WO1999064469A1

WO1999064469A1 - INHIBITEURS DE FIXATION DE $i(HELICOBACTER PYLORI)

Info

Publication number: WO1999064469A1
Application number: PCT/JP1999/002540
Authority: WO
Inventors: Yoshikatsu Kodama; Nobutake Kimura
Original assignee: Ghen Corporation; Nisshin Flour Milling Co., Ltd.
Priority date: 1998-06-09
Filing date: 1999-05-17
Publication date: 1999-12-16
Also published as: CA2300082A1; AU3731399A; EP1002805A4; EP1002805A1; KR20010022739A

Description

へリコバクタピロリの定着阻害剤技術分野

本発明は、ヘリコバクタ一 · ピロリ (Helicobacter pylori) ( H pと略記することがある）の定着阻害剤、およ明びへリコバクタ一 ' ピロリの感染によって引き起こされる胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を効果的に予防または治療しうる経口予防剤、治療剤に関する。さらに胃炎田、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の予防、改善用食品にも関する。書背景技術

ヘリコバクタ— · ピロリによる感染症は、現在消化器臨床分野で精力的な研究が行われている。その理由は、胃炎や胃潰瘍などの胃疾患の病因がこの菌の関与を抜きに考えられず、また、世界人口の約半数がこの菌に感染しているためである。そこで、 WH Oの国際癌研究機関（IARC) は、疫学的研究からへリコバクタ — · ヒロ Uを definite carcinogen と認 Eしている ₀

へリコパクター . ピロリは、一端に数本の鞭毛（flagella) を持つ、ら旋型をしたグラム陰性桿菌で、ヒ卜の胃粘膜に生息する菌である。この蘭は、 1983年ォ —ストラリアの Marshall, B. J. と Warren, J. R. によって胃炎、胃潰瘍患者の胃生検材料から高率に検出されることが報告され、その後、疫学的研究から、この菌は胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍の起因菌であり、さらには胃癌などの疾患と関連があるとの報告が相次いで発表されている。

ヘリコバクタ一 . ピロリ感染症の病原因子（virulence factor) としては、これまで、この菌が産生するゥレアーゼ、粘膜ムチン層を遊走するための鞭毛、炎症性サイトカインとしてのインタ一ロイキン- 8の産生に関与するとされる Cag A 外膜蛋白、胃粘膜上皮細胞の空胞化 · ビラン ·壊死および潰瘍形成に関与する Va c A空胞化細胞毒が挙げられている。このうちのゥレアーゼについては、ゥレア —ゼにより産生されるアンモニアが、胃内 pHを中和し増殖環境を確保すること、および胃粘膜にダメージを与えることにより、結果的に胃炎や胃潰瘍、さらには胃癌に移行すると考えられていた。

消化性潰瘍の根治的治療にはヘリコバクタ一 · ピロリの除菌が不可欠であると考えられており、その除菌療法としては抗生物質と胃酸分泌抑制剤との併用療法が一般的である。 H pが一旦胃粘膜に定着すると、抗生物質のみによる除菌は難しく、 H pの除菌には、胃酸分泌を強力に抑制するプロトンポンプインヒビ夕一と複数の抗生物質が併用の形でしばしば常用量を超える量で使用されている。しかし、抗生物質の長期投与は、その副作用に加え、耐性菌の増加という非常に重犬な問題が危惧される。

除菌を目的とした抗生物質の投与による副作用および耐性菌の増加などの問題を解決する方法として、経口ワクチンによる免疫療法のアプローチが見られるが、感染モデル動物の作出や実験条件の複雑さが障害となって、新しい予防、治療法の確立を目指した研究はほとんど進展していない。さらに、経口ワクチンにおいて必須のアジュバントの毒性の問題も未解決である。また、ワクチンはあくまで予防を主体とするものであり、一旦 H pが感染した患者に対しては効果は望めない。

さらに、ワクチンに代わる免疫療法として、 H p全菌体を抗原として得られた鶏卵抗体の使用が提案されているが、全菌体に対する抗体では完全な除菌は望めず、また実際の胃内での除菌効果については確認されていない。

一方、ある種のビフィズス菌ゃ乳酸菌の菌体、これらの菌体から抽出した多糖類が胃潰瘍の予防、治療に有用であること（特開平 4 一 5236号公報）、ある種の海草由来のラムノース多糖 · ラムナンやラムノースオリゴ糖が抗潰瘍剤として有用であること（特開平 6 - 247861号公報）が報告されている。また、モズク由来の多糖類であるフコイダンが H pの胃粘膜への定着を阻止し、抗潰瘍性を有するとされている（特開平 7 - 138166号公報）が、この公報における潰瘍治癒作用の証明には、 H pによる潰瘍形成とは病理発生が基本的に異なる酢酸誘発潰瘍が用いられており、従って H p感染による胃炎、胃潰瘍形成の抑制効果を示すものではない。さらに、この公報にはフコース（単糖類）が定着因子と考えられるとの記載があり、その考えに基づき、 H pのフコィダンによる定着阻害をみるインビ卜口実験においてはピオチン化フコースが接着マ一カーとして使用されているが

、現時点ではフコースは接着因子とは考えられていないので、やはり H p定着阻害の効果を示すものではない。

そして、これらは、 H p定着の機構を解明した上で定着阻害剤を開発したものではない。これまで、 H pの胃内定着の機構、具体的には H pの接着因子（adhe sin)や接着因子に対応する胃粘膜上の受容体については明らかにされておらず、定着の機構に関する知見に基づいた有効な H pの定着阻害剤ゃ抗潰瘍剤の開発は行われていなかった。例えば、上記特開平 4 - 5236号公報ではどのような多糖類が抗潰瘍作用を示すのか不明であり、しかも酢酸誘発潰瘍およびアルコール性ス卜レス潰瘍の予防、治療に関するものである。また、上記特開平 6 - 247861号公報では、用いる多糖は脱硫酸処理を施したものであり、後述するように本発明にお、て見出された、 H pの定着阻害には硫酸基が関与するとの知見とは相反するものである。上記特開平 7 - 138166号公報では、主としてフコース（単糖類）からなり、若干のゥロン酸を含有し、構成糖の一部が硫酸エステル化されているフコィダンが用いられ、これが H p定着阻害作用も有するとの記載があるが、やはり多糖鎖の硫酸基が H pの定着阻害に有効であるとの認識は全くみられず、 H p 定着阻害の機構に基づいて薬剤を提供したものではない。しかも、上述のように、この公報の記載からはフコィダンが H p定着阻害の効果があることは示されない。

以上の通り、 H pを除菌するために、抗生物質を長期にわたり使用すると副作用と共に耐性菌の増加の恐れがある等の問題があり、ヮクチンゃ抗体の使用でも十分な効果は望めない。また、各種の多糖類を用いた場合の抗潰瘍作用、また、フコィダンの H p定着阻害効果については、それらの作用機構は明らかにされていない。発明の開示

本発明の目的は、消化性潰瘍の発生に関与する H pの胃内定着に関する機構を解明し、それに基づいて H pの定着阻害剤を提供することである。また、抗生物質の使用に伴う副作用や耐性菌増加という欠点を持たず、 H p感染による胃炎、胃潰瘍等に対して、効果的で安全性の高い予防剤および治療剤、並びに予防または改善用食品を提供することである。

本発明者らは、これまで十分に解明されていなかった、ヘリコバクタ一 · ピロリの胃粘膜への定着に関し、新規な重要な知見を得たことに基づき本発明に至つた。

H pは増殖条件の特殊性から、胃内での生態に関しては十分に解明されていなかった。特に、強酸性の胃内での増殖の鍵となる胃粘膜への定着に関して種々の研究がなされているにもかかわらず、胃内での強い增殖能力の理由ははつきりと説明できなかった。胃粘膜への接着は、胃内での H pの増殖に重要な役割を果たすものであるので、接着因子の解明は、 H pにより引き起こされる胃炎、消化性潰瘍の予防、治療法の開発に大きな意義をもつ。

これまで考えられていたいくつかの病原因子のうちの 1つである、 H pが産生するウレァ一ゼについては、前述のように胃内の尿素をアンモニアに変換するという酵素としての役割が胃炎、胃潰瘍、胃癌などを引き起こすと考えられていた。また、各種実験から、ウレァ一ゼは H pの胃粘膜への定着には関与しない、すなわちウレァ一ゼは接着因子（adhesin)としての機能は持たないと報告されてきた。本発明者らは、 H pの接着に関する従来の研究結果からは予想外の、ゥレアーゼそのものが H pの胃粘膜への接着に関与するとの知見を得た。すなわち、 H Pの産生するウレァ一ゼは、尿素をアンモニアに変換する酵素としての作用に加え、接着因子としての機能が大きいこと、すなわちゥレアーゼ自体が胃粘膜ムチンに結合することによりこの菌の増殖が可能となることを見出した。

さらに本発明者等は、ゥレアーゼに対応した胃粘膜ムチンの受容体分子は硫酸基が関与していることを示唆する知見を得た。このように、接着因子とその受容体分子との関係を明らかにすることにより、耐性菌を生じずに H pを除菌する新規な方法を提供することが可能になった。

本発明の要旨は、硫酸基を含み構成糖の 50モル％以上がフコースからなる多糖類以外の、硫酸基を含む多糖類を有効成分とするヘリコバクタ一 · ピロリの定着阻害剤、並びに、硫酸基を含む多糖類および胃酸分泌抑制剤を有効成分とするへリコバクタ— . ピロリの定着阻害剤である。さらに本発明は、硫酸基を含み構成糖の 50モル％以上がフコースからなる多糖類以外の、硫酸基を含む多糖類を有効成分とするヘリコバクタ一 ' ピロリ感染による胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防剤および治療剤にも関し、また、硫酸基を含む多糖類および胃酸分泌抑制剤を有効成分とするヘリコパクター · ピロリ感染による胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防剤および治療剤にも関する。また、本発明は、硫酸基を含み構成糖の 50モル％以上がフコースからなる多糖類以外の、硫酸基を含む多糖類を添加した胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の予防または改善用食品も提供する。

上記において使用する硫酸基を含む多糖類としては、デキストラン硫酸、ーカラギ一ナン、ス—カラギ一ナン、へパリン、または硫酸化力一ドランが好ましい。図面の簡単な説明

図 1は、ゥレアーゼの精製胃ムチンおよび MKN45 細胞に対する接着パターンを示す。

図 2は、 MKN45 細胞に対するウレァ一ゼの接着性を示す。

図 3は、各種硫酸基を含む多糖類のゥレアーゼ接着抑制率を示す。

図 4は、各種硫酸基を含む多糖類のゥレアーゼ接着抑制率を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明において H p定着阻害剤として使用する硫酸基を含む多糖類は、天然に存在するものでも、化学的に合成したものでもよい。ここで多糖とは、オリゴ糖を含む、数個以上の単糖から構成される糖質であり、ホモ多糖、ヘテロ多糖、複合糖質を構成する多糖のいずれでもよい。硫酸基には、 0 -硫酸基、 N -硫酸基 (スルホアミノ基）が含まれ、硫酸基の位置は特に限定されない。

本発明で使用する硫酸基を含む多糖類の硫酸基含量は、硫黄（sulfur) 含量として通常 5 %以上であり、好ましくは 9〜20%である。 H pの胃粘膜定着阻止能は硫酸化の度合いと相関しているので、硫黄含量が 10〜18%程度の多糖類を使用するのが特に好ましい。本発明において使用できる硫酸基を含む多糖類を例示すると、天然に存在する硫酸基を含む多糖類では、例えばデキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、へパリン、へパリノイド、マンナン硫酸、カロニン硫酸、カラギ一ナン（ C一力ラギ —ナン、 λ—力ラギーナン等）、デルマタン硫酸、フノラン、ボルフイラン等が挙げられ、デキストラン硫酸、 Λ —カラギ一ナン、ス一力ラギ一ナン、へパリンが好ましく、特に好ましいのはデキストラン硫酸、ス—カラギ一ナンである。合成された硫酸基を含む多糖類には、硫酸化力一ドラン、硫酸化ラク卜一ス、硫酸化オリゴ糖、硫酸化レンチナン、硫酸化シゾフィラン、硫酸化酵母グルカン等があり、中でも硫酸化力一ドランが好ましい。

本発明で使用する硫酸基を含む多糖類は、市販品を利用することができる。例えば、コンドロイチン硫酸、カラギ一ナンは食品添加物（增粘剤）として、デキストラン硫酸やへパリンは皮下、筋肉内、静脈注射用の抗血液凝固剤の原料として用いられている。また、硫酸基を含む多糖類としては、それを含有する動物組織、紅藻類や褐藻類などの藻類等から得られた抽出物や精製物を使用するか、硫酸基含量が低いか全く含有しない天然の多糖類を硫酸化して用いてもよい。抽出、精製の方法あるいは硫酸化の方法は任意の既知の方法を使用すればよい。硫酸基を含む多糖類を有効成分として含む H p定着阻害剤あるいは抗潰瘍剤は経口により投与する：硫酸基を含む多糖類は、抗血液凝固作用を有するため、注射による投与の場合は副作用を有するものもあるが、経口投与の場合にはそのような副作用は生じず安全である。また、食品添加物として使用されているものは当然、安全性は確認されている。

本発明で用いる硫酸基を含む多糖類は、後述のィンビトロ実験および動物実験から明らかなように、 H pの胃粘膜への定着を阻止し、高い除菌効果を発揮しうる。従って、硫酸基を含む多糖類を有効成分とする薬剤組成物は、 H pの胃粘膜への定着によって発生する胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防剤、治療剤として有用であり、また硫酸基を含む多糖類を添加した食品を胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防または改善用食品として用いることもできる。

従来、 H p感染による胃炎、胃潰瘍の病理発生には、 H pの定着によって産生されるゥレア一ゼが病原因子の 1つとして注目されてはいたが、 H pの胃粘膜への接着に関与する因子であることは全く予想されていなかった。そのような状況において、本発明は先に、 H pの接着因子は菌体表層に局在しているウレァーゼであることを見出し、抗ゥレア一ゼ抗体を胃炎、胃潰瘍等の予防剤または治療剤として用いることを提案した（特開平 10— 287585号）。 H pがヒ卜胃癌由来 MKN - 45細胞によく付着し、炎症性サイト力インであるインタロイキン- 8を分泌することを利用して、抗ゥレア一ゼ鶏卵抗体の H p接着阻止能を検討し、さらに H p高感受性へアレスマウスを用いて H p定着阻止能を調べた。その結果、この抗体が KN細胞への H pの接着を効率よく阻止するとともに、動物実験においても有意な H p定着抑制効果を示した。この抗ゥレア一ゼ鶏卵抗体は、意外にもゥレア一ゼの酵素活性をほとんど阻害しない。従って、ウレァ一ゼは従来考えられていた酵素としての作用以外に、胃粘膜への接着にも関与していることが示唆される。本発明者等はさらに、ピオチン化ウレァ一ゼがへパリン、胃ムチン、あるいは MKN- 45細胞に特異的に付着することを明らかにし、そして、このウレァ一ゼ接着が硫酸基を含む多糖類によつて特異的に抑制されるとともに、動物実験においても硫酸基を含む多糖類の経口投与によって胃内の H p定着が用量依存的にかつ特異的に抑制されることを実証した（以下の実験例参照）。これらから、 H pのゥレア一ゼは胃内においてアンモニアを生成して粘膜にダメージを与えることに加え、接着因子としての機能も有することが分かる。また、 H pの接着因子であるゥレア一ゼに対応する胃ムチンの受容体分子は、主に硫酸基もしくは硫酸エステルで構成されていると考えられる。

本発明では、 H pの接着因子とその受容体の関係を明らかにし、硫酸基を含む多糖類が H p定着阻害作用を有することを確認したことに基づき、有用な H p定着阻害剤、胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防剤および治療剤、並びに胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防または改善用食品を提供するものである。硫酸基を含む多糖類を H p定着阻害剤、あるいは胃炎、胃潰瘍等の予防剤、治療剤として用いる場合、その剤形は任意であるが、経口投与に適した形態とする。通常、硫酸基を含む多糖類を主剤とし、これに慣用の担体や賦形剤を配合して任意の方法で製剤化して用いることができる。必要に応じて、その他の添加剤または薬剤、例えば制酸剤（炭酸水素ナトリウム、炭酸マグネシウム、沈降炭酸力ルシゥム、合成ヒドロタルサイ卜等）、胃粘膜保護剤（合成ゲイ酸アルミニウム、スクラルファート、銅クロロフィリンナトリゥム等）や消化酵素（ピオジァスターゼ、リバ—ゼ等）を加えてもよい。本発明薬剤の投与量は、特に制限するものではないが、硫酸基を含む多糖類として、予防の場合には成人 1日当たり 1〜 5 mgZkg、治療の場合で成人 1日当たり 50~500 mg/kgの範囲が好ましい。胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防、改善用食品の場合は、食品中硫酸基含有多糖類が、通常 0. 1 %以上、好ましくは 0. 5 %以上含まれる。

また、硫酸基を含む多糖類からなる H p定着阻害剤、並びに胃炎、胃潰瘍もしくは十二指腸潰瘍の予防剤および治療剤は、胃酸分泌抑制剤を併用することにより一層その効果を高めることができる。

胃酸分泌抑制剤としては、シメチジン、ラニチジン、ファモチジン等の H ₂インヒビター、オメプラゾ一ル、ランソプラゾール等のプロトンポンプインヒビタ一が使用できる。胃酸分泌抑制剤の投与量は成人 1日当たり 20〜30mgが好ましい。次に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はそれらによつて制限されるものではない実施例

〔実施例 1〕

処方例 1 (細粒） 1. 5 g中

デキス卜ラン硫酸 100 mg

乳糖 950 mg

トウモロコシデンプン 405 mg

PVPCK-30) 45 mg

上記成分をとり、湿式造粒法を用いた通常の方法により細粒を得た。

処方例 2 (錠剤） 3錠中

κ一力ラギ一ナン 300 mg

乳糖（200M) 250 mg

トウモロコシデンプン 50 mg

結晶セルロース 180 mg _g P T/JP 5

PVPCK-300) 22 mg

ステアリン酸マグネシゥム 8 mg

上記成分をとり、通常の方法により錠剤を得た。

処方例 3 (顆粒） 1. 5 g中

硫酸カードラン 100 mg

乳糖（200M) 900 mg

トウモロコシデンプン 450 mg

PVPCK-30) 50 mg

上記成分をとり、押し出し造粒法で通常の方法により顆粒剤を得た。

〔実験例 1〕ィンビ卜口実験

各種の硫酸基を含む多糖類について、 H pが産生するゥレア一ゼの胃粘膜への定着阻害効果をィンビ卜口実験系において調べた。

(実験材料および方法）

胃ムチンへのゥレア一ゼ接着試験

本発明者等は、先に、 H pの接着因子が H pが産生するウレァ一ゼであることを見出した。さらに、このウレァ一ゼは以下に示すように胃粘膜のムチンによく結合する。

ウレァ一ゼの接着試験に用いる豚胃ムチンを以下のようにして調製した。

約 2 力月齢の健康な豚を屠殺し、胃部を摘出し、内部に 0. 1Mリン酸塩 + 0. 15M NaCl + 5mM N-ェチルマレイミド（NEM)十 ΙπιΜ フエ二ルメチルスルホニルフルオラィド（PMSF) + lmM EDTA含有 PBS (pH 7. 4)を加えて洗浄した。胃を切開し、粘膜を削り取り、上記の緩衝液に浮遊させた。この粘膜浮遊液を氷冷しながらポリ卜口ンホモゲナイザーを用いて均一にした。これを 15，000 x gで遠心し上清を得た。この上清を 25，000 x gで再び遠心し、上清を回収し、蒸留水で透析した後、凍結乾燥して粗精製胃ムチンを得た。次いで、この乾燥粗精製胃ムチンを PBS (pH 6. 8) (6M塩酸グァニジンおよびプロティア一ゼインヒビ夕一（5mM NEM， lmM PMS F, lmM EDTA)を含む）に溶解し、これを塩化セシウム密度勾配（1. 5 g/ml) に重層し、 34， 000 X gで 48時間遠心した。シアル酸含有分画の検出はニトロセルロース膜ブ口ッティングと過ヨウ素酸シフ試薬による染色によって行った。発色した分画をプールし、再び塩化セシウム密度勾配に重層して遠心した。染色陽性分画をプールし、凍結乾燥した。次いで、 0. 1Mリン酸緩衝液（0. 1M NaCl 含有、 pH 6 . 8) で平衡化したセファロ一ス CL- 4B カラムを通してゲル濾過をし、分画した。 PAS染色陽性で、蛋白濃度の高い分画をプールし、 PBS (pH 6. 8)で透析して精製豚胃ムチンを得た。これを使用時まで - 80°Cに保存した。なお、得られた精製豚胃ムチンは SDS- PAGEの結果、 66 kD の糖タンパク質であることを認めた。

ウレァ一ゼ接着試験用マイクロプレートは次のようにして作製した。

96ゥエルマイクロプレートの各々のゥエルに 1. 25%グルタルアルデヒド溶液を 100 μ 1ずつ加え、 5分間感作した。次に、ゥュルを蒸留水で 3回洗浄し、精製豚胃ムチン（1. 27 mg/ml) をゥヱル当たり 50 / 1ずつ加え、 4 °Cに一夜静置することによって固相化した。使用時には各々のゥヱルに 3 %BSA を加えて 37°Cで 60 分間反応させることによってブロッキングした後、 0. 05%ッィン 20加 PBS で 3回洗浄したプレー卜をウレァ一ゼ接着試験に供した。

上記で作成したマイクロプレート上の固相化された豚胃ムチンへのゥレアーゼ接着試験は以下のように行つた。

精製したピオチン化ウレァ一ゼは pH域の異なる接着培地（20mMリン酸緩衝液に 0. 01%ツイン 20および 0. 15M NaClを含む。接着培地の pHは予め 2. 0、 3. 0、 4. 0 、 4. 5、 5. 0、 5. 5、 6. 0 および 6. 5 に調整しておく）を用いて最終濃度が 7. 0 g /ml となるように希釈した。調整したウレァ一ゼを前述のムチン固相化マイクロプレートの 2穴ずつに加え、 37°Cで 60分間感作した。次に、各々のゥヱルを接着培地で 3回洗浄した後、直ちに 10%中性ホルマリン（pH 7. 4) を加え、プレ ―トを 37°Cで 30分静置することによって固定した。ゥヱルに付着したゥレアーゼ量を測定するため、ストレプトアビジン HRP を各々のゥヱルに加え、 37°Cで 60分間反応させた。次いで、基質としてオルト- フヱニレンジァミン 2塩酸および H₂ 0₂を加え反応させた。反応停止液には 3N H₂S0₄を用いた。なお、ランニングプレ ―卜には 2倍段階希釈した既知量のゥレアーゼを置いて、そのカリブレーション力一ブから未知量のサンプルを測定した。

ヒト胃癌由来 MKN45 細胞へのウレァ一ゼ接着試験ヒ卜胃癌由来 MKN45細胞に H pがよく接着し、インターロイキン- 8を分泌することが明らかにされている (Kabir, A. M. A. et al. , 1997, Gut 40 : 49-55) (細胞は東海大学医学部感染症学部門より分与）。この細胞を利用して、上記の精製胃ムチンで行ったのと同様の方法でピオチン化ゥレア一ゼの接着能を検討した。

MKN細胞の調製は、単層培養細胞を得るため細胞浮遊液を 96ウェルマイクロブレートに 1ゥヱル当たり 2 X 10⁴ 個になるように接種し、 37°Cの 5 %C0₂ 培養装置で約 7日間培養することにより行った。

ウレァ―ゼ接着抑制試験

ヒ卜胃癌由来 MKN45 細胞を用いて、各種硫酸基を含む多糖類のウレァ一ゼ接着抑制試験を行った。まず、種々の濃度に調整した硫酸基を含む多糖類とピオチン化ウレァ一ゼを混合し、この混合物を 37°Cで 60分間振盪しながら感作した。次に、この混合物を 96ゥヱルマイクロプレートの単層培養細胞ゥヱルに移し、プレートを振盪しながら再び 37°Cで 60分間感作した。その後マイクロプレートのゥヱルを接着培地（pH 3. 0) で 3回洗浄し、各々のゥエルの細胞を 65°C 10分間加熱することによって固定した。固定した各々のゥヱルを PBS-ツイン 20 (0. 5 %) (pH 6. 8 ) で 3回洗浄し、細胞に接着したピオチン化ウレァ一ゼを検出するため、各々のゥエルにストレプトアビジン HRP を加えた後、前記「胃ムチンへのウレァ一ゼ接着試験」に記載された ELISA により測定した。

(結果）

精製胃ムチンおよび MKN45 細胞に対するウレァ一ゼの接着パターン

図 1に示すように、精製胃ムチンおよび MKN45細胞に対するウレァ一ゼの接着パターンは酷似している。すなわち、 MKN 細胞へのウレァ一ゼの接着は、ムチンの場合と同様に pH域に依存しており、これは MKN細胞が胃ムチンに認められるのと同じ受容体を細胞表面に発現していることを示唆している（ゥレア一ゼの胃ムチンへの接着パターンには pH 4. 5の域でもショルダーピークが認められる点で MK N45細胞の場合とやや異なるが、これは MKN45 細胞の表面には十分な量のウレァ -ゼ受容体が発現していないか、受容体分子の構成がわずかに異なっているためであると考えられる）。 pH 3. 0領域でのウレァ一ゼ接着は胃粘膜における H pの定着を反映していると考えられ、この pH域でゥレア一ゼの接着が阻止できる物質ェ 2 は H pの胃内定着を阻止し、結果的に胃炎、胃潰癟を予防、治療できる可能性がめる。

MKN45 細胞へのウレァ一ゼ接着反応

図 2から明らかなように、 MKN45 細胞へのウレァ一ゼ接着反応は用量依存的に S字状カーブを示した。

硫酸基を含む多糖類によるゥレア一ゼ接着反応の抑制

図 3および図 4に示すように、 MKN45 細胞へのウレァ一ゼ接着反応は硫酸基を含む多糖類により特異的に抑制された。図 3には、硫酸基を含む多糖類としてデキストラン硫酸、へパリン、ス一力ラギ一ナン、 /c —カラギ一ナンを用いた場合の平均ゥレアーゼ接着抑制率が示されており、これらの硫酸基を含む多糖類は接着を特異的にかつ用量依存的に抑制していることが分かる。一方、対照物質として使用した、硫酸基を含有しないデキストランはこの接着を抑制しなかった。また、図 4は、対照として力一ドランを、硫酸基を含む多糖類として硫酸化カードランを用いた場合の平均ウレァ一ゼ接着抑制率を表し、硫酸化力一ドランがこの接着を特異的かつ用量依存的に抑制している。

以上の結果から、 H pのゥレアーゼは胃ムチンおよび MKN 細胞に特異的かつ用量依存的に接着し、このゥレアーゼ接着は硫酸基を含む多糖類によつて特異的かつ用量依存的に抑制されることが明らかである。ゥレア一ゼは H p菌体表層に局在しているので、硫酸基を含有する物質を経口投与すれば胃内の H p菌体のウレァ一ゼに特異的に結合することにより、除菌することができると考えられる。〔実験例 2〕インビボ実験

実験例 1の結果をさらに動物実験により確認した。

実験動物として H p感染に対して最も高感受性を示すヘアレスマウス（NS: Hr/ ICR系、財団法人動物繁殖研究所、受託番号 IAR-NHI-9701) (ATCC#72024) を用いた。以下の表 1に示すスケジュールに基づき動物実験を行った。検体は攻撃 2日前から屠殺時まで飲水に溶解して自由飲水投与した。マウスの 1日当たりの飲水量は 4〜8 mlであった。攻撃菌株はヒ卜臨床材料から分離された NSP335株（Cag A + および Vac A + ) を用い、攻撃菌量はマウス当たり 1 x lO ⁹ CFU とした。検体投与終了時に各群のマウスを屠殺し、胃を摘出し、内容物を除去した後、ボルテックスミキサーを用いて PBS (pH 7. 2)で 8回洗浄し、ホモゲナイザーで乳剤を作製し、 H p検出用材料とした。 H pの検出は乳剤を H p検出用培地（ポアメデァ H p分離培地、栄研化学）に接種し、ガスパック法で 37°C、 5日間培養し、コロニ一数を計測することによって行った。供試検体としてデキストラン硫酸、デキストラン、カラギ一ナン、力一ドランおよび硫酸化力一ドランを用いた。表 1 動物実験スケジュール

N S P 3 3 5

攻撃（ 1 X 10^SCFU/マウス）

検体投与（飲水）

以下の表 2 1および表 2 - 2は H pの除菌効果を示す。これらの表から明らかなように、硫酸基を含む多糖類（一力ラギ一ナン、ス一力ラギーナン、デキストラン硫酸、硫酸化カードラン）はすべて、 H pの胃内定着を抑制し、高い除菌効果が得られた。また、多糖類の硫酸基の量と定着阻止能は相関する傾向が認められた（表 2 - 2 ) 。これに対し、硫酸基を含有しない多糖類は無投与の対照群と同様、 H pの定着を阻止しなかった。 T/JP99/02540

1 4 表 2 — 1

表 2 — 2

(実験例 3 ) インビボ実験（硫酸基を含む多糖類と胃酸分泌抑制剤との併用）供試検体として、実験例 2において高い除菌率を示したデキストラン硫酸と硫酸カードランを選択し、胃酸分泌抑制剤（H ₂インヒビタ一、プロトンポンプインヒビ夕一）との併用効果を動物実験により調べた。

動物実験の方法は前記実験例 2と同様であるが、実験のスケジュールは以下の表 3に示す通りとし、検体の投与は攻撃 1週間後から屠殺時までとする。表 3

N S P 3 3 5

攻撃（ 1 x l0⁹CFU/マウス）

検体投与（飲水）

硫酸基を含む多糖類としてデキストラン硫酸または硫酸力一ドランを、胃酸分泌抑制剤としてシメチジン（H₂インヒビター）またはオメプラゾ一ル（プロトンポンプインヒビタ一）を併用した場合の除菌効果を表 4に示す。 H pの定着が安定化した攻撃 1週間後からの投与であっても高い除菌率を示し、硫酸基を含む多糖類単独での投与よりさらに優れた除菌効果が得られた。

表 4

以上の動物実験から、硫酸基を含む多糖類は H pの胃内定着を効率よく抑制で 1 b きること、さらに H₂インヒビタ一やプロ卜ンポンプィンヒビター等の胃酸分泌抑制剤との併用においてより高い除菌効果を示すことが明らかとなった。これらの物質は抗生物質と異なり、薬剤耐性の問題が生じないため H p除菌のための有用な方法を提供しうる。産業上の利用可能性

上述のように、本発明によれば、へリコパクター ' ピロリの胃粘膜への有効な定着阻害剤が提供される。この定着阻害剤は、ヘリコバクタ一 ' ピロリ感染によつて引き起こされる胃炎、胃潰瘍等に対して安全で効果的な予防剤および治療剤、並びに予防または改善用食品として用いることができる。本発明は、へリコクタ一 · ピロリの胃粘膜への接着に関与する因子およびそれに対応する胃内の受容体を見出したことに基づいて、 H pの定着阻害に硫酸基を含む多糖類を用いるものであるので、抗生物質とは異なり耐性菌を生じることなく胃内のヘリコバクタ一 · ピロリを特異的に除菌することができ、従って、胃炎、胃潰瘍等を有効に抑制することができる。その除菌効果は胃酸分泌抑制剤との併用によりさらに高くなる。

Claims

請求の範囲

1 . 硫酸基を含み構成糖の 50モル％以上がフコースからなる多糖類以外の、硫酸基を含む多糖類を有効成分とするへリコパクター · ピロリの定着阻害剤。

2 . 硫酸基を含む多糖類および胃酸分泌抑制剤を有効成分とするヘリコバクタ ― · ピロリの定着阻害剤。

3 . 硫酸基を含む多糖類がデキストラン硫酸、 κ 一力ラギ一ナン、 λ—カラギ —ナン、へパリンまたは硫酸化カードランである請求の範囲第 1項または第 2項記載の定着阻害剤。

4 . 硫酸基を含み構成糖の 50モル％以上がフコースからなる多糖類以外の、硫酸基を含む多糖類を有効成分とするヘリコバクタ一 · ピロリ感染による胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防剤および治療剤。

5 . 硫酸基を含む多糖類および胃酸分泌抑制剤を有効成分とするヘリコバクタ

― · ピロリ感染による胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防剤および治療剤。

6 . 硫酸基を含む多糖類がデキストラン硫酸、一力ラギ一ナン、 λ—力ラギ一ナン、へパリンまたは硫酸化力一ドランである請求の範囲第 4項または第 5項記載の予防剤および治療剤。

7 . 請求の範囲第 1項記載の定着阻害剤を添加した胃炎、胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防または改善用食品。

8 . 硫酸基を含む多糖類がデキストラン硫酸、 /c一力ラギ一ナン、ス一力ラギーナン、へパリンまたは硫酸化力一ドランである請求の範囲第 7項記載の食品。