WO2000008185A1 - Nukleinsäuremoleküle kodierend für beta-amylase, pflanzen, die eine modifizierte stärke synthetisieren, herstellungsverfahren und verwendungen - Google Patents

Nukleinsäuremoleküle kodierend für beta-amylase, pflanzen, die eine modifizierte stärke synthetisieren, herstellungsverfahren und verwendungen Download PDF

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starch
plant
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plants
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Claus Frohberg
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Aventis Cropscience Gmbh
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Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid molecules which encode a protein with the activity of a ⁇ -amylase from potatoes and to processes for producing transgenic plant cells and plants which synthesize a modified starch. Furthermore, the present invention relates to vectors and host cells which contain the nucleic acid molecules according to the invention, the plant cells and plants resulting from the processes according to the invention, the starch synthesized by the plant cells and plants according to the invention and processes for producing this starch.
  • polysaccha de are important, renewable raw materials from plants.
  • starch which is one of the most important storage substances in higher plants.
  • the potato plays an important role in starch production.
  • the polysaccharide starch is a polymer made up of chemically uniform building blocks, the glucose molecules. However, it is a very complex mixture of different molecular forms that differ in terms of their degree of polymerization
  • Starch is therefore not a uniform raw material.
  • amylose and starch an essentially unbranched polymer composed of ⁇ -1,4-glycosidically linked glucose molecules, from amylopectin starch, which in turn is a complex mixture of differently branched glucose chains
  • the branches come about through the occurrence of additional ⁇ -1,6-glycosidic linkages.
  • the synthesized starch consists of approximately 25% amylose starch and approximately 75% % from amylopectin starch.
  • the molecular structure of the starch which is largely determined by the degree of branching, the amylose / amylopectin ratio, the average length and distribution of the side chains and the presence of phosphate groups, is crucial for important functional properties of the starch or its aqueous solutions .
  • important functional properties are solubility, retrograding behavior, film-forming properties, viscosity, color stability, gelatinization properties and binding and adhesive properties.
  • the starch grain size can also be important for various applications.
  • the production of starches containing high amylose is of particular interest for certain applications.
  • a modified starch contained in plant cells can advantageously change the behavior of the plant cell under certain conditions.
  • starch-containing organs such as seeds or tubers
  • modified starches which result in plant cells or plant organs containing this starch being more suitable for further processing, for example in the production of foods such as "popcorn” or "cornflakes” from corn or from chips fries, chips or potato powder from potatoes.
  • reducing sugars especially glucose
  • Potatoes in particular are often stored at temperatures of 4 to 8 ° C to minimize starch degradation during storage. The reducing sugars released in this way, in particular glucose, lead, for example, to undesired browning reactions (so-called Maillard reactions) in the manufacture of French fries or chips.
  • the biochemical pathways that lead to starch building are essentially known.
  • the starch synthesis in plant cells takes place in the plastids.
  • Important enzymes involved in starch metabolism are, for example, the branching enzymes, ADP-glucose pyrophosphorylases, starch grain-bound starch synthases, soluble starch synthases, debranching enzymes, disproportionation enzymes, plastidic starch phosphorylases, the R1 enzymes, R1 enzymes or glucosidases.
  • the object of the present invention is to develop further or alternative genetic engineering approaches for modifying the starch metabolism in starch-forming plants (for example rye, barley, oats, maize, wheat, millet, sago, rice, pea, marker pea, cassava, potato, tomato, rape, Soybean, hemp, flax, sunflower, cow pea, mung bean, bean, banana or arrowroot) to provide suitable nucleic acid molecules by means of which plant cells can be transformed, so that the synthesis of modified, advantageous starch varieties is made possible.
  • starch-forming plants for example rye, barley, oats, maize, wheat, millet, sago, rice, pea, marker pea, cassava, potato, tomato, rape, Soybean, hemp, flax, sunflower, cow pea, mung bean, bean, banana or arrowroot
  • Such changed starch varieties e.g. Modifications related to their degree of branching, the amylose / amylopectin ratio, the phosphate content, the starch grain size and / or the average length and distribution of the side chains (i.e. side chain structure).
  • Another object of the invention is to provide methods which enable the production of transgenic plants which synthesize an altered starch variety.
  • transgenic plants which have been transformed with the nucleic acid molecules according to the invention synthesize a starch which has a particular change in its physicochemical properties and / or in its side chain structure, so that the stated objects are achieved by providing the embodiments described in the claims.
  • the invention therefore relates to a nucleic acid molecule, coding for a protein with the function of a ⁇ -amylase from potato, selected from the group consisting of a) nucleic acid molecules which code for a protein which has the protein identified under Seq ID NO. 2 amino acid sequence specified or their derivatives or parts, b) nucleic acid molecules which the Seq ID No.
  • nucleotide sequence shown or their derivatives or parts comprise or a corresponding ribonucleotide sequence; c) nucleic acid molecules which hybridize with the nucleic acid molecules mentioned under (a) or (b) or are complementary, preferably hybridize specifically and d) nucleic acid molecules whose nucleotide sequence differs from the sequence of the nucleic acid molecules mentioned under (a), (b) or (c) due to the degeneration of the genetic code.
  • the present invention relates to a nucleic acid molecule coding for a ⁇ -amylase, which has an amino acid sequence according to Seq. ID No. 2 or their derivatives or parts thereof encoded according to the cDNA insert of the plasmid St-b-Amy (DSM No. 12348).
  • the ⁇ -amylase according to the invention is involved in the starch metabolism of the potato and is directly or indirectly involved in the starch biosynthesis.
  • the term “derivative” in relation to the ⁇ -amylase protein (or its polypeptide, amino acid sequence) of the invention encompasses one of Seq. ID No. 2 derived polypeptide which contains at least 86 amino acid residues, preferably at least 120, in particular at least 1 55 and very particularly preferably about 163-170 amino acid residues, which consists of the group of amino acid residues consisting of 1 12 V, 1 13 P, 1 14 V , 1 16 V, 1 17 M, 1 19 P, 120 L, 139 L, 142 L, 145 A, 146 G, 147 V, 149 G, 1 51 M, 153 D, 155 W, 156 W, 157 G, 160 E, 1 64 P, 1 67 Y, 169 W, 172 Y, 175 L, 183 G, 184 L, 185 K, 187 Q, 190 M, 191 S, 192 F, 193 H, 195 C, 196 G, 197 G, 198 N,
  • ID No. 2 are selected and which contains at least about 1-61, preferably at least 1 22, in particular at least 1 70, more preferably at least 220 and very particularly preferably about 232-241 amino acid residues, which consists of the group of amino acid residues consisting of 1 M, 2 A, 3 M, 4 S, 5 L, 6 P, 7 H, 8 Q, 9 I, 10 G, 1 1 A, 12 L, 13 S, 14 G, 1 5 T, 1 6 S, 1 7 L, 18 T, 19 A, 20 E, 21 T, 22 G, 23 G, 24 V, 25 S, 26 C, 27 E, 28 V, 29 P, 30 A, 31 K, 32 G, 33 S, 34 S, 35 A, 36 T, 38 A, 39 M, 40 W, 41 R, 42 T, 44 M, 45 T, 46 N, 47 L, 48 K, 49 V, 50 S, 51 V, 52 Q , 53 K, 54 T, 55 G, 56 T, 57 E, 58 I, 59 D, 60 R, 61 V, 62 S,
  • the term “part” in relation to the ⁇ -amylase protein (polypeptide, amino acid sequence) according to the invention comprises a poly- or oligopeptide consisting of at least about 10-19, preferably at least 80, more preferably at least 1 60, particularly preferably at least 320 and most preferably about 400-550 of the amino acid residues of the ⁇ -amylase or their derivatives encoded by the nucleic acid molecule according to the invention.
  • the present invention further relates to a nucleic acid molecule which a nucleic acid molecule according to Seq. ID No. 1 contains, according to the cDNA insert of the plasmid deposited with the DSZM on July 24, 1998, DSM No. 12348 or its derivatives or parts, in particular the coding region or its derivatives or parts.
  • the term “derivative” in relation to the nucleic acid molecule according to the invention comprises a polynucleotide which contains at least 246 nucleotides, preferably at least 344, in particular at least 443, and very particularly preferably about 467-487 nucleotides, selected from the group consisting of 241 T, 245 T, 257 C, 268 G, 272 A, 279 T, 285 A, 290 A, 291 G, 307 A, 309 G, 31 1 A, 314 C, 320 A, 322 A, 323 A, 325 G, 334 G, 335 T, 337 C, 338 C, 340 G, 341 T, 343 T, 346 G, 347 T, 349 A, 350 T, 351 G, 353 T, 355 C, 356 C , 359 T, 361 G, 368 T, 370 A, 386 T, 400 G,
  • nucleotide or amino acid sequences according to the invention according to Seq ID No. 1 or Seq. ID no. 2 are also understood as derivatives of said sequences according to the invention in which the numbering of the individual sequence elements can differ from that of the sequences ID no. 1 or no. 2 according to the invention.
  • the decisive factor here is a significant correspondence of at least one sequence section (“part”) with the sequence according to the invention. According to the general technical knowledge, such matches can easily be determined, for example, by suitable computer programs, for example by carrying out a sequence comparison of the sequence according to the invention with a sequence in question to be compared (so-called “sequence alignment”).
  • Computer programs of this type which can be purchased, for example, (for example Omiga ⁇ , version 1 .1 .3. From Oxford Molecular Ltd., Oxford, UK) and which are in part also an integral part of sequence databases (for example EMBL, GenBank) , identify, for example, the best possible match of identical or possibly chemically equivalent sequence elements and take into account in particular the presence of insertions and / or deletions, which can lead to a shift of individual sequence elements or of sequence sections and in this way can influence the numbering of the sequence elements or sequence sections.
  • sequence databases for example, the best possible match of identical or possibly chemically equivalent sequence elements and take into account in particular the presence of insertions and / or deletions, which can lead to a shift of individual sequence elements or of sequence sections and in this way can influence the numbering of the sequence elements or sequence sections.
  • the term “derivative” in relation to the nucleic acid molecule according to the invention which codes for a ⁇ -amylase encompasses a nucleic acid molecule which is obtained by addition, deletion, insertion or recombination of one or more nucleotides from Seq. ID No. 1 deviates and fulfills the conditions as defined above.
  • the term “derivative” in relation to the nucleic acid molecule according to the invention which codes for a ⁇ -amylase includes a complementary or a reversely complementary sequence (polynucleotide) of the nucleic acid molecule according to the invention or of derivatives or parts thereof.
  • part referring to the nucleic acid molecule encoding a ⁇ -amylase according to this invention encompasses a poly- or oligonucleotide consisting of at least about 1-535, preferably at least about 36-100, especially at least 200, more preferably at least 400, particularly preferably at least 800 and most preferably about 1400-1700 of the nucleotides of a nucleic acid molecule according to the invention which codes for a ⁇ -amylase, or their derivatives.
  • the terms “derivative” and / or “part” according to the present invention comprise a polynucleotide, or a poly- or oligopeptide as defined above, which has a functional and / or structural equivalent of the ß- obtained from potato Amylase gene (ie the nucleic acid molecule which codes for the ⁇ -amylase) or ⁇ -amylase polypeptide.
  • the term “functional and / or structural equivalence” generally means the same, an equivalent or similar function of the corresponding molecule of the invention, if appropriate in particular a biological function.
  • Another object of the invention is a recombinant nucleic acid molecule containing a) a nucleotide sequence coding for a protein with the function of a ⁇ -amylase, preferably from potato, or parts of said nucleotide sequence and b) one or more nucleotide sequences which code for a protein selected from the group Group A, consisting of proteins with the function of branching enzymes, ADP-glucose pyrophosphorylases, starch-bound starch synthases, soluble starch synthases, debranching enzymes, disproportionation enzymes, plastid starch phosphorylases, R1 enzymes, amylases, glucosidases, selected from parts of nucleotides for nucleotides Group A and nucleic acid molecules which hybridize with one of said nucleotide sequences or parts thereof, preferably a deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid molecule, particularly preferably a
  • the nucleic acid according to the invention coding for a protein with the function of a ⁇ -amylase from potato is described by Seq. ID No. 1, the protein encoded by the nucleotide sequence by Seq. ID No. 2.
  • Seq. ID NO. 1 attaatattattattatggcaatgagtctgccacaccagatcggtgccttatcaggaaca tcgctcacggcggaaaccggtggagtttcatgcgaagttccggcgaaggggagttcagct acatcagctatgtggagaacaccgatgacgaatttaaaagtatcggtacaaaaacagga actgaaattgacagggtgtcgcgtcgcgtcgcgcgatgagtccgatgatgggagga ggaatgcggccggatttattagcgtgtcaagcgttgatggaagctcaggtagatgaggta gttgagaatataaggttaggaattcgtcggagaaagagaagagaatataaggt
  • the ⁇ -amylase nucleotide sequence according to the invention points to known ⁇ -amylase-coding molecules (Wang et al., 1997, Plant Physiol. 1 13 (2): 403-409; Yoshigi et al., 1994, Biotechn. & Biochem. 58 (6): 1080-1086; Monroe et al., 1991, Plant Physiol. 97: 1 599-1 601) have a comparatively low sequence homology.
  • the amino acid sequence also differs from the ⁇ -amylases described in the prior art by an additional N-terminal sequence (amino acids from position 1-25), which is also represented accordingly at the level of the nucleotide sequence.
  • Nucleotide sequences which are suitable according to the invention and which code for a group A protein are described, for example, for soluble (type I, II, IM or IV) or starch-bound starch synthase isoforms in Hergersberg, 1988, dissertation, University of Cologne; Abel, 1995, dissertation FU Berlin; Abel et al., 1996 Plant Journal 10 (6): 981-991; Visser et al., 1989, Plant Be. 64: 185-192; van der Leij et al., 1991, Mol. Gen. Genet.
  • branching enzyme isoforms branching enzyme I, lia or Mb
  • debranching enzyme isoforms debranching enzyme, isoamylases, pulluianases, R1 enzymes
  • disproportionation enzyme isoforms for example described in WO 92/14827; WO 95/07335; WO 95/09922; WO 96/19581; WO 97/22703; WO 97/32985; WO 97/42328; Takaha et al., 1993, J.
  • nucleotide sequences to be used according to the invention are of pro- or eukaryotic origin, preferably of bacterial, fungal or vegetable origin.
  • parts of nucleotide sequences means parts of the nucleotide sequences to be used according to the invention which are at least 15 bp, preferably at least 150 bp, particularly preferably at least 500 bp, but a length of 5000 bp, preferably 2500 bp do not exceed.
  • hybridization means hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under stringent conditions, as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • a “specific hybridization” is particularly preferably carried out under the following highly stringent conditions:
  • Hybridization buffer 2 x SSC; 10 x Denhardt's solution (Fikoll 400 + PEG + BSA;
  • Herring sperm DNA 50 ⁇ g / ml tRNA; or 0.25 M sodium phosphate buffer pH 7.2; 1mM EDTA; 7% SDS in one
  • the molecules hybridizing with the nucleic acid molecules according to the invention also include fragments, derivatives and allelic variants of the nucleic acid molecules according to the invention. Fragments include parts of the nucleic acid mo- understood molecules that are long enough to code part of the proteins described.
  • the term derivative in this context means that the sequences of these molecules differ from the sequences of the nucleic acid molecules according to the invention at one or more positions and have a high degree of homology to these sequences.
  • Homology means a sequence identity of at least 60%, preferably over 70% and particularly preferably over 85%.
  • the deviations from the nucleic acid molecules according to the invention can be caused by deletions, substitutions, insertions or recombinations.
  • nucleic acid molecules which are homologous to the molecules according to the invention and which are derivatives of these molecules are generally variations of these molecules which are modifications which have the same biological function. These can be both naturally occurring variations, for example sequences from other plant species, or mutations, wherein these mutations can have occurred naturally or have been introduced by targeted mutagenesis. Furthermore, the variations can be synthetically produced sequences.
  • allelic variants can be both naturally occurring variants and also synthetically produced variants or those produced by recombinant DNA techniques.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be DNA molecules, in particular cDNA or genomic molecules. Furthermore, the nucleic acid molecules according to the invention can be RNA molecules.
  • the nucleic acid molecules according to the invention or parts thereof can e.g. B. obtained from natural sources, be produced by recombinant techniques or synthetically.
  • To express the nucleic acid molecules according to the invention in sense or antisense orientation in plant cells these are linked to regulatory DNA elements which ensure transcription in plant cells. These include promoters in particular. In general, any promoter active in plant cells can be used for the expression.
  • the promoter can be selected so that the expression takes place constitutively or only in a certain tissue, at a certain time in plant development or at a time determined by external influences, which can be chemically or biologically inducible, for example.
  • the promoter - like the nucleotide sequence - can be homologous or heterologous.
  • Suitable promoters are, for example, the 35S RNA promoter of the Cauliflower Mosaic Virus for constitutive expression, the patatin gene promoter B33 (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J.
  • a termination sequence terminating the nucleic acid molecule according to the invention can serve for the correct termination of the transcription and the addition of a poly-A tail to the transcript, which is assigned a function in stabilizing the transcripts.
  • Such elements are described in the literature (cf. Gielen et al., 1989, EMBO J. 8: 23-29) and are interchangeable.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be used for the production of transgenic plant cells and plants which are increased or decreased in the activity of the ⁇ -amylase or in the activity of the ⁇ -amylase and at least one further enzyme of starch metabolism.
  • the nucleic acid molecules according to the invention are introduced into suitable vectors, with the necessary regulatory nucleic acid sequences for efficient transcription provided in plant cells and introduced into plant cells.
  • the nucleic acid molecules according to the invention for inhibiting the synthesis of the endogenous ⁇ -amylase or the endogenous ⁇ -amylase and at least one further protein from group A in the cells.
  • nucleic acid molecules according to the invention can be used to express the ⁇ -amylase or the ⁇ -amylase and at least one further protein of group A in cells of transgenic plants and thus lead to an increase in the activity of the respectively expressed enzymes in the cells.
  • nucleic acid molecules according to the invention to inhibit the synthesis of the endogenous ⁇ -amylase and the overexpression of at least one other Group A protein in the cells.
  • nucleic acid molecules according to the invention can also be used to express ⁇ -amylase and to inhibit at least one further group A protein in cells of transgenic plants.
  • the latter two embodiments of the invention thus lead to a simultaneous inhibition and increase in the activities of the respectively inhibited or expressed enzymes in the cells.
  • Another object of the invention is a vector containing a nucleic acid molecule according to the invention.
  • vector encompasses plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and other vectors which are common in genetic engineering and which contain the nucleic acid molecules according to the invention and are suitable for transforming cells.
  • Such vectors are preferably suitable for transforming plant cells. Especially they preferably allow the nucleic acid molecules according to the invention to be integrated into the genome of the plant cell, optionally together with flanking regulatory regions. Examples of this are binary vectors, such as pBinAR or pBinB33, which can be used in the gene transfer mediated by agrobacteria.
  • the vector according to the invention is characterized in that the nucleotide sequence which codes for a protein with the function of a ⁇ -amylase or whose parts are present in the sense or anti-sense direction.
  • the vector according to the invention is characterized in that the nucleotide sequence which codes for one or more proteins selected from group A or parts thereof is present in the sense or anti-sense direction.
  • the vector according to the invention is characterized in that the nucleotide sequence which codes for a plurality of proteins selected from group A or parts thereof is present partly in the sense direction and partly in the anti-sense direction.
  • the vector according to the invention is very particularly preferably linked to regulatory elements which express, i.e. e.g. ensure the transcription and synthesis of an RNA, which can be translated in the case of a nucleotide sequence present in the sense direction, in a pro- or eukaryotic cell.
  • deletions at the 5 'end of the DNA sequence make it possible, for example, to specifically produce enzymes which, by removing the corresponding transit or signal sequences, no longer in their original (homologous) compartment, but in the cytosol, or due to the addition of other signal sequences are located in one or more other (heterologous) compartments.
  • the DNA sequences according to the invention or parts of these sequences can be introduced into plasmids which permit mutagenesis or a sequence change by recombination of DNA sequences.
  • Base exchanges can be carried out or natural or synthetic sequences can be added.
  • adapters or links can be attached to the fragments.
  • Manipulations which provide suitable restriction sites or which remove excess DNA or restriction sites can also be used. Where insertions, deletions or substitutions are possible, ' rro mutagenesis, primer repair, restriction or ligation can be used.
  • Another object of the invention is a host cell, in particular prokaryotic or eukaryotic cells, preferably bacterial or plant cells (for example from E.
  • nucleic acid molecule or a vector according to the invention contains a nucleic acid molecule or a vector according to the invention or that of a cell containing a nucleic acid molecule according to the invention or a vector according to the invention was transformed.
  • Another object of the invention is a host cell, in particular prokaryotic or eukaryotic cells, preferably bacterial or plant cells (for example from E. coli, Agrobacterium, Solananceae, Poideae, rye, barley, oats, corn, wheat, millet, sago, rice, Pea, marker pea, cassava, potato, tomato, rapeseed, soybean, hemp, flax, sunflower, cow pea, mung bean, bean, banana or arrowroot), which in addition to a recombinant nucleic acid molecule coding for a protein with the function of a ⁇ -amylase, one or contains a number of further recombinant nucleic acid molecules which code for a protein selected from group A, or parts thereof or nucleotide sequences which hybridize with these nucleic acid molecules.
  • prokaryotic or eukaryotic cells preferably bacterial or plant cells (for example from E. coli, Agrobacterium, Solan
  • the host cells according to the invention can optionally also be produced by successive transformation (so-called "super transformation”), in that individual nucleotide sequences or vectors containing nucleotide sequences which code for a protein with the function of branching enzymes, ADP-giucose pyrophosphorylases , Starch grain-bound starch synthases, soluble starch synthases I, II, III or IV, branching enzymes, disproportionation enzymes, plastid starch phosphorylases, R1 enzymes, amylases, glucosidases, parts thereof, and nucleic acid molecules which hybridize with one of the said nucleotide sequences or parts thereof , successive cell transformations.
  • successive transformation in that individual nucleotide sequences or vectors containing nucleotide sequences which code for a protein with the function of branching enzymes, ADP-giucose pyrophosphorylases , Starch grain-bound starch synthases, soluble starch
  • Another embodiment of the present invention relates to a method for producing a transgenic plant cell which synthesizes a modified starch, characterized in that a nucleic acid molecule or a vector according to the invention is integrated into the genome of a plant cell.
  • nucleic acid molecules according to the invention it is possible, using genetic engineering methods, to intervene in the starch metabolism of plants and to change it in such a way that a modified starch is synthesized which, for example, in terms of structure, water content, protein content, lipid content, fiber content, Ash / phosphate content,
  • Amylose / amylopectin ratio molecular weight distribution, degree of branching, grain size and shape as well as crystallization or also in their physicochemical properties such as flow and sorption behavior, gelatinization temperature, viscosity, thickening performance, solubility, paste structure, transparency, heat, shear and acid stability, tendency to retrogradation, Gel formation, freeze / thaw stability, complex formation, iodine binding, film formation, adhesive strength, enzyme stability, digestibility or reactivity is changed in comparison to starch synthesized in wild-type plants.
  • the synthesized protein can be localized in any compartment of the plant cell.
  • the transit or signal sequence ensuring the localization may have to be deleted (removed) and the remaining coding region possibly linked to DNA sequences, which ensure localization in the respective compartment.
  • sequences are known (see for example Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95-106).
  • the production of plant cells with a reduced activity of a protein involved in starch metabolism can be achieved, for example, by expressing an appropriate antisense RNA, a sense RNA to achieve a cosuppression effect, in vivo mutagenesis or the expression of a correspondingly constructed ribozyme that specifically cleaves transcripts which encode one of the proteins involved in starch metabolism, using a nucleic acid molecule according to the invention, preferably by expression of an antisense transcript.
  • a DNA molecule can be used that comprises the entire sequence coding for a protein involved in starch metabolism, including any flanking sequences that may be present, as well as DNA molecules that only comprise parts of the coding sequence, these parts having a minimum length of 1 5 bp, preferably of at least 100-500 bp, and in particular of over 500 bp.
  • DNA molecules are used which are shorter than 5000 bp, preferably shorter than 2500 bp.
  • DNA sequences which have a high degree of homology to the sequences of the DNA molecules according to the invention, but which are not completely identical. The minimum homology should be greater than approximately 65%. The use of sequences with a homology of 75% and in particular 80% is preferred.
  • ribozymes for reducing the activity of certain proteins in cells is known to the person skilled in the art and is described, for example, in EP-B1-0 321 201.
  • the expression of ribozymes in plant cells was e.g. described in Feyter et al. (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-338).
  • the reduction of the proteins involved in starch metabolism in the plant cells according to the invention can also be achieved by the so-called "in vivo mutagenesis", in which a hybrid RNA-DNA oligonucleotide ("chimeroplast”) is introduced into cells by transforming cells (Kipp PB et al, Poster session at.
  • in vivo mutagenesis in which a hybrid RNA-DNA oligonucleotide (“chimeroplast”) is introduced into cells by transforming cells (Kipp PB et al, Poster session at.
  • Part of the DNA component of the RNA-DNA oligonucleotide used here is homologous to a nucleic acid sequence of an endogenous protein, but has a mutation in comparison to the nucleic acid sequence of the endogenous protein or contains a heterologous region which is enclosed by the homologous regions.
  • the mutation or contained in the DNA component of the RNA-DNA oligonucleotide can heterologous region can be transferred into the genome of a plant cell. This leads to a reduction in the activity of the protein involved in starch metabolism.
  • the enzyme activities involved in starch metabolism in the plant cells can be reduced by a cosuppression effect.
  • This method is known to the person skilled in the art and is described, for example, in Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel et al., (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), Palaqui and Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159), Vaucheret et al., (Mol. Gen. Genet 248 (1995), 31 1 -317), de Borne et al. (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621) and other sources.
  • DNA molecules can be used for the transformation, which simultaneously contain several regions coding for the corresponding enzymes in antisense orientation under the control of a suitable promoter.
  • Each sequence can alternatively be under the control of its own promoter, or the sequences can be transcribed as a fusion from a common promoter, so that the synthesis of the proteins in question is inhibited to approximately the same or different extent.
  • the length of the individual coding regions which are used in such a construct what has already been stated above for the production of antisense constructs applies. In principle, there is no upper limit for the number of antisense fragments transcribed from a promoter in such a DNA molecule. However, the resulting transcript should generally not exceed a length of 25 kb, preferably 1 5 kb.
  • nucleic acid molecules according to the invention With the aid of the nucleic acid molecules according to the invention, it is possible to transform plant cells and to inhibit the synthesis of several enzymes at the same time. Furthermore, the nucleic acid molecules according to the invention can be introduced into classic mutants which are defective or defective in relation to one or more genes of starch biosynthesis (Shannon and Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller and Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, London, 2nd edition: 25-86).
  • defects can relate, for example, to the following proteins: starch-grain-bound (GBSS I) and soluble starch synthases (SSS I, II, III and IV), branching enzymes (BE I, ILA and Mb), "debranching" enzymes (R-enzymes , Isoamylases, pullulanases), disproportionation enzymes and plastid starch phosphorylases.
  • GBSS I starch-grain-bound
  • SSS I, II, III and IV soluble starch synthases
  • BE I, ILA and Mb branching enzymes
  • R-enzymes "debranching" enzymes
  • Isoamylases Isoamylases
  • pullulanases pullulanases
  • disproportionation enzymes plastid starch phosphorylases.
  • the present invention thus also relates to transgenic plant cells obtainable by a method according to the invention, which have been transformed with a nucleic acid molecule or vector according to the invention, and to transgenic plant cells which originate from cells transformed in this way.
  • the cells according to the invention contain a nucleic acid molecule according to the invention, this being preferably linked to regulatory DNA elements which ensure transcription in plant cells, in particular with a promoter.
  • the cells according to the invention can be distinguished from naturally occurring plant cells, inter alia, in that they contain a nucleic acid molecule according to the invention which does not naturally occur in these cells or in that such a molecule is integrated at a location in the genome of the cell where it is not otherwise occurs, ie in a different genomic environment.
  • the transgenic plant cells according to the invention can be distinguished from naturally occurring plant cells in that they contain at least one copy of a nucleic acid molecule according to the invention stably integrated into their genome, if appropriate in addition to copies of such a molecule which occur naturally in the cells. If the nucleic acid molecule (s) introduced into the cells is an additional copy of the molecules already naturally occurring in the cells, the plant cells according to the invention can be made of naturally occurring ones distinguish by the fact that this additional copy (s) is (are) located at locations in the genome where they do not naturally occur. This can be checked, for example, using a Southern blot analysis.
  • Plant cells according to the invention are preferred in which the enzyme activity of individual enzymes involved in starch metabolism is increased or decreased by at least 10%, particularly preferably at least 30% and very particularly preferably by at least 50%.
  • the plant cells according to the invention can preferably be distinguished from naturally occurring plant cells by at least one of the following features: If the introduced nucleic acid molecule according to the invention is heterologous in relation to the plant cell, the transgenic plant cells have transcripts of the introduced nucleic acid molecules according to the invention. These can e.g. B. by Northern blot analysis.
  • the plant cells according to the invention contain one or more proteins which are encoded by an introduced nucleic acid molecule according to the invention. This can e.g. B. by immunological methods, in particular by Western blot analysis.
  • the cells according to the invention can be distinguished from naturally occurring cells, for example due to the additional expression of nucleic acid molecules according to the invention.
  • the transgenic plant cells contain, for example, more or fewer transcripts of the nucleic acid molecules according to the invention. This can e.g. B. can be detected by Northern blot analysis.
  • "More” or “less” preferably means at least 10% more or less, preferably at least 20% more or less and particularly preferably at least 50% more or less transcripts than corresponding non-transformed cells.
  • the cells preferably also have a corresponding (at least 10%, 20% or 50%) increase or decrease in the content of protein according to the invention.
  • the transgenic plant cells can be regenerated into whole plants using techniques known to those skilled in the art.
  • the plants obtainable by regeneration of the transgenic plant cells according to the invention and processes for producing transgenic plants by regeneration of whole plants from the plant cells according to the invention are likewise the subject of the present invention.
  • the invention furthermore relates to plants which contain the transgenic plant cells according to the invention.
  • the transgenic plants can in principle be plants of any species, i.e. both monocot and dicot plants. They are preferably useful plants, i.e. Plants that are cultivated by humans for purposes of nutrition or for technical, especially industrial purposes. These are preferably starch-storing plants, e.g.
  • Cereals (rye, barley, oats, maize, wheat, millet, sago etc.), rice, peas, marker peas, cassava, potatoes, tomatoes, rapeseed, soybeans, hemp, flax, sunflower, cow peas, mung beans or arrowroot.
  • the invention also relates to propagation material of the plants according to the invention, for example fruits, seeds, tubers, rhizomes, seedlings, cuttings, calli, protoplasts, cell cultures etc.
  • the change in the enzymatic activities of the enzymes involved in the starch metabolism results in the synthesis of a starch with a different structure in the plants produced by the process according to the invention.
  • a large number of cloning vectors are available to prepare the introduction of foreign genes into higher plants, which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 etc.
  • the desired sequence can be inserted into the .vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is used for the transformation of £ .co // cells. Transformed .co // ' cells are grown in a suitable medium, then harvested and lysed. The plasmid is recovered.
  • Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analysis method for characterizing the plasmid DNA obtained (Sambrook et al. Loc.cit.). After each manipulation, the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained can be linked to other DNA sequences. Each plasmid DNA sequence can be cloned in the same or different plasmids.
  • a variety of techniques are available for introducing DNA into a plant host cell. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transformation agent, the fusion of protoplasts using polyethylene glycol (PEG), the injection, the electroporation of DNA, the introduction of DNA using the biolistic method and More options.
  • Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transformation agent
  • PEG polyethylene glycol
  • DNA When DNA is injected and electroporated into plant cells, there are no special requirements for the plasmids or DNA used. Simple plasmids such as e.g. pUC derivatives can be used. If whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is necessary.
  • Simple plasmids such as e.g. pUC derivatives can be used. If whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is necessary.
  • the Ti or Ri plasmid is used for the transformation of the plant cell, then at least the right boundary, but often the right and left boundary of the Ti and Ri plasmid T-DNA as a flank region, must be linked to the genes to be introduced.
  • Agrobacteria are used for the transformation, the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate vector or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria on the basis of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination.
  • Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria. Using a helper plasmid, the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation).
  • Binary vectors can replicate in both E. coli and agrobacteria. They contain a selection marker gene and a linker or polylinker, which are framed by the right and left T-DNA border region. They can be transformed directly into the agrobacteria (Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 1 63: 181-187).
  • the agrobacterium serving as the host cell should contain a plasmid bearing a wr region. The wir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell. Additional T-DNA may be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and is sufficiently described in EP 12051 6; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 and An et al. (1985) EMBO J. 4: 277-287.
  • plant exhibits can expediently be cocultured with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Whole plants can then again be made from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which may contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells be regenerated.
  • the plants thus obtained can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • Other possibilities of introducing foreign DNA using the biolistic method or by protoplast transformation are known (see, for example, Willmitzer, L, 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (HJ Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).
  • EP 292 435 describes a process by means of which fertile plants can be obtained starting from a slimy, soft (friable) granular corn callus.
  • Shillito et al. Bio / Technology 7 (1989), 581) have observed in this connection that for the regenerability to fertile plants it is also necessary to start from callus suspension cultures from which a dividing protoplast culture, with the ability to regenerate plants, can be produced. After an in vitro cultivation time of 7 to 8 months, Shillito et al. Plants with viable offspring, but which have abnormalities in morphology and reproductivity.
  • Prioli and Sondahl (Bio / Technology 7 (1989), 589) also describe the regeneration and extraction of finished maize plants from vlais protoplasts.
  • the introduced DNA is integrated in the genome of the plant cell, it is generally stable there and is also retained in the progeny of the originally transformed cell. It usually contains a selection marker that gives the transformed plant cells resistance to a biocide or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinothricin and others. taught.
  • the individually chosen marker should therefore allow the selection of transformed cells from cells that lack the inserted DNA.
  • the transformed cells grow within the plant in the usual way (see also McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
  • the resulting plants can be grown normally and crossed with plants that have the same transformed genetic makeup or other genetic makeup.
  • the resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic characteristics.
  • Two or more generations should be grown to ensure that the phenotypic trait is stably maintained and inherited. Seeds should also be harvested to ensure that the appropriate phenotype or other traits have been preserved.
  • Another object of the invention is a process for the production of starch in a manner known per se, in which plant cells, plants, plant parts or propagation material according to the invention are processed or integrated into the process.
  • Processes for extracting the starch from plants or from starch-storing parts of plants are known to the person skilled in the art.
  • Process for extracting starch from Corn seeds are e.g. B. in Eckhoff et al. (Cereal Chem. 73 (1996) 54-57).
  • the extraction of maize starch on an industrial scale is usually achieved by so-called "wet milling”.
  • methods for extracting the starch from various starch-storing plants are described, e.g. B. in "Starch: Chemistry and Technology (Ed .: Whistler, BeMiller and Paschall (1994), 2nd edition, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-1 2-746270-8; see e.g. chapter
  • the transgenic plant cells and plants according to the invention synthesize a starch whose physicochemical properties have been changed, for example, compared to starch synthesized in wild-type plants.
  • Yet another object of the invention is starch, which can be obtained from a plant cell, plant, its propagation material or a method according to the invention.
  • Another embodiment of the present invention also includes the industrial use of the starch according to the invention for the production of foods, packaging materials or disposable articles.
  • the starch according to the invention can be prepared by methods known to those skilled in the art be modified and is suitable in unmodified or modified form for various uses in the food or non-food sector.
  • the possible uses of the starch according to the invention can basically be divided into two large areas.
  • One area comprises the hydrolysis products of starch, mainly glucose and glucose building blocks, which are obtained by enzymatic or chemical processes. They serve as the starting material for further chemical modifications and processes, such as fermentation.
  • the simplicity and cost-effective execution of a hydrolysis process can be important here, as is currently carried out essentially enzymatically using amyloglucosidase. It would be conceivable to save costs by using fewer enzymes.
  • Starch is a classic additive for many foods, where it essentially takes on the function of binding aqueous additives or increases the viscosity or increases gel formation. Important characteristics are the flow and sorption behavior, the swelling and gelatinization temperature, the viscosity and thickening performance, the solubility of the starch, the transparency and paste structure, the heat, shear and acid stability, the tendency to retrogradation, the ability to form films, the Freeze / thaw stability, digestibility and the ability to form complexes with, for example, inorganic or organic ions. 2.
  • starch is used as an additive for different manufacturing processes or as an additive in technical products.
  • starch is primarily used for retardation (retention of solids), the setting of filler and fine particles, as a strengthening agent and for drainage.
  • the favorable properties of the starch in terms of rigidity, hardness, sound, grip, gloss, smoothness, splitting resistance and surfaces are exploited.
  • starches A large area of use of starches is in the adhesive industry, where the possible uses are divided into four areas: use as pure starch glue, use in those prepared with special chemicals Starch glues, the use of starch as an additive to synthetic resins and polymer dispersions and the use of starch as an extender for synthetic adhesives.
  • 90% of the starch-based adhesives are used in the fields of corrugated cardboard, paper bags, bags and pouches, composite materials for paper and aluminum, cardboard packaging and rewetting glue for envelopes, stamps, etc.
  • starch as a sizing agent, i.e. as an auxiliary for smoothing and strengthening the hook-and-loop behavior to protect against the tensile forces acting during weaving and to increase the abrasion resistance during weaving, starch as an agent for textile finishing, especially after quality-reducing pretreatments such as bleaching, dyeing etc., starch as a thickening agent in the manufacture of color pastes to prevent dye diffusion and starch as an additive to chaining agents for sewing threads.
  • the fourth area of application is the use of starches as an additive in building materials.
  • One example is the production of gypsum plasterboard, in which the starch mixed in the gypsum slurry pastes with the water, diffuses to the surface of the gypsum board and binds the cardboard to the board there.
  • Other areas of application are admixing to plaster and mineral fibers.
  • starch products are used to delay setting.
  • starch products lends itself to the manufacture of soil stabilization agents, which are used in the case of artificial earth movements temporary protection of the soil particles against water can be used.
  • Combined products made of starch and polymer emulsions are, according to current knowledge, equivalent to the products previously used in their erosion and incrustation-reducing effects, but are priced significantly below these.
  • starch in crop protection agents to change the specific properties of the preparations. This is how starches are used to improve the wetting of crop protection agents and fertilizers, to release the active substances in a dosed manner, to convert liquid, volatile and / or malodorous substances into microcrystalline, stable, moldable substances, to mix incompatible compounds and to extend the duration of action by reducing the decomposition used.
  • starches are used as binders for tablets or for binder dilution in capsules. Starches also serve as tablet disintegrants since they absorb liquid after swallowing and swell to such an extent after a short time that the active substance is released. Medical lubricant and wound powders are based on starch for qualitative reasons. In the field of cosmetics, starches are used, for example, as carriers for powder additives such as fragrances and salicylic acid. A relatively large area of application for starch is toothpaste.
  • Starch is used as an additive to coal and briquette. Coal can be agglomerated or briquetted with a high-quality addition of starch, which prevents the briquettes from breaking down prematurely.
  • the starch addition is between 4 and 6% for barbecued coal and between for calorified coal 0, 1 and 0.5%. Furthermore, starches are becoming increasingly important as binders, since their addition to coal and briquette can significantly reduce the emissions of harmful substances.
  • Starch can also be used as a flocculant in ore and coal sludge processing.
  • Another area of application is as an additive to foundry additives.
  • Various casting processes require cores that are made from binder-mixed sands.
  • Bentonite which is mixed with modified starches, mostly swelling starches, is predominantly used today as a binder.
  • the purpose of the starch addition is to increase the flow resistance and to improve the binding strength.
  • the swelling starches can have other production requirements, such as dispersibility in cold water, rehydration, good miscibility in sand and high water retention capacity.
  • Starch is used in the rubber industry to improve technical and optical quality. The reasons for this are the improvement of the surface gloss, the improvement of the handle and the appearance, for this reason starch is sprinkled on the sticky rubberized surfaces of rubber materials before the cold vulcanization, and the improvement of the printability of the rubber.
  • starch secondary products in the processing process (starch is only a filler, there is no direct link between synthetic polymer and starch) or, alternatively, the integration of starch secondary products in the production of polymers (starch and polymer are one firm bond).
  • starch as a pure filler is not competitive compared to other substances like talc. It is different if the specific starch properties come into play and this significantly changes the property profile of the end products.
  • An example of this is the use of starch products in the processing of thermoplastics, such as polyethylene.
  • the starch and the synthetic polymer are combined by co-expression in a ratio of 1: 1 to form a 'master batch', from which various products are made with granulated polyethylene using conventional processing techniques.
  • starch in polyurethane foams.
  • starch derivatives By adapting the starch derivatives and by optimizing the process, it is possible to control the reaction between synthetic polymers and the hydroxyl groups of the starches.
  • the result is polyurethane films which, through the use of starch, obtain the following property profiles: a reduction in the coefficient of thermal expansion, a reduction in shrinkage behavior, an improvement in pressure / stress behavior, an increase in Permeability to water vapor without changing the water absorption, reducing the flammability and the tear density, no dripping of flammable parts, freedom from halogen and reduced aging.
  • Disadvantages that are currently still present are reduced compressive strength and reduced impact resistance.
  • Solid plastic products such as pots, plates and bowls can also be manufactured with a starch content of over 50%.
  • starch / polymer mixtures can be assessed favorably because they have a much higher biodegradability.
  • starch graft polymers Because of their extreme water-binding capacity, starch graft polymers have also become extremely important. These are products with a backbone made of starch and a side grid of a synthetic monomer grafted on according to the principle of the radical chain mechanism.
  • the starch graft polymers available today are characterized by better binding and retention properties of up to 1000 g of water per g of starch with high viscosity.
  • the areas of application for these superabsorbents have expanded significantly in recent years and are in the hygiene area with products of diapers and pads as well as in the agricultural sector, e.g. seed pilling.
  • modified starches by means of genetic engineering methods can, on the one hand, the properties of e.g. Change the starch obtained from the plant so that further modifications by means of chemical or physical changes no longer appear to be necessary.
  • starches modified by genetic engineering processes can also be subjected to further chemical modifications, which leads to further improvements in quality for certain of the areas of use described above.
  • These chemical modifications are generally known. In particular, these are modifications by heat and pressure treatment, treatment with organic or inorganic acids, enzymatic treatment, oxidations and esterifications, which e.g. lead to the formation of phosphate, nitrate, sulfate, xanthate, acetate and citrate starches.
  • monohydric or polyhydric alcohols can be used in the presence of strong acids to produce starch ethers, so that starch alkyl ether, O-allyl ether, hydroxyl alkyl ether, O-carboxylmethyl ether, N-containing starch ether, P-containing starch ether, S-containing starch ether , cross-linked starches or starch graft polymers result.
  • the starches according to the invention are used in industrial applications, preferably for food or in the production of packaging materials and disposable articles.
  • Buffer A 50 mM Tris-HCl pH 8.0
  • Buffer B 50mM Tris-HCl pH 7.6 2.5mM DTT 2mM EDTA
  • Buffer C 0.5 M sodium citrate pH 7.6 50 mM Tris-HCl pH 7.6 2.5 mM DTT 2 mM EDTA
  • the vector pBluescript II SK (Stratagene) was used for cloning in E. coli.
  • the gene constructions were cloned into the binary vector pBinAR Hyg (Höfgen & Willmitzer, 1 990r Plant Sei. 66: 221-230) and pBinB33-Hyg.
  • the f. co // strain DH5 ⁇ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) was used.
  • the E. co // strain XL1-Blue was used for the in vivo excision.
  • the plasmid pBinAR is a derivative of the binary vector plasmid pBin19 (Bevan, 1984, Nucl. Acid Res. 12: 871 1 -8721), which was constructed as follows: A 529 bp fragment which contains the nucleotides 6909-7437 of the 35S promoter of the Cauliflower mosaic virus was isolated as an EcoRI / Kpnl fragment from plasmid pDH51 (Pietrzak et al., 1986) and ligated between the EcoRI and Kpnl sites of the polylinker of pUC18 and was designated plasmid pUC18-35S.
  • a 192 bp fragment was isolated from the plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., 1983) using the restriction endonucleases Hindill and Pvull, DNA of the Ti plasmid pTiACH ⁇ (Gielen et al, 1984, EMBO J.: 835-846) comprises (nucleotides 1 1749-1 1939). After adding Sphl linkers to the Pvull site, the fragment was ligated between the SpHI and HindIII sites of pUC18-35S and was designated plasmid pA7.
  • the DNA was transferred by direct transformation using the Höfgen & Willmitzer method (1988, Nucleic Acids Res. 16: 9877).
  • the plasmid DNA of transformed agrobacteria was isolated by the method of Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acids Res. 7: 1513-1 523) and analyzed by gel electrophoresis after a suitable restriction cleavage.
  • % Bacto agar laid After a week's incubation at 25 ° C. and 3000 lux, the leaves were induction on MS medium with 1.6% glucose, 1.4 mg / l zeatin ribose, 20 mg / l naphthylacetic acid, 20 mg / l giberellic acid, 250 mg / l Claforan, 50 mg / l kanamycin, and 0.80. % Bacto agar laid.
  • Potato plants were kept in the greenhouse under the following conditions: light period 16 h at 25000 lux and 22 ° C.
  • the radiocative labeling of DNA fragments was carried out using a DNA random primer labeling kit from Boehringer Mannheim (Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • the starch synthase activity was determined by determining the incorporation of 14 C-glucose from ADP [ 14 C-glucose] into a product insoluble in methanol / KCi as described in Denyer & Smith, 1992, Planta 186: 609-61 7. 8. Detection of soluble starch synthases in the native gel
  • tissue samples from potato tubers were disrupted in 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 2 mM DTT, 2.5 mM EDTA, 10% glycerol and 0.4 mM PMSF.
  • the electrophoresis was carried out in a MiniProtean II chamber (BioRAD).
  • the monomer concentration of the 1.5 mm thick gels was 7.5% (w / v), 25 mM Tris-Glycine pH 8.4 served as gel and running buffer. Equal amounts of protein extract were applied and separated for 2 h at 10 mA per gel.
  • the activity gels were then incubated in 50 mM Tricine-NaOH pH 8.5, 25 mM potassium acetate, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM ADP-glucose, 0.1% (w / v) amylopectin and 0. 5 M sodium citrate. Glucans formed were stained with Lugol's solution.
  • the starch produced by the transgenic potato plants was as follows
  • Starch was isolated from potato plants using standard methods and the amylose to amylopectin ratio according to the method described by Hovenkamp-Hermelink et al. described method (Potato Research 31 (1988) 241 -246).
  • glucose units may be phosphorylated at the carbon atoms of positions C2, C3 and C6.
  • 100 mg of starch in 1 ml of 0.7 M HCl were hydrolyzed for 4 hours at 95 ° C. (Nielsen et. Al. (1 994) Plant Physiol. 105: 1 1 1 - 1 1 7). After neutralization with 0.7 M KOH, 50 ml of the hydrolyzate were subjected to an optical-enzymatic test to determine glucose-6-phosphate subjected.
  • the change in the absorption of the test mixture was followed at 334 nm.
  • the total phosphate was determined as described in Arnes, 1996, method in Enzymology VIII, 1 15-1 18.
  • the grain size was determined using a "Lumosed" photo sedimentometer from Retsch GmbH, Germany. For this purpose, 0.2 g of starch was suspended in approx. 150 ml of water and measured immediately. The program supplied by the manufacturer calculated the average diameter of the starch granules on the assumption of an average density of the starch of 1.5 g / l.
  • the gelatinization or viscosity properties of the starch were recorded with a Viscograph E from Brabender oHG, Germany, or with a Rapid Visco Analyzer, Newport Scientific Pty Ltd, Investment Support Group, Warriewood NSW 2102, Australia.
  • a suspension of 30 g starch in 450 ml water was subjected to the following heating program: heat up from 50 ° C to 96 ° C at 3 ° / min., keep constant for 30 minutes, cool down to 30 ° C at 3 ° / min. and keep it constant for another 30 minutes.
  • the temperature profile provided characteristic gelatinization properties.
  • RVA Rapid Visco Analyzer
  • a suspension of 2 g starch in 25 ml water was subjected to the following heating program: suspend for 60 s at 50 ° C, heat from 50 ° C to 95 ° C at 12 ° / min., Keep constant for 2.5 minutes, cool to 50 ° C at 12 ° C / min. and keep it constant for another 2 minutes.
  • the RVA temperature profile provided the viscometric parameters of the examined starches for the maximum (Max) and final viscosity (Fin), the gelatinization temperature (T), the minimum viscosity (Min) occurring after the maximum viscosity, and the difference between the minimum and final viscosity (setback, Set) (see Table 1 and Fig. 1).
  • Example 1 Isolation of a cDNA fragment coding for ⁇ -amylase from potato
  • the KV832 / pACAG transformants were cultured on YT medium (5 g / l NaCl, 8 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract) with 1% glucose and 1 mM IPTG at 37 ° C.
  • the medium contained 10 mg / l chloramphenicol for selection for the presence of the plasmid pACAG.
  • the medium contained 100 mg / l ampicillin for selection for positive transformants.
  • Plasmid DNA from clearly weakly stained colonies was prepared according to Birnboim & Doly (1979) and used to transform E. coli DH5 ⁇ (Sambrook et al., 1989, loc.cit.). Plasmid DNA from these transformants was used for DNA sequencing and as Seq. ID # 1 identified.
  • the plasmid selected in this way was deposited on July 24, 1998 under the number DSM 12348 at the German Collection for Microorganisms in Braunschweig, FRG, and contains an approximately 1300 bp Asp718 / BamH1 between the CAMV 35S promoter and the ocs terminator Fragment of the as Seq. ID No. 1 shown nucleotide sequence, coding for a ⁇ -amylase from Solanum tuberosum.
  • a 2384 bp EcoRI fragment containing a cDNA coding for SS I from Potato, (Abel 1995, loc.cit.) was smoothed and introduced in the vector pBinAR pre-cut with Smal in a “sense” orientation with respect to the 35S promoter.
  • a 4212 bp Asp718 / Xbal fragment containing a cDNA coding for the SS III from potato was in "antisense" orientation with respect to the 35S promoter between the Asp718 and the Xbal interface of the vector pBinAR-Hyg introduced.
  • a 1650 bp HindIII fragment which contains a partial cDNA coding for the BE enzyme from potato was smoothed and introduced in "antisense" orientation with respect to the B33 promoter into the vector pBinB33 precut with Smal.
  • the plasmid obtained was cut open with BamHI.
  • a 1362 bp BamHI fragment containing a partial cDNA coding for the SS III enzyme from potato (Abel et al., 1996, loc.cit.), Also in the “antisense” orientation with respect to the B33, Promotors introduced.
  • a 2384 bp EcoRI fragment containing a cDNA coding for SS I from potato (Abel, 1995, loc.cit.) was smoothed and inserted into the Smal site of the pBinB33 vector cloned in "antisense" orientation with respect to the B33 promoter.
  • a 1362 bp BamHI fragment containing a partial cDNA coding for the SS III from potato (Abel et al., 1996, loc.cit.) was inserted into the BamHI site of the resulting vector also in an "antisense" orientation with respect to the B33 - Promotors introduced.
  • Example 12 Introduction of the plasmids into the genome of potato cells
  • the plasmids listed in Examples 1 to 11 were transferred individually and / or successively into agrobacteria, with the aid of which the transformation of potato cells was carried out as described above. Whole plants were then regenerated from the transformed plant cells.
  • Example 13 Characterization of the physico-chemical properties of the modified starches
  • the transgenic potato plants showed a change in the physico-chemical properties of the starches they synthesized.
  • the starch formed by these plants differs, for example, from starch synthesized in wild type plants in their phosphate or amylose content, the viscosity or gelatinization properties determined by means of RVA, and their chromatographic behavior.
  • This international depository accepts the microorganism designated under I, which it received on 199 8 - 0 7 - 24 (date of first deposit) 1
  • microorganism referred to under I was received by this international depository on (date of first deposit) and an application for the conversion of this first deposit into a deposit pursuant to the Budapest Treaty was received on (date of receipt of the request for conversion)

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die ein Protein mit der Aktivität einer β-Amylase aus Kartoffel kodieren sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren und Wirtszellen, welche die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, die aus den erfindungsgemäßen Verfahren hervorgehenden Pflanzenzellen und Pflanzen, die von den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisierte Stärke sowie Verfahren zur Herstellung dieser Stärke.

Description

NUKLEINSÄUREMOLEKÜLE KODIEREND FÜR BETA-AMYLASE, PFLANZEN, DIE EINE MODIFIZIERTE STÄRKE SYNTHETISIEREN, HERSTELLUNGSVERFAHREN UND VERWENDUNGEN
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die ein Protein mit der Aktivität einer ß-Amylase aus Kartoffel kodieren sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren und Wirtszellen, welche die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, die aus den erfindungsgemäßen Verfahren hervorgehenden Pflanzenzellen und Pflanzen, die von den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisierte Stärke sowie Verfahren zur Herstellung dieser Stärke.
Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung, die pflanzlichen Inhaltsstoffen als erneuerbaren Rohstoffquellen beigemessen wird, ist die biotechnologische Forschung um eine Anpassung pflanzlicher Rohstoffe an die Anforderungen der verarbeitenden Industrie bemüht. Um die Anwendung von nachwachsenden Rohstoffen in möglichst vielen Einsatzgebieten zu ermöglichen, ist es insofern erforderlich, eine große Stoffvielfalt zur Verfügung zu stellen.
Neben ölen, Fetten und Proteinen stellen Polysaccha de wichtige, nachwachsende Rohstoffe aus Pflanzen dar. Eine zentrale Stellung bei den Polysacchariden nimmt neben Cellulose die Stärke ein, die einer der wichtigsten Speicherstoffe in höheren Pflanzen ist. Neben Mais, Reis und Weizen spielt die Kartoffel insbesondere bei der Stärkeproduktion eine wichtige Rolle.
Das Polysaccharid Stärke ist ein Polymer aus chemisch einheitlichen Grundbausteinen, den Glukosemolekülen. Es handelt sich dabei jedoch um ein sehr komplexes Gemisch aus unterschiedlichen Molekülformen, die sich hinsichtlich ihres Polymerisationsgrades
BE S TAT I GU N GSKO P I E und des Auftretens von Verzweigungen der Glukoseketten unterscheiden. Daher stellt Stärke keinen einheitlichen Rohstoff dar. Man unterscheidet insbesondere die Amylose- '"Stärke, ein im wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1 ,4-glykosidisch verknüpften Glukosemolekülen, von der Amylopektin-Stärke, die ihrerseits ein komplexes Gemisch aus unterschiedlich verzweigten Glukoseketten darstellt. Die Verzweigungen kommen dabei durch das Auftreten von zusätzlichen α-1 ,6-glykosidischen Verknüpfungen zustande. In typischen für die Stärkeproduktion verwendeten Pflanzen, wie z.B. Mais oder Kartoffel, besteht die synthetisierte Stärke zu ca. 25% aus Amylosestärke und zu ca. 75% aus Amylopektin-Stärke.
Die molekulare Struktur der Stärke, die zu einem großen Teil durch den Verzweigungsgrad, das Amylose/Amylopektin-Verhältnis, die durchschnittliche Länge und Verteilung der Seitenketten sowie das Vorhandensein von Phosphatgruppen bestimmt wird, ist ausschlaggebend für wichtige funktioneile Eigenschaften der Stärke bzw. ihrer wäßrigen Lösungen. Als wichtige funktioneile Eigenschaften sind hierbei beispielsweise zu nennen, die Löslichkeit, das Retrogradierungsverhalten, die Filmbildungseigenschaften, die Viskosität, die Farbstabilität, die Verkleisterungseigenschaften sowie Binde- und Klebeeigenschaften. Auch die Stärkekorngröße kann für verschiedene Anwendungen von Bedeutung sein. Für bestimmte Anwendungen ist auch die Erzeugung von hochamylosehaltigen Stärken von besonderem Interesse. Ferner kann eine in Pflanzenzellen enthaltene modifizierte Stärke das Verhalten der Pflanzenzelle unter bestimmten Bedingungen vorteilhaft verändern. Denkbar ist beispielsweise eine Verringerung des Stärkeabbaus während der Lagerung von Stärke-enthaltenden Organen, wie z.B. Samen oder Knollen, vor deren weiterer Verarbeitung, z.B. zur Extraktion der Stärke. Ferner ist es von Interesse, modifizierte Stärken herzustellen, die dazu führen, daß Pfianzenzellen oder pflanzliche Organe, die diese Stärke enthalten, besser zur Weiterverarbeitung geeignet sind, beispielsweise bei der Herstellung von Lebensmitteln wie "Popcorn" oder "Cornflakes" aus Mais oder von Pommes frites, Chips oder Kartoffelpulver aus Kartoffeln. Von besonderem Interesse ist hierbei die Verbesserung der Stärken in der Hinsicht, daß sie ein reduziertes "cold sweetening" aufweisen, d.h. eine verringerte Freisetzung von reduzierenden Zuckern (insbesondere Glucose) bei einer längeren Lagerung bei niedrigen Temperaturen. Gerade Kartoffeln werden häufig bei Temperaturen von 4 bis 8°C gelagert, um den Stärkeabbau während der Lagerung zu minimieren. Die hierbei freigesetzten reduzierenden Zucker, insbesondere Glucose, führen beispielsweise bei der Herstellung von Pommes frites oder Chips zu unerwünschten Bräunungsreaktionen (sogennannte Maillard-Reaktionen).
Die Anpassung der aus Pflanzen isolierbaren Stärke an bestimmte industrielle Verwendungszwecke erfolgt häufig mit Hilfe chemischer Modifikationen, die in der Regel zeit- und kostenintensiv sind. Es erscheint daher wünschenswert, Möglichkeiten zu finden, Pflanzen herzustellen, die eine Stärke synthetisieren, die in ihren Eigenschaften bereits den spezifischen Anforderungen der verarbeitenden Industrie entsprechen und somit ökonomische und ökologische Vorteile in sich vereinen.
Eine Möglichkeit, derartige Pflanzen bereitzustellen, besteht - neben züchterischen Maßnahmen - in der gezielten genetischen Veränderung des Stärkemetabolismus stärkeproduzierender Pflanzen durch gentechnologische Methoden. Voraussetzung hierfür ist jedoch die Identifizierung und Charakterisierung der an der Stärkesynthese - modifikation und -abbau (Stärkemetabolismus) beteiligten Enzyme sowie die Isolierung der entsprechenden, für diese Enzyme kodierenden DNA-Sequenzen.
Die biochemischen Synthesewege, die zum Aufbau von Stärke führen, sind im wesentlichen bekannt. Die Stärkesynthese in pflanzlichen Zellen findet in den Piastiden statt. In photosynthetisch aktiven Geweben sind dies die Chloroplasten, in photosynthetisch inaktiven, stärkespeichernden Geweben die Amyloplasten.
Wichtige am Stärkemetabolismus beteiligte Enzyme sind z.B. die Verzweigungsenzyme (branching enzyme), ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn-gebundene Stärkesynthasen, lösliche Stärkesynthasen, Entzweigungsenzyme (debranching enzyme), Disproportionierungsenzyme, plastidäre Stärkephosphorylasen, die R1 - Enzyme (R1 - Proteine), Amylasen oder Glukosidasen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere bzw. alternative gentechnische Ansätze zur Modifizierung des Stärkemetabolismus in stärkebildenden Pflanzen (z.B. Roggen, Gerste, Hafer, Mais, Weizen, Hirse, Sago, Reis, Erbse, Markerbse, Maniok, Kartoffel, Tomate, Raps, Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Kuherbse, Mungbohne, Bohne, Banane oder Arrowroot) geeignete Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung zu stellen, mittels derer Pflanzenzellen transformiert werden können, so daß die Synthese von veränderten, vorteilhaften Stärkevarietäten ermöglicht wird.
Solche veränderten Stärkevarietäten weisen z.B. Modifikationen in bezug auf ihren Verzweigungsgrad, das Amylose/Amylopektin-Verhältnis, den Phosphatgehalt, die Stärkekorngröße und/oder die durchschnittliche Länge und Verteilung der Seitenketten (d.h. Seitenkettenstruktur) auf.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zur Verfügung zu stellen, die die Herstellung transgener Pflanzen ermöglichen, die eine veränderte Stärkevarietät synthetisieren.
Überraschenderweise synthetisieren transgene Pflanzen, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen transformiert wurden, eine Stärke, die in besonderer Weise in ihren physikochemischen Eigenschaften und/oder in ihrer Seitenkettenstruktur verändert ist, so daß die genannten Aufgaben durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst werden.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Nukleinsäuremolekül, codierend für ein Protein mit der Funktion einer ß-Amylase aus Kartoffel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID NO. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt oder deren Derivate oder Teile, b) Nukleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder deren Derivate oder Teile umfassen oder eine korrespondierende Ribonucleotidsequenz; c) Nukleinsäuremoleküle, die mit den unter (a) oder (b) genannten Nukleinsäuremolekülen hybridisieren oder komplementär sind, vorzugsweise spezifisch hybridisieren und d) Nukleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz der unter (a), (b) oder (c) genannten Nukleinsäuremoleküle abweicht.
Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein für eine ß-Amylase codierendes Nukleinsäuremolekül, das eine Aminosäuresequenz gemäß Seq. ID Nr. 2 oder deren Derivate oder Teile davon gemäß dem cDNA-lnsert des Plasmids St-b-Amy (DSM Nr. 12348) codiert, enthält. Die genannte erfindungsgemäße ß-Amylase ist am Stärkestoffwechsel der Kartoffel beteiligt und ist direkt oder indirekt an der Stärkebiosynthese beteiligt.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff "Derivat" in bezug auf das ß- Amylase-Protein (bzw. dessen Polypeptid, Aminosäuresequenz) der Erfindung ein von Seq. ID Nr. 2 abgeleitetes Polypeptid, das mindestens 86 Aminosäurereste, vorzugsweise mindestens 120, insbesondere mindestens 1 55 und ganz besonders bevorzugt etwa 163-170 Aminosäurereste enthält, die aus der Gruppe der Aminosäurereste bestehend aus 1 12 V, 1 13 P, 1 14 V, 1 16 V, 1 17 M, 1 19 P, 120 L, 139 L, 142 L, 145 A, 146 G, 147 V, 149 G, 1 51 M, 153 D, 155 W, 156 W, 157 G, 160 E, 1 64 P, 1 67 Y, 169 W, 172 Y, 175 L, 183 G, 184 L, 185 K, 187 Q, 190 M, 191 S, 192 F, 193 H, 195 C, 196 G, 197 G, 198 N, 1 99 V, 200 G, 201 D, 205 I, 206 P, 208 P, 210 W, 21 1 V, 219 P, 220 D, 223 Y, 224 T, 228 G, 230 R, 231 N, 233 E, 234 Y, 238 G, 240 D, 243 P, 247 G, 248 R, 249 T, 254 Y, 256 D, 258 M, 261 F, 262 R, 273 I, 276 I, 278 V, 279 G, 281 G, 282 P, 284 G, 285 E, 286 L, 287 R, 288 Y, 289 P, 290 S, 291 Y, 292 P, 298 W, 300 F, 301 P, 302 G, 303 I, 304 G, 306 F, 307 Q, 308 C, 309 Y, 310 D, 31 1 K, 312 Y, 321 A, 325 G, 329 W, 336 D, 337 A, 338 G, 340 Y, 344 P, 347 T, 349 F, 350 F, 362 G, 364 F, 365 F, 368 W, 369 Y, 370 S, 373 L, 376 H, 380 I, 381 L, 384 A, 388 F, 393 V, 394 K, 398 K, 401 G, 402 I, 403 H, 404 W, 406 Y, 41 1 H, 41 2 A, 414 E, 41 5 L, 41 6 T, 417 A, 418 G, 419 Y, 420 Y, 421 N, 426 D, 427 G, 428 Y, 430 P, 431 I, 432 A, 438 H, 443 N, 444 F, 445 T, 446 C, 448 E, 449 M, 453 E, 454 Q, 458 A, 462 P, 465 L, 466 V, 468 Q, 469 V, 481 A, 483 E, 484 N, 485 A, 486 L, 488 R, 489 Y, 490 D, 493 A, 496 Q, 518 T, 519 Y, 520 L, 52,1 R, 526 L, 538 F, 539 V und 542 M gemäß Seq. ID Nr. 2 ausgewählt sind, und das mindestens etwa 1 -61 , vorzugsweise mindestens 1 22, insbesondere mindestens 1 70, bevorzugter mindestens 220 und ganz besonders bevorzugt etwa 232-241 Aminosäurereste enthält, die aus der Gruppe der Aminosäurereste bestehend aus 1 M, 2 A, 3 M, 4 S, 5 L, 6 P, 7 H, 8 Q, 9 I, 10 G, 1 1 A, 12 L, 13 S, 14 G, 1 5 T, 1 6 S, 1 7 L, 18 T, 19 A, 20 E, 21 T, 22 G, 23 G, 24 V, 25 S, 26 C, 27 E, 28 V, 29 P, 30 A, 31 K, 32 G, 33 S, 34 S, 35 A, 36 T, 38 A, 39 M, 40 W, 41 R, 42 T, 44 M, 45 T, 46 N, 47 L, 48 K, 49 V, 50 S, 51 V, 52 Q, 53 K, 54 T, 55 G, 56 T, 57 E, 58 I, 59 D, 60 R, 61 V, 62 S, 63 P, 64 S, 65 P, 66 S, 67 P, 68 P, 69 M, 70 S, 71 P, 73 M, 74 G, 75 G, 76 G, 78 R, 79 P, 80 D, 81 L, 82 L, 84 C, 85 Q, 86 A, 87 L, 88 M, 89 E, 90 A, 91 Q, 92 V, 93 D, 94 E, 95 V, 96 V, 97 E, 98 R, 99 E, 100 Y, 101 K, 103 R, 105 S, 107 E, 108 K, 109 E, 1 10 K, 1 1 1 G, 1 18 M, 122 S, 124 K, 126 D, 127 H, 128 T, 131 R, 132 K, 133 K, 140 Q, 144 S, 1 52 M, 161 R, 1 63 A, 170 G, 176 M, 177 E, 180 K, 186 V, 204 T, 209 R, 212 V, 215 M, 222 A, 226 Q, 227 W, 232 F, 235 V, 241 T, 242 L, 246 K, 251 V, 253 C, 260 G, 263 D, 267 N, 271 D, 272 T, 294 K, 295 D, 297 V, 299 K, 305 A, 314 I, 319 G, 323 A, 324 F, 331 H, 332 T, 335 T, 339 Q, 343 W, 348 N, 352 K, 353 E, 355 G, 356 G, 358 D, 360 Q, 363 E, 371 E, 372 M, 378 E, 382 Q, 383 S, 385 K, 386 A, 387 I, 389 E, 390 D, 391 K, 392 G, 395 I, 397 V, 399 I, 407 G, 413 P, 433 Q, 442 F, 447 V, 452 H, 456 Q, 459 L, 467 R, 470 A, 471 L, 474 Q, 475 E, 477 Q, 478 V, 479 P, 491 D, 492 Y, 494 H, 495 E, 499 Q, 500 A, 501 S, 502 S, 503 L, 505 I, 506 N, 508 Q, 509 S, 51 1 D, 51 3 E, 51 5 C, 524 P, 528 H, 529 P, 530 D, 534 R, 537 A, 546 K, 548 A, 549 N, 550 K, 551 C, 552 R, 555 V, 556 E, 558 E, 559 A, 560 E, 561 H, 562 F, 564 H, 565 I, 566 T, 567 Q, 568 P, 569 L, 570 V, 571 Q, 573 A, 574 A, 575 A, 576 A, 577 L, 578 M und 579 H (hier durch Einbuchstabencode für Aminosäuren angegeben) gemäß Seq. ID Nr. 2 ausgewählt sind. Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff "Teil" in bezug auf das -erfindungsgemäße ß-Amylase-Protein (Polypeptid, Aminosäuresequenz) ein Poly- oder Oligopeptid, bestehend aus mindestens etwa 10-19, vorzugsweise mindestens 80, bevorzugter mindestens 1 60, besonders bevorzugt mindestens 320 und am meisten bevorzugt etwa 400-550 der Aminosäurereste der durch das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül codierten ß-Amylase oder deren Derivate.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Nukleinsäuremolekül, das ein Nukleinsäuremolekül gemäß Seq. ID Nr. 1 enthält, gemäß dem cDNA-lnsert des bei der DSZM am 24.07.1998 hinterlegten Plasmids DSM Nr. 12348 oder dessen Derivate oder Teile, insbesondere der codierenden Region oder deren Derivate oder Teile.
Im Sinne dieser Erfindung umfaßt der Begriff "Derivat" in bezug auf das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül (Nucleotidsequenz oder Polynucleotid) ein Polynucleotid, das mindestens 246 Nucleotide, vorzugsweise mindestens 344, insbesondere mindestens 443, und ganz besonders bevorzugt etwa 467-487 Nucleotide enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 241 T, 245 T, 257 C, 268 G, 272 A, 279 T, 285 A, 290 A, 291 G, 307 A, 309 G, 31 1 A, 314 C, 320 A, 322 A, 323 A, 325 G, 334 G, 335 T, 337 C, 338 C, 340 G, 341 T, 343 T, 346 G, 347 T, 349 A, 350 T, 351 G, 353 T, 355 C, 356 C, 359 T, 361 G, 368 T, 370 A, 386 T, 400 G, 404 T, 406 A, 409 G, 41 6 T, 420 G, 425 T, 433 G, 434 C, 436 G, 437 G, 439 G, 440 T, 442 G, 443 A, 445 G, 446 G, 449 T, 451 A, 452 T, 453 G, 457 G, 458 A, 460 G, 463 T, 464 G, 465 G, 466 T, 467 G, 468 G, 469 G, 470 G, 473 T, 476 T, 478 G, 479 A, 487 G, 490 C, 491 C, 499 T, 500 A, 503 A, 505 T, 506 G, 507 G, 51 1 G, 514 T, 51 5 A, 524 T, 527 T, 533 T, 535 G, 539 A, 542 A, 547 G, 548 G, 551 T, 553 A, 554 A, 557 T, 559 C, 560 A, 562 G, 566 T, 568 A, 569 T, 570 G, 571 T, 572 C, 574 T, 575 T, 576 C, 577 C, 578 A, 583 T, 584 G, 586 G, 587 G, 589 G, 590 G, 592 A, 593 A, 595 G, 596 T, 598 G, 599 G, 601 G, 602 A, 610 A, 613 A, 614 T, 61 5 C, 61 6 C, 61 7 C, 620 T, 622 C, 623 C, 628 T, 629 G, 630 G, 631 G, 632 T, 637 G, 638 A, 653 A, 655 C, 656 C, 658 G, 659 A, -662 T, 667 T, 668 A, 669 C, 670 A, 671 C, 682 G, 683 G, 689 G, 690 G, 691 A, 692 A, 697 G, 698 A, 700 T, 701 A, 704 T, 710 T, 712 G, 713 G, 718 G, 719 A, 727 C, 728 C, 731 T, 734 T, 739 G, 740 G, 742 A, 743 G, 745 A, 746 C, 749 C, 752 T, 755 A, 760 T, 761 A, 766 G, 767 A, 768 T, 769 T, 771 C, 772 A, 773 T, 774 G, 779 G, 781 T, 782 T, 785 G, 787 G, 788 A, 794 T, 806 T, 811 G, 817 A, 818 T, 823 G, 824 A, 826 A, 827 T, 830 A, 832 G, 833 T, 835 G, 836 G, 839 T, 841 G, 842 G, 844 C, 845 C, 850 G, 851 G, 853 G, 854 A, 857 T, 860 G, 862 T, 863 A, 865 C, 866 C, 868 T, 869 C, 871 T, 872 A, 874 C, 875 C, 878 A, 880 A, 884 A, 886 G, 887 G, 892 T, 893 G, 894 G, 898 T, 899 T, 901 C, 902 C, 904 G, 905 G, 907 A, 908 T, 910 G, 911 G, 916 T, 917 T, 919 C, 920 A, 922 T, 923 G, 925 T, 926 A, 928 G, 929 A, 930 C, 931 A, 932 A, 934 T, 935 A, 938 T, 949 T, 950 T, 961 G, 962 C, 973 G, 974 G, 977 A, 980 C, 983 A, 985 T, 986 G, 987 G, 988 G, 1000 C, 1001 C, 1006 G, 1007 A, 1009 G, 1010 C, 1012 G, 1013 G, 1018 T, 1019 A, 1020 C, 1021 A, 1022 A, 1025 A, 1030 C, 1031 C, 1033 G, 1034 A, 1039 A, 1040 C, 1045 T, 1046 T, 1048 T, 1049 T, 1050 C, 1051 A, 1060 G, 1069 T, 1075 A, 1079 A, 1082 A, 1084 G, 1085 G, 1090 T, 1091 T, 1093 T, 1094 T, 1095 C, 1097 T, 1102T, 1103 G, 1104 G, 1105 T, 1106 A, 1108 T, 1109 C, 1118 T, 1121 T, 1124 A, 1126 C, 1127 A, 1130 G, 1139 T, 1187 C, 1192 A, 1193 A, 1196 T, 1199 C, 1201 G, 1202 G, 1204 A, 1205 T, 1207 C, 1208 A, 1209 C, 1210 T, 1211 G, 1212 G, 1216T, 1217 A, 1227 G, 1231 C, 1232 A, 1234 G, 1235 C, 1238 C, 1240 G, 1241 A, 1243 C, 1244 T, 1246 A, 1247 C, 1249 G, 1250 C, 1252 G, 1253 G, 1255 T, 1256 A, 1258 T, 1259 A, 1260 C, 1261 A, 1262 A, 1263 C, 1276 G, 1277 A, 1279 G, 1280 G, 1282 T, 1283 A, 1285 C, 1288 C, 1289 C, 1291 A, 1292 T, 1294 G, 1295 C, 1300 A, 1301 T, 1304 T, 1312 C, 1313 A, 1318 G, 1322 T, 1325 T, 1327 A, 1328 A, 1330 T, 1331 T, 1333 A, 1334 C, 1336 T, 1337 G, 1342 G, 1343 A, 1344 G, 1345 A, 1346 T, 1347 G, 1352 A, 1353 C, 1357 G, 1358 A, 1360 C, 1361 A, 1370 A, 1372 G, 1373 C, 1379 G, 1382 C, 1384 C, 1385 C, 1388 A, 1394 T, 1396 G, 1397 T, 1401 G, 1402 C, 1403 A, 1405 G, 1406 T, 1414 G, 1422 G, 1426 G, 1439 T, 1441 G, 1442 C, 1445 G, 1447 G, 1448 A, 1450 A, 1451 A, 1453 G, 1454 C, 1457 T, 1463 G, 1465 T, 1466 A, 1468 G, 1469 A, 1477 G, 1478 C, 1481 A, 1490 T, 1 51 1 A, 1 520 A, 1 541 T, 1546 G, 1 550 T, 1 552 A, 1553 C, 1 555 T, 1556 A, 1559 T, 1 562 G, 1565 T, 1577 T, 1 580 T, 1 591 A, 1 592 A, 1 594 T, 1 603 T, 1604 T, 1 61 2 T, 1 613 T, 1615 G, 1 616 T, 1 621 A, 1 622 A,
1624 A, 1625 T, 1 626 G, 1 628 A, 1 630 G, 1 633 G, 1640 A, 1661 A, 1 683 T, 1692 T, 1713 A, 1719 T, 1728 C und 1731 C gemäß Seq. ID Nr. 1 und das ferner mindestens etwa 1 -1 27 Nucleotide, vorzugsweise mindestens 253, insbesondere mindestens 354, bevorzugter mindestens 455 und ganz besonders bevorzugt etwa 481 -501 Nucleotide enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1 A, 2 T, 3 G, 4 G, 5 C, 6 A, 7 A, 8 T, 9 G, 10 A, 1 1 G, 12 T, 13 C, 14 T, 15 G, 16 C, 17 C, 18 A, 19 C, 20 A, 21 C, 22 C, 23 A, 24 G, 25 A, 26 T, 27 C, 28 G, 29 G, 30 T, 31 G, 32 C, 33 C, 34 T, 35 T, 36 A, 37 T, 38 C, 39 A, 40 G, 41 G, 42 A, 43 A, 44 C, 45 A, 46 T, 47 C, 48 G, 49 C, 50 T, 51 C, 52 A, 53 C, 54 G, 55 G, 56 C, 57 G, 58 G, 59 A, 60 A, 61 A, 62 C, 63 C, 64 G, 65 G, 66 T, 67 G, 68 G, 69 A, 70 G, 71 T, 72 T, 73 T, 74 C, 75 A, 76 T, 77 G, 78 C, 79 G, 80 A, 81 A, 82 G, 83 T, 84 T, 85 C, 86 C, 87 G, 88 G, 89 C, 90 G, 92 A, 93 G, 94 G, 95 G, 96 G, 97 A, 99 T, 102 A, 103 G, 104 C, 105 T, 106 A, 109 T, 1 10 C, 1 1 1 A, 1 12 G, 1 13 C, 1 15 A, 1 16 T, 1 17 G, 1 18 T, 120 G, 1 21 A, 1 22 G, 123 A, 124 A, 125 C, 126 A, 1 27 C, 1 29 G, 131 T, 132 G, 133 A, 1 34 C, 135 G, 1 37 A, 138 T, 139 T, 140 T, 141 A, 142 A, 143 A, 144 A, 146 T, 148 T, 149 C, 1 50 G, 1 52 T, 153 A, 1 54 C, 155 A, 157 A, 1 60 A, 161 C, 162 A, 163 G, 1 65 A, 1 66 A, 167 C, 1 69 G, 171 A, 172 A, 1 74 T, 175 G, 176 A, 178 A, 1 79 G, 1 80 G, 1 81 G, 183 G, 184 T, 185 C, 188 C, 189 G, 190 T, 191 C, 195 G, 196 T, 199 C, 200 C, 201 G, 202 C, 203 C, 204 G, 205 A, 206 T, 207 G, 208 A, 209 G, 210 T, 21 1 C, 21 6 G, 21 7 A, 218 T, 226 G, 228 A, 229 A, 231 G, 233 G, 234 G, 237 G, 238 G, 239 A, 244 T, 246 A, 247 G, 250 T, 252 T, 254 A, 256 G, 260 T, 262 A, 263 T, 274 G, 275 T, 276 A, 277 G, 278 A, 284 T, 286 G, 287 T, 288 T, 293 G, 295 G, 297 A, 298 T, 301 A, 302 A, 304 G, 306 T, 308 G, 310 A, 313 T, 31 5 G, 324 A, 327 G, 328 A, 331 G, 333 A, 348 T, 352 A, 354 G, 358 T, 360 G, 363 T, 365 G, 369 G, 379 C, 383 C, 392 G, 393 G, 394 A, 395 A, 396 G, 397 A, 402 G, 408 T, 417 A, 419 A, 424 T, 430 A, 432 C, 447 G, 488 C, 495 A, 5T9 T, 528 G, 529 G, 538 A, 549 A, 556 G, 558 T, 567 G, 573 T, 588 T, 600 T, 611 C, 612 G, 618 T, 619 C, 621 T, 626 G, 633 T, 634 G, 639 G, 645 G, 657 A, 665 C, 666 A, 678 G, 681 G, 684 A, 687 G, 693 T, 694 T, 695 T, 703 G, 705 A, 708 G, 709 C, 717 C, 723 A, 726 T, 729 A, 732 T, 744 G, 747 T, 751 G, 756 A, 757 T, 758 G, 762 T, 777 A, 778 G, 780 G, 783 T, 789 T, 799 A, 805 C, 814 A, 815 C, 816 C, 859 C, 861 T, 864 T, 879 A, 882 A, 883 G, 885 T, 889 G, 890 T, 891 A, 912 T, 914 C, 915 T, 941 T, 942 C, 943 A, 951 A, 952 C, 956 G, 966 A, 970 T, 978 G, 992 A, 995 C, 996 C, 999 T, 1003 A, 1004 C, 1014 T, 1015 C, 1026 T, 1027 T, 1028 G, 1029 G, 1042 A, 1055 A, 1062 T, 1065 T, 1066 G, 1067 G, 1072 G, 1078 C, 1080 A, 1087 G, 1098 C, 1115 T, 1119 T, 1120T, 1134G, 1144 C, 1146 A, 1147T, 1148 C, 1155 G, 1156 G, 1157 C, 1159 A, 1161 A, 1165 G, 1166 A, 1169 A, 1171 A, 1172 A, 1173 G, 1174 G, 1175 G, 1179 T, 1183 A, 1186 T, 1191 T, 1195 A, 1197 T, 1200 A, 1203 T, 1219 G, 1224 A, 1233 T, 1237 C, 1245 G, 1267 C, 1281 T, 1296 C, 1305 T, 1311 C, 1320 A, 1350 T, 1354 C, 1355 A, 1356 C, 1365 A, 1366 C, 1368 A, 1377 A, 1386 T, 1393 T, 1400 G, 1408 G, 1409 C, 1410 T, 1411 T, 1412 T, 1413 A, 1420 C, 1421 A, 1423 G, 1428 T, 1429 C, 1432 G, 1435 C, 1436 C, 1456 T, 1472 A, 1474 T, 1476 T, 1479 A, 1483 G, 1485 A, 1494 T, 1499 C, 1500 A, 1501 T, 1503 C, 1504 T, 1507 T, 1508 T,
1509 G, 1514T, 1516 A, 1517 A, 1525 T, 1526 C, 1527 A, 1528 G, 1529 G, 1533 T, 1536 A, 1538 A, 1544 G, 1557 T, 1558 T, 1560 G, 1569 T, 1570 C, 1571 C, 1575 C, 1581 C, 1582 C, 1584 T, 1585 C, 1588 G, 1590 T, 1593 C, 1597 A, 1601 G, 1608 T, 1629 A, 1635 A, 1636 A, 1638 A, 1641 C, 1643 C, 1644 A, 1646 A, 1647 C, 1649 A, 1651 T, 1652 G, 1655 G, 1664T, 1666 G, 1668 G, 1674 G, 1676 C, 1678 G, 1680 G, 1682 A, 1686 C, 1687 G, 1690 C, 1693 A, 1696 A, 1698 T, 1708 G, 1712 A, 1724 C, 1725 T, 1727 C, 1729 C, 1730 T, 1732 A, 1734 G, 1735 C, 1736 A und 1738 T gemäß Seq. ID Nr.1.
Bei der oben explizit angegebenen Numerierung der Positionen der einzelnen Elemente der erfindungsgemäßen Nukleotid- bzw. Aminosäure-Sequenzen gemäß Seq ID Nr. 1 bzw. Seq. ID Nr. 2 werden als Derivate der besagten erfindungsgemäßen Sequenzen auch solche Sequenzen verstanden, in denen die Numerierung der einzelnen Sequenzelemente von denen der erfindungsgemäßen Sequenzen ID Nr. 1 bzw. Nr. 2 abweichen kann. Maßgebend ist hierbei eine signifikante Übereinstimmung von mindestens einem Sequenzabschnitt ("Teil") mit der erfindungsgemäßen Sequenz. Solche Übereinstimmungen können gemäß dem allgemeinen Fachwissen z.B. durch geeignete Computer-Programme einfach ermittelt werden, indem z.B. ein Sequenzvergleich der erfindungsgemäßen Sequenz mit einer in Frage stehenden, zu vergleichenden Sequenz durchgeführt wird (sog. "Sequenz-Alignment"). Derartige Computer-Programme, die z.B. käuflich zu erwerben sind (z.B. Omigaβ, Version 1 .1 .3. der Firma Oxford Molecular Ltd., Oxford, UK) und die zum Teil auch integraler Bestandteil von Sequenzdatenbanken (z.B. EMBL, GenBank) sind, identifizieren z.B. die bestmögliche Übereinstimmung von identischen bzw. gegebenenfalls chemisch äquivalenten Sequenzeiementen und berücksichtigen insbesondere das Vorliegen von Insertionen und/oder Deletionen, die zu einer Verschiebung einzelner Sequenzelemente oder von Sequenzabschnitten führen können und auf diese Weise die Numerierung der Sequenzelemente oder Sequenzabschnitte beeinflussen können.
Ferner umfaßt der Begriff "Derivat" in bezug auf das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül, das für eine ß-Amylase codiert, ein Nukleinsäuremolekül, das durch Addition, Deletion, Insertion oder Rekombination eines oder mehrerer Nucleotide von Seq. ID Nr. 1 abweicht und die Bedingungen wie oben definiert erfüllt.
Außerdem beinhaltet der Begriff "Derivat" in bezug auf das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül, das für eine ß-Amylase codiert, eine komplementäre oder eine revers komplementäre Sequenz (Polynucleotid) des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder von Derivaten oder Teilen davon. Der Begriff "Teil", der sich auf das für eine ß-Amylase codierendes Nukleinsäuremolekül gemäß dieser Erfindung bezieht, umfaßt ein Poly- oder Oligonucleotid, bestehend aus mindestens etwa 1 5-35, vorzugsweise mindestens etwa 36-100, insbesondere mindestens 200, bevorzugter mindestens 400, besonders bevorzugt mindestens 800 und am meisten bevorzugt etwa 1400-1700 der Nucleotide eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, das für eine ß-Amylase codiert, oder deren Derivate.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfassen die Begriffe "Derivat" und/oder "Teil" gemäß der vorliegenden Erfindung ein Polynucleotid, bzw. ein wie oben definiertes Poly- oder Oligopeptid, das eine funktionale und/oder strukturelle Äquivalenz des aus Kartoffel gewonnenen ß-Amylase-Gens (d.h. des Nukleinsäuremoleküls, das für die ß-Amylase codiert) bzw.ß-Amylase-Polypeptids zeigt. Der Begriff "funktionale und/oder strukturelle Äquivalenz" bedeutet im allgemeinen die gleiche, eine äquivalente oder ähnliche Funktion des entsprechenden Moleküls der Erfindung, gegebenenfalls insbesondere biologische Funktion.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend a) eine Nukleotidsequenz codierend für ein Protein mit der Funktion einer ß-Amylase, vorzugsweise aus Kartoffel, oder Teile besagter Nucleotidsequenz und b) ein oder mehrere Nucleotidsequenzen, die für ein Protein kodieren, ausgewählt aus der Gruppe A, bestehend aus Proteinen mit der Funktion von Verzweigungsenzymen, ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen, löslichen Stärkesynthasen, Entzweigungsenzymen, Disproportionierungsenzymen, plastidären Starkephosphorylasen, R1 - Enzymen, Amylasen, Glukosidasen, Teilen von Nukleotidsequenzen kodierend für Proteine ausgewählt aus der Gruppe A und Nukleinsäuremoleküle, die mit einem der besagten Nukleotidsequenzen oder deren Teilen hybridisiert, vorzugsweise ein Desoxyribonukleinsäure- oder Ribonukleinsäure- Molekül, besonders bevorzugt ein cDNA-Molekül. Besonders bevorzugt ist ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem der besagten Nukleotidsequenzen oder deren Teilen spezifisch hybridisiert.
Die erfindungsgemäße Nukleinsaure codierend für ein Protein mit der Funktion einer ß-Amylase aus Kartoffel ist durch Seq. ID Nr. 1 dargestellt, das durch die Nukleotidsequenz kodierte Protein durch Seq. ID Nr. 2.
Seq. ID Nr. 1 : attaatattattattatggcaatgagtctgccacaccagatcggtgccttatcaggaaca tcgctcacggcggaaaccggtggagtttcatgcgaagttccggcgaaggggagttcagct acatcagctatgtggagaacaccgatgacgaatttaaaagtatcggtacaaaaaacagga actgaaattgacagggtgtcgccgtcgccgtcgccgccgatgagtccgatgatgggagga ggaatgcggccggatttattagcgtgtcaagcgttgatggaagctcaggtagatgaggta gttgagagagaatataaggttaggaattcgtcggagaaagagaaaggagttccggtgttt gttatgatgccgttggatagtgtgaaaatggatcatactgtgaataggaagaaggcgatg aatgcgagtttacaggcgttgaagagcgccggtgtggaagggattatgatggatgtgtgg tggggattggtggagagagatgcgccgggagagtataattggggcggttatgctgagctt atggaaatggcgaaaaaacatggactcaaagttcaagctgtgatgtctttccatcaatgt ggtggaaacgtcggtgattcctgcacgatccctcttccaaggtgggttgttgaggagatg gagaaggatccagatcttgcatacacagatcagtggggaaggaggaattttgaatatgta tcgcttggttgcgatacacttccagttcttaaaggaaggactcctgtccaatgctattct gatttcatgagagggtttagagatagatttgagaatctcctaggtgacaccattgtggaa attcaagtcgggatgggtccagctggagagctccgttatccatcctatccggaaaaagat ggagtatggaaattccctggaattggtgcttttcagtgttatgacaagtacatgatcagt agcttacagggtgcagcagaagcttttggtaagcctgaatggggacacaccggtccaacc gatgctggtcagtacaacaattggccagaagataccaactttttcaagaaggaaggtggt ggatgggatagtcaatatggggagttcttcctcacttggtattctgagatgcttttgaac catggtgagaggatactgcaatcagccaaggcgatattcgaggacaagggtgttaagatt tcagttaagattgcaggtattcactggcactatggaacaaggtcccatgcccctgagctg accgctggatactacaacacccgtaaccgagatggttaccttcccatcgcccaaatgctt gcccgccacggtgcagttttcaacttcacatgtgttgagatgcgtgaccacgagcagcca caagatgcactatgtgcacctgagaagttggttaggcaagtggctttagcaactcaggaa ctcaagttccacttgctggggagaatgcattgccacgatacgatgattatgcacatgaa cagatccttcaagcatcctcattgaatatcaacgatcaatcaggtgatagagagatgtgc gcgtttacatatttgaggatgaatcctgacctattccatcctgataactggaggcgattc gttgccttcgtgaagaaaatgaaagaaggaaaagacgcaaacaaatgccgggaacaagta gagagggaggcagagcatttcgtgcatataactcagccgttagtgcaagaagctgcagct gccctcatgcactaagcaaatggttgtcaaatagtactgtaattttgatccttttagcta acatggagtttttcaacatgttacgaggatcttatagctcgttatcgttcttcttatatg tttgtaaaactgtccatcgtgtattttttcgaagttagacattatgtcttaatgaaatga tacataattcagtagtaaaaaaaaaaaaaa
Seq. ID Nr. 2:
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Die erfindungsgemäße ß-Amylase-Nukleotidsequenz weist zu bekannten ß-Amylase- kodierenden Molekülen (Wang et al., 1997, Plant Physiol. 1 13(2):403-409; Yoshigi et al., 1994, Biotechn. & Biochem. 58(6): 1080-1086; Monroe et al., 1991 , Plant Physiol. 97: 1 599-1 601 ) eine vergleichsweise geringe Sequenzhomologie auf. Die Aminosäuresequenz unterscheidet sich darüber hinaus von den im Stand der Technik beschriebenen ß-Amylasen durch eine zusätzliche N-terminale Sequenz (Aminosäuren der Position 1 -25), die auch entsprechend auf der Ebene der Nukleotidsequenz repräsentiert wird.
Erfindungsgemäß geeignete Nukleotidsequenzen, die für ein Protein der Gruppe A kodieren, sind beispielsweise für lösliche (Typ I, II, IM oder IV) oder Stärkekorn- gebundene Stärkesynthase-Isoformen beschrieben in Hergersberg, 1988, Dissertation, Universität Köln; Abel, 1995, Dissertation FU Berlin; Abel et al., 1996, Plant Journal 10(6):981 -991 ; Visser et al., 1989, Plant Sei. 64: 185-192; van der Leij et al., 1991 , Mol. Gen. Genet. 228:240-248; EP-A-0779363; WO 92/1 1376; WO 96/1 5248; WO 97/26362; WO 97/44472; WO 97/45545; Delrue et al., 1992, J. Bacteriol. 174: 3612-3620; Baba et al., 1993, Plant Physiol. 103:565-573; Dry et al., 1992, The Plant Journal 2,2: 193-202 oder auch in den EMBL Datenbank Einträgen X74160; X58453; X88789; X 94400; für Verzweigungsenzym-Isoformen (branching enzyme I, lia oder Mb), Entzweigungsenzym-Isoformen (debranching enzyme, Isoamylasen, Pulluianasen, R1 - Enzyme) oder Disproportionierungsenzym- Isoformen beispielsweise beschrieben in WO 92/14827; WO 95/07335; WO 95/09922; WO 96/19581 ; WO 97/22703; WO 97/32985; WO 97/42328; Takaha et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 1391 -1396 oder auch in dem EMBL Datenbank Eintrag X83969 und solche für ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen und plastidäre Stärkephosphorylase-Isoformen beispielsweise beschrieben in EP-A-0368506; EP-A- 0455316; WO 94/28146; DE 196531 76.4; WO 97/1 1 188; Brisson et al., 1989, The Plant Cell 1 :559-566; Buchner et al., 1 996, Planta 199:64-73; Camirand et al., 1989, Plant Physiol. 89(4 Suppl.) 61 ; Bhatt & Knowler, J. Exp. Botany 41 (Suppl.) 5-7; Lin et al., 1991 , Plant Physiol. 95: 1 250-1253; Sonnewald et al., 1 995, Plant Mol. Biol. 27:567-576; DDBJ Nr. D23280; Lorberth et al., 1998, Nature Biotechnology 1 6:473- 477. Die erfindungsgemäß geeignet einzusetzenden Nukleotidsequenzen sind pro- oder eukaryontischen Ursprungs, vorzugsweise bakteriellen, pilzlichen oder pflanzlichen Ursprungs.
Der Begriff "Teile von Nukleotidsequenzen" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung Teile der erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleotidsequenzen, die mindestens 1 5 bp, vorzugsweise mindestens 1 50 bp, besonders bevorzugt mindestens 500 bp lang sind, jedoch eine Länge von 5000 bp, vorzugsweise 2500 bp nicht überschreiten.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind.
Besonders bevorzugt erfolgt eine "spezifische Hybridisierung", unter den folgenden hoch-stringenten Bedingungen:
Hybridisierungspuffer: 2 x SSC; 10 x Denhardt-Lösung (Fikoll 400 + PEG + BSA;
Verhältnis 1 : 1 : 1 ); 0, 1 % SDS; 5 mWI EDTA; 50 mM Na2HP04; 250 μg/ml
Heringssperma-DNA; 50 μg/ml tRNA; oder 0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2; 1 mM EDTA; 7% SDS bei einer
Hybridisierungstemperatur: T = 55 bis 68°C,
Waschpuffer: 0,2 x SSC; 0, 1 % SDS und
Waschtemperatur: T = 40 bis 68°C.
Die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle. Unter Fragmenten werden dabei Teile der Nukleinsäuremo- leküle verstanden, die lang genug sind, um einen Teil der beschriebenen Proteine zu odieren. Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der erfindungsgemaßen Nukleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 60 %, vorzugsweise über 70 % und besonders bevorzugt über 85 %. Die Abweichungen zu den erfindungsgemaßen Nukleinsäuremolekülen können dabei durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen oder Rekombinationen entstanden sein.
Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder strukturelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nukleinsäuremolekülen oder den durch sie kodierten Proteinen, besteht. Bei den Nukleinsäuremolekülen, die homolog zu den erfindungsgemaßen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Pflanzenspezies, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen kann es sich um DNA-Moleküle handeln, insbesondere um cDNA- oder genomische Moleküle. Ferner können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle RNA-Moleküle sein. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Teile davon können z. B. aus natürlichen Quellen gewonnen sein, durch rekombinante Techniken oder synthetisch hergestellt sein. Zur Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in sense- oder antisense-Orientierung in pflanzlichen Zellen werden diese mit regulatorischen DNA- Elementen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu zählen insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Expression jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt, der z.B. chemisch oder biologisch induzierbar sein kann. In Bezug auf die transformierte Pflanze kann der Promotor - wie auch die Nukleotidsequenz - homolog oder heterolog sein. Geeignete Promotoren sind z.B. der Promotor der 35S RNA des Cauliflower Mosaic Virus für eine konstitutive Expression, der Patatingen-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8:23-29) für eine knollenspezifische Expression in Kartoffeln oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z.B. der ST-LS1 -Promotor (Stockhaus et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 7943-7947; Stockhaus et al., 1989, EMBO J. 8: 2445-2451 ) oder für eine endosperm-spezifische Expression der HMG-Promotor aus Weizen oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais.
Eine das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül abschließende Terminationssequenz kann der korrekten Beendigung der Transkription dienen, sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., 1989, EMBO J. 8:23-29) und sind beliebig austauschbar.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können für die Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen verwendet werden, die in der Aktivität der ß-Amylase oder in der Aktivität der ß-Amylase und mindestens eines weiteren Enzyms des Stärkemetabolismus erhöht oder erniedrigt sind. Hierfür werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in geeignete Vektoren eingebracht, mit den notwendigen regulatorischen Nukleinsäure-Sequenzen für eine effiziente Transkription in pflanzlichen Zellen versehen und in pflanzliche Zellen eingeführt. Es besteht zum einen die Möglichkeit, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur Inhibierung der Synthese der endogenen ß-Amylase oder der endogenen ß-Amylase und mindestens eines weiteren Proteins der Gruppe A in den Zellen zu verwenden. Dies kann mit Hilfe von antisense-Konstrukten, in vivo Mutagenese, eines auftretenden Cosuppressionseffektes oder mit Hilfe von in entsprechender Weise konstruierten Ribozymen erreicht werden. Andererseits können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur Expression der ß-Amylase oder der ß-Amylase und mindestens eines weiteren Proteins der Gruppe A in Zellen transgener Pflanzen verwendet werden und so zu einer Steigerung der Aktivität der jeweils exprimierten Enzyme in den Zellen führen.
Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur Inhibierung der Synthese der endogenen ß-Amylase und der Überexpression mindestens eines weiteren Proteins der Gruppe A in den Zellen zu verwenden.
Schließlich können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle auch zur Expressionn der ß-Amylase und der Inhibierung mindestens eines weiteren Proteins der Gruppe A in Zellen transgener Pflanzen verwendet werden. Die beiden letztgenannten Ausführungsformen der Erfindung führen so zu einer gleichzeitigen Hemmung und Steigerung der Aktivitäten der jeweils inhibierten bzw. exprimierten Enzyme in den Zellen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor, enthaltend ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül.
Der Begriff "Vektor" umfaßt Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten und zur Transformation von Zellen geeignet sind. Vorzugsweise sind derartige Vektoren zur Transformation pflanzlicher Zellen geeignet. Besonders bevorzugt erlauben sie die Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, gegebenenfalls zusammen mit flankierenden regulatorischen Regionen, in das Genom der Pflanzenzelle. Beispiele hierfür sind binäre Vektoren, wie pBinAR oder pBinB33, die bei dem Agrobakterien-vermittelten Gentransfer eingesetzt werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich der erfindungsgemäße Vektor dadurch aus, daß die Nukleotidsequenz, die für ein Protein mit der Funktion einer ß- Amylase codiert oder deren Teile in sense- oder anti-sense-Richtung vorliegt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich der erfindungsgemäße Vektor dadurch aus, daß die Nukleotidsequenz, die für ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe A oder Teilen davon kodiert, in sense- oder anti-sense- Richtung vorliegt.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich der erfindungsgemäße Vektor dadurch aus, daß die Nukleotidsequenz, die für mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe A oder Teilen davon kodiert, teilweise in sense- Richtung und teilweise in anti-sense-Richtung vorliegt.
Der erfindungsgemäße Vektor ist ganz besonders bevorzugt mit regulatorischen Elementen verknüpft, die die Expression, d.h. z.B. die Transkription und Synthese einer RNA, die im Fall einer in sense-Richtung vorliegenden Nukleotidsequenz translatierbar ist, in einer pro- oder eukaryontischen Zelle gewährleisten.
Darüberhinaus ist es möglich, mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY) verschiedenartige Mutationen in die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen einzuführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit gegebenfalls veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletionen vom 5'- oder vom 3'- Ende der kodierenden DNA-Sequenzen erzeugt werden, die zur Synthese entsprechend verkürzter Proteine führen. Durch derartige Deletionen am 5'-Ende der DNA-Sequenz ist es beispielsweise möglich, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Entfernen der entsprechenden Transit- oder Signal-Sequenzen nicht mehr in ihrem ursprünglichen (homologen) Kompartiment, sondern im Cytosol, oder aufgrund der Addition von andereren Signalsequenzen in einem oder mehreren anderen (heterologen) Kompartimenten lokalisiert sind.
Andererseits ist auch die Einführung von Punktmutationen denkbar an Positionen, bei denen eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluß beispielweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z.B. Mutanten hergestellt werden, die einen veränderten KM- oder kcat-Wert besitzen oder die nicht mehr den normalerweise in der Zeile vorliegenden Regulationsmechanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen.
Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teile dieser Sequenzen in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von molekularbiologischen Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, loc.cit.) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung stellen oder die überfüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen in Frage kommen, können in 'rro-Mutagenese, "primer repair" , Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und ggf. weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Wirtszelle, insbesondere prokaryontische oder eukaryontische Zellen, vorzugsweise bakterielle oder pflanzliche Zellen (z.B. aus E.coli, Agrobacterium, Solananceae, Poideae, Roggen, Gerste, Hafer, Mais, Weizen, Hirse, Sago, Reis, Erbse, Markerbse, Maniok, Kartoffel, Tomate, Raps, Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Kuherbse, Mungbohne, Bohne, Banane oder Arrowroot), die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält oder die von einer Zelle, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert wurde, abstammt.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Wirtszelle, insbesondere prokaryontische oder eukaryontische Zellen, vorzugsweise bakterielle oder pflanzliche Zellen (z.B. aus E.coli, Agrobacterium, Solananceae, Poideae, Roggen, Gerste, Hafer, Mais, Weizen, Hirse, Sago, Reis, Erbse, Markerbse, Maniok, Kartoffel, Tomate, Raps, Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Kuherbse, Mungbohne, Bohne, Banane oder Arrowroot), die neben einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül codierend für ein Protein mit der Funktion einer ß-Amylase, ein oder mehrere weitere rekombinante Nukleinsäuremoleküle enthält, die für ein Protein ausgewählt aus der Gruppe A kodieren, oder deren Teilen oder mit diesen Nukleinsäuremolekülen hybridisierende Nukleotidsequenzen.
Neben der Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle lassen sich die erfindungsgemäßen Wirtszellen ggf. auch durch sukzessive Transformation herstellen (sog. "Supertransformation"), indem einzelne Nukleotidsequenzen oder Vektoren enthaltend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein codieren mit der Funktion von Verzweigungsenzymen, ADP-Giukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen, löslichen Stärkesynthasen I , II, III oder IV, Entzweigungsenzymen, Disproportionierungsenzymen, plastidären Starkephosphorylasen, R1 - Enzymen, Amylasen, Glukosidasen, Teilen davon, sowie Nukleinsäuremoleküle, die mit einem der besagten Nukleotidsequenzen oder deren Teilen hybridisiert, in mehreren, aufeinderfolgenden Transformationen der Zellen eingesetzt werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle, die eine modifizierte Stärke synthetisiert, dadurch gekennzeichnet, daß ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder ein erfindungsgemäßer Vektor in das Genom einer Pflanzenzelle integriert wird.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle ist es möglich, mit Hilfe gentechnischer Methoden in den Stärkemetabolismus von Pflanzen einzugreifen und ihn dahingehend zu verändern, daß es zur Synthese einer modifizierten Stärke kommt, die beispielsweise in bezug auf Struktur, Wassergehalt, Proteingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt, Asche/Phosphatgehalt,
Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmassenverteilung, Verzweigungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallisation oder auch in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften wie Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur, Viskosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur, Transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrogradationsneigung, Gelbildung, Gefrier/Taustabilität, Komplexbildung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität, Verdaulichkeit oder Reaktivität im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert ist. Durch eine Erhöhung der Aktivität von am Stärkemetabolismus beteiligten Proteinen, beispielsweise durch Überexpression entsprechender Nukleinsäuremoleküle, oder durch die Bereitstellung von Mutanten, die nicht mehr den zelleigenen Regulationsmechanismen unterliegen und/oder unterschiedliche Temperaturabhängigkeiten in bezug auf ihre Aktivität besitzen, besteht die Möglichkeit der Ertragssteigerung in entsprechend gentechnisch veränderten Pflanzen. Durch die Steigerung der Aktivität einer oder mehrerer am Stärkemetabolismus beteiligten Proteinen in bestimmten Zellen der stärkespeichernden Gewebe transformierter Pflanzen wie z.B. in der Knolle bei der Kartoffel oder in dem Endosperm von Mais oder Weizen kann es zu einer besonders ausgeprägten Ertragssteigerung kommen. Die wirtschaftliche Bedeutung und die Vorteile dieser Möglichkeiten des Eingriffs in den Stärkemetabolismus liegen auf der Hand.
Bei der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in Pflanzen besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment (Cytosol, Vakuole, Apoplast, Piastiden, Mitochondrien) zu erreichen, muß die die Lokalisation gewährleistende Transit- oder Signalsequenz ggf. deletiert (entfernt) werden und die verbleibende codierende Region gegebenenfalls mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (siehe beispielsweise Braun et al., EMBO J. 1 1 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991 ), 95-106).
Die Herstellung von Pflanzenzellen mit einer verringerten Aktivität eines am Stärkemetabolismus beteiligten Proteins kann beispielsweise erzielt werden durch die Expression einer entsprechenden antisense-RNA, einer sense-RNA zur Erzielung eines Cosuppressionseffektes, in vivo Mutagenese oder die Expression eines entsprechend konstruierten Ribozyms, das spezifisch Transkripte spaltet, die eines der am Stärkemetabolismus beteiligten Proteine codieren, unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise durch Expression eines antisense-Transkripts.
Hierzu kann zum einen ein DNA-Molekül verwendet werden, das die gesamte für ein am Stärkemetabolismus beteiligtes Protein codierende Sequenz einschließlich eventuell vorhandener flankierender Sequenzen umfaßt, als auch DNA-Moleküle, die nur Teile der codierenden Sequenz umfassen, wobei diese Teile eine Mindestlänge von 1 5 bp, vorzugsweise von mindestens 100-500 bp, und insbesondere von über 500 bp aufweisen. In der Regel werden DNA-Moleküle verwendet, die kürzer als 5000 bp, vorzugsweise kürzer als 2500 bp sind. Möglich ist auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die einen hohen Grad an Homologie zu den Sequenzen der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle aufweisen, aber nicht vollkommen identisch sind. Die minimale Homologie sollte größer als ca. 65 % sein. Die Verwendung von Sequenzen mit einer Homologie von 75% und insbesondere 80 % ist zu bevorzugen.
Die Expression von Ribozymen zur Verringerung der Aktivität von bestimmten Proteinen in Zellen ist dem Fachmann bekannt und ist beispielsweise beschrieben in EP-B1 -0 321 201 . Die Expression von Ribozymen in pflanzlichen Zellen wurden z.B. beschrieben in Feyter et al. (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-338).
Ferner kann die Verringerung der am Stärkemetabolismus beteiligten Proteine in den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen auch durch die sogenannte "in vivo-Mutagenese" erreicht werden, bei der durch Transformation von Zellen ein hybrides RNA-DNA- Oligonucleotid ("Chimeroplast") in Zellen eingeführt wird (Kipp P.B. et al., Poster Session beim "5th International Congress of Plant Molecular Biology, 21 -27, September 1997, Singapore; R.A. Dixon und C.J. Arntzen, Meeting report zu "Metabolie Engineering in Transgenic Plants", Keystone Symposia, Copper Mountain, CO, USA, TIBTECH 1 5 (1997), 441 -447; internationale Patentanmeldung WO 95/1 5972; Kren et al., Hepatology 25 (1997), 1462-1468; Cole-Strauss et al., Science 273 (1996), 1386-1 389).
Ein Teil der DNA-Komponente des hierbei verwendeten RNA-DNA-Oligonucleotids ist homolog zu einer Nucleinsäuresequenz eines endogenen Proteins, weist jedoch im Vergleich zur Nucleinsäuresequenz des endogenen Proteins eine Mutation auf oder enthält eine heterologe Region, die von den homologen Regionen umschlossen ist.
Durch Basenpaarung der homologen Regionen des RNA-DNA-Oligonucleotids und des endogenen Nucleinsäuremoleküls, gefolgt von homologer Rekombination kann die in der DNA-Komponente des RNA-DNA-Oligonucleotids enthaltene Mutation oder heterologen Region in das Genom einer Pflanzenzelle übertragen werden. Dies führt zu einer Verringerung der Aktivität des am Stärkemetabolismus beteiligten Proteins.
Alternativ kann die Verringerung der am Stärkemetabolismus beteiligten Enzymaktivitäten in den Pflanzenzellen durch einen Cosuppressionseffekt erfolgen. Dieses Verfahren ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel et al., (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91 -103), Flavell et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43- 46), Palaqui und Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159), Vaucheret et al., (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 31 1 -317), de Borne et al. (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621 ) und anderen Quellen.
Zur Inhibierung der Synthese mehrerer an der Stärkebiosynthese beteiligter Enzyme in den transformierten Pflanzen können DNA-Moleküle zur Transformation verwendet werden, die gleichzeitig mehrere, die entsprechenden Enzyme codierenden Regionen in antisense-Orientierung unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors enthalten. Hierbei kann alternativ jede Sequenz unter der Kontrolle eines eigenen Promotors stehen, oder die Sequenzen können als Fusion von einem gemeinsamen Promotor transkribiert werden, so daß die Synthese der betreffenden Proteine in etwa gleichem oder unterschiedlichem Ausmaß inhibiert wird. Für die Länge der einzelnen codierenden Regionen, die in einem derartigen Konstrukt verwendet werden, gilt das, was oben bereits für die Herstellung von antisense-Konstrukten ausgeführt wurde. Eine obere Grenze für die Anzahl der in einem derartigen DNA-Molekül von einem Promotor aus transkribierten antisense-Fragmente gibt es im Prinzip nicht. Das entstehende Transkript sollte aber in der Regel eine Länge von 25 kb, vorzugsweise von 1 5 kb nicht überschreiten.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle ist es möglich, Pflanzenzellen zu transformieren und die Synthese mehrerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in klassische Mutanten eingebracht werden, die in bezug auf ein oder mehrere Gene der Stärkebiosynthese defizient oder defekt sind (Shannon und Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller und Paschall, Starch:Chemistry and Technology, Academic Press, London, 2nd Edition: 25-86). Diese Defekte können sich z.B. auf folgende Proteine beziehen: Stärkekorn-gebundene (GBSS I) und lösliche Stärkesynthasen (SSS I, II, III und IV), Verzweigungsenzyme (BE I, lla und Mb), "Debranching"-Enzyme (R-Enzyme, Isoamylasen, Pullulanasen), Disproportionierungsenzyme und plastidäre Starkephosphorylasen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflanzenzellen, erhältlich nach einem erfindungsgemäßen Verfahren, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül oder Vektor transformiert wurden, sowie transgene Pflanzenzellen, die von derartig transformierten Zellen abstammen. Die erfindungsgemäßen Zellen enthalten ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, wobei dieses vorzugsweise mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft ist, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten, insbesondere mit einem Promotor. Die erfindungsgemäßen Zellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen unter anderem dadurch unterscheiden, daß sie ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthalten, das natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommt oder dadurch, daß ein solches Molekül an einem Ort im Genom der Zelle integriert vorliegt, an dem es sonst nicht vorkommt, d.h. in einer anderen genomischen Umgebung. Ferner lassen sich die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, daß sie mindestens eine Kopie eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls stabil integriert in ihr Genom enthalten, gegebenenfalls zusätzlich zu natürlicherweise in den Zellen vorkommenden Kopien eines solchen Moleküls. Handelt es sich bei dem (den) in die Zellen eingeführten Nukleinesäuremolekül(en) um zusätzliche Kopien zu bereits natürlicherweise in den Zellen vorkommenden Molekülen, so lassen sich die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen von natürlicherweise vorkommenden insbesondere dadurch unterscheiden, daß diese zusätzliche(n) Kopie(n) an Orten im Genom lokalisiert ist (sind) an denen sie natürlicherweise nicht vorkommt (vorkommen). Dies läßt sich beispielsweise mit Hilfe einer Southern Blot-Analyse nachprüfen.
Bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Pflanzenzellen, in denen die Enzymaktivität einzelner, am Stärkemetabolismus beteiligter Enzyme zu mindestens 10%, besonders bevorzugt zu mindestens 30% und ganz besonders bevorzugt um mindestens 50% erhöht oder erniedrigt ist.
Weiterhin lassen sich die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen vorzugsweise durch mindestens eines der folgenden Merkmale unterscheiden: Ist das eingeführte erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül heterolog in Bezug auf die Pflanzenzelle, so weisen die transgenen Pflanzenzellen Transkripte der eingeführten erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle auf. Diese lassen sich z. B. durch Northern-Blot-Analyse nachweisen. Beispielsweise enthalten die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen ein oder mehrere Proteine, die durch ein eingeführtes erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül codiert werden. Dies kann z. B. durch immunologische Methoden, insbesondere durch eine Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden.
Ist das eingeführte erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül homolog in Bezug auf die Pflanzenzelle, können die erfindungsgemäßen Zellen von natürlicherweise auftretenden beispielsweise aufgrund der zusätzlichen Expression erfindungsgemäßer Nukleinsäuremoleküle unterschieden werden. Die transgenen Pflanzenzellen enthalten z.B. mehr oder weniger Transkripte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle. Dies kann z. B. durch Northern-Blot-Analyse nachgewiesen werden. "Mehr" bzw. "weniger"bedeutet dabei vorzugweise mindestens 10% mehr bzw. weniger, bevorzugt mindestens 20% mehr bzw. weniger und besonders bevorzugt mindestens 50% mehr bzw. weniger Transkripte als entsprechende nicht-transformierte Zellen. Vorzugsweise weisen die Zellen ferner eine entsprechende (mindestens 10%, 20% bzw. 50%ige) Steigerung bzw. Verminderung des Gehalts an erfindungsgemäßen Protein auf. Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden.
Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen durch Regeneration von ganzen Pflanzen aus den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ferner sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen, die die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Spezies handeln, d.h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen, d.h. Pflanzen, die vom Menschen kultiviert werden für Zwecke der Ernährung oder für technische, insbesondere industrielle Zwecke. Vorzugsweise sind dies stärkespeichernde Pflanzen, wie z.B. Getreidearten (Roggen, Gerste, Hafer, Mais, Weizen, Hirse, Sago etc.), Reis, Erbse, Markerbse, Maniok, Kartoffel, Tomate, Raps, Sojabohne, Hanf, Flachs, Sonnenblume, Kuherbse, Mungbohne oder Arrowroot.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, Kalli, Protoplasten, Zellkulturen etc..
Durch die Veränderung der enzymatischen Aktivitäten der in den Stärkemetabolismus involvierten Enzyme kommt es zur Synthese einer in ihrer Struktur veränderten Stärke in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Pflanzen.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den .Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von £.co//-Zellen verwendet. Transformierte .co//'-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt (Sambrook et al. loc.cit.). Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA- Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, mittels Polyethylenglykol (PEG), die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide bzw. DNA gestellt. Es können einfache Plasmide wie z.B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist jedoch die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T- DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende -DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige wr-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 1 63:181 -187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium sollte ein Plasmid, das eine wr-Region trägt, enthalten. Die wir- Region ist für den Transfer der T- DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 12051 6; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sei., 4: 1 -46 und An et al. (1985) EMBO J. 4: 277-287 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Expiantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistsischen Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vgl. z.B. Willmitzer, L, 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel- Cambridge).
Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491 -506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271 -282).
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.
Spezifisch die Transformation von Mais wird in der Literatur verschiedentlich beschrieben (vgl. z.B. WO95/061 28, EP 0 513 849; EP 0 465 875). In EP 292 435 wird ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe dessen, ausgehend von einem schleimlosen, weichen (friable) granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen erhalten werden können. Shillito et al. (Bio/Technology 7 (1989), 581 ) haben in diesem Zusammenhang beobachtet, daß es ferner für die Regenerierbarkeit zu fertilen Pflanzen notwendig ist, von Kallus-Suspensionskulturen auszugehen, aus denen eine sich teilende Protoplastenkultur, mit der Fähigkeit zu Pflanzen zu regenerieren, herstellbar ist. Nach einer in vitro Kultivierungszeit von 7 bis 8 Monaten erhalten Shillito et al. Pflanzen mit lebensfähigen Nachkommen, die jedoch Abnormalitäten in der Morphologie und der Reproduktivität aufweisen. Prioli und Söndahl (Bio/Technology 7 (1989), 589) beschreiben ebenfalls die Regeneration und die Gewinnung fertiier Mais-Pflanzen aus vlais-Protoplasten.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinothricin u.a. vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Merkmale.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Merkmale erhalten geblieben sind.
Ebenfalls ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Herstellung von Stärke in an sich bekannter Weise, worin erfindungsgemäße Pflanzenzellen, Pflanzen, Pflanzenteilen oder Vermehrungsmaterial verarbeitet bzw. in das Verfahren integriert werden.
Verfahren zur Extraktion der Stärke aus Pflanzen oder aus stärkespeichernden Teilen von Pflanzen sind dem Fachmann bekannt. Verfahren zur Extraktion von Stärke aus Maissamen sind z. B. in Eckhoff et al. (Cereal Chem. 73 (1996) 54-57) beschrieben. Die Extraktion von Maisstärke im industriellen Maßstab wird in der Regel durch das sogenannte "wet milling" erreicht. Weiterhin sind Verfahren zur Extraktion der Stärke aus verschiedenen stärkespeichernden Pflanzen beschrieben, z. B. in "Starch: Chemistry and Technology (Hrsg.: Whistler, BeMiller und Paschall (1994), 2. Ausgabe, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-1 2-746270-8; siehe z. B. Kapitel
XII, Seite 412-468: Mais und Sorghum-Stärken: Herstellung; von Watson; Kapitel
XIII, Seite 469-479: Tapioca-, Arrowroot- und Sagostärken: Herstellung; von Corbishley und Miller; Kapitel XIV, Seite 479-490: Kartoffelstärke: Herstellung und Verwendungen; von Mitch; Kapitel XV, Seite 491 bis 506: Weizenstärke: Herstellung, Modifizierung und Verwendungen; von Knight und Oson; und Kapitel XVI, Seite 507 bis 528: Reisstärke: Herstellung und Verwendungen; von Rohmer und Klem). Vorrichtungen, die für gewöhnlich bei Verfahren zur Extraktion von Stärke von Pflanzenmaterial verwendet werden, sind Separatoren, Dekanter, Hydrocyclone, Sprühtrockner und Wirbelschichttrockner.
Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisieren aufgrund der Expression eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls eine Stärke, die beispielsweise in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert ist.
Noch ein weiterer Erfindungsgegenstand ist auch die Stärke, die aus einer erfindungsgemäßen Pflanzenzelle, Pflanze, deren Vermehrungsmaterial oder einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist.
Zu einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zählt auch die industrielle Verwendung der erfindungsgemäßen Stärke zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Verpackungsmaterialien oder Einwegartikeln.
Die erfindungsgemäßen Stärke kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren modifiziert werden und eignet sich in unmodifizierter oder modifizierter Form für verschiedene Verwendungen im Nahrungsmittel- oder Nicht-Nahrungsmittelbereich.
Die Einsatzmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Stärke lassen sich grundsätzlich in zwei große Bereiche unterteilen. Der eine Bereich umfaßt die Hydrolyseprodukte der Stärke, hauptsächlich Glukose und Glukosebausteine, die über enzymatische oder chemische Verfahren erhalten werden. Sie dienen als Ausgangsstoff für weitere chemische Modifikationen und Prozesse, wie Fermentation. Von Bedeutung kann hier die Einfachheit und kostengünstige Ausführung eines Hydrolyseverfahrens sein, wie es gegenwärtig im wesentlichen enzymatisch unter Verwendung von Amyloglukosidase verläuft. Vorstellbar wäre eine Kosteneinsparung durch einen geringeren Einsatz von Enzymen. Eine Strukturveränderung der Stärke, z.B. Oberflächenvergrößerung des Korns, leichtere Verdaulichkeit durch geringeren Verzweigungsgrad oder eine sterische Struktur, die die Zugänglichkeit für die eingesetzten Enzyme begrenzt, könnte dies bewirken.
Der andere Bereich, in dem die erfindungsgemäße Stärke wegen ihrer polymeren Struktur als sogenannte native Stärke verwendet werden kann, gliedert sich in zwei weitere Einsatzgebiete:
1 . Nahrungsmittelindustrie
Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nahrungsmittel, bei denen sie im wesentlichen die Funktion des Bindens von wäßrigen Zusatzstoffen übernimmt bzw. eine Erhöhung der Viskosität oder aber eine erhöhte Gelbildung hervorruft. Wichtige Eigenschaftsmerkmale sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und Verkleisterungstemperatur, die Viskosität und Dickungsleistung, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz und Kleisterstruktur, die Hitze-, Scher- und Säurestabilität, die Neigung zur Retrogradation, die Fähigkeit zur Filmbildung, die Gefrier/Taustabilität, die Verdaulichkeit sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit z.B. anorganischen oder organischen Ionen. 2. Nicht-Nahrungmittelindustrie
In diesem großen Bereich wird Stärke als Hilfsstoff für unterschiedliche Herstellungsprozesse bzw. als Zusatzstoff in technischen Produkten eingesetzt. Bei der Verwendung von Stärke als Hilfsstoff ist hier insbesondere die Papier- und Pappeindustrie zu nennen. Stärke dient dabei in erster Linie zur Retardation (Zurückhaltung von Feststoffen), der Abbindung von Füllstoff- und Feinstoffteilchen, als Festigungsstoff und zur Entwässerung. Darüber hinaus werden die günstigen Eigenschaften der Stärke in bezug auf die Steifigkeit, die Härte, den Klang, den Griff, den Glanz, die Glätte, die Spaltfestigkeit sowie die Oberflächen ausgenutzt.
2.1 . Papier- und Pappeindustrie
Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier Anwendungsbereiche, nämlich Oberfläche, Strich, Masse und Sprühen, zu unterscheiden. Auf die Oberflächenstärke entfällt mit 80 % des Verbrauchs die mit Abstand größte Stärkemenge, 8 % werden als Strichstärke, 7 % als Massestärke und 5 % als Sprühstärke eingesetzt. Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Oberflächenbehandlung sind im wesentlichen ein hoher Weißegrad, eine angepaßte Viskosität, eine hohe Viskositätsstabilität, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbildung. Bei der Verwendung im Strich spielt der Feststoffgehalt, eine angepaßte Viskosität, ein hohes Bindevermögen sowie eine hohe Pigmentaffinität eine wichtige Rolle. Als Zusatz zur Masse ist eine rasche, gleichmäßige, verlustfreie Verteilung, eine hohe mechanische Stabilität und eine vollständige Zurückhaltung im Papierfließ von Bedeutung. Beim Einsatz der Stärke im Sprühbereich sind ebenfalls ein angepaßter Feststoffgehalt, hohe Viskosität sowie ein hohes Bindevermögen von Bedeutung.
2.2. Klebstoffindustrie
Ein großer Einsatzbereich von Stärken besteht in der Klebstoffindustrie, wo man die Einsatzmöglichkeiten in vier Teilbereiche gliedert: die Verwendung als reinem Stärkeleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemikalien aufbereiteten Stärkeleimen, die Verwendung von Stärke als Zusatz zu synthetischen Harzen und Polymerdispersionen sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für synthetische Klebstoffe. 90 % der Klebstoffe auf Stärkebasis werden in den Bereichen Wellpappenherstellung, Herstellung von Papiersäcken, Beuteln und Tüten, Herstellung von Verbundmaterialien für Papier und Aluminium, Herstellung von Kartonagen und Wiederbefeuchtungsleim für Briefumschläge, Briefmarken usw. eingesetzt.
2.3. Textil- und Textilpflegemittelindustrie
Ein großes Einsatzfeld für Stärken als Hilfmittel und Zusatzstoff ist der Bereich Herstellung von Textilien und Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilindustrie sind die folgenden vier Einsatzbereiche zu unterscheiden: Der Einsatz der Stärke als Schlichtmittel, d.h. als Hilfstoff zur Glättung und Stärkung des Klettverhaltens zum Schutz gegen die beim Weben angreifenden Zugkräfte sowie zur Erhöhung der Abriebfestigkeit beim Weben, Stärke als Mittel zur Textilaufrüstung vor allem nach qualitätsverschlechternden Vorbehandlungen, wie Bleichen, Färben usw., Stärke als Verdickungsmittel bei der Herstellung von Farbpasten zur Verhinderung von Farbstoffdiffusionen sowie Stärke als Zusatz zu Kettungsmitteln für Nähgarne.
2.4. Baustoffindustrie
Der vierte Einsatzbereich ist die Verwendung von Stärken als Zusatz bei Baustoffen. Ein Beispiel ist die Herstellung von Gipskartonplatten, bei der die im Gipsbrei vermischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an die Oberfläche der Gipsplatte diffundiert und dort den Karton an die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche sind die Beimischung zu Putz- und Mineralfasern. Bei Transportbeton werden Stärkeprodukte zur Verzögerung der Abbindung eingesetzt.
2.5. Bodenstabilisation
Ein mengenmäßig begrenzter Markt für Stärkeprodukte bietet sich bei der Herstellung von Mitteln zur Bodenstabilisation an, die bei künstlichen Erdbewegungen zum temporären Schutz der Bodenpartikel gegenüber Wasser eingesetzt werden. Kombinationsprodukte aus Stärke und Pplymeremulsionen sind nach heutiger Kenntnis in ihrer Erosions- und verkrustungsmindernden Wirkung den bisher eingesetzten Produkten gleichzusetzen, liegen preislich aber deutlich unter diesen.
2.6. Einsatz bei Pflanzenschutz- und Düngemitteln
Ein Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke in Pflanzenschutzmitteln zur Veränderung der spezifischen Eigenschaften der Präparate. So werden Stärken zur Verbesserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und Düngemitteln, zur dosierten Freigabe der Wirkstoffe, zur Umwandlung flüssiger, flüchtiger und/oder übelriechender Wirkstoffe in mikrokristalline, stabile, formbare Substanzen, zur Mischung inkompatibler Verbindungen und zur Verlängerung der Wirkdauer durch Verminderung der Zersetzung eingesetzt.
2.7. Pharmaka, Medizin und Kosmetikindustrie
Ein weiteres Einsatzgebiet besteht im Bereich der Pharmaka, Medizin und Kosmetikindustrie. In der pharmazeutischen Industrie werden Stärken als Bindemittel für Tabletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kapseln eingesetzt. Weiterhin dienen Stärken als Tablettensprengmittel, da sie nach dem Schlucken Flüssigkeit absorbieren und nach kurzer Zeit soweit quellen, daß der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizinische Gleit- und Wundpuder basieren aus qualitativen Gründen auf Stärke. Im Bereich der Kosmetik werden Stärken beispielsweise als Träger von Puderzusatzstoffen, wie Düften und Salicylsäure eingesetzt. Ein relativ großer Anwendungsbereich für Stärke liegt bei Zahnpasta.
2.8. Stärkezusatz zu Kohle und Brikett
Einen Einsatzbereich bietet die Stärke als Zusatzstoff zu Kohle und Brikett. Kohle kann mit einem Stärkezusatz quantitativ hochwertig agglomeriert bzw. brikettiert werden, wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts verhindert wird. Der Stärkezusatz liegt bei Grillkohle zwischen 4 und 6 %, bei kalorierter Kohle zwischen 0, 1 und 0,5 %. Des weiteren gewinnen Stärken als Bindemittel an Bedeutung, da durch ihren Zusatz zu Kohle und Brikett der Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermindert werden kann.
2.9. Erz- und Kohleschlammaufbereitung
Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohieschlammaufbereitung als Flockungsmittel eingesetzt werden.
2.10. Gießereihilfsstoff
Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu Gießereihilfsstoffen. Bei verschiedenen Gußverfahren werden Kerne benötigt, die aus Bindemittel-versetzten Sänden hergestellt werden. Als Bindemittel wird heute überwiegend Bentonit eingesetzt, das mit modifizierten Stärken, meist Quellstärken, versetzt ist. Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfestigkeit sowie die Verbesserung der Bindefestigkeit. Darüber hinaus können die Quellstärken weitere produktionstechnische Anforderungen, wie im kalten Wasser dispergierbar, rehydratisierbar, gut in Sand mischbar und hohes Wasserbindungsvermögen, aufweisen.
2.1 1 . Einsatz in der Kautschukindustrie
In der Kautschukindustrie wird Stärke zur Verbesserung der technischen und optischen Qualität eingesetzt. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflächenglanzes, die Verbesserung des Griffs und des Aussehens, dafür wird Stärke vor der Kaltvulkanisation auf die klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen gestreut, sowie die Verbesserung der Bedruckbarkeit des Kautschuks.
2.1 2. Herstellung von Lederersatzstoffen
Eine weitere Absatzmöglichkeit von modifizierten Stärken besteht bei der Herstellung von Lederersatzstoffen. .2.13. Stärke in synthetischen Polymeren,
Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Einsatzgebiete ab: die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in den Verarbeitungsprozess (Stärke ist nur Füllstoff, es besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem Polymer und Stärke) oder alternativ die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in die Herstellung von Polymeren (Stärke und Polymer gehen eine feste Bindung ein).
Die Verwendung von Stärke als reinem Füllstoff ist verglichen mit den anderen Stoffen wie Talkum nicht wettbewerbsfähig. Anders sieht es aus, wenn die spezifischen Stärkeeigenschaften zum Tragen kommen und hierdurch das Eigenschaftsprofil der Endprodukte deutlich verändert wird. Ein Bespiel hierfür ist die Anwendung von Stärkeprodukten bei der Verarbeitung von Thermoplasten, wie Polyäthylen. Hierbei werden die Stärke und das synthetische Polymer durch Koexpression im Verhältnis von 1 : 1 zu einem 'master batch' kombiniert, aus dem mit granuliertem Polyäthylen unter Anwendung herkömmlicher Verfahrenstechniken diverse Produkte hergestellt werden. Durch die Einbindung von Stärke in Polyäthylenfolien kann eine erhöhte Stoffdurchiässigkeit bei Hohlkörpern, eine verbesserte Wasserdampfdurchlässigkeit, ein verbessertes Antistatikverhalten, ein verbessertes Antiblockverhalten sowie eine verbesserte Bedruckbarkeit mit wäßrigen Farben erreicht werden. Gegenwärtige Nachteile betreffen die ungenügende Transparenz, die verringerte Zugfestigkeit sowie eine verringerte Dehnbarkeit.
Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung von Stärke in Polyurethanschäumen. Mit der Adaption der Stärkederivate sowie durch die verfahrenstechnische Optimierung ist es möglich, die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydroxygruppen der Stärken gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind Polyurethanfolien, die durch die Anwendung von Stärke folgende Eigenschaftsprofile erhalten: eine Verringerung des Wärmeausdehnungsoffizienten, Verringerung des Schrumpfverhaltens, Verbesserung des Druck/Spannungsverhaltens, Zunahme der Wasserdampfdurchlässigkeit ohne Veränderung der Wasseraufnahme, Verringerung der Entflammbarkeit und der Aufrißdichte, kein Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und verminderte Alterung. Nachteile, die gegenwärtig noch vorhanden sind, sind verringerte Druckfestigkeit sowie eine verringerte Schlagfestigkeit.
Die Produktentwicklung beschränkt sich inzwischen nicht mehr nur auf Folien. Auch feste Kunststoff produkte, wie Töpfe, Platten und Schalen, sind mit einem Stärkegehalt von über 50 % herzustellen. Des weiteren sind Stärke/ Polymermischungen günstig zu beurteilen, da sie eine sehr viel höhere biologische Abbaubarkeit aufweisen.
Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin auf Grund ihres extremen Wasserbindungsvermögen Stärkepfropfpolymerisate gewonnen. Dies sind Produkte mit einem Rückgrat aus Stärke und einer nach dem Prinzip des Radikalkettenmechanismus aufgepfropften Seitengitters eines synthetischen Monomers. Die heute verfügbaren Stärkepfropfpolymerisate zeichnen sich durch ein besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu 1000 g Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität aus. Die Anwendungsbereiche für diese Superabsorber haben sich in den letzten Jahren stark ausgeweitet und liegen im Hygienebereich mit Produkten Windeln und Unterlagen sowie im landwirtschaftlichen Sektor, z.B. bei Saatgutpillierungen.
Entscheidend für den Einsatz von neuen, gentechnisch veränderten Stärken sind zum einen die Struktur, Wassergehalt, Proteingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt, Asche/Phosphatgehalt, Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmassenverteilung, Verzweigungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallisation, zum anderen auch die Eigenschaften, die in folgende Merkmale münden: Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur, Viskosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur, Transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrogradationsneigung, Gelbildung, Gefrier/Taustabilität, Komplexbildung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabiiität, Verdaulichkeit und Reaktivität.
Die Erzeugung modifizierter Stärken mittels gentechnischer Verfahren kann zum einen die Eigenschaften der z.B. aus der Pflanze gewonnenen Stärke dahingehend verändern, daß weitere Modifikationen mittels chemischer oder physikalischer Veränderungen nicht mehr notwendig erscheinen. Zum anderen können jedoch auch durch gentechnische Verfahren veränderte Stärken weiteren chemischen Modifikationen unterworfen werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qualität für bestimmte der oben beschriebenen Einsatzgebiete führt. Diese chemischen Modifikationen sind grundsätzlich bekannt. Insbesondere handelt es sich dabei um Modifikationen durch Hitze- und Druckbehandlung, Behandlung mit organischen oder anorganischen Säuren, enzymatische Behandlung, Oxidationen und Veresterungen, welche z.B. zur Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-, Xanthat-, Acetat- und Citratstärken führen. Desweiteren können ein- oder mehrwertige Alkohole in Gegenwart starker Säuren zur Erzeugung von Erzeugung von Stärkeethern eingesetzt werden, so daß Stärke-Alkylether, O-Allylether, Hydroxylalkylether, O-Carboxylmethylether, N-haltige Stärkeether, P-haltige Stärkeether, S-haltige Stärkeether, vernetzte Stärken oder Stärke-Pfropf-Polymerisate resultieren.
Eine Verwendung der erfindungsgemäßen Stärken liegt in der industriellen Anwendung, vorzugsweise für Lebensmittel oder der Herstellung von Verpackungsmaterialien und Einwegartikeln.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustrierung der Erfindung und stellen in keiner Weise eine Einschränkung dar.
Verwendete Abkürzungen:
BE branching enzyme (Verzweigungsenzym) bp Basenpaar IPTG Isopropyl ß-D-Thiogalacto-Pyranosid
SS soluble starch synthase (lösliche Stärkesynthase)
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
In den Beispielen verwendete Medien und Lösungen:
20 x SSC 175,3 g NaCI
88,2 g Natrium-Citrat ad 1000 ml mit ddH20 pH 7,0 mit 10 N NaOH
Puffer A 50 mM Tris-HCI pH 8,0
2,5 mM DTT
2 mM EDTA
0,4 mM PMSF
10% Glycerin
0, 1 % Natriumdithionit
Puffer B 50 mM Tris-HCI pH 7,6 2,5 mM DTT 2 mM EDTA
Puffer C 0,5 M Natriumeitrat pH 7,6 50 mM Tris-HCI pH 7,6 2,5 mM DTT 2 mM EDTA
10 x TBS 0,2 M Tris-HCI pH 7,5 5,0 M NaCI 10 x TBST 10 x TBS
0, 1 % (v/v) Tween 20
Elutionspuffer 25 mM Tris pH 8,3 250 mM Glycin
Dialysepuffer 50 mM Tris-HCI pH 7,0
50 mM NaCI
2 mM EDTA
14,7 mM ß-Mercaptoethanol
0,5 mM PMSF
Proteinpuffer 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,2
10 mM EDTA
0,5 mM PMSF
14,7 mM ß-Mercaptoethanol
Beschreibung der Abbildungen:
Fig. 1 stellt ein schematisches RVA-Temperaturprofil (Viskosität vs. Zeit [minj) dar mit den viskosimetrischen Parametern T = Verkleisterungstemperatur, Temperatur zum Zeitpunkt des Verkleisterungsbeginns; Max bezeichnet die maximale Viskosität; Min bezeichnet die minimale Viskosität; Fin bezeichnet die Viskosität am Ende der Messung; Set ist die Differenz (Δ) aus Min und Fin (Setback).
In den Beispielen wurden die folgenden Methoden verwendet:
1 . Klonierungsverfahren
Zur Klonierung in E. coli wurde der Vektor pBluescript II SK (Stratagene) verwendet. Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR Hyg (Höfgen & Willmitzer, 1 990r Plant Sei. 66:221 -230) und pBinB33-Hyg kloniert.
2. Bakterienstämme und Plasmide
Für den Bluescript-Vektor p Bluescript II KS (Stratagene) und für die pBinAR Hyg- und pBinB33 Hyg-Konstrukte wurde der f. co//-Stamm DH5α (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet. Für die in vivo excision wurde der E. co//-Stamm XL1 -Blue verwendet.
pBinAR
Das Plasmid pBinAR ist ein Derivat des binären Vektorplasmids pBin19 (Bevan, 1984, Nucl. Acid Res. 12:871 1 -8721 ), das folgendermaßen konstruiert wurde: Ein 529 bp langes Fragment, das die Nukleotide 6909-7437 des 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus umfaßt, wurde als EcoRI/Kpnl-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., 1986) isoliert und zwischen die EcoRI- und Kpnl- Schnittstellen des Polylinkers von pUC18 ligiert und wurde Plasmid pUC18-35S bezeichnet. Aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., 1983) wurde mit Hilfe der Restriktionsendonucleasen Hindill und Pvull ein 192 bp langes Fragment isoliert, DNA des Ti-Plasmids pTiACHδ (Gielen et al, 1984, EMBO J. :835-846) umfaßt (Nukleotide 1 1749-1 1939). Nach Addition von Sphl-Linkern an die Pvull-Schnittstelle wurde das Fragment zwischen die SpHI- und Hindlll-Schnittstellen von pUC18-35S ligiert und wurde Plasmid pA7 bezeichnet. Desweiteren wurde der gesamte Polylinker enthaltend den 35S-Promotor und ocs-Terminator mit EcoRI und Hindlll herausgeschnitten und in den entsprechend geschnittenen pBin19 ligiert. Dabei entstand der pflanzliche Expressionsvektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990).
pBinB33
Der Promotor des Patatin Gens B33 aus Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al.,
1989) wurde als Dral-Fragment (Nukleotide -1 51 2 - + 14) in den mit Sst I geschnittenen Vektor pUC19, dessen Enden mit Hilfe der T4-DNA Polymerase geglättet worden waren, ligiert. Daraus entstand das Plasmid pUC19-B33. Aus diesem Plasmid wurde der B33-Promotor mit EcoRI und Smal herausgeschnitten und in den entsprechend geschnittenen Vektor pBinAR ligiert. Hieraus entstand der pflanzliche Expressionsvektor pBinB33.
pBinAR-Hyg
Ausgehend vom Plasmid pA7 (vgl. Beschreibung des Vektors pBinAR) wurde das EcoRI-Hindlll Fragment umfassend den 35S-Promotor, den ocs-Terminator sowie den zwischen 35S-Promotor und ocs-Terminator gelegenen Teil des Polylinker in das entsprechend geschnittene pBin-Hyg Plasmid gesetzt.
pBinB33-Hyg
Ausgehend vom Plasmid pBinB33 wurde das EcoRI-Hindlll Fragment umfassend den B33-Promotor, einen Teil des Polylinkers sowie den ocs-Terminator herausgeschnittenen und in den entsprechend geschnittenen Vektor pBin-Hyg ligiert. Hieraus entstand der pflanzliche Expressionsvektor pBinB33-Hyg.
3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens
Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen&Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res. 16:9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim&Doly (1979, Nucleic Acids Res. 7:1513-1 523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.
4. Transformation von Kartoffeln
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum L.cv. Desiree, Vereinigte Saatzuchten eG, Ebstorf) wurde mit Hilfe des Agrobacterium tυmefaciens-Stammes C58C1 durchgeführt (Dietze et al. (1995) in Gene Transfer to Plants. S. 24-29, eds.: Potrykus, I. and Spangenberg, G., Springer Verlag, Deblaere et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13:4777-4788).
Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige&Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473) mit 2% Saccharose gelegt, welches 50 ml einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium f-vrne/ac/eΛS-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1 ,6% Glukose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylaminopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin, und 0,80. % Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1 ,6% Glukose, 1 ,4 mg/l Zeatinribose, 20 mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin, und 0,80. % Bacto Agar gelegt.
5. Pflanzenhaltung
Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten: Lichtperiode 16 h bei 25000 Lux und 22°C
Dunkelperiode 8 h bei 1 5 °C Luftfeuchte 60 %
6. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
Die radiokative Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer Mannheim (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
7. Bestimmung der Stärkesynthase-Aktivität
Die Bestimmung der Stärkesynthaseaktivität erfolgte durch Bestimmung des Einbaus von 14 C-Glukose aus ADP[14 C-Glukose] in ein in Methanol/KCi unlösliches Produkt wie beschrieben in Denyer & Smith, 1992, Planta 186:609-61 7. 8. Nachweis von löslichen Stärkesynthasen im nativen Gel
Zum Nachweis der Aktivität löslicher Stärkesynthasen durch nicht-denaturierende Gelelektrophorese wurden Gewebeproben von Kartoffelknollen in 50 mM Tris-HCI pH 7,6, 2 mM DTT, 2,5 mM EDTA, 10 % Glycerin und 0,4 mM PMSF aufgeschlossen. Die Elektrophorese wurde in einer MiniProtean II Kammer (BioRAD) durchgeführt. Die Monomerkonzentration der 1 ,5 mm dicken Gele war 7,5 % (w/v), als Gel- und Laufpuffer diente 25 mM Tris-Glycin pH 8,4. Gleiche Mengen an Proteinextrakt wurden aufgetragen und für 2 h bei 10 mA je Gel aufgetrennt. Anschließend erfolgte die Inkubation der Aktivitäts-Gele in 50 mM Tricine-NaOH pH 8,5, 25 mM Kaliumacetat, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM ADP-Glukose, 0,1 % (w/v) Amylopektin und 0,5 M Natriumeitrat. Gebildete Glukane wurden mit Lugolscher Lösung angefärbt.
9. Stärkeanalytik
Die von den transgenen Kartoffelpflanzen gebildete Stärke wurde durch folgende
Methoden charakterisiert: a) Bestimmung des Amylose/Amylopektinverhältnisses in Stärke aus
Kartoffelpflanzen
Stärke wurde nach Standardmethoden aus Kartoffelpflanzen isoliert und das Verhältnis Amylose zu Amylopektin nach der von Hovenkamp-Hermelink et al. beschriebenen Methode (Potato Research 31 (1988) 241 -246) bestimmt.
b)Bestimmung des Phosphatgehaltes
In der Kartoffelstärke können einige Glucoseeinheiten an den Kohlenstoffatomen der Position C2, C3 und C6 phosphoryliert sein. Zur Bestimmung des Phosphorylierungsgrades an der C6-Position der Glucose wurden 100 mg Stärke in 1 ml 0,7 M HCI für 4 Stunden bei 95°C hydrolysiert (Nielsen et. al. (1 994) Plant Physiol. 105: 1 1 1 -1 1 7). Nach Neutralisation mit 0,7 M KOH wurden zur Glucose-6- phosphat-Bestimmung 50 ml des Hydrolysats einem optisch-enzymatischen Test unterzogen. Die Änderung der Absorption des Testansatzes ( 100 mM Imidazol/HCI; .10 mM MgCI2; 0,4 mM NAD; 2 U Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aus Leuconostoc mesenteroides; 30°C) wurde bei 334 nm verfolgt.
Die Bestimmung des Gesamtphosphats erfolgte wie in Arnes, 1996, Methode in Enzymology VIII, 1 15-1 18 beschrieben.
c) Analyse der Seitenketten des Amylopektins
Zur Analyse der Verteilung und Länge der Seitenketten in den Stärkeproben wurde 1 ml einer 0, 1 %igen Stärkelösung mit 0,4 U Isoamylase (Megazyme International Ireland Ltd., Bray, Ireland) über Nacht bei 37°C in 100 mM Na-citrat-Puffer, pH 3,5 verdaut.
Die weitere Analyse erfolgte, sofern nicht anders erwähnt, entsprechend den Angaben von Tomlinson et al., (1997), Plant J. 1 1 :31 -47.
d) Korngrößenbestimmung
Die Korngrößenbestimmung wurde mit einem Fotosedimentometer des Typs "Lumosed" der Firma Retsch GmbH, Deutschland, durchgeführt. Hierfür wurden 0.2 g Stärke in ca. 1 50 ml Wasser suspendiert und sofort vermessen. Das vom Hersteller mitgelieferte Programm berechnete den mittleren Durchmesser der Stärkekörner auf der Annahme einer durchschnittlichen Dichte der Stärke von 1 ,5 g/l.
e) Verkleisterungseigenschaften
Die Verkleisterungs- bzw. Viskositätseigenschaften der Stärke wurden mit einem Viskograph E der Firma Brabender oHG, Deutschland, oder mit einem Rapid Visco Analyser, Newport Scientific Pty Ltd, Investment Support Group, Warriewood NSW 2102, Australien, aufgezeichnet. Bei Verwendung des Viskographen E wurde eine Suspension von 30 g Stärke in 450 ml Wasser folgendem Heizprogramm unterzogen: aufheizen von 50°C auf 96°C mit 3°/min., 30 Minuten konstant halten, abkühlen auf 30°C mit 3°/min. und abermals 30 Minuten konstant halten . Das Temperaturprofil lieferte charakteristische Verkleisterungseigenschaften.
Bei der Messung mittels des Rapid Visco Analysers (RVA) wurde eine Suspension von 2 g Stärke in 25 ml Wasser folgendem Heizprogramm unterzogen: 60 s bei 50°C suspendieren, aufheizen von 50°C auf 95°C mit 12°/min., 2,5 Minuten konstant halten, abkühlen auf 50°C mit 12°C/min. und abermals 2 Minuten konstant halten. Das RVA-Temperaturprofil lieferte die viskosimetrischen Parameter der untersuchten Stärken für die maximale (Max) und Endviskosität (Fin), die Verkleisterungstemperatur (T), die nach der maximalen Viskosität auftretende minimale Viskosität (Min) sowie die Differenz aus minimaler und Endviskosität (Setback, Set) (vgl. Tabelle 1 und Fig. 1 ).
f) Bestimmung der Gelfestigkeit
Zur Bestimmung der Gelfestigkeit mittels eines Texture Analyser wurden 2 g Stärke in 25 ml Wasser verkleistert (vgl. Messung mittels RVA) und anschließend 24 h lang bei 25 °C luftdicht verschlossen gelagert. Die Proben wurden unter der Sonde (runder Stempel) eines Texture Analysers TA-XT2 (Stable Micro Systems) fixiert und die Gelfestigkeit mit folgenden Parameter-Einstellungen bestimmt:
Test-Geschwindigkeit 0,5 mm
Eindringtiefe 7 mm
Kontaktfläche (des Stempels) 1 13 mm2
Druck/Kontaktfläche 2 g
10. Bestimmung von Glucose, Fructose und Saccharose
Zur Bestimmung des Glucose-, Fructose- bzw. Saccharosegehalts wurden kleine Knollenstücke (Durchmesser ca. 10 mm) von Kartoffelknollen in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend für 30 min bei 80°C in 0,5 ml 10 mM HEPES, pH 7,5; 80 % (v/v) Ethanol extrahiert. Der Überstand, der die löslichen Bestandteile enthält, -wurde abgenommen und das Volumen bestimmt. Der Überstand wurde zur Bestimmung der Menge an löslichen Zuckern verwendet. Die quantitative Bestimmung von löslicher Glucose, Fructose und Saccharose wurde in einem Ansatz mit folgender Zusammensetzung durchgeführt.
100,0 mM Imidazol/HCI, pH 6,9
1 ,5 mM MgCI2
0,5 mM NADP +
1 ,3 mM ATP
10-50 μ\ Probe
1 ,0 U Glucose-6-Phosphatdehydrogenase aus Hefe
Der Ansatz wurde 5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bestimmung der
Zucker erfolgt anschließend photometrisch durch Messung der Absorption bei 340 nm nach aufeinanderfolgender Zugabe von
1 ,0 Einheiten Hexokinase aus Hefe (zur Bestimmung von Glucose),
1 ,0 Einheiten Phosphoglucoisomerase aus Hefe (zur Bestimmung von Fructose) und
1 ,0 Einheiten Invertase aus Hefe (zur Bestimmung von Saccharose).
Ausführungsbeispiele:
Beispiel 1 : Isolierung eines cDNA-Fragments kodierend für ß-Amylase aus Kartoffel
Etwa 6x106 PIaque forming Units (pfU's) einer Knollen-spezifischen cDNA-Bibliothek aus Kartoffel (λZAP II, Stratagene) wurden nach Herstellerangaben (Stratagene) in vivo excisiert und ein Teil des Phagmidstocks zur Transfektion von E.coli XL1 -MRF-Zellen (nach Herstellerangaben) verwendet. Plasmid-DNA von etwa 5x105 solcher E.coli-Transformanden wurde präpariert (Sambrook et al., 1989,loc.cit.) und zur Transformation nach der Elektroporationsmethode (BioRAD, nach Angaben des Herstellers) von Zellen des E.coli-Stammes KV832/pACAG (Abel, G., 1995, Dissertation am FB Biologie der FU Berlin) verwendet.
Die KV832/pACAG-Transformanden wurden auf YT-Medium (5g/I NaCI, 8g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt) mit 1 % Glukose und 1 mM IPTG bei 37°C kultiviert. Zur Selektion auf das Vorhandensein des Plasmids pACAG enthielt das Medium 10 mg/l Chloramphenicol. Zur Selektion auf positive Transformanden enthielt das Medium 100 mg/l Ampicillin.
Nach etwa 14 Stunden Wachstum wurden die Kolonien der transformierten Zellen über Jod-Dampf gefärbt. Plasmid-DNA deutlich schwach gefärbter Kolonien wurde nach Birnboim & Doly (1979) präpariert und zur Transformation von E. coli DH5α (Sambrook et al., 1989, loc.cit.) verwendet. Plasmid DNA dieser Transformanden wurde zur DNA-Sequenzierung eingesetzt und als Seq. ID Nr. 1 identifiziert.
Das auf diese Weise selektierte Plasmid wurde am 24.07.98 unter der Nummer DSM 12348 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen in Braunschweig, BRD, hinterlegt und enthält zwischen dem CAMV 35S-Promotor und dem ocs-Terminator ein ca. 1300 bp langes Asp718/BamH1 -Fragment der als Seq. ID Nr. 1 dargestellten Nukleotidsequenz, kodierend für eine ß-Amylase aus Solanum tuberosum.
Beispiel 2: Herstellung des Plasmids p35SαSSI-Hyg
Ein 1831 bp langes Asp718/Xbal-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend für die SSS I aus Kartoffel (Abel, G., ( 1995) Dissertation, Freie Universität Berlin), wurde in "antisense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors zwischen die Asp718- und Xbal-Schnittstelle des Vektors pBinAR-Hyg eingeführt.
Beispiel 3: Herstellung des Plasmids p35S-SSI-Kan
Ein 2384 bp langes EcoRI-Fragment, enthaltend eine cDNA kodierend für SS I aus Kartoffel, (Abel 1995, loc.cit.) wurde geglättet und in dem mit Smal -vorgeschnittenen Vektor pBinAR in "sense"-Orientierung bezüglich des 35S- Promotors eingeführt.
Beispiel 4: Herstellung des Plasmids p35SαSSII-Kan
Ein 1959 bp langes Smal/Asp718-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend für die SS II aus Kartoffel (Abel, 1995, dort als GBSS II bezeichnet), wurde geglättet und in "antisense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors in die Smal- Schnittstelle des Vektors pBinAR eingeführt.
Beispiel 5: Herstellung des Plasmids pB33-SSII-Hyg
Ein 2619 bp langes Smal/Sall Fragment, enthaltend eine cDNA kodierend für die SS II aus Kartoffel (Abel, 1995, loc.cit.), wurde in den mit Smal und Sall vorgeschnittenen Vektor pBinB33-Hyg in "sense"-Orientierung bezüglich des B33- Promotors eingeführt.
Beispiel 6: Herstellung des Plasmids p35SαSSIII-Hyg
Ein 4212 bp langes Asp718/Xbal-Fragment, enthaltend eine cDNA kodierend für die SS III aus Kartofffel (Abel et al., 1996, Plant J. 10(6):981 -991 ), wurde in "antisense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors zwischen die Asp718- und die Xbal-Schnittstelle des Vektors pBinAR-Hyg eingeführt.
Beispiel 7: Herstellung des Plasmids p35S-SSIII-Kan
Ein 4191 bp langes EcoRI-Fragment, enthaltend eine cDNA kodierend für SS III aus Kartoffel (Abel et al., 1996, loc.cit.), wurde geglättet und in "sense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors in die Smal-Schnittstelle des Vektors pBinAR eingeführt.
Beispiel 8: Herstellung des Plasmids pB33αBEαSSIII-Kan
Ein 1650 bp langes Hindll-Fragment, welches eine partielle cDNA kodierend für das BE-Enzym aus Kartoffel enthält (Kossmann et al., 1991 , Mol. & Gen. Genetics 230(1- 2):39-44), wurde geglättet und in "antisense"-Orientierung bezüglich des B33 Promotors in den mit Smal vorgeschnittenen Vektor pBinB33 eingeführt. Das erhaltene Plasmid wurde mit BamHI aufgeschnitten. In die Schnittstelle wurde ein 1362 Bp langes BamHI-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend für das SS Ill-Enzym aus Kartoffel (Abel et al., 1996, loc.cit.), ebenfalls in "antisense"- Orientierung bezüglich des B33-Promotors eingeführt.
Beispiel 9: Herstellung des Plasmids p35SαSSII-αSSIII-Kan
Ein 1546 bp langes EcoRV/Hincll-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend für die SS II aus Kartoffel (Abel, 1995, loc.cit.), wurde in den EcoRV/Hincll- geschnittenen Vektor pBluescript II KS kloniert und anschließend über einen Asp718/BamHI-Verdau wieder herausgeschnitten und in den ebenso verdauten Vektor pBinAR in "antisense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors eingefügt. Danach wurde ein 1356 Bp langes BamHI-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend für die SS III aus Kartoffel (Abel et al., 1996, loc.cit.), ebenfalls in "antisense"-Orientierung bezüglich des 35S-Promotors in die BamHI-Schnittstelle des Vektors pBinAR-αSSII eingeführt.
Beispiel 10: Herstellung des Plasmids pB33αSSIαSSIII-Kan
Ein 2384 bp langes EcoRI-Fragment enthaltend eine cDNA kodierend für SS I aus Kartoffel (Abel, 1995, loc.cit.) wurde geglättet und in die Smal-Schnittstelle des pBinB33-Vektors in "antisense"-Orientierung bezüglich des B33-Promotors kloniert. Ein 1362 Bp langes BamHI-Fragment enthaltend eine partielle cDNA kodierend für die SS III aus Kartoffel (Abel et al., 1996, loc.cit.) wurde in die BamHI-Schnittstelle des resultierenden Vektors ebenfalls in "antisense"-Orientierung bezüglich des B33- Promotors eingeführt.
Beispiel 1 1 : Herstellung des Plasmids p35SαSSII-Hyg
Ein 1959 bp langes Smal/Asp718-Fragment, enthaltend eine partielle cDNA kodierend für die SS II (Abel, 1995, loc.cit.), wurde geglättet und in "antisense"- Orientierung bezüglich des 35S-Promotors in die Smal-Schnittstelle des pBinAR-Hyg- Vektors eingeführt.
Beispiel 12: Einführung der Plasmide in das Genom von Kartoffelzellen
Die in Beispiel 1 bis 1 1 aufgeführten Plasmide wurden einzeln und/oder aufeinanderfolgend in Agrobakterien transferiert, mit deren Hilfe die Transformation von Kartoffelzellen wie oben beschrieben vorgenommen wurde. Aus den transformierten Pflanzenzellen wurden anschließend ganze Pflanzen regeneriert.
Beispiel 13: Charakterisierung der physiko-chemischen Eigenschaften der modifizierten Stärken
Als Ergebnis der Transformation zeigten die transgenen Kartoffelpflanzen eine Veränderung der physiko-chemischen Eigenschaften der von ihnen synthetisierten Stärken. Die von diesen Pflanzen gebildete Stärke unterscheidet sich z.B. von in Wildtyppflanzen synthetisierter Stärke in ihrem Phosphat- oder Amylosegehalt, den mittels RVA bestimmten Viskositäts- oder Verkleisterungseigenschaften sowie ihrem chromatographischen Verhalten. BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
Hoechst Schering AgrEvo GmbH INTERNATIONALES FORMBLATT
65926 Frankfurt am Main
EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen: Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER:
St - 3-Amy
DSM 12348
II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter i. bezeichneten Mikroorganismus wurde
( ) eine wissenschaftliche Beschreibung
(X ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht (Zutreffendes ankreuzen).
III. EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 199 8 - 0 7 - 24 (Datum der Ersthinteriegung)1 eingegangen ist
IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Ersthinteriegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung)
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name. DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschπft(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift: Mascheroder Weg 1b D-38124 Braunschweig
Datum. 1998 - 07 - 30
1 Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 0196

Claims

Patentansprüche:
1 . Nukleinsäuremolekül, codierend ein Protein mit der Funktion einer ß-Amylase aus Kartoffel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID NO. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt oder deren Derivate oder Teile, b) Nukleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder deren Derivate oder Teile umfassen oder eine korrespondierende Ribonucleotidsequenz; c) Nukleinsäuremoleküle, die mit den unter (a) oder (b) genannten Nukleinsäuremolekülen hybridisieren, vorzugsweise spezifisch hybridisieren oder komplementär sind, und d) Nukleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz der unter (a), (b) oder (c) genannten Nukleinsäuremoleküle abweicht.
2. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, enthaltend a) ein Nukleinsäuremolekül codierend für ein Protein mit der Funktion einer ß-Amylase aus Kartoffel gemäß Anspruch 1 und b) ein oder mehrere Nukleotidsequenzen, die für ein Protein kodieren, ausgewählt aus der Gruppe A, bestehend aus Proteinen mit der Funktion von Verzweigungsenzymen, ADP-Glukose-Pyrophosphorylasen, Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen, löslichen Stärkesynthasen, Entzweigungsenzymen, Disproportionierungsenzymen, plastidären Starkephosphorylasen, R1 - Enzymen, Amylasen, Glukosidasen, Teilen besagter Nukleotidsequenzen oder mit besagten Nukleotidsequenzen hybridisierende Nukleinsäuremoleküle.
3. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, das ein Desoxyribonukleinsäure- Molekül ist.
4. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, das ein cDNA-Molekül ist.
5. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 , das ein Ribonukleinsäure-Molekül ist.
6. Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 hybridisiert, vorzugsweise spezifisch hybridisiert.
7. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6.
8. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz codierend für ein Protein mit der Funktion einer löslichen Stärkesynthase III oder Teile davon in sense- oder anti-sense-Richtung vorliegt.
9. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 -6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz codierend für ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe A oder Teile davon in sense- oder anti-sense-Richtung vorliegt.
10. Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 -6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz codierend für ein oder mehrere Proteine ausgewählt aus der Gruppe A teilweise in sense- Richtung und teilweise in anti-sense-Richtung vorliegt.
1 1 . Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 -6, dadurch gekennzeichnet, daß es mit regulatorischen Elementen verknüpft ist, die die Transkription und Synthese einer RNA, die ggf. WO 00/08185 59 PCTΛEP99 Θ5523.
translatierbar ist, in einer pro- oder eukaryontischen Zelle gewährleisten.
12. Wirtszelle, die mit einem Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 -6 oder einem Vektor nach einem oder mehreren der Ansprüche 7- 1 1 transformiert ist oder von einer solchen Zelle abstammt.
13. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle, die eine modifizierte Stärke synthetisiert, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nukleinsäuremolekül nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 -6, oder ein Vektors nach Anspruch 7-1 1 in das Genom einer Pflanzenzelle integriert wird.
14. Pflanzenzelle, erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 13.
15. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die eine modifizierte Stärke synthetisiert, dadurch gekennzeichnet, daß aus einer Zelle nach Anspruch 14 eine vollständige Pflanze regeneriert wird.
16. Pflanze, enthaltend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 14.
17. Pflanze nach Anspruch 1 6, die eine Nutzpflanze ist.
18. Pflanze nach einem oder mehreren der Ansprüche 16 bis 17, die eine stärkespeichernde Pflanze ist.
19. Pflanze nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 6 bis 18, die eine Weizen-, Mais-, Kartoffel- oder Reispflanze ist.
20. Vermehrungsmaterial einer Pflanze nach einem oder mehreren der Ansprüche 16 bis 19.
21 . Verfahren zur Herstellung von Stärke nach einem an sich bekannten Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß Pflanzenzellen gemäß Anspruch 14, Pflanzen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 6 bis 19 oder Vermehrungsmaterial nach Anspruch 20 in das Verfahren integriert werden.
22. Stärke, erhältlich aus einer Zelle gemäß Anspruch 12 oder 14, einer Pflanze nach einem oder mehreren der Ansprüche 16 bis 19, aus Vermehrungsmaterial nach Anspruch 20 oder einem Verfahren nach Anspruch 21 .
23. Verwendung der Stärke nach Anspruch 22 im industriellen Bereich, vorzugsweise zur Herstellung von Lebensmitteln, Verpackungsmaterialien oder Einwegartikeln.
24. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 -6 oder Vektoren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7-1 1 zur Herstellung von transgenen Zellen, vorzugsweise bakteriellen oder pflanzlichen Zellen.
25. Verwendung von Pflanzenzellen gemäß Anspruch 14, Pflanzen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 6 bis 19 oder Vermehrungsmaterial nach Anspruch 20 zur Herstellung von Stärke.
PCT/EP1999/005523 1998-07-31 1999-07-30 Nukleinsäuremoleküle kodierend für beta-amylase, pflanzen, die eine modifizierte stärke synthetisieren, herstellungsverfahren und verwendungen WO2000008185A1 (de)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
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