WO2000009147A1

WO2000009147A1 - Agent de regulation du taux de glycemie

Info

Publication number: WO2000009147A1
Application number: PCT/JP1999/004322
Authority: WO
Inventors: Tsutomu Nakagawa; Mutsuo Taiji; Chikao Nakayama; Hiroshi Noguchi
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
Priority date: 1998-08-11
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2000-02-24
Also published as: AU5195699A; EP1106182A4; CN1314819A; CA2339833A1; KR20010072354A; EP1106182A1

Description

明細書血糖値調節剤技術分野

本発明は、インスリン治療を必要とする糖尿病患者の血糖値を調節するまたは正常値に近づけるための医薬に関する。さらに詳しくは、インスリン受容体ァゴニストおよびニューロトロフィンを有効成分とするインスリン治療を必要とする糖尿病患者の血糖値調節剤、該 2成分の該血糖値調節剤の調製への使用、および該 2成分を用いたインスリン治療を必要とする患者の血糖値を正常域に調節する方法に関する。

背景技術

糖尿病は成因から 1型、 2型と分類される。 1型糖尿病は、ウィルス感染ゃ自己免疫反応などによって引き起こされる降臓ランゲルハンス氏島細胞の脱落により、インスリンの分泌が減少して生じる糖尿病である。一般的に若年発症型糖尿病はこのタイプで、ケトーシス傾向が強く、生命に危険が及ぶ可能性もある。また、慢性的な高血糖状態の持続は細小血管の障害に伴う合併症、例えば糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害などを引き起こす原因になる。

2型糖尿病は、近年生活水準の向上による食生活の欧米化、運動不足傾向の増加により、患者数が増加している。 2型糖尿病の場合も高血糖状態が続くことにより、各種合併症を引き起こすことは 1型糖尿病の場合と同様である。

現在、臨床で実施されている糖尿病患者の治療法としては、 1型糖尿病患者の場合はィンスリン投与が中心である。近年は、「厳格な血糖コントロールが糖尿病性合併症の発症予防に有効」との報告に基づき、インスリンを頻回注射するィンスリン強化療法が積極的に取り入れられている（日本臨床 5 5巻' 1 9 9 7年増刊号 p . 2 4 9— 2 5 4 )。し力、し、インスリン療法にも問題が有り、頻回注射を行うことは、患者にとって大きな負担である。更にインスリンが過剰に作用した場合の低血糖が問題になっている（日本臨床 5 5卷 · 1 9 9 7年増刊号 p . 2 4 3— 2 4 8 )。また、インスリン強化療法を受けた患者では心筋梗塞などの大血管障害を発症する割合が高かったとの報告もある（N. En g l. J. o f M e d.， v o l.329, p.977 (1 993))。 2型糖尿病患者に対する治療としては、食事 ·運動療法が基本的に行われ、必要に応じて SU剤、ビグアナイド剤などの経口血糖降下剤が投与される。し力、し、これらの治療が行われても、糖尿病が進行すると十分な血糖コント口一ルができない場合が多い。このような患者に対してはインスリンが使用される（日本臨床 55卷' 1997年増刊号 p. 233— 237)。また、近年では 2型糖尿病患者に対して、糖尿病発症初期から積極的にインスリン治療を行うケースも増加している。このように 2型糖尿病患者に対するインスリンの有用性が再認識されつつある。し力し、インスリン投与による、コンプライアンスの低下、低血糖の惹起、大血管障害の発症などの問題があることは、 1型糖尿病の場合と同様である。

この様な、インスリン療法の欠点を補うために、インスリンとは逆の作用である、血糖値増加作用を有するソマトスタチン誘導体（US 4， 703, 034)、ァミリンァゴニスト、 AC 1 37 (US 5, 175, 145)のような生理活性物質とインスリンとの併用が検討されている。

神経栄養因子は、生体内で標的細胞あるいは神経およびグリア細胞 ·シュワン細胞から供給され、神経細胞の生存維持、分化促進などの作用を示す蛋白質である。神経栄養因子は、作用する神経の種類や受容体によって、分類されている。その中で、ェユーロトロフィンとして知られる蛋白群は互いに相同性が高い。二ユーロトロフィンとしては、 NGF (神経成長因子）、 BDNF (脳由来神経栄養因子）、 NT— 3 (ニューロトロフィン 3)、 NT— 4 5などが知られている。また、ニューロトロフィンは、 P— 75および t r k遺伝子産物である受容体 (t r kA、 t r kBおよび/"または t r kC)の特異的リガンドとして作用することが知られている（野々村健、畠中寛；実験医学第 13巻 376頁（1 99 5年)）。

NGF、 BDNF等のニューロトロフィンは従来より、 A L Sなど神経変性疾患に対する治療剤として研究されている。 J o u r n a l o f Ne u r o p a t h o l o g y a n d Ex p e r i me n t a l Ne u r o l o g y, v o 1.56, p. 1 290 (1997) A. P. Mi z i s i n他、には、糖尿病性の末梢神経障害に対する B D N Fの作用が示されている。この文献は B D N Fがインビボに於ける運動神経伝達速度の低下を軽減するという知見から、糖尿病性の末梢神経障害の効果を示唆したものである。

また、以下に列挙する報告において、神経栄養因子の血糖値に対する影響が報告されている。

(1) Ex p. Ne u r o l o g y, v o l. 1 31, p. 229 (1995)， P a 1 l e y— mo un t e r MA e t a 1.

BDNFの食欲抑制効果を正常マウスで検討している。 BDNFの投与により、血中ィンスリンの値が下がり、食欲や体重はともに減少する、血糖値は下がらないと記載されている。

(2) Cy t o k i n e, v o l . 7, p. 150 (1995) F a n t u z z i , G e t a 1.

正常マウスに対する C N T F (毛様体神経栄養因子）の影響を報告している。 C NT F投与により、マウスの食欲と体重が減少し、血糖値が下がると報告している。 CNTF I L—1、 I L_ 6など他のサイト力インファミリーで見られる炎症惹起作用のメカニズム解明を目的とした論文であり、糖尿病との関係は示唆されていない。

(3) P r o c Na t l . Ac a d. S c i.USA, v o l . 94, p.645 6 (1 997) G l o a g u e n, I e t a 1.

およひ" WO 98/221 28 : I s t i t u t e d i R i c e r c h e d i

B i o 1 o g i a Mo 1 e c o 1 a r e P. A n g e 1 e t t i S . P. A ( 1

998.5.28公開）

肥満糖尿病モデル動物である d b/d bマウスに CNTFを投与し、その体重や食欲の減少および血糖値低下作用を報告している。 WO 98/221 28では、「C NT F受容体活性化物質を投与する肥満症あるいは肥満に伴う糖尿病の治療法」が開示されている。しかし、これらの文献には、 1型糖尿病に関する効果や、インスリンとの併用についての記載は無い。

(4) B i o c h e m. B i o p h y s. Re s. Co mm u n . , Vo l. 238 p.633 (1 997) On o, M e t a 1. 肥満糖尿病モデル動物である d b / d bマウスにおいて、 B D N Fや NT— 3 の投与が、単なる摂食量低下に起因する以上に高血糖を抑制し、正常マウスレべルにまで下げることを報告している。また、ストレブトゾトシンを投与して、鸱臓細胞を破壊し、インスリン分泌の低下した糖尿病モデルラットにおいては、 B D N F単独投与では効果が認められなかつたと報告している。

1型糖尿病及び 2型糖尿病の治療において重要な、インスリン投与による血糖値コントロールをより安全かつ確実に行うための医薬、コンプライアンスを改善し、低血糖ショック、大血管障害などの副作用を起こしにくい血糖降下剤が、医療現場で求められている。

発明の開示

本発明の目的は、インスリンの効果を増強しつつ、低血糖ショックなどの副作用発現のリスクを和らげることができ、コンプライアンスの改善も可能とする、新規な血糖値調節剤を提供することである。

本発明の他の目的は、インスリン受容体ァゴニストおよびニューロトロフィンを有効成分とするィンスリン治療を必要とする糖尿病患者の血糖値を調節する薬剤を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、該 2成分を該血糖値調節用薬剤の調製への使用を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、インスリン治療を必要とする糖尿病患者に、インスリン受容体ァゴニストおよびニューロトロフィンを同時にまたは別々に投与することにより、副作用の発現を抑えて、血糖値を正常域に調節する方法を提供するものである。

本発明者らは、単独投与で 2型糖尿モデル動物に対して顕著な血糖降下作用を示すが、正常レベル以下には下げない B D N Fの作用に注目し、インスリン分泌の低下した糖尿病モデルを用いて、インスリンとの併用効果を検討した。その結果、（1 ) B D N Fは、インスリン分泌の低下した糖尿病モデルにおいて、単独では十分奏功しない程度の用量のィンスリンと併用すれば、その効果を増幅して好ましい血糖値低下をもたらす、（2 )この作用は、単なる相加 Z相乗的なものではなく、より大量のインスリンと B D N Fを併用すると、上記増幅作用は小さくなつて、むしろ正常値以下への血糖降下を起こさない、ことを見いだし、検討を重ね、本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明は、下記の特徴を有するものである。

[1]インスリン受容体ァゴニストおよびニューロトロフィンを有効成分とするィンスリン治療を必要とする糖尿病患者の血糖値調節剤。

[2]ニューロトロフィンが脳由来神経栄養因子（BDNF)である [1]の血糖値調節剤。，

[ 3 ]インスリン受容体ァゴニストがィンスリンである [ 1 ]の血糖値調節剤。

[4]インスリン治療を必要とする糖尿病患者がィンスリン依存型糖尿病患者である [1]の血糖値調節剤。

[5]インスリン受容体ァゴニストおよび、 t r kA、 t r kBおよび Zまたは t r k C受容体ァゴニストを有効成分とするィンスリン治療を必要とする糖尿病患者の血糖値調節剤。

[6]ニューロトロフィンを有効成分とするインスリン療法の補助剤。

[7]インスリン受容体ァゴニストおよびニューロトロフィンの、インスリン治療を必要とする糖尿病患者の血糖値調節剤の調製における使用。

[8]インスリン治療を必要とする糖尿病患者に、インスリン受容体ァゴニストぉよびニューロトロフィンを同時にまたは別々に投与することを特徴とする、糖尿病患者の血糖値を正常域に調節する方法。

図面の簡単な説明

第 1図は S T Z誘発糖尿病マウスにおけるインスリン投与量と血糖降下作用の関係を示すダラフであり、縦軸は血糖値、横軸はィンスリン投与後の時間を示す。翁はインスリン 0単位 Zk g投与群（n = 6)、画はインスリン 0. 5単位/ 8投与群（₁1=6)、 ▲はインスリン 1. 5単位 Zk g投与群（n = 6)、〇はィンスリン 5.0単位/ k g投与群（n = 6)の各時点における平均血糖を示す。

*、 **はそれぞれ Tu k e yの検定により、インスリン 0単位 Zk g投与群に対して P<0.05、 P< 0.01の有意差があることを示す。

第 2図は S T Z誘発糖尿病マウスにおける B D N Fと低用量ィンスリンの併用効果を示すグラフであり、縦軸は血糖値、横軸はインスリン投与後の時間を示す。秦は D— PBS+生理食塩水投与群（n = 10)、口は BDNF+生理食塩水投与群（_n = 10)、 ▲は D— PBS+インスリン投与群（n = l 0)、 ◊は BDN F +インスリン投与群 (n = 9)の各時点における平均血糖値を示す。 * *は T u k e yの検定により、 D— PBS+インスリン投与群に対して、 Pく 0.01の有意差があることを示す。

第 3図は S T Z誘発糖尿病マウスにおける B D N Fと高用量ィンスリンの併用効果を示すグラフであり、縦軸は血糖値、横軸はインスリン投与後の時間を示す。（a)：厶は0— PBS+インスリン 1. 5単位 Zk g投与群（n = 6)、園は 801^?+ィンスリン1.5単位 Zk g投与群（n = 6)の各時点における平均血糖直を示す。（b) ：〇は D— PB S+インスリン 4. 5単位ノ k g投与群（n =

6)、 ♦は BDNF+インスリン 4. 5単位 Zk g投与群（ n = 6 )の各時点における平均血糖値を示す。それぞれのインスリン投与量において、 D— PBS投与群と B DNF投与群の間の血糖値に有意な差は認められなかった。

発明を実施するための最良の形態

以下、本明細書における用語の意味あるいは定義について述べる。

「インスリン治療を必要とする糖尿病患者」とは、インスリン作用不足によりィンスリン投与が必要な患者を意味する。詳しくは、 1型糖尿病患者及び 2型糖尿病患者で、インスリン依存状態にあり、あるいはインスリン作用不足により高血糖状態の是正のためインスリン投与が必要な患者を意味する。例えば、隊臓] 3 細胞が障害を受ける等の理由で、インスリンが正常に分泌されなくなった結果、高血糖を呈する患者等を意味する。

「インスリン受容体ァゴニスト」とは、インスリン受容体に結合して、同受容体を活性化させ、血糖値降下をもたらす物質の総称である。具体的には、天然型ヒトインスリン、速効型インスリン改変体 LY 275585などのインスリン改変体、 I G F— 1等が挙げられる。インスリン、 I G F— 1の改変体は、天然型のァミノ酸配列を公知の手法にてァミノ酸残基が置換、欠失あるいは付加された一次構造を持つタンパクであり、インスリン受容体結合能おょぴ活性化能を有する限り、本発明における「インスリン受容体ァゴニスト」の概念に含まれる。また、より低分子のペプチドや有機化合物も、インスリン受容体結合能および活性化能を有する限り、本発明における「インスリン受容体ァゴニスト」の概念に含まれる。

「ニューロトロフィン」とは、生体では、神経成長の標的となる細胞から分泌され、または自己分泌や傍分泌により神経 (ニューロン）の成長、分化、生存を助けて、神経回路（シナプス）を形成させる神経栄養因子を意味する。具体的には、脳由来神経栄養因子 (以下、 BDNFと略す）、神経成長因子（以下、 NGFと略す）、ニューロトロフィン 3 (以下、 NT— 3と略す）、ニューロトロフィン 4 (以下、 NT— 4と略す）、ニューロトロフィン 5 (以下、 NT— 5と略す）、ニューロト口フィン 6 (以下、 NT— 6と略す)等が挙げられる。

「インスリン治療を必要とする患者の血糖値調節剤」とは、 1型糖尿病、あるいは 2型糖尿病患者で、ィンスリン治療の対象となる患者の血糖値を正常域にコントロールするために用いる医薬を意味する。正常域血糖値は、臨床検査基準によれば、グルコース 75 g負荷 2時間後で 20 Omg/d 1以下、空腹時血糖値力 Sl 40mgZd l以下、特に 100〜120mgZd 1の範囲である。本発明の血糖ィ直調節剤は、ときには空腹時血糖値 40 Omg/d 1を越える患者の血糖値を 200mgZd 1以下に下げ、かつ 70mgZd 1以下には下げないという、安全カゝっ持続的な正常域血糖値調節を可能とする薬剤である。

尚、最近訂正された糖尿病の判断基準によると、糖尿病域の血糖値は、ダルコース 75 g負荷 2時間後で 20 Omg/d 1以上、空腹時血糖値が 1 26mg/ d 1以上の範囲である。

「t r kA、 t r kBおよび Zまたは t r kC受容体ァゴ-スト」とは、「二ユーロトロフィン」の受容体として知られる t r k遺伝子発現産物のうち、 t r kA、 t r kBまたは t r k Cに結合してこれらの受容体を活性化させ、作用を発現させる物質の総称である。具体的には既知のュユーロトロフィンとして t r kAに結合する NGF、 t r k Bに結合する BDNF、 NT— 4、 t r kCに結合する NT— 3等が挙げられる。この概念にはそれぞれの「ニューロトロフィン」の改変体 (アミノ酸置換、欠失、付加改変体）のみならず、より低分子のぺプチド、有機化合物も t r k A、 t r k Bまたは t r k C受容体に対する結合能および活性化能、例えばチ口シン残基のリン酸化など、を有する限り、「 t r k A、 t r kBおよび/または t r kC受容体ァゴニスト」の概念に含まれる。

「インスリン療法の補助剤」とは、インスリン治療を受けている 1型糖尿病患者あるいは 2型糖尿病患者に予め、あるいはインスリンと同時に投与することにより、（1)インスリン投与量、投与頻度の低減効果および（2)インスリンの効きすぎによる危険な低血糖を予防する効果、を発現する薬剤である。（1)の効果は、生体の細胞のィンスリン感受性を高めるなどの薬理機序により、インスリン作用をより強く発現させるという「インスリン作用増強作用」と同義であり、特に、単独投与では十分血糖降下作用が現れない程度の低用量のィンスリンと共に投与した場合に発現する。（2)の効果は、単独投与で十分な血糖降下作用が得られるような高投与量のィンスリンと併用した場合に発現する。

(製造方法とアツセィ方法）

本発明のィンスリン治療を必要とする患者の血糖値調節剤またはィンスリン療法の補助剤に用いるニューロトロフィン（NG F、 BDNF、 NT— 3、 NT— 4など）は、それぞれの固有の生理活性を示すもので有れば、天然抽出品、遺伝子組換え品を問わず、精製して本発明に使用することができる。例えば、 BDN Fの場合、 B a r d e， Y. Eら（Th e EMBO J., v o l . 5, p. 549 —553 (1 982))によって、ブタ脳から単離され、その後クローユングで、 1 1 9個のアミノ酸から成る一次構造が解析されたものであるが（L e i b r o c k , J e t . a 1. ： N a t u r e , v o l . 34 1, p. 149 (1 98 9))、 N末端にメチォニン残基を有する Me t— BDNF、現在公知の手法にて上記の天然配列の一部を置換、欠失あるいは付加して作成した組換え B DN F改変体も、 BDNF活性を有する医薬製剤である限り、本宪明に含まれる。

BDNF活性とは、後根神経節、迷走神経下神経節、運動ニューロン、網隱経節、黒質ドーパミン作動性ニューロン、前脳基底野コリン作動性ニューロン等の生存維持'分化促進作用などを意味する。この生体での作用は、 i n v i t r oまたは i n v i v oで確認する事ができる（特開平 5— 328974、 US P 5, 180, 820)。

BDNFの製造方法は種々報告されており、何れの製法による BDNFも本発明の製剤に用いることができる。動物組織からの抽出品の場合、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば良い（Th e EMBO J., v o l . 5， p.549 (1 982))。また、 B D N Fを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物 (培養上清、培養細胞)から分離精製して BDNFを得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により BDNFをコードする遺伝子を適切なベクタ一に組み込み、これを適切な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換え BDNFを得ることができる（例えば、 P r o c. Na t l . Ac a d. S c i. USA, v o l . 88, p. 961 (1 991)、 B i o c h em. B i o p h y s. Re s. C o mm u n . v o l . 1 86， p. 1 553 (1 992))。遺伝子工学的手法は均質かつ大量の B D N Fの製造に好適である。上記宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、植物又は動物細胞を用いることができる。他のニューロトロフィンの NGF、 NT- 3 , NT— 4等についても、遺伝子組換え品の製造が報告されている。 NGFは BDNFと同様に、種々の宿主細胞で発現させ、製造することができる（CHO細胞： S c hme 1 z e r C. H. , J . Ne u r o c h em i s t r y, v o l . 59, p. 16

75 (1992) 大腸菌：日本特許 2637392号）。 NT— 3は BDNFと同様に、種々の宿主細胞で発現させ、生産することができる。 Ne u r o n, v o 1.4， p.767 (1990)、あるいは特開平 5—161493 (WO 91/3 569)にその製法、アツセィ法が開示されている。 NT— 4は BDNFと同様に、種々の宿主細胞で発現させ、製造することができる。 P r o c. Na t l .

Ac a d. S c i. USA, v o l . 89, p. 3060 (1 992)、特表平 7-509600 (WO 93/25684), あるいは特表平 6— 50161 7 (WO 92/05254)に組換え NT— 4の発現方法およびアツセィ方法が記載されている。

ニューロトロフィンと組み合わせて使用するインスリン受容体ァゴニストのうち、インスリンを主成分とするものは、既に多くの医薬が市販されている。具体的には、動物由来インスリン「イスリジン」清水製薬一武田薬品工業、組換えヒトインスリン「ノボリン R」ノボノルディスク一山之内、同「ヒユーマリン R」日本ィーライリリー、ほか結晶性ィンスリン亜鈴水性懸濁注射液、イソフェンィンスリン水性懸濁注射液、プロタミンインスリン亜鉛水性懸濁注射液など（ 0本医薬品集、日本医薬情報センター編、 1 9 9 7年 1 0月版、 2 0 3〜2 0 6頁）が挙げられる。また、 I G F— Iは「ソマゾン」として藤沢薬品より市販されてレヽる。

(製剤）

製剤としては、注射剤、経口剤、液剤、凍結乾燥品いずれも用いることができる。特に皮下投与用注射製剤が好ましい。非経口投与製剤には、当該分野にて公知の安定化剤、担体を用いることができ、使用時に等張溶液として用いるのが好ましい。医薬担体としては、例えば、アルブミン等の血漿由来蛋白、グリシン等のアミノ酸、マンニトール等の糖を用いることができる。また、水溶製剤、凍結乾燥製剤として使用する場合、凝集を防ぐために T w e e n 8 0などの界面活性剤を添加するのが好ましい。最も簡便には、市販のインスリン皮下投与用液剤にニューロトロフィンを溶解して、本発明の皮下投与用液剤を作ることができる。長期の薬効を要する場合は、生体内分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸—ポリグリコール酸重合体）を用いたマイクロスフェアタイプの徐放性製剤担体を用いて製剤する事も可能である。

本発明の血糖値調節剤においては、有効成分のィンスリン受容体ァゴニストとニューロトロフィンとを同時に投与してもまた別々に投与してもよく、したがつて、同時投与では両性分を含有する製剤とすることができ、あるいは、両成分を別々に製剤化し、キット形態とすることもできる。例えば、各々凍結乾燥品とし、これらと溶角翠液とのキットとし、用時溶^^して用いてもよく、あるいは一方の成分の溶液製剤と他方の成分の凍結乾燥製剤とのキットとし、用時両者を混合、溶解させて用いてもよいし、両成分を各々溶液剤の組合せとし、用時混合することもできる。

また、両成分を別々に投与する場合には、上記のようなキット製品とし、各々を別々に投与してもよく、あるいは、一方の成分の市販品と他方の成分の製品とを組合せて用いることもできる。

(主剤配合比）有効成分であるインスリン受容体ァゴニストとニューロトロフィンの配合比は自由に設定でき、公知の動物実験あるいは臨床治験にぉレ、て適当な配合比を決定することができる。インスリンと BDNFを含有する皮下注射製剤の場合、インスリン 1単位に対し、 BDNF0.01〜； 100 m gを配合することができる。本発明の血糖値調節剤では、ィンスリン受容体ァゴニストおよびニューロト口フィンを、それぞれ、一日投与量に適合した用量にて配合した製剤とすることができ、例えば、インスリン受容体ァゴニスト 0. 1〜1000単位（ヒトインスリンに換算して、以下同じ）、およびニューロトロフィン 0.6 // g〜7200mg を含有する製剤、好ましくはィンスリン受容体ァゴニスト 4〜 100単位およびニューロトロフィン 6 μ g〜300 Omgを含有する製剤とすることができる。これらは、上述の如く、同一製剤中に配合してもよく、また別々の製剤中に含有させることもできる。

(使用方法）

本発明の血糖値調節剤は、基本的には公知のィンスリン製剤と同様にして、ィンスリン治療を必要とする患者に投与することができる。基本的に'は、インスリン受容体ァゴ-スト投与量は、ヒトインスリンに換算して、 0. 1〜1000単位ヒト /日相当、好ましくは 4〜100単位/ヒト日相当、これと同時にあるいは予め投与される-ユーロトロフィンの一日用量は、約 0.01 // g〜l 2 Omg/k g/d a y , 好ましくは 0. l /i g〜50mg ^/k gノ d a yであり、適宜、皮下、静脈内あるいは筋肉内注射によって投与することができる。

また本発明の血糖値調節剤では、前述したように、両活性成分を同時にまたは別々に投与することができる。したがって、本発明の血糖値調節剤を用いたインスリン治療を必要とする糖尿病患者の治療に際しては、ィンスリン受容体ァゴニストおよび-ユーロトロフィンの上記一日用量を、該患者に対して、同時にまたは別々に投与する。好ましくは-ユーロトロフィンの一日用量を一回で、または 2〜 3回に分割して投与し、ついでインスリン受容体ァゴニストの一日用量を一回で、または 2〜 3回に分割して投与する。

(毒性）

一般的に、インスリン製剤は、糖尿病初期は、 4〜 20単位を食前皮下注、以後、症状に合わせて 4〜 80単位 _/ ヒト Z日を用いる。ケースバイケースではあるが、およそ 1 00単位ヒト /日までは、臨床的に安全が確認されている。二ユーロトロフィン、特に BDNFの場合、ラットおよび力二クイザルで、それぞれを 100mgZk g、 6 Omg/k gの皮下投与を 4週間実施したが、死亡例はなく、また、急性毒性の点にっレ、ても、ラットおよび力二クイザルで 200m gZk g以上の投与量でも死亡の発現は無く安全性は高い。他のニューロトロフインについても、特に重篤な副作用は報告されていない。

以下、本発明を実施例にて説明する。

実施例：

インスリン分泌の低下した糖尿病モデルに対する B D N Fとインスリンの併用効果

(1)実験材料と方法

試薬 ·· B D N Fはリジエネ口ン社より購入して使用した。生理食塩水（大塚製薬）、 D— PBS (G I BCO)、インスリン（ノボリン U注 100 (登録商標)）、ストレプトゾトシン（シグマ）は市販品を購入して使用した。その他の試薬は市販の特級試薬を用いた。

実験動物：雄性 C57BL/6NC r jマウス（ S P F規格）を日本チヤ一ルス . リバ—より購入した。 1週間の予備飼育の後、 7あるいは 8週齢で実験に使用した。マウスは飼育環境として温度は 23 ± 2°C、湿度は 55 ± 10 %に設定され、照明は 8 ： 00〜20 ： 00点灯、 20 ： 00〜8 ： 00消灯のサイクルに設定された部屋で飼育した。予備飼育中は固形飼料（CE— 2、日本クレア）および滅菌水道水を自由摂取させたが、実験に供する際には必要に応じて絶食処置を施した。

(2)ストレプトゾトシン（STZ)、 BDNF、インスリン投与液の調製

S TZを 1 OmMクェン酸ナトリウム水溶液（pH 5. 5)に溶解し、 20mg

/m lの溶液を調製した。なお、 STZ溶液は用時調製し、溶解後 5分以内に使用した。 BDNF投与液は D—PB S (G i b e o社）で 2mg/m 1に希釈し、実験に供した。インスリン投与液は持続型インスリン（ノボリン U注 100)を生理食塩水で希釈して実験に供した。 (3) STZ投与によりインスリン分泌が低下した糖尿病モデル動物での高血糖動物の選別と群分け

予備飼育の完了したマウスに（2)で調製した STZ溶液を 10 // 1 /g体重の割合（STZとして 20 OmgZk g)で腹腔内に投与した。翌日に再度 STZ溶液の投与を行った。 2回目の STZ投与の 3日後、全個体の血糖値および体重を測定し、その結果に従って、群分けを行った。この時、高血糖になっていないマウス（S O OmgZd 1以下）、明らかに状態の悪いマウスは実験から除外した。

( 4 )血糖直の測定方法および統計解析

血糖値は尾静脈より採取した血液を用いて、アントセンス I I血糖測定装置 (三共 ·バイエノレ社）により測定した。測定した血糖ィ直について、 T u k e yの検定を行った。

( 5 )インスリン単独投与での血糖降下

STZ誘発糖尿病マゥスに対する、インスリン投与量とその血糖降下作用の関係を検討した。 STZ投与により高血糖を惹起したマウスをその血糖値おょぴ体重を指標に 4群に群分けした (各群 6匹)。各群にインスリンを 0、 0. 5、 1. 5、 5.0単位 k gの割合で皮下投与し、投与後 1時間ごとに 4時間後まで血糖ィ直を測定した。なお、インスリン投与後は絶食措置を施した。各測定時間ごとの各群の血糖ィ直を第 1図に示す。ィンスリン投与による用量依存的な血糖降下作用が確認されたが、インスリン 0.5単位 Z k g投与群（画）では、インスリン 0単位投与群 (すなわち、ィンスリン無投与群）（秦）に比し、投与 1時間後に有意な血糖値低下が見られたものの、平均 400mg/d 1以上の血糖値が約 30 Omg, d 1に下がったに過ぎず、 2時間後には、血糖値はほぼ元のレベルに戻った。しかし、インスリン 1. 5単位/ k g投与群（▲)およびインスリン 5.0単位/ k g 投与群（〇）のようなより高用量のィンスリン投与群では顕著な血糖値降下が認められた。

(6)BDNFとインスリンの併用効果 1 ：低用量インスリンに対する作用増強

S T Z誘発糖尿病マゥスに対する、 B D N Fとインスリンの併用効果を検討した。 STZ投与により高血糖を惹起したマウスをその血糖および体重を指標に 4群に群分けした（9あるいは 10匹/群)。第一群： D— PBS+生理食塩水投与群（n=l 0)、第二群： 20mg/k gBDNF+生理食塩水投与群（n=l 0)、第三群： D—PBS + 0.5単位 gインスリン投与群（n= 10)、第四群： 20mgZk gBDNF + 0.5単位 Zk gインスリン投与群（n = 9 )。 B D N F (または D— P B S )はインスリン（または生理食塩水）投与の 1時間前に投与し、インスリン (または生理食塩水)投与後 1時間ごとに 4時間後まで血糖値を経時的に測定した。なお、 BDNFあるいは D— PBS投与後、動物は絶食措置を施した。各測定時間ごとの各群の血糖値を第 2図に示す。

その結果、 BDNF 2 OmgZk g+生理食塩水投与群（口）では、有意な血糖降下作用は認められなかつた。一方、 D—PBS + 0. 5単位, k gインスリン投与群（▲)ではィンスリン投与後 1、 2時間後の血糖値は約 S S OmgZd lにまで低下した。 2 OmgZk g BDNF + 0.5単位/ k gインスリン投与群 (〇）では、インスリン投与後 1、 2時間後の血糖値は、それぞれ、約 210、 2 2 Orng/d 1と顕著な降下が認められ、かつ、 D— PB S + 0. 5単位 Zk g インスリン投与群と比較しても有意な血糖降下作用が観察された。すなわち、単独投与では十分な効果が見られないィンスリン低用量投与群において、 BDNF 前処理により明らかなィンスリン作用増強が認められた。

(7)BDNFとインスリンの併用効果 2 ：高用量ィンスリンに対する作用

STZ誘発糖尿病マウスに対する、 BDNFと高用量インスリンの併用効果を検討した。 STZ投与により高血糖を惹起したマウスをその血糖値および体重を指標に 4群に群分けした（6匹 Z群)。第一群： D— PBS+1. 5単位 gィンスリン投与群、第二群： 2 Omg/k gBDNF+1. 5単位/ k gインスリン投与群、第三群： D— PBS + 4.5単位/ k gインスリン投与群、第四群： 2 Omg/k g BDNF + 4.5単位 Zk gインスリン投与群。 BDNF (または D— P B S )はインスリン投与の 1時間前に投与し、ィンスリン投与後 1時間ごとに 4時間後まで血糖値を経時的に測定した。なお、 BDNFあるいは D—PB S投与後、動物は絶食措置を施した。各測定時間ごとの各群の血糖値を第 3図に示す。第 3図中、（a)はインスリン 1.5単位 Zk gを併用した場合、（b)はィンスリン 4.5単位/ k gを併用した場合を示す。

第 3図（a)、（b)に示されるとおり、 D—PBS + 1. 5単位 gインスリン投与群（△)、 2 Omg/k gBDNF+1. 5単位 Zk gインスリン投与群— (画）、 D-PB S + 4.5単位/ k gインスリン投与群（〇）および 2 Omg/k g BDNF + 4.5単位// k gインスリン投与群（令）の！/、ずれも顕著な血糖値の降下が認められたが、 D— P B S投与群と B DNF投与群の間では有意な差は認められなかった。

(製剤例 1 )

本発明の血糖値調節剤のうち、代表的なものであるインスリンおよび B D N F 含有皮下投与用水溶製剤は、以下のように製造することができる。

(1)インスリン 100単位、精製組換え BDNF 2 Omgに対し、マンニトール 10 m g、非ィオン性界面活性剤（ポリソルベート 80 ) 0. 1 m gをカロえ、燐酸緩衝液 1 m 1 (pH7.0、 10mM)に溶解させる。

( 2 )山之内製薬株式会社製ィンスリン注射製剤「ノボリン U注 100」遺伝子組換えヒトインスリン 1000単位ノ1 Om 1に、 BDNF 1 Omgを溶角早させる。 (製剤例 2)

本発明のインスリン療法補助剤のうち、代表的なものである BDNF含有注射用液剤は、精製組換え BDNF 2 Omgに対し、マンニトール 1 Omg、非ィォン性界面活性剤（ポリソルベート 80) 0. 1mgを力 Bえ、燐酸緩衝液 1ml (pH 7.0、 1 OmM)に溶解させて製造できる。

産業上の利用の可能性

本発明の血糖値調節剤あるいは補助剤を投与することにより、（ 1 )高血糖状態のィンスリン治療を必要とする患者におけるィンスリン作用の増強、（ 2)インスリンの過剰作用に対してはその作用を増強せず、低血糖の防止という効果が得られ、より安全かつ効率的な糖尿病患者の正常域血糖値調節が可能になる。すなわち、インスリン単独製剤と比較して、インスリンの投与量および投与頻度を下げても同等の血糖コントロールが可能となる治療法を提供することができ、インスリンの投与を必要とする患者に対して、コンプライアンスの改善、低血糖発現の軽減、大血管障害などの副作用の発現を軽減することが可能である。

Claims

請求の範囲

1. インスリン受容体ァゴニストおよびニューロトロフィンを有効成分とするインスリン治療を必要とする糖尿病患者の血糖値調節剤。

2. ニューロトロフィンが脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン 3、ニューロトロフィン 4、ニューロトロフィン 5およびニューロトロフイン 6から選ばれる 1種である請求項 1の血糖値調節剤。

3. ニューロトロフィンが脳由来神経栄養因子である請求項 1の血糖値調節剤。

4. インスリン受容体ァゴニストがィンスリンである請求項 1の血糖値調節剤。

5. インスリン治療を必要とする糖尿病患者がィンスリン依存型糖尿病患者である請求項 1の血糖値調節剤。

6. インスリン受容体ァゴニスト 0. 1〜1 000単位（ヒトインスリンに換算）およびニューロトロフィン 0. 6 g〜720 Omgを配合する請求項 1〜4 のいずれかの血糖ィ直調節剤。

7. インスリン受容体ァゴニスト 4〜1 00単位（ヒトインスリンに換算）および-ユーロトロフィン 6 /x g〜300 Omgを配合する請求項 1〜4のいずれかの血糖値調節剤。

8. インスリン受容体ァゴニストおよび、 t r kA、 t r kBおよび/または t r kC受容体ァゴニストを有効成分とするインスリン治療を必要とする糖尿病患者の血糖値調節剤。

9. ニューロトロフィンを有効成分とするインスリン療法の補助剤。

1 0. インスリン受容体ァゴニストおよび-ユーロトロフィンの、インスリン治療を必要とする糖尿病患者の血糖値調節剤の調製における使用。

1 1. ニュ一口トロフィンが脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロト口フィン 3、ニューロトロフィン 4、ニューロトロフィン 5およびニューロトロフィン 6から選ばれる 1種である、請求項 1 0の使用。

1 2. ニューロトロフィンが脳由来神経栄養因子である、請求項 1 0の使用。

1 3. インスリン受容体ァゴニストがインスリンである請求項 1 0の使用。

1 4 . インスリン治療を必要とする糖尿病患者に、インスリン受容体ァゴニストおよびニューロトロフィンの各有効量を、同時にまたは別々に投与することを特徴とする糖尿病患者の血糖値を正常域に調節する方法。

1 5 . インスリン受容体ァゴニストおよびニューロトロフィンを各々、皮下、静脈内または筋肉注射によって投与する請求項 1 4の方法。

1 6 . ニューロトロフィンが脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロト口フィン 3、ニューロトロフィン 4、ニューロトロフィン 5およびニューロトロフィン 6から選ばれる 1種である請求項 1 4の方法。

1 7 . ニューロトロフィンが脳由来神経栄養因子である請求項 1 4の方法。

1 8 . インスリン受容体ァゴニストがインスリンである請求項 1 4の方法。