WO2000015812A1 - Fragment d'adn a fonction promoteur - Google Patents

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WO2000015812A1
WO2000015812A1 PCT/JP1999/004847 JP9904847W WO0015812A1 WO 2000015812 A1 WO2000015812 A1 WO 2000015812A1 JP 9904847 W JP9904847 W JP 9904847W WO 0015812 A1 WO0015812 A1 WO 0015812A1
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plant
gene
dna
promoter
vector
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PCT/JP1999/004847
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Hirofumi Uchimiya
Satoshi Arai
Takaomi Fushimi
Michito Tagawa
Hiromitsu Fukuzawa
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Nissan Chemical Industries, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a novel DNA having a promoter function in a plant or a plant cell derived from a gene encoding rice adenylate kinase, and to expression and control of expression of a heterologous gene using the DNA. .
  • the promoter is the portion of the DNA sequence upstream of the structural gene and contains a signal (TATA region) for the RNA polymerase to initiate transcription, allowing the subsequent protein synthesis to proceed.
  • a specific base sequence called a cis element exists at the 5, upstream of the TATA region, and this specific region is said to play an important role in controlling the intensity of promoter-one activity and controlling expression.
  • the promoter of the Arabidopsis thaliana gene (rd29A) whose expression is induced by drying [Koizumi et al., Gene 129: 175-182 (1993)] has been isolated.
  • the cis-element that controls the induction of drying of the rd29A gene is a 9-base sequence consisting of TACCGACAT [Yamaguchi-Shinozaki et al., J. Am. Plant Res. 108: 127-136 (1995)], and it has been clarified that the above-mentioned cis element consisting of 9 bases is essential to function as a promoter induced by drought.
  • cauliflower mosaic virus 35S promoter [Guilley et al., Cell 30: 763-773 (1982)] is currently one of the best known promoters in plant transformation.
  • Analysis using tobacco [Morel 1 et al., Nature 315: 200-204 (1985)] or petunia [Sander, Nucl. Acid Res. 15: 1543-1558 (1987)] showed that the 35 S promoter was a nopaline synthase promoter.
  • the promoter activity was more than 30 times stronger than that of As described above, since the promoter activity of the 35S promoter is strong in dicotyledonous plants, this promoter is widely used to introduce a plant-expressible structural gene into dicotyledonous plants and to achieve high expression. Commonly used.
  • the expression of the 35S promoter and the Adh promoter is not easily regulated by tissue-specific expression or chemicals.
  • a promoter that has promoter activity and is capable of controlling tissue / site-specific expression and controlling expression with a safe chemical substance is desired in not only dicotyledonous plants but also monocotyledonous plants.
  • adenylate kinase which is considered to be involved in the energy system in animals, microorganisms, and plants, [Noda et al., The Enzymes. Academic Press, New York: 279-305 (1973), etc.] ] It has been known. In plants, adenylate kinase is induced by sucrose and the like in rice plants [Kawai et al., Hybridization 1: 253 (1994)], and is localized in the vascular bundle [Kawai et al., J. Plant Physiol. 146: 239-242 (1995); Kawai et al., Plant Molecular Biology 27: 943-951 (1995)].
  • the present invention provides a promoter function that enables expression of a linked foreign structural gene in a plant or a plant cell, and enables the control of expression by a safe chemical substance and the control of tissue / site-specific expression.
  • An object of the present invention is to obtain and provide a novel DNA fragment having
  • the present inventors have made intensive studies in order to solve the above problems, a promoter a region of rice AK- a gene was isolated, further have a promoter one activity in this promoter region force? A heterogeneous plants However, they have found that it is possible to control the expression and expression of a foreign gene, and have completed the present invention.
  • the present invention comprises the following promoter derived from a gene encoding rice adenylate kinase. That is, as long as it has at least a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and has a function of controlling the expression of a structural gene that can be expressed in a plant in a plant or a plant cell, It is a DNA fragment having a promoter function that may include a deletion, insertion or substitution, for example, a 1440 bp DNA shown in SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also relates to a vector having the DNA fragment having one promoter function, a bacterium containing the vector, and a plant transformed with the vector or the bacterium. Further, the present invention provides a method for introducing a recombinant DNA obtained by linking a DNA fragment having one promoter function and another DNA sequence into a plant, Methods for controlling expression of a column are provided.
  • FIG. 1 shows the construction diagram of p21.
  • N0S-Pro indicates the nopaline synthase promoter gene
  • NPT-II indicates the kanamycin resistance gene
  • NOS-Ter indicates the nopaline synthase terminator gene
  • AK-a-Pro indicates the AK-a promoter gene.
  • the DNA fragment having the promoter function of the present invention can be isolated from a plant genomic library by plaque hybridization using the rice AK cDNA as a probe, as described below. .
  • Genomic DNA is extracted from a plant, for example, rice, and the isolated genomic DNA is partially digested with an appropriate restriction enzyme, for example, Sau3A I, and subjected to sucrose density gradient centrifugation or agarose gel electrophoresis to obtain a long DNA fragment, for example, A 23 kb DNA fragment is fractionated, integrated into an appropriate vector, for example, ⁇ phage, and packaged.
  • the recombinant phage is infected with E. coli, for example, the XL-1 XL1 ue strain, and plated.
  • a genomic library can be obtained by culturing on a medium, for example, an LB plate (1% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.3% agarose). Base Kuta scratch, may be used plasmid force?, The use of Sufaji Ya old ink stick Dobekuta one desirable in that it can insert the longer fragments.
  • a membrane for example, a nylon membrane, is placed on the above-mentioned plate medium, and this membrane is dipped in a denaturing solution, then dipped in a neutralizing solution, and washed with a washing solution, so that the recombinant DNA on the plate medium is single-stranded. And adsorb it to the membrane be able to.
  • the membrane hybridized with the probe thus labeled is subjected to autoradiography, and a clone that strongly hybridizes to the probe is detected and can be isolated as a positive clone.
  • the DNA of the isolated positive clone is treated with an appropriate restriction enzyme, for example, EcoRI, subcloned into an appropriate cloning vector, for example, pBluescript II, and subjected to Maxam-Gilbert method or dideoxy method.
  • an appropriate restriction enzyme for example, EcoRI
  • subcloned into an appropriate cloning vector for example, pBluescript II
  • the base sequence can be further determined, and commercially available kits and auto sequencers that automatically perform sequence determination can also be used.
  • the nucleotide sequence of the obtained clone can be determined, and the 5, untranslated region of the AK gene and the upstream promoter region can be found.
  • Structural genes linked downstream of the promoter region obtained in this manner include, for example, reporter genes, insecticidal protein genes, herbicide resistance genes, genes expressing antibacterial activity, and plant flowering induction Genes, genes involved in plant growth regulation, genes involved in plant morphogenesis, genes involved in stress resistance, genes involved in flower pigmentation, genes involved in light damage resistance, genes involved in increased yield, etc. No.
  • the repo overnight gene includes the / 9-glucuronidase (GUS) gene, luciferase gene, chloramphenico-l-acetyltransferase (CAT) gene and the like.
  • the insecticidal protein genes include the crystal protein gene of Bacillus thuringiensis and protease inhibitors. Glyphosate-tolerant gene, glufosinate-tolerant gene or sulfonylurea-based herbicide-tolerant gene, etc. as herbicide-tolerant genes, and chitinase, glucanase, or lysozyme as genes to express antibacterial activity.
  • Genes cecropin gene, etc., genes that induce florigen as plants that induce flowering of plants, genes that are involved in the production of florigen, etc.
  • Genes involved in stress resistance such as the 1C gene, include the fatty acid desaturase gene (FAD3), and genes involved in flower pigmentation, such as the chalcone synthase gene and the phenylalanine ammonia lyase gene.
  • the genes involved in photodamage resistance include the glutamine synthase gene.
  • -Methods for introducing a recombinant DNA, in which a structural gene, for example, a reporter gene is linked downstream of a promoter, into a plant include indirect and direct introduction methods.
  • Examples of the direct introduction method include an electro- volatilization method, a particle gun method, a PEG method, a microinjection method, and a silicon carbide whisker method.
  • plants into which the gene is introduced include plants such as cereals, vegetables, fruit trees, forage crops, fruit trees, and ornamental plants.
  • plants such as cereals, vegetables, fruit trees, forage crops, fruit trees, and ornamental plants.
  • they may be monocotyledonous or dicotyledonous plants, regardless of their types.
  • Plants containing the introduced promoters and structural genes Ligation of drug resistance genes such as namycin and hygromycin into a gene transfer vector, or simultaneous introduction of a vector with a drug resistance gene into a plant, followed by selection with a drug such as kanamycin or hygromycin Can be obtained by Analysis of genes introduced into the plant, such as PCR and Southern hybridization methods, and analysis of translation products of introduced structural genes, such as plant leaf extract The protein can be confirmed by analyzing the protein by enzyme activity, Western method or the like, and a plant into which the target gene has been introduced can be selected.
  • the resulting transformed plant can be grown to collect seeds, and the plant can be differentiated and regenerated using the tissue of the transformed plant, for example, leaves and roots.
  • a method for controlling expression include a method of treating a transformed plant with sucrose as follows.
  • a treatment method includes spraying an inducer on the foliage of the plant with a spray or the like, or adding the inducer to soil or a hydroponic solution. Also, a method of regenerating leaf pieces of a plant body in a regeneration medium containing sucrose can be considered.
  • examples of a treatment method include a method in which the seed is germinated and rooted using a sucrose solution.
  • a treatment method includes adding sucrose to a liquid medium or a solid medium, or directly attaching a sucrose solution to a plant cell.
  • Induction of the promoter introduced into the plant by sucrose can be confirmed by observing the quantitative changes in the ligated and introduced structural gene and the translation product of Z or structural gene.
  • the GUS gene when used as a structural gene, The GUS activity of the treated transformed plants and the untreated transformed plants was measured by the fluorescence method of measuring the fluorescence of 4 MU, which is the degradation product of 4 MUG by GUS, with ultraviolet light (365 nm). By observing the difference in GUS activity between the two plants, sucrose induction can be confirmed.
  • the crystal protein gene of Bacillus thuringiensis is used as the structural gene
  • the difference in the insecticidal activity between the sucrose-treated transformed plant and the untreated transformed plant can be determined. Guidance can be confirmed.
  • AK gene Since the AK gene is localized in the vascular region, a structural gene can be ligated downstream of one promoter region, and the expression site of the introduced gene can be controlled in a transformed plant into which the gene has been introduced.
  • the analysis of the site-specific expression of the structural gene linked to and introduced into the promoter can be confirmed by analyzing the localization of the structural gene and Z or the translation product of the structural gene in the plant.
  • the location of GUS in the transformed plant can be confirmed by histochemical methods.
  • the tissue by microscopic observation of the blue color of indigot in, which is the hydrolysis product of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid by Lr Us, the GUS The location can be confirmed.
  • mutations such as deletion and substitution are performed on the promoter region to produce various mutant promoters.
  • a structural gene for example, a reporter gene is ligated to the mutant promoter and introduced into a plant.
  • Mutation treatment includes, for example, preparing a mutation mutant of a DNA fragment having a promoter function, cutting a DNA fragment having a promoter function with an appropriate restriction enzyme, deleting a portion thereof, and ligating the fragment. And the like.
  • by linking a region that controls sucrose induction and a region that controls Z or tissue / site-specific expression to an existing, for example, 35S promoter, it is possible to control the expression of 35S promoter. Become.
  • genomic DNA was extracted and isolated from rice (Nihonbare) leaves two weeks after seeding.
  • the isolated genomic DNA was partially digested with MboI.
  • the reaction solution was extracted with phenol-chloroform, and the obtained aqueous layer was precipitated with ethanol.
  • the obtained precipitate was dissolved in a TE buffer to obtain a MboI fragment of genomic DNA.
  • the MboI fragment of the genomic DNA obtained in this manner was used by using the ⁇ -GEM12 XhoI Half-site Arms Cloning System (manufactured by Promega), and the XhoI site of Fernvectoris GEM-12. After packaging into phage particles, the recombinant phage was combined with top agar containing E. coli (KW251) together with NZ YM (1% NZ amine, 0.5% Yeast Extract, 0.5% Na). C 1, 0. 2% Mg S 0 4 ⁇ 7 H 2 0, plated on 1.3% Agarosu) Plate, at 37 ° C, then over ⁇ cultured to form a plaque.
  • Example 2 Screening of rice genome library
  • AK-a cDNA isolated by Kawai et al. [Kawai et al., The Plant Journal 2 (6): 845-854 (1992)] was used as a probe, and Random Primer DNA was used for DNA labeling.
  • Labeling Kit Ver.2.0 (TaKaRa) was used in the following manner. l ⁇ g of AK-a cDNA and 2 ⁇ 1 of Rand0mPrimer were put into a tube, and the total amount was made 141 with a sterile tube.
  • the probe was obtained by heating at 65 ° C for 5 minutes.
  • DNA was prepared from the 11 positive phages isolated by the following method. Picked single phage, 100 1 of SM buffer (0. 58% N a C 0. 2% M g S_ ⁇ 4 ⁇ H 2 0, 0. 0 1% gelatin, 0. 05% T ris- HC 1), left at room temperature for 1 hour, added Escherichia coli (KW251) at 20/1, left at 37 ° C for 15 minutes, added 5 ml of NZYM medium, and cultured at 37 ° C overnight. . After cultivation, 1001 of clonal form was added to the culture, and the mixture was shaken for 15 minutes.
  • RNase A and DNase I were added to the resulting phage supernatant, respectively; 5; «gZm 1 And incubate at 37 ° C for 30 minutes, add an equal volume of 20% PEG6000-2.5 M NaCl solution, leave on ice for 1 hour, centrifuge, and precipitate the resulting precipitate. Suspended in 1 SM buffer. EDTA (final concentration: 10 mM) and SDS (final concentration: 0.1%) were added to the suspension, and the mixture was incubated at 65 ° C for 15 minutes, and then subjected to phenol extraction, phenol monocrope form extraction, and chromate form extraction. And an aqueous layer was obtained.
  • Each phage DNA obtained in this way is treated with several kinds of restriction enzymes including Sac I, Xba I and Pst I, separated by agarose gel electrophoresis, and probed with the full length AK-a cDNA. Southern analysis was performed. From the result, AK—a of c A 4-1 Sac I DNA fragment (1500 bp) and a 4-1 Xba I fragment (about 2000 bp), which are considered to contain a region homologous to DNA, were centrifuged with a filter for DNA recovery (SUPREC- 01, manufactured by TaKaRa) and recovered from the agarose gel.
  • SUPREC- 01 filter for DNA recovery
  • Each of the recovered DNA fragments was ligated to a restriction enzyme site (Sac I, Xba I) of pBluescript II (STRATAGENE) using a DNA Ligation Kit (TaKaRa) to transform Escherichia coli (XL1-Blue).
  • a restriction enzyme site Sac I, Xba I
  • STRATAGENE DNA Ligation Kit
  • TaKaRa DNA Ligation Kit
  • XL1-Blue Escherichia coli
  • two types of clones were obtained. 4 - 1 Sac I fragment P 3- 2-1 a including clones, a clone containing the Xba I fragment 4-1 was designated P4-2-l.
  • the nucleotide sequences of both clones were determined according to the dideoxy method using a nucleotide sequence determination kit (Bca BEST Dideoxy Sequencing Kit, manufactured by TaKaRa). As a result, it was clarified that the region containing the homology to
  • 11 positive phages were treated with the restriction enzyme SacI, separated by agarose gel electrophoresis, and subjected to Southern analysis.
  • Two types of DNA fragments obtained by treating the insert part of p4-2-1 with SacI were used as probes.
  • a positive phage (4-1) considered to contain the upstream region of AK-a cDNA was selected, and the following operation was performed.
  • 4-1 was treated with a combination of Sac I and 12 restriction enzymes, including Sac I and Pst I, Sac I and BamH I, and Sac I and Sal I, separated by agarose gel electrophoresis, and then analyzed by Southern analysis. Was done.
  • clone containing the 4-1 Pst I fragment was obtained.
  • the obtained p50 and p50 were sequenced using the Deletion Kit for Kilo-Sequence (TaKaRa) and the nucleotide sequences of a plurality of deletion mutant clones having deletions of different lengths were determined according to the dideoxy method. It was determined using a kit for sequencing (Sequencing High-Cycle-, manufactured by T0Y0B0).
  • nucleotide sequences of p3-2-1, 4-2-l, and p50 determined in this way were analyzed using a genetic information analysis software (GENETYX-MAC Ver.8, manufactured by SoftTube Development Co., Ltd.).
  • the nucleotide sequence of about 4.3 Kb shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was determined.
  • the regions of base sequence numbers 1337 to 1577, 2841 to 2986, 3074 to 3193, 33 14 to 348 1, 4 126 to 4215 shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing are: [Kawai et al., The Plant Journal 2 (6): 845-854 (1992)] o
  • the translation initiation codon (AT G ) Is present in nucleotide sequence numbers 1475 to 1477 shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the p50 obtained in Example 3 was treated with Sal I, separated by agarose electrophoresis, and then translated from agarose gel using a centrifuge tube with a filter for collecting DNA (SUPREC-01, manufactured by TaKaRa).
  • a DNA fragment containing a region of 1440 bp (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) upstream of the starting point (base numbers 1475 to 1477 in SEQ ID NO: 1) was recovered.
  • the obtained DNA fragment is plant
  • the vector was introduced into the SalI site of a gene transfer vector (pBI101, CL0NTECH) into a plant having a kanamycin resistance gene that could confirm the gene transfer into E. coli, and this vector was named p21 and is shown in Figure 1.
  • p21 was introduced into Agrobacterium (LBA4404 strain) by the following method.
  • the absorbance of 600 1111 at 28 ° C was determined using a YAG liquid medium (1% Bacto-peptone, 1% Bacto-yeast extract, 0.5% NaCl).
  • the cells were cultured until they reached 0.
  • the culture was cooled on ice, centrifuged, and the precipitated cells were suspended in 1 ml of 20 mM aCl2 solution, frozen with liquid nitrogen, added with 1 g of P21 DNA, and added at 37 ° C. After thawing for 1 minute, 1 ml of YEP liquid medium was added, followed by gentle shaking culture at 28 ° C for 4 hours.
  • the culture was centrifuged, and the precipitated cells were suspended in 0.1 lm 1 of YEP liquid medium.
  • YEP plates (1.3% agarose, 25 g / ml kanamycin, 300 g / ml) (Streptomycin and 100 gZml of rifampicin) and cultured at 28 ° C. for 3 days to obtain a transformed agrobacterium.
  • the gene was introduced into tobacco according to the following method.
  • the above-mentioned transformed agrobacterium was cultured overnight at 28 ° C. in YEP liquid medium.
  • aseptically grown tobacco leaves were cut into 1 cm squares and infected by immersing them in the above-mentioned culture of the transformed agrobacterium for 5 minutes.
  • tobacco leaves from which excess culture solution had been removed on sterile filter paper were placed on MS-NB plates, and cultured under approximately 300 lux light.
  • the cells were transferred to an MS-NB plate containing 500 g / ml of claforan and cultured to remove the transformed agrobacterium.
  • the presence of the transgene in the transgenic tobacco obtained in this manner was determined according to the CTAB method by using the genomic DNA extracted from the transgenic tobacco as a type III, and the sequence between the promoter gene and the GUS gene, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. Amplification was performed by PCR using the primers described in the above section, and confirmed by agarose electrophoresis.
  • the composition of the reaction solution used for the PCR reaction is as follows.
  • TaKaRa EX Taq (TaKaRa) was used as the thermostable DNA polymerase.
  • the PCR solution was separated by 2% agarose gel electrophoresis. As a result, the presence of the introduced AK promoter region and GUS gene could be confirmed.
  • the promoter activity was confirmed by measuring the enzymatic activity (GUS activity) of GUS, a translation product of a reporter gene linked downstream thereof, by the following method.
  • the protein was quantified using the Bio-Rad Protein Assay Kit (BIO-RAD) according to the blood flow method.
  • the amount of 4MU produced per unit time and per unit protein was calculated.
  • the unit is pmol / min / mg.
  • Plant tissues such as leaves or roots were cut off, immersed in a fixative (0.3% formamide, 10 mM MES, 0.3 M mannitol), suctioned with a vacuum pump, and treated at room temperature for about 1 hour. .
  • the tissue is washed with a buffer (50 mM sodium phosphate, pH 7.0), immersed in a solution of 5-bromo-4-chloro-3 -indoleyl- ⁇ -D-glucuronic acid (X_Gluc), and vacuum pumped. After that, treat at 37 ° C for 2 hours or more. The tissue was observed under a microscope to confirm the blue color developed by indigotin.
  • a fixative 10 mM MES, 0.3 M mannitol
  • X_Gluc 5-bromo-4-chloro-3 -indoleyl- ⁇ -D-glucuronic acid
  • Seeds were collected from AK-GUS tobacco plants that expressed GUS activity in the recombinant generation. These seeds were sown to obtain a recombinant next-generation AK-GUS tobacco. Histochemistry results of the tested tissue staining using, AK promoter is still work in recombinant next generation, it has been particularly expressed confirmation stronger force s at the growth point and the vascular bundle.
  • the p50 obtained in Example 3 was treated with SalI, separated by agarose electrophoresis, and translated into agarose gel using a centrifuge tube with a filter for collecting DNA (SUPREC-01, manufactured by TaKaRa).
  • a DNA fragment containing a region of 1440 bp (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) upstream of the point (base numbers 1475 to 1477 in SEQ ID NO: 1) was recovered.
  • the obtained DNA fragment was ligated to the herbicide-resistant gene PPT-acetyltransferase (PAT) gene and the 35S terminator gene to introduce a gene transfer vector for the agrobacterium method.
  • PPT-acetyltransferase PPT-acetyltransferase
  • pNC / AK-PAT was introduced into agrobacterium (LBA4404, EHA101) by the method described in Example 3 to introduce genes into tobacco and rice.
  • the presence of the thus-obtained AK-PAT tobacco and rice transgenes was determined using the primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5 between the promoter gene and the 35S terminator gene according to the CTAB method. Amplified by PCR reaction and confirmed by agarose gel electrophoresis. As a result, a band was detected at the target size, and the presence of the transgene was confirmed.
  • a herbicide tolerance test was performed by spraying glufosinate onto foliage of the produced AK-PAT tobacco and rice. The non-recombinant completely died AK-PAT tobacco and rice grew with herbicide tolerance.
  • Seeds were collected from AK-PAT tobacco and rice that developed herbicide tolerance in the recombinant generation. When the seeds were sown in a glufosinate solution, they germinated normally. When glufosinate was applied to the resulting recombinant next-generation AK-PAT tobacco, foliar tolerance was exhibited.
  • the promoter of the present invention can express a useful gene by introducing it into a plant or a plant cell linked to the useful gene. Further, since the promoter-one gene of the present invention is a promoter of the AK gene induced by sucrose, it can be used as a promoter for inducing the expression of the introduced useful gene by sucrose. Furthermore, since AK is localized in the vascular bundle, it is possible to limit the tissue and site where the introduced gene is expressed.

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Description

明細書
プロモータ一機能を有する DN A断片 技術分野
本発明は、 イネのアデニル酸キナーゼをコードする遺伝子に由来する、 植 物体内又は植物細胞内でプロモータ一機能を有する新規な DN A及び該 DN Aを用いた異種遺伝子の発現及び発現の制御に関する。
背景技術
一般に、 遺伝子の発現制御には、 プロモーターと呼ばれる構造遺伝子の 5， 上流領域が関っていることが知られている。 プロモーターは、 構造遺伝 子の上流にある DN A配列部分であり、 RN Aポリメラーゼが転写を開始す るためのシグナル （TATA領域） を含み、 続くタンパク質合成の進行を可 能とさせる。
TATA領域の 5， 上流には、 シスエレメン トと呼ばれる特定の塩基配列 が存在し、 この特定の領域が、 プロモータ一活性の強弱や発現制御において 重要な働きをするといわれている。
たとえば、 乾燥により発現が誘導されるシロイヌナズナの遺伝子 （ r d 2 9 A) のプロモーター [Koizumi ら， Gene 129:175-182(1993)] が単離され たが、 その後、 プロモーター領域に欠失変異を加えた実験や種々の DN A断 片を結合した実験から、 r d 29 A遺伝子の乾燥誘導を制御するシスエレン ェン トは、 T A C C G A C A Tからなる 9塩基の配列であること [Yamaguchi-Shinozakiら， J .Plant Res. 108:127-136(1995)] が報告され、 乾燥で誘導されるプロモーターとして機能するためには、 上記の 9塩基から なるシスエレメントが必須であることが明らかにされている。
一方、 現在、 植物の形質転換において、 カリフラワーモザイクウィルスの 35 Sプロモーター [Guilley ら， Cell 30:763-773(1982)] は、 もっとも 良く知られているプロモータ一の一つであり、 35 Sプロモータ一は、 双子 葉植物及び双子葉植物のプロトプラスト内に導入された遺伝子の発現を制御 する [Fromm ら， Pro Natl. Acad. Sci. 82:5824-5828(1985)]。 タバコ [Morel 1 ら， Nature 315:200-204(1985)] 又はペチュニア [Sander, Nucl. Acid Res. 15:1543-1558(1987)] を用いた解析により、 35 Sプロモーター は、 ノパリンシンターゼプロモーターと比較して、 プロモータ一活性が 30 倍以上強力であることが示された。 この様に、 双子葉植物において 35 Sプ ロモ一ターのプロモーター活性は強力であるので、 双子葉植物へ、 植物で発 現可能な構造遺伝子を導入し、 高発現させるために、 このプロモーターが広 く用いられている。
しかし、 35 Sプロモータ一は、 農業上重要な単子葉植物であるイネ科植 物において、 比較的低いプロモータ一活性しか示さない [Hauptmann ら， Plant Cell Rep. 6 :265-270 (1987) ]0
反対に、 トウモロコシのアルコールデヒドロゲナ一ゼ （Ad h) 遺伝子由 来のプロモーターは、 双子葉植物である N i c 0 t i a n a p 1 umb a g i n i f o 1 i aのプロトプラスト中では非常に低い発現しか与えない [Ellisら， EMBO J. 6:11- 16(1987)]
また、 35 Sプロモーターや Ad hプロモータ一は、 組織特異的発現調節 や化学物質による発現調節は容易ではないと考えられる。
今後、 遺伝子組換えにより、 広範囲な植物において実用上有用な新植物種 を作出するためには、 導入する構造遺伝子の発現をいかに効率良く行う力、、 またいかにその発現を調節するかということは、 重要な技術であると考えら れる。
従って、 双子葉植物のみならず単子葉植物においても、 プロモーター活性 を有し、 かつ組織 ·部位特異的発現の制御や安全な化学物質による発現の制 御が可能なプロモーターが望まれている。
ところで、 動物、 微生物及び植物の生体内で、 エネルギー系に関与してい る と考え られているアデニル酸キナーゼ （A K) [ Noda ら， The Enzymes. Academic Press, New York: 279-305 (1973)等] が知られている。 植物においては、 ィネ植物体内でアデニル酸キナーゼがスクロース等によ つて誘導されること [川合ら， 育雑 別 1:253(1994)]、 維管束部分に局在 すること [Kawai ら， J. Plant Physiol. 146:239-242(1995)； Kawai ら， Plant Molecular Biology 27:943-951(1995)] が明らかにされている。
また、 イネ AKをコードする 2種類の c DNA (AK— a及び AK— b) が単離されている [Kawaiら， The Plant Journal 2(6) :845-854(1992)] が、 ゲノム D N Aは得られておらず、 そのプロモータ一領域の塩基配列も知られ ていない。
発明の開示
本発明は、 連結された外来構造遺伝子を植物体内又は植物細胞内で発現せ しめ、 かつ安全な化学物質による発現の制御や組織 ·部位特異的な発現の制 御を可能にする、 プロモータ一機能を有する新規な DNA断片を取得、 提供 することを課題とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、 イネ A K— a遺伝子のプロモータ一領域を単離し、 さらに、 このプロモーター領域 力 ?異種植物内においてもプロモータ一活性を有し、 外来遺伝子の発現及び発 現の制御を可能にすることを見いだし、 本発明を完成するに至った。
本発明は、 イネのアデ二ル酸キナ一ゼをコードする遺伝子に由来する、 以 下に示すプロモータ一からなる。 すなわち、 配列表の配列番号 1に示す塩基 配列の少なくとも一部からなり、 植物体内又は植物細胞内において、 植物で 発現可能な構造遺伝子の発現を制御する機能を有するかぎり 1又は 2以上の 塩基の欠失、 挿入又は置換を含んでもよいプロモーター機能を有する DNA 断片であり、 たとえば配列番号 2に示す 1440 b pの DNAである。 また 本発明は、 そのプロモータ一機能を有する DNA断片を有するベクタ一、 そ のベクターを含む細菌、 及びそのベクター又は細菌で形質転換された植物で ある。 さらに本発明は、 前記のプロモータ一機能を有する DNA断片と他の DNA配列とを連結した組換え D N Aを植物に導入し、 前記組換え D N A配 列の発現を制御する方法を提供する。
図面の簡単な説明
図 1は、 p 21の構築図を示す。 N0S - Proはノパリンシンターゼプロモー タ一遺伝子を、 NPT- IIはカナマイシン抵抗性遺伝子を、 NOS- Terはノパリン シンターゼターミネータ一遺伝子を、 AK- a - Proは AK-aプロモータ一遺伝子 を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下の記載において、 常法として用いられる組換え DNA技術は、 特筆し ないかぎり以下の文献： Molecular Cloning, Fristch ら， Cold Spring Harbour Press(1989)に記載されている技術を使用して実施することができ る。
本発明のプロモーター機能を有する DN A断片は、 以下に記載する、 イネ AKの c DN Aをプローブに用いた、 プラークハイプリダイゼ一ション等に より、 植物ゲノムライブラリ一から単離することができる。
植物、 たとえばイネよりゲノム DNAを抽出し、 単離したゲノム DNAを 適当な制限酵素、 たとえば Sau3A Iで部分分解し、 ショ糖密度勾配遠心ある いはァガロースゲル電気泳動により、 長い DNA断片、 たとえば 9〜23 k bの DNA断片を分画し、 これを適当なベクタ一、 たとえば λファージに組 み込み、 パッケージングした後、 この組換えファージを大腸菌、 たとえば X L— 1 Β 1 u e株に感染させ、 平板培地、 たとえば LBプレート （1 % Bacto tryptone, 0. 5 % yeast- extract、 l %NaCl、 1. 3%ァガ口— ス） にて培養することにより、 ゲノムライブラリーを得ることができる。 ベ クタ一は、 プラスミ ドを用いてもよい力 ?、 スファージゃコスミ ドベクタ一を 用いると、 より長い断片を挿入できる点で望ましい。
メンブレン、 たとえばナイロンメンブレンを、 上記の平板培地の上に置き、 このメンブレンを変性液に浸した後、 中和液に浸し、 洗浄液で洗浄すること により、 平板培地上の組換え DNAを一本鎖にし、 メンブレンに吸着させる ことができる。
プロ一ブとして、 たとえば AK構造遺伝子の一部をもとに合成したオリゴ DNAあるいは、 AKの c DNAを铸型とし、 その一部を P C R法で増幅さ せた DNAを、 〔 な 一 13 2 P〕 d CTP、 D I G (D i g o x i g e n i n)、 ピオチン等により標識して用いることができる。
上記の一本鎖 DNAが付着したメンブレンと標識したプローブを用い、 ノヽ イブリダイゼーションすることができる。
この様にして標識したプロ一ブでハイブリダィズさせたメンブレンをォー トラジオグラフィーに供し、 プロ一ブに強くハイブリダイズするクローンを 検出し、 陽性クローンとして単離することができる。
単離した陽性クローンの DNAを適当な制限酵素、 たとえば Eco RI で処 理し、 適当なクローニングベクタ一、 たとえば pBluescript II にサブクロ 一二ングし、 Ma x am— G i l b e r t法あるいは、 ジデォキシ法などに よりその塩基配列を決定することができ、 市販されているキッ ト類、 及び配 列決定を自動的に行うォートシークェンサ一等も使用できる。
上記のようにして、 得られたクローンの塩基配列を決定し、 A K遺伝子の 5， 非翻訳領域とその上流のプロモーター領域を見いだすことができる。 この様にして得られたプロモータ一領域の下流に連結する構造遺伝子とし ては、 たとえばレポーター遺伝子、 殺虫性タンパク質遺伝子、 除草剤耐性遺 伝子、 抗菌活性を発現する遺伝子、 植物の開花を誘導する遺伝子、 植物の生 長制御遺伝子、 植物の形態形成に関わる遺伝子、 耐ス トレスに関与する遺伝 子、 花の色素形成に関わる遺伝子、 光障害耐性に関与する遺伝子、 収量増大 に関与する遺伝子等が挙げられる。
レポ一夕一遺伝子としては、 /9-グルクロニダーゼ （GUS) 遺伝子、 ル シフェラーゼ遺伝子、 クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ (CAT) 遺伝子等があげられる。 殺虫性タンパク質遺伝子と しては Bacillus thuringiensis の結晶タンパク質遺伝子やプロテアーゼインヒビ ター遺伝子等が、 除草剤耐性遺伝子としてはグリホサート耐性遺伝子ゃグル ホシネート耐性遺伝子やスルホニルゥレア系除草剤耐性遺伝子等が、 抗菌活 性を発現する遺伝子としてはキチナ一ゼ遺伝子やグルカナーゼ遺伝子やリゾ チーム遺伝子ゃセクロピン遺伝子等が、 植物の開花を誘導する遺伝子として フロリゲンの生成に関与する遺伝子等が、 植物の生長制御遺伝子としてはポ リガラクチュロナ一ゼ遺伝子等、 植物の形態形成に関わる遺伝子としては r 0 1 C遺伝子等、 耐ストレスに関与する遺伝子としては脂肪酸不飽和化酵素 遺伝子 （F A D 3 ) 等が、 花の色素形成に関わる遺伝子としてカルコンシン タ一ゼ遺伝子やフエ二ルァラニンアンモニアリア一ゼ遺伝子等が、 光障害耐 性に関与する遺伝子としてはグルタミン合成酵素遺伝子等が、 収量増大に関 与する遺伝子としては修飾された種子貯蔵タンパク質遺伝子やショ糖リン酸 合成酵素遺伝子等が挙げられる。 - プロモーターの下流に構造遺伝子、 たとえばレポ一ター遺伝子を連結した 組換え D N Aの植物への導入方法としては、 間接導入法及び直接導入法が挙 げられる。
間接導入法としては、 たとえばァグロパクテリゥムを用いた方法が挙げら れる。
直接導入法としては、 たとえばエレク トロボレ一シヨン法、 パーティクル ガン法、 P E G法、 マイクロインジェクション法、 シリコンカーバイ ドウイ スカ一法等があげられる。
遺伝子を導入する植物体としては、 たとえば穀類、 野菜、 果樹， 飼料作物、 果樹および観賞用植物等の植物があげられ、 たとえばイネ、 トウモロコシ、 コムギ、 ォォムギ、 シバ、 サトウキビ、 アスパラガス、 綿、 ビート、 馬鈴薯、 サツマィモ、 シクラメン、 スターチス、 金魚草、 タバコ、 ァラビドプシス等 力'考えられる。 並びにそれらは単子葉、 双子葉植物のいずれでもよく、 その 種類を問わない。
導入したプロモーターと構造遺伝子が含まれている植物体は、 たとえば力 ナマイシンやハイグロマイシン等の薬剤耐性遺伝子を遺伝子導入べクタ一に 連結するか、 又は、 薬剤耐性遺伝子を持つベクターを同時に植物体に導入し た後に、 薬剤、 たとえばカナマイシンやハイグロマイシン等で選抜すること により得ることが可能である。 さらに、 植物体へ導入した遺伝子の解析、 た とえば P C R法やサザンハイブリダィゼーシヨン法等の方法や、 導入した構 造遺伝子の翻訳産物の解析、 たとえば植物の葉の抽出液等の目的のタンパク 質を、 酵素活性やウェスタン法等により解析することによって確認し、 目的 とする遺伝子が導入された植物体を選択することもできる。
得られた形質転換植物を、 生長させ、 種子を採取することや、 形質転換植 物の組織、 たとえば葉や根を用い植物体を分化、 再生することができる。
A K遺伝子は、 スクロースで発現が制御されることから、 プロモータ一領 域の下流に構造遺伝子を連結させ、 それを導入した形質転換植物中で、 導入 した構造遺伝子の発現の制御を行うことができる。 発現制御の方法としては、 形質転換植物をスクロースで以下のように処理する方法が挙げられる。
形質転換植物が完全な植物体の場合の処理方法としては、 その茎葉部に誘 導物質をスプレー等で散布するか、 もしくは土壌や水耕液に添加する方法が 挙げられる。 また、 植物体の葉片を、 スクロースを含む再分化培地で再分化 させる方法も考えられる。
形質転換植物が種子である場合の処理方法としては、 種子をスクロースの 溶液を用い、 発芽及び 根させる方法が挙げられる。
形質転換植物が植物細胞、 たとえばカルスの場合の処理方法としては、 液 体培地や固体培地中にスクロースを添加するか、 もしくは直接植物細胞にス クロース溶液を付着させる方法が挙げられる。
植物に導入したプロモーターのスクロースによる誘導は、 連結し導入した 構造遺伝子及び Z又は構造遺伝子の翻訳産物の量的変化をみることによって 確認できる。
たとえば、 構造遺伝子として G U S遺伝子を使用した場合、 スクロース処 理を行った形質転換植物と、 無処理の形質転換植物の G U S活性を、 4 M U Gの G U Sによる分解物である 4 MUの紫外光 （3 6 5 n m) による蛍光を 測定する蛍光法により測定し、 両植物の G U S活性の差をみることによって、 スクロースによる誘導が確認できる。
また、 たとえば、 構造遺伝子として Baci l lus thuringiensis の結晶タン パク質遺伝子を使用した場合、 スクロース処理を行った形質転換植物と、 無 処理の形質転換植物の殺虫活性の差をみることによって、 スクロースによる 誘導が確認できる。
A K遺伝子は、 維管束部分に局在することから、 プロモータ一領域の下流 に構造遺伝子を連結させ、 それを導入した形質転換植物中で、 導入した遺伝 子の発現部位を制御することができる。
プロモーターに連結し導入した構造遺伝子の部位特異的発現の解析は、 構 造遺伝子及び Z又は構造遺伝子の翻訳産物の、 植物体内での局在を解析する ことによって確認できる。
たとえば、 構造遺伝子として G U S遺伝子を使用した場合、 形質転換植物 体内での G U Sの存在部位は、 組織化学法により確認することができる。 すなわ 、 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β -D-glucuronic acid の Lr U s による加水分解産物である indigot inの青い発色を顕微鏡観察によって組織 を観察することにより、 G U Sの局在部位を確認できる。
また、 プロモーター領域に欠失 ·置換等の変異処理を行い、 種々の変異プ 口モーターを作製し、 この変異プロモータ一に構造遺伝子、 たとえばレポ一 タ一遺伝子を連結し植物へ導入後、 レポ一タ一遺伝子の発現を前出の方法を 用い解析することにより、 スクロースによる誘導を制御する領域及び維管束 特異的な発現を制御する領域を決定することができる。 変異処理としては、 たとえばプロモータ一機能を有する D N A断片のディレーシヨンミュータン トを作製したり、 プロモータ一機能を有する D N A断片を適当な制限酵素で 切断し、 一部を欠失させた後、 連結すること等が挙げられる。 さらに、 スクロースによる誘導を制御する領域及び Z又は組織 ·部位特異 的発現制御する領域を、 既存の、 たとえば 35 Sプロモーターに連結するこ とにより、 35 Sプロモータ一の発現を制御することも可能になる。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する力 本発明はこれらによって なんら限定されるものではない。
実施例 1 ： イネゲノムライブラリーの作製
イネゲノムライブラリ一を作製するため、 播種後 2週間目のイネ （二ホン バレ） の葉より、 ゲノム DNAを抽出、 単離した。 単離したゲノム DNAを、 Mbo I で部分分解した。 反応液をフエノールークロロホルム抽出し、 得られ た水層をエタノール沈殿後、 得られた沈殿を TE緩衝液に溶かし、 ゲノム D N Aの Mbo I断片を得た。
こう して得られた、 ゲノム DN Aの Mbo I断片を、 λ- GEM12 Xho I Half - site Arms Cloning System (Pr omega社製) を用レ、、 ファーンベクタ一ス GEM-12の Xho Iサイ トに組み込み、 ファージ粒子にパッケ一ジングした後、 この組換えファージを大腸菌 （KW251) を含むトツプアガーとともに、 NZ YM ( 1 % N Z am i n e, 0. 5% Y e a s t Ex t r a c t, 0. 5 % N a C 1、 0. 2 % Mg S 04 · 7 H20、 1. 3 %ァガロース） プ レートにプレーティングし、 37°Cで、 ー晚培養し、 プラークを形成させた。 実施例 2 ： イネゲノムライブラリーのスクリーニング
( a) メンブレンの作製
上記の、 プラークが形成された NZ YMプレートを冷蔵後、 その上に鉛筆 で印を付けたメンブレン （Hybond N+、 Amersham社製） を置き 2分間放置し、 針でメンブレンからァガ一を突き刺し印を付けて、 メンブレンをはがした。 このメンブレンを 1. 5M Na C l、 0. 5 M N a 0 H溶液に 2分間浸し 変性させ、 次に 1. 5M T r 1 s -HC 1 (p H 7. 5)、 2 XS SC溶液 に 5分間浸し中和させ、 次に 0. 2M T r i s -HC 1 (p H 7. 5)、 2 X S S C溶液に 30秒浸し洗浄した後、 濾紙上でメンプレンを乾燥させる ことにより、 NZ YMプレート上の組換え DNAをメンブレン上に一本鎖の 状態で、 吸着させた。
(b) プローブの作製
プローブとしては、 川合ら [Kawai ら， The Plant Journal 2(6) :845- 854(1992)] によって単離された、 AK— aの c DN Aを用い、 DNAの標 識には Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0 (TaKaRa 社製） を用い、 以下の様な方法で行った。 l〃 gのAK— aのc DNAと 2〃 1の R a n d 0 m P r i me rとをチューブに入れ、 滅菌フ で全量を 14 1にした。
10 XBu f f e r、 d NTP M i x t u r eを各 2. 5 μ {a-2 L· P〕 d CTP (1. 85MB Q) を 5 / 1加えた。 1 1の E x o— f r e e K 1 e n ow F r a gme n t加え、 37 °Cで 1 0分間保温後、
65 °Cで 5分間加熱し、 プローブを得た。
( c ) ノヽイブリダイゼーション
上記の一本鎖 DN Aが付着したメンブレンをハイプリバッグに入れ、 メン ブレン 100 c m "あたり 5 m 1のハィブリダイゼ一シヨンバッファー （5 X S S C、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5% S D S) を加え、 超音波処理及 び加熱、 急冷処理をした s a l mo n s e rm DNAを 0. l mgZ m lになるように加え、 65 °Cで 1時間インキュベートした。 これに上記の 標識したプローブを加熱、 急冷処理し、 ハイブリダィゼーシヨ ンバッファー 1 m 1あたり、 1 05〜 1 00 c p m相当加えた。 密封後、 65でで 1晚ハ イブリダイゼーションした。 次に、 ハイブリダイゼーションの終了したメン プレンを、 まず洗浄液 A (0. 1 % SDS、 2 X S S C) 中で室温で 1 0 分間振盪させ洗诤し、 次に洗浄液 B (0. 1 % SDS、 1 XS S C) 中で
65°Cで 30分間振盪させ洗浄する。 再度、 新しい洗浄液 B中で、 65°Cで 30分振盪させ洗浄し、 その後、 風乾させた。
(d) オートラジオグラフィー
風乾させたメンブレンをラップで包んだ後、 ォ一トラジオグラフィ一に供 し、 ォ一トラジオグラフィーフィルムを得た。 メンブレンに付けた印による フィルム上のシグナルとプレートのァガーに付けた印とを合わせ、 フィルム 上のポジティブシグナルの位置から、 プローブに強くハイブリダイズするフ ァージを検出し、 陽性ファージとして単離した。 約 200万のファージから 1 1個の陽性ファージを得た。
実施例 3 ：塩基配列の決定
(a) 陽性ファージ DN Aの調製
単離した 1 1個の陽性ファージから、 以下の様な方法で DNAを調製した。 単一のファージを拾い、 100 1の SM緩衝液 （0. 58% N a C 0. 2 % M g S〇 4 · H 20、 0. 0 1 % g e l a t i n, 0. 05 % T r i s— HC 1 ) に懸濁し、 室温に 1時間放置し、 大腸菌 （KW251) を 2 0/ 1加え、 37°Cで 1 5分間放置後、 NZ YM培地を 5m 1加え、 37 °C で一晩培養した。 培養後、 培養液にクロ口ホルムを 1 00 1加え、 1 5分 間振盪させ、 遠心分離後、 得られたファージ液である上清に RN a s e A、 DN a s e Iをそれぞれ 5；« gZm 1になるように加え、 37°Cで 30分 間インキュベートし、 等量の 20% PEG6000- 2. 5M NaC l 溶液を加え、 氷上で 1時間静置し、 遠心分離し、 得られた沈殿を 500 1 の SM緩衝液に懸濁した。 懸濁液に、 EDTA (終濃度 1 0mM) と SDS (終濃度 0. 1%) を加え、 65°C、 15分間保温後、 フヱノール抽出、 フ ェノール一クロ口ホルム抽出、 クロ口ホルム抽出を行い、 水層を得た。 得ら れた水層に等量のイソプロパノールを加え一 80°Cで、 1 0分間静置した後、 遠心し、 沈殿に 70%エタノールを加え、 再度遠心し、 沈殿を 50 1の T E緩衝液に溶かし、 ファージ DN A溶液を得た。
( b ) 陽性ファージ D N Aの塩基配列の決定
この様にして得られた各ファージ DN Aを Sac I、 Xba I、 Pst Iを含む数種 類の制限酵素で処理し、 ァガロ一スゲル電気泳動で分離後、 A K— aの c D N A全長をプローブとしたサザン解析を行った。 その結果より AK— aの c DNAに相同な領域を含むと考えられる、 4-1 の Sac IDNA断片 （1 50 0 b p) 及び 4-1の Xba I断片 （約 2000 b p) を、 DNA回収用フィル ター付遠心チューブ （SUPREC- 01、 TaKaRa社製） を用い、 ァガロースゲル中 よ り 回収した。 回収した D N A断片を、 それぞれ pBluescript II (STRATAGENE社） の制限酵素部位 （Sac I、 Xba I) に、 DNA L i g a t i o n K i t (TaKaRa社製） を用いて連結し、 大腸菌 （XL1- Blue) に 形質転換することにより、 2種類のクローンを得た。 4 - 1の Sac I断片を含 むクローンを P3- 2- 1、 4-1の Xba I断片を含むクローンを p4-2-l と命名し た。 両クローンの塩基配列を、 ジデォキシ法に従い、 塩基配列決定用キッ ト (Bca BEST Dideoxy Sequencing Kit, TaKaRa社製） を用い決定した。 その 結果、 A K— aの c DNAと相同性のある領域は含んでいるが、 目的の翻訳 開始点より上流の領域は含んでいないことが明らかとなった。
そこで、 1 1個の陽性ファージを制限酵素 Sac Iで処理し、 ァガロースゲル 電気泳動で分離後、 サザン解析を行った。 プローブとして、 前出の p4- 2-1 のインサ一ト部分を Sac Iで処理して得られる 2種類の DNA断片を用いた。 その結果、 AK— aの c DN Aの上流域を含むと考えられる陽性ファージ (4-1) を選び、 以下の操作を行った。 4 - 1を Sac Iと Pst I、 Sac Iと BamH I、 Sac Iと Sal Iの組み合わせを含む、 Sac Iと 12種類の制限酵素の組み 合わせで処理し、 ァガロースゲル電気泳動で分離後、 サザン解析を行った。 プローブとして、 前出の p4- 2-1のィンサート部分を Sac Iで処理して得ら れた 2種類の DN A断片を用いた。 これまでのサザン解析の結果から、 AK 一 a翻訳開始点の上流域を含むと考えられる 4-1の Pst I断片を、 DNA回 収用フィルタ一付遠心チューブ （SUPREC- 01、 TaKaRa社製） を用い、 ァガロ ースゲル中よ り回収した。 回収した D N A断片を、 pBluescript II (STRATAGENE社） の制限酵素部位 （Pst I) に、 DNA L i g a t i o n K i t (TaKaRa社製） を用い連結後、 大腸菌 （XLl-Blue) に形質転換する ことにより、 サブクローニングを行い、 4-1 の Pst I 断片を含むクローン (p50) を得た。 得られた p50及び p50 を Kilo- Sequence用 Deletion Kit (TaKaRa社製） を用いて作製した長さの異なる欠失部分を有する複数のデ ィレーシヨンミュータントクローンの塩基配列を、 ジデォキシ法に従い、 塩 基配列決定用キッ ト （Sequencing High -Cycle -、 T0Y0B0社製） を用いて決 定した。
(C) 決定した塩基配列の解析
この様にして決定した p3-2- 1、 4-2-l及び p50の塩基配列を、 遺伝子情 報解析ソフ トゥヱァ （GENETYX- MAC Ver.8、 ソフ トゥヱァ開発株式会社製） を用いて解析し、 配列表の配列番号 1に示す約 4. 3 Kbの塩基配列を明ら かにした。 明ら力、にした塩基配列の内、 配列表の配列番号 1に示す塩基配列 番号 1337〜 1577、 2841〜 2986、 3074〜 3 1 93、 33 14〜 348 1、 4 126〜 421 5の領域は既に報告のある A K c DNA の塩基配列と一致した [Kawai ら， The Plant Journal 2(6)： 845- 854 (1992) ]o さらに、 AKcDNAの解析から明らかにされた翻訳開始コド ン （AT G) が配列表の配列番号 1に示す塩基配列番号 1475〜 1477 に存在することが明らかとなつた。
遺伝子情報解析ソフトウ ア （GENETYX - MAC Ver.8、 ソフ トゥヱァ開発株 式会社製） を用いたプロモータ—解析により、 配列番号 1中の塩基番号 94 7から 954 (8塩基） 及び 953から 958 ( 6塩基） に TATAボック ス様の配列の存在を確認した。
実施例 4 ： プロモーター活性の検定
(a) 植物への遺伝子導入
実施例 3において得られた p50を Sal Iで処理し、 ァガロース電気泳動に よって分離後、 DN A回収用フィ ルタ一付遠心チューブ （SUPREC- 01、 TaKaRa社製） を用い、 ァガロースゲル中より、 翻訳開始点 （配列番号 1中 の塩基番号 1475から 1477) より上流の 1440 b p (配列表の配列 番号 2) の領域を含む DN A断片を回収した。 得られた DN A断片を、 植物 への遺伝子導入を確認できるカナマイシン耐性遺伝子を持つ植物への遺伝子 導入ベクター （pBI101、 CL0NTECH社） の Sal I サイ トに揷入し、 このべク ターを p21 と命名し、 図 1に示した。 p21 を以下の方法によりァグロバクテ リウム （LBA4404株） に導入した。
ァグロパクテリゥムを、 YE P液体培地 （ 1 % Bacto-peptone, 1 % Bacto-yeast extract, 0. 5 % NaCl) を用い、 2 8°〇で6 0 0 ]1111の吸 光度が 1. 0程度になるまで培養した。 培養液を氷上で冷却した後、 遠心分 離し、 沈殿した菌体を 1 m lの 2 0mMC a C l 2溶液に懸濁し、 液体窒素 により凍結させ、 P21DNAを 1 g加え、 3 7°Cで 5分間解凍し、 1 m l の YE P液体培地を加え、 2 8 °Cで 4時間緩やかに振盪培養した。 培養液を 遠心分離し、 沈殿した菌体を 0. l m 1の YE P液体培地に懸濁し、 YE P プレート （ 1. 3 %ァガロース、 2 5 g/m 1のカナマイシン、 3 0 0 g/m l のス トレプトマイシン、 1 0 0 gZm l のリファンピシンを含 む） にプレーティングし、 2 8 °Cで 3日間培養し、 形質転換ァグロパクテリ ゥムを得た。
以下の方法に従い、 タバコへの遺伝子導入を行った。
まず上記の形質転換ァグロパクテリゥムを YEP液体培地を用い、 2 8°C で一晩培養した。 次に、 無菌栽培したタバコの葉を 1 c m角に切り取り、 前 出の形質転換ァグロパクテリゥムの培養液に 5分間浸すことにより感染させ た。 感染後、 滅菌した濾紙上で余分な培養液を除いたタバコの葉を、 MS— NBプレート上に置き、 約 3 0 0 0ルックスの光の下で培養した。 5日後に、 形質転換ァグロパクテリゥムを除くために 5 0 0 g/m lのクラフォラン を含んだ MS— NBプレートに移し培養した。 7日後にカナマイシン耐性の 個体を得るために 1 0 0 g/m 1のカナマイシンと 5 0 0 /i gZm lのク ラフオランを含んだ MS— NB ( 1 6 5 0 m g/ 1 NH4N03、 1 9 0 0 m g/ 1 KN03、 4 4 0 mg/ 1 CaCl2'2H20、 3 7 Omg/ 1 MgS04-7H2 0、 1 7 0 m g/ 1 KH2P04、 6. 2 m g/ \ NH3B03、 2 2. 3 mg/ 1 MnS04'4H20、 8. 6mg/ 1 ZnS04'7H20、 0. 83 m g/ 1 KI、 0. 25mg/ l Na2Mo04'2H20、 0. 025 mg/ 1 CuS04'5H20、 0. 0
2 5mg/ 1 CoCl2'6H20、 37. 3 m g / 1 Na2- EDTA、 2 7. 8 m g / 1 FeS04'7H20、 1 Omg/ 1 塩酸チアミン、 5mgZ l ニコチン 酸、 l OmgZ l 塩酸ピリ ドキシン、 l O OmgZ l myo—イノシ トー ル、 2mgZ l グリシン、 30000 mgZ l ショ糖、 0. lmgZ 1 ひ - Naphthaleneacetic Acid、 1. OmgZ l 6-Ben¾yl adenine) プレ ートに移し培養した。 10日後、 カナマイシン耐性の分化した茎葉部が大き くなつたら、 ホルモンを含まない MS ( 1 65 Omg/ 1 NH4N03、 1 9 O O m g/ 1 KN03、 44 O m g/ 1 CaCl2'2H20、 3 7 0 m g / 1 MgS04'7H20、 1 7 Omg/ 1 KH2P04、 6. 2 mg/ 1 NH3B03、 22.
3 mg/ 1 MnS04'4H20、 8. 6 mg/ 1 ZnS04'7H20、 0. 83 m g/ 1 KI, 0. 25mg / 1 Na2Mo04 ·2Η20、 0. 025 mg/ 1 CuS04 · 5H20、 0. 025 mg/ 1 CoCl2'6H20、 37. 3 mg/ 1 Na2- EDTA、 27. 8 m g/ 1 FeS04'7H20、 1 0 m g / 1 塩酸チアミ ン、 5mgZ 1 ニコチン酸、 10mg/ l 塩酸ピリ ドキシン、 l O OmgZ l myo —イノシトール、 2mgZ l グリシン、 30000mg/ l ショ糖、 3 00 Omg/ 1 Gel lan gum) プレートに移し、 成育させることによって形 質転換タバコを得た。
(b) 導入遺伝子の確認
こうして得られた形質転換タバコ中の導入遺伝子の存在は、 C TAB法に 従い、 形質転換タバコから抽出したゲノム DNAを铸型とし、 プロモーター 遺伝子と G U S遺伝子の間を、 配列番号 3及び配列番号 4に記載のプライマ —を用いて P CR反応によって増幅させ、 ァガロース電気泳動を行うことに よって確認した。 PCR反応に用いた反応液の組成は以下の通りである。 な お、 耐熱性 DNAポリメラーゼには、 T aKaR a EX T a q (TaKaRa 社製） を用いた。 T r i s -HC 1 H8. 3 10 mM
KC 1 50 mM
Figure imgf000018_0001
各 dNPT 0. 2mM
耐熱性 DN Aポリメラーゼ 1 U
ゲノム DNA 0. 1 ^ g
各プラィマ一 20 p m o 1
滅菌水を足して、 全量を 50 1にする。
また、 PCR反応の条件は以下の通りである
95 °C 5分間
95°C 1分間、 55°C 2分間、 72°C 2分間のサイクルを 30回
72°C 7分間
PCR反応液を 2% ァガロースゲル電気泳動で分離した。 その結果、 導 入した A Kプロモータ—領域及び G U S遺伝子の存在を確認できた。
(c) プロモータ一活性の測定
プロモータ一活性は、 その下流に連結したレポーター遺伝子の翻訳産物で ある GUSの酵素活性 （GUS活性） を以下の方法によって測定することに よって確認した。
( c一 1 ) 蛍光法
形質転換植物の葉片、 又は根、 約 10 Omgをマイクロチューブ （1. 5 m l ) に入れ、 抽出緩衝液 （5 OmM リン酸緩衝液 （pH 7. 0)、 1 0 mM EDTA、 0. 1 % T r i t o n X - 100、 0. 1% N - L a u r o y l s a r c o s i n e S o d i um S a l t、 1 mM β― メルカプトエタノール） を 100 1加え、 氷上で十分にすりつぶし、 遠心 後約 100 1の上清を回収した。 得られた上清を用い、 G U S活性の測定 と蛋白量の定量を行う。
G US活性の測定は、 上記の上清 80 μ 1に緩衝液 1 70 1を加え抽出 1フ
液と した。 抽出液に、 基質 と して 4 - methyl - umbelliferyレ β -D- glucuronide (4MUG)溶液 （ImM 4MUGZ抽出緩衝液） を 2 5 0 1加え、 3 7°Cで反応を開始した。 反応開始 1 0分後と 4 0分後に反応液の一部 （1 0 0 μ I ) をとり、 反応停止液 （0. 2Μ 炭酸ナトリウム） 2 m lに添加す ることによって反応を停止させた。 ブランクとして、 反応停止液 2 m lに抽 出液 1 0 0 1 のみを添加 した も のを、 対照と して 4-methy umbel 1 if erone (4MU)の 1 / Mの溶液を 5 0 1及び 1 0 0 1添加した反 応停止液 2 m 1を用いた。 これらの溶液の蛍光を分光蛍光光度計を用い測定 した （励起波長 = 3 6 5 nm、 発光波長 = 4 5 5 nm)。
タンパク質の定量は、 ブラッ ドフォー ド法に従い、 Bio - Rad Protein Assay Kit (BIO- RAD社） を用い行った。
この様にして得られた数値をもとに、 単位時間及び単位蛋白量あたりの 4 MU生成量を算出した。 単位は、 pmol/min/mg。
AK -GU S 非組換え体
GU S活性値 9 8. 5 1 1 4. 4 9
標準誤差 1 5. 6 1 4. 3 7 (C一 2) 組織化学法
植物の組織たとえば葉、 又は根を切り取り、 固定液 （0. 3 % ホルムァ ミ ド、 1 0mM ME S、 0. 3M マンニト一ル） に浸し、 真空ポンプで 吸引後、 室温で約 1時間処理した。 組織を緩衝液 （5 0 mM リン酸ナトリ ゥム p H 7 . 0 ) で洗浄し、 5- bromo- 4- chloro - 3 - indolyl - β - D - glucuronic acid (X_Gluc)溶液に浸し、 真空ポンプで吸引後、 3 7°Cで 2時 間以上処理する。 顕微鏡観察によって組織を観察し、 indigotin による青の 発色を確認した。 実施例 4
(c-3) 組換え次世代植物体の解析
組換え当代で G U S活性を発現した A K— G U Sタバコから、 種子を採種 した。 この種子を播種して組換え次世代の AK— GUSタバコを得た。 組織 化学法を用いた組織染色に供試した結果、 AKプロモーターは組換え次世代 でも機能し、 特に成長点や維管束での発現が強いこと力 s確認された。
実施例 5 ：除草剤耐性植物の作出
(a) 植物への遺伝子導入
実施例 3において得られた p50を Sal Iで処理し、 ァガロース電気泳動に よって分離後、 DN A回収用フィ ルター付遠心チューブ （SUPREC- 01、 TaKaRa 社製） を用い、 ァガロースゲル中より、 翻訳開始点 （配列番号 1中 の塩基番号 1 475から 1477) より上流の 1 440 b p (配列表の配列 番号 2) の領域を含む DN A断片を回収した。 得られた DN A断片を除草剤 耐性遺伝子である P P T—ァセチルトランスフヱラーゼ （PAT) 遺伝子、 3 5 Sタ一ミネーター遺伝子と連結してァグロパクテリゥム法用の遺伝子導 入べクタ一に挿入し、 pNC/AK - PAT と名付けた。 pNC/AK-PAT を実施例 3に記 載の方法でァグロパクテリゥム （LBA4404、 EHA101) に導入し、 タバコ及び ィネへの遺伝子導入を行った。
(b) 導入遺伝子の確認
こうして得られた AK— PATタバコ及びイネの導入遺伝子の存在は、 C TAB法に従い、 プロモータ一遺伝子と 3 5 Sターミネ一ター遺伝子の間を 配列番号 3及び配列番号 5に記載のプライマ—を用いて P C R反応によって 増幅させ、 ァガロース電気泳動を行うことによって確認した。 その結果、 目 的とするサイズにバンドが検出された為、 導入遺伝子の存在が確認された。
( C ) 除草剤耐性試験
作出した AK— PATタバコ及びイネにグルホシネートを茎葉散布するこ とにより、 除草剤耐性試験を行った。 非組換え体は完全に枯死したのに対し て、 A K— P A Tタバコ及びイネは除草剤耐性を発現して生育した。
(d) 組換え次世代での除草剤耐性試験
組換え当代で除草剤耐性を発現した A K— P A Tタバコ及びィネから、 種 子を採種した。 この種子をグルホシネート溶液中に播種したところ、 通常通 りに発芽した。 また、 得られた組換え次世代の AK— PATタバコにグルホ シネートを茎葉散布したところ、 除草剤耐性を発現した。
産業上の利用可能性
本発明のプロモ一ターは、 有用な遺伝子と連結した植物又は植物細胞に導 入することにより、 その有用な遺伝子を発現させることができる。 また、 本 発明のプロモータ一遺伝子は、 スクロースで誘導される A K遺伝子のプロモ 一夕一であることから、 導入した有用遺伝子の発現をスクロースによって誘 導するプロモーターとして利用することも可能である。 さらに、 A Kは、 維 管束に局在することから、 導入した遺伝子の発現組織 ·部位を限定すること も可能である。

Claims

請求の範囲
1 . 配列表の配列番号 1で表される塩基配列の全部又は一部からなり、 植 物体内又は植物細胞内において、 植物で発現可能な構造遺伝子の発現を制御 する機能を有するかぎり 1又は 2以上の塩基の欠失、 挿入又は置換を含んで もよい D N A断片。
2 . 請求の範囲第 1項記載の D N A断片を含むベクター。
3 . 請求の範囲第 2項記載のべクターで形質転換された宿主細菌。
4 . 請求の範囲第 2項記載のべクターで形質転換された植物細胞。
5 . 請求の範囲第 4項記載の植物細胞から得られた再生植物体。
6 . 請求の範囲第 5項記載の植物体から得られた種子。
7 . 請求の範囲第 3項記載の細菌で形質転換された植物細胞。
8 . 請求の範囲第 7項記載の植物細胞から得られた再生植物体。
9 . 請求の範囲第 8項記載の植物体から得られた種子。
1 0 . 配列表の配列番号 2で表される塩基配列の全部又は一部からなり、 植物体内又は植物細胞内において、 植物で発現可能な構造遺伝子の発現を制 御する機能を有するかぎり 1又は 2以上の塩基の欠失、 挿入又は置換を含ん でもよい請求の範囲第 1項記載の D N A断片。
1 1 . 請求の範囲第 1 0項記載の D N A断片を含むベクタ一。
1 2 . 請求の範囲第 1 1項記載のベクタ一で形質転換された宿主細菌。
1 3 . 請求の範囲第 1 1項記載のベクタ一で形質転換された植物細胞。
1 4 . 請求の範囲第 1 3項記載の植物細胞から得られた再生植物体。
1 5 . 請求の範囲第 1 4項記載の植物体から得られた種子。
1 6 . 請求の範囲第 1 2項記載の細菌で形質転換された植物細胞。
1 7 . 請求の範囲第 1 6項記載の植物細胞から得られた再生植物体。
1 8 . 請求の範囲第 1 7項記載の植物体から得られた種子。
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