WO2000014112A2 - Papillomviren, mittel zu deren nachweis sowie zur therapie von durch sie verursachten erkrankungen - Google Patents

Papillomviren, mittel zu deren nachweis sowie zur therapie von durch sie verursachten erkrankungen Download PDF

Info

Publication number
WO2000014112A2
WO2000014112A2 PCT/DE1999/002824 DE9902824W WO0014112A2 WO 2000014112 A2 WO2000014112 A2 WO 2000014112A2 DE 9902824 W DE9902824 W DE 9902824W WO 0014112 A2 WO0014112 A2 WO 0014112A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
virus
papillomavirus
protein
genome
Prior art date
Application number
PCT/DE1999/002824
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2000014112A3 (de
Inventor
Ethel-Michele De Villiers-Zur Hausen
Harald Zur Hausen
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
Priority to US09/786,454 priority Critical patent/US6589532B1/en
Priority to EP99968672A priority patent/EP1109893A2/de
Publication of WO2000014112A2 publication Critical patent/WO2000014112A2/de
Publication of WO2000014112A3 publication Critical patent/WO2000014112A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • Papillomaviruses means for their detection and for the therapy of diseases caused by them
  • the invention relates to a DNA which codes for a peptide of a papillomavirus main capsid protein or a papillomavirus genome. Furthermore, the invention relates to proteins encoded by the papilloma virus genome and antibodies directed against them, and to their use in diagnosis, therapy and vaccination.
  • HP viruses Human papilloma viruses
  • benign e.g. Warts
  • malignancies e.g. Carcinomas of the skin and uterus
  • epithelial neoplasms see Frankfurt, H., Biochimica et Biophysica Acta (BBA) 1288, (1996), pages 55-78.
  • HP viruses are also being considered for the development of malignant tumors in the oropharyngeal area
  • Papilloma viruses have an icosahedral capsid without a shell, in which a circular, double-stranded DNA molecule of approximately 7900 bp is present.
  • the capsid comprises a major capsid protein (L1) and a minor capsid protein (L2). Both proteins, co-expressed or L1 expressed alone, lead to the formation of virus-like particles in vitro (cf. Kirnbauer, R. et al., Journal of Virology, (1993), pages 6929-6936).
  • Papilloma viruses cannot be propagated in monolayer cell culture. Their characterization is therefore extremely difficult, and the detection of papilloma viruses already creates considerable problems. This is particularly true for papilloma viruses in skin carcinomas.
  • the object of the present invention is therefore to provide an agent with which papilloma viruses, in particular in carcinomas of the skin, can be detected.
  • a means should also be provided to treat these papillomaviruses therapeutically.
  • the invention thus relates to a DNA coding for a peptide of a papillomavirus main capsid protein (L1), the peptide comprising the amino acid sequence of FIG. 1, 2, 3, 4, 5 or 6 or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids.
  • L1 papillomavirus main capsid protein
  • Another object of the invention is a DNA coding for a peptide of a papillomavirus main capsid protein, the DNA being the base sequence of FIG. 1, FIG. 2, FIG. 3, FIG. 4, FIG. 5 or FIG. 6 or one thereof encompassed by one or more base pairs of different base sequences.
  • FIG. 2 shows the base sequence and the amino acid sequence derived therefrom of a DNA coding for a peptide from L1 of a papillomavirus. This DNA was deposited as plasmid DL428 with the DSM under DSM 12310 on July 14, 1998.
  • FIG. 3 shows the base sequence and the amino acid sequence derived therefrom of a DNA coding for a peptide from L1 of a papilloma virus. This DNA was deposited as plasmid DL436 at DSM under DSM 12311 on July 14, 1998.
  • FIG. 4 shows the base sequence and the amino acid sequence derived therefrom of a DNA coding for a peptide from L1 of a papillomavirus. This DNA was deposited as plasmid DL473 with the DSM under DSM 12312 on July 14, 1998.
  • FIG. 5 shows the base sequence and the amino acid sequence derived therefrom of a DNA coding for a peptide from L1 of a papilloma virus. This DNA was deposited as plasmid KG80 with the DSM under DSM 12313 on July 14, 1998.
  • FIG. 6 shows the base sequence and the amino acid sequence derived therefrom of a DNA coding for a peptide from Ll of a papillomavirus. This DNA was deposited as plasmid TN111 with the DSM under DSM 12314 on July 14, 1998.
  • the above DNA was compared to the DNA of known papilloma viruses. Sequence homology studies were carried out. A homology that is less than 90% shows a DNA according to the invention as a new HP virus.
  • the DNAs according to the invention have the following sequence homologies with known papilloma viruses:
  • the above DNA can be in a vector or Expression vector are present.
  • expression vectors for E. coli, these are, for example, pGEMEX, pUC derivatives, pGEM-T and pGEX-2T.
  • yeast for example, pYlOO and Ycpadl should be mentioned, while for expression in animal cells, for example, pKCR, pEF-BOS, cDM8 and pCEV4 must be specified.
  • suitable cells in order to express the above DNA present in an expression vector.
  • suitable cells include the E. coli strains HB101, DH1, xl776, JM101, JM 109 and XLl-Blue, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, NH-3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, and Hey.
  • the person skilled in the art knows how the above DNA has to be inserted into an expression vector. He is also aware that the above DNA can be inserted in connection with a DNA coding for another protein or peptide, so that the above DNA can be expressed in the form of a fusion protein.
  • papilloma virus genome comprising the above DNA.
  • the term "papilloma virus genome” also includes an incomplete genome, i.e. Fragments of a papilloma virus genome comprising the above DNA. This can e.g. be a DNA coding for Ll or a part thereof.
  • a common method can be used to provide the above papillomavirus genome.
  • a method comprising the following method steps is favorable:
  • epithelial neoplasm encompasses any neoplasms of epithelial tissue in humans and animals. Examples of such neoplasms are warts, condylomas in the genital area and carcinomas of the (mucous) skin. The latter are preferably used in the present case to isolate the above papillomavirus genome.
  • vector includes any vector suitable for cloning chromosomal or extrachromosomal DNA.
  • examples of such vectors are cosmids such as pWE15 and Super Cosl, and phages such as ⁇ phages, e.g. ⁇ ZAP Expressvector, ⁇ ZAPII Vector and ⁇ gtlO Vector.
  • ⁇ phages are preferably used.
  • the above vectors are known and are available from Stratagene.
  • Papillomavirus genomes according to the invention can be integrated in chromosomal DNA or extrachromosomal. Methods are known to the person skilled in the art to clarify this. He also knows how to find the optimal restriction enzymes for cloning the papillomavirus genomes. It will be based on genomes of known papilloma viruses. In particular, the person skilled in the art will observe the aforementioned HP viruses accordingly.
  • a papilloma virus genome designated DL473-G is described by way of example.
  • the total DNA from a biopsy of a squamous epithelial Carcinoma isolated, cleaved with BamHI and electrophoresed in an agarose sail.
  • the agarose gel is then subjected to a blotting process, whereby the DNA is transferred to a nitrocellulose membrane.
  • This is used in a hybridization process in which the DNA from FIG. 4, possibly in combination with a DNA from HP virus 15, is used as the labeled sample. Hybridization with the papilloma virus DNA present in the total DNA is obtained.
  • the above total DNA cleaved with BamHI is cloned in a ⁇ phage.
  • the corresponding clones i.e. the clones containing the papillomavirus DNA are identified by hybridization with the DNA of FIG. 4, possibly in combination with a DNA of the HP virus 15.
  • the insert of these clones is then subjected to further cloning in a plasmid vector, whereby a clone is obtained which contains the papillomavirus genome DL473-G. The genome is confirmed by sequencing.
  • papillomavirus genomes are provided. They are named according to the DNAs used for their preparation, with: DL416-G, DL428-G, DL436-G, KG80-G or TNlll-G.
  • Another object of the invention is a protein encoded by the above papillomavirus genome.
  • a protein is, for example, a main capsid protein (L1) or a secondary capsid protein (L2).
  • the above protein is produced in a conventional manner.
  • the production of L1 and L2 of the papillomavirus genome DL473-G is described as an example.
  • the HP virus 15 related to the DNA of FIG. 4 is used for this purpose.
  • the complete sequence and the position of individual DNA regions coding for proteins are known from this.
  • Papillomavirus genome DL473-G identified. They are confirmed by sequencing.
  • the DNA coding for L1 is referred to as DL473-G-L1 DNA and the DNA coding for L2 as DL473-G-L2-DNA.
  • the DNA coding for L1 or L2 is inserted into an expression vector.
  • E. coli examples of such for E. coli, yeast and animal cells are mentioned above.
  • vector pGEX-2T for expression in E. coli (cf. Kirnbauer, R. et al., Supra).
  • pGEX-2T-DL473-G-L1 or pGEX-2T-DL473 -G-L2 is obtained.
  • these expression vectors express a glutathione S-transferase-L1 or glutathione S-transferase-L2 fusion protein. These proteins are purified in the usual way.
  • the bacculovirus or vaccinia virus system is called for a further expression of the above coding L1 or L2 DNA.
  • Expression vectors that can be used for this are, for example, pEV mod. and pSynwtVI " for the bacculovirus system (cf. Kirnbauer, R. et al., supra).
  • vectors with the vaccinia virus are" early "(p7.5k) - or” late "(Psynth, pllK) promoter (cf. Hagensee, M., E. et al., Journal of Virology (1993), pages 315-322).
  • the bacculovirus system is preferred.
  • a particle comprises an Ll protein
  • an L1 protein as well as an Ll protein.
  • a virus-like particle of the latter case is also obtained by inserting the above DL473-G-L1 and DL473-G-L2 DNAs together into the expression vector pSynwtVI " and the pSynwtVI " DL473-G-L1 / L2 obtained is used for the infection of SF-9 insect cells.
  • the above virus-like particles are cleaned in a conventional manner. They are also an object of the invention.
  • Another object of the invention is an antibody directed against an above protein or virus-like particle.
  • Such is produced in the usual way. It is described by way of example for the production of an antibody which is directed against a virus-like particle comprising L1 of DL473-G.
  • the virus-like particle BALB / c mice is injected subcutaneously. This injection is repeated every 3 weeks. About 2 weeks after the last injection, the serum containing the antibody is isolated and tested in the usual way.
  • the antibody is a monoclonal antibody.
  • spleen cells are removed from the mice after the fourth injection above and these are fused with myeloma cells in the usual way. The further cloning is also carried out according to known methods.
  • the present invention makes it possible to detect papilloma viruses, in particular in carcinomas of the skin.
  • the DNA according to the invention can be used as such or encompassed by a further DNA.
  • the latter can also be a papilloma virus gome or part of it.
  • the present invention also enables the provision of previously unknown papilloma viruses. These are found particularly in carcinomas of the skin. Furthermore, the invention provides proteins and virus-like particles which are due to these papillomaviruses. Antibodies are also provided which are directed against these proteins or particles.
  • the present invention thus enables diagnostic and take therapeutic measures for papilloma virus diseases. In addition, it provides the opportunity to build a vaccine against papillomavirus infections. The present invention thus represents a breakthrough in the field of papilloma virus research.
  • Example 1 Identification of the DL473-G papilloma virus genome
  • the total DNA is isolated from a biopsy of a squamous cell carcinoma of the skin. 10 g of this DNA are cleaved with the restriction enzyme BamHI and electrophoresed in a 0.5% agarose gel. At the same time, 10 ⁇ g of the above DNA, which has not been cleaved, are also separated. The agarose gel is subjected to a blotting process, whereby the DNA from the agarose gel is transferred to a nitrocellulose membrane. This is used in a hybridization process in which the above DNA from FIG. 4 is used in combination with HP virus 15 DNA as a p 32 -labeled sample. Hybridization with the blotted DNA is obtained.
  • the biopsy DNA obtained from Example 1 is cleaved with the restriction enzyme BamHI.
  • the fragments obtained are used in a ligase reaction in which the ⁇ ZAP Express vector, which has been cleaved and dephosphorylated with BamHI, is also present.
  • the recombinant DNA molecules obtained in this way are packaged in bacteriophages and these used to infect bacteria.
  • the ZAP Express Vector Kit offered by Stratagene is used for these process steps.
  • the phage plaques obtained are then subjected to a hybridization process in which the p 32 -labeled DNA from FIG. 4 used in Example 1 is used in combination with p 32 -labeled HP virus 15 DNA. Hybridization with corresponding phage plaques is obtained.
  • the BamHI fragments of DL473-G are isolated from these and used together with a BamHI-splitted, dephosphorylated plasmid vector, pBluescript, in a further ligase reaction.
  • the recombinant DNA molecules obtained are used to transform bacteria, E. coli XLl-Blue.
  • a bacterial clone containing the papillomavirus genome DL473-G is identified by restriction cleavage or hybridization with the above DNA samples.
  • the plasmid of this bacterial clone is called pBlue-DL473-G.

Abstract

Die Erfindung betrifft eine DNA, die für ein Peptid eines Papillomvirus-Hauptcapsid-Proteins bzw. ein Papillomvirus-Genom codiert. Des weiteren betrifft die Erfindung durch das Papillomvirus-Genom codierte Proteine und gegen sie gerichtete Antikörper sowie deren Verwendung in Diagnose, Therapie und Vakzinierung.

Description

Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen
Die Erfindung betrifft eine DNA, die für ein Peptid eines Papillomvirus-Hauptcapsid-Proteins bzw. ein Papillomvirus- Genom codiert. Desweiteren betrifft die Erfindung durch das Papillomvirus-Genom codierte Proteine und gegen sie gerichtete Antikörper sowie deren Verwendung in Diagnose, Therapie und Vakzinierung .
Es ist bekannt, daß Papillomviren das Epithelgewebe von Mensch und Tier infizieren. Human-Papillomviren (nachstehend mit HP- Viren bezeichnet) finden sich in benignen, z.B. Warzen, Kondylome im Genitalbereich, und malignen, z.B. Karzinome der Haut und der Gebärmutter, epithelialen Neoplasmen (vgl. zur Hausen, H., Biochimica et Biophysica Acta (BBA) 1288, (1996), Seiten 55-78) . Auch werden HP-Viren für die Entwicklung maligner Tumoren im Oropharyngealbereich in Betracht gezogen
(vgl. zur Hausen, H., Curr. Top. Microbiol . Immuno1. 78,
(1977) , Seiten 1-30) .
Papillomviren weisen ein ikosaedrisches Capsid ohne Hülle auf, in dem ein zirkuläres, doppelsträngiges DNA-Molekül von etwa 7900 bp vorliegt. Das Capsid umfaßt ein Hauptcapsid-Protein (Ll) und ein Nebencapsid-Protein (L2). Beide Proteine, coexprimiert oder Ll alleine exprimiert, führen in vitro zur Ausbildung von Virus-ähnlichen Partikeln (vgl. Kirnbauer, R. et al., Journal of Virology, (1993), Seiten 6929-6936).
Papillomviren lassen sich nicht in Monolayer-Zellkultur vermehren. Ihre Charakterisierung ist daher äußerst schwierig, wobei bereits der Nachweis von Papillomviren erhebliche Probleme schafft. Dies trifft insbesondere für Papillomviren in Karzinomen der Haut zu. Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem Papillomviren, insbesondere in Karzinomen der Haut, nachgewiesen werden können. Ferner sollte ein Mittel bereitgestellt werden, um gegen diese Papillomviren therapeutisch vorgehen zu können.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Bereitstellung der Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine für ein Peptid eines Papillomvirus-Hauptcapsid-Proteins (Ll) codierende DNA, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5 oder Fig. 6 oder eine davon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz umfaßt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine für ein Peptid eines Papillomvirus-Hauptcapsid-Proteins codierende DNA, wobei die DNA die Basensequenz von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5 oder Fig. 6 oder eine davon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Basensequenz umfaßt.
Fig. 1 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von Ll eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid DL416 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) unter DSM 12309 am 14. Juli 1998 hinterlegt.
Fig. 2 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von Ll eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid DL428 bei der DSM unter DSM 12310 am 14. Juli 1998 hinterlegt.
Fig. 3 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von Ll eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid DL436 bei der DSM unter DSM 12311 am 14. Juli 1998 hinterlegt . Fig. 4 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von Ll eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid DL473 bei der DSM unter DSM 12312 am 14. Juli 1998 hinterlegt.
Fig. 5 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von Ll eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid KG80 bei der DSM unter DSM 12313 am 14. Juli 1998 hinterlegt.
Fig. 6 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von Ll eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid TN111 bei der DSM unter DSM 12314 am 14. Juli 1998 hinterlegt.
Vorstehende DNA wurde mit der DNA bekannter Papillomviren verglichen. Es wurden Sequenzhomologie-Studien durchgeführt. Eine Homologie, die weniger als 90 % beträgt, weist eine erfindungsgemäße DNA als neues HP-Virus aus. Die erfindungsgemäßen DNAs weisen zu bekannten Papillomviren folgende Sequenzhomologien auf:
DNA von Fig. 1 78 % zu HP-Virus 61
DNA von Fig. 2 91 % zu HP-Virus 9 (DL 428)
DNA von Fig. 3 77 % zu HP-Virus 17
DNA von Fig. 4 80 % zu HP-Virus 15
DNA von Fig. 5 77 % zu HP-Virus 12
DNA von Fig. 6 81 % zu HP-Virus 12
Bezüglich der DNA von Fig. 2 muß angemerkt werden, daß hier nur ein Teil des offenen Leserasters betrachtet wurde und dieser sich in einer höchstkonservierten Region befindet. Legt man die obige Definition, die sich auf das gesamte Ll- Leseraster bezieht, zugrunde, ist auch hier eine Gesamthomologie von weniger als 90 % zu erwarten.
Erfindungsgemäß kann vorstehende DNA in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEM-T und pGEX-2T. Für die Expression in Hefe sind z.B. pYlOO und Ycpadl zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEF-BOS, cDM8 und pCEV4 , anzugeben sind.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um vorstehende, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E. coli-Stämme HB101, DH1, xl776, JM101, JM 109 und XLl-Blue, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, NH-3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, und Heia.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise vorstehende DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß vorstehende DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid codierenden DNA inseriert werden kann, so daß vorstehende DNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Papillomvirus- Genom, das vorstehende DNA umfaßt. Der Ausdruck "Papillomvirus-Genom" umfaßt auch ein unvollständiges Genom, d.h. Fragmente eines Papillomvirus-Genoms , die vorstehende DNA umfassen. Dies kann z.B. eine für Ll codierende DNA oder ein Teil davon sein.
Zur Bereitstellung vorstehenden Papillomvirus-Genoms kann ein übliches Verfahren verwendet werden. Günstig ist ein Verfahren, das folgende Verfahrensschritte umfaßt:
(a) Isolierung der Gesamt-DNA aus einer Biopsie epithelialen Neoplasmas ,
(b) Hybridisierung der Gesamt-DNA von (a) mit vorstehender DNA, wodurch ein in der Gesamt-DNA von (a) enthaltenes Papillomvirus-Genom nachgewiesen wird, und (c) Klonierung der das Papillomvirus-Genom enthaltenden Gesamt-DNA von (a) in einem Vektor, und gegebenenfalls Subklonierung des erhaltenen Klons, wobei sämtliche Verfahrensschritte üblicher DNA-Rekombinationstechnik entstammen.
Hinsichtlich der Isolierung, Hybridisierung und Klonierung von Zeil-DNA wird ergänzend auf Sambrook et al . , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) verwiesen.
Der Ausdruck " epitheliales Neoplasma" umfaßt jegliche Neoplasmen des Epithelgewebes bei Mensch und Tier. Beispiele solcher Neoplasmen sind Warzen, Kondylome im Genitalbereich und Karzinome der ( Schleim) haut . Letztere werden vorliegend bevorzugt verwendet, um vorstehendes Papillomvirus-Genom zu isolieren.
Der Ausdruck "Vektor" umfaßt jegliche zur Klonierung von chromosomaler bzw. extrachromosomaler DNA geeignete Vektoren. Beispiele solcher Vektoren sind Cosmide, wie pWEl5 und Super Cosl, und Phagen, wie λ-Phagen, z.B. λZAP Expressvector, λZAPII Vector und λgtlO Vektor. Vorliegend werden λ-Phagen bevorzugt verwendet. Vorstehende Vektoren sind bekannt und bei der Firma Stratagene erhältlich.
Erfindungsgemäße Papillomvirus-Genome können integriert in chromosomaler DNA oder extrachromosomal vorliegen. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, dies abzuklären. Auch weiß er um Verfahren, die zur Klonierung der Papillomvirus-Genome optimalen Restriktionsenzyme herauszufinden. Er wird sich an Genomen bekannter Papillomviren orientieren. Insbesondere wird der Fachmann die vorstehend genannten HP-Viren entsprechend beachten.
Beispielhaft wird die Bereitstellung eines mit DL473-G bezeichneten Papillomvirus-Genoms beschrieben. Hierzu wird die Gesamt-DNA aus einer Biopsie eines plattenepithelialen Karzinoms isoliert, mit BamHI gespalten und in einem Agaro- segel elektrophoretisch aufgetrennt. Das Agarosegel wird danach einem Blotting-Verfahren unterzogen, wodurch die DNA auf eine Nitrozellulosemembran übertragen wird. Diese wird in ein Hybridisierungsverfahren eingesetzt, in dem die DNA von Fig. 4, ggfs. in Kombination mit einer DNA von HP-Virus 15 als markierte Probe verwendet wird. Es wird eine Hybridisierung mit der in der Gesamt-DNA vorliegenden Papillomvirus-DNA erhalten.
Im weiteren wird vorstehende mit BamHI gespaltene Gesamt-DNA in einem λ-Phagen kloniert. Die entsprechenden Klone, d.h. die die Papillomvirus-DNA enthaltenden Klone, werden durch Hybridisierung mit der DNA von Fig. 4, ggfs. in Kombination mit einer DNA des HP-Virus 15 identifiziert. Das Insert dieser Klone wird dann einer weiteren Klonierung in einem Plasmid- Vektor unterzogen, wodurch ein Klon erhalten wird, der das Papillomvirus-Genom DL473-G enthält. Das Genom wird durch Sequenzierung bestätigt.
In analoger Weise werden weitere Papillomvirus-Genome bereitgestellt. Sie werden entsprechend der zu ihrer Bereitstellung verwendeten DNAs bezeichnet, mit: DL416-G, DL428-G, DL436-G, KG80-G bzw. TNlll-G.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Protein, das durch vorstehendes Papillomvirus-Genom codiert wird. Ein solches Protein ist z.B. ein Hauptcapsid-Protein (Ll) oder ein Nebencapsidprotein (L2). Die Herstellung eines vorstehenden Proteins erfolgt in üblicher Weise. Beispielhaft wird die Herstellung von Ll bzw. L2 des Papillomvirus-Genoms DL473-G beschrieben. Hierzu wird das zu der DNA von Fig. 4 verwandte HP-Virus 15 herangezogen. Von diesem ist die vollständige Sequenz und die Lage einzelner für Proteine codierender DNA- Bereiche bekannt. Durch parallele Restriktionsspaltungen beider Genome und anschließender Hybridisierung mit verschiedenen, die Ll bzw. L2 codierende DNA betreffenden Fragmenten werden diese DNAs auf derr. Papillomvirus-Genom DL473-G identifiziert. Sie werden durch Sequenzierung bestätigt. Die für Ll codierende DNA wird mit DL473-G-L1-DNA und die für L2 codierende DNA mit DL473-G-L2-DNA bezeichnet.
Im weiteren wird die für Ll bzw. L2 codierende DNA in einen Expressionsvektor inseriert. Beispiele eines solchen für E. coli, Hefe und tierische Zellen sind vorstehend genannt. Insbesondere wird für die Expression in E. coli auf den Vektor pGEX-2T verwiesen (vgl. Kirnbauer, R. et al . , supra) . Nach Insertion der DL473-G-L1- bzw. DL473-G-L2-DNA wird pGEX-2T- DL473-G-L1 bzw. pGEX-2T-DL473 -G-L2 erhalten. Diese Expressionsvektoren exprimieren nach Transformation von E. coli ein Glutathion S-Transferase-Ll- bzw. Glutathion S- Transferase-L2-Fusionsprotein. Die Reinigung dieser Proteine erfolgt in üblicher Weise.
Für eine weitere Expression vorstehender Ll bzw. L2 codierender DNA wird das Bacculovirus- bzw. Vacciniavirus- System genannt. Hierfür verwendbare Expressionsvektoren sind z.B. pEV mod. und pSynwtVI" für das Bacculovirus-System (vgl. Kirnbauer, R. et al . , supra). Für das Vacciniavirus-System sind insbesondere Vektoren mit dem Vacciniavirus "early" (p7.5k)- bzw. "late" (Psynth, pllK) -Promotor zu nennen (vgl. Hagensee, M. , E. et al . , Journal of Virology (1993), Seiten 315-322). Vorliegend wird das Bacculovirus-System bevorzugt. Nach Insertion vorstehender Ll bzw. L2 codierender DNA in pEV mod. wird pEVmod. -DL473-G-L1 bzw. pEVmod. -DL473-G-L2 erhalten.
Der erstere Expres s i onsvekt or alleine bzw. beide Expressionsvektoren zusammen führen nach Infektion von SF-9 Insektenzellen zur Ausbildung von Virus-ähnlichen Partikeln. Im ersteren Fall umfaßt ein solches Partikel ein Ll-Protein, während es im letzteren Fall neben einem Ll- auch ein L2- Protein enthält.
Ein Virus-ähnliches Partikel letzteren Falls wird auch erhalten, indem die vorstehenden DL473-G-L1- und DL473-G-L2- DNAs gemeinsam in den Expressionsvektor pSynwtVI" inseriert werden und das erhaltene pSynwtVI"DL473-G-Ll/L2 zur Infektion von SF-9 Insektenzellen verwendet wird. Die Reinigung vorstehender Virus-ähnlicher Partikel erfolgt in üblicher Weise. Sie stellen auch einen Gegenstand der Erfindung dar.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Protein bzw. Virus-ähnliches Partikel gerichteter Antikörper. Die Herstellung eines solchen erfolgt in üblicher Weise. Beispielhaft wird es für die Herstellung eines Antikörpers beschrieben, der gegen ein Ll von DL473-G umfassendes Virus-ähnliches Partikel gerichtet ist. Hierzu wird das Virus-ähnliche Partikel BALB/c-Mäusen subcutan injiziert. Diese Injektion wird im Abstand von jeweils 3 Wochen wiederholt. Etwa 2 Wochen nach der letzten Injektion wird das den Antikörper enthaltende Serum isoliert und in üblicher Weise getestet.
In bevorzugter Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. Zu seiner Herstellung werden nach vorstehender vierten Injektion den Mäusen Milzzellen entnommen und diese in üblicher Weise mit Myelomzellen fusioniert. Die weitere Klonierung erfolgt ebenso nach bekannten Verfahren.
Mit der vorliegenden Erfindung wird es ermöglicht, Papillomviren, insbesondere in Karzinomen der Haut, nachzuweisen. Hierzu kann die erfindungsgemäße DNA als solche oder von einer weiteren DNA umfaßt eingesetzt werden. Letztere kann auch ein Papillomvirus-Gom oder ein Teil davon sein.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ferner die Bereitstellung von bisher nicht gekannten Papillomviren. Diese finden sich insbesondere in Karzinomen der Haut. Desweiteren liefert die Erfindung Proteine und Virus-ähnliche Partikel, die auf diese Papillomviren zurückgehen. Darüberhinaus werden Antikörper bereitgestellt, die gegen diese Proteine bzw. Partikel gerichtet sind.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es also, diagnostische und therapeutische Maßnahmen bei Papillomvirus-Erkrankungen zu ergreifen. Darüberhinaus liefert sie die Möglichkeit, eine Vakzine gegen Papillomvirus-Infektionen aufzubauen. Die vorliegende Erfindung stellt somit einen Durchbruch auf dem Gebiet der Papillomvirus-Forschung dar.
Die Erfindung wird durch die Beispiele erläutert.
Beispiel 1: Identifizierung des Papillomvirus-Genoms DL473-G
Aus einer Biopsie eines Plattenepithelkarzinoms der Haut wird die Gesamt-DNA isoliert. lO g dieser DNA werden mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und in einem 0,5 % Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Gleichzeitig werden auch lOμg vorstehender DNA aufgetrennt, die nicht gespalten worden ist. Das Agarosegel wird einem Blotting-Verfahren unterzogen, wodurch die DNA aus dem Agarosegel auf eine Nitrozellulosemembran übertragen wird. Diese wird in ein Hybridisierungsverfahren eingesetzt, in dem die vorstehende DNA von Fig. 4 in Kombination mit HP- Virus-15 DNA als p32-markierte Probe verwendet wird. Es wird eine Hybridisierung mit der geblotteten DNA erhalten.
Vorstehende Verfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der DNA-Rekombinationstechnik bekannt. Ergänzend wird auf Sambrook et al . , supra verwiesen.
Beispiel 2: Klonierung des Papillomvirus-Genoms DL473-G
Die aus Beispiel 1 erhaltene Biopsie-DNA wird mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten. Die erhaltenen Fragmente werden in eine Ligasereaktion eingesetzt, in der ebenfalls der mit BamHI gespaltene und dephosphorylierte Vektor λZAP Express vorliegt. Die hierbei erhaltenen rekombinanten DNA- Moleküle werden in Bakteriophagen verpackt und diese zur Infektion von Bakterien verwendet. Für diese Verfahrensschritte wird der von der Firma Stratagene angebotene ZAP Express Vektor Kit verwendet. Die erhaltenen Phagenplaques werden dann einem Hybridis- ierungsverfahren unterzogen, in dem die in Beispiel 1 verwendete p32-markierte DNA von Fig. 4 in Kombination mit p32-markierter HP-Virus-15-DNA verwendet wird. Es wird eine Hybridisierung mit entsprechenden Phagenplaques erhalten. Aus diesen werden die BamHI-Fragmente von DL473-G isoliert und zusammen mit einem BamHI -gespal tenen , de- phosphorylierten Plasmid-Vektor, pBluescript, in eine weitere Ligasereaktion eingesetzt. Die erhaltenen rekombinanten DNA-Moleküle werden zur Transformation von Bakterien, E. coli XLl-Blue, verwendet. Durch Restriktionsspaltungen bzw. Hybridisierung mit vorstehenden DNA-Proben wird ein das Papillomvirus-Genom DL473-G enthaltender Bakte- rienklon identifiziert. Das Plasmid dieses Bakterienklons wird mit pBlue-DL473-G bezeichnet.

Claims

Patentansprüche
DNA, codierend für ein Peptid eines Papillomvirus- Haup t c ap s i d- Pr o t e i s , wobei das Peptid die Aminosäuresequenz von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5 oder Fig. 6, wobei die Figuren 1 - 6 Bestandteil dieses Anspruchs sind, oder eine davon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz umfaßt, und wobei die DNA durch folgende Verfahrensschritte erhältlich ist:
(a) Isolierung der Gesamt-DNA aus einer Biopsie epithelialen Neoplasmas,
(b) Hybridisierung der Gesamt-DNA von (a) mit einer DNA von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5 oder Fig. 6, wodurch ein in der Gesamt-DNA von (a) enthaltenes Papillomvirus-Genom nachgewiesen wird, und
(c) Klonierung der das Papillomvirus-Genom enthaltenden Gesamt-DNA von (a) in einem Vektor sowie Sequenzierung des Klons, und
wobei die DNA eine Homologie von weniger als 90 % zu einer DNA eines bekannten HP-Virus aufweist.
DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptid des Papillomvirus-Hauptcapsid-Proteins codierende DNA die Basensequenz von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5 oder Fig. 6, wobei die Figuren 1 -6 Bestandteil dieses Anspruchs sind, oder eine davon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Basensequenz umfaßt, und wobei die DNA durch folgende Verfahrensschritte erhältlich ist:
(a) Isolierung der Gesamt-DNA aus einer Biopsie epithelialen Neoplasmas,
(b) Hybridisierung der Gesamt-DNA von (a) mit einer DNA von Fig. 1, Fig.
2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5 oder Fig. 6, wodurch ein in der Gesamt-DNA von (a) enthaltendes Papillomvirus-Genom nachgewiesen wird, und (c) Klonierung der das Papillomvirus-Genom enthaltenden Gesamt-DNA von (a) in einem Vektor sowie Sequenzierung des Klons, und
wobei die DNA eine Homologie von weniger als 90 % zu einer DNA eines bekannten HP-Virus aufweist.
3. DNA nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA ein Papillomvirus-Genom umfaßt.
4. Protein, codiert durch das Papillomvirus-Genom nach Anspruch 3.
5. Protein nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Papillomvirus-Hauptcapsid-Protein als Virus-ähnliches Partikel vorliegt.
6. Protein nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus-ähnliche Partikel auch ein Papillomvirus- Nebencapsid-Protein enthält.
7. Expressionsvektor, umfassend eine für das Protein nach Anspruch 4 codierende DNA.
8. Transformante, enthaltend den Expressionsvektor nach Anspruch 7.
9. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 4, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 8 unter geeigneten Bedingungen.
10. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach einem der Ansprüche 4-6.
11. Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1-3 als Reagens zur Diagnose von Papillomvirus-Infektionen bzw. - Erkrankungen.
12. Verwendung des Proteins nach einem der Ansprüche 4-6 als Reagens zur Diagnose, Therapie und/oder Vakzinierung von bzw. bei Papillomvirus-Infektionen bzw. -Erkrankungen.
PCT/DE1999/002824 1998-09-03 1999-09-01 Papillomviren, mittel zu deren nachweis sowie zur therapie von durch sie verursachten erkrankungen WO2000014112A2 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/786,454 US6589532B1 (en) 1998-09-03 1999-09-01 Papilloma viruses, means for the detection thereof and therapy for diseases caused thereby
EP99968672A EP1109893A2 (de) 1998-09-03 1999-09-01 Papillomviren, mittel zu deren nachweis sowie zur therapie von durch sie verursachten erkrankungen

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19840263A DE19840263C1 (de) 1998-09-03 1998-09-03 Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen
DE19840263.5 1998-09-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2000014112A2 true WO2000014112A2 (de) 2000-03-16
WO2000014112A3 WO2000014112A3 (de) 2000-11-09

Family

ID=7879737

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE1999/002824 WO2000014112A2 (de) 1998-09-03 1999-09-01 Papillomviren, mittel zu deren nachweis sowie zur therapie von durch sie verursachten erkrankungen

Country Status (4)

Country Link
US (1) US6589532B1 (de)
EP (1) EP1109893A2 (de)
DE (1) DE19840263C1 (de)
WO (1) WO2000014112A2 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5057823B2 (ja) * 2007-03-31 2012-10-24 テイ・エス テック株式会社 ヘッドレスト及び該ヘッドレストを備えた車両用シート
AU2011258501B2 (en) 2010-05-25 2016-07-07 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995030754A1 (de) * 1994-05-04 1995-11-16 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Für ein peptid eines papillomvirus-hauptcapsid-proteins codierende dna und dessen verwendungen
WO1996030520A2 (en) * 1995-03-30 1996-10-03 Merck & Co., Inc. Synthetic hpv6/11 hybrid l1 dna encoding human papillomavirus type 11 l1 protein
DE19735118C1 (de) * 1997-08-13 1998-08-13 Deutsches Krebsforsch Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995030754A1 (de) * 1994-05-04 1995-11-16 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Für ein peptid eines papillomvirus-hauptcapsid-proteins codierende dna und dessen verwendungen
WO1996030520A2 (en) * 1995-03-30 1996-10-03 Merck & Co., Inc. Synthetic hpv6/11 hybrid l1 dna encoding human papillomavirus type 11 l1 protein
DE19735118C1 (de) * 1997-08-13 1998-08-13 Deutsches Krebsforsch Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERNARD, H.-U. ET AL.: "Identification and assessment of known and novel human papillomaviruses by..." J. INFECT. DIS., Bd. 170, 1994, Seiten 1077-1085, XP000885471 -& DATABASE EMBL [Online] Accession No. U12499, 31. Dezember 1994 (1994-12-31) "Human papillomavirus type 62" XP002141565 -& DATABASE EMBL [Online] Accession No. P50823, 1. Oktober 1996 (1996-10-01) "Major capsid protein L1" XP002141566 *
DELIUS, H. ET AL.: "The genomes of three of four novel HPV types, defined by differences of their L1 genes, show..." VIROLOGY, Bd. 240, Nr. 2, 20. Februar 1998 (1998-02-20), Seiten 359-365, XP000882955 *
FIRZLAFF, J.M. ET AL.: "Detection of human papillomavirus capsid antigens in various squamous epithelial lesions using antibodies directed against the L1 and L2 open reading frames" VIROLOGY, Bd. 164, 1988, Seiten 467-477, XP000882959 *
PEYTON, C.L. AND WHEELER, C.M.: "Identification of five novel human papillomavirus sequences in..." J. INFECT. DIS., Bd. 170, 1994, Seiten 1089-1092, XP000885468 -& DATABASE EMBL [Online] Accession No. U12480, 26. November 1994 (1994-11-26) "Human papillomavirus isolate CP8304 L1 protein gene, ..." XP002141567 -& DATABASE EMBL [Online] Accession No. Q84235, 1. November 1996 (1996-11-01) "L1 protein" XP002141568 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000014112A3 (de) 2000-11-09
DE19840263C1 (de) 2000-05-25
EP1109893A2 (de) 2001-06-27
US6589532B1 (en) 2003-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0809700B1 (de) Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung
DE69836753T2 (de) Papilloma virus capsomere impfstoff-formulierungen und deren verwendungen
DE69333859T2 (de) Sich selbst-zusammenbauende rekombinante hpv16 papillomavirus hüllproteine
DE69629556T2 (de) Synthetisches, hpv6/11 hybrides l1 dns, das für menschliches papillomavirus typ 11 l1-protein kodiert
JP2755574B2 (ja) 乳頭腫ウイルスの特徴を示すポリペプチドを含む組成物
EP0342128A1 (de) Sonden für Papilloma-Virus (HPV49, HPV50, HPV54, HPV55), zu diesem Papilloma-Virus genetisch und immunologisch verwandte Produkte und in vitro Methoden zur Diagnose von Papilloma-Virusinfektionen und Herstellung von Antikörpern gegen diese Papilloma-Viren
DE69531308T2 (de) Verfahren zur Herstellung von gereinigten papillomavirus Proteinen
DE69631586T9 (de) Für menschliches papillomavirus stamm 18 kodierende dns
DE4415743C2 (de) Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen
DE19526386C1 (de) Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen
DE69933875T2 (de) Protein-verabreichungssystem, das dem menschlichen papillomavirus ähnliche partikel benützt.
DE19648962C1 (de) Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen
DE19735118C1 (de) Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen
DE19712541C1 (de) Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen
DE19840263C1 (de) Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen
DE4447664C2 (de) Fusionsproteine, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Anwendung
WO1997002491A1 (de) Nachweisverfahren für spezifische, gegen hpv-proteine gerichtete antikörper
DE4332596A1 (de) Monoklonale Antikörper
FR2656627A1 (fr) Sonde a papillomavirus (hvpv63), notamment pour le diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus, pouvant s'accompagner de neoplasies genitales, et produits genetiquement et immunologiquement lies a ce papillomavirus.
DE19905883C2 (de) Chimäre Virus-ähnliche Partikel bzw. chimäre Capsomere von BPV
DE19526752A1 (de) Hocheffiziente Bildung von Papillomavirusähnlichen Partikeln

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1999968672

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09786454

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1999968672

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1999968672

Country of ref document: EP