JPH0984587A - イネCatB遺伝子プロモーター - Google Patents
イネCatB遺伝子プロモーターInfo
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- JPH0984587A JPH0984587A JP7248149A JP24814995A JPH0984587A JP H0984587 A JPH0984587 A JP H0984587A JP 7248149 A JP7248149 A JP 7248149A JP 24814995 A JP24814995 A JP 24814995A JP H0984587 A JPH0984587 A JP H0984587A
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】活性の高い植物プロモーターを提供することお
よびイネ等の作物の品種を改良すること。 【解決手段】イネCatB遺伝子プロモーターを用い
る。特に第1イントロンを含むプロモーターは活性が高
い。
よびイネ等の作物の品種を改良すること。 【解決手段】イネCatB遺伝子プロモーターを用い
る。特に第1イントロンを含むプロモーターは活性が高
い。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本願発明は、植物遺伝子のプ
ロモーターを用いる、有用物質の生産あるいは有用植物
の育種に関する。さらに詳しくは、イネのカタラーゼ遺
伝子B(以下、CatBという)のプロモーター遺伝子
を用いる、有用物質の生産あるいは有用植物の育種に関
する。
ロモーターを用いる、有用物質の生産あるいは有用植物
の育種に関する。さらに詳しくは、イネのカタラーゼ遺
伝子B(以下、CatBという)のプロモーター遺伝子
を用いる、有用物質の生産あるいは有用植物の育種に関
する。
【0002】
【従来の技術】従来、植物遺伝子の発現に関して使用さ
れるプロモーターは、種々知られている。例えば、アグ
ロバクテリウム属のT−DNAプロモーター、ノパリン
シンセターゼ(NOS)プロモーター、オクトピンプロ
モーター等が知られている。また、カリフラワーモザイ
クウイルス(CaMV)プロモーターも植物遺伝子プロ
モーターとして汎用されている。しかし、その活性は、
実用的に用いられるには低いという問題点がある。
れるプロモーターは、種々知られている。例えば、アグ
ロバクテリウム属のT−DNAプロモーター、ノパリン
シンセターゼ(NOS)プロモーター、オクトピンプロ
モーター等が知られている。また、カリフラワーモザイ
クウイルス(CaMV)プロモーターも植物遺伝子プロ
モーターとして汎用されている。しかし、その活性は、
実用的に用いられるには低いという問題点がある。
【0003】ところで、細胞中の活性酸素種(スーパー
オキシド、過酸化水素、ハイドロキシルラジカル、一重
項酸素など)の濃度が上昇した状態を、酸化ストレス
(oxidative stress)と呼ぶ。これは、過酸化状態、紫
外線や放射線、チトクロームの電子伝達系の異常、ペル
オキシゾーム異常増加、高温・低温・化学物質等の非生
物的作因、オゾンや二酸化硫黄のような大気汚染物質等
が引き起こす「酸化状態」と、細胞内の「抗酸化剤防御
機構(スーパーオキサイドディスミュターゼ(SO
D)、カタラーゼ(CAT)、ペルオキシダーゼ、ビタ
ミンE、C及びA、等)」のバランスが崩れたときに起
きる。
オキシド、過酸化水素、ハイドロキシルラジカル、一重
項酸素など)の濃度が上昇した状態を、酸化ストレス
(oxidative stress)と呼ぶ。これは、過酸化状態、紫
外線や放射線、チトクロームの電子伝達系の異常、ペル
オキシゾーム異常増加、高温・低温・化学物質等の非生
物的作因、オゾンや二酸化硫黄のような大気汚染物質等
が引き起こす「酸化状態」と、細胞内の「抗酸化剤防御
機構(スーパーオキサイドディスミュターゼ(SO
D)、カタラーゼ(CAT)、ペルオキシダーゼ、ビタ
ミンE、C及びA、等)」のバランスが崩れたときに起
きる。
【0004】真核生物では、酸化ストレスに曝されると
SODやCAT活性が高まることが以前から知られてい
た。また、あらかじめSODやCATを誘導しておく
と、細胞は酸化ストレスに対して若干の抵抗性を示すこ
とも観察されていた。
SODやCAT活性が高まることが以前から知られてい
た。また、あらかじめSODやCATを誘導しておく
と、細胞は酸化ストレスに対して若干の抵抗性を示すこ
とも観察されていた。
【0005】植物においても、酸化ストレスが生じるこ
とが知られている。例えば、光合成を妨げる様々な条
件(光照射下の低温や除草剤処理など)によって、光合
成反応経路等に起因する活性酸素種が、異常に発生す
る、暗所でも、植物が低温に曝されると過酸化水素等
の活性酸素種の濃度上昇がある、除草剤(パラコート
等)や紫外線もその作用機構に活性酸素種が関わってい
る、および、乾燥ストレスや重金属なども、酸化スト
レスを引き起こすと考えられている。
とが知られている。例えば、光合成を妨げる様々な条
件(光照射下の低温や除草剤処理など)によって、光合
成反応経路等に起因する活性酸素種が、異常に発生す
る、暗所でも、植物が低温に曝されると過酸化水素等
の活性酸素種の濃度上昇がある、除草剤(パラコート
等)や紫外線もその作用機構に活性酸素種が関わってい
る、および、乾燥ストレスや重金属なども、酸化スト
レスを引き起こすと考えられている。
【0006】植物は、酸化ストレスに対抗するために抗
酸化剤防御酵素系が協調してこれらの活性酸素種を消去
する等の、種々の防御反応を行っている。最近になって
の低温耐性にカタラーゼの関与を強く示唆する実験結
果が報告された。
酸化剤防御酵素系が協調してこれらの活性酸素種を消去
する等の、種々の防御反応を行っている。最近になって
の低温耐性にカタラーゼの関与を強く示唆する実験結
果が報告された。
【0007】他方で、病原菌の感染のような生物的刺激
に対して、植物細胞はその表面でOxidative burstと呼
ばれる急速な活性酸素種発生を行うことが知られてい
る。この現象は、従来、病原菌を攻撃するためと解釈さ
れてきた。しかし、最近になって、この現象は、細胞内
部の種々の防御遺伝子の発現を誘導するカスケードをス
タートさせるためのシグナルとしても機能していること
が判ってきた。植物ウイルス感染時にも、過酸化水素が
防御タンパク質誘導に関与していることが最近明らかに
された。これらの新しい知見は、過酸化水素などの活性
酸素種の濃度を制御するカタラーゼが情報伝達の制御に
関わっていることを示唆するものとして注目されてい
る。
に対して、植物細胞はその表面でOxidative burstと呼
ばれる急速な活性酸素種発生を行うことが知られてい
る。この現象は、従来、病原菌を攻撃するためと解釈さ
れてきた。しかし、最近になって、この現象は、細胞内
部の種々の防御遺伝子の発現を誘導するカスケードをス
タートさせるためのシグナルとしても機能していること
が判ってきた。植物ウイルス感染時にも、過酸化水素が
防御タンパク質誘導に関与していることが最近明らかに
された。これらの新しい知見は、過酸化水素などの活性
酸素種の濃度を制御するカタラーゼが情報伝達の制御に
関わっていることを示唆するものとして注目されてい
る。
【0008】そのひとつはトウモロコシ幼苗の低温訓化
(Chilling acclimation)による耐冷性獲得のメカニズ
ムとして、訓化過程での微量過酸化水素蓄積によるカタ
ラーゼ(Cat3)遺伝子発現の誘導が報告されてい
る。また、タバコにおける病原体によるPR蛋白質(Pa
thogenesis-related proteins)の誘導メカニズムとし
て、サリチル酸がカタラーゼを阻害し、細胞中の過酸化
水素濃度が上昇してPR蛋白質を誘導すると報告されて
いる。これらは植物細胞でも活性酸素種自体が活性酸素
消去系遺伝子の誘導に直接関わっている可能性を示唆す
るものであり、また、過酸化水素濃度を調節する消去系
酵素群がシグナル制御の役割を持つ可能性がある。
(Chilling acclimation)による耐冷性獲得のメカニズ
ムとして、訓化過程での微量過酸化水素蓄積によるカタ
ラーゼ(Cat3)遺伝子発現の誘導が報告されてい
る。また、タバコにおける病原体によるPR蛋白質(Pa
thogenesis-related proteins)の誘導メカニズムとし
て、サリチル酸がカタラーゼを阻害し、細胞中の過酸化
水素濃度が上昇してPR蛋白質を誘導すると報告されて
いる。これらは植物細胞でも活性酸素種自体が活性酸素
消去系遺伝子の誘導に直接関わっている可能性を示唆す
るものであり、また、過酸化水素濃度を調節する消去系
酵素群がシグナル制御の役割を持つ可能性がある。
【0009】他方、イネでは、イネ種子の低温発芽性と
種子中のカタラーゼ活性の高さの相関関係が示唆されて
いる(谷田ら、農芸化学会1990年年会)。また、低酸素
条件下である水中で発芽させたイネ芽生えを空気中に出
すことによって酸素分圧を急激に上昇させたときに、カ
タラーゼ遺伝子が特異的に発現することが、最近になっ
て明らかにされた(森田ら、植物生理学会1994年度講演
要旨集、115頁)。
種子中のカタラーゼ活性の高さの相関関係が示唆されて
いる(谷田ら、農芸化学会1990年年会)。また、低酸素
条件下である水中で発芽させたイネ芽生えを空気中に出
すことによって酸素分圧を急激に上昇させたときに、カ
タラーゼ遺伝子が特異的に発現することが、最近になっ
て明らかにされた(森田ら、植物生理学会1994年度講演
要旨集、115頁)。
【0010】従って、イネのカタラーゼ遺伝子のプロモ
ーターは、種々のシグナルに対して、反応し得る可能性
が高く、活性が高いプロモーターが見いだせれば、非常
に有用であると考えられる。例えば、 カタラーゼ構造遺伝子と組み合わせて、耐冷性の低い
植物(インディカ種のイネあるいは野菜など)に導入し
て耐冷性を付与すること、 カタラーゼ構造遺伝子と組み合わせて、日本で最も多
く栽培されているジャポニカ種イネに導入して、耐冷性
を強化すること、 カタラーゼ構造遺伝子と組み合わせて、種子中にカタ
ラーゼを高濃度に蓄積させ、低温発芽性あるいは水中発
芽性を上昇させて、直播きに適したイネを作出するこ
と、 カタラーゼ構造遺伝子と組み合わせてC3植物に、ペ
ルオキシゾム局在型カタラーゼをコードする遺伝子を導
入し、ペルオキシゾームにより多く蓄積させることによ
り、光呼吸を抑制し、光合成能を高めることが出来る可
能性があること、 植物病原菌感染時に発現することが知られている遺伝
子(PRタンパク質、キチナーゼ等)のプロモーターと
組み合わせ、その下流にイネカタラーゼ遺伝子のエクソ
ン部分を含むDNA断片をアンチセンス方向に挿入して
植物に導入し、内在性カタラーゼ遺伝子の発現を抑制す
ることによって、シグナルとして動く過酸化水素濃度を
上昇させて防御関連遺伝子の発現を強化することが出来
る可能性があること、および、 目的遺伝子を形質転換体の中で高い効率で安定的に発
現し得る汎用べクターの開発が期待されること、等の有
用性が考えられる。
ーターは、種々のシグナルに対して、反応し得る可能性
が高く、活性が高いプロモーターが見いだせれば、非常
に有用であると考えられる。例えば、 カタラーゼ構造遺伝子と組み合わせて、耐冷性の低い
植物(インディカ種のイネあるいは野菜など)に導入し
て耐冷性を付与すること、 カタラーゼ構造遺伝子と組み合わせて、日本で最も多
く栽培されているジャポニカ種イネに導入して、耐冷性
を強化すること、 カタラーゼ構造遺伝子と組み合わせて、種子中にカタ
ラーゼを高濃度に蓄積させ、低温発芽性あるいは水中発
芽性を上昇させて、直播きに適したイネを作出するこ
と、 カタラーゼ構造遺伝子と組み合わせてC3植物に、ペ
ルオキシゾム局在型カタラーゼをコードする遺伝子を導
入し、ペルオキシゾームにより多く蓄積させることによ
り、光呼吸を抑制し、光合成能を高めることが出来る可
能性があること、 植物病原菌感染時に発現することが知られている遺伝
子(PRタンパク質、キチナーゼ等)のプロモーターと
組み合わせ、その下流にイネカタラーゼ遺伝子のエクソ
ン部分を含むDNA断片をアンチセンス方向に挿入して
植物に導入し、内在性カタラーゼ遺伝子の発現を抑制す
ることによって、シグナルとして動く過酸化水素濃度を
上昇させて防御関連遺伝子の発現を強化することが出来
る可能性があること、および、 目的遺伝子を形質転換体の中で高い効率で安定的に発
現し得る汎用べクターの開発が期待されること、等の有
用性が考えられる。
【0011】従って、イネの遺伝子から、活性が高く、
実用的にも使用され得るプロモーターが取得できれば、
イネ等の作物の品種改良のみならず、他の植物細胞にお
ける物質生産用の汎用ベクターが開発でき、植物細胞を
用いる物質生産に大いに貢献できると考えられる。
実用的にも使用され得るプロモーターが取得できれば、
イネ等の作物の品種改良のみならず、他の植物細胞にお
ける物質生産用の汎用ベクターが開発でき、植物細胞を
用いる物質生産に大いに貢献できると考えられる。
【0012】イネのカタラーゼの構造遺伝子としてはカ
タラーゼA(CatA)、CatB、およびカタラーゼ
C(CatC)遺伝子が知られており、それぞれ相同性
が高い配列を有している。CatBのcDNAはその配
列が知られている(Plant Physiol.(1994) 105:1015-10
16)。
タラーゼA(CatA)、CatB、およびカタラーゼ
C(CatC)遺伝子が知られており、それぞれ相同性
が高い配列を有している。CatBのcDNAはその配
列が知られている(Plant Physiol.(1994) 105:1015-10
16)。
【0013】しかし、これらの遺伝子のプロモーターの
解析は全くなされておらず、プロモーターの位置も特定
されていないのが現状である。
解析は全くなされておらず、プロモーターの位置も特定
されていないのが現状である。
【0014】
【発明が解決しようとする課題】本願発明は、上記問題
点を解決すること、およびイネ等の作物における育種を
目的としており、従来、汎用されているCaMVプロモ
ーターよりも、非常に高い活性を有する植物遺伝子プロ
モーターを提供することにある。
点を解決すること、およびイネ等の作物における育種を
目的としており、従来、汎用されているCaMVプロモ
ーターよりも、非常に高い活性を有する植物遺伝子プロ
モーターを提供することにある。
【0015】
【課題を解決するための手段】本願発明は、イネのカタ
ラーゼB(CatB)遺伝子のプロモーター活性が非常
に高いことを見いだして完成されたものである。
ラーゼB(CatB)遺伝子のプロモーター活性が非常
に高いことを見いだして完成されたものである。
【0016】本願発明は、配列番号1で示される配列、
またはその一部を有する配列であって配列番号1の配列
と同等のプロモーター活性を有する、イネCatB遺伝
子プロモーターに関する。
またはその一部を有する配列であって配列番号1の配列
と同等のプロモーター活性を有する、イネCatB遺伝
子プロモーターに関する。
【0017】本願発明は、配列番号2で示される配列、
またはその一部を有する配列であって配列番号2の配列
と同等のプロモーター活性を有する、イネCatB遺伝
子プロモーターに関する。この配列は、イネCatB構
造遺伝子の第1イントロンを含む配列である。
またはその一部を有する配列であって配列番号2の配列
と同等のプロモーター活性を有する、イネCatB遺伝
子プロモーターに関する。この配列は、イネCatB構
造遺伝子の第1イントロンを含む配列である。
【0018】本願発明は、上記イネCatB遺伝子プロ
モーターを有する、植物発現用カセットに関する。好適
な実施態様においては、配列番号2の配列を含むカセッ
トである。さらに好適な実施態様においては、本願発明
の植物発現用カセットは、ノパリンシンセターゼ遺伝子
のターミネーター配列を含む。
モーターを有する、植物発現用カセットに関する。好適
な実施態様においては、配列番号2の配列を含むカセッ
トである。さらに好適な実施態様においては、本願発明
の植物発現用カセットは、ノパリンシンセターゼ遺伝子
のターミネーター配列を含む。
【0019】さらに、本願発明は、上記イネCatB遺
伝子プロモーターと発現可能に接続された外来遺伝子と
を含む、組換えプラスミドに関する。
伝子プロモーターと発現可能に接続された外来遺伝子と
を含む、組換えプラスミドに関する。
【0020】また、本願発明は上記組換えプラスミドで
形質転換された、植物細胞および植物に関する。
形質転換された、植物細胞および植物に関する。
【0021】また、本願発明は、組換え蛋白質の製造方
法に関し、以下の工程:イネCatB遺伝子プロモータ
ーを有する組換えプラスミドを作製する工程;該組換え
プラスミドで植物細胞を形質転換する工程;および該形
質転換された植物細胞を培養する工程;を包含する。
法に関し、以下の工程:イネCatB遺伝子プロモータ
ーを有する組換えプラスミドを作製する工程;該組換え
プラスミドで植物細胞を形質転換する工程;および該形
質転換された植物細胞を培養する工程;を包含する。
【0022】さらに、本願発明は、組換え植物の製造方
法に関し、以下の工程:イネCatB遺伝子プロモータ
ーを有する組換えプラスミドを作製する工程;該組換え
プラスミドで植物細胞を形質転換する工程;および該形
質転換された植物細胞を培養する工程;を包含する。
法に関し、以下の工程:イネCatB遺伝子プロモータ
ーを有する組換えプラスミドを作製する工程;該組換え
プラスミドで植物細胞を形質転換する工程;および該形
質転換された植物細胞を培養する工程;を包含する。
【0023】
【発明の実施の形態】本願発明のイネCatB遺伝子プ
ロモーターは、配列番号1で示される配列を有してい
る。
ロモーターは、配列番号1で示される配列を有してい
る。
【0024】イネCatB遺伝子プロモーターは、イネ
のゲノミックライブラリーからスクリーニングされ得
る。米国クローンテック社(CLONTECH Laboratories In
c., Palo Alto, CA)が市販しているイネのゲノミック
DNAライブラリー(RICE Genomic Library)が用いら
れ得る。
のゲノミックライブラリーからスクリーニングされ得
る。米国クローンテック社(CLONTECH Laboratories In
c., Palo Alto, CA)が市販しているイネのゲノミック
DNAライブラリー(RICE Genomic Library)が用いら
れ得る。
【0025】プローブとしては、本願発明者らが単離し
たイネCatA cDNAが用いられ得る。イネCat
A構造遺伝子とイネCatB構造遺伝子とは、構造が類
似する部分があるので、その共通部分が用いられ得る。
なお、ゲノミックCatA遺伝子の塩基配列は、日本農
芸化学会1992年大会講演要旨集:日本農芸化学会誌66
(3)、488(1992))で発表されている。
たイネCatA cDNAが用いられ得る。イネCat
A構造遺伝子とイネCatB構造遺伝子とは、構造が類
似する部分があるので、その共通部分が用いられ得る。
なお、ゲノミックCatA遺伝子の塩基配列は、日本農
芸化学会1992年大会講演要旨集:日本農芸化学会誌66
(3)、488(1992))で発表されている。
【0026】まず、イネゲノミック遺伝子ライブラリー
を、ファージλを用いて作製し、プラークを形成させ
る。このプラークを常法に従って、ニトロセルロース等
のメンブレンに移し、標識したプローブでハイブリダイ
ズさせる。ハイブリダイズ終了後、洗浄し、オートラジ
オグラフィーにかけ、ハイブリダイズすることが確認さ
れたファージからDNAを調製する。
を、ファージλを用いて作製し、プラークを形成させ
る。このプラークを常法に従って、ニトロセルロース等
のメンブレンに移し、標識したプローブでハイブリダイ
ズさせる。ハイブリダイズ終了後、洗浄し、オートラジ
オグラフィーにかけ、ハイブリダイズすることが確認さ
れたファージからDNAを調製する。
【0027】調製したファージDNAを、適当な制限酵
素を組み合わせて消化し、その消化物をアガロースゲル
電気泳動で分離する。分離したDNA断片をナイロンメ
ンブレンに移して、上記のプローブをハイブリダイズさ
せ、シグナルの強さとバンドのパターンの相違に基づい
て、スクリーニングする。
素を組み合わせて消化し、その消化物をアガロースゲル
電気泳動で分離する。分離したDNA断片をナイロンメ
ンブレンに移して、上記のプローブをハイブリダイズさ
せ、シグナルの強さとバンドのパターンの相違に基づい
て、スクリーニングする。
【0028】シグナルの強さとバンドのパターンがCa
tA遺伝子のそれとほぼ一致するクローンはCatA遺
伝子に対応すると考えられる。従って、バンドのパター
ンが一部しか一致しないクローンは、CatA遺伝子の
欠損クローン、あるいはCatA以外の別のカタラーゼ
遺伝子のクローンである可能性があるので、さらに、C
atA cDNAをプローブとして用いて、下記のよう
な緩い条件と厳しい条件でのハイブリダイゼーションを
行って、パターンを比較する。このパターンの比較で、
CatA以外の別のカタラーゼ遺伝子であることが推定
される。PCR等の方法あるいは塩基配列を決定して、
異なるカタラーゼ遺伝子であることを確認し得る。
tA遺伝子のそれとほぼ一致するクローンはCatA遺
伝子に対応すると考えられる。従って、バンドのパター
ンが一部しか一致しないクローンは、CatA遺伝子の
欠損クローン、あるいはCatA以外の別のカタラーゼ
遺伝子のクローンである可能性があるので、さらに、C
atA cDNAをプローブとして用いて、下記のよう
な緩い条件と厳しい条件でのハイブリダイゼーションを
行って、パターンを比較する。このパターンの比較で、
CatA以外の別のカタラーゼ遺伝子であることが推定
される。PCR等の方法あるいは塩基配列を決定して、
異なるカタラーゼ遺伝子であることを確認し得る。
【0029】このようにして、CatA以外のゲノミッ
クのカタラーゼ遺伝子が、単離され得る。本願において
は、2つの異なるゲノミックのカタラーゼ遺伝子、Ca
tBおよびCatCが単離された。
クのカタラーゼ遺伝子が、単離され得る。本願において
は、2つの異なるゲノミックのカタラーゼ遺伝子、Ca
tBおよびCatCが単離された。
【0030】これらの配列の情報に基づいて、プロモー
ター領域が特定され得る。プロモーター配列は、イント
ロンを有する場合は、プロモーター自体だけでなく、第
1イントロン等の領域をも含み得る。
ター領域が特定され得る。プロモーター配列は、イント
ロンを有する場合は、プロモーター自体だけでなく、第
1イントロン等の領域をも含み得る。
【0031】CatB遺伝子のプロモーター配列が特定
されると、その配列を切り出して、植物用発現ベクター
につなぎ込み得る。つなぎ込まれたプロモーターの活性
は、そのプロモーターの下流に適当な酵素をコードする
遺伝子を連結し、その遺伝子の発現を、例えば、酵素活
性を測定して、測定する。植物を宿主とする場合には、
例えば、pBI221等のようなプラスミドを用いて、
β-グルクウロナーゼ(GUS)の発現を指標として測
定するのが一般的であり、本願明細書においても、GU
Sの発現で測定する方法が適用され得る。
されると、その配列を切り出して、植物用発現ベクター
につなぎ込み得る。つなぎ込まれたプロモーターの活性
は、そのプロモーターの下流に適当な酵素をコードする
遺伝子を連結し、その遺伝子の発現を、例えば、酵素活
性を測定して、測定する。植物を宿主とする場合には、
例えば、pBI221等のようなプラスミドを用いて、
β-グルクウロナーゼ(GUS)の発現を指標として測
定するのが一般的であり、本願明細書においても、GU
Sの発現で測定する方法が適用され得る。
【0032】GUS活性は、Jeffersonらの方法(EMBO
J 6:3901-3907(1987))に基本的に従って測定され得
る。すなわち、タンパク質量にして50μg相当のプロ
トプラスト抽出液と25μlの20mM 4−methyl um
belliferyl glucuronide(4MUG)、それに抽出バッ
ファー、さらに植物組織内在性のGUS様活性を抑制す
るために100μlメタノール(Kosugi et al., Plant
Sci 70:133−140(1990))を加えて全量
を500μlとし、37℃でインキュベートする。0時
間と2時間後に反応液から200μlを採取し、0.2M
Na2CO3を0.8ml加えて反応を停止させる。蛍光
分光光度計により、365nmの励起光で455nmの
蛍光を測定する。2時間試料の値から0時間試料の値を
引き、酵素活性を4-MU pmoles/min/mg proteinで表示す
る。
J 6:3901-3907(1987))に基本的に従って測定され得
る。すなわち、タンパク質量にして50μg相当のプロ
トプラスト抽出液と25μlの20mM 4−methyl um
belliferyl glucuronide(4MUG)、それに抽出バッ
ファー、さらに植物組織内在性のGUS様活性を抑制す
るために100μlメタノール(Kosugi et al., Plant
Sci 70:133−140(1990))を加えて全量
を500μlとし、37℃でインキュベートする。0時
間と2時間後に反応液から200μlを採取し、0.2M
Na2CO3を0.8ml加えて反応を停止させる。蛍光
分光光度計により、365nmの励起光で455nmの
蛍光を測定する。2時間試料の値から0時間試料の値を
引き、酵素活性を4-MU pmoles/min/mg proteinで表示す
る。
【0033】いったんCatB遺伝子のプロモーター領
域が特定されると、さらにその配列を改変して、プロモ
ーター活性が高めることも本発明の範囲内である。例え
ば、CatB遺伝子のプロモーター領域に不要な配列を
除去して、あるいは一部改変して得られる、改変前と同
等あるいはそれ以上の活性を有する配列も本願発明の範
囲内にある。
域が特定されると、さらにその配列を改変して、プロモ
ーター活性が高めることも本発明の範囲内である。例え
ば、CatB遺伝子のプロモーター領域に不要な配列を
除去して、あるいは一部改変して得られる、改変前と同
等あるいはそれ以上の活性を有する配列も本願発明の範
囲内にある。
【0034】活性が確認されたCatB遺伝子のプロモ
ーターは、適当な植物発現ベクターに組み込まれ得る。
この植物発現用ベクターに組み込まれたプロモーター配
列の3’末端側に、適当なリンカー配列、例えばマルチ
クローニングサイトを有するリンカーを導入して、植物
宿主に適した発現カセットが作製され得る。この発現カ
セットには、発現効率を向上させるため等の目的で、タ
ーミネーター配列が含まれ得る。このターミネーター配
列は、上記マルチクローニングサイトを有するリンカー
配列を介して、プロモーター配列と結合され得る。
ーターは、適当な植物発現ベクターに組み込まれ得る。
この植物発現用ベクターに組み込まれたプロモーター配
列の3’末端側に、適当なリンカー配列、例えばマルチ
クローニングサイトを有するリンカーを導入して、植物
宿主に適した発現カセットが作製され得る。この発現カ
セットには、発現効率を向上させるため等の目的で、タ
ーミネーター配列が含まれ得る。このターミネーター配
列は、上記マルチクローニングサイトを有するリンカー
配列を介して、プロモーター配列と結合され得る。
【0035】上記植物用発現カセットのマルチクローニ
ングサイトに、あるいは、プロモーターの下流に、外来
遺伝子が発現可能に接続される。このようにして生じた
組換えプラスミドは、常法に従って、植物細胞をプロト
プラスト化して、形質転換され得る。植物細胞のプロト
プラストの作製は、Mol Gen. Genet 206: 408-413(198
7)に記載の方法に従って行い得る。例えば、継代後5日
目のカルス細胞サスペンジョンを直径10cmプラスチ
ックシャーレに移し、アスピレーターで培地を除いて酵
素液(例えば、4% セルラーゼRS(ヤクルト)、1%
マセロザイムR10(ヤクルト)、0.4M マンニトール、
0.5% CaCl2.2H2O、及び0.5% Potassium Dextran Sulf
ate)20mlを加え、パラフィルムをして28℃の暗
所に静置する。約5時間後にナイロンメッシュで濾過し
て未消化物を取り除き、洗浄操作を繰り返してから、エ
レクトロポレーション等に用いる。
ングサイトに、あるいは、プロモーターの下流に、外来
遺伝子が発現可能に接続される。このようにして生じた
組換えプラスミドは、常法に従って、植物細胞をプロト
プラスト化して、形質転換され得る。植物細胞のプロト
プラストの作製は、Mol Gen. Genet 206: 408-413(198
7)に記載の方法に従って行い得る。例えば、継代後5日
目のカルス細胞サスペンジョンを直径10cmプラスチ
ックシャーレに移し、アスピレーターで培地を除いて酵
素液(例えば、4% セルラーゼRS(ヤクルト)、1%
マセロザイムR10(ヤクルト)、0.4M マンニトール、
0.5% CaCl2.2H2O、及び0.5% Potassium Dextran Sulf
ate)20mlを加え、パラフィルムをして28℃の暗
所に静置する。約5時間後にナイロンメッシュで濾過し
て未消化物を取り除き、洗浄操作を繰り返してから、エ
レクトロポレーション等に用いる。
【0036】形質転換された植物細胞は、そのまま、外
来遺伝子がコードする有用物質の生産に使用され得る。
有用物質の回収は、細胞外から、あるいは細胞内から、
常法に従って行われ得る。さらに、形質転換された植物
細胞を分化させて、形質転換された植物組織、あるいは
植物体とし得る。
来遺伝子がコードする有用物質の生産に使用され得る。
有用物質の回収は、細胞外から、あるいは細胞内から、
常法に従って行われ得る。さらに、形質転換された植物
細胞を分化させて、形質転換された植物組織、あるいは
植物体とし得る。
【0037】さらに、イネCatB遺伝子は、細菌と植
物の両宿主で発現可能なバイナリーベクターに組み込む
ことが可能である。このようなバイナリーベクターは当
業者に周知である。例えば、アグロバクテリウムの発現
系を用いると、微生物による感染のシステムが利用され
得る。そして、例えば、タバコ等の植物に導入され得
る。従って、植物体の形質転換にも、使用され得る。
物の両宿主で発現可能なバイナリーベクターに組み込む
ことが可能である。このようなバイナリーベクターは当
業者に周知である。例えば、アグロバクテリウムの発現
系を用いると、微生物による感染のシステムが利用され
得る。そして、例えば、タバコ等の植物に導入され得
る。従って、植物体の形質転換にも、使用され得る。
【0038】イネCatB遺伝子は、酸化ストレス等の
種々のシグナルに対して、反応し得る可能性が高い。従
って、そのシグナルに応じて種々の段階で発現させるこ
とが可能である。即ち、発現の調節が自由に行われ得る
と考えられる。
種々のシグナルに対して、反応し得る可能性が高い。従
って、そのシグナルに応じて種々の段階で発現させるこ
とが可能である。即ち、発現の調節が自由に行われ得る
と考えられる。
【0039】従って、イネの遺伝子から、活性が高く、
実用的にも使用され得るプロモーターが取得できれば、
イネの品種改良のみならず、他の植物細胞における物質
生産用の汎用ベクターが開発でき、植物細胞を用いる物
質生産に大いに貢献できると考えられる。また、種々の
植物体への遺伝子導入にも使用され得る。
実用的にも使用され得るプロモーターが取得できれば、
イネの品種改良のみならず、他の植物細胞における物質
生産用の汎用ベクターが開発でき、植物細胞を用いる物
質生産に大いに貢献できると考えられる。また、種々の
植物体への遺伝子導入にも使用され得る。
【0040】以下に、実施例に基づいて本願発明を説明
するが、本願発明の範囲は、実施例のみに限定されるも
のではない。
するが、本願発明の範囲は、実施例のみに限定されるも
のではない。
【0041】
(イネCatBゲノミック遺伝子の単離:ゲノミックラ
イブラリーからのスクリーニング)CatAcDNAの
一部を、CatB遺伝子のクローニングに用いた。Ca
tA cDNAのクローニングの過程で得られた不完全
長cDNA(全長約1.8kbpのうち、5’非翻訳領域及び
若干のコード領域の合計約450bpを欠損する3’末端側
の1.35kbp)を含むラムダファージ(クローン#51)
のインサート部分をPCRで増幅した。同ファージより
DNAを調製してこれをテンプレートとし、プライマー
としてλgt11-Forward Primer及びλgt11 Reverse Prim
er(東洋紡)を用いた。生成物をセントリコン−100
(amicon)で精製し、濃度を25ng/10μlにして、マルチ
プライムラベル法(Amersham)のプローブとした。
イブラリーからのスクリーニング)CatAcDNAの
一部を、CatB遺伝子のクローニングに用いた。Ca
tA cDNAのクローニングの過程で得られた不完全
長cDNA(全長約1.8kbpのうち、5’非翻訳領域及び
若干のコード領域の合計約450bpを欠損する3’末端側
の1.35kbp)を含むラムダファージ(クローン#51)
のインサート部分をPCRで増幅した。同ファージより
DNAを調製してこれをテンプレートとし、プライマー
としてλgt11-Forward Primer及びλgt11 Reverse Prim
er(東洋紡)を用いた。生成物をセントリコン−100
(amicon)で精製し、濃度を25ng/10μlにして、マルチ
プライムラベル法(Amersham)のプローブとした。
【0042】米国クローンテック社(CLONTECH Laborat
ories Inc., Palo Alto, CA)から購入したイネのゲノ
ミックDNAライブラリー(RICE Genomic Library)を
用いて、CatB遺伝子をスクリーニングした。ゲノミ
ックライブラリーを構成するファージλEMBL−3を
常法に従って、E.coli NM538株に感染さ
せ、ファージプラークを形成させた。このファージプラ
ークをナイロンメンブレンに移し、下記の標準的条件で
上記プローブとハイブリダイズさせた。なお、プローブ
は、32Pで標識した。
ories Inc., Palo Alto, CA)から購入したイネのゲノ
ミックDNAライブラリー(RICE Genomic Library)を
用いて、CatB遺伝子をスクリーニングした。ゲノミ
ックライブラリーを構成するファージλEMBL−3を
常法に従って、E.coli NM538株に感染さ
せ、ファージプラークを形成させた。このファージプラ
ークをナイロンメンブレンに移し、下記の標準的条件で
上記プローブとハイブリダイズさせた。なお、プローブ
は、32Pで標識した。
【0043】ハイブリダイズ溶液:6x SSC-0.1% SDS, 5
x Denhardt's, 100μg/ml salmon sperm DNA;ハイブリ
ダイズ温度:65℃;ハイブリダイズ時間:overnight。
x Denhardt's, 100μg/ml salmon sperm DNA;ハイブリ
ダイズ温度:65℃;ハイブリダイズ時間:overnight。
【0044】次に、メンブレンを、以下の比較的緩い条
件で洗浄した。洗浄条件:2x SSC-0.1% SDS 室温5分
プラス30分;1x SSC-0.1% SDS 68℃、1時間。
件で洗浄した。洗浄条件:2x SSC-0.1% SDS 室温5分
プラス30分;1x SSC-0.1% SDS 68℃、1時間。
【0045】洗浄後、常法に従って、ナイロンメンブレ
ンをオートラジオグラフィーにかけ、プローブとハイブ
リダイズしたクローンを検出した。ハイブリダイズする
ことが確認されたファージからそれぞれDNAを調製し
た。
ンをオートラジオグラフィーにかけ、プローブとハイブ
リダイズしたクローンを検出した。ハイブリダイズする
ことが確認されたファージからそれぞれDNAを調製し
た。
【0046】上記ファージのDNAをSal IとSca
Iの制限酵素を組み合わせて消化し、その消化物をア
ガロースゲル電気泳動で分離した。分離したDNA断片
をナイロンメンブレンに移して、上述のCatA cD
NA断片をプローブとしてハイブリダイズさせた。ハイ
ブリダイズの条件は上記と同じであり、メンブレン洗浄
は以下の条件で行った。洗浄条件:2x SSC 室温 5−
10分 2回;2x SSC-0.1% SDS 65℃、30分。
Iの制限酵素を組み合わせて消化し、その消化物をア
ガロースゲル電気泳動で分離した。分離したDNA断片
をナイロンメンブレンに移して、上述のCatA cD
NA断片をプローブとしてハイブリダイズさせた。ハイ
ブリダイズの条件は上記と同じであり、メンブレン洗浄
は以下の条件で行った。洗浄条件:2x SSC 室温 5−
10分 2回;2x SSC-0.1% SDS 65℃、30分。
【0047】洗浄後、常法に従って、ナイロンメンブレ
ンをオートラジオグラフィーにかけ、プローブとハイブ
リダイズしたDNA断片を検出した。
ンをオートラジオグラフィーにかけ、プローブとハイブ
リダイズしたDNA断片を検出した。
【0048】シグナルの強さとバンドのパターンがほぼ
同一の、従って同じ構造を持つと推定される一群のクロ
ーンと、バンドのパターンが一部しか一致しないクロー
ンとがある。
同一の、従って同じ構造を持つと推定される一群のクロ
ーンと、バンドのパターンが一部しか一致しないクロー
ンとがある。
【0049】前者のシグナルの強さとバンドのパターン
がほぼ一致するクローンはCatA遺伝子に対応すると
考えられた。実際、No.74のクローンは、CatA
cDNAに対応する遺伝子であった。
がほぼ一致するクローンはCatA遺伝子に対応すると
考えられた。実際、No.74のクローンは、CatA
cDNAに対応する遺伝子であった。
【0050】他方、後者のバンドのパターンが一部しか
一致しないクローンは、CatA遺伝子の欠損クロー
ン、あるいはCatA以外の別のカタラーゼ遺伝子のク
ローンである可能性がある。そこで、CatA cDN
Aをプローブとして用いて、下記のような緩い条件と厳
しい条件でのハイブリダイゼーションを行って、パター
ンを比較した。
一致しないクローンは、CatA遺伝子の欠損クロー
ン、あるいはCatA以外の別のカタラーゼ遺伝子のク
ローンである可能性がある。そこで、CatA cDN
Aをプローブとして用いて、下記のような緩い条件と厳
しい条件でのハイブリダイゼーションを行って、パター
ンを比較した。
【0051】緩いハイブリダイズ条件:50% フォルムア
ミドを添加した、6x SSC-0.1% SDS,5x Denhardt's, 100
μg/ml salmon sperm DNA;ハイブリダイズ温度:37
℃;ハイブリダイズ時間:overnight。
ミドを添加した、6x SSC-0.1% SDS,5x Denhardt's, 100
μg/ml salmon sperm DNA;ハイブリダイズ温度:37
℃;ハイブリダイズ時間:overnight。
【0052】メンブレン洗浄条件は上記と同じであり、
2x SSC-0.1% SDS 室温5分プラス30分;1x SSC-0.1%
SDS 68℃、1時間であった。
2x SSC-0.1% SDS 室温5分プラス30分;1x SSC-0.1%
SDS 68℃、1時間であった。
【0053】厳しいハイブリダイズの条件:50% フォル
ムアミドを添加した、6x SSC-0.1%SDS, 5x Denhardt's,
100μg/ml salmon sperm DNA;ハイブリダイズ温度:4
2℃;ハイブリダイズ時間:overnight。
ムアミドを添加した、6x SSC-0.1%SDS, 5x Denhardt's,
100μg/ml salmon sperm DNA;ハイブリダイズ温度:4
2℃;ハイブリダイズ時間:overnight。
【0054】メンブレン洗浄条件は、2x SSC-0.1% SDS
室温5分プラス30分;1x SSC-0.1% SDS 68℃、1時
間であった。
室温5分プラス30分;1x SSC-0.1% SDS 68℃、1時
間であった。
【0055】厳しい条件でのハイブリダイズの結果、標
準的ハイブリダイズのパターンと同じ数のバンドが検出
された。他方、緩い条件のハイブリダイズでは、厳しい
条件のハイブリのパターンよりも多数のバンドを示し
た。これらの結果から、バンドのパターンが一部しか一
致しないクローンは、CatA遺伝子の欠損クローンで
はなく、CatAに似てはいるが、塩基配列が異なる部
分を持つDNA、すなわちCatA以外の別のカタラー
ゼ遺伝子である可能性が高いことが判った。
準的ハイブリダイズのパターンと同じ数のバンドが検出
された。他方、緩い条件のハイブリダイズでは、厳しい
条件のハイブリのパターンよりも多数のバンドを示し
た。これらの結果から、バンドのパターンが一部しか一
致しないクローンは、CatA遺伝子の欠損クローンで
はなく、CatAに似てはいるが、塩基配列が異なる部
分を持つDNA、すなわちCatA以外の別のカタラー
ゼ遺伝子である可能性が高いことが判った。
【0056】約20個の、バンドのパターンが一部しか
一致しないクローンを、カタラーゼアイソザイム遺伝子
候補としてさらに解析した。この内のNo.7クローン
は、詳細なサザン分析、部分塩基配列の解析、CatA
塩基配列に基づくPCR分析などから、CatAとは異
なるカタラーゼ遺伝子であると結論した。また、Cat
BcDNAとも異なる配列であることがわかり、Cat
Cと命名された。CatCの塩基配列は、日本農芸化学
会1994年大会にて発表されている(講演要旨:日本農芸
化学会誌68、404(1994))。
一致しないクローンを、カタラーゼアイソザイム遺伝子
候補としてさらに解析した。この内のNo.7クローン
は、詳細なサザン分析、部分塩基配列の解析、CatA
塩基配列に基づくPCR分析などから、CatAとは異
なるカタラーゼ遺伝子であると結論した。また、Cat
BcDNAとも異なる配列であることがわかり、Cat
Cと命名された。CatCの塩基配列は、日本農芸化学
会1994年大会にて発表されている(講演要旨:日本農芸
化学会誌68、404(1994))。
【0057】CatAともNo.7クローン(Cat
C)とも異なるパターンを示すクローンがあり、その中
からNo.6クローンをさらに詳細に解析した。No.
6クローンのDNAについては、部分的に塩基配列も解
析した。この配列は、CatB遺伝子のcDNA配列
(Plant Physiol.(1994) 105:1015-1016)と一致した。
C)とも異なるパターンを示すクローンがあり、その中
からNo.6クローンをさらに詳細に解析した。No.
6クローンのDNAについては、部分的に塩基配列も解
析した。この配列は、CatB遺伝子のcDNA配列
(Plant Physiol.(1994) 105:1015-1016)と一致した。
【0058】これらの情報を基に、CatB遺伝子の
5’非翻訳領域を得るために二つのDNAオリゴマーを
合成した。
5’非翻訳領域を得るために二つのDNAオリゴマーを
合成した。
【0059】 GGTCGATTCTCATCTCTCCCACAACAAATC:配列番号4(CatB cDNAの102-131に相当) CAATGTCTCAGGGCTTCCACGCTCATGCAC:配列番号5(CatB cDNAの484-455に相当) 他方、イネカルスから、cDNAライブラリーを調製し
た。このcDNAライブラリーのDNAをテンプレート
とし、上記二つの合成DNAをプライマーとして、標準
的条件でPCRを行った。約400bpのDNA断片が
増幅された。この400bp DNA断片をプローブと
して用い、上記CatB遺伝子と思われるクローン群を
再度スクリーニングし、ハイブリダイスする数個のクロ
ーンを得た。
た。このcDNAライブラリーのDNAをテンプレート
とし、上記二つの合成DNAをプライマーとして、標準
的条件でPCRを行った。約400bpのDNA断片が
増幅された。この400bp DNA断片をプローブと
して用い、上記CatB遺伝子と思われるクローン群を
再度スクリーニングし、ハイブリダイスする数個のクロ
ーンを得た。
【0060】この中の、上記No.6クローンは、PC
R増幅した400bpの上流に、約lkbp以上の5’
上流域を持ち、且つ全長が約5kbp以上であることが
わかった。このクローンをクローンU6と命名した。ク
ローンU6の制限酵素地図を作製した。図1にその制限
酵素地図を示す。
R増幅した400bpの上流に、約lkbp以上の5’
上流域を持ち、且つ全長が約5kbp以上であることが
わかった。このクローンをクローンU6と命名した。ク
ローンU6の制限酵素地図を作製した。図1にその制限
酵素地図を示す。
【0061】クローンU6から、5’上流域を約1kb
p含む断片(Sal I−Eco RI消化断片)とその
下流の断片(Eco RI−Eco RI消化断片)を切
り出し、シーケンス解析用のベクター(pUC18)に
挿入し、5’側から及び3’側からの段階的欠損プラス
ミドを多数作成し、塩基配列決定を行った。4985b
pの配列が決定された。配列番号3にその全配列を示
す。
p含む断片(Sal I−Eco RI消化断片)とその
下流の断片(Eco RI−Eco RI消化断片)を切
り出し、シーケンス解析用のベクター(pUC18)に
挿入し、5’側から及び3’側からの段階的欠損プラス
ミドを多数作成し、塩基配列決定を行った。4985b
pの配列が決定された。配列番号3にその全配列を示
す。
【0062】(Cat遺伝子プロモーターを有する組換
えプラスミドの作製)得られたCatB遺伝子は、49
85bpであった。そして、配列番号3の1073番目から
1216番目に第1エクソン、1333番目から1429番目に第2
エクソン、2341番目から2618番目に第3エクソン、2970
番目から3746番目に第4エクソン、3968番目から4057番
目に第5エクソン、4252番目から4319番目に第6エクソ
ン、4410番目から4503番目に第7エクソン、および4616
番目から4881番目に第8エクソンが存在すること、およ
び、それぞれのエクソンの間に、第1から第7イントロ
ンが存在することがわかった。
えプラスミドの作製)得られたCatB遺伝子は、49
85bpであった。そして、配列番号3の1073番目から
1216番目に第1エクソン、1333番目から1429番目に第2
エクソン、2341番目から2618番目に第3エクソン、2970
番目から3746番目に第4エクソン、3968番目から4057番
目に第5エクソン、4252番目から4319番目に第6エクソ
ン、4410番目から4503番目に第7エクソン、および4616
番目から4881番目に第8エクソンが存在すること、およ
び、それぞれのエクソンの間に、第1から第7イントロ
ンが存在することがわかった。
【0063】上記配列から、プロモーター領域は、1073
番目より前の配列と推定された。
番目より前の配列と推定された。
【0064】この配列情報に基づいて、プロモーター領
域を切り出すことができる。
域を切り出すことができる。
【0065】イネCatB遺伝子プロモーターを有する
プラスミド、CatB−GUS−△0の作製を図2に示
す。
プラスミド、CatB−GUS−△0の作製を図2に示
す。
【0066】クローンU6をSalIおよびEcoRI
で切断し、2.3Kbpの断片を切り出した。この断片
を、SalI−EcoRI切断したpUC18に連結し
た。得られた組換えプラスミドを、Eco47I(東洋
紡(株)製)で消化し、約2kbpの断片を回収した。
この断片をDNAポリメラーゼのKlenow断片で消
化し、ついで、PstIで消化した。クローンU6の7
番目から1370番目までの配列(配列番号2)を有す
る断片Aが得られた。この断片Aには、第1エクソンの
上流側の配列、第1エクソン、第1イントロン、およ
び、第2エクソンの一部が含まれていた。断片Aの5’
末端側は、PstI部位であり、3’末端は平滑末端で
ある。
で切断し、2.3Kbpの断片を切り出した。この断片
を、SalI−EcoRI切断したpUC18に連結し
た。得られた組換えプラスミドを、Eco47I(東洋
紡(株)製)で消化し、約2kbpの断片を回収した。
この断片をDNAポリメラーゼのKlenow断片で消
化し、ついで、PstIで消化した。クローンU6の7
番目から1370番目までの配列(配列番号2)を有す
る断片Aが得られた。この断片Aには、第1エクソンの
上流側の配列、第1エクソン、第1イントロン、およ
び、第2エクソンの一部が含まれていた。断片Aの5’
末端側は、PstI部位であり、3’末端は平滑末端で
ある。
【0067】植物細胞用発現ベクターpBI221(クロ
ンテック社)は、カリフラワーモザイクウイルス(CaM
V)35Sプロモーター、β-グルクウロナーゼ(GU
S)コーディング領域およびノパリンシンセターゼのタ
ーミネーター(NOS・T)を有している。このpBI
221を、PstIおよびSmaIで消化し、PstI
−SmaI大断片Bを回収する。この大断片Bは、pB
I221から、CaMVの35Sプロモーター領域が削
除されている断片である。この大断片Bと、上記クロー
ンU6の7番目から1370番目までの配列を有する断
片Aとを連結させ、CatB−GUS−△0を作製し
た。
ンテック社)は、カリフラワーモザイクウイルス(CaM
V)35Sプロモーター、β-グルクウロナーゼ(GU
S)コーディング領域およびノパリンシンセターゼのタ
ーミネーター(NOS・T)を有している。このpBI
221を、PstIおよびSmaIで消化し、PstI
−SmaI大断片Bを回収する。この大断片Bは、pB
I221から、CaMVの35Sプロモーター領域が削
除されている断片である。この大断片Bと、上記クロー
ンU6の7番目から1370番目までの配列を有する断
片Aとを連結させ、CatB−GUS−△0を作製し
た。
【0068】同様にして、図3および図4に示す方法
で、それぞれ、CatAおよびCatC遺伝子のプロモ
ーター領域をGUS遺伝子に接続したプラスミド、Ca
tA−GUS−△0、およびCatC−GUS−△0を
作製した。CatA−GUS−△0には、1606番目から
1893番目に、CatC−GUS−△0には、1229番目か
ら1324番目にイントロンが存在している。
で、それぞれ、CatAおよびCatC遺伝子のプロモ
ーター領域をGUS遺伝子に接続したプラスミド、Ca
tA−GUS−△0、およびCatC−GUS−△0を
作製した。CatA−GUS−△0には、1606番目から
1893番目に、CatC−GUS−△0には、1229番目か
ら1324番目にイントロンが存在している。
【0069】得られたプラスミド、CatA−GUS−
△0、CatB−GUS−△0、およびCatC−GU
S−△0を、イネOc細胞に導入した。コントロールと
して、pBI221を用いた。
△0、CatB−GUS−△0、およびCatC−GU
S−△0を、イネOc細胞に導入した。コントロールと
して、pBI221を用いた。
【0070】(イネ細胞の形質転換とGUS遺伝子の発
現)300mlのフラスコに、以下の組成のAA培地を
70ml入れ、イネOc細胞を、緩やかに攪拌(90r
pm)しながら、28℃で、懸濁培養した。
現)300mlのフラスコに、以下の組成のAA培地を
70ml入れ、イネOc細胞を、緩やかに攪拌(90r
pm)しながら、28℃で、懸濁培養した。
【0071】AA培地の組成(Mol. Gen. Genet. 161:
67-76(1978)) 1)無機塩 濃度(mg/l) MnSO4.4-6H2O 10 H3BO3 3 ZnSO4.7H2O 2 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.2H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 KI 0.75 CaCl2.2H2O 150 MgSO4.7H2O 250 NaH2PO4.H2O 150 KCl 3,000 2)鉄分 Fe-EDTA 40 3)ビタミン・有機物 蔗糖 20,000 ニコチン酸 1 塩酸チアミン 10 塩酸ピリドキシン 1 myo-イノシトール 100 L-アルギニン 177 L-グリシン 7.5 L-グルタミン 900 L-アスパラギン酸 300 4)ホルモン酸 2,4−D 1 カイネチン 0.2 GA3 0.1 1週間毎に、10mlの培養物を70mlの新鮮な培地
に移した。移してから5日目の細胞を用いて、プロトプ
ラストを作製した。プロトプラストの作製は、Mol Gen.
Genet 206: 408-413(1987)に記載の方法に従った。継
代後5日目のカルス細胞サスペンジョンを直径10cm
プラスチックシャーレに移し、アスピレーターで培地を
除いて酵素液(4% セルラーゼRS(ヤクルト)、1%
マセロザイムR10(ヤクルト)、0.4M マンニトー
ル、0.5% CaCl2.2H2O、0.5% Potassium Dextran Su
lfate)20mlを加えた。パラフィルムをして28℃
の暗所に静置した。約5時間後にナイロンメッシュで濾
過して未消化物を取り除き、洗浄操作を繰り返した。
67-76(1978)) 1)無機塩 濃度(mg/l) MnSO4.4-6H2O 10 H3BO3 3 ZnSO4.7H2O 2 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.2H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 KI 0.75 CaCl2.2H2O 150 MgSO4.7H2O 250 NaH2PO4.H2O 150 KCl 3,000 2)鉄分 Fe-EDTA 40 3)ビタミン・有機物 蔗糖 20,000 ニコチン酸 1 塩酸チアミン 10 塩酸ピリドキシン 1 myo-イノシトール 100 L-アルギニン 177 L-グリシン 7.5 L-グルタミン 900 L-アスパラギン酸 300 4)ホルモン酸 2,4−D 1 カイネチン 0.2 GA3 0.1 1週間毎に、10mlの培養物を70mlの新鮮な培地
に移した。移してから5日目の細胞を用いて、プロトプ
ラストを作製した。プロトプラストの作製は、Mol Gen.
Genet 206: 408-413(1987)に記載の方法に従った。継
代後5日目のカルス細胞サスペンジョンを直径10cm
プラスチックシャーレに移し、アスピレーターで培地を
除いて酵素液(4% セルラーゼRS(ヤクルト)、1%
マセロザイムR10(ヤクルト)、0.4M マンニトー
ル、0.5% CaCl2.2H2O、0.5% Potassium Dextran Su
lfate)20mlを加えた。パラフィルムをして28℃
の暗所に静置した。約5時間後にナイロンメッシュで濾
過して未消化物を取り除き、洗浄操作を繰り返した。
【0072】得られたプロトプラストをEP緩衝液(5m
M MgCl2、70mM KCl、0.1% MES、0.4M マンニトール、
蒸留水を加えてpH5.6とし、フィルターで滅菌する:Nat
ure338:274-276(1989))に懸濁し、その一部(0.5
ml)をとり、上記プラスミドDNA20μg/mlお
よびキャリアDNAとしてのサケ精子DNA30μg/
mlと混合した。次に、Gene−Pulser(Bi
o−Rad、CA)を用いて、電極間距離0.4cmの
ディスポーサブルキュベット中で、500μFのキャパ
シタンスおよび100Ωの抵抗で、300V/cmでエ
レクトロポレーションした。氷上で10分インキュベー
トした後、プロトプラストに1.5mlのR2P培養液
を添加してMillicell(Millipore,CA)に入れ、これを
5mlのR2P培地(Plant Cell Physiol. 14:1113-11
21(1973))を含む6cmプラスチックディシュに入れ
る。Millicellの外側にナースセルを添加し、28℃、
暗条件で培養した。なお、ナースセルの有無は、CatA-G
US-△0、CatB-GUS-△0、およびCatC-GUS-△0の発現には
影響を及ぼさなかった。
M MgCl2、70mM KCl、0.1% MES、0.4M マンニトール、
蒸留水を加えてpH5.6とし、フィルターで滅菌する:Nat
ure338:274-276(1989))に懸濁し、その一部(0.5
ml)をとり、上記プラスミドDNA20μg/mlお
よびキャリアDNAとしてのサケ精子DNA30μg/
mlと混合した。次に、Gene−Pulser(Bi
o−Rad、CA)を用いて、電極間距離0.4cmの
ディスポーサブルキュベット中で、500μFのキャパ
シタンスおよび100Ωの抵抗で、300V/cmでエ
レクトロポレーションした。氷上で10分インキュベー
トした後、プロトプラストに1.5mlのR2P培養液
を添加してMillicell(Millipore,CA)に入れ、これを
5mlのR2P培地(Plant Cell Physiol. 14:1113-11
21(1973))を含む6cmプラスチックディシュに入れ
る。Millicellの外側にナースセルを添加し、28℃、
暗条件で培養した。なお、ナースセルの有無は、CatA-G
US-△0、CatB-GUS-△0、およびCatC-GUS-△0の発現には
影響を及ぼさなかった。
【0073】R2P培地の組成 (1)Major elements(mg/l) KNO3 4000 (NH4)2SO4 335 MgSO4.7H2O 250 CaCl2.2H2O 150 NaH2PO4.H2O 273 (2)Minor elements(mg/ml) MnSO4.4H2O 1.6 ZnSO4.7H2O 2.2 CuSO4.5H2O 0.125 H3BO3 3.0 NaMoO4.2H2O 0.125 Na2EDTA 7.5 FeSO4.7H2O 5.5 (3)有機成分(mg/ml) イノシトール 100 ニコチン酸 1.0 ピリドキシン塩酸 1.0 チアミン塩酸 10 蔗糖(g/l) 137 2,4−D(mg/l) 2.0 pH 5.6 GUS活性用のプロトプラストの処理は、基本的には、
ラボマニュアル:植物遺伝子の機能解析(岩淵雅樹・志
村令郎編、丸善、1992)p.55の記述に従って行っ
た。エレクトロポレーション処理後、4日間、28℃、
暗所にて培養したプロトプラストを、1mlファルコン
・ピペット(#7521)で1.5mlマイクロチューブに
とり、室温で9,000rpm、3分間遠心し、ペレッ
トを分析まで−80度の保存した。
ラボマニュアル:植物遺伝子の機能解析(岩淵雅樹・志
村令郎編、丸善、1992)p.55の記述に従って行っ
た。エレクトロポレーション処理後、4日間、28℃、
暗所にて培養したプロトプラストを、1mlファルコン
・ピペット(#7521)で1.5mlマイクロチューブに
とり、室温で9,000rpm、3分間遠心し、ペレッ
トを分析まで−80度の保存した。
【0074】ペレットに200μlの抽出バッファー
(50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)、10mM Na2E
DTA、0.1% TritonX−100、0.1% Sodium Lauryl Sarco
sine、10mM β−メルカプトエタノール)を加え、氷水
中で5分、凍結したペレットを融解した。超音波処理装
置(Branson Sonifier model 250)を用いて、Output c
ontrol 2、Dutycycle 10%の条件で、1分間処理し
た。処理後、15,000rpm、20分間、4℃で遠心分離し
た。上清(プロトプラスト抽出液)をとり、GUS活性
測定用のサンプルとした。サンプル中のタンパク質濃度
はBradford法(AnalBiochem 72:248-254(1976))で決
定した。
(50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)、10mM Na2E
DTA、0.1% TritonX−100、0.1% Sodium Lauryl Sarco
sine、10mM β−メルカプトエタノール)を加え、氷水
中で5分、凍結したペレットを融解した。超音波処理装
置(Branson Sonifier model 250)を用いて、Output c
ontrol 2、Dutycycle 10%の条件で、1分間処理し
た。処理後、15,000rpm、20分間、4℃で遠心分離し
た。上清(プロトプラスト抽出液)をとり、GUS活性
測定用のサンプルとした。サンプル中のタンパク質濃度
はBradford法(AnalBiochem 72:248-254(1976))で決
定した。
【0075】GUS活性は、上記のJeffersonらの方法
に従った。内在性のGUS活性は、反応液に20%(V
/V)のメタノールを加えることにより最少にした。実
験結果は、少なくとも2回の実験の結果であり、それぞ
れの実験には、同一試料について3つのサンプル(トリ
プリケート)が含まれていた。
に従った。内在性のGUS活性は、反応液に20%(V
/V)のメタノールを加えることにより最少にした。実
験結果は、少なくとも2回の実験の結果であり、それぞ
れの実験には、同一試料について3つのサンプル(トリ
プリケート)が含まれていた。
【0076】結果を図5に示す。この結果は、CatB
遺伝子プロモーターが、コントロールであるCaMV、
CatAおよびCatCのプロモーターに比べて、非常
に高い活性を示した。
遺伝子プロモーターが、コントロールであるCaMV、
CatAおよびCatCのプロモーターに比べて、非常
に高い活性を示した。
【0077】
【発明の効果】本願発明のCatB遺伝子プロモーター
は、従来植物用の汎用プロモーターとして使用されてい
るCaMVに比べて、非常に高い活性を有している。従
って、植物細胞を用いる有用物質の生産、およびイネの
等の品種改良に有用である。
は、従来植物用の汎用プロモーターとして使用されてい
るCaMVに比べて、非常に高い活性を有している。従
って、植物細胞を用いる有用物質の生産、およびイネの
等の品種改良に有用である。
【0078】
配列番号1 配列の長さ:1072 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号:プロモーター 存在位置:1..1072 特徴を決定した方法:E 配列 GTCGACCTGC AGGTCAACGG ATCTTATTTT TCCATTATAA TATATATAAT AAATAAATAT 60 ATGTTTACTT TTATTATAGT ACTTTAAAAG ATAAATCTAT ATATGTTGTT CTAGTTCCTT 120 TAAACTAAAT ATTATTAAAG TTATTAATGG TTAAAGTTAT AAAAGTTTGA TATCAAACTC 180 GTCCAAAATG TCGATTAATA TCGAACCGGA GCGAGTACAG TATTAGTAGC AAGTCAGCCA 240 CATGGGACAT GGCCCACATG CATGCACGTC GTATGAACAC ACCGTGATTC TTTGCCACTT 300 GCATAATATT CTAGCACTGC TATACTACAC GACGACTGAC GGCGACGTCA GTTCAGTTTA 360 GTTTGCCGCA TCCATCGCGA AGGCTACTCT ACCCATCCCA TTTTTTTTTA AAAAAAAATA 420 CTATAAATCT AAATATCTTA CATTAGATTT GTATATTTTA AAGCAAAGAG AATAATATGT 480 AGATATAAGT ATGTACCTAC TCGCTCGAGC ACAAGATCAC TGCAACAAGC ATTGAAGATC 540 GCTCCTAGCA ATGGTCTCAA CTTACCATGT AAACTAAGAG CAACTATAAT GTTTTTCTTT 600 TATTAGGAAT GGTTGCATCT TATATTTTGA GATTGAGAAA ACACATATAG AAATTATACA 660 GGATTTAGCA TTTGGGATGC CGGCCGGATT CCTGATTTCC CAGTCTCTGG CTTTCTTTTT 720 AAACAAAAAC GAAAAAAGCA GTGATCCGAT CGATCACGAT GAGCGAGCTA GTAAGCTCCA 780 AAACAAAATA GAGTACGTAC GTATAATCCT AGAGTCCGGA TAATAATAAT CCGTTTGGTT 840 CGCGTTAAAA AAGTCTTATC TCCTCGTGAT CCCTTTTTTT GGATCGATCC ATGTTCGTAG 900 TACGTGACAA GCACGCGCAC CAACCGAAGC AGGTACCTGT GTCGCTGCCT GTGGGCCCCA 960 CACACCCCAA GACGGCCATT AATAAACAAA CACGACGTGG ACGAAGAGAA GGGAGGCCGG 1020 CAAGAAGCAT ACTAGCACGC TACGAAACCC CCCTTCTCTT CGTCCCCAAA TT 1072 配列番号:2 配列の長さ:1364 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号:プロモーター 存在位置:1..1364 特徴を決定した方法:E 配列 CTGCAGGTCA ACGGATCTTA TTTTTCCATT ATAATATATA TAATAAATAA ATATATGTTT 60 ACTTTTATTA TAGTACTTTA AAAGATAAAT CTATATATGT TGTTCTAGTT CCTTTAAACT 120 AAATATTATT AAAGTTATTA ATGGTTAAAG TTATAAAAGT TTGATATCAA ACTCGTCCAA 180 AATGTCGATT AATATCGAAC CGGAGCGAGT ACAGTATTAG TAGCAAGTCA GCCACATGGG 240 ACATGGCCCA CATGCATGCA CGTCGTATGA ACACACCGTG ATTCTTTGCC ACTTGCATAA 300 TATTCTAGCA CTGCTATACT ACACGACGAC TGACGGCGAC GTCAGTTCAG TTTAGTTTGC 360 CGCATCCATC GCGAAGGCTA CTCTACCCAT CCCATTTTTT TTTAAAAAAA AATACTATAA 420 ATCTAAATAT CTTACATTAG ATTTGTATAT TTTAAAGCAA AGAGAATAAT ATGTAGATAT 480 AAGTATGTAC CTACTCGCTC GAGCACAAGA TCACTGCAAC AAGCATTGAA GATCGCTCCT 540 AGCAATGGTC TCAACTTACC ATGTAAACTA AGAGCAACTA TAATGTTTTT CTTTTATTAG 600 GAATGGTTGC ATCTTATATT TTGAGATTGA GAAAACACAT ATAGAAATTA TACAGGATTT 660 AGCATTTGGG ATGCCGGCCG GATTCCTGAT TTCCCAGTCT CTGGCTTTCT TTTTAAACAA 720 AAACGAAAAA AGCAGTGATC CGATCGATCA CGATGAGCGA GCTAGTAAGC TCCAAAACAA 780 AATAGAGTAC GTACGTATAA TCCTAGAGTC CGGATAATAA TAATCCGTTT GGTTCGCGTT 840 AAAAAAGTCT TATCTCCTCG TGATCCCTTT TTTTGGATCG ATCCATGTTC GTAGTACGTG 900 ACAAGCACGC GCACCAACCG AAGCAGGTAC CTGTGTCGCT GCCTGTGGGC CCCACACACC 960 CCAAGACGGC CATTAATAAA CAAACACGAC GTGGACGAAG AGAAGGGAGG CCGGCAAGAA 1020 GCATACTAGC ACGCTACGAA ACCCCCCTTC TCTTCGTCCC CAAATTGCAC TACAAAAAAG 1080 GCCGCCCCTT TCTTCTCTCC TCGTCCTTAT CACCACCAAT CCGATCCTCT TCTCTTCTCT 1140 TCTCTTCTTC CCCACATCCA GTTCGATTCT CATCTCTCCC ACAACAAATC ACGCCATGGA 1200 TCCCTACAAG GTGCCGCCTT TTCCTGATTT TCTTTTCTTC TAGATCGATC GTCGATTTGG 1260 TTTGGTTTGG TTTCTTGATG CGCTCATCCC AATCTGACTG ACTCACTGGA TTCCTCCTCC 1320 TTGCAGCATC GGCCGTCCAG CGGGAGCAAT TCCACCTTCT GGAC 1364 配列番号:3 配列の長さ:4985 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:イネ 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン1 存在位置:1073..1216 特徴を決定した方法:S 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン2 存在位置:1333..1429 特徴を決定した方法:S 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン3 存在位置:2341..2618 特徴を決定した方法:S 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン4 存在位置:2970..3746 特徴を決定した方法:S 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン5 存在位置:3968..4057 特徴を決定した方法:S 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン6 存在位置:4252..4319 特徴を決定した方法:S 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン7 存在位置:4410..4503 特徴を決定した方法:S 配列の特徴 特徴を表す記号:エクソン8 存在位置:4616..4881 特徴を決定した方法:S 配列 GTCGACCTGC AGGTCAACGG ATCTTATTTT TCCATTATAA TATATATAAT AAATAAATAT 60 ATGTTTACTT TTATTATAGT ACTTTAAAAG ATAAATCTAT ATATGTTGTT CTAGTTCCTT 120 TAAACTAAAT ATTATTAAAG TTATTAATGG TTAAAGTTAT AAAAGTTTGA TATCAAACTC 180 GTCCAAAATG TCGATTAATA TCGAACCGGA GCGAGTACAG TATTAGTAGC AAGTCAGCCA 240 CATGGGACAT GGCCCACATG CATGCACGTC GTATGAACAC ACCGTGATTC TTTGCCACTT 300 GCATAATATT CTAGCACTGC TATACTACAC GACGACTGAC GGCGACGTCA GTTCAGTTTA 360 GTTTGCCGCA TCCATCGCGA AGGCTACTCT ACCCATCCCA TTTTTTTTTA AAAAAAAATA 420 CTATAAATCT AAATATCTTA CATTAGATTT GTATATTTTA AAGCAAAGAG AATAATATGT 480 AGATATAAGT ATGTACCTAC TCGCTCGAGC ACAAGATCAC TGCAACAAGC ATTGAAGATC 540 GCTCCTAGCA ATGGTCTCAA CTTACCATGT AAACTAAGAG CAACTATAAT GTTTTTCTTT 600 TATTAGGAAT GGTTGCATCT TATATTTTGA GATTGAGAAA ACACATATAG AAATTATACA 660 GGATTTAGCA TTTGGGATGC CGGCCGGATT CCTGATTTCC CAGTCTCTGG CTTTCTTTTT 720 AAACAAAAAC GAAAAAAGCA GTGATCCGAT CGATCACGAT GAGCGAGCTA GTAAGCTCCA 780 AAACAAAATA GAGTACGTAC GTATAATCCT AGAGTCCGGA TAATAATAAT CCGTTTGGTT 840 CGCGTTAAAA AAGTCTTATC TCCTCGTGAT CCCTTTTTTT GGATCGATCC ATGTTCGTAG 900 TACGTGACAA GCACGCGCAC CAACCGAAGC AGGTACCTGT GTCGCTGCCT GTGGGCCCCA 960 CACACCCCAA GACGGCCATT AATAAACAAA CACGACGTGG ACGAAGAGAA GGGAGGCCGG 1020 CAAGAAGCAT ACTAGCACGC TACGAAACCC CCCTTCTCTT CGTCCCCAAA TTGCACTACA 1080 AAAAAGGCCG CCCCTTTCTT CTCTCCTCGT CCTTATCACC ACCAATCCGA TCCTCTTCTC 1140 TTCTCTTCTC TTCTTCCCCA CATCCAGTTC GATTCTCATC TCTCCCACAA CAAATCACGC 1200 CATGGATCCC TACAAGGTGC CGCCTTTTCC TGATTTTCTT TTCTTCTAGA TCGATCGTCG 1260 ATTTGGTTTG GTTTGGTTTC TTGATGCGCT CATCCCAATC TGACTGACTC ACTGGATTCC 1320 TCCTCCTTGC AGCATCGGCC GTCCAGCGGG AGCAATTCCA CCTTCTGGAC CACCAACTCC 1380 GGCGCCCCCG TCTGGAACAA CAACTCCGCC CTCACCGTCG GAGAGCGAGG TACTGAGCTG 1440 CTCCATCCTC CATCTTCCTC ATCTCTTCCT CCACGAATCT ATACTTCCTA TCGATCCATG 1500 TGCTTTATGT CTGCTTAGAG GCGTATTTGG GCTTGCTTCC ATCATGATCC AATGTTAACT 1560 TTGAGCGATC AGATGCTTAA TAATTTGTCT GTGTCTGGTA GCAACAGAAA AGGTCCCTGG 1620 ATCTGTGTGA ATTGGACTGT AGCACGACGT GTGCGATCTT GCCTTACTAT TGTTCCTTTA 1680 GAGCTATTCA AAGTTTGCAT CTTTGGTGTG GGGGGGTTTT CAGCCTTTTG CTTTGAGTAA 1740 CATGTCCTTG TCACTACCTT GTGATTCATC TGTGCTGCTT ACACACAAAG AGGAAGATCT 1800 CTAGTTTGGT TGCACTATGT TCTTGTTATT GCTCGGTTAC ACTCCTTCAT CAACGCTAAA 1860 AGACGCAGTC TTGATATTTT TCTCTGTCGC TGTCAATCTG TCATACCATT AATAAAGAAC 1920 GTATAAAAAT TGACCTTTTC CCCATTCATA GTAGTGATTA TCTCACTTGT CCTCAGTTCT 1980 AAAACAGCAT TCTTGTTTTT TGGGGGTTTT TTTACCATTA TCGGTTCACT TTACAAAGTA 2040 ATCTGATGAC GATCAAATTT ACTGGAGTAC CAGAGAAGCA CAAGTCTATT TCATACATAT 2100 ATCCAACATG ACTCAAGTTT CGAAAGTGAC TGGAAGTCAT GTTCCAAATG TCATGGTCAC 2160 TAAAAGTACC AAACTCTGAC AAAGATGTAT TTGCATCTAG AACTAAGTGC TTCTATCATC 2220 GATCTGTGAA GTTTTCTTTC TAGTGTTTTC CCTTTATTTA TACTCAGCAA CTCCTGTATT 2280 TTTGCAATCT GTAATCATGG CTGTTTTGTG GTTTGACATG ATGAATTCTT CAATCGACAG 2340 GCCCTATCCT CCTTGAGGAC TATCATCTGA TTGAAAAGCT TGCACAGTTT GACAGGGAGC 2400 GTATCCCTGA ACGTGTCGTT CATGCAAGGG GAGCCAGTGC CAAGGGATTT TTTGAGGTTA 2460 CTCATGATAT TTCTCACCTC ACATGTGCTG ATTTTCTCCG TGCTCCTGGT GTTCAGACCC 2520 CAGTTATTGT TCGGTTCTCC ACAGTCGTGC ATGAGCGTGG AAGCCCTGAG ACATTGAGGG 2580 AACCACGTGG TTTTGCTGTC AAGTTTTACA CTAGAGAGGT ACTTGCTCTT TCGCTTCTTT 2640 CTTTCATAGG ATTGTAGGAG GGAGACATTC AGTATAATGT ATTCTTCAAG CATAAGGCTG 2700 TAGAATCAAA TGTCTAGTTG TTCTCAGTTG GTTAAGTAGA ACATGAAAGA TTGGTTGTCC 2760 TTTACCTCCA CACTCCATAG GTCCAGTGCA TTGCTTAATC TTATATCTAC TAAAGCAAAT 2820 GAGGGTAATT TGGTCTTATA TATCTCAAAA GTCTCACACA TTGGACATAT ATCTAACCAG 2880 TGTCACCTAC AACTTTGTCT TACTGTTTAT TTACTGATTT GCATTCAGTG CTGCCATATT 2940 TTGATATTTT CTGAGTCAAT GCTTTTCAGG GTAATTTTGA TCTTGTTGGG AACAATATGC 3000 CTGTCTTTTT TATCCGAGAT GGGATGAAAT TCCCTGACAT GGTCCATGCT TTCAAGCCAA 3060 GTCCAAAGAC CAATATGCAG GAGAACTGGA GAATAGTTGA TTTCTTTTCA CACCACCCAG 3120 AGAGCCTGCA CATGTTCTCC TTCCTCTTTG ACGATGTAGG CATCCCACTC AACCACAGGC 3180 ACATGGAGGG TTTTGGTGTC AACACCTACA CCCTAATCAA TAAGGATGGA AAGCCTCACC 3240 TTGTCAAATT CCACTGGAAG CCTACCTGTG GTGTCAAATG CCTGTTGGAT GATGAAGCTG 3300 TGAVTGTTGG CGGCACCTGC CACAGCCATG CCACGAAGGA CTTGACTGAT TCTATTGCAG 3360 CAGGGAATTA CCCAGAGTGG AAGCTTTACA TCCAGACTAT TGATCCTGAT CATGAGGACA 3420 GATTTGACTT CGATCCTCTT GATGTCACCA AGACATGGCC AGAGGATATC ATCCCCCTGC 3480 AGCCAGTTGG ACGGATGGTC CTGAACAAAA ACATTGATAA CTTCTTTGCA GAAAATGAAC 3540 AGCTTGCTTT CTGCCCAGCG ATAATTGTCC CTGGAATCCA TTACTCTGAT GATAAGCTGC 3600 TCCAGACAAG AATTTTCTCC TATGCTGATA CCCAAAGGCA CCGTCTTGGC CCAAACTATT 3660 TGATGCTTCC TGTGAATGCA CCAAAATGTG CATACCACAA CAACCACCAC GATGGCTCCA 3720 TGAATTTCAT GCACAGGGAT GAAGAGGTAC TGTGTGTATA TACTTTCAGA GATACATCTC 3780 CTGCATTCAG TTGTTGTGAT GCATCTTTCT GTTTTTGTCC ATTACATATT GTTTCTTCCA 3840 GTCAACACAA ACAGAATGGG ACTATCATTC AGTTTATTGC ATTTACATCT ATTTGCCTTG 3900 TTTTTAGGTT AACTACTTCC CTTCAATTCA GTTTATTGCA TTTACATCTA TTTGCCTTGT 3960 TTTTTAGGTT AACTACTTCC CTTCAAGGTT TGATGCTGCA CGTCATGCTG AGAAGGTCCC 4020 TATTCCTCCT CGTGTTCTAA CAGGCTGTCG GGAAAAGGTG TGTAACTTGG TCCACTTGAA 4080 CTCCTTGCGC TGTTACCTTG TGAGCATGGT TTTGTCCCGC TACATTAGGA GACTATTTGC 4140 TGATTTGGAA TGCGATGAAA TATGTATTAT AGATGTGGTA CCCTGGAAAG TACAATGACC 4200 ACATGCATTT GACACAATGT TTTCTGCCTC TCTTTTTTGT TGGAAATGCA GTGTGTCATT 4260 GACAAGGAGA ACAATTTCCA ACAGGCTGGT GAGAGATACC GGTCATTTGA CCCTGCCAGG 4320 TTTGTTCTTG TTCAATTTAA TTCGTGTGAA CACATCGAAG AGTTTGAGCA ACAACGCTAA 4380 TTAAACTTTT CTTTTTGTAT GTAACACAGG CAAGATCGTT TTCTCCAGCG GTGGGTTGAT 4440 GCTCTCTCAG ATCCTCGTAT TACACATGAA CTCCGTGGCA TCTGGATCTC CTACTGGTCG 4500 CAGGTAACAT AATTTCTTCG TGGGTGCAAA GTGCTTATCA GTTGTCAGTG AGAGATCATG 4560 TACAATTGTA CCTTGTATTG ACACACTGAA ACCATATATT TGTGTGTTGT TGCAGTGTGA 4620 TGCGTCCCTT GGGCAGAAGC TGGCTTCACG TCTCAACCTG AAACCAAACA TGTAGATCGG 4680 CCAGGAGGAA TCCAGTGGTG GTGCTATGTT GGACAGTCAA ACATGAACTG TAATGTGTCG 4740 ACCAGCCGTA GTCGTGAATA AAATGTGATA CGGTGATATG TATACTGGTG ACGCAAGTTG 4800 TGAAACTGTA TCTGGAATCC TGAAAATATG CCTTGCTGTG TCTTGGGAAA TGAAACTGTA 4860 TCTGGAATCC TGAAAATATG CCTTGCTGTG TCTTGGGAAA ACATCTGCCA TCTCTTGTTT 4920 GCCTTTGTGT TAAGATGGCT TTAGAGACTG GAACGAACAA CCAGCTGTTT GCCTTTGTGC 4980 CTTTG 4985 配列番号:4 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA アンチセンス:No フラグメント型:中間部フラグメント 起源:イネ 配列 GGTCGATTCT CATCTCTCCC ACAACAAATC 30 配列番号:5 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA アンチセンス:Yes フラグメント型:中間部フラグメント 起源:イネ 配列 CAATGTCTCA GGGCTTCCAC GCTCATGCAC 30
【図1】クローンU6の制限酵素地図である。
【図2】プラスミドCatB−GUS−△0の作製を示
す模式図である。
す模式図である。
【図3】プラスミドCatA−GUS−△0の作製を示
す模式図である。
す模式図である。
【図4】プラスミドCatC−GUS−△0の作製を示
す模式図である。
す模式図である。
【図5】各プロモーターの活性を比較した図である。
Claims (9)
- 【請求項1】 配列番号1で示される配列、またはその
一部を有する配列であって配列番号1の配列と同等のプ
ロモーター活性を有する、イネCatB遺伝子プロモー
ター。 - 【請求項2】 配列番号2で示される配列、またはその
一部を有する配列であって配列番号2の配列と同等のプ
ロモーター活性を有する、イネCatB遺伝子プロモー
ター。 - 【請求項3】 請求項1に記載のイネCatB遺伝子プ
ロモーターを有する、植物発現用カセット。 - 【請求項4】 請求項2に記載のイネCatB遺伝子プ
ロモーターを有する、植物発現用カセット。 - 【請求項5】 請求項1または2に記載のイネCatB
遺伝子プロモーターと発現可能に接続された遺伝子とを
含む、組換えプラスミド。 - 【請求項6】 請求項5に記載の組換えプラスミドで形
質転換された、植物細胞。 - 【請求項7】 請求項5に記載の組換えプラスミドで形
質転換された、植物。 - 【請求項8】 請求項1または2に記載のイネCatB
遺伝子プロモーターを有する組換えプラスミドを作製す
る工程;該組換えプラスミドで植物細胞を形質転換する
工程;該形質転換された植物細胞を培養する工程;を包
含する、組換え蛋白質の製造方法。 - 【請求項9】 請求項1または2に記載のイネCatB
遺伝子プロモーターを有する組換えプラスミドを作製す
る工程;該組換えプラスミドで植物細胞を形質転換する
工程;該形質転換された植物細胞を培養する工程;を包
含する、組換え植物の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7248149A JP2955644B2 (ja) | 1995-09-26 | 1995-09-26 | イネCatB遺伝子プロモーター |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7248149A JP2955644B2 (ja) | 1995-09-26 | 1995-09-26 | イネCatB遺伝子プロモーター |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0984587A true JPH0984587A (ja) | 1997-03-31 |
JP2955644B2 JP2955644B2 (ja) | 1999-10-04 |
Family
ID=17173955
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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-
1995
- 1995-09-26 JP JP7248149A patent/JP2955644B2/ja not_active Expired - Lifetime
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US6812381B2 (en) | 1998-09-10 | 2004-11-02 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | DNA fragment having promoter function |
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US7232940B2 (en) * | 2000-04-26 | 2007-06-19 | Missouri Board Of Curators | Polynucleotide sequences from rice |
WO2003064649A1 (fr) * | 2002-01-25 | 2003-08-07 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Promoteur exprimant un gene etranger dans une racine ou l'apex d'une pousse |
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