JPH0984587A - イネＣａｔＢ遺伝子プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】活性の高い植物プロモーターを提供することお
よびイネ等の作物の品種を改良すること。 【解決手段】イネＣａｔＢ遺伝子プロモーターを用い
る。特に第１イントロンを含むプロモーターは活性が高
い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本願発明は、植物遺伝子のプ
ロモーターを用いる、有用物質の生産あるいは有用植物
の育種に関する。さらに詳しくは、イネのカタラーゼ遺
伝子Ｂ（以下、ＣａｔＢという）のプロモーター遺伝子
を用いる、有用物質の生産あるいは有用植物の育種に関
する。

【０００２】

【従来の技術】従来、植物遺伝子の発現に関して使用さ
れるプロモーターは、種々知られている。例えば、アグ
ロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡプロモーター、ノパリン
シンセターゼ（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピンプロ
モーター等が知られている。また、カリフラワーモザイ
クウイルス（ＣａＭＶ）プロモーターも植物遺伝子プロ
モーターとして汎用されている。しかし、その活性は、
実用的に用いられるには低いという問題点がある。

【０００３】ところで、細胞中の活性酸素種（スーパー
オキシド、過酸化水素、ハイドロキシルラジカル、一重
項酸素など）の濃度が上昇した状態を、酸化ストレス
（oxidative stress）と呼ぶ。これは、過酸化状態、紫
外線や放射線、チトクロームの電子伝達系の異常、ペル
オキシゾーム異常増加、高温・低温・化学物質等の非生
物的作因、オゾンや二酸化硫黄のような大気汚染物質等
が引き起こす「酸化状態」と、細胞内の「抗酸化剤防御
機構（スーパーオキサイドディスミュターゼ（ＳＯ
Ｄ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、ペルオキシダーゼ、ビタ
ミンＥ、Ｃ及びＡ、等）」のバランスが崩れたときに起
きる。

【０００４】真核生物では、酸化ストレスに曝されると
ＳＯＤやＣＡＴ活性が高まることが以前から知られてい
た。また、あらかじめＳＯＤやＣＡＴを誘導しておく
と、細胞は酸化ストレスに対して若干の抵抗性を示すこ
とも観察されていた。

【０００５】植物においても、酸化ストレスが生じるこ
とが知られている。例えば、光合成を妨げる様々な条
件（光照射下の低温や除草剤処理など）によって、光合
成反応経路等に起因する活性酸素種が、異常に発生す
る、暗所でも、植物が低温に曝されると過酸化水素等
の活性酸素種の濃度上昇がある、除草剤（パラコート
等）や紫外線もその作用機構に活性酸素種が関わってい
る、および、乾燥ストレスや重金属なども、酸化スト
レスを引き起こすと考えられている。

【０００６】植物は、酸化ストレスに対抗するために抗
酸化剤防御酵素系が協調してこれらの活性酸素種を消去
する等の、種々の防御反応を行っている。最近になって
の低温耐性にカタラーゼの関与を強く示唆する実験結
果が報告された。

【０００７】他方で、病原菌の感染のような生物的刺激
に対して、植物細胞はその表面でOxidative burstと呼
ばれる急速な活性酸素種発生を行うことが知られてい
る。この現象は、従来、病原菌を攻撃するためと解釈さ
れてきた。しかし、最近になって、この現象は、細胞内
部の種々の防御遺伝子の発現を誘導するカスケードをス
タートさせるためのシグナルとしても機能していること
が判ってきた。植物ウイルス感染時にも、過酸化水素が
防御タンパク質誘導に関与していることが最近明らかに
された。これらの新しい知見は、過酸化水素などの活性
酸素種の濃度を制御するカタラーゼが情報伝達の制御に
関わっていることを示唆するものとして注目されてい
る。

【０００８】そのひとつはトウモロコシ幼苗の低温訓化
（Chilling acclimation）による耐冷性獲得のメカニズ
ムとして、訓化過程での微量過酸化水素蓄積によるカタ
ラーゼ（Ｃａｔ３）遺伝子発現の誘導が報告されてい
る。また、タバコにおける病原体によるＰＲ蛋白質（Pa
thogenesis-related proteins）の誘導メカニズムとし
て、サリチル酸がカタラーゼを阻害し、細胞中の過酸化
水素濃度が上昇してＰＲ蛋白質を誘導すると報告されて
いる。これらは植物細胞でも活性酸素種自体が活性酸素
消去系遺伝子の誘導に直接関わっている可能性を示唆す
るものであり、また、過酸化水素濃度を調節する消去系
酵素群がシグナル制御の役割を持つ可能性がある。

【０００９】他方、イネでは、イネ種子の低温発芽性と
種子中のカタラーゼ活性の高さの相関関係が示唆されて
いる（谷田ら、農芸化学会1990年年会）。また、低酸素
条件下である水中で発芽させたイネ芽生えを空気中に出
すことによって酸素分圧を急激に上昇させたときに、カ
タラーゼ遺伝子が特異的に発現することが、最近になっ
て明らかにされた（森田ら、植物生理学会1994年度講演
要旨集、115頁）。

【００１０】従って、イネのカタラーゼ遺伝子のプロモ
ーターは、種々のシグナルに対して、反応し得る可能性
が高く、活性が高いプロモーターが見いだせれば、非常
に有用であると考えられる。例えば、 カタラーゼ構造遺伝子と組み合わせて、耐冷性の低い
植物（インディカ種のイネあるいは野菜など）に導入し
て耐冷性を付与すること、 カタラーゼ構造遺伝子と組み合わせて、日本で最も多
く栽培されているジャポニカ種イネに導入して、耐冷性
を強化すること、 カタラーゼ構造遺伝子と組み合わせて、種子中にカタ
ラーゼを高濃度に蓄積させ、低温発芽性あるいは水中発
芽性を上昇させて、直播きに適したイネを作出するこ
と、 カタラーゼ構造遺伝子と組み合わせてＣ３植物に、ペ
ルオキシゾム局在型カタラーゼをコードする遺伝子を導
入し、ペルオキシゾームにより多く蓄積させることによ
り、光呼吸を抑制し、光合成能を高めることが出来る可
能性があること、 植物病原菌感染時に発現することが知られている遺伝
子（ＰＲタンパク質、キチナーゼ等）のプロモーターと
組み合わせ、その下流にイネカタラーゼ遺伝子のエクソ
ン部分を含むＤＮＡ断片をアンチセンス方向に挿入して
植物に導入し、内在性カタラーゼ遺伝子の発現を抑制す
ることによって、シグナルとして動く過酸化水素濃度を
上昇させて防御関連遺伝子の発現を強化することが出来
る可能性があること、および、 目的遺伝子を形質転換体の中で高い効率で安定的に発
現し得る汎用べクターの開発が期待されること、等の有
用性が考えられる。

【００１１】従って、イネの遺伝子から、活性が高く、
実用的にも使用され得るプロモーターが取得できれば、
イネ等の作物の品種改良のみならず、他の植物細胞にお
ける物質生産用の汎用ベクターが開発でき、植物細胞を
用いる物質生産に大いに貢献できると考えられる。

【００１２】イネのカタラーゼの構造遺伝子としてはカ
タラーゼＡ（ＣａｔＡ）、ＣａｔＢ、およびカタラーゼ
Ｃ（ＣａｔＣ）遺伝子が知られており、それぞれ相同性
が高い配列を有している。ＣａｔＢのｃＤＮＡはその配
列が知られている（Plant Physiol.(1994) 105:1015-10
16)。

【００１３】しかし、これらの遺伝子のプロモーターの
解析は全くなされておらず、プロモーターの位置も特定
されていないのが現状である。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本願発明は、上記問題
点を解決すること、およびイネ等の作物における育種を
目的としており、従来、汎用されているＣａＭＶプロモ
ーターよりも、非常に高い活性を有する植物遺伝子プロ
モーターを提供することにある。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本願発明は、イネのカタ
ラーゼＢ（ＣａｔＢ）遺伝子のプロモーター活性が非常
に高いことを見いだして完成されたものである。

【００１６】本願発明は、配列番号１で示される配列、
またはその一部を有する配列であって配列番号１の配列
と同等のプロモーター活性を有する、イネＣａｔＢ遺伝
子プロモーターに関する。

【００１７】本願発明は、配列番号２で示される配列、
またはその一部を有する配列であって配列番号２の配列
と同等のプロモーター活性を有する、イネＣａｔＢ遺伝
子プロモーターに関する。この配列は、イネＣａｔＢ構
造遺伝子の第１イントロンを含む配列である。

【００１８】本願発明は、上記イネＣａｔＢ遺伝子プロ
モーターを有する、植物発現用カセットに関する。好適
な実施態様においては、配列番号２の配列を含むカセッ
トである。さらに好適な実施態様においては、本願発明
の植物発現用カセットは、ノパリンシンセターゼ遺伝子
のターミネーター配列を含む。

【００１９】さらに、本願発明は、上記イネＣａｔＢ遺
伝子プロモーターと発現可能に接続された外来遺伝子と
を含む、組換えプラスミドに関する。

【００２０】また、本願発明は上記組換えプラスミドで
形質転換された、植物細胞および植物に関する。

【００２１】また、本願発明は、組換え蛋白質の製造方
法に関し、以下の工程：イネＣａｔＢ遺伝子プロモータ
ーを有する組換えプラスミドを作製する工程；該組換え
プラスミドで植物細胞を形質転換する工程；および該形
質転換された植物細胞を培養する工程；を包含する。

【００２２】さらに、本願発明は、組換え植物の製造方
法に関し、以下の工程：イネＣａｔＢ遺伝子プロモータ
ーを有する組換えプラスミドを作製する工程；該組換え
プラスミドで植物細胞を形質転換する工程；および該形
質転換された植物細胞を培養する工程；を包含する。

【００２３】

【発明の実施の形態】本願発明のイネＣａｔＢ遺伝子プ
ロモーターは、配列番号１で示される配列を有してい
る。

【００２４】イネＣａｔＢ遺伝子プロモーターは、イネ
のゲノミックライブラリーからスクリーニングされ得
る。米国クローンテック社（CLONTECH Laboratories In
c., Palo Alto, CA）が市販しているイネのゲノミック
ＤＮＡライブラリー（RICE Genomic Library)が用いら
れ得る。

【００２５】プローブとしては、本願発明者らが単離し
たイネＣａｔＡ ｃＤＮＡが用いられ得る。イネＣａｔ
Ａ構造遺伝子とイネＣａｔＢ構造遺伝子とは、構造が類
似する部分があるので、その共通部分が用いられ得る。
なお、ゲノミックＣａｔＡ遺伝子の塩基配列は、日本農
芸化学会1992年大会講演要旨集：日本農芸化学会誌66
(3)、488(1992)）で発表されている。

【００２６】まず、イネゲノミック遺伝子ライブラリー
を、ファージλを用いて作製し、プラークを形成させ
る。このプラークを常法に従って、ニトロセルロース等
のメンブレンに移し、標識したプローブでハイブリダイ
ズさせる。ハイブリダイズ終了後、洗浄し、オートラジ
オグラフィーにかけ、ハイブリダイズすることが確認さ
れたファージからＤＮＡを調製する。

【００２７】調製したファージＤＮＡを、適当な制限酵
素を組み合わせて消化し、その消化物をアガロースゲル
電気泳動で分離する。分離したＤＮＡ断片をナイロンメ
ンブレンに移して、上記のプローブをハイブリダイズさ
せ、シグナルの強さとバンドのパターンの相違に基づい
て、スクリーニングする。

【００２８】シグナルの強さとバンドのパターンがＣａ
ｔＡ遺伝子のそれとほぼ一致するクローンはＣａｔＡ遺
伝子に対応すると考えられる。従って、バンドのパター
ンが一部しか一致しないクローンは、ＣａｔＡ遺伝子の
欠損クローン、あるいはＣａｔＡ以外の別のカタラーゼ
遺伝子のクローンである可能性があるので、さらに、Ｃ
ａｔＡ ｃＤＮＡをプローブとして用いて、下記のよう
な緩い条件と厳しい条件でのハイブリダイゼーションを
行って、パターンを比較する。このパターンの比較で、
ＣａｔＡ以外の別のカタラーゼ遺伝子であることが推定
される。ＰＣＲ等の方法あるいは塩基配列を決定して、
異なるカタラーゼ遺伝子であることを確認し得る。

【００２９】このようにして、ＣａｔＡ以外のゲノミッ
クのカタラーゼ遺伝子が、単離され得る。本願において
は、２つの異なるゲノミックのカタラーゼ遺伝子、Ｃａ
ｔＢおよびＣａｔＣが単離された。

【００３０】これらの配列の情報に基づいて、プロモー
ター領域が特定され得る。プロモーター配列は、イント
ロンを有する場合は、プロモーター自体だけでなく、第
１イントロン等の領域をも含み得る。

【００３１】ＣａｔＢ遺伝子のプロモーター配列が特定
されると、その配列を切り出して、植物用発現ベクター
につなぎ込み得る。つなぎ込まれたプロモーターの活性
は、そのプロモーターの下流に適当な酵素をコードする
遺伝子を連結し、その遺伝子の発現を、例えば、酵素活
性を測定して、測定する。植物を宿主とする場合には、
例えば、ｐＢＩ２２１等のようなプラスミドを用いて、
β-グルクウロナーゼ（ＧＵＳ）の発現を指標として測
定するのが一般的であり、本願明細書においても、ＧＵ
Ｓの発現で測定する方法が適用され得る。

【００３２】ＧＵＳ活性は、Jeffersonらの方法（EMBO
J 6：3901-3907(1987)）に基本的に従って測定され得
る。すなわち、タンパク質量にして５０μｇ相当のプロ
トプラスト抽出液と２５μｌの２０ｍＭ ４−methyl um
belliferyl glucuronide（４ＭＵＧ）、それに抽出バッ
ファー、さらに植物組織内在性のＧＵＳ様活性を抑制す
るために１００μｌメタノール（Kosugi et al., Plant
Sci 70：１３３−１４０（１９９０））を加えて全量
を５００μｌとし、３７℃でインキュベートする。０時
間と２時間後に反応液から２００μｌを採取し、0.2M
Ｎａ₂ＣＯ₃を０．８ｍｌ加えて反応を停止させる。蛍光
分光光度計により、３６５ｎｍの励起光で４５５ｎｍの
蛍光を測定する。２時間試料の値から０時間試料の値を
引き、酵素活性を4-MU pmoles/min/mg proteinで表示す
る。

【００３３】いったんＣａｔＢ遺伝子のプロモーター領
域が特定されると、さらにその配列を改変して、プロモ
ーター活性が高めることも本発明の範囲内である。例え
ば、ＣａｔＢ遺伝子のプロモーター領域に不要な配列を
除去して、あるいは一部改変して得られる、改変前と同
等あるいはそれ以上の活性を有する配列も本願発明の範
囲内にある。

【００３４】活性が確認されたＣａｔＢ遺伝子のプロモ
ーターは、適当な植物発現ベクターに組み込まれ得る。
この植物発現用ベクターに組み込まれたプロモーター配
列の３’末端側に、適当なリンカー配列、例えばマルチ
クローニングサイトを有するリンカーを導入して、植物
宿主に適した発現カセットが作製され得る。この発現カ
セットには、発現効率を向上させるため等の目的で、タ
ーミネーター配列が含まれ得る。このターミネーター配
列は、上記マルチクローニングサイトを有するリンカー
配列を介して、プロモーター配列と結合され得る。

【００３５】上記植物用発現カセットのマルチクローニ
ングサイトに、あるいは、プロモーターの下流に、外来
遺伝子が発現可能に接続される。このようにして生じた
組換えプラスミドは、常法に従って、植物細胞をプロト
プラスト化して、形質転換され得る。植物細胞のプロト
プラストの作製は、Mol Gen. Genet 206: 408-413(198
7)に記載の方法に従って行い得る。例えば、継代後５日
目のカルス細胞サスペンジョンを直径１０ｃｍプラスチ
ックシャーレに移し、アスピレーターで培地を除いて酵
素液（例えば、４％ セルラーゼRS（ヤクルト）、１％
マセロザイムR10（ヤクルト）、0.4Ｍ マンニトール、
0.5％ CaCl₂.2H₂O、及び0.5％ Potassium Dextran Sulf
ate）２０ｍｌを加え、パラフィルムをして２８℃の暗
所に静置する。約５時間後にナイロンメッシュで濾過し
て未消化物を取り除き、洗浄操作を繰り返してから、エ
レクトロポレーション等に用いる。

【００３６】形質転換された植物細胞は、そのまま、外
来遺伝子がコードする有用物質の生産に使用され得る。
有用物質の回収は、細胞外から、あるいは細胞内から、
常法に従って行われ得る。さらに、形質転換された植物
細胞を分化させて、形質転換された植物組織、あるいは
植物体とし得る。

【００３７】さらに、イネＣａｔＢ遺伝子は、細菌と植
物の両宿主で発現可能なバイナリーベクターに組み込む
ことが可能である。このようなバイナリーベクターは当
業者に周知である。例えば、アグロバクテリウムの発現
系を用いると、微生物による感染のシステムが利用され
得る。そして、例えば、タバコ等の植物に導入され得
る。従って、植物体の形質転換にも、使用され得る。

【００３８】イネＣａｔＢ遺伝子は、酸化ストレス等の
種々のシグナルに対して、反応し得る可能性が高い。従
って、そのシグナルに応じて種々の段階で発現させるこ
とが可能である。即ち、発現の調節が自由に行われ得る
と考えられる。

【００３９】従って、イネの遺伝子から、活性が高く、
実用的にも使用され得るプロモーターが取得できれば、
イネの品種改良のみならず、他の植物細胞における物質
生産用の汎用ベクターが開発でき、植物細胞を用いる物
質生産に大いに貢献できると考えられる。また、種々の
植物体への遺伝子導入にも使用され得る。

【００４０】以下に、実施例に基づいて本願発明を説明
するが、本願発明の範囲は、実施例のみに限定されるも
のではない。

【００４１】

【実施例】

（イネＣａｔＢゲノミック遺伝子の単離：ゲノミックラ
イブラリーからのスクリーニング）ＣａｔＡｃＤＮＡの
一部を、ＣａｔＢ遺伝子のクローニングに用いた。Ｃａ
ｔＡ ｃＤＮＡのクローニングの過程で得られた不完全
長ｃＤＮＡ（全長約1.8kbpのうち、５’非翻訳領域及び
若干のコード領域の合計約450bpを欠損する３’末端側
の1.35kbp）を含むラムダファージ（クローン＃５１）
のインサート部分をＰＣＲで増幅した。同ファージより
ＤＮＡを調製してこれをテンプレートとし、プライマー
としてλgt11-Forward Primer及びλgt11 Reverse Prim
er（東洋紡）を用いた。生成物をセントリコン−１００
（amicon）で精製し、濃度を25ng/10μlにして、マルチ
プライムラベル法（Amersham）のプローブとした。

【００４２】米国クローンテック社（CLONTECH Laborat
ories Inc., Palo Alto, CA）から購入したイネのゲノ
ミックＤＮＡライブラリー（RICE Genomic Library)を
用いて、ＣａｔＢ遺伝子をスクリーニングした。ゲノミ
ックライブラリーを構成するファージλＥＭＢＬ−３を
常法に従って、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭ５３８株に感染さ
せ、ファージプラークを形成させた。このファージプラ
ークをナイロンメンブレンに移し、下記の標準的条件で
上記プローブとハイブリダイズさせた。なお、プローブ
は、³²Ｐで標識した。

【００４３】ハイブリダイズ溶液：6x SSC-0.1% SDS, 5
x Denhardt's, 100μg/ml salmon sperm DNA；ハイブリ
ダイズ温度：65℃；ハイブリダイズ時間：overnight。

【００４４】次に、メンブレンを、以下の比較的緩い条
件で洗浄した。洗浄条件：2x SSC-0.1% SDS 室温５分
プラス30分；1x SSC-0.1% SDS 68℃、１時間。

【００４５】洗浄後、常法に従って、ナイロンメンブレ
ンをオートラジオグラフィーにかけ、プローブとハイブ
リダイズしたクローンを検出した。ハイブリダイズする
ことが確認されたファージからそれぞれＤＮＡを調製し
た。

【００４６】上記ファージのＤＮＡをＳａl ＩとＳｃａ
Ｉの制限酵素を組み合わせて消化し、その消化物をア
ガロースゲル電気泳動で分離した。分離したＤＮＡ断片
をナイロンメンブレンに移して、上述のＣａｔＡ ｃＤ
ＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせた。ハイ
ブリダイズの条件は上記と同じであり、メンブレン洗浄
は以下の条件で行った。洗浄条件：2x SSC 室温 ５−
10分 ２回；2x SSC-0.1% SDS 65℃、30分。

【００４７】洗浄後、常法に従って、ナイロンメンブレ
ンをオートラジオグラフィーにかけ、プローブとハイブ
リダイズしたＤＮＡ断片を検出した。

【００４８】シグナルの強さとバンドのパターンがほぼ
同一の、従って同じ構造を持つと推定される一群のクロ
ーンと、バンドのパターンが一部しか一致しないクロー
ンとがある。

【００４９】前者のシグナルの強さとバンドのパターン
がほぼ一致するクローンはＣａｔＡ遺伝子に対応すると
考えられた。実際、Ｎｏ．７４のクローンは、ＣａｔＡ
ｃＤＮＡに対応する遺伝子であった。

【００５０】他方、後者のバンドのパターンが一部しか
一致しないクローンは、ＣａｔＡ遺伝子の欠損クロー
ン、あるいはＣａｔＡ以外の別のカタラーゼ遺伝子のク
ローンである可能性がある。そこで、ＣａｔＡ ｃＤＮ
Ａをプローブとして用いて、下記のような緩い条件と厳
しい条件でのハイブリダイゼーションを行って、パター
ンを比較した。

【００５１】緩いハイブリダイズ条件：50% フォルムア
ミドを添加した、6x SSC-0.1% SDS,5x Denhardt's, 100
μg/ml salmon sperm DNA；ハイブリダイズ温度：37
℃；ハイブリダイズ時間：overnight。

【００５２】メンブレン洗浄条件は上記と同じであり、
2x SSC-0.1% SDS 室温５分プラス30分；1x SSC-0.1%
SDS 68℃、１時間であった。

【００５３】厳しいハイブリダイズの条件：50% フォル
ムアミドを添加した、6x SSC-0.1%SDS, 5x Denhardt's,
100μg/ml salmon sperm DNA；ハイブリダイズ温度：4
2℃；ハイブリダイズ時間：overnight。

【００５４】メンブレン洗浄条件は、2x SSC-0.1% SDS
室温５分プラス30分；1x SSC-0.1% SDS 68℃、１時
間であった。

【００５５】厳しい条件でのハイブリダイズの結果、標
準的ハイブリダイズのパターンと同じ数のバンドが検出
された。他方、緩い条件のハイブリダイズでは、厳しい
条件のハイブリのパターンよりも多数のバンドを示し
た。これらの結果から、バンドのパターンが一部しか一
致しないクローンは、ＣａｔＡ遺伝子の欠損クローンで
はなく、ＣａｔＡに似てはいるが、塩基配列が異なる部
分を持つＤＮＡ、すなわちＣａｔＡ以外の別のカタラー
ゼ遺伝子である可能性が高いことが判った。

【００５６】約２０個の、バンドのパターンが一部しか
一致しないクローンを、カタラーゼアイソザイム遺伝子
候補としてさらに解析した。この内のＮｏ．７クローン
は、詳細なサザン分析、部分塩基配列の解析、ＣａｔＡ
塩基配列に基づくＰＣＲ分析などから、ＣａｔＡとは異
なるカタラーゼ遺伝子であると結論した。また、Ｃａｔ
ＢｃＤＮＡとも異なる配列であることがわかり、Ｃａｔ
Ｃと命名された。ＣａｔＣの塩基配列は、日本農芸化学
会1994年大会にて発表されている（講演要旨：日本農芸
化学会誌68、404(1994)）。

【００５７】ＣａｔＡともＮｏ．７クローン（Ｃａｔ
Ｃ）とも異なるパターンを示すクローンがあり、その中
からＮｏ．６クローンをさらに詳細に解析した。Ｎｏ．
６クローンのＤＮＡについては、部分的に塩基配列も解
析した。この配列は、ＣａｔＢ遺伝子のｃＤＮＡ配列
（Plant Physiol.(1994) 105:1015-1016)と一致した。

【００５８】これらの情報を基に、ＣａｔＢ遺伝子の
５’非翻訳領域を得るために二つのＤＮＡオリゴマーを
合成した。

【００５９】 GGTCGATTCTCATCTCTCCCACAACAAATC：配列番号4（CatB cDNAの102-131に相当） CAATGTCTCAGGGCTTCCACGCTCATGCAC：配列番号5（CatB cDNAの484-455に相当） 他方、イネカルスから、ｃＤＮＡライブラリーを調製し
た。このｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡをテンプレート
とし、上記二つの合成ＤＮＡをプライマーとして、標準
的条件でＰＣＲを行った。約４００ｂｐのＤＮＡ断片が
増幅された。この４００ｂｐ ＤＮＡ断片をプローブと
して用い、上記ＣａｔＢ遺伝子と思われるクローン群を
再度スクリーニングし、ハイブリダイスする数個のクロ
ーンを得た。

【００６０】この中の、上記Ｎｏ．６クローンは、ＰＣ
Ｒ増幅した４００ｂｐの上流に、約ｌｋｂｐ以上の５’
上流域を持ち、且つ全長が約５ｋｂｐ以上であることが
わかった。このクローンをクローンＵ６と命名した。ク
ローンＵ６の制限酵素地図を作製した。図１にその制限
酵素地図を示す。

【００６１】クローンＵ６から、５’上流域を約１ｋｂ
ｐ含む断片（Ｓａｌ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＩ消化断片）とその
下流の断片（Ｅｃｏ ＲＩ−Ｅｃｏ ＲＩ消化断片）を切
り出し、シーケンス解析用のベクター（ｐＵＣ１８）に
挿入し、５’側から及び３’側からの段階的欠損プラス
ミドを多数作成し、塩基配列決定を行った。４９８５ｂ
ｐの配列が決定された。配列番号３にその全配列を示
す。

【００６２】（Ｃａｔ遺伝子プロモーターを有する組換
えプラスミドの作製）得られたＣａｔＢ遺伝子は、４９
８５ｂｐであった。そして、配列番号３の1073番目から
1216番目に第１エクソン、1333番目から1429番目に第２
エクソン、2341番目から2618番目に第３エクソン、2970
番目から3746番目に第４エクソン、3968番目から4057番
目に第５エクソン、4252番目から4319番目に第６エクソ
ン、4410番目から4503番目に第７エクソン、および4616
番目から4881番目に第８エクソンが存在すること、およ
び、それぞれのエクソンの間に、第１から第７イントロ
ンが存在することがわかった。

【００６３】上記配列から、プロモーター領域は、1073
番目より前の配列と推定された。

【００６４】この配列情報に基づいて、プロモーター領
域を切り出すことができる。

【００６５】イネＣａｔＢ遺伝子プロモーターを有する
プラスミド、ＣａｔＢ−ＧＵＳ−△０の作製を図２に示
す。

【００６６】クローンＵ６をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ
で切断し、２．３Ｋｂｐの断片を切り出した。この断片
を、ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ切断したｐＵＣ１８に連結し
た。得られた組換えプラスミドを、Ｅｃｏ４７Ｉ（東洋
紡（株）製）で消化し、約２ｋｂｐの断片を回収した。
この断片をＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で消
化し、ついで、ＰｓｔＩで消化した。クローンＵ６の７
番目から１３７０番目までの配列（配列番号２）を有す
る断片Ａが得られた。この断片Ａには、第１エクソンの
上流側の配列、第１エクソン、第１イントロン、およ
び、第２エクソンの一部が含まれていた。断片Ａの５’
末端側は、ＰｓｔＩ部位であり、３’末端は平滑末端で
ある。

【００６７】植物細胞用発現ベクターｐＢＩ２２１（クロ
ンテック社）は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭ
Ｖ）３５Ｓプロモーター、β-グルクウロナーゼ（ＧＵ
Ｓ）コーディング領域およびノパリンシンセターゼのタ
ーミネーター（ＮＯＳ・Ｔ）を有している。このｐＢＩ
２２１を、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩで消化し、ＰｓｔＩ
−ＳｍａＩ大断片Ｂを回収する。この大断片Ｂは、ｐＢ
Ｉ２２１から、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター領域が削
除されている断片である。この大断片Ｂと、上記クロー
ンＵ６の７番目から１３７０番目までの配列を有する断
片Ａとを連結させ、ＣａｔＢ−ＧＵＳ−△０を作製し
た。

【００６８】同様にして、図３および図４に示す方法
で、それぞれ、ＣａｔＡおよびＣａｔＣ遺伝子のプロモ
ーター領域をＧＵＳ遺伝子に接続したプラスミド、Ｃａ
ｔＡ−ＧＵＳ−△０、およびＣａｔＣ−ＧＵＳ−△０を
作製した。ＣａｔＡ−ＧＵＳ−△０には、1606番目から
1893番目に、ＣａｔＣ−ＧＵＳ−△０には、1229番目か
ら1324番目にイントロンが存在している。

【００６９】得られたプラスミド、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−
△０、ＣａｔＢ−ＧＵＳ−△０、およびＣａｔＣ−ＧＵ
Ｓ−△０を、イネＯｃ細胞に導入した。コントロールと
して、ｐＢＩ２２１を用いた。

【００７０】（イネ細胞の形質転換とＧＵＳ遺伝子の発
現）３００ｍｌのフラスコに、以下の組成のＡＡ培地を
７０ｍｌ入れ、イネＯｃ細胞を、緩やかに攪拌（９０ｒ
ｐｍ）しながら、２８℃で、懸濁培養した。

【００７１】ＡＡ培地の組成（Mol. Gen. Genet. 161：
67-76(1978)） １）無機塩 濃度（mg/l） MnSO₄.4-6H₂O 10 H₃BO₃ 3 ZnSO₄.7H₂O 2 Na₂MoO₄.2H₂O 0.25 CuSO₄.2H₂O 0.025 CoCl₂.6H₂O 0.025 KI 0.75 CaCl₂.2H₂O 150 MgSO₄.7H₂O 250 NaH₂PO₄.H₂O 150 KCl 3,000 ２）鉄分 Fe-EDTA 40 ３）ビタミン・有機物 蔗糖 20,000 ニコチン酸 1 塩酸チアミン 10 塩酸ピリドキシン 1 myo-イノシトール 100 L-アルギニン 177 L-グリシン 7.5 L-グルタミン 900 L-アスパラギン酸 300 ４）ホルモン酸 ２，４−Ｄ 1 カイネチン 0.2 ＧＡ３ 0.1 １週間毎に、１０ｍｌの培養物を７０ｍｌの新鮮な培地
に移した。移してから５日目の細胞を用いて、プロトプ
ラストを作製した。プロトプラストの作製は、Mol Gen.
Genet 206: 408-413(1987)に記載の方法に従った。継
代後５日目のカルス細胞サスペンジョンを直径１０ｃｍ
プラスチックシャーレに移し、アスピレーターで培地を
除いて酵素液（４％ セルラーゼRS（ヤクルト）、１％
マセロザイムR10（ヤクルト）、0.4Ｍ マンニトー
ル、0.5％ CaCl₂.2H₂O、0.5％ Potassium Dextran Su
lfate）２０ｍｌを加えた。パラフィルムをして２８℃
の暗所に静置した。約５時間後にナイロンメッシュで濾
過して未消化物を取り除き、洗浄操作を繰り返した。

【００７２】得られたプロトプラストをＥＰ緩衝液（5m
M MgCl₂、70mM KCl、0.1％ MES、0.4M マンニトール、
蒸留水を加えてpH5.6とし、フィルターで滅菌する：Nat
ure338：274-276(1989)）に懸濁し、その一部（０．５
ｍｌ）をとり、上記プラスミドＤＮＡ２０μｇ／ｍｌお
よびキャリアＤＮＡとしてのサケ精子ＤＮＡ３０μｇ／
ｍｌと混合した。次に、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ、ＣＡ）を用いて、電極間距離０．４ｃｍの
ディスポーサブルキュベット中で、５００μＦのキャパ
シタンスおよび１００Ωの抵抗で、３００Ｖ／ｃｍでエ
レクトロポレーションした。氷上で１０分インキュベー
トした後、プロトプラストに１．５ｍｌのＲ２Ｐ培養液
を添加してMillicell（Millipore，CA）に入れ、これを
５ｍｌのＲ２Ｐ培地（Plant Cell Physiol. 14:1113-11
21(1973)）を含む６ｃｍプラスチックディシュに入れ
る。Millicellの外側にナースセルを添加し、２８℃、
暗条件で培養した。なお、ナースセルの有無は、CatA-G
US-△0、CatB-GUS-△0、およびCatC-GUS-△0の発現には
影響を及ぼさなかった。

【００７３】Ｒ２Ｐ培地の組成 （１）Major elements(mg/l) KNO₃ 4000 (NH₄)₂SO₄ 335 MgSO₄.7H₂O 250 CaCl₂.2H₂O 150 NaH₂PO₄.H₂O 273 （２）Minor elements(mg/ml) MnSO₄.4H₂O 1.6 ZnSO₄.7H₂O 2.2 CuSO₄.5H₂O 0.125 H₃BO₃ 3.0 NaMoO₄.2H₂O 0.125 Na₂EDTA 7.5 FeSO₄.7H₂O 5.5 （３）有機成分(mg/ml) イノシトール 100 ニコチン酸 1.0 ピリドキシン塩酸 1.0 チアミン塩酸 10 蔗糖（g/l） 137 ２，４−Ｄ（mg/l） 2.0 ｐＨ 5.6 ＧＵＳ活性用のプロトプラストの処理は、基本的には、
ラボマニュアル：植物遺伝子の機能解析（岩淵雅樹・志
村令郎編、丸善、1992）ｐ．５５の記述に従って行っ
た。エレクトロポレーション処理後、４日間、２８℃、
暗所にて培養したプロトプラストを、１ｍｌファルコン
・ピペット（＃7521）で１．５ｍｌマイクロチューブに
とり、室温で９，０００ｒｐｍ、３分間遠心し、ペレッ
トを分析まで−８０度の保存した。

【００７４】ペレットに２００μｌの抽出バッファー
（50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)、10mM Na₂E
DTA、0.1％ TritonX−100、0.1％ Sodium Lauryl Sarco
sine、10mM β−メルカプトエタノール）を加え、氷水
中で５分、凍結したペレットを融解した。超音波処理装
置（Branson Sonifier model 250）を用いて、Output c
ontrol ２、Dutycycle １０％の条件で、１分間処理し
た。処理後、15,000rpm、２０分間、４℃で遠心分離し
た。上清（プロトプラスト抽出液）をとり、ＧＵＳ活性
測定用のサンプルとした。サンプル中のタンパク質濃度
はBradford法（AnalBiochem 72：248-254(1976)）で決
定した。

【００７５】ＧＵＳ活性は、上記のJeffersonらの方法
に従った。内在性のＧＵＳ活性は、反応液に２０％（Ｖ
／Ｖ）のメタノールを加えることにより最少にした。実
験結果は、少なくとも２回の実験の結果であり、それぞ
れの実験には、同一試料について３つのサンプル（トリ
プリケート）が含まれていた。

【００７６】結果を図５に示す。この結果は、ＣａｔＢ
遺伝子プロモーターが、コントロールであるＣａＭＶ、
ＣａｔＡおよびＣａｔＣのプロモーターに比べて、非常
に高い活性を示した。

【００７７】

【発明の効果】本願発明のＣａｔＢ遺伝子プロモーター
は、従来植物用の汎用プロモーターとして使用されてい
るＣａＭＶに比べて、非常に高い活性を有している。従
って、植物細胞を用いる有用物質の生産、およびイネの
等の品種改良に有用である。

【００７８】

【配列表】

配列番号１ 配列の長さ：1072 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：プロモーター 存在位置：1..1072 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GTCGACCTGC AGGTCAACGG ATCTTATTTT TCCATTATAA TATATATAAT AAATAAATAT 60 ATGTTTACTT TTATTATAGT ACTTTAAAAG ATAAATCTAT ATATGTTGTT CTAGTTCCTT 120 TAAACTAAAT ATTATTAAAG TTATTAATGG TTAAAGTTAT AAAAGTTTGA TATCAAACTC 180 GTCCAAAATG TCGATTAATA TCGAACCGGA GCGAGTACAG TATTAGTAGC AAGTCAGCCA 240 CATGGGACAT GGCCCACATG CATGCACGTC GTATGAACAC ACCGTGATTC TTTGCCACTT 300 GCATAATATT CTAGCACTGC TATACTACAC GACGACTGAC GGCGACGTCA GTTCAGTTTA 360 GTTTGCCGCA TCCATCGCGA AGGCTACTCT ACCCATCCCA TTTTTTTTTA AAAAAAAATA 420 CTATAAATCT AAATATCTTA CATTAGATTT GTATATTTTA AAGCAAAGAG AATAATATGT 480 AGATATAAGT ATGTACCTAC TCGCTCGAGC ACAAGATCAC TGCAACAAGC ATTGAAGATC 540 GCTCCTAGCA ATGGTCTCAA CTTACCATGT AAACTAAGAG CAACTATAAT GTTTTTCTTT 600 TATTAGGAAT GGTTGCATCT TATATTTTGA GATTGAGAAA ACACATATAG AAATTATACA 660 GGATTTAGCA TTTGGGATGC CGGCCGGATT CCTGATTTCC CAGTCTCTGG CTTTCTTTTT 720 AAACAAAAAC GAAAAAAGCA GTGATCCGAT CGATCACGAT GAGCGAGCTA GTAAGCTCCA 780 AAACAAAATA GAGTACGTAC GTATAATCCT AGAGTCCGGA TAATAATAAT CCGTTTGGTT 840 CGCGTTAAAA AAGTCTTATC TCCTCGTGAT CCCTTTTTTT GGATCGATCC ATGTTCGTAG 900 TACGTGACAA GCACGCGCAC CAACCGAAGC AGGTACCTGT GTCGCTGCCT GTGGGCCCCA 960 CACACCCCAA GACGGCCATT AATAAACAAA CACGACGTGG ACGAAGAGAA GGGAGGCCGG 1020 CAAGAAGCAT ACTAGCACGC TACGAAACCC CCCTTCTCTT CGTCCCCAAA TT 1072 配列番号：２ 配列の長さ：1364 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：プロモーター 存在位置：1..1364 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CTGCAGGTCA ACGGATCTTA TTTTTCCATT ATAATATATA TAATAAATAA ATATATGTTT 60 ACTTTTATTA TAGTACTTTA AAAGATAAAT CTATATATGT TGTTCTAGTT CCTTTAAACT 120 AAATATTATT AAAGTTATTA ATGGTTAAAG TTATAAAAGT TTGATATCAA ACTCGTCCAA 180 AATGTCGATT AATATCGAAC CGGAGCGAGT ACAGTATTAG TAGCAAGTCA GCCACATGGG 240 ACATGGCCCA CATGCATGCA CGTCGTATGA ACACACCGTG ATTCTTTGCC ACTTGCATAA 300 TATTCTAGCA CTGCTATACT ACACGACGAC TGACGGCGAC GTCAGTTCAG TTTAGTTTGC 360 CGCATCCATC GCGAAGGCTA CTCTACCCAT CCCATTTTTT TTTAAAAAAA AATACTATAA 420 ATCTAAATAT CTTACATTAG ATTTGTATAT TTTAAAGCAA AGAGAATAAT ATGTAGATAT 480 AAGTATGTAC CTACTCGCTC GAGCACAAGA TCACTGCAAC AAGCATTGAA GATCGCTCCT 540 AGCAATGGTC TCAACTTACC ATGTAAACTA AGAGCAACTA TAATGTTTTT CTTTTATTAG 600 GAATGGTTGC ATCTTATATT TTGAGATTGA GAAAACACAT ATAGAAATTA TACAGGATTT 660 AGCATTTGGG ATGCCGGCCG GATTCCTGAT TTCCCAGTCT CTGGCTTTCT TTTTAAACAA 720 AAACGAAAAA AGCAGTGATC CGATCGATCA CGATGAGCGA GCTAGTAAGC TCCAAAACAA 780 AATAGAGTAC GTACGTATAA TCCTAGAGTC CGGATAATAA TAATCCGTTT GGTTCGCGTT 840 AAAAAAGTCT TATCTCCTCG TGATCCCTTT TTTTGGATCG ATCCATGTTC GTAGTACGTG 900 ACAAGCACGC GCACCAACCG AAGCAGGTAC CTGTGTCGCT GCCTGTGGGC CCCACACACC 960 CCAAGACGGC CATTAATAAA CAAACACGAC GTGGACGAAG AGAAGGGAGG CCGGCAAGAA 1020 GCATACTAGC ACGCTACGAA ACCCCCCTTC TCTTCGTCCC CAAATTGCAC TACAAAAAAG 1080 GCCGCCCCTT TCTTCTCTCC TCGTCCTTAT CACCACCAAT CCGATCCTCT TCTCTTCTCT 1140 TCTCTTCTTC CCCACATCCA GTTCGATTCT CATCTCTCCC ACAACAAATC ACGCCATGGA 1200 TCCCTACAAG GTGCCGCCTT TTCCTGATTT TCTTTTCTTC TAGATCGATC GTCGATTTGG 1260 TTTGGTTTGG TTTCTTGATG CGCTCATCCC AATCTGACTG ACTCACTGGA TTCCTCCTCC 1320 TTGCAGCATC GGCCGTCCAG CGGGAGCAAT TCCACCTTCT GGAC 1364 配列番号：３ 配列の長さ：4985 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：イネ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン１ 存在位置：1073..1216 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン２ 存在位置：1333..1429 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン３ 存在位置：2341..2618 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン４ 存在位置：2970..3746 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン５ 存在位置：3968..4057 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン６ 存在位置：4252..4319 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン７ 存在位置：4410..4503 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：エクソン８ 存在位置：4616..4881 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GTCGACCTGC AGGTCAACGG ATCTTATTTT TCCATTATAA TATATATAAT AAATAAATAT 60 ATGTTTACTT TTATTATAGT ACTTTAAAAG ATAAATCTAT ATATGTTGTT CTAGTTCCTT 120 TAAACTAAAT ATTATTAAAG TTATTAATGG TTAAAGTTAT AAAAGTTTGA TATCAAACTC 180 GTCCAAAATG TCGATTAATA TCGAACCGGA GCGAGTACAG TATTAGTAGC AAGTCAGCCA 240 CATGGGACAT GGCCCACATG CATGCACGTC GTATGAACAC ACCGTGATTC TTTGCCACTT 300 GCATAATATT CTAGCACTGC TATACTACAC GACGACTGAC GGCGACGTCA GTTCAGTTTA 360 GTTTGCCGCA TCCATCGCGA AGGCTACTCT ACCCATCCCA TTTTTTTTTA AAAAAAAATA 420 CTATAAATCT AAATATCTTA CATTAGATTT GTATATTTTA AAGCAAAGAG AATAATATGT 480 AGATATAAGT ATGTACCTAC TCGCTCGAGC ACAAGATCAC TGCAACAAGC ATTGAAGATC 540 GCTCCTAGCA ATGGTCTCAA CTTACCATGT AAACTAAGAG CAACTATAAT GTTTTTCTTT 600 TATTAGGAAT GGTTGCATCT TATATTTTGA GATTGAGAAA ACACATATAG AAATTATACA 660 GGATTTAGCA TTTGGGATGC CGGCCGGATT CCTGATTTCC CAGTCTCTGG CTTTCTTTTT 720 AAACAAAAAC GAAAAAAGCA GTGATCCGAT CGATCACGAT GAGCGAGCTA GTAAGCTCCA 780 AAACAAAATA GAGTACGTAC GTATAATCCT AGAGTCCGGA TAATAATAAT CCGTTTGGTT 840 CGCGTTAAAA AAGTCTTATC TCCTCGTGAT CCCTTTTTTT GGATCGATCC ATGTTCGTAG 900 TACGTGACAA GCACGCGCAC CAACCGAAGC AGGTACCTGT GTCGCTGCCT GTGGGCCCCA 960 CACACCCCAA GACGGCCATT AATAAACAAA CACGACGTGG ACGAAGAGAA GGGAGGCCGG 1020 CAAGAAGCAT ACTAGCACGC TACGAAACCC CCCTTCTCTT CGTCCCCAAA TTGCACTACA 1080 AAAAAGGCCG CCCCTTTCTT CTCTCCTCGT CCTTATCACC ACCAATCCGA TCCTCTTCTC 1140 TTCTCTTCTC TTCTTCCCCA CATCCAGTTC GATTCTCATC TCTCCCACAA CAAATCACGC 1200 CATGGATCCC TACAAGGTGC CGCCTTTTCC TGATTTTCTT TTCTTCTAGA TCGATCGTCG 1260 ATTTGGTTTG GTTTGGTTTC TTGATGCGCT CATCCCAATC TGACTGACTC ACTGGATTCC 1320 TCCTCCTTGC AGCATCGGCC GTCCAGCGGG AGCAATTCCA CCTTCTGGAC CACCAACTCC 1380 GGCGCCCCCG TCTGGAACAA CAACTCCGCC CTCACCGTCG GAGAGCGAGG TACTGAGCTG 1440 CTCCATCCTC CATCTTCCTC ATCTCTTCCT CCACGAATCT ATACTTCCTA TCGATCCATG 1500 TGCTTTATGT CTGCTTAGAG GCGTATTTGG GCTTGCTTCC ATCATGATCC AATGTTAACT 1560 TTGAGCGATC AGATGCTTAA TAATTTGTCT GTGTCTGGTA GCAACAGAAA AGGTCCCTGG 1620 ATCTGTGTGA ATTGGACTGT AGCACGACGT GTGCGATCTT GCCTTACTAT TGTTCCTTTA 1680 GAGCTATTCA AAGTTTGCAT CTTTGGTGTG GGGGGGTTTT CAGCCTTTTG CTTTGAGTAA 1740 CATGTCCTTG TCACTACCTT GTGATTCATC TGTGCTGCTT ACACACAAAG AGGAAGATCT 1800 CTAGTTTGGT TGCACTATGT TCTTGTTATT GCTCGGTTAC ACTCCTTCAT CAACGCTAAA 1860 AGACGCAGTC TTGATATTTT TCTCTGTCGC TGTCAATCTG TCATACCATT AATAAAGAAC 1920 GTATAAAAAT TGACCTTTTC CCCATTCATA GTAGTGATTA TCTCACTTGT CCTCAGTTCT 1980 AAAACAGCAT TCTTGTTTTT TGGGGGTTTT TTTACCATTA TCGGTTCACT TTACAAAGTA 2040 ATCTGATGAC GATCAAATTT ACTGGAGTAC CAGAGAAGCA CAAGTCTATT TCATACATAT 2100 ATCCAACATG ACTCAAGTTT CGAAAGTGAC TGGAAGTCAT GTTCCAAATG TCATGGTCAC 2160 TAAAAGTACC AAACTCTGAC AAAGATGTAT TTGCATCTAG AACTAAGTGC TTCTATCATC 2220 GATCTGTGAA GTTTTCTTTC TAGTGTTTTC CCTTTATTTA TACTCAGCAA CTCCTGTATT 2280 TTTGCAATCT GTAATCATGG CTGTTTTGTG GTTTGACATG ATGAATTCTT CAATCGACAG 2340 GCCCTATCCT CCTTGAGGAC TATCATCTGA TTGAAAAGCT TGCACAGTTT GACAGGGAGC 2400 GTATCCCTGA ACGTGTCGTT CATGCAAGGG GAGCCAGTGC CAAGGGATTT TTTGAGGTTA 2460 CTCATGATAT TTCTCACCTC ACATGTGCTG ATTTTCTCCG TGCTCCTGGT GTTCAGACCC 2520 CAGTTATTGT TCGGTTCTCC ACAGTCGTGC ATGAGCGTGG AAGCCCTGAG ACATTGAGGG 2580 AACCACGTGG TTTTGCTGTC AAGTTTTACA CTAGAGAGGT ACTTGCTCTT TCGCTTCTTT 2640 CTTTCATAGG ATTGTAGGAG GGAGACATTC AGTATAATGT ATTCTTCAAG CATAAGGCTG 2700 TAGAATCAAA TGTCTAGTTG TTCTCAGTTG GTTAAGTAGA ACATGAAAGA TTGGTTGTCC 2760 TTTACCTCCA CACTCCATAG GTCCAGTGCA TTGCTTAATC TTATATCTAC TAAAGCAAAT 2820 GAGGGTAATT TGGTCTTATA TATCTCAAAA GTCTCACACA TTGGACATAT ATCTAACCAG 2880 TGTCACCTAC AACTTTGTCT TACTGTTTAT TTACTGATTT GCATTCAGTG CTGCCATATT 2940 TTGATATTTT CTGAGTCAAT GCTTTTCAGG GTAATTTTGA TCTTGTTGGG AACAATATGC 3000 CTGTCTTTTT TATCCGAGAT GGGATGAAAT TCCCTGACAT GGTCCATGCT TTCAAGCCAA 3060 GTCCAAAGAC CAATATGCAG GAGAACTGGA GAATAGTTGA TTTCTTTTCA CACCACCCAG 3120 AGAGCCTGCA CATGTTCTCC TTCCTCTTTG ACGATGTAGG CATCCCACTC AACCACAGGC 3180 ACATGGAGGG TTTTGGTGTC AACACCTACA CCCTAATCAA TAAGGATGGA AAGCCTCACC 3240 TTGTCAAATT CCACTGGAAG CCTACCTGTG GTGTCAAATG CCTGTTGGAT GATGAAGCTG 3300 TGAVTGTTGG CGGCACCTGC CACAGCCATG CCACGAAGGA CTTGACTGAT TCTATTGCAG 3360 CAGGGAATTA CCCAGAGTGG AAGCTTTACA TCCAGACTAT TGATCCTGAT CATGAGGACA 3420 GATTTGACTT CGATCCTCTT GATGTCACCA AGACATGGCC AGAGGATATC ATCCCCCTGC 3480 AGCCAGTTGG ACGGATGGTC CTGAACAAAA ACATTGATAA CTTCTTTGCA GAAAATGAAC 3540 AGCTTGCTTT CTGCCCAGCG ATAATTGTCC CTGGAATCCA TTACTCTGAT GATAAGCTGC 3600 TCCAGACAAG AATTTTCTCC TATGCTGATA CCCAAAGGCA CCGTCTTGGC CCAAACTATT 3660 TGATGCTTCC TGTGAATGCA CCAAAATGTG CATACCACAA CAACCACCAC GATGGCTCCA 3720 TGAATTTCAT GCACAGGGAT GAAGAGGTAC TGTGTGTATA TACTTTCAGA GATACATCTC 3780 CTGCATTCAG TTGTTGTGAT GCATCTTTCT GTTTTTGTCC ATTACATATT GTTTCTTCCA 3840 GTCAACACAA ACAGAATGGG ACTATCATTC AGTTTATTGC ATTTACATCT ATTTGCCTTG 3900 TTTTTAGGTT AACTACTTCC CTTCAATTCA GTTTATTGCA TTTACATCTA TTTGCCTTGT 3960 TTTTTAGGTT AACTACTTCC CTTCAAGGTT TGATGCTGCA CGTCATGCTG AGAAGGTCCC 4020 TATTCCTCCT CGTGTTCTAA CAGGCTGTCG GGAAAAGGTG TGTAACTTGG TCCACTTGAA 4080 CTCCTTGCGC TGTTACCTTG TGAGCATGGT TTTGTCCCGC TACATTAGGA GACTATTTGC 4140 TGATTTGGAA TGCGATGAAA TATGTATTAT AGATGTGGTA CCCTGGAAAG TACAATGACC 4200 ACATGCATTT GACACAATGT TTTCTGCCTC TCTTTTTTGT TGGAAATGCA GTGTGTCATT 4260 GACAAGGAGA ACAATTTCCA ACAGGCTGGT GAGAGATACC GGTCATTTGA CCCTGCCAGG 4320 TTTGTTCTTG TTCAATTTAA TTCGTGTGAA CACATCGAAG AGTTTGAGCA ACAACGCTAA 4380 TTAAACTTTT CTTTTTGTAT GTAACACAGG CAAGATCGTT TTCTCCAGCG GTGGGTTGAT 4440 GCTCTCTCAG ATCCTCGTAT TACACATGAA CTCCGTGGCA TCTGGATCTC CTACTGGTCG 4500 CAGGTAACAT AATTTCTTCG TGGGTGCAAA GTGCTTATCA GTTGTCAGTG AGAGATCATG 4560 TACAATTGTA CCTTGTATTG ACACACTGAA ACCATATATT TGTGTGTTGT TGCAGTGTGA 4620 TGCGTCCCTT GGGCAGAAGC TGGCTTCACG TCTCAACCTG AAACCAAACA TGTAGATCGG 4680 CCAGGAGGAA TCCAGTGGTG GTGCTATGTT GGACAGTCAA ACATGAACTG TAATGTGTCG 4740 ACCAGCCGTA GTCGTGAATA AAATGTGATA CGGTGATATG TATACTGGTG ACGCAAGTTG 4800 TGAAACTGTA TCTGGAATCC TGAAAATATG CCTTGCTGTG TCTTGGGAAA TGAAACTGTA 4860 TCTGGAATCC TGAAAATATG CCTTGCTGTG TCTTGGGAAA ACATCTGCCA TCTCTTGTTT 4920 GCCTTTGTGT TAAGATGGCT TTAGAGACTG GAACGAACAA CCAGCTGTTT GCCTTTGTGC 4980 CTTTG 4985 配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA アンチセンス：Ｎｏ フラグメント型：中間部フラグメント 起源：イネ 配列 GGTCGATTCT CATCTCTCCC ACAACAAATC 30 配列番号：５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA アンチセンス：Ｙｅｓ フラグメント型：中間部フラグメント 起源：イネ 配列 CAATGTCTCA GGGCTTCCAC GCTCATGCAC 30

【図面の簡単な説明】

【図１】クローンＵ６の制限酵素地図である。

【図２】プラスミドＣａｔＢ−ＧＵＳ−△０の作製を示
す模式図である。

【図３】プラスミドＣａｔＡ−ＧＵＳ−△０の作製を示
す模式図である。

【図４】プラスミドＣａｔＣ−ＧＵＳ−△０の作製を示
す模式図である。

【図５】各プロモーターの活性を比較した図である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示される配列、またはその
   一部を有する配列であって配列番号１の配列と同等のプ
   ロモーター活性を有する、イネＣａｔＢ遺伝子プロモー
   ター。
2. 【請求項２】 配列番号２で示される配列、またはその
   一部を有する配列であって配列番号２の配列と同等のプ
   ロモーター活性を有する、イネＣａｔＢ遺伝子プロモー
   ター。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のイネＣａｔＢ遺伝子プ
   ロモーターを有する、植物発現用カセット。
4. 【請求項４】 請求項２に記載のイネＣａｔＢ遺伝子プ
   ロモーターを有する、植物発現用カセット。
5. 【請求項５】 請求項１または２に記載のイネＣａｔＢ
   遺伝子プロモーターと発現可能に接続された遺伝子とを
   含む、組換えプラスミド。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の組換えプラスミドで形
   質転換された、植物細胞。
7. 【請求項７】 請求項５に記載の組換えプラスミドで形
   質転換された、植物。
8. 【請求項８】 請求項１または２に記載のイネＣａｔＢ
   遺伝子プロモーターを有する組換えプラスミドを作製す
   る工程；該組換えプラスミドで植物細胞を形質転換する
   工程；該形質転換された植物細胞を培養する工程；を包
   含する、組換え蛋白質の製造方法。
9. 【請求項９】 請求項１または２に記載のイネＣａｔＢ
   遺伝子プロモーターを有する組換えプラスミドを作製す
   る工程；該組換えプラスミドで植物細胞を形質転換する
   工程；該形質転換された植物細胞を培養する工程；を包
   含する、組換え植物の製造方法。