CN113151026A - 一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法及其应用 - Google Patents

一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法及其应用 Download PDF

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孟维龙
张文荟
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Abstract

本发明提出了一种表达β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，包括如下步骤：S1、化学合成β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶的基因序列；S2、酶切S1中所述基因序列并与酶切线性化的毕赤酵母表达载体分别连接或重组，得基因表达质粒；S3、将S2中构架好的基因表达质粒酶切线性化后分别或混合转化入毕赤酵母感受态细胞中；S4、通过His缺陷、G418抗性以及PCR方法筛选出分别或同时含有基因的阳性克隆菌株，得到能够分别或同时表达β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶的毕赤酵母；所述β‑甘露聚糖酶以及α‑半乳糖苷酶的核苷酸序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列。本发明通过β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶配合使用可以更加彻底地降解半乳甘露聚糖。

Description

一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方 法及其应用
技术领域
本发明涉及一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法及其应用。
背景技术
半乳甘露聚糖是一种包含了甘露糖骨干与半乳糖旁基的多糖，是一种抗营养因子，其抗营养作用的主要原因是溶于水后具有的高度粘性。由于动物体内不能产生降解半乳甘露聚糖的酶类，动物采食半乳甘露聚糖含量高的食物后，增加了肠道食糜的粘度，降低了胃肠道运动对食糜的混合效率，从而阻碍酶对饲料的消化和养分的吸收。
现有技术通过单一的酶如β-甘露聚糖酶消除抗营养因子半乳甘露聚糖，但是，β-甘露聚糖酶只能水解甘露糖骨干的1,4连接键，不能水解1,6键连接的半乳糖残基，水解产物很大一部分不是单糖或寡糖。营养物质不能充分被吸收利用造成了食物的浪费，也使得动物觅食后长不快。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法及其应用，β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶配合使用既可以水解甘露糖骨干的1,4连接键，又能水解1,6键连接的半乳糖残基，水解产物是单糖或寡糖，可以被动物充分吸收利用。β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶配合使用作为饲料添加剂可以加快动物生长。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，包括如下步骤：
S1、化学合成如SEQ ID No.1所示的β-甘露聚糖酶和如SEQ ID No.2所示的α-半乳糖苷酶的基因序列；
S2、酶切S1中所述β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的基因序列并与酶切线性化的毕赤酵母表达载体分别连接或重组，得β-甘露聚糖酶基因表达质粒和α-半乳糖苷酶基因表达质粒；
S3、将S2中构建好的β-甘露聚糖酶基因表达质粒和α-半乳糖苷酶基因表达质粒酶切线性化后分别或混合转化入毕赤酵母感受态细胞中；
S4、通过His缺陷和G418抗性筛选出有基因插入的毕赤酵母菌，然后通过PCR方法筛选出分别或同时含有β-甘露聚糖酶基因和α-半乳糖苷酶基因的阳性克隆菌株，得到能够分别或同时表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母；
所述β-甘露聚糖酶以及α-半乳糖苷酶的核苷酸序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列。
进一步地，所述S2中β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的基因序列与酶切线性化的毕赤酵母表达载体通过T4连接酶或2X ClonExpress Mix连接或重组。
进一步地，所述S3中表达质粒采用Sacl酶切线性化。
进一步地，所述表达质粒线性化后跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认重组质粒完全线性化。
进一步地，将完全线性化的所述表达质粒等量或等比例混合后，转化入毕赤酵母感受态细胞中，200-240rpm条件下进行摇床培养1h。
进一步地，所述S4中PCR监测过程中，依据所述β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶所示的检测引物对初步筛选所得的毕赤酵母菌进行检测，挑选出同时整合有β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶基因的毕赤酵母菌株。
进一步地，将所述同时整合有β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶基因的毕赤酵母菌株跑 SDS-PAGE胶鉴定分泌蛋白，挑选得β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶基因表达量高的菌株。
进一步地，一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母，所述毕赤酵母中包含β-甘露聚糖酶以及α-半乳糖苷酶的基因序列。
进一步地，所述毕赤酵母表达质粒包括载体pPIC9K和EcoRI酶切位点以及Not1酶切位点之间的全长基因如β-甘露聚糖酶基因以及α-半乳糖苷酶基因。
进一步地，一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的应用，包括如下步骤：
c、将毕赤酵母工程菌株转接入含有15mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28-30℃，200-240rpm条件下进行摇床培养至OD600＝2-6；
d、菌体重悬于BMM培养基，200-240rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱导，培养4-6天；
c、应用：将β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶作为饲料添加剂应用于降解饲料中的抗营养因子半乳甘露聚糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：通过β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶配合使用可以更加彻底地降解半乳甘露聚糖，以β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶配合使用作为饲料添加剂处理饲料后不会造成营养物质浪费。
附图说明
参照附图来说明本发明的公开内容。应当了解，附图仅仅用于说明目的，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。在附图中，相同的附图标记用于指代相同的部件。其中：
图1为实施例2与实施例1相比的酶表达图。
附图标记说明：A：Protein ladder，B：单独表达β-甘露聚糖酶(分子量40KDa)，C：单独表达α-半乳糖苷酶(分子量84KDa)，B：使用本发明的方法混合使用β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶。
图2为实施例2与实施例1相比的酶切对照图。
附图标记说明：A：单独使用β-甘露聚糖酶，可以部分降解半乳甘露聚糖并释放部分单糖和低聚糖；B：单独使用α-半乳糖苷酶，可以降解半乳甘露聚糖的侧链半乳糖；C：使用本发明的方法配合使用β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶，可以彻底降解半乳甘露聚糖并释放大量单糖和寡糖；D：半乳甘露聚糖(不加酶)；E：1％甘露糖；F：1％半乳糖；G：1％蔗糖；H：1％麦芽糖；I：1％乳糖；J：1％棉籽糖；K：1％低聚半乳糖。
具体实施方式
容易理解，根据本发明的技术方案，在不变更本发明实质精神下，本领域的一般技术人员可以提出可相互替换的多种结构方式以及实现方式。因此，以下具体实施方式以及附图仅是对本发明的技术方案的示例性说明，而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限制。
实施例1
分别表达β-甘露聚糖酶manX和α-半乳糖苷酶agaY并配合使用消除饲料中半乳甘露聚糖的方法及其应用，包括如下步骤：
优化改良的β-甘露聚糖酶基因manX，如SEQ ID No.1；优化改良的α-半乳糖苷酶基因 agaY，如SEQ ID No.2；各序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列；
化学合成如SEQ ID No.1和如SEQ ID No.2所示的序列；
β-甘露聚糖酶基因manX片段、α-半乳糖苷酶基因agaY片段和载体pPIC9K均经EcoRI 和Not1双酶切，酶切体系如下：
Figure RE-GDA0003095247940000031
将酶切后的β-甘露聚糖酶基因manX片段和α-半乳糖苷酶基因agaY片段分别与酶切后的pPIC9K载体连接，连接体系如下：
Figure RE-GDA0003095247940000041
将连接产物分别转化入大肠杆菌Top10感受态细胞；
涂布含氨苄青霉素的平板；
PCR检测阳性克隆。菌检上游引物PF1:TGGTCTGTTCGGTTACGGTG，下游引物PR1:CCCATGTCTCCCACACCTTC；菌检上游引物PF2:AGAGGGTATGTCTCGTGCCT，下游引物PR2:CTTGGTTCGTGCATACCCCT；
扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到目的质粒pPIC9K-manX和pPIC9K-agaY；
质粒均用SacI酶切线性化，酶切体系如下：
Figure RE-GDA0003095247940000042
跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认重组质粒完全线性化；
将线性化的质粒分别电转化入毕赤酵母感受态细胞中，200-240rpm条件下进行摇床培养 1h，4000rpm离心10min收集菌体；
将菌体涂布在His缺陷平板上培养2天，挑选单菌落；
通过2-5mg/mL G418的平板筛选出含有融合基因的毕赤酵母菌p-manX和p-agaY；
将毕赤酵母工程菌p-manX和p-agaY转接入含有15mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28-30℃，200-240rpm条件下进行摇床培养至OD600＝2-6；
4000rpm离心10min收集菌体；
菌体重悬于BMM培养基，200-240rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱导，培养4-6天；
4000rpm离心5min收集发酵液，得到粗酶液；
跑SDS–PAGE胶鉴定分泌蛋白，评估各菌株目标蛋白的表达水平(图2)，挑选表达量高的菌株；
酶活性测定，挑选产酶活高的菌株；
粗酶提纯；
实施例2
同时表达β-甘露聚糖酶manX和α-半乳糖苷酶agaY并配合使用消除饲料中半乳甘露聚糖的方法及其应用，包括如下步骤：
优化改良的β-甘露聚糖酶基因manX，如SEQ ID No.1；优化改良的α-半乳糖苷酶基因 agaY，如SEQ ID No.2；各序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列；
化学合成如SEQ ID No.1和如SEQ ID No.2所示的序列；
载体pPIC9K经EcoRI和Not1双酶切，酶切体系如下：
Figure RE-GDA0003095247940000051
将带有同源臂的β-甘露聚糖酶基因manX片段和α-半乳糖苷酶基因agaY片段分别与酶切后的pPIC9K载体重组，重组体系如下：
Figure RE-GDA0003095247940000052
将重组产物分别转化入大肠杆菌Top10感受态细胞；
涂布含氨苄青霉素的平板；
PCR检测阳性克隆。菌检上游引物PF1:TGGTCTGTTCGGTTACGGTG，下游引物PR1:CCCATGTCTCCCACACCTTC；菌检上游引物PF2:AGAGGGTATGTCTCGTGCCT，下游引物PR2:CTTGGTTCGTGCATACCCCT；
扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到目的质粒pPIC9K-manX和pPIC9K-agaY；
质粒均用SacI酶切线性化，酶切体系如下：
Figure RE-GDA0003095247940000053
跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认重组质粒完全线性化；
将线性化的质粒pPIC9K-manX和pPIC9K-agaY等比例混合；
混合物同时电转化入毕赤酵母感受态细胞中，200-240rpm条件下进行摇床培养1h， 4000rpm离心10min收集菌体；
将菌体涂布在His缺陷平板上培养2天，挑选单菌落；
通过2-5mg/mL G418的平板筛选出含有融合基因的毕赤酵母菌；
PCR检测挑选出同时整合有基因manX和agaY的毕赤酵母菌株p-manX-agaY；
将毕赤酵母工程菌株p-manX-agaY转接入含有15mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28-30℃，200-240rpm条件下进行摇床培养至OD600＝2-6；
4000rpm离心10min收集菌体；
菌体重悬于BMM培养基，200-240rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱导，培养4-6天；
4000rpm离心5min收集发酵液，得到粗酶液；
跑SDS–PAGE胶鉴定分泌蛋白(图1)，挑选manX和agaY同时表达且表达量高的菌株；
酶活性测定，挑选产酶活高的菌株；
粗酶提纯；
以半乳甘露聚糖为底物，使用实施例2中制备所得的酶MANX和AGAY协同降解半乳甘露聚糖，并以实施例1中制备所得的酶MANX单独降解半乳甘露聚糖作为对照，反应体系如下：
1ml底物(1％半乳甘露聚糖)+40U酶MANX或AGAY
反应时间：4h
跑PLC检测酶切结果(图2)。
以上实验结果表明，本方法通过β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶配合使用可以更加彻底地降解半乳甘露聚糖。因此，本发明可用于饲料添加剂降解抗营养因子半乳甘露聚糖。
本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容，本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下，对上述实施例进行多种变形和修改，而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。
序列表
<110> 上海国龙生物科技有限公司
<120> 一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1167
<212> DNA
<213> 改良的β-甘露聚糖酶(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
gagaggctga agcttacgta gaattcatgt tagtggcttc tttagctgct gcaaaatgcg 60
ctttacctgc ttgggccgca aaccccatgc aaggccaatg tattggcatg acttacactg 120
gtgattgtgc taccggtact actgaaaatg catatggtac tttttggatt ggtctgttcg 180
gttacggtgt tgctgaccct gataaggcct accaatatat cgtgaacggc tcaactgtgg 240
ttagaacttt aggcttccca gtgacaccag ccgatatcga atcaccagtt tactatgatc 300
aatcttgggc acttagtaac ggcacaggtc ttattaattt aggaccaaac gctttacaaa 360
acttcgctag aggctcttac gacgctttaa ttcataggct ttctggaaac aattggtctg 420
gaggcggtat gcaagtatac gtgcaacaaa tccttggttc tactcacgac ttgtttgatc 480
caactgatcc acaggtaatt ccagccttta agaaatacat ttacggtttt gttagtagat 540
acgtagatga gcctactgta ttgggatggg aattggccaa tgaaccctgt gccgaggctt 600
ccaccggcgt ttcaaccgga aattgtacag atcctaccat tacgggttgg attgctgaaa 660
tttctgcaca gtacataaaa tccattgacc ctaatcattt agaaggtgtg ggagacatgg 720
gttttatagg aaacgacgat ggcaatcctt cttacccata ccagggaact ttggagattg 780
acgaggcaaa tttgtcccaa atcccaacta tagatttcgg tttgtttcac gcatacccag 840
agtcttgggg tcaaacgaat gacaactcag gcgtgggttg gggcaatgga tggattactg 900
atcatgctgc ttctgctgga aagggagtca ttatggaaga gtctttcggt gatactattg 960
accaagcctt atactaccaa gagtggtacg ataccgtaat ttccacagga tctggcgacc 1020
tgatcattca ggctggtagt cacttaactg gcggtgatac accaaacgat ggttacactg 1080
agtattctga cggagacgtt tacaacattg ctcaacagca tgctgcccct gcaatgggtg 1140
cggccgcgaa ttaattcgcc ttagaca 1167
<210> 2
<211> 2232
<212> DNA
<213> 改良的α-半乳糖苷酶(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
gagaggctga agcttacgta gaattcatgt taagagtttc cgccgaattg gccgccatca 60
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tcgttgttga tggtttggct gctttcgctc tgcatcaagc cggcttctcc tatgtcttcc 180
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acacggttag tgatctttgg taccaagaag tgctagatgg aacagctttc aagccatctt 420
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taggtaggtc tgtaaacatt acgggtaagg gttcaggtga tcagaccgtg gaacaatttg 600
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aaggagaggg tatgtctcgt gccttgcaca gattgtatgt acgaaagcat ctgattaggt 1020
caaaggacgc aacttccgat agaccttggt tgttgaacaa ttgggaagtt ggtccttact 1080
ttaactacaa ccaggattca atagagagat taaggcgtca gtcttccgct ttgggcgcta 1140
gactatttgt catggacgac ggttggttcg gtgacaagta ccccaacacg tctgacaatg 1200
aaggactggg agatgtaact cccaatcccg atcgtttccc tgatggtttg atccccgtta 1260
gtgaaagaat caccaatatg ttcgttaatg gtactgctga gactttgagg tttggtatcc 1320
ctgttgagcc agagatggct aaccccaatt ccctgtaccg aaagcactct gactgggttc 1380
ttcatgctag atcttatccc cgtactgaac gtcgtaacgg attagttcta aatggagctt 1440
tgccagaagt ccaagatttt ataaacgatt ttatgaacaa tctattaaat agtgcagaca 1500
tcttgtacgt gaagtgggat atgaacaggg gtatgcacga accaagaaca taccacgagt 1560
acatgttggg cctgtatcat gtattagatt taactttgtc aagtagattt ccagccgtct 1620
tgttcggttg cgcttccggt ggattgcgtt ttgatgcagg aattttacat gattttccac 1680
agttctggac atctggtacc gatggagttg acaggattac tagatttggt acctcactgg 1740
ctcactaccc ctcctcagct atgggattgc acttgtctgc tgttgtaaac caccaaactg 1800
gtcgaacggt accaatggag tttagacacg tagctatgat aatgggtcca tcttttggcg 1860
aattagaccc tgctacggct caaaatccaa gggaagtaga tgagttaatt aagttggctc 1920
caattgtttt gactggagat ttataccgat tacgattgtc tgaagaatct cagtggagaa 1980
caaagccagc cgctcttttc aaggcagagg acggatccca ggcagacttg ttttattttc 2040
aagtaggagt aaataatcat gctgttccat gggtcgagtt acagggcctt gatccagaag 2100
ctcgtaactc agttgacggt aatgcctata cgggagccaa catgttgggt ttgcagttca 2160
cttttaagtc tgaatacgga agtaaacttg tctttttgga acaagcggcc gcgaattaat 2220
tcgccttaga ca 2232

Claims (10)

1.一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、化学合成如SEQ ID No.1所示的β-甘露聚糖酶和如SEQ ID No.2所示的α-半乳糖苷酶的基因序列；
S2、酶切S1中所述β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的基因序列并与酶切线性化的毕赤酵母表达载体分别连接或重组，得β-甘露聚糖酶基因表达质粒和α-半乳糖苷酶基因表达质粒；
S3、将S2中构建好的β-甘露聚糖酶基因表达质粒和α-半乳糖苷酶基因表达质粒酶切线性化后分别或混合转化入毕赤酵母感受态细胞中；
S4、通过His缺陷和G418抗性筛选出有基因插入的毕赤酵母菌，然后通过PCR方法筛选出分别或同时含有β-甘露聚糖酶基因和α-半乳糖苷酶基因的阳性克隆菌株，得到能够分别或同时表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母；
所述β-甘露聚糖酶以及α-半乳糖苷酶的核苷酸序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列。
2.根据权利要求1所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，所述S2中β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的基因序列与酶切线性化的毕赤酵母表达载体通过T4连接酶或2X ClonExpress Mix连接或重组。
3.根据权利要求1所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，所述S3中表达质粒采用Sacl酶切线性化。
4.根据权利要求3所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，所述表达质粒线性化后跑1%的agarose琼脂糖凝胶确认重组质粒完全线性化。
5.根据权利要求4所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，将完全线性化的所述表达质粒等量或等比例混合后，转化入毕赤酵母感受态细胞中，200-240 rpm条件下进行摇床培养1h。
6.根据权利要求1所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，所述S4中PCR监测过程中，依据所述β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶所示的检测引物对初步筛选所得的毕赤酵母菌进行检测，挑选出同时整合有β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶基因的毕赤酵母菌株。
7.根据权利要求6所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，其特征在于，将所述同时整合有β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶基因的毕赤酵母菌株跑SDS-PAGE胶鉴定分泌蛋白，挑选得β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶基因表达量高的菌株。
8.基于权利要求1-7所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，获取一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母中包含β-甘露聚糖酶以及α-半乳糖苷酶的基因序列。
9.根据权利要求8所述的表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母表达质粒包括载体pPIC9K和EcoRI酶切位点与Not1酶切位点之间的全长基因如β-甘露聚糖酶基因以及α-半乳糖苷酶基因。
10.一种表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的应用，其特征在于，包括如下步骤：
将毕赤酵母工程菌株转接入含有15mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28-30℃，200-240 rpm条件下进行摇床培养至OD600=2-6；
菌体重悬于BMM培养基，200-240 rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5%甲醇诱导，培养4-6天；
c、应用：将β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶作为饲料添加剂应用于降解饲料中的抗营养因子半乳甘露聚糖。
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