre ao genoma hospedeiro) e compatível a um sistema de expressão de levedura. Conforme o uso em questão, o termo “vetor” significa qualquer plasmídeo, ou outro vetor, em forma de filamento duplo ou filamento único ou em forma linear ou circular que possa transformar uma célula de levedura por integração no genoma de célula de levedura ou estando presente de modo extracromossômico (por exemplo, um plasmídeo de replicação autônoma). Conforme conhecido na técnica, um vetor (por exemplo, vetor de expressão ou cassete de expressão) é uma construção de ácido nucléico usada para transformar uma célula hospedeira para expressão de uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo e o vetor não é encontrado na natureza na célula hospedeira que ele transforma.

[0124] Em uma modalidade, o vetor de expressão tem sitos de clivagem de endonuclease de restrição para a inserção de fragmentos de DNA (por exemplo, um ou mais sítios de clonagem e/ou um sítio de clonagem múltipla), e marcadores genéticos para seleção de transformantes. Por exemplo, os marcadores genéticos para seleção de transformantes podem incluir um marcador de seleção que permita que uma levedura transformada se desenvolva em um meio desprovido de um nutriente necessário que não pode ser produzido por uma cepa deficiente, um marcador de seleção que codifica uma enzima à qual os substratos cromogênicos são conhecidos, ou um marcador de seleção que proporcione resistência a um fármaco, incluindo, sem limitação, G418, Nourseotricina (Nat), Zeocina, Blasticidina, ou Higromicina. Em outra modalidade, o vetor de expressão tem uma sequência terminadora para terminação de transcrição (por exemplo, o terminador AOX 1 ou HSP150). Em outra modalidade, o vetor de expressão tem uma região não-transladada 3’ a jusante da proteína que codifica a sequência com um sítio de poliadenilação. Conforme o uso em questão, “região não-transladada 3’” significa sequências nucleotídicas que não sejam transladadas em proteína e estejam localizadas a jusante de uma sequência de codificação para uma proteína. Tipicamente, uma região não-transladada 3’ inclui sequências regulatórias para processamento de mRNA. Em outra modalidade, o vetor de expressão tem uma origem de replicação (por exemplo, uma origem bacteriana de replicação) para uso na síntese e amplificação do vetor, por exemplo, em um hospedeiro bacteriano. Vários vetores de expressão são descritos nas Patentes nos U.S. 6.451.572, 6.841.370, 6.974.690, 7.320.876, 7.078.035, 7.138.260, e na Publicação PCT no WO 2007/112739, todas aqui incorporadas a título de referência. A construção e uso de vetores de expressão são descritos em Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001), aqui incorporado a título de referência. Em outra modalidade, o vetor de expressão, ou um fragmento do mesmo, pode ser sintetizado de novo ou PCR pode ser usado para amplificar e unir as seções de vetores de expressão.

[0125] Conforme o uso em questão, “sequências regulatórias” significam sequências nucleotídicas que estejam tipicamente a montante ou a jusante da extremidade 5’ ou 3’, respectivamente, de uma sequência de codificação de proteína. As sequências regulatórias não são transladadas em proteína. As sequências regulatórias incluem, mas não se limitam a, sequências que afetem o processamento ou estabilidade de RNA, como sequências de sinal de poliadenilação, acentuadores, sítios de aglutinação repressores, e promotores.

[0126] Em uma modalidade, a sequência de codificação de proteína pode ser operacionalmente ligada no vetor de expressão à sequência promotora capaz de direcionar a expressão da proteína, por exemplo, em levedura. Conforme o uso em questão, “operacionalmente ligado(a)” significa funcionalmente ligado(a). Conforme descrito no presente documento, o promotor pode ser um “promotor constitutivo”. Um “promotor constitutivo” significa um promotor que regula a expressão de um gene de interesse. O termo “promotor constitutivo” é conhecido na técnica. Um promotor constitutivo pode ter alguma atividade induzível, mas a atividade máxima obtida pelo promotor não é induzível.

[0127] Conforme o uso em questão “promotor” significa uma sequência nucle- otídica tipicamente localizada a montante da extremidade 5’ de uma sequência de codificação para uma proteína que controla a transcrição de RNA a partir do DNA, em parte, interagindo-se com vários fatores regulatórios que controlam a transcrição. Em uma modalidade, o promotor pode ser derivado a partir da mesma espécie de levedura que a célula hospedeira de levedura usada para expressão de proteína. Em outra modalidade, o promotor pode ser derivado a partir de uma espécie de levedura diferente da célula hospedeira de levedura usada para expressão de proteína. Em uma modalidade, um promotor pode incluir uma sequência TATA box que atua como um sítio de reconhecimento para direcionar a iniciação de transcrição, incluindo, sem li-mitação, um ou mais elementos acentuadores transcricionais. Os elementos acentu- adores podem ser proximais ou distais à sequência TATA box e podem estar em uma orientação 5’ a 3’ normal ou podem estar em uma orientação 3’ a 5’. Em outra modalidade, um elemento acentuador pode ser um elemento acentuador nativo à sequência promotora ou pode ser um elemento acentuador heterólogo inserido na construção de vetor de expressão. Um “elemento acentuador” conforme o uso em questão é um elemento regulatório que pode simular uma atividade promotora.

[0128] Em várias modalidades ilustrativas descritas no presente documento, o promotor pode ser um ácido nucléico isolado em que a sequência do ácido nucléico isolado compreende uma sequência pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica a um fragmento da mesma, em que o ácido nucléico isolado compreende a sequência de um promotor constitutivo de Pichia pastoris. Em outra modalidade, a sequência de ácido nucléico isolado é uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou um fragmento da mesma em que o ácido nucléico isolado compreende a sequência de um promotor constitutivo de Pichia pastoris.

[0129] Conforme o uso em questão “um ácido nucléico isolado” significa um ácido nucléico que seja substancialmente isento de sequências que flanqueiam naturalmente o ácido nucléico no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucléico é derivado. Por exemplo, em várias modalidades, um ácido nucléico isolado de acordo com a invenção pode conter menos de cerca de 2 kb, menos de cerca de 1 kb, menos de cerca de 0,5 kb, menos de cerca de 0,1 kb de sequências nucleotídi- cas, menos de cerca de 0,05 kb, ou nenhuma sequência nucleotídica que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucléico no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucléico isolado é derivado.

[0130] Conforme o uso em questão, “um fragmento do(a) mesmo(a)” ao se referir à molécula de ácido nucléico isolado significa um fragmento do ácido nucléico isolado de SEQ ID NOS: 1 a 2. Em várias modalidades ilustrativas, o fragmento pode ter cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, cerca de 200 nucleotídeos de comprimento, cerca de 300 nucleotídeos de comprimento, cerca de nucleotídeos de comprimento, cerca de 500 nucleotídeos de comprimento, cerca de 600 nucleotídeos de comprimento, cerca de 700 nucleotídeos de comprimento, cerca de 800 nucleotídeos de comprimento, ou cerca de 900 nucle- otídeos de comprimento. Em outras modalidades, o fragmento pode se estender cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 300 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos, cerca de 700 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos, ou cerca de 900 nucleotídeos a montante da extremidade 3’ do ácido nucléico isolado de qualquer SEQ ID NOS: 1 a 2. Em ainda outras modalidades, o fragmento pode incluir cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 300 nucleotídeos, ou cerca de 350 nucleotídeos a montante e/ou a jusante a partir da sequência TATA box encontrada em cada uma das SEQ ID NOS: 1 a 2.

[0131] Em várias modalidades, os ácidos nucléicos isolados descritos no presente documento podem ser purificados por técnicas de purificação de ácidos nucléi- cos (por exemplo, DNA) que sejam bem conhecidas na técnica. Por exemplo, os ácidos nucléicos podem ser separados dos contaminantes por métodos físicos que incluem, mas não se limitam a, centrifugação, técnicas de pressão, ou utilizando-se uma substância com afinidade por ácidos nucléicos (por exemplo, DNA), como, por exemplo, microesferas de sílica. Após uma lavagem suficiente, os ácidos nucléicos isolados podem ser suspensos em água ou em um tampão. Em outras modalidades, kits comerciais se encontram disponíveis, como Qiagen™, Nuclisensm™, e Wizard™ (Pro- mega), e Promegam™. Descrevem-se métodos para purificar ácidos nucléicos em Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001), aqui incorporado a título de referência. Um ácido nucléico isolado conforme descrito no presente documento pode ser um ácido nu- cléico isolado que também seja purificado, ou o ácido nucléico isolado pode ser impuro. Um “ácido nucléico purificado” é substancialmente isento de outro material celular, ou meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes, ou substancialmente isentos de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados.

[0132] Os ácidos nucléicos isolados descritos no presente documento têm capacidade de hibridização específica, sob condições de hibridização apropriadas (por exemplo, tampão apropriado, resistência iônica, temperatura, formamida, e concentrações de MgCl2), a um ácido nucléico complementar. Os ácidos nucléicos isolados descritos no presente documento podem ser modificados por substituição, eliminação, truncamento, e/ou podem ser fundidos a outras moléculas de ácido nucléico em que os ácidos nucléicos isolados resultantes se hibridizam especificamente aos ácidos nu- cléicos complementares.

[0133] Ácidos nucléicos complementares aos ácidos nucléicos isolados também se encontram no escopo da invenção, ou fragmentos desses, descritos no presente documento, e aqueles que se hibridizam nos ácidos nucléicos isolados descritos no presente documento ou aqueles que se hibridizam em seus complementos sob condições altamente estringentes. Conforme o uso em questão, o termo “complementar” se refere à capacidade de sequências nucleotídicas de purina e pirimidina em se associarem através de ligação de hidrogênio para formar moléculas de ácido nucléico de fita dupla. Guanina e citosina, adenina e timina, e adenina e uracila são complementares e podem se associar através de ligação de hidrogênio resultando na formação de moléculas de ácido nucléico de fita dupla quando duas moléculas de ácido nucléico tiverem sequências “complementares”. As sequências de DNA complementares são referidas como um “complemento.”

[0134] De acordo com a invenção, “condições altamente estringentes” significam hibridização a 65°C em 5X SSPE e formamida a 50%, e lavagem a 65°C em 0,5X SSPE. Condições para hibridização de alta estringência são descritas em Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001), aqui incorporado a título de referência. Em alguns aspectos ilustrativos, a hibridização pode ocorrer ao longo do comprimento total do ácido nucléico isolado, ou ao longo de parte de seu comprimento, ou a um fragmento do mesmo.

[0135] Moléculas de ácido nucléico isolado tendo cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade aos ácidos nucléicos isolados descritos no presente documento também são incluídas, ou a um fragmento da mesma. A determinação da identidade percentual ou similaridade entre sequências pode ser realizada, por exemplo, utilizando-se o programa GAP (Genetics Computer Group, software; agora disponível via Accelrys em http://www.accelrys.com), e alinhamentos podem ser realizados usando, por exemplo, o algoritmo ClustalW (software VNTI, In- forMax Inc.). Um banco de dados de sequência pode ser buscado usando a sequência de ácido nucléico isolado de interesse, ou a sequência de um fragmento da mesma. Os algoritmos para busca em banco de dados são tipicamente baseados no software BLAST (Altschul et al., 1990). Em algumas modalidades, a identidade percentual pode ser determinada ao longo do comprimento total do ácido nucléico isolado.

[0136] As técnicas para sintetizar os ácidos nucléicos isolados descritos no presente documento são bem conhecidas na técnica e incluem sínteses químicas e métodos recombinantes. Essas técnicas são descritas em Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001), aqui incorporado a título de referência. As moléculas de ácido nucléico isolado também podem ser produzidas comercialmente. As técnicas para sintetizar os ácidos nucléicos isolados descritos no presente documento são bem conhecidas na técnica. Os ácidos nucléicos isolados descritos no presente documento podem ser analisados por técnicas conhecidas na técnica, como análise ou sequenciamento de enzima de restrição, para determinar a sequência dos ácidos nucléicos isolados. Logo, os ácidos nucléicos isolados descritos no presente documento podem ser sintéticos.

[0137] Em aspectos ilustrativos, as células de levedura são transformadas por um vetor de expressão que compreende um ácido nucléico heterólogo que codifica a proteína de interesse operacionalmente ligada a um dos promotores descritos no presente documento usando procedimentos bem conhecidos pelos indivíduos versados na técnica. O termo “transformação” significa a transferência de um ácido nucléico, ou um fragmento de ácido nucléico, a uma célula hospedeira. Em modalidades ilustrativas, esses protocolos de transformação incluem eletroporação, métodos de acetato de lítio, e uso de esferoplastos. Em aspectos ilustrativos, a sequências de codificação de ácido nucléico expresso pode ser uma sequência de codificação de ácido nucléico heterólogo. Conforme o uso em questão, uma sequência de codificação heteróloga é definida como um ácido nucléico artificial ou sintético ou um ácido nucléico originário a partir de uma espécie diferente da espécie a partir da qual a sequência promotora foi derivada. Logo, uma sequência de codificação heteróloga ligada a um promotor descrito no presente documento não ocorre na natureza.

[0138] Em várias modalidades, as células de levedura transformadas podem ser desenvolvidas por técnicas que incluem fermentação em lote e contínua em um meio líquido ou em um meio semi-sólido, ou um meio sólido. Tipicamente, “condições que permitam a expressão da proteína” conforme o uso em questão significam condições para fermentação em lote ou contínua de levedura em um meio líquido, mas não se exclui o desenvolvimento em um meio semi-sólido, como agar. Os meios de cultura para células de levedura são conhecidos na técnica e são tipicamente suplementados por uma fonte de carbono (por exemplo, glicose). Um meio de cultura de levedura típico é um caldo YPD (Sunrise Science Products, Inc.) que compreende extrato de levedura (10 gramas), peptona Bacto (20 gramas), e dextrose (20 gramas). Em um aspecto ilustrativo, as células de levedura transformadas podem ser desenvolvidas aerobicamente a 30°C em um ambiente de pH controlado (um pH de cerca de 6) e com a fonte de carbono (por exemplo, glicose) mantida continuamente em um nível predeterminado conhecido para suportar o crescimento das células de levedura a uma densidade desejada dentro de um período de tempo específico.

[0139] Em uma modalidade ilustrativa, proporciona-se um método para produzir uma proteína. O método compreende a etapa de cultivar em um meio de cultura uma célula hospedeira que compreende um primeiro cassete de expressão que compreende um ácido nucléico isolado de qualquer um dos SEQ ID NOS: 1 a 2, ou um fragmento do mesmo, operacionalmente ligado a uma sequência de codificação hete- róloga que codifica uma proteína, em que a cultura é realizada sob condições que permitam a expressão da proteína. O método pode compreender, ainda, a etapa de purificar a proteína a partir do meio da célula hospedeira culturada. Conforme o uso em questão, um “cassete de expressão” significa os elementos de um vetor de expressão que direciona a célula de levedura a produzir RNA. Um cassete de expressão compreende pelo menos sequências regulatórias (por exemplo, um promotor) e uma sequência de codificação para RNA e proteína (isto é, uma fase de leitura aberta, ORF). O ácido nucléico isolado pode ser pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% homólogo ao ácido nucléico isolado de qualquer um dos SEQ ID NOS: 1 a 2, ou um fragmento do mesmo. Em vários aspectos ilustrativos, a sequência de codificação de proteína pode ser proveniente de uma bactéria, uma levedura, um fungo, ou um vírus.

[0140] Nessa modalidade de método, a proteína pode ser expressa usando o primeiro cassete de expressão em combinação com um segundo cassete de expressão. Em outra modalidade, o segundo cassete de expressão pode compreender 1) a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência que compreende a sequência de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 em que SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 têm uma atividade promotora, ou qualquer outro promotor regulado por metanol conhecido, como sequências promotoras AOX 1, AOX 2, FLD, ou DAS, ou 2) o ácido nucléico isolado de qualquer um entre SEQ ID NOS: 1 a 2, ou um fragmento do mesmo, operacionalmente ligado à sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína.

[0141] Ainda em outra modalidade, a proteína pode ser expressa usando o primeiro cassete de expressão, o segundo cassete de expressão, e um terceiro cassete de expressão. Em outro aspecto ilustrativo, o terceiro cassete de expressão pode compreender 1) a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência que compreende a sequência de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 em que SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 têm uma atividade promotora, ou quaisquer outros promotores regulados por metanol conhecidos, como sequências promotoras AOX 1, AOX 2, FLD, ou DAS, ou 2) o ácido nucléico isolado de qualquer um entre SEQ ID NOS: 1 a 2, ou um fragmento do mesmo, operacionalmente ligado à sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína.

[0142] Em outra modalidade, pode-se usar qualquer número de cassetes de expressão adicionais e os cassetes de expressão podem compreender 1) a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência que compreende a sequência de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 em que SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 têm uma atividade promotora, ou quaisquer outros promotores regulados por metanol conhecidos, como sequências promotoras AOX 1, AOX 2, FLD, ou DAS, ou 2) o ácido nucléico isolado de qualquer um entre SEQ ID NOS: 1 a 2, ou um fragmento do mesmo, operacionalmente ligado à sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína. Em outra modalidade, o primeiro cassete de expressão, o segundo cassete de expressão, e o terceiro cassete de expressão conforme descrito acima são usados no método, junto a um quarto cassete de expressão, um quinto cassete de expressão, e um sexto cassete de expressão em que todos os cassetes de expressão compreendem o ácido nucléico isolado de qualquer um entre SEQ ID NOS: 1 a 2, ou um fragmento do mesmo, operacionalmente ligado à sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína.

[0143] Ainda em outra modalidade, proporciona-se um método para produzir uma ou mais proteínas. O método compreende a etapa de cultivar em um meio de cultura uma célula hospedeira que compreende um primeiro cassete de expressão, um segundo cassete de expressão, e, opcionalmente, um ou mais cassetes de expressão adicionais, em que cada um dos cassetes de expressão compreende 1) uma sequência de codificação heteróloga que codifica uma ou mais proteínas operacionalmente ligadas a um ácido nucléico isolado tendo uma sequência que compreende a sequência de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4 em que SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 têm uma atividade promotora, ou quaisquer outros promotores regulados por metanol conhecidos, como sequências promotoras AOX 1, AOX 2, FLD, ou DAS, ou 2) o ácido nucléico isolado de qualquer um entre SEQ ID NOS: 1 a 2, ou um fragmento do mesmo, operacionalmente ligado a uma sequência de codificação heteróloga que codifica uma ou mais proteínas, em que a cultura é realizada sob condições que permitam a expressão de uma ou mais proteínas. O método pode compreender, ainda, a etapa de purificar uma ou mais proteínas a partir do meio da célula hospedeira cultivada.

[0144] Em qualquer uma das modalidades descritas nos dois parágrafos anteriores, o ácido nucléico isolado pode ser pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% homólogo ao ácido nucléico isolado de qualquer um dos SEQ ID NOS: 1 a 2, ou um fragmento do mesmo. Em qualquer uma das modalidades descritas nos dois parágrafos anteriores, os cassetes de expressão podem ser incluídos em um vetor de expressão ou em múltiplos vetores de expressão. Em qualquer uma das modalidades descritas nos dois parágrafos anteriores, os vetores de expressão nos quais os cassetes de expressão são incorporados podem ser vetores que se replicam autonomamente ou que se integram no genoma da célula hospedeira.

[0145] Em várias modalidades ilustrativas, a proteína codificada por qualquer uma das sequências de codificação heterólogas descritas no presente documento operacionalmente ligadas ao promotor pode ser uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em uma toxina, um anticorpo, um hormônio, uma enzima, um fator de crescimento, uma citocina, uma proteína estrutural, uma proteína imunogênica (por exemplo, um antígeno de vacina), e uma proteína de sinalização celular. Em uma modalidade, a proteína é uma enzima para uso em ração animal. Nessa modalidade, a proteína pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma fitase, uma mananase, uma galactosidase, uma amilase, uma glicanase, uma celulase, uma protease, e uma xilanase. Em outra modalidade, a proteína pode ser uma enzima útil para glicosilação. Em outro aspecto, mais de uma proteína pode ser expressa utilizando- se múltiplos cassetes de expressão, cada um com uma sequência de codificação he- teróloga, operacionalmente ligada a um promotor. No entanto, esses exemplos de proteína são não-limitantes e qualquer proteína ou peptídeo ou polipeptídeo capaz de ser expresso em levedura podem ser expressos de acordo com os ácidos nucléicos isolados, vetores de expressão, células hospedeiras, construções de DNA, métodos, e proteínas isoladas descritas no presente documento. As enzimas descritas acima podem ser provenientes de qualquer espécie (por exemplo, espécie fúngica, como uma espécie de levedura).

[0146] As proteínas expressas por levedura para uso de acordo com a presente invenção podem ser produzidas sob a forma purificada por técnicas convencionais. Conforme o uso em questão, “proteína isolada” significa uma proteína purificada. Uma proteína purificada é substancialmente isenta de outros contaminantes de célula de levedura ou contaminantes provenientes do meio de cultura. Por exemplo, “substancialmente isento” de outros contaminantes de célula de levedura ou contaminantes provenientes do meio de cultura significa que a proteína é pelo menos cerca de 60% pura, pelo menos cerca de 70% pura, pelo menos cerca de 80% pura, pelo menos cerca de 90% pura, pelo menos cerca de 95% pura, pelo menos cerca de 98% pura, cerca de 60% pura, cerca de 70% pura, cerca de 80% pura, cerca de 90% pura, cerca de 95% pura, ou cerca de 98% pura (todos com base no peso seco). Tipicamente, a proteína é secretada no levedura meio de cultura e é coletada a partir do meio de cultura.

[0147] Em uma modalidade ilustrativa, para purificação a partir do meio de cultura a proteína pode, por exemplo, ser submetida à precipitação de sulfato de amô- nio seguido por cromatografia de coluna DEAE-Sefarose. Em outras modalidades, técnicas convencionais conhecidas pelos indivíduos versados na técnica podem ser usadas, tal como precipitação de sulfato de amônio ou etanol, extração de ácido, filtração de gel, cromatografia por troca de ânions ou cátions, cromatografia de colina DEAE-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia de lectina, cromato- grafia de afinidade, extração solvente-solvente, ultrafiltração, e HPLC.

[0148] Alternativamente, as etapas de purificação podem não ser necessárias porque a proteína pode estar presente em concentrações altas no meio de cultura que a proteína é essencialmente pura no meio de cultura (por exemplo, 70 a 80% pura). Em uma modalidade, a proteína é coletada a partir do meio de cultura sem etapas de purificação adicionais resfriando-se a cultura de levedura (por exemplo, a cerca de 4°C a cerca de 8°C) e removendo-se as células de levedura usando essas técnicas como centrifugação, microfiltração, e filtração a vácuo giratória. A proteína no meio isento de células pode, então, ser concentrado por essas técnicas como, por exemplo, ultrafiltração e filtração de fluxo tangencial.

[0149] Em algumas modalidades onde a proteína não é secretada no meio de cultura, as células de levedura podem ser lisadas, por exemplo, por sonicação, calor, ou tratamento químico, e o homogenado centrifugado para remover detritos celulares. O sobrenadante pode, então, ser submetido à precipitação de sulfato de amônio, e técnicas de fracionamento adicionais conforme a necessidade, como filtração de gel, cromatografia por troca iônica, cromatografia de coluna DEAE-Sefarose, cromatogra- fia de afinidade, extração solvente-solvente, ultrafiltração, e HPLC para purificar a proteína. Deve-se compreender que os métodos de purificação descritos acima para purificação de proteínas a partir do meio de cultura ou a partir de células de levedura lisadas são não-limitantes e quaisquer técnicas de purificação conhecidas pelos indivíduos versados na técnica podem ser usadas para purificar a proteína expressa por levedura se for requerido que essas técnicas obtenham uma proteína substancial-mente pura.

[0150] Várias formulações das preparações de proteína purificada podem ser preparadas de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, as proteínas podem ser estabilizadas através da adição de outras proteínas (por exemplo, gelatina e leite desnatado em pó), agentes químicos (por exemplo, glicerol, polietileno glicol, EDTA, sorbato de potássio, benzoato de sódio, e agentes redutores e aldeídos), polissacarí- deos, monossacarídeos, lipídeos (óleos vegetais hidrogenados), e similares. Em uma modalidade, as proteínas para adição a produtos alimentícios ou blendas para ração animal podem ser secas (por exemplo, secagem por aspersão, secagem por tambo- ramento, e liofilização) e formuladas como pós, grânulos, pílulas, blocos minerais, líquidos, e géis através de processos conhecidos. Em uma modalidade, podem-se usar agentes de gelificação, tais como gelatina, alginato, colágeno, agar, pectina e carra- genana.

[0151] Em modalidades alternativas, a expressão de proteína pode servir para expressão intracelular, como para ação enzimática na levedura em um processo de biotransformação, ou para exibição na superfície celular de levedura. Para essas modalidades, a proteína, expressa conforme descrito no presente documento, não é purificada.

[0152] Em várias modalidades, as proteínas descritas acima são selecionadas a partir do grupo que consiste em uma toxina, um anticorpo, um hormônio, uma enzima, um fator de crescimento, uma citocina, uma proteína estrutural, uma proteína imunogênica (por exemplo, um antígeno de vacina), e uma proteína de sinalização celular. Em outra modalidade, as proteínas descritas acima são selecionadas a partir do grupo que consiste em um anticorpo, um hormônio, uma enzima, um fator de crescimento, uma citocina, uma proteína estrutural, uma proteína imunogênica (por exemplo, um antígeno de vacina), e uma proteína de sinalização celular. Em ainda outra modalidade, a sequência de codificação para uma proteína, um fragmento da mesma, uma proteína de fusão (por exemplo, uma proteína quimérica), ou um peptídeo, podem ser usadas de acordo com a invenção. Em outra modalidade, uma proteína modificada pode ser expressa, como uma proteína mutada ou uma proteína com aminoácidos não-naturais.

[0153] Em uma modalidade, as toxinas podem ser proteínas como, por exemplo, toxina botulínica ou verotoxina-1, e após a preparação usando os métodos, ácidos nucléicos isolados, vetores de expressão, células hospedeiras, e construções de DNA conforme descrito no presente documento, as toxinas podem ser modificadas usando um agente de direcionamento de modo que sejam voltados especificamente a células doentes. Em outro aspecto ilustrativo, o anticorpo pode ser um anticorpo humanizado, um anticorpo que não seja humanizado, um nanocorpo, ou um fragmento de anticorpo, como um fragmento Fab de um anticorpo ou um anticorpo de cadeia única. Em outra modalidade, o hormônio pode ser, por exemplo, uma gonadotropina, um hormônio adrenocorticotrófico, um hormônio do crescimento, vasopressina, oxitocina, soma- tostatina, gastrina, ou leptina. Em outra modalidade ilustrativa, o fator de crescimento pode ser insulina, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento endotelial vascular, eritropoietina, fator de crescimento derivado de plaqueta, trombopoietina, ou uma proteína morfogênica óssea. Em um aspecto, a citocina pode ser IL-2, IFN-α, IFN-Y, ou GM-CSF. Em uma modalidade, a proteína não é uma toxina sérica. Em outro aspecto ilustrativo, as proteínas de vacina podem ser qualquer proteína de vacina adequada que seja imunogênica em um paciente ou em um animal, incluindo, sem limitação, proteínas de HPV (por exemplo, HPV 16 e HPV 18), e proteínas de vacina contra tétano, como exemplos. Em outra modalidade ilustrativa, as enzimas podem ser, por exemplo, enzimas para rações animais conforme discutido no presente documento, acetil colinesterase, ou ciclooxigenase, ou qualquer outra enzima útil que possa ser expressa em levedura. Em outra modalidade, as proteínas estruturais podem ser expressas, por exemplo, netrinas, proteínas de ligação de actina, ou miosina, e, em outra modalidade, proteínas de sinalização celular, como proteínas ras, quinases, a proteína ErbB2 (o receptor Her-2) pode ser expressa usando os métodos, ácidos nucléicos isolados, vetores de expressão, células hospedeiras, e construções de DNA conforme descrito no presente documento.

[0154] Em uma modalidade, a proteína é uma enzima para uso em ração animal. Nessa modalidade, a proteína pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma fitase, uma mananase, uma galactosidase, uma amilase, uma glicanase, uma celulase, uma protease, e uma xilanase, ou uma combinação dessas. Por exemplo, pode-se expressar uma variedade de fitases de acordo com os métodos descritos no presente documento. Exemplos de genes de fitase (isto é, uma sequência de codificação de fitase) que podem ser expressos de acordo com a invenção são genes de fitase derivados a partir de bactérias, fungos filamentosos, plantas, e leveduras, como genes appA (Número de acesso Gene Bank M58708) e appA2 (número de acesso Gene Bank 250016) derivados a partir de Escherichia coli e os genes phyA e phyB derivados a partir do fungo Aspergillus niger, ou qualquer mutante desses genes que retenha ou tenha uma atividade aperfeiçoada de hexakisfosfato fosfoidrolase myo-inositol (vide, por exemplo, Rodriguez et al., Arch. of Biochem. and Biophys. 382: 105-112 (2000), aqui incorporado a título de referência). Genes de alfa- e beta-galactosidase exemplificadores são provenientes da espécie Aspergillus (por exemplo, Aspergillus alliaceus, Aspergillus orzae, Aspergillus nidulans, Aspergillus parasiticus, e Aspergillus niger). Genes de fitase substituídos, excluídos e truncados, ou um fragmento dos mesmos, também podem ser expressos de acordo com a invenção.

[0155] Em uma modalidade, a proteína expressa usando os métodos descritos no presente documento pode ser usada em ração animal que compreende uma mistura de ração animal. Em várias modalidades, qualquer mistura de ração animal conhecida na técnica pode ser usada, como farelo de semente de colza, farelo de semente de algodão, farelo de soja, e farelo de milho. Ingredientes opcionais da mistura de ração animal incluem açúcares e carboidratos complexos, como monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos solúveis em água e insolúveis em água. Ingredientes de aminoácido opcionais que podem ser adicionados à mistura de ração são arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treo- nina, triptofano, valina, tirosina etil HCl, alanina, ácido aspártico, glutamato de sódio, glicina, prolina, serina, cisteina etil HCl, e análogos, e sais desses. Vitaminas que podem ser opcionalmente adicionadas são tiamina HCl, riboflavina, piridoxina HCl, nia- cina, niacinamida, inositol, cloreto de colina, pantotenato de cálcio, biotina, ácido fó- lico, ácido ascórbico, e vitaminas A, B, K, D, E, e similares. Ingredientes de proteínas minerais, incluindo proteínas obtidas a partir de farelo de carne ou farelo de peixe, ovo líquido ou em pó, materiais solúveis de peixe, concentrado da proteína do leite, óleos (por exemplo, óleo de soja), amido de milho, cálcio, fosfato inorgânico, sulfato de cobre, sal, e calcário também podem ser adicionados. Antioxidantes também podem ser adicionados.

[0156] Em outra modalidade, proporciona-se um kit que compreende um vetor de expressão que compreende o ácido nucléico isolado de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2, ou um fragmento do mesmo. Em um aspecto ilustrativo, o ácido nucléico isolado, ou o fragmento, pode ser 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico ao ácido nucléico isolado de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2, ou ao fragmento do mesmo. Em várias modalidades ilustrativas, o fragmento pode ter cerca de 50 nu- cleotídeos de comprimento, cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, cerca de 200 nucleotídeos de comprimento, cerca de 300 nucleotídeos de comprimento, cerca de 400 nucleotídeos de comprimento, cerca de 500 nucleotídeos de comprimento, cerca de 600 nucleotídeos de comprimento, cerca de 700 nucleotídeos de comprimento, cerca de 800 nucleotídeos de comprimento, ou cerca de 900 nucleotídeos de comprimento. Em outras modalidades, o fragmento pode se estender cerca de 50 nucleotí- deos, cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 300 nucleotí- deos, cerca de 400 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos, cerca de 700 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos, ou cerca de 900 nucleotídeos a montante a partir da extremidade 3’ do ácido nucléico isolado de qualquer um entre SEQ ID NOS: 1 a 2. Ainda em outras modalidades, o fragmento pode incluir cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotí- deos, cerca de 300 nucleotídeos, ou cerca de 350 nucleotídeos a montante e/ou a jusante a partir da sequência TATA box encontrada em cada um dos SEQ ID NOS: 1 a 2.

[0157] Em uma modalidade, o vetor de expressão (isto é, com o promotor he- terólogo) incluído no kit pode ter qualquer um dos outros elementos descritos no presente documento, como um marcador de seleção, um sítio de clonagem, como um sítio de clonagem múltipla, um acentuador, uma sequência de terminação, uma sequência de peptídeo de sinal, e similares. Em outro aspecto, o vetor de expressão pode ser um vetor que se replique autonomamente ou se integre no genoma da célula hospedeira. Em outra modalidade, o vetor de expressão pode ser circularizado ou linearizado (isto é, digerido por uma enzima de restrição de modo que um gene de interesse possa ser facilmente clonado no vetor de expressão). Em outra modalidade, o kit pode incluir um vetor de expressão e uma ORF de controle que codifica um marcador ou gene de controle para expressão (por exemplo, uma ORF que codifica um fragmento LacZ-α) para uso como um controle para mostrar que o vetor de expressão é capaz de ser ligado e usado a um gene de interesse.

[0158] Em outra modalidade ilustrativa, o kit pode conter um tubo contendo um plasmídeo de expressão circular. Em outra modalidade, o kit pode conter um tubo com um vetor de expressão linear que seja digerido com uma enzima de restrição, assim o mesmo está pronto para clonar um gene de interesse. Em uma modalidade, o tubo pode ser esterilizado. Em qualquer das modalidades, o kit também pode incluir um vetor de expressão circular ou linear e um ORF de controle que codifica um marcador ou gene de controle para expressão (por exemplo, um ORF que codifica um fragmento LacZ-α) para uso como um controle em mostrar que o vetor de expressão pode ser ligado a um gene de interesse, e/ou mostrar que a célula hospedeira é competente para transformação.

[0159] Em ainda outra modalidade, o kit pode conter vários vetores de expressão diferentes. Em outra modalidade, os vários vetores de expressão diferentes podem conter o mesmo promotor, mas diferentes marcadores selecionáveis, como genes para resistência aos fármacos G418, Nourseotricina (Nat), Zeocina, Blasticidina, ou Higromicina. Nessa modalidade, o kit também pode conter alíquotas dos fármacos (por exemplo, G418, Nourseotricina (Nat), Zeocina, Blasticidina, ou Higromicina) em tubos, ou outros recipientes, separados dos vetores correspondentes.

[0160] Em qualquer uma das modalidades do kit descritas acima, o ácido nu- cléico isolado pode consistir em qualquer um entre SEQ ID NOS. 1 a 2, ou um fragmento do mesmo. O termo “consiste em” significa que a sequência especificada pelo SEQ ID NO. não tem sequências nucleotídicas adicionais além daquelas correspondentes ao SEQ ID NO.

[0161] Em outro aspecto ilustrativo, o kit pode incluir outros componentes para uso com o vetor de expressão, como componentes para transformação de células de levedura, enzimas de restrição para incorporar uma sequência de codificação de proteína de interesse no vetor de expressão, ligases, componentes para purificação de construções de vetor de expressão, tampões (por exemplo, um tampão de ligação), instruções para uso (por exemplo, para facilitar a clonagem), e quaisquer outros componentes adequados para uso em um kit para produzir e usar os vetores de expressão descritos no presente documento. Em outra modalidade, o vetor de expressão ou qualquer outro componente do kit pode ser incluído no kit em um tubo vedado (por exemplo, esterilizado ou não-esterilizado) ou qualquer outro recipiente ou embalagem adequados (por exemplo, esterilizados ou não-esterilizados). Os kits descritos nos parágrafos anteriores que incluem o vetor de expressão compreendem o vetor de expressão que compreende um promotor descrito no presente documento operacionalmente ligado ao vetor que seja heterólogo ao promotor (isto é, a combinação não ocorre na natureza).

[0162] Os exemplos a seguir proporcionam métodos ilustrativos para realizar a prática da presente invenção. Como tal, esses exemplos são proporcionados somente por propósitos ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.

EXEMPLOS Exemplo 1: Preparação de sequências promotoras e plasmídeos contendo promotores

[0163] “Chips” de microarranjo para medir níveis de mRNA de Pichia pastoris foram criados por Affymetrix (Affymetrix, Inc.) usando uma sequência de DNA genô- mica de Pichia fornecida por Dr. James Cregg. Os chips de microarranjo foram sondados com amostras de RNA a partir de culturas de levedura desenvolvidas em diferentes fontes de carbono, incluindo metanol, glicerol e etanol. As culturas foram colhidas em vários pontos de tempo em fase semi-logarítmica e congeladas para o isolamento de RNA subsequente conforme recomendado por Affymetrix. Os protocolos padrão da Affymetrix para sondar microarranjos de Affymetrix foram seguidos.

[0164] RNA total de cada amostra celular foi extraído por um método de ruptura de microesfera de vidro/extração de fenol/precipitação de LiCl. RNA foi convertido em cDNA e subsequentemente amplificado e rotulado para sonda chips Affymetrix. Os cDNAs rotulados foram hibridizados a chips de microarranjo de Pichia pastoris Affyme- trix e avaliados usando o software Affymetrix. Uma análise de dados identificou os genes induzidos por metanol (em relação a glicerol) ou genes expressos sob a maioria das condições (isto é, constitutivamente expressos) conforme mostrado na Tabela 1.

[0165] A Tabela 1 lista os níveis de mRNA relativos dos genes indicados comparando a atividade promotora de células de Pichia pastoris desenvolvidas em um meio com metanol, glicerol ou etanol como a fonte de carbono. TABELA 1. Atividade relativa dos promotores

[0166] A Figura 6 mostra a atividade promotora relativa para pUPP, TEF2, Chr1-0469, GAP, AOX1, e DAS usando as fontes de carbono, metanol (barra mais à esquerda em cada conjunto de barras), estarvação de metanol (segunda barra da esquerda em cada conjunto de barras), glicerol (terceira barra da esquerda em cada conjunto de barras), e etanol (barra mais à direita em cada conjunto de barras). As proteínas hipotéticas são as ORFs para os promotores UPP e Chr1-0469.

[0167] Os promotores de dois genes constitutivamente expressos foram clo- nados e testados com vetores repórteres. Todos os plasmídeos repórteres estavam sem elementos promotores para conduzir a expressão do ORF repórter; alternativamente, um esquema de clonagem que utiliza enzimas de restrição Tipo II (isto é, BsaI) foi colocado para introduzir fragmentos de DNA (promotores) a montante da ORF. Todas as construções continham a mesma sequência terminadora transcricional 3’AOX1 após a interrupção do códon do ORF repórter.

[0168] Um plasmídeo repórter, pTZ-GFP, é um derivado de pJAZ (resistência à zeocina como um marcador de seleção) sem o promotor AOX1, mas com uma ORF de proteína fluorescente verde (GFP) como um gene repórter para expressão intracelular. Um segundo grupo de plasmídeos repórteres contém genes marcadores selecionáveis para resistência à zeocina ou G418 e as ORFs Aspergillus alfa-galactosidase ou beta-galactosidase como repórteres para expressão intracelular. O terceiro grupo de plasmídeos repórteres tem o sinal de Fator pré-pré-alfa de Acasalamento (aMF) S. cerevisiae para secreção fundida em fase com a sequência de codificação E. coli appA2 para fosfatase (fitase), como a ORF repórter. Nenhuma das sequências de plasmídeo repórteres são expressas em Pichia pastoris sem a introdução de uma sequência que tenha atividade promotora a montante da ORF repórter.

[0169] Dois dos promotores constitutivos mais ativos, dos genes UPP e Chr1- 0469, consistiam em DNA ~1000 bp “a montante” de ORF’s de função desconhecida. Essas sequências promotoras foram amplificadas usando iniciadores PCR e DNA ge- nômico de Pichia pastoris. A sequência dos produtos de PCR foi confirmada, antes da ligação nos plasmídeos repórteres. O promotor UPP foi clonado usando sítios BsaI estrategicamente colocados nos iniciadores franqueando o promotor. O promotor Chr1-0469 contém sítios de reconhecimento para BsaI e BsmBI; portanto, extremidades de clonagem foram criadas por um procedimento de PCR-desnaturação- anelamento. Brevemente, o promotor foi amplificado com dois conjuntos de iniciadores. Os produtos de PCR representam duas moléculas de DNA de fita dupla quase idênticas exceto pelo fato de que as extremidades são deslocadas por 4 bp (uma é quatro nucleotídeos mais curta a partir da extremidade 5’ e quatro nucleotídeos mais longa a partir da extremidade 3’, e a outra quatro nucleotídeos mais longa a partir da extremidade 5’ e quatro nucleotídeos mais curta a partir da extremidade 3’). Os dois produtos de PCR diferentes são misturados, desnaturados e anelados para criar moléculas promotoras com as 4 extensões de fita única de base em cada extremidade da molécula (extremidades “pegajosas” para facilitar a clonagem). As extremidades de clonagem, geradas por digestão BsaI ou por PCR-desnaturação-anelamento, foram complementares às extremidades criadas nos plasmídeos repórteres. Os promotores que regulam os genes AOX1 e GAP1 de Pichia pastoris foram introduzidos nas mesmas construções repórteres como controles.

[0170] As construções de plasmídeo específicas promotoras foram linearizadas por digestão com enzimas de restrição específicas e introduzidas em células de Pichia pastoris do tipo selvagem por eletroporação. Os transformantes contendo o DNA de plasmídeo integrado no genoma da cepa hospedeira foram selecionados em YPD agar seja com zeocina ou G418. Colônias únicas a partir da transformação foram purificadas (novamente em placas seletivas), então, vários clones foram coletados em placas YPD primárias. Essas placas primárias foram replicadas em placa a uma série de placas de diagnóstico com um meio de agar contendo um dos compostos a seguir como a única fonte de carbono destinada ao crescimento das células de Pichia pastoris: glicose (isto é, dextrose), glicerol, metanol, ou etanol (todos em 1% em p/v). As placas foram incubadas a 30°C durante 20 a 44 horas antes da classificação.

EXEMPLO 2: Determinação da expressão de GFP em transformantes

[0171] O nível relativo de expressão de GFP entre os vários transformantes foi comparado. Nesse exemplo, placas de réplica foram expostas à luz UV usando um transiluminador e a intensidade de fluorescência das diferentes cepas foi comparada por visualização direta. Colônias negativas de células de Pichia sem expressão de GFP não demonstraram fluorescência GFP sob iluminação UV. A intensidade da fluorescência observada se correlacionou a um aumento na expressão de GFP.

[0172] A Figura 5 é um exemplo de expressão de GFP para vários transfor- mantes em placas de réplica com diferentes fontes de carbono. O local das diferentes cepas de promotor de Pichia em cada painel é o mesmo, e o painel “YPD Primário” identifica o local das cepas por sua designação promotora: AOX1, pUPP, GAP1, 0001, 0002, 0003, 0004, 0005, 0006, 0007, e Vetor (controle simulado). A parte inferior da Figura 5, rotulada como “Expressão de GFP induzida por Dex, Gly, MeOH, ou EtOH” mostra que a fonte de carbono usada em cada painel é dextrose (D), glicerol (G), metanol (M) ou etanol (E), respectivamente. Os dados mostram que o promotor UPP é tão forte ou mais forte que o promotor GAP sob as condições testadas, e é mais forte que o promotor AOX sob a maioria das condições testadas.

EXEMPLO 3: Determinação da atividade relativa de alfa- e beta-galactosidases de transformantes

[0173] O promotor UPP e as sequências promotoras Chr1-0469 foram amplificados usando iniciadores PCR e DNA genômico de Pichia pastoris (as sequências dos iniciadores dianteiros usados para amplificação dos fragmentos de promotor são mostradas na Figura 8). As sequências dos produtos de PCR foram confirmadas, antes da ligação no plasmídeo repórter alfa-GAL (Figura 7). Os promotores que regulam Pichia pastoris GAP, TEF2, DAS e AOX1 ORFs foram introduzidos no mesmo plasmí- deo repórter como controles. As sequências dos fragmentos de promotor inseridos foram confirmadas sequenciando-se todas as inserções, em ambas as direções, usando iniciadores específicos de plasmídeo localizados a montante do fragmento inserido (iniciadores dianteiros) e na região 5’ da ORF de alfa-Galactosidase (iniciadores reversos). As construções de plasmídeo específicas promotoras foram linearizadas pela digestão com enzimas de restrição específicas e introduzidas nas células de Pi- chia pastoris do tipo selvagem por eletroporação, e transformantes contendo o DNA de plasmídeo integrado no genoma da cepa hospedeira foram selecionados. As células foram bem isoladas, os transformantes de colônia única foram purificados e coletados em uma placa primária YPD e incubadas a 30°C. A placa primária foi subsequentemente replicada em placa a uma série de placas de diagnostico com meio de agar contendo um ou mais dos compostos a seguir como a única fonte de carbono para o crescimento das células de Pichia pastoris: glicose (isto é, dextrose), glicerol, metanol, ou etanol (todos em 1% p/v) e substrato cromogênico alfa-X-Gal. Essas placas foram, então, incubadas a 30°C durante 44 horas (Figura 9).

[0174] O nível de expressão das diferentes construções de gene repórter de promotor-alfa-galactosidase foi determinado pela observação da alfa-galactosidase de pacas de agar YPD feitas com 100 mM tampão de fosfato, pH 6,5, e alfa-X-GAL como um substrato cromogênico. A atividade repórter foi detectada como um produto de cor azul nas células ou ao redor das mesmas. A atividade repórter foi demonstrada pelos promotores UPP e Chr1-0469.

[0175] As designações de promotor na Figura 9 correspondem ao promotor Chr1-0469 (SEQ ID NO: 1) e ao promotor UPP (SEQ ID NO: 2). O comprimento de cada fragmento promotor é indicado pela posição +1 igual a A no códon de partida ATG do gene correspondente no genoma Pichia pastoris (portanto, as sequências promotoras são de -1 a -1500). Os fragmentos de outros promotores de Pichia pastoris bem como um vetor repórter sem quaisquer sequências promotoras são usados como controles. Os transformantes foram incubados em placas de agar contendo X-alfa- GAL, um substrato cromogênico para alfa-Galactosidase, e uma dentre quatro fontes de carbono conforme indicado. As placas A e B na Figura 9, painel A, foram replicadas em placa em diferentes fontes de carbono a placas A e B, respectivamente, mostradas na Figura 9, painéis B e C, respectivamente. Logo, as designações na Figura 9, painel A das placas A e B se referem à Figura 9, painéis B e C, respectivamente. As notações de NO:1 e NO:2 se referem a SEQ ID NOS: 1 e 2 (isto é, ao promotor usado para expressar α-galactosidase). O nível de expressão de α-galactosidase com os promotores é mostrado nas tabelas rotuladas Placa A e Placa B abaixo nas várias fontes de carbono. O nível de expressão de α-galactosidase é mostrado como 0, +1, +2, +3, +4, e +5, com o nível de expressão aumentando de 0 a +5.

[0176] De modo similar, a ORF beta-Galactosidase foi usada para análise da expressão das construções de repórter com o promotor Chr1-0469 e as sequências promotoras UPP nos transformantes de Pichia pastoris. Nesses experimentos, o nível de expressão do gene repórter beta-galactosidase foi determinado em placas com beta-X-GAL como um substrato cromogênico. A atividade repórter com ORF beta-Ga-lactosidase também foi demonstrada com promotores UPP e Chr1-0469. Expressão d e alfa-galactosidase re ativa, Placa A, da Figura 9.

Expressão d e alfa-galactosidase re ativa, Placa B, da Figura 9

EXEMPLO 4: Determinação da atividade de fitase de transformantes [001]O nível de atividade de fitase foi determinado nos vários transformantes. Um meio de agar em placas foi suplementado com 100 mM de tampão de fosfato, pH 6,5, e fitato de cálcio. A atividade de fitase atua para converter a substância de fitato de cálcio colóide não-transparente em material transparente, formando um halo transparente ao redor das colônias que expressam e secretam uma fosfatase (fitase). Uma expressão aumentada da fitase pelas células leva a uma secreção aumentada da enzima, conforme demonstrado por um halo mais amplo observado ao redor da colônia celular. A atividade repórter foi demonstrada pelos promotores UPP e Chr1-0469 (Figura 10). Na Figura 10, os transformantes que hospedam sequências promotoras GAP, promotor Chr1-0469 (SEQ ID NO: 1) e o promotor UPP (SEQ ID NO: 2) são clonados a montante da ORF que consiste em um fator pré-pró alfa S.cerevisiae fundido em fase com DNA que codifica a fitase E.coli appA2. As células foram manchadas em placas de diagnóstico com fitato de cálcio e glicose ou metanol e incubadas durante 27 horas a 30°C. O nível da expressão de fitase com os promotores é notado por 0, +1, +2, +3, +4, e +5, com o nível de expressão aumentado de 0 a +5. Os níveis relativos de expressão de fitase são mostrados na tabela abaixo por No:1 e No:2 representando SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. TABELA X. Atividade de fi tase relativa da Figura 10

Claims (31)

1. Ácido nucleico isolado CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência do ácido nucleico isolado compreende um promotor da SEQ ID NO:2, ou um fragmento da mesma que exibe atividade de promotor, em que o promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação heteróloga, e o dito fragmento inclui por 300 nucleotídeos, 400 nucleotídeos, 500 nucleotídeos, 600 nucleotídeos ou 700 nucleotídeos a montante da extremidade 3’ da SEQ ID NO: 2, e em que o dito fragmento é um fragmento contíguo da SEQ ID NO: 2 e o dito fragmento compreende uma sequência TATA box para direcionar a iniciação de transcrição.

2. Ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de codificação heteróloga codifica uma proteína selecionada dentre o grupo que consiste em uma toxina, um anticorpo, um hormônio, uma enzima, um fator de crescimento, uma citocina, uma proteína estrutural, uma proteína imunogênica e uma proteína de sinalização celular.

3. Ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína é uma enzima para uso em ração animal.

4. Ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína é selecionada dentre o grupo que consiste em uma mananase, uma amilase, uma fitase, uma galactosidase, uma glucanase, uma protease, uma celulase e uma xilanase.

5. Ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína é uma fitase.

6. Ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína é uma galactosidase.

7. Vetor de expressão CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o ácido nucleico isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Construto de DNA CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o ácido nucleico isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

9. Célula hospedeira de levedura CARACTERIZADA pelo fato de que com-preende o vetor de expressão, como definido na reivindicação 7.

10. Célula hospedeira de levedura CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o ácido nucleico isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

11. Célula hospedeira de levedura, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira de levedura é uma espécie de Pichia.

12. Célula hospedeira de levedura, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a espécie de Pichia é Pichia pastoris.

13. Célula hospedeira de levedura, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira de levedura é uma levedura metilotrófica.

14. Célula hospedeira de levedura, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira de levedura é selecionada dentre o grupo que consiste na espécie de Hansenula, espécie de Pichia e espécie de Candida.

15. Célula hospedeira de levedura CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o construto de DNA, como definido na reivindicação 8, em que a célula hospedeira de levedura é uma levedura metilotrófica.

16. Célula hospedeira de levedura, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de que é selecionada dentre o grupo que consiste em espécies de Hansenula, espécies de Pichia e espécies de Candida.

17. Célula hospedeira de levedura, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira de levedura é selecionada dentre o grupo que consiste em espécies de Hansenula, espécies de Pichia, espécies de Saccharomyces, espécies de Schizosaccharomyces, espécies de Torulas- pora, uma espécie de Candida, uma espécie de Yarrowia e espécies de Kluyve- romyces.

18. Método para produzir uma proteína CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende a etapa de: (i) cultivar em um meio de cultura uma célula hospedeira de levedura que compreende um primeiro cassete de expressão compreendendo o ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 1, e o segundo cassete de expressão operacionalmente ligada a uma sequência de codificação heteróloga, e (ii) permitir a expressão da proteína, em que sequência de codificação heteróloga codifica uma proteína, em que a proteína é expressa usando o primeiro cassete de expressão em combinação com um segundo cassete de expressão, o dito segundo cassete compreendendo a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucleico isolado tendo uma sequência compreendendo a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, em que a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 tem atividade promotora.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína é selecionada dentre o grupo que consiste em uma toxina, um anticorpo, um hormônio, uma enzima, um fator de crescimento, uma citocina, uma proteína estrutural, uma proteína imunogênica e uma proteína de sinalização celular.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína é uma enzima para uso em ração animal.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína é selecionada dentre o grupo que consiste em uma mana- nase, uma amilase, uma glucanase, uma fitase, uma galactosidase, uma celulase, uma protease e uma xilanase.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína é uma fitase.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína é uma galactosidase.

24. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucleico isolado tendo uma sequência que compreende a sequência de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, em que SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 têm atividade promotora.

25. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína é expressa usando o primeiro cassete de expressão, o segundo cassete de expressão, e um terceiro cassete de expressão.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o terceiro cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucleico isolado tendo uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira de levedura é uma levedura metilotrófica.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira de levedura é selecionada dentre o grupo que consiste em espécies de Hansenula, espécies de Pichia e espécies de Candida.

29. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o terceiro cassete de expressão compreende a sequência de codificação heteróloga que codifica a proteína operacionalmente ligada a um ácido nucleico isolado tendo uma sequência que compreende a sequência de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, em que SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 têm uma atividade promotora.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor consiste na SEQ ID NO: 2.

31. Ácido nucleico isolado CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência do ácido nucleico isolado consiste na SEQ ID NO: 2 operacionalmente ligada a uma sequência de codificação heteróloga.

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