CN1314819A - 血糖水平控制剂 - Google Patents

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Abstract

公开了用于需要胰岛素治疗的糖尿病患者的血糖水平控制剂,其包含作为活性组分的一种胰岛素受体激动剂和一种神经营养蛋白;使用上述两种成分制备血糖控制剂;和使用这两种组分将糖尿病血糖水平控制在正常范围内的方法。通过使用上述药用制剂控制需要胰岛素治疗的糖尿病患者的血糖水平,可以增强胰岛素的效应,并且同时可以减轻诸如低血糖性休克的副作用,由此也使得能够改善顺从性。

Description

血糖水平控制剂
技术领域
本发明涉及将用胰岛素疗治的糖尿病患者的血糖水平控制在正常范围或使其正常化的药物。更具体地讲，本发明涉及需要胰岛素治疗的糖尿病患者的血糖水平控制剂，所述控制剂包括作为活性组分的一种胰岛素受体激动剂和一种神经营养蛋白；涉及这两种组分在制备所述血糖水平控制剂方面的应用；和涉及采用所述两种组分将需要胰岛素治疗的糖尿病患者的血糖水平控制在正常范围内的方法。
背景技术
根据发病机理，糖尿病分为1型和2型。病毒感染或自身免疫应答等诱导的胰腺β细胞的破坏导致缺乏胰岛素分泌，而引起1型糖尿病。一般而言，青少年糖尿病属于该类糖尿病，其中酮病发生率高，以致有生命危险的可能性。另外，持续的慢性高血糖可能引起由微血管病引起的糖尿病并发症，例如糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病等。
最近，由于生活标准的提高和/或饮食方式变为西方型饮食方式，或运动缺乏的增加，患有2型糖尿病的患者数目已经增加。由于2型糖尿病中持续的高血糖，可能诱导各种糖尿病并发症，这与1型糖尿病中的情况一样。
在目前的糖尿病患者的临床治疗方面，主要使用胰岛素注射治疗1型糖尿病患者。最近，根据一个报告，严格控制血糖水平有效地预防糖尿病并发症的发生，因此已经积极使用频繁注射胰岛素，即胰岛素强化疗法(参见Nippon Rinsho，第55卷，1997增刊，第249-254页)。然而，该胰岛素疗法也存在问题，并且频繁注射胰岛素给患者带来很大负担。而且，低血糖也是一个严重的问题，这由胰岛素的作用过度引起(参见Nippon Rinsho，第55卷，1997增刊，第249-254页)。此外，有报道：用胰岛素强化疗法治疗的患者表现出有较高风险发生诸如心肌梗塞的大血管病(参见N.Eng.J.of Med.，第329卷，第977页(1993))。
2型糖尿病基本上通过运动疗法或饮食疗法治疗，如有必要，通过给予口服抗糖尿病药(诸如SU药、双胍化合物等)治疗。然而，尽管有这些疗法，但有在晚期(progressed)糖尿病患者中可能充分控制血糖水平的许多病例，因此在那些患者中，需要给予胰岛素(参见NipponRinsho，第55卷，1997增刊，第249-254页)。此外，最近在2型糖尿病患者中，甚至在该疾病早期用胰岛素的积极治疗逐渐增加。因此，再次认识到胰岛素疗法对于患者的效力。然而，在2型糖尿病的胰岛素治疗以及在1型糖尿病的治疗中，仍存在一些问题，诸如顺从性降低、发生低血糖和发生大血管病。
为了矫正胰岛素疗法的上述缺陷，已经对胰岛素和具有与胰岛素相反的低血糖活性的另一种药理学活性物质的联合应用进行了研究，所述另一种药理学活性物质诸如促生长素抑制素(US 4,703,034)、糊精激动剂化合物AC137(US 5,175,145)等。
神经营养因子是由活体靶细胞或神经元和神经胶质细胞·许旺细胞提供的蛋白，表现出维持神经元存活和分化的活性，根据作用的神经或受体种类，分为多种类型。其中，称为神经营养蛋白的蛋白相互之间具有高度的结构同源性。其典型实例为NGF(神经生长因子)、BDNF(脑源神经营养因子)、NT-3(神经营养蛋白3)、NT-4/5等，已知它们起作受体(trkA、trkB和/或trkC)的配体的作用，它们为P-75和trk基因的产物(参见Takeshi NONOMURA,hrioshi HARANAKA；Jikken Igaku，第13卷，第376页(1995))。
诸如NGF、BDNF等的神经营养蛋白已经作为用于治疗诸如ALS的神经变性性疾病患者的治疗剂进行了研究。例如JoumalNeurophathology and Experimental Neurology，第56卷，第1290页(1997)A.P.Mizisin等公开了BDNF对糖尿病性周围神经病的药理学活性，但该文献根据BDNF在体内改善运动神经传导降低的发现，仅提出BDNF对糖尿病性周围神经病可能有药理活性。
在以下例举的报道中，报道了神经营养因子对血糖水平的效应。
(1)Exp.Neurology，第131卷，第229页(1995),Palley-mounterMA等：
对正常小鼠研究了由BDNF诱导的食欲的抑制。公开了通过给予BDNF降低血液胰岛素水平，并也降低了食欲和体重，但未降低血糖水平。
(2)Cytokine，第7卷，第150页(1995),Fantuzzi,G.等：
报道了CNTF(睫状神经营养因子)对正常小鼠的效应。公开了通过给予CNTF降低食欲和体重，而且还降低血糖水平。该文献的目的是阐述CNTF或其它细胞因子成员诸如IL-1、IL-6的炎症诱导活性的机制，但该文献从未公开那些机制和糖尿病之间的关系。
(3)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第94卷，第6456页(1997),Gloaguen,I.等和WO 98/22128,Istitute di Ricerche di Biologia MolecolareP.Angletti S.P.A.(于1998年5月28日公开)：
报道了通过给予肥胖性糖尿病动物模型db/db小鼠CNTF，由该疗法引起的体重和食欲降低，和CNTF的血糖降低效应。WO 98/22128公开了一种治疗肥胖或肥胖性糖尿病的方法，包括给予CNTF受体激活剂。然而，这些文献从未公开或提示CNTF对1型糖尿病的效应，也没有公开或提示CNTF和胰岛素的联合应用。
(4)Biochem. Biophys.Res.Commun.，第238卷，第633页(1997)，One M.等：
报道了通过给予肥胖性糖尿病动物模型db/db小鼠BDNF或NT-3，可以抑制高血糖，但不是仅仅由食物摄取降低而引起的，血糖水平可以降至正常小鼠的水平。另外，也报道了在链脲菌素诱导的其胰腺细胞被链脲菌素破坏而不能分泌胰岛素的糖尿病模型大鼠中，单独给予BDNF不表现出对血糖水平的效应。
在临床领域，需要在1型糖尿病和2型糖尿病治疗中重要的、可以更安全和更准确地保证和辅助胰岛素控制血糖水平的药物，以及一种可以使得能够改善顺从性和减轻副作用(诸如低血糖性休克、大血管病等)的低血糖药。
发明的公开
本发明的一个目的是提供用于控制血糖水平的新药物，该药物可以增强胰岛素的效应，并且降低其诸如低血糖性休克的副作用的风险，此外还可以使得能够改善顺从性。
本发明的另一目的是提供控制需要胰岛素治疗的糖尿病患者血糖水平的药物，该药物包含作为活性组分的一种胰岛素受体激动剂和一种神经营养蛋白。
本发明的再一目的是提供应用所述两种组分制备所述用于控制血糖水平的所述药物。
本发明的又一目的是提供一种方法，通过同时或分别给予一种胰岛素受体激动剂和一种神经营养蛋白，将需要胰岛素治疗的患者的血糖水平控制在正常水平，同时抑制副作用的发生。
本发明人已经研究了BDNF的效应，通过单独给予BDNF,BDNF在2型糖尿病的动物模型中表现出区别的血糖水平降低活性，但不会使血糖水平降至正常范围水平之下，还研究了在胰岛素分泌降低的糖尿病动物模型中联合应用BDNF和胰岛素。结果，我们发现，(1)通过给予BDNF与当单独给予时其用量不能表现出足够效应的胰岛素，BDNF增强胰岛素的效应，并且将胰岛素分泌降低的糖尿病动物模型的血糖水平降至优选值，并且(2)BDNF的这类效应不是相加效应/协同效应，并且当将BDNF与高得多量的胰岛素一起给予时，BDNF的上述效应减小，BDNF不会使血糖水平降至低于正常值，最后，完成了本发明。
亦即本发明具有以下特征。
[1]用于需要胰岛素治疗患者的血糖水平控制剂，包含作为活性组分的一种胰岛素受体激动剂和一种神经营养蛋白。
[2]根据[1]的血糖水平控制剂，其中所述神经营养蛋白为脑源神经营养因子(BDNF)。
[3]根据[1]的血糖水平控制剂，其中所述胰岛素受体激动剂为胰岛素。
[4]根据[1]的血糖水平控制剂，其中所述需用胰岛素治疗的患者为胰岛素依赖型糖尿病患者。
[5]用于需要胰岛素治疗的患者的血糖水平控制剂，包含作为活性组分的一种胰岛素受体激动剂和一种trkA、trkB和/或trkC受体激动剂。
[6]胰岛素疗法的辅助药，包含作为活性组分的一种神经营养蛋白。
[7]胰岛素受体激动剂和神经营养蛋白在制备用于需要胰岛素治疗的糖尿病患者的血糖水平控制剂方面的应用。
[8]将需要胰岛素治疗的患者的血糖水平控制在正常范围内内的方法，包括同时或分别给予所述糖尿病患者一种胰岛素受体激动剂和一种神经营养蛋白。
附图简述
图1为一曲线图，显示在STZ诱导的糖尿病小鼠中胰岛素剂量和血糖降低活性之间的关系。纵坐标轴显示血糖水平，横坐标轴显示给予胰岛素后的时间。●显示用0单位/kg胰岛素治疗组(n=6)在每个点的平均血糖水平，■显示用0.5单位/kg胰岛素治疗组(n=6)在每个点的平均血糖水平，▲显示用1.5单位/kg胰岛素治疗组(n=6)在每个点的平均血糖水平，而○显示用5.0单位/kg胰岛素治疗组(n=6)在每个点的平均血糖水平。*和**显示在Turkey试验中，与用0单位/kg胰岛素治疗组相比有显著差异，分别为p＜0.05、p＜0.01。
图2为一曲线图，显示在STZ诱导的糖尿病小鼠中联合应用BDNF和低剂量胰岛素的效应。纵坐标轴显示血糖水平，横坐标轴显示给予胰岛素后的时间。●显示用D-PBS+盐水治疗组(n=10)在每个点的平均血糖水平，□显示用BDNF+盐水治疗组(n=10)在每个点的平均血糖水平，▲显示用D-PBS+胰岛素治疗组(n=10)在每个点的平均血糖水平，而◇显示用BDNF+胰岛素治疗组(n=9)在每个点的平均血糖水平。**显示在Turkey试验中，与用D-PBS+胰岛素治疗组相比有显著差异，p＜0.01。
图3为一曲线图，显示在STZ诱导的糖尿病小鼠中联合应用BDNF和高剂量胰岛素的效应。纵坐标轴显示血糖水平，横坐标轴显示给予胰岛素后的时间。(a)：◇显示用D-PBS+0.5单位/kg胰岛素治疗组(n=6)在每个点的平均血糖水平，和■显示用BDNF+1.5单位/kg胰岛素治疗组(n=6)在每个点的平均血糖水平，(b)：□显示用D-PBS+4.5单位/kg胰岛素治疗组(n=6)在每个点的平均血糖水平，而◆显示BDNF+4.5单位/kg胰岛素治疗组(n=6)在每个点的平均血糖水平。在每个胰岛素剂量下，在D-PBS治疗组和BDNF治疗组之间的血糖水平没有显著差异。
实施本发明的最佳方式
以下解释本说明书中所用的每个术语的含义或定义。
“需要胰岛素治疗的糖尿病患者”是指由于缺乏胰岛素活性而需要胰岛素治疗的患者。更具体地讲，“需要胰岛素治疗的糖尿病患者”是指处于胰岛素依赖状态的1型糖尿病或2型糖尿病患者，它们需要胰岛素以治疗高血糖。例如，是指因为由于胰腺β细胞被破坏而不能正常分泌胰岛素，而显示高血糖的患者。
“胰岛素受体激动剂”是可以结合于胰岛素受体并可以激活所述受体、因此可以降低血糖水平的物质的统称。具体地说，它包括例如天然存在的人胰岛素、改性的胰岛素诸如速效改性胰岛素LY275585、IGF-1等。一种胰岛素变异体或改性IGF-1是一种其一级结构中通过常规的遗传工程技术经取代、缺失或添加而修饰了天然存在的氨基酸序列的某些氨基酸残基的蛋白，它也包括在本发明的“胰岛素受体激动剂”的范围内，只要这样的制品表现出胰岛素受体结合能力和胰岛素受体激活活性。另外，较低分子量的肽或有机化合物可以包括在本发明的“胰岛素受体激动剂”范围内，只要这样的制品表现出胰岛素受体结合能力和胰岛素受体激活活性。
“神经营养蛋白”是指一种神经营养因子，所述神经营养因子从靶细胞通过自分泌或旁分泌分泌用于神经生长或促进神经元生长、分化或存活，并且使得其在活机体内形成神经回路(突触)。例如，目前已知的脑源神经营养因子(在下文缩写为BDNF)、神经生长因子(在下文缩写为NGF)、神经营养蛋白3(在下文缩写为NT-3)、神经营养蛋白4(在下文缩写为NT-4)、神经营养蛋白5(在下文缩写为NT-5)和神经营养蛋白6(在下文缩写为NT-6)。
“用于需要胰岛素治疗的患者的血糖水平控制剂”是指用于将患有1型糖尿病或2型糖尿病的患者并且可以为胰岛素治疗对象的患者的血糖水平控制在正常范围内的药物。按照目前的临床检验标准，正常的血糖水平为在75g剂量的葡萄糖耐受试验后2小时低于200mg/dl，和低于140mg/dl禁食血糖，尤其是在100-120mg/dl范围内。本发明的血糖水平控制剂为使得能够安全并持续地将血糖水平控制在正常范围内的药物，它可以将禁食血糖水平高于400mg/dl的患者的血糖水平降至200mg/dl或更低，但不低于70mg/dl。
根据最近修正的糖尿病诊断标准，糖尿病的血糖水平在75g剂量的葡萄糖耐受试验后2小时高于200mg/dl，和高于126mg/dl禁食血糖。
“trkA、trkB和/或trkC受体激动剂”是结合于在称为“神经营养蛋白”受体的trk基因表达产物中的trkA、trkB或trkC并激活它们以显示其活性的物质的统称。具体地说，已知的神经营养蛋白是例如结合于trkA的NGF、结合于trkB的BDNF或NT-4和结合于trkC的NT-3等。这一概念不仅包括修饰的化合物(通过氨基酸取代、缺失或添加而修饰)，而且包括较低分子量的肽和有机化合物，只要它们表现出对于trkA、trkB或trkC的结合能力和激活能力，例如酪氨酸残基的磷酸化活性。
“胰岛素治疗的辅助药”是指这样一种药物，所述药物在胰岛素治疗下的1型糖尿病或2型糖尿病患者中，通过在给予胰岛素之前或与给予胰岛素的同时给予时，表现出(1)降低胰岛素剂量和胰岛素给药频率的活性，和(2)防止因胰岛素作用过度引起的严重低血糖的活性。(1)的效应与“增强胰岛素作用的活性”的含义相同。这种效应可以通过提高所述细胞的胰岛素敏感性而达到，这种效应当与单独给予时不能表现出足够低血糖活性的低剂量胰岛素一起给予时尤为明显。当与甚至在单独给予时也可以表现足够低血糖活性的高剂量胰岛素一起给予时，表现出(2)的效应。制备和测定方法
将用于本发明的血糖水平控制剂或需用胰岛素治疗的患者的胰岛素治疗辅助药的神经营养蛋白(NGF、BDNF、NT-3、NT-4等)，可以是任何一种神经营养蛋白，例如天然存在的、重组的神经营养蛋白，只要它表现出固有的生物化学。它可以经纯化后用于本发明。例如，Brade,Y.E.等从猪脑中分离出BDNF(参见EMBO Joumal,第5卷，第549-553页(1982))，克隆后分析BDNF基因，由此证实BDNF的一级结构由119个氨基酸组成(参见leibrock,J.等，Nature，第341页，第149页(1989))。另外，诸如Met-BDNF的在N末端具有一个甲硫氨酸残基的修饰重组BDNF，或通过用常规的基因工程技术经取代、缺失或除去、或添加上述天然存在的BDNF序列中的一部分氨基酸序列而产生的重组突变BDNF，可以用于本发明，只要它们是具有BDNF活性的药用制剂。
“BDNF活性”是指维持脊神经节、迷走神经下节、运动神经元、视网膜神经节、黑质多巴胺能(nigradopaminergic)神经元、前脑基底胆碱能神经元等的存活或促进其分化的活性。这些活性可以在体外或体内得到证实(JP-A-5-328974,USP 5,180,820)。
已经报道了用于制备BDNF的各种方法，用任一方法制备的任何BDNF均可以用于本发明中。当从动物组织中分离的BDNF用于本发明时，可以将其纯化至这样一种程度，使得它可以用作药物(参见EMBO Joumal，第5卷，第549页(1982))。或者，可以从可以产生BDNF的原代培养细胞或建立的细胞系获得BDNF，并从其培养液(例如培养上清液、培养的细胞)中分离BDNF。此外，通过常规的基因工程技术，例如通过将编码BDNF的基因插入合适的载体中，用所述重组载体转化合适的宿主，并且从所得转化子的培养上清液中分离，可以获得重组BDNF(参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第88卷，第961页；Biochem.Biophys.Res.Commun.，第186卷，第1553页(1992))。所述基因工程技术适用于大规模生产相同质量的BDNF。用于上述方法的宿主细胞不受限制，但可以是已经用于基因工程技术的任何常规宿主细胞，例如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、植物细胞或动物细胞。
已经报道了其它神经营养蛋白的基因重组产物，诸如NGF、NT-3、NT-4等。NGF可以以制备BDNF的相同方式由各种宿主细胞制备。(CHO Cell,Schmelzer,C.H.:J.Neurochemistry,59,1675(1992))、大肠杆菌细胞：日本专利第263792号)。NT-3可以以制备BDNF的相同方式由各种宿主细胞制备。其制备和测定方法公开于Neuron，第4卷，767(1990)或JP-A-5-161493(WO 91/3659)。NT-4可以以制备BDNF的相同方式由各种宿主细胞制备。重组NT-4的表达方法及其测定方法公开于Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第89卷，第3060页(1992)、JP-A-4-509600(WO 93/25684)或JP-A-6-501617(WO 92/05254)。
在与神经营养蛋白一起使用的胰岛素受体激动剂中，主要含胰岛素的许多药物是市售的。具体实例为SHIMIZU EIYAKU-TAKEDACHEMICAL INDUSTRIES,LTD.生产的动物来源的胰岛素“Iszilin”；Novo Noridsk-YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.生产的重组人胰岛素“Novolin R”；Eli Lilly Japan KK生产的相同的“Humulin R”；和其它结晶胰岛素锌悬液、鱼精蛋白锌胰岛素悬液；胰岛素锌鱼精蛋白悬液等。(Drugs in Japan,Japan Pharmaceuticalinformation Center编辑，1997年10月版，第203-206页)。另外，IGF-I由FUJISAWA PHAEMACEUTICAL CO.LTD以“Somazon”出售。药用制剂
药用制剂可以是注射用制剂、口服制剂、液体制剂、冻干制剂，优选用于皮下给药的注射用制剂。这些胃肠外药用制剂可以含有一种用于该领域的常规稳定剂或载体，最好是以等渗溶液形式使用所述制剂。所述药用载体或稀释剂可以是例如得自血清的蛋白诸如白蛋白、氨基酸诸如甘氨酸、糖诸如甘露醇等。当本发明的药用制剂为溶液制剂或冻干制剂形式时，最好向其中加入表面活性剂诸如土温80，以防止活性物质的聚集。最简单的是，将神经营养蛋白溶于市售的用于皮下注射的胰岛素液体制剂中，得到本发明的用于皮下注射的液体制剂。当需要延长药理学效应时，则可以用常规的微球型持续释放的药用载体的生物降解性(biodegenerative)聚合物(例如聚乙酸-聚乙醇酸的聚合物)制备药用制剂。
在本发明的血糖水平控制剂中，所述活性组分-胰岛素受体激动剂和神经营养蛋白可以同时给予或分别给予，因此当同时给予时，可以将这些组分配制为含两种组分的一种制剂，或可以将这两种组分分别配制，然后装入一个试剂盒包装中。例如，分别冻干这两种组分，制备包括这两种冻干组分和一种其溶剂的试剂盒，然后当使用时将这些组分溶解；或制备包括这两种组分之一的溶液制剂和另一种冻干组分的试剂盒，然后当使用时，将这些组合混合并溶解；或制备包含每一组分的两种溶液制剂的试剂盒，然后当使用时将这两种溶液制剂混合。
当分别给予时，这两种组分以上述试剂盒形式制备，单独给予每种组分，或将这两种组分之一的制剂与市售的另一种组分的制剂一起使用。活性组分的混合比
所述活性组分-胰岛素受体激动剂和神经营养蛋白的混合比可以自由限定，可以通过常规动物试验或临床试验确定合适的比率。在含有胰岛素和BDNF的皮下注射制剂中BDNF的含量为每单位胰岛素0.01-100mg。
在本发明的血糖水平控制剂中，胰岛素受体激动剂和神经营养蛋白合适含量分别为其日剂量。例如，将其配制为含有0.1-1,000单位(换算的人胰岛素量，下文与此相同)量的一种胰岛素受体激动剂和0.6μg-7,200mg量的一种神经营养蛋白的制剂，最好为含有4-100单位量的一种胰岛素受体激动剂和6μg-3,000mg量的一种神经营养蛋白的制剂。这些活性组分可以如上所述一起包含于同一制剂中，或包含于不同制剂中。用法
可以将本发明的血糖水平控制剂，以与给予常规胰岛素制剂相似的方式主要给予需要胰岛素治疗的患者。所述胰岛素受体激动剂的日剂量的范围换算为人胰岛素的量，基本上为0.1-1,000单位/人，最好为4-100单位/人。与所述胰岛素受体激动剂同时或分别给药的所述神经营养蛋白的日剂量范围为约0.01μg-120mg/kg，最好为0.1μg-50mg/kg，它可以经皮下、静脉内或肌内给予。
如上所述，在本发明的血糖水平控制剂中，两种所述活性组分可以同时给予或分别给予。因此，采用本发明的血糖水平控制剂治疗需要胰岛素治疗的糖尿病患者时，将上述日剂量的所述胰岛素受体激动剂和所述神经营养蛋白同时或分别给予所述患者。最好是，所述神经营养蛋白的日剂量一日给予一次，或分为2-3个剂量单位，然后，将所述日剂量的所述胰岛素受体激动剂一日给予一次，或分为2-3个剂量单位。毒性
一般而言，在糖尿病早期，在每次进食之前，通过皮下注射剂量为4-20单位应用胰岛素制剂，然后，根据该患者的病情，以4-80单位/人/天的剂量使用。尽管根据情况确定剂量，但证实至多约100单位/人/天的剂量在临床上是安全的。当将神经营养蛋白、尤其是将BDNF分别以100mg/kg和60mg/kg的剂量皮下给予大鼠和短尾猴4周时，没有动物死亡。关于急性毒性，以高于200mg/kg剂量将BDNF给予大鼠的短尾猴，没有动物死亡。因此，BDNF表现出高度的安全性。对于其它神经营养蛋白，也没有严重的副作用报道。
通过实施例说明本发明。
实施例
在胰岛素分泌减少的糖尿病动物模型中联合应用BDNF和胰岛素的效应：
(1)试验材料和方法：
试剂：使用的BDNF购自REGENERON PHAEMACEUTICALS,INC.。购买并使用市售的盐水溶液(Otsuka Pharmaceutical Company,Limited)、D-PBS(GIBCO)、胰岛素(Novolin U注射液100(商标))、链脲菌素(Sigma)。其它试剂是具有最佳质量的市售试剂。
试验动物：雄性C57 BL/6NCrj小鼠(SPF)购自Charles River JapanInc.。预喂养1周后，将7或8周龄的动物用于实验中。将小鼠保持在温度控制为23±2℃、湿度为55±10％的房间中，照明周期为开灯(8:00至20:00)，关灯(20:00至8:00)。在预喂养期间，让动物自由进食动物饲料(CE-2,Clea Japan,Inc.)和灭菌自来水，但如有必要，当用于实验时，给小鼠禁食。
(2)链脲菌素(STZ)、BDNF和胰岛素给药溶液的制备：
将STZ溶于10mM柠檬酸钠溶液(pH5.5)中，得到20mg/ml溶液。使用时制备STZ溶液，并在溶解后5分钟内使用。通过用D-PBS(Gibco)稀释至2mg/ml的浓度，制备BDNF溶液，并用于实验中。通过用盐水稀释持续释放型胰岛素(Novolin U注射液100)，制备胰岛素溶液并用于实验中。
(3)通过给予STZ降低胰岛素分泌的高血糖动物的选自和分组：
对预喂养的小鼠以10μl/g的比率(以STZ 200mg/kg的剂量)腹膜给予上述(2)中制备的STZ溶液。第二天，再次给予小鼠STZ溶液。第二次给予STZ后3天，测量所有小鼠的血糖水平和体重，根据结果将动物分组。在该实验中排除未表现出高血糖(300mg/dl或更低)的小鼠和明显情况差的小鼠。
(4)测量血糖水平的方法及其统计学分析：
用Antsence Ⅱ血糖分析仪(Sankyo,Bayer)测量取自尾静脉的血的血糖水平。通过Turkey检验分析如此测量的血糖水平。
(5)通过单独给予胰岛素降低血糖水平：
研究了在STZ诱导的糖尿病小鼠中所述胰岛素剂量及其低血糖活性之间的关系。将通过给予STZ诱导的高血糖小鼠根据其血糖水平和体重分为4组(每组6只动物)。向每组以0、0.5、1.5和5.0单位/kg的剂量皮下注射胰岛素，测量给药后每1小时的血糖水平，直至给药后4小时。给予胰岛素后，让动物禁食。图1显示每组每个时间的血糖水平。观察到给予胰岛素的剂量依赖性低血糖效应，与胰岛素0单位/kg治疗组(●)相比，观察到在给药后1小时，在胰岛素0.5单位/kg治疗组(■)的血糖水平显著降低，但高于400mg/dl的平均血糖水平仅降至约300mg/ml，此后2小时，血糖水平几乎回复至原始水平。然而，在较高剂量诸如1.5单位/kg胰岛素治疗组(▲)中和5.0单位/kg胰岛素治疗组(○)中，观察到血糖水平的显著降低。
(6)联合应用BDNF和胰岛素的效应(1)；对低剂量胰岛素的效应：
研究了联合应用BDNF和胰岛素对STZ诱导的糖尿病小鼠的效应。将给予STZ诱导的高血糖小鼠根据其血糖水平和体重分为4组(每组9或10只动物)。第一组：D-PBS+盐水治疗组(n=10)，第二组：20mg/kg BDNF+盐水治疗组(n=10)，第三组：D-PBS+0.5单位/kg胰岛素治疗组(n=10)，第四组：20mg/ml BDNF+0.5单位/kg胰岛素治疗组(n=9)。在给予胰岛素(或盐水)之前1小时给予BDNF(或D-PBS)，在给予胰岛素(或盐水)之后每1小时，定期测量血糖水平，直至给药后4小时。在给予BDNF或D-PBS后让动物禁食。图2显示每组每个时间的血糖水平。
结果，在20mg/kg BDNF+盐水治疗组(□)中，没有观察到血糖水平的显著降低。另一方面，在D-PBS+0.5单位/kg胰岛素治疗组(▲)中，在给予胰岛素后1小时或2小时，血糖水平降低至约350mg/dl。在20mg/kg BDNF+0.5单位/kg胰岛素治疗组(○)中，在给予胰岛素后1小时或2小时，血糖水平分别显著降至约210、220mg/dl，而当与D-pBS+0.5单位/kg胰岛素治疗组相比时，观察到血糖水平的显著降低的活性。亦即在单独给予时不表现出足够效应的低剂量胰岛素治疗组中，观察到通过预给予BDNF明显增强胰岛素活性。
(7)联合应用BDNF和胰岛素的效应(2)；对较高剂量的胰岛素的效应：
研究了联合应用BDNF和较高剂量的胰岛素对STZ诱导的糖尿病小鼠的效应。将给予STZ诱导的高血糖小鼠根据其血糖水平和体重分为4组(每组6只动物)。第一组：D-PBS+1.5单位/kg胰岛素治疗组，第二组：20mg/kg BDNF+1.5单位/kg胰岛素治疗组，第三组：D-PBS+4.5单位/kg胰岛素治疗组，第四组：20mg/kgBDNF+4.5单位/kg胰岛素治疗组。在给予胰岛素(或盐水)之前1小时给予BDNF(或D-PBS)，在给予胰岛素之后每1小时，定期测量血糖水平，直至给药后4小时。在给予BDNF或D-PBS后让动物禁食。图3显示每一时间点的血糖水平。在图3中，(a)显示使用1.5单位/kg胰岛素时的数据，而(b)显示使用4.5单位/kg胰岛素时的数据。
如图3(a)和(b)所示，在D-PBS+1.5单位/kg胰岛素治疗组(Δ)、20mg/kg BDNF+1.5单位/kg胰岛素治疗组(■)、D-PBS+4.5单位/kg胰岛素治疗组(○)和20mg/kg BDNF+4.5单位/kg胰岛素治疗组(◆)的每个组中，均观察到血糖水平的明显下降，但在D-PBS治疗组和BDNF治疗组之间没有显著差异。制剂1
在本发明的血糖水平控制剂中，可以如下制备一种代表性制剂-含胰岛素和BDNF的用于皮下给药的水溶液制剂。
(1)向胰岛素(100单位)和纯化的重组BDNF(20g)中加入甘露醇(10mg)和非离子表面活性剂(聚山梨醇酯80,0.1mg)，将混合物溶于10mM磷酸缓冲盐溶液(pH7.0,1ml)中。
(2)将BDNF(10mg)溶于YAMANOUCHI Pharmaceutical Co.,Ltd.生产的重组人胰岛素(1000单位/10ml)的胰岛素注射液制剂(Novolin U注射液100)中。制剂2
在本发明的胰岛素治疗辅助药中，通过将甘露醇(10mg)和非离子表面活性剂(聚山梨醇酯80,0.1mg)加入纯化的重组BDNF(20g)中，并将所得混合物溶于10mM磷酸缓冲盐溶液(pH7.0,1ml)中，可以制备一种代表性制剂-含BDNF的液体制剂。
工业应用性
通过给予本发明的血糖水平控制剂或辅助药，(1)可以在需要胰岛素治疗的高血糖患者中增强胰岛素活性，但(2)不增强胰岛素的过度作用，使得可以预防低血糖，藉此可以达到安全而有效地将糖尿病患者的血糖水平控制在正常范围内。亦即与仅含胰岛素的药剂相比，本发明可以提供一种治疗方法，用此方法，可以控制血糖水平，其控制水平即使胰岛素剂量和给药频率降低后，也与原始量的胰岛素控制水平相同。因此，本发明可以在需要胰岛素治疗的糖尿病患者中改善顺从性、抑制低血糖的发生，并进一步减轻诸如大血管病的副作用。

Claims (18)

1．用于需要胰岛素治疗的糖尿病患者的血糖水平控制剂，所述血糖水平控制剂包含作为活性组分的一种胰岛素受体激动剂和一种神经营养蛋白。
2．根据权利要求1的血糖水平控制剂，其中所述神经营养蛋白为选自脑源神经营养因子、神经生长因子、神经营养蛋白3、神经营养蛋白4、神经营养蛋白5和神经营养蛋白6中的一个成员。
3．根据权利要求1的血糖水平控制剂，其中所述神经营养蛋白为脑源神经营养因子。
4．根据权利要求1的血糖水平控制剂，其中所述胰岛素受体激动剂为胰岛素。
5．根据权利要求1的血糖水平控制剂，其中所述需要胰岛素治疗的糖尿病患者为胰岛素依赖型糖尿病患者。
6．根据权利要求1-4中任一项的血糖水平控制剂，所述血糖水平控制剂含有0.1-1000单位(换算为人胰岛素的量)量的一种胰岛素受体激动剂和0.6μg-7200mg量的一种神经营养蛋白。
7．根据权利要求1-4中任一项的血糖水平控制剂，所述血糖水平控制剂含有4-100单位(换算为人胰岛素的量)量的一种胰岛素受体激动剂和6μg-3,000mg量的一种神经营养蛋白。
8．用于需要胰岛素治疗的糖尿病患者的血糖水平控制剂，所述血糖水平控制剂包含作为活性组分的一种胰岛素受体激动剂和一种trkA、trkB和/或trkC受体激动剂。
9．胰岛素疗法的辅助药，所述辅助药包含作为活性组分的一种神经营养蛋白。
10．胰岛素受体激动剂和神经营养蛋白在制备用于需要胰岛素治疗的糖尿病患者的血糖水平控制剂方面的应用。
11．根据权利要求10的用途，其中所述神经营养蛋白为选自脑源神经营养因子、神经生长因子、神经营养蛋白3、神经营养蛋白4、神经营养蛋白5和神经营养蛋白6中的一个成员。
12．根据权利要求10的用途，其中所述神经营养蛋白为脑源神经营养因子。
13．根据权利要求10的用途，其中所述胰岛素受体激动剂为胰岛素。
14．用于将需要胰岛素治疗的糖尿病患者的血糖水平控制在正常范围内内的方法，所述方法包括同时或分别给予所述糖尿病患者均为有效量的一种胰岛素受体激动剂和一种神经营养蛋白。
15．根据权利要求14的方法，其中所述胰岛素受体激动剂和所述神经营养蛋白分别经皮下、静脉内或肌内给予。
16．根据权利要求14的方法，其中所述神经营养蛋白为选自脑源神经营养因子、神经生长因子、神经营养蛋白3、神经营养蛋白4、神经营养蛋白5和神经营养蛋白6中的一个成员。
17．根据权利要求14的方法，其中所述神经营养蛋白为脑源神经营养因子。
18．根据权利要求14的方法，其中所述胰岛素受体激动剂为胰岛素。
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