WO1999064469A1 - INHIBITEURS DE FIXATION DE $i(HELICOBACTER PYLORI) - Google Patents

INHIBITEURS DE FIXATION DE $i(HELICOBACTER PYLORI) Download PDF

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polysaccharide
inhibitor
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Yoshikatsu Kodama
Nobutake Kimura
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Ghen Corporation
Nisshin Flour Milling Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention is effective in inhibiting Helicobacter pylori (sometimes abbreviated as Hp) colonization inhibitor, and is effective against gastritis, gastric ulcer, and duodenal ulcer caused by infection with Helicobacter pylori.
  • Hp Helicobacter pylori
  • the present invention relates to an oral prophylactic or therapeutic agent which can be prevented or treated. It also relates to foods for preventing and improving gastritis, gastric ulcer and duodenal ulcer.
  • Helicobacter pylori is a spiral, gram-negative bacillus with several flagella at one end, which inhabits the gastric mucosa of humans.
  • the orchid was reported in 1983 by Marshall, BJ and Warren, JR of Australia, to be detected in gastric biopsies from patients with gastritis and gastric ulcer in high rates. It has been reported that it is the causative agent of gastritis, gastric ulcer, and duodenal ulcer, and is further linked to diseases such as gastric cancer.
  • Helicobacter pylori infection factors such as perease produced by this bacterium, flagella for migrating mucosal mucin layer, and interleukin-8 as an inflammatory cytokine Outer membrane proteins of Cag A, which are thought to be involved in the production, vacuolation of gastric mucosal epithelial cells ⁇ Vilan ⁇ Vac A vacuolated cytotoxin, which is involved in necrosis and ulceration.
  • ammonia is produced by perease, which neutralizes the gastric pH and secures a growth environment. And damage to the gastric mucosa was thought to result in gastritis, gastric ulcer, and even gastric cancer.
  • Hp eradication of Helicobacter pylori is indispensable for the curative treatment of peptic ulcer, and the combination therapy of antibiotics and gastric acid secretion inhibitor is generally used as the eradication therapy.
  • Hp eradication involves a combination of a proton pump inhibitor, which strongly suppresses gastric acid secretion, and multiple antibiotics. And is often used in an amount exceeding the usual dose.
  • long-term administration of antibiotics may cause serious problems such as side effects and an increase in resistant bacteria.
  • Oral vaccine-based immunotherapy approaches can be used to solve problems such as side effects and increase in resistant bacteria due to administration of antibiotics for the purpose of eradication.
  • problems such as side effects and increase in resistant bacteria due to administration of antibiotics for the purpose of eradication.
  • As a barrier little research has been done to establish new prevention and treatment methods.
  • the toxicity of essential adjuvants in oral vaccines remains unresolved.
  • vaccines are mainly for prevention and are not expected to be effective for patients once infected with Hp.
  • fucose is not considered to be an adhesion factor, and thus does not show an effect of inhibiting Hp colonization.
  • An object of the present invention is to elucidate the mechanism relating to gastric colonization of Hp involved in the development of peptic ulcer, and to provide an Hp colonization inhibitor based on the mechanism. In addition, it has no drawbacks such as side effects and increase of resistant bacteria associated with the use of antibiotics.
  • An object of the present invention is to provide an effective and highly safe preventive and therapeutic agent for gastric ulcer and the like, and a food for prevention or improvement.
  • the present inventors have arrived at the present invention based on new important findings regarding the establishment of Helicobacter pylori on gastric mucosa, which had not been sufficiently elucidated until now.
  • urease produced by Hp plays an important role as an enzyme that converts urea in the stomach into ammonia as described above. It was thought to cause stomach ulcer, stomach cancer and so on.
  • various experiments have reported that urease does not participate in the fixation of Hp to the gastric mucosa, that is, urease has no function as an adhesion factor (adhesin).
  • the present inventors have unexpectedly found from the results of previous studies on Hp adhesion, and found that perease itself is involved in the adhesion of Hp to gastric mucosa.
  • urease produced by HP not only functions as an enzyme that converts urea to ammonia, but also has a large function as an adhesion factor.
  • urease itself binds to gastric mucosal mucin, and as a result, It has been found that proliferation is possible.
  • the present inventors have obtained findings suggesting that a sulfate group is involved in a gastric mucosa mucin receptor molecule corresponding to a protease.
  • a sulfate group is involved in a gastric mucosa mucin receptor molecule corresponding to a protease.
  • the gist of the present invention is to provide a Helicobacter pylori fixation inhibitor containing a sulfate group-containing polysaccharide as an active ingredient other than a polysaccharide having a sulfate group and comprising 50% by mole or more of fucose, and a sulfate group.
  • Helicobacter. Helicobacter. Helicobacter pylori is an inhibitor of H. pylori.
  • the present invention provides a method for treating gastritis, gastric ulcer, or duodenal ulcer due to Helicobacter pylori infection containing a sulfate group-containing polysaccharide as an active ingredient other than a polysaccharide containing sulfate groups and containing 50 mol% or more of fucose.
  • the present invention also relates to a prophylactic and therapeutic agent, and also to a preventive and therapeutic agent for gastritis, gastric ulcer or duodenal ulcer due to Helicobacter pylori infection, comprising a polysaccharide containing a sulfate group and a gastric acid secretion inhibitor as active ingredients.
  • the present invention also provides a food for preventing or ameliorating gastritis, gastric ulcer and duodenal ulcer, to which a polysaccharide containing a sulfate group other than the polysaccharide containing a sulfate group and comprising 50% by mol or more of fucose is added. I do.
  • dextran sulfate, -carrageenan, s-carrageenan, heparin, or sulfated dolane is preferable.
  • FIG. 1 shows the adhesion pattern of perease to purified gastric mucin and MKN45 cells.
  • FIG. 2 shows the adhesion of urease to MKN45 cells.
  • FIG. 3 shows the inhibitory rates of urease adhesion of polysaccharides containing various sulfate groups.
  • FIG. 4 shows the inhibitory rates of urease adhesion of polysaccharides containing various sulfate groups.
  • the polysaccharide containing a sulfate group used as the Hp fixing inhibitor may be a naturally occurring one or a chemically synthesized one.
  • the polysaccharide is a saccharide composed of several or more monosaccharides including an oligosaccharide, and may be any of a homopolysaccharide, a heteropolysaccharide, and a polysaccharide constituting a complex saccharide.
  • the sulfate group includes 0-sulfate group and N-sulfate group (sulfoamino group), and the position of the sulfate group is not particularly limited.
  • the sulfate group content of the polysaccharide containing a sulfate group used in the present invention is usually 5% or more, preferably 9 to 20%, as the sulfur content. Since the ability of Hp to inhibit gastric mucosal colonization correlates with the degree of sulfation, it is particularly preferable to use a polysaccharide having a sulfur content of about 10 to 18%.
  • polysaccharides containing a sulfate group examples include, for example, naturally occurring polysaccharides containing a sulfate group, such as dextran sulfate, chondroitin sulfate, heparin, heparinoid, mannan sulfate, caronine sulfate, and carrageenan.
  • Nan such as C-strength rag-nan, ⁇ -strength ruginan
  • dermatan sulfate funolan, and boruilan, and the like.
  • Dextran sulfate, ⁇ ⁇ -carrageenan, sugi-strike raginan, and heparin are particularly preferred. It is dextran sulfate, sucrose-carrageenan.
  • Synthetic sulfate-containing polysaccharides include sulfated dolans, sulfated lactose, sulfated oligosaccharides, sulfated lentinans, sulfated schizophyllan, sulfated yeast glucan, etc. Forced drain is preferred.
  • polysaccharide containing a sulfate group used in the present invention commercially available products can be used.
  • chondroitin sulfate and carrageenan are used as food additives (viscosity agents), and dextran sulfate and heparin are used as raw materials for anticoagulants for subcutaneous, intramuscular, and intravenous injection.
  • an extract or a purified product obtained from an animal tissue containing the sulfate group or an algae such as a red algae or a brown algae is used, or the sulfate group content is low or no. Natural polysaccharides not containing may be sulfated and used.
  • Hp colonization inhibitor or anti-ulcer agent containing a sulfated polysaccharide as an active ingredient is orally administered: Since a sulfated polysaccharide has an anticoagulant effect, side effects occur when administered by injection Some drugs have oral toxicity, but oral administration is safe without such side effects. Naturally, the safety of food additives has been confirmed.
  • the polysaccharide containing a sulfate group used in the present invention prevents Hp from adhering to the gastric mucosa and exerts a high eradication effect, as is clear from in vitro experiments and animal experiments described below. Therefore, a pharmaceutical composition containing a polysaccharide containing a sulfate group as an active ingredient is useful as an agent for preventing or treating gastritis, gastric ulcer or duodenal ulcer caused by colonization of Hp on the gastric mucosa.
  • a food to which a polysaccharide containing a group is added can be used as a food for preventing or improving gastritis, gastric ulcer or duodenal ulcer.
  • Hp adheres well to human gastric carcinoma-derived MKN-45 cells and secretes interleukin-8, an inflammatory site-inducing factor, which inhibits the ability of anti-purease hen egg antibody to inhibit Hp adhesion.
  • interleukin-8 an inflammatory site-inducing factor
  • this antibody efficiently inhibited the adhesion of Hp to KN cells, and also showed a significant Hp-fixation inhibitory effect in animal experiments.
  • this anti-dialease hen egg antibody hardly inhibits the enzyme activity of perease. Therefore, it is suggested that urease is involved in adhesion to the gastric mucosa in addition to the previously considered action as an enzyme.
  • the present inventors further revealed that the biotinylated urease specifically adheres to heparin, gastric mucin, or MKN-45 cells, and that this urease adhesion is associated with sulfate-containing polysaccharides.
  • Hp colonization in the stomach was demonstrated to be dose-dependently and specifically inhibited by oral administration of sulfate-containing polysaccharides in animal experiments (see below). See experimental example).
  • Hp urease produces ammonia in the stomach and damages mucous membranes, and also has a function as an adhesion factor.
  • the receptor molecule of gastric mucin corresponding to peripase which is an adhesion factor of Hp, is considered to be mainly composed of sulfate groups or sulfate esters.
  • a useful Hp immobilization inhibitor It is intended to provide a preventive and therapeutic agent for gastritis, gastric ulcer or duodenal ulcer, and a food for preventing or improving gastritis, gastric ulcer or duodenal ulcer.
  • a polysaccharide containing a sulfate group is used as an Hp colonization inhibitor, a prophylactic agent or a therapeutic agent for gastritis, gastric ulcer, etc.
  • the dosage form is arbitrary, but a form suitable for oral administration.
  • a polysaccharide containing a sulfate group is used as a main ingredient, and a conventional carrier or excipient is blended with the main ingredient to form a formulation by any method and used.
  • antacids sodium bicarbonate, magnesium carbonate, precipitated carbon dioxide
  • Lucidum synthetic hydrotalcite, etc.
  • gastric mucosal protective agents synthetic aluminum gaterate, sucralfate, copper chlorophyllin sodium, etc.
  • digestive enzymes priodiastase, rivase, etc.
  • the dosage of the drug of the present invention is not particularly limited, as a polysaccharide containing a sulfate group, 1 to 5 mg / kg of adult per day for prevention and 50 to 500 mg / day of adult for adult for treatment. A range of kg is preferred.
  • the food In the case of foods for preventing and / or improving gastritis, gastric ulcer or duodenal ulcer, the food generally contains 0.1% or more, preferably 0.5% or more, of a sulfate-containing polysaccharide in the food.
  • Hp colonization inhibitors consisting of polysaccharides containing sulfate groups, and preventive and therapeutic agents for gastritis, gastric ulcer or duodenal ulcer, can be further enhanced by the combined use of gastric acid secretion inhibitors. Can be.
  • the gastric acid secretion inhibitor cimetidine, ranitidine, H 2 inhibitor formation such as famotidine, Omepurazo Ichiru, pro ton pump inhibitor one such lansoprazole may be used.
  • the dosage of the gastric acid secretion inhibitor is preferably 20 to 30 mg per day for an adult.
  • Formulation example 2 (tablets) of 3 tablets
  • the adhesion factor of Hp is urease produced by Hp.
  • this urease binds well to mucin in the gastric mucosa, as shown below.
  • Porcine stomach mucin used for the urease adhesion test was prepared as follows.
  • a healthy pig about 2 months old is slaughtered, the stomach is removed, and 0.1M phosphate + 0.15M NaCl + 5mM N-ethylmaleimide (NEM) is added to the phenylmethylsulfonylfluoride. (PMSF) + PBS containing lmM EDTA (pH 7.4) was added for washing.
  • the stomach was incised, the mucous membrane was scraped off and suspended in the above buffer.
  • the mucosal suspension was homogenized using a polyhomogenizer while cooling on ice. This was centrifuged at 15,000 xg to obtain a supernatant.
  • the supernatant was centrifuged again at 25,000 xg, the supernatant was collected, dialyzed against distilled water, and freeze-dried to obtain a crude gastric mucin.
  • the dried crude gastric mucin was dissolved in PBS (pH 6.8) (containing 6M guanidine hydrochloride and Protease-zeinhibiu (5 mM NEM, lmM PMS F, lmM EDTA)), and this was dissolved in a cesium chloride density gradient. (1.5 g / ml) and centrifuged at 34,000 X g for 48 hours.
  • the microplate for urease adhesion test was prepared as follows.
  • the perease adhesion test to the immobilized pig stomach mucin on the microplate prepared above was performed as follows.
  • Purified biotinylated urease is used in adhesion media of different pH ranges (containing 0.01% twin 20 and 0.15M NaCl in 20 mM phosphate buffer.
  • the pH of the adhesion medium is 2.0, 3.0, 4 0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 and 6.5) to a final concentration of 7.0 g / ml.
  • the prepared urease was added to each of the two wells of the microplate immobilized with mucin described above, and sensitized at 37 ° C for 60 minutes. Next, each gel was washed three times with the adhesion medium, and immediately thereafter, 10% neutral formalin (pH 7.4) was added, and the plate was fixed by leaving it at 37 ° C for 30 minutes.
  • Streptavidin HRP was added to each gel to measure the amount of urease attached to the gel, and reacted at 37 ° C for 60 minutes. Then, as the substrate ortho - it was added full We two range ⁇ Min 2 HCl and H 2 0 2 reaction. The stop solution with 3N H 2 S0 4. The running plate was placed with a known amount of doublese serially diluted urease, and an unknown sample was measured from the calibration force.
  • Urease adhesion test to MKN45 cells derived from human gastric cancer It has been shown that Hp adheres well to human gastric cancer-derived MKN45 cells and secretes interleukin-8 (Kabir, AMA et al., 1997, Gut 40: 49-55) (Cells are Tokai University Dispensed from the School of Medicine's Infectious Diseases Division Utilizing these cells, the adhesion ability of the biotinylated perease was examined in the same manner as in the case of the above purified gastric mucin.
  • the cell suspension to obtain a monolayer culture cells were inoculated to a 2 X 10 4 cells per Uweru in 96-well micro-blanking rate, in 5% C0 2 culture equipment of 37 ° C This was performed by culturing for about 7 days.
  • urease adhesion inhibition test of polysaccharides containing various sulfate groups was performed. First, a sulfate-containing polysaccharide adjusted to various concentrations was mixed with piotinylated urease, and the mixture was sensitized with shaking at 37 ° C for 60 minutes. Next, this mixture was transferred to a monolayer culture cell plate of a 96-well microplate, and sensitized again at 37 ° C. for 60 minutes while shaking the plate. Thereafter, the microplate was washed three times with the adhesion medium (pH 3.0), and the cells in each well were fixed by heating at 65 ° C for 10 minutes.
  • the adhesion medium pH 3.0
  • the adhesion patterns of urease to purified gastric mucin and MKN45 cells are very similar. That is, the adhesion of urease to MKN cells depends on the pH range as in the case of mucin, and MKN cells express the same receptors on the cell surface as those found in gastric mucin. (The pattern of adhesion of rarease to gastric mucin is slightly different from that of MKN45 cells in that a shoulder peak is observed even at pH 4.5, but this is the surface of MKN45 cells. This may be due to insufficient expression of urease receptor or the slightly different composition of the receptor molecule).
  • Urease adhesion in the pH 3.0 region is thought to reflect the colonization of Hp in the gastric mucosa, and a substance that can inhibit perease adhesion in this pH range.
  • C2 prevents Hp from colonizing the stomach, and consequently has the potential to prevent and treat gastritis and gastric ulcer.
  • FIGS. 3 and 4 the urease adhesion reaction to MKN45 cells was specifically inhibited by the sulfate-containing polysaccharide.
  • Figure 3 shows the average inhibition rate of urease adhesion when dextran sulfate, heparin, sugi-ragi-nan, and / c-carrage-nan were used as the sulfate-containing polysaccharides. It can be seen that the polysaccharide containing a sulfate group specifically inhibits the adhesion in a dose-dependent manner. On the other hand, dextran containing no sulfate group used as a control did not inhibit this adhesion.
  • mice As an experimental animal, a hairless mouse (NS: Hr / ICR, animal breeding research institute, accession number IAR-NHI-9701) (ATCC # 72024) showing the highest sensitivity to Hp infection was used. Animal experiments were performed according to the schedule shown in Table 1 below. Specimens were dissolved in drinking water from day 2 before challenge until the time of sacrifice and administered with free drinking water. Mice consumed 4-8 ml of water per day. The challenge strain used was NSP335 strain (Cag A + and Vac A +) isolated from human clinical material, and the challenge strain was 1 x 10 9 CFU per mouse. At the end of the test administration, the mice in each group were sacrificed, the stomach was removed, and the contents were removed.
  • NSP335 strain Cag A + and Vac A +
  • an emulsion was prepared with a homogenizer and used as a material for Hp detection.
  • the detection of Hp is carried out by inoculating the emulsion into an Hp detection medium (Poremedia Hp separation medium, Eiken Chemical Co., Ltd.), culturing at 37 ° C for 5 days by the gas pack method, and counting the number of colonies. went. Dextran sulfate, dextran, carrageenan, force doran and sulfated force doran were used as test samples.
  • Hp detection medium Poremedia Hp separation medium, Eiken Chemical Co., Ltd.
  • Table 21 and Table 2-2 below show the eradication effect of Hp.
  • sulfate-containing polysaccharides Ichiragi ginnan, Sui ri laginan, dextran sulfate, sulfated curdlan
  • Table 2-2 shows the ability to inhibit settlement.
  • polysaccharides containing no sulfate group did not prevent Hp colonization, as did the untreated control group.
  • Example 3 In vivo experiment (a combination of a polysaccharide containing a sulfate group and a gastric acid secretion inhibitor) As test specimens, dextran sulfate and curdlan sulfate, which showed high eradication rates in Experimental Example 2, were selected. gastric acid secretion inhibitor (H 2 inhibitors one proton pump inhibitor evening I) effects of the combination was investigated by animal experiments.
  • an effective inhibitor of Helicobacter pylori on gastric mucosa can be used as a safe and effective preventive and therapeutic agent against gastritis, gastric ulcer, etc. caused by Helicobacter pylori infection, and as a food for prevention or improvement.
  • the present invention is based on the discovery of factors involved in the adhesion of Helicobacter pylori to gastric mucosa and their corresponding receptors in the stomach. Unlike antibiotics, it can specifically remove Helicobacter pylori in the stomach without producing resistant bacteria unlike antibiotics, and therefore can effectively suppress gastritis, gastric ulcer, etc. . Its eradication effect is further enhanced by the combined use with a gastric acid secretion inhibitor.

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Description

へリコバクタ ピロリの定着阻害剤 技術分野
本発明は、 ヘリコバクタ一 · ピロリ (Helicobacter pylori) ( H pと略記する ことがある) の定着阻害剤、 およ明びへリコバクタ一 ' ピロリの感染によって引き 起こされる胃炎、 胃潰瘍および十二指腸潰瘍を効果的に予防または治療しうる経 口予防剤、 治療剤に関する。 さらに胃炎田、 胃潰瘍および十二指腸潰瘍の予防、 改 善用食品にも関する。 書 背景技術
ヘリコバクタ— · ピロリによる感染症は、 現在消化器臨床分野で精力的な研究 が行われている。 その理由は、 胃炎や胃潰瘍などの胃疾患の病因がこの菌の関与 を抜きに考えられず、 また、 世界人口の約半数がこの菌に感染しているためであ る。 そこで、 WH Oの国際癌研究機関 (IARC) は、 疫学的研究からへリコバクタ — · ヒロ Uを definite carcinogen と認 Eしている 0
へリコパクター . ピロリは、 一端に数本の鞭毛 (flagella) を持つ、 ら旋型を したグラム陰性桿菌で、 ヒ卜の胃粘膜に生息する菌である。 この蘭は、 1983年ォ —ストラリアの Marshall, B. J. と Warren, J. R. によって胃炎、 胃潰瘍患者の 胃生検材料から高率に検出されることが報告され、 その後、 疫学的研究から、 こ の菌は胃炎、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍の起因菌であり、 さらには胃癌などの疾患と 関連があるとの報告が相次いで発表されている。
ヘリコバクタ一 . ピロリ感染症の病原因子 (virulence factor) としては、 こ れまで、 この菌が産生するゥレアーゼ、 粘膜ムチン層を遊走するための鞭毛、 炎 症性サイ トカインとしてのインタ一ロイキン- 8の産生に関与するとされる Cag A 外膜蛋白、 胃粘膜上皮細胞の空胞化 · ビラン ·壊死および潰瘍形成に関与する Va c A空胞化細胞毒が挙げられている。 このうちのゥレアーゼについては、 ゥレア —ゼにより産生されるアンモニアが、 胃内 pHを中和し増殖環境を確保すること、 および胃粘膜にダメージを与えることにより、 結果的に胃炎や胃潰瘍、 さらには 胃癌に移行すると考えられていた。
消化性潰瘍の根治的治療にはヘリコバクタ一 · ピロリの除菌が不可欠であると 考えられており、 その除菌療法としては抗生物質と胃酸分泌抑制剤との併用療法 が一般的である。 H pが一旦胃粘膜に定着すると、 抗生物質のみによる除菌は難 しく、 H pの除菌には、 胃酸分泌を強力に抑制するプロトンポンプインヒビ夕一 と複数の抗生物質が併用の形でしばしば常用量を超える量で使用されている。 し かし、 抗生物質の長期投与は、 その副作用に加え、 耐性菌の増加という非常に重 犬な問題が危惧される。
除菌を目的とした抗生物質の投与による副作用および耐性菌の増加などの問題 を解決する方法として、 経口ワクチンによる免疫療法のアプローチが見られるが 、 感染モデル動物の作出や実験条件の複雑さが障害となって、 新しい予防、 治療 法の確立を目指した研究はほとんど進展していない。 さらに、 経口ワクチンにお いて必須のアジュバントの毒性の問題も未解決である。 また、 ワクチンはあくま で予防を主体とするものであり、 一旦 H pが感染した患者に対しては効果は望め ない。
さらに、 ワクチンに代わる免疫療法として、 H p全菌体を抗原として得られた 鶏卵抗体の使用が提案されているが、 全菌体に対する抗体では完全な除菌は望め ず、 また実際の胃内での除菌効果については確認されていない。
一方、 ある種のビフィズス菌ゃ乳酸菌の菌体、 これらの菌体から抽出した多糖 類が胃潰瘍の予防、 治療に有用であること (特開平 4 一 5236号公報) 、 ある種の 海草由来のラムノース多糖 · ラムナンやラムノースオリゴ糖が抗潰瘍剤として有 用であること (特開平 6 - 247861号公報) が報告されている。 また、 モズク由来 の多糖類であるフコイダンが H pの胃粘膜への定着を阻止し、 抗潰瘍性を有する とされている (特開平 7 - 138166号公報) が、 この公報における潰瘍治癒作用の 証明には、 H pによる潰瘍形成とは病理発生が基本的に異なる酢酸誘発潰瘍が用 いられており、 従って H p感染による胃炎、 胃潰瘍形成の抑制効果を示すもので はない。 さらに、 この公報にはフコース (単糖類) が定着因子と考えられるとの 記載があり、 その考えに基づき、 H pのフコィダンによる定着阻害をみるインビ 卜口実験においてはピオチン化フコースが接着マ一カーとして使用されているが
、 現時点ではフコースは接着因子とは考えられていないので、 やはり H p定着阻 害の効果を示すものではない。
そして、 これらは、 H p定着の機構を解明した上で定着阻害剤を開発したもの ではない。 これまで、 H pの胃内定着の機構、 具体的には H pの接着因子 (adhe sin)や接着因子に対応する胃粘膜上の受容体については明らかにされておらず、 定着の機構に関する知見に基づいた有効な H pの定着阻害剤ゃ抗潰瘍剤の開発は 行われていなかった。 例えば、 上記特開平 4 - 5236号公報ではどのような多糖類 が抗潰瘍作用を示すのか不明であり、 しかも酢酸誘発潰瘍およびアルコール性ス 卜レス潰瘍の予防、 治療に関するものである。 また、 上記特開平 6 - 247861号公 報では、 用いる多糖は脱硫酸処理を施したものであり、 後述するように本発明に お 、て見出された、 H pの定着阻害には硫酸基が関与するとの知見とは相反する ものである。 上記特開平 7 - 138166号公報では、 主としてフコース (単糖類) か らなり、 若干のゥロン酸を含有し、 構成糖の一部が硫酸エステル化されているフ コィダンが用いられ、 これが H p定着阻害作用も有するとの記載があるが、 やは り多糖鎖の硫酸基が H pの定着阻害に有効であるとの認識は全くみられず、 H p 定着阻害の機構に基づいて薬剤を提供したものではない。 しかも、 上述のように 、 この公報の記載からはフコィダンが H p定着阻害の効果があることは示されな い。
以上の通り、 H pを除菌するために、 抗生物質を長期にわたり使用すると副作 用と共に耐性菌の増加の恐れがある等の問題があり、 ヮクチンゃ抗体の使用でも 十分な効果は望めない。 また、 各種の多糖類を用いた場合の抗潰瘍作用、 また、 フコィダンの H p定着阻害効果については、 それらの作用機構は明らかにされて いない。 発 明 の 開 示
本発明の目的は、 消化性潰瘍の発生に関与する H pの胃内定着に関する機構を 解明し、 それに基づいて H pの定着阻害剤を提供することである。 また、 抗生物 質の使用に伴う副作用や耐性菌増加という欠点を持たず、 H p感染による胃炎、 胃潰瘍等に対して、 効果的で安全性の高い予防剤および治療剤、 並びに予防また は改善用食品を提供することである。
本発明者らは、 これまで十分に解明されていなかった、 ヘリコバクタ一 · ピロ リの胃粘膜への定着に関し、 新規な重要な知見を得たことに基づき本発明に至つ た。
H pは増殖条件の特殊性から、 胃内での生態に関しては十分に解明されていな かった。 特に、 強酸性の胃内での増殖の鍵となる胃粘膜への定着に関して種々の 研究がなされているにもかかわらず、 胃内での強い增殖能力の理由ははつきりと 説明できなかった。 胃粘膜への接着は、 胃内での H pの増殖に重要な役割を果た すものであるので、 接着因子の解明は、 H pにより引き起こされる胃炎、 消化性 潰瘍の予防、 治療法の開発に大きな意義をもつ。
これまで考えられていたいくつかの病原因子のうちの 1つである、 H pが産生 するウレァ一ゼについては、 前述のように胃内の尿素をアンモニアに変換すると いう酵素としての役割が胃炎、 胃潰瘍、 胃癌などを引き起こすと考えられていた 。 また、 各種実験から、 ウレァ一ゼは H pの胃粘膜への定着には関与しない、 す なわちウレァ一ゼは接着因子 (adhesin)としての機能は持たないと報告されてき た。 本発明者らは、 H pの接着に関する従来の研究結果からは予想外の、 ゥレア ーゼそのものが H pの胃粘膜への接着に関与するとの知見を得た。 すなわち、 H Pの産生するウレァ一ゼは、 尿素をアンモニアに変換する酵素としての作用に加 え、 接着因子としての機能が大きいこと、 すなわちゥレアーゼ自体が胃粘膜ムチ ンに結合することによりこの菌の増殖が可能となることを見出した。
さらに本発明者等は、 ゥレアーゼに対応した胃粘膜ムチンの受容体分子は硫酸 基が関与していることを示唆する知見を得た。 このように、 接着因子とその受容 体分子との関係を明らかにすることにより、 耐性菌を生じずに H pを除菌する新 規な方法を提供することが可能になった。
本発明の要旨は、 硫酸基を含み構成糖の 50モル%以上がフコースからなる多糖 類以外の、 硫酸基を含む多糖類を有効成分とするヘリコバクタ一 · ピロリの定着 阻害剤、 並びに、 硫酸基を含む多糖類および胃酸分泌抑制剤を有効成分とするへ リコバクタ— . ピロリの定着阻害剤である。 さらに本発明は、 硫酸基を含み構成糖の 50モル%以上がフコースからなる多糖 類以外の、 硫酸基を含む多糖類を有効成分とするヘリコバクタ一 ' ピロリ感染に よる胃炎、 胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防剤および治療剤にも関し、 また、 硫 酸基を含む多糖類および胃酸分泌抑制剤を有効成分とするヘリコパクター · ピロ リ感染による胃炎、 胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防剤および治療剤にも関する 。 また、 本発明は、 硫酸基を含み構成糖の 50モル%以上がフコースからなる多糖 類以外の、 硫酸基を含む多糖類を添加した胃炎、 胃潰瘍および十二指腸潰瘍の予 防または改善用食品も提供する。
上記において使用する硫酸基を含む多糖類としては、 デキストラン硫酸、 ー カラギ一ナン、 ス—カラギ一ナン、 へパリ ン、 または硫酸化力一ドランが好まし い。 図面の簡単な説明
図 1は、 ゥレアーゼの精製胃ムチンおよび MKN45 細胞に対する接着パターンを 示す。
図 2は、 MKN45 細胞に対するウレァ一ゼの接着性を示す。
図 3は、 各種硫酸基を含む多糖類のゥレアーゼ接着抑制率を示す。
図 4は、 各種硫酸基を含む多糖類のゥレアーゼ接着抑制率を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明において H p定着阻害剤として使用する硫酸基を含む多糖類は、 天然に 存在するものでも、 化学的に合成したものでもよい。 ここで多糖とは、 オリゴ糖 を含む、 数個以上の単糖から構成される糖質であり、 ホモ多糖、 ヘテロ多糖、 複 合糖質を構成する多糖のいずれでもよい。 硫酸基には、 0 -硫酸基、 N -硫酸基 (スルホアミノ基) が含まれ、 硫酸基の位置は特に限定されない。
本発明で使用する硫酸基を含む多糖類の硫酸基含量は、 硫黄 (sulfur) 含量と して通常 5 %以上であり、 好ましくは 9〜20%である。 H pの胃粘膜定着阻止能 は硫酸化の度合いと相関しているので、 硫黄含量が 10〜18%程度の多糖類を使用 するのが特に好ましい。 本発明において使用できる硫酸基を含む多糖類を例示すると、 天然に存在する 硫酸基を含む多糖類では、 例えばデキストラン硫酸、 コンドロイチン硫酸、 へパ リン、 へパリノイ ド、 マンナン硫酸、 カロニン硫酸、 カラギ一ナン ( C一力ラギ —ナン、 λ—力ラギーナン等) 、 デルマタン硫酸、 フノラン、 ボルフイラン等が 挙げられ、 デキストラン硫酸、 Λ —カラギ一ナン、 ス一力ラギ一ナン、 へパリン が好ましく、 特に好ましいのはデキストラン硫酸、 ス—カラギ一ナンである。 合 成された硫酸基を含む多糖類には、 硫酸化力一ドラン、 硫酸化ラク卜一ス、 硫酸 化オリゴ糖、 硫酸化レンチナン、 硫酸化シゾフィラン、 硫酸化酵母グルカン等が あり、 中でも硫酸化力一ドランが好ましい。
本発明で使用する硫酸基を含む多糖類は、 市販品を利用することができる。 例 えば、 コンドロイチン硫酸、 カラギ一ナンは食品添加物 (增粘剤) として、 デキ ストラン硫酸やへパリンは皮下、 筋肉内、 静脈注射用の抗血液凝固剤の原料とし て用いられている。 また、 硫酸基を含む多糖類としては、 それを含有する動物組 織、 紅藻類や褐藻類などの藻類等から得られた抽出物や精製物を使用するか、 硫 酸基含量が低いか全く含有しない天然の多糖類を硫酸化して用いてもよい。 抽出 、 精製の方法あるいは硫酸化の方法は任意の既知の方法を使用すればよい。 硫酸基を含む多糖類を有効成分として含む H p定着阻害剤あるいは抗潰瘍剤は 経口により投与する: 硫酸基を含む多糖類は、 抗血液凝固作用を有するため、 注 射による投与の場合は副作用を有するものもあるが、 経口投与の場合にはそのよ うな副作用は生じず安全である。 また、 食品添加物として使用されているものは 当然、 安全性は確認されている。
本発明で用いる硫酸基を含む多糖類は、 後述のィンビトロ実験および動物実験 から明らかなように、 H pの胃粘膜への定着を阻止し、 高い除菌効果を発揮しう る。 従って、 硫酸基を含む多糖類を有効成分とする薬剤組成物は、 H pの胃粘膜 への定着によって発生する胃炎、 胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防剤、 治療剤と して有用であり、 また硫酸基を含む多糖類を添加した食品を胃炎、 胃潰瘍または 十二指腸潰瘍の予防または改善用食品として用いることもできる。
従来、 H p感染による胃炎、 胃潰瘍の病理発生には、 H pの定着によって産生 されるゥレア一ゼが病原因子の 1つとして注目されてはいたが、 H pの胃粘膜へ の接着に関与する因子であることは全く予想されていなかった。 そのような状況 において、 本発明は先に、 H pの接着因子は菌体表層に局在しているウレァーゼ であることを見出し、 抗ゥレア一ゼ抗体を胃炎、 胃潰瘍等の予防剤または治療剤 として用いることを提案した (特開平 10— 287585号) 。 H pがヒ卜胃癌由来 MKN - 45細胞によく付着し、 炎症性サイ ト力インであるインタロイキン- 8を分泌するこ とを利用して、 抗ゥレア一ゼ鶏卵抗体の H p接着阻止能を検討し、 さらに H p高 感受性へアレスマウスを用いて H p定着阻止能を調べた。 その結果、 この抗体が KN細胞への H pの接着を効率よく阻止するとともに、 動物実験においても有意 な H p定着抑制効果を示した。 この抗ゥレア一ゼ鶏卵抗体は、 意外にもゥレア一 ゼの酵素活性をほとんど阻害しない。 従って、 ウレァ一ゼは従来考えられていた 酵素としての作用以外に、 胃粘膜への接着にも関与していることが示唆される。 本発明者等はさらに、 ピオチン化ウレァ一ゼがへパリン、 胃ムチン、 あるいは MKN- 45細胞に特異的に付着することを明らかにし、 そして、 このウレァ一ゼ接着 が硫酸基を含む多糖類によつて特異的に抑制されるとともに、 動物実験において も硫酸基を含む多糖類の経口投与によって胃内の H p定着が用量依存的にかつ特 異的に抑制されることを実証した (以下の実験例参照) 。 これらから、 H pのゥ レア一ゼは胃内においてアンモニアを生成して粘膜にダメージを与えることに加 え、 接着因子としての機能も有することが分かる。 また、 H pの接着因子である ゥレア一ゼに対応する胃ムチンの受容体分子は、 主に硫酸基もしくは硫酸エステ ルで構成されていると考えられる。
本発明では、 H pの接着因子とその受容体の関係を明らかにし、 硫酸基を含む 多糖類が H p定着阻害作用を有することを確認したことに基づき、 有用な H p定 着阻害剤、 胃炎、 胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防剤および治療剤、 並びに胃炎 、 胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防または改善用食品を提供するものである。 硫酸基を含む多糖類を H p定着阻害剤、 あるいは胃炎、 胃潰瘍等の予防剤、 治 療剤として用いる場合、 その剤形は任意であるが、 経口投与に適した形態とする 。 通常、 硫酸基を含む多糖類を主剤とし、 これに慣用の担体や賦形剤を配合して 任意の方法で製剤化して用いることができる。 必要に応じて、 その他の添加剤ま たは薬剤、 例えば制酸剤 (炭酸水素ナトリウム、 炭酸マグネシウム、 沈降炭酸力 ルシゥム、 合成ヒドロタルサイ 卜等) 、 胃粘膜保護剤 (合成ゲイ酸アルミニウム 、 スクラルファート、 銅クロロフィ リンナトリゥム等) や消化酵素 (ピオジァス ターゼ、 リバ—ゼ等) を加えてもよい。 本発明薬剤の投与量は、 特に制限するも のではないが、 硫酸基を含む多糖類として、 予防の場合には成人 1日当たり 1〜 5 mgZkg、 治療の場合で成人 1日当たり 50~500 mg/kgの範囲が好ましい。 胃炎、 胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防、 改善用食品の場合は、 食品中硫酸基 含有多糖類が、 通常 0. 1 %以上、 好ましくは 0. 5 %以上含まれる。
また、 硫酸基を含む多糖類からなる H p定着阻害剤、 並びに胃炎、 胃潰瘍もし くは十二指腸潰瘍の予防剤および治療剤は、 胃酸分泌抑制剤を併用することによ り一層その効果を高めることができる。
胃酸分泌抑制剤としては、 シメチジン、 ラニチジン、 ファモチジン等の H 2イン ヒビター、 オメプラゾ一ル、 ランソプラゾール等のプロ トンポンプインヒビタ一 が使用できる。 胃酸分泌抑制剤の投与量は成人 1日当たり 20〜30mgが好ましい。 次に、 本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、 本発明はそれらによ つて制限されるものではない 実施例
〔実施例 1〕
処方例 1 (細粒) 1. 5 g中
デキス卜ラン硫酸 100 mg
乳糖 950 mg
トウモロコシデンプン 405 mg
PVPCK-30) 45 mg
上記成分をとり、 湿式造粒法を用いた通常の方法により細粒を得た。
処方例 2 (錠剤) 3錠中
κ一力ラギ一ナン 300 mg
乳糖(200M) 250 mg
トウモロコシデンプン 50 mg
結晶セルロース 180 mg g P T/JP 5
PVPCK-300) 22 mg
ステアリン酸マグネシゥム 8 mg
上記成分をとり、 通常の方法により錠剤を得た。
処方例 3 (顆粒) 1. 5 g中
硫酸カードラン 100 mg
乳糖(200M) 900 mg
トウモロコシデンプン 450 mg
PVPCK-30) 50 mg
上記成分をとり、 押し出し造粒法で通常の方法により顆粒剤を得た。
〔実験例 1〕 ィンビ卜口実験
各種の硫酸基を含む多糖類について、 H pが産生するゥレア一ゼの胃粘膜への 定着阻害効果をィンビ卜口実験系において調べた。
(実験材料および方法)
胃ムチンへのゥレア一ゼ接着試験
本発明者等は、 先に、 H pの接着因子が H pが産生するウレァ一ゼであること を見出した。 さらに、 このウレァ一ゼは以下に示すように胃粘膜のムチンによく 結合する。
ウレァ一ゼの接着試験に用いる豚胃ムチンを以下のようにして調製した。
約 2 力月齢の健康な豚を屠殺し、 胃部を摘出し、 内部に 0. 1Mリン酸塩 + 0. 15M NaCl + 5mM N-ェチルマレイミ ド (NEM)十 ΙπιΜ フエ二ルメチルスルホニルフルオラ ィド (PMSF) + lmM EDTA含有 PBS (pH 7. 4)を加えて洗浄した。 胃を切開し、 粘膜 を削り取り、 上記の緩衝液に浮遊させた。 この粘膜浮遊液を氷冷しながらポリ 卜 口ンホモゲナイザーを用いて均一にした。 これを 15,000 x gで遠心し上清を得た 。 この上清を 25,000 x gで再び遠心し、 上清を回収し、 蒸留水で透析した後、 凍 結乾燥して粗精製胃ムチンを得た。 次いで、 この乾燥粗精製胃ムチンを PBS (pH 6. 8) (6M塩酸グァニジンおよびプロティア一ゼインヒビ夕一 (5mM NEM, lmM PMS F, lmM EDTA)を含む) に溶解し、 これを塩化セシウム密度勾配 (1. 5 g/ml) に重 層し、 34, 000 X gで 48時間遠心した。 シアル酸含有分画の検出はニトロセルロー ス膜ブ口ッティ ングと過ヨウ素酸シフ試薬による染色によって行った。 発色した 分画をプールし、 再び塩化セシウム密度勾配に重層して遠心した。 染色陽性分画 をプールし、 凍結乾燥した。 次いで、 0. 1Mリン酸緩衝液 (0. 1M NaCl 含有、 pH 6 . 8) で平衡化したセファロ一ス CL- 4B カラムを通してゲル濾過をし、 分画した。 PAS染色陽性で、 蛋白濃度の高い分画をプールし、 PBS (pH 6. 8)で透析して精製 豚胃ムチンを得た。 これを使用時まで - 80°Cに保存した。 なお、 得られた精製豚 胃ムチンは SDS- PAGEの結果、 66 kD の糖タンパク質であることを認めた。
ウレァ一ゼ接着試験用マイクロプレートは次のようにして作製した。
96ゥエルマイクロプレートの各々のゥエルに 1. 25%グルタルアルデヒド溶液を 100 μ 1ずつ加え、 5分間感作した。 次に、 ゥュルを蒸留水で 3回洗浄し、 精製 豚胃ムチン (1. 27 mg/ml) をゥヱル当たり 50 / 1ずつ加え、 4 °Cに一夜静置する ことによって固相化した。 使用時には各々のゥヱルに 3 %BSA を加えて 37°Cで 60 分間反応させることによってブロッキングした後、 0. 05%ッィン 20加 PBS で 3回 洗浄したプレー卜をウレァ一ゼ接着試験に供した。
上記で作成したマイクロプレート上の固相化された豚胃ムチンへのゥレアーゼ 接着試験は以下のように行つた。
精製したピオチン化ウレァ一ゼは pH域の異なる接着培地 (20mMリン酸緩衝液に 0. 01%ツイン 20および 0. 15M NaClを含む。 接着培地の pHは予め 2. 0、 3. 0、 4. 0 、 4. 5、 5. 0、 5. 5、 6. 0 および 6. 5 に調整しておく) を用いて最終濃度が 7. 0 g /ml となるように希釈した。 調整したウレァ一ゼを前述のムチン固相化マイ クロプレートの 2穴ずつに加え、 37°Cで 60分間感作した。 次に、 各々のゥヱルを 接着培地で 3回洗浄した後、 直ちに 10%中性ホルマリン (pH 7. 4) を加え、 プレ ―トを 37°Cで 30分静置することによって固定した。 ゥヱルに付着したゥレアーゼ 量を測定するため、 ストレプトアビジン HRP を各々のゥヱルに加え、 37°Cで 60分 間反応させた。 次いで、 基質としてオルト- フヱニレンジァミン 2塩酸および H2 02を加え反応させた。 反応停止液には 3N H2S04を用いた。 なお、 ランニングプレ ―卜には 2倍段階希釈した既知量のゥレアーゼを置いて、 そのカリブレーション 力一ブから未知量のサンプルを測定した。
ヒト胃癌由来 MKN45 細胞へのウレァ一ゼ接着試験 ヒ卜胃癌由来 MKN45細胞に H pがよく接着し、 インターロイキン- 8を分泌する ことが明らかにされている (Kabir, A. M. A. et al. , 1997, Gut 40 : 49-55) (細胞 は東海大学医学部感染症学部門より分与) 。 この細胞を利用して、 上記の精製胃 ムチンで行ったのと同様の方法でピオチン化ゥレア一ゼの接着能を検討した。
MKN細胞の調製は、 単層培養細胞を得るため細胞浮遊液を 96ウェルマイクロブ レートに 1ゥヱル当たり 2 X 104 個になるように接種し、 37°Cの 5 %C02 培養装 置で約 7日間培養することにより行った。
ウレァ―ゼ接着抑制試験
ヒ卜胃癌由来 MKN45 細胞を用いて、 各種硫酸基を含む多糖類のウレァ一ゼ接着 抑制試験を行った。 まず、 種々の濃度に調整した硫酸基を含む多糖類とピオチン 化ウレァ一ゼを混合し、 この混合物を 37°Cで 60分間振盪しながら感作した。 次に 、 この混合物を 96ゥヱルマイクロプレートの単層培養細胞ゥヱルに移し、 プレー トを振盪しながら再び 37°Cで 60分間感作した。 その後マイクロプレートのゥヱル を接着培地 (pH 3. 0) で 3回洗浄し、 各々のゥエルの細胞を 65°C 10分間加熱する ことによって固定した。 固定した各々のゥヱルを PBS-ツイン 20 (0. 5 %) (pH 6. 8 ) で 3回洗浄し、 細胞に接着したピオチン化ウレァ一ゼを検出するため、 各々の ゥエルにストレプトアビジン HRP を加えた後、 前記 「胃ムチンへのウレァ一ゼ接 着試験」 に記載された ELISA により測定した。
(結果)
精製胃ムチンおよび MKN45 細胞に対するウレァ一ゼの接着パターン
図 1に示すように、 精製胃ムチンおよび MKN45細胞に対するウレァ一ゼの接着 パターンは酷似している。 すなわち、 MKN 細胞へのウレァ一ゼの接着は、 ムチン の場合と同様に pH域に依存しており、 これは MKN細胞が胃ムチンに認められるの と同じ受容体を細胞表面に発現していることを示唆している (ゥレア一ゼの胃ム チンへの接着パターンには pH 4. 5の域でもショルダーピークが認められる点で MK N45細胞の場合とやや異なるが、 これは MKN45 細胞の表面には十分な量のウレァ -ゼ受容体が発現していないか、 受容体分子の構成がわずかに異なっているため であると考えられる) 。 pH 3. 0領域でのウレァ一ゼ接着は胃粘膜における H pの 定着を反映していると考えられ、 この pH域でゥレア一ゼの接着が阻止できる物質 ェ 2 は H pの胃内定着を阻止し、 結果的に胃炎、 胃潰癟を予防、 治療できる可能性が める。
MKN45 細胞へのウレァ一ゼ接着反応
図 2から明らかなように、 MKN45 細胞へのウレァ一ゼ接着反応は用量依存的に S字状カーブを示した。
硫酸基を含む多糖類によるゥレア一ゼ接着反応の抑制
図 3および図 4に示すように、 MKN45 細胞へのウレァ一ゼ接着反応は硫酸基を 含む多糖類により特異的に抑制された。 図 3には、 硫酸基を含む多糖類としてデ キストラン硫酸、 へパリン、 ス一力ラギ一ナン、 /c —カラギ一ナンを用いた場合 の平均ゥレアーゼ接着抑制率が示されており、 これらの硫酸基を含む多糖類は接 着を特異的にかつ用量依存的に抑制していることが分かる。 一方、 対照物質とし て使用した、 硫酸基を含有しないデキストランはこの接着を抑制しなかった。 ま た、 図 4は、 対照として力一ドランを、 硫酸基を含む多糖類として硫酸化カード ランを用いた場合の平均ウレァ一ゼ接着抑制率を表し、 硫酸化力一ドランがこの 接着を特異的かつ用量依存的に抑制している。
以上の結果から、 H pのゥレアーゼは胃ムチンおよび MKN 細胞に特異的かつ用 量依存的に接着し、 このゥレアーゼ接着は硫酸基を含む多糖類によつて特異的か つ用量依存的に抑制されることが明らかである。 ゥレア一ゼは H p菌体表層に局 在しているので、 硫酸基を含有する物質を経口投与すれば胃内の H p菌体のウレ ァ一ゼに特異的に結合することにより、 除菌することができると考えられる。 〔実験例 2〕 インビボ実験
実験例 1の結果をさらに動物実験により確認した。
実験動物として H p感染に対して最も高感受性を示すヘアレスマウス (NS: Hr/ ICR系、 財団法人動物繁殖研究所、 受託番号 IAR-NHI-9701) (ATCC#72024) を用い た。 以下の表 1に示すスケジュールに基づき動物実験を行った。 検体は攻撃 2日 前から屠殺時まで飲水に溶解して自由飲水投与した。 マウスの 1日当たりの飲水 量は 4〜8 mlであった。 攻撃菌株はヒ卜臨床材料から分離された NSP335株 (Cag A + および Vac A + ) を用い、 攻撃菌量はマウス当たり 1 x lO 9 CFU とした。 検 体投与終了時に各群のマウスを屠殺し、 胃を摘出し、 内容物を除去した後、 ボル テックスミキサーを用いて PBS (pH 7. 2)で 8回洗浄し、 ホモゲナイザーで乳剤を 作製し、 H p検出用材料とした。 H pの検出は乳剤を H p検出用培地 (ポアメデ ァ H p分離培地、 栄研化学) に接種し、 ガスパック法で 37°C、 5日間培養し、 コ ロニ一数を計測することによって行った。 供試検体としてデキストラン硫酸、 デ キストラン、 カラギ一ナン、 力一ドランおよび硫酸化力一ドランを用いた。 表 1 動物実験スケジュール
Figure imgf000015_0001
N S P 3 3 5
攻撃 ( 1 X 10SCFU/マウス)
検体投与 (飲水)
以下の表 2 1および表 2 - 2は H pの除菌効果を示す。 これらの表から明ら かなように、 硫酸基を含む多糖類 ( 一力ラギ一ナン、 ス一力ラギーナン、 デキ ストラン硫酸、 硫酸化カードラン) はすべて、 H pの胃内定着を抑制し、 高い除 菌効果が得られた。 また、 多糖類の硫酸基の量と定着阻止能は相関する傾向が認 められた (表 2 - 2 ) 。 これに対し、 硫酸基を含有しない多糖類は無投与の対照 群と同様、 H pの定着を阻止しなかった。 T/JP99/02540
1 4 表 2 — 1
Figure imgf000016_0001
表 2 — 2
Figure imgf000016_0002
(実験例 3 ) インビボ実験 (硫酸基を含む多糖類と胃酸分泌抑制剤との併用) 供試検体として、 実験例 2において高い除菌率を示したデキストラン硫酸と硫 酸カードランを選択し、 胃酸分泌抑制剤 (H 2インヒビタ一、 プロトンポンプイン ヒビ夕一) との併用効果を動物実験により調べた。
動物実験の方法は前記実験例 2と同様であるが、 実験のスケジュールは以下の 表 3に示す通りとし、 検体の投与は攻撃 1週間後から屠殺時までとする。 表 3
Figure imgf000017_0001
N S P 3 3 5
攻撃 ( 1 x l09CFU/マウス)
検体投与 (飲水)
硫酸基を含む多糖類としてデキストラン硫酸または硫酸力一ドランを、 胃酸分 泌抑制剤としてシメチジン (H2インヒビター) またはオメプラゾ一ル (プロ トン ポンプインヒビタ一) を併用した場合の除菌効果を表 4に示す。 H pの定着が安 定化した攻撃 1週間後からの投与であっても高い除菌率を示し、 硫酸基を含む多 糖類単独での投与よりさらに優れた除菌効果が得られた。
表 4
Figure imgf000017_0002
以上の動物実験から、 硫酸基を含む多糖類は H pの胃内定着を効率よく抑制で 1 b きること、 さらに H2インヒビタ一やプロ卜ンポンプィンヒビター等の胃酸分泌抑 制剤との併用においてより高い除菌効果を示すことが明らかとなった。 これらの 物質は抗生物質と異なり、 薬剤耐性の問題が生じないため H p除菌のための有用 な方法を提供しうる。 産業上の利用可能性
上述のように、 本発明によれば、 へリコパクター ' ピロリの胃粘膜への有効な 定着阻害剤が提供される。 この定着阻害剤は、 ヘリコバクタ一 ' ピロリ感染によ つて引き起こされる胃炎、 胃潰瘍等に対して安全で効果的な予防剤および治療剤 、 並びに予防または改善用食品として用いることができる。 本発明は、 へリコ クタ一 · ピロリの胃粘膜への接着に関与する因子およびそれに対応する胃内の受 容体を見出したことに基づいて、 H pの定着阻害に硫酸基を含む多糖類を用いる ものであるので、 抗生物質とは異なり耐性菌を生じることなく胃内のヘリコバク タ一 · ピロリを特異的に除菌することができ、 従って、 胃炎、 胃潰瘍等を有効に 抑制することができる。 その除菌効果は胃酸分泌抑制剤との併用によりさらに高 くなる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 硫酸基を含み構成糖の 50モル%以上がフコースからなる多糖類以外の、 硫 酸基を含む多糖類を有効成分とするへリコパクター · ピロリの定着阻害剤。
2 . 硫酸基を含む多糖類および胃酸分泌抑制剤を有効成分とするヘリコバクタ ― · ピロリの定着阻害剤。
3 . 硫酸基を含む多糖類がデキストラン硫酸、 κ 一力ラギ一ナン、 λ—カラギ —ナン、 へパリンまたは硫酸化カードランである請求の範囲第 1項または第 2項 記載の定着阻害剤。
4 . 硫酸基を含み構成糖の 50モル%以上がフコースからなる多糖類以外の、 硫 酸基を含む多糖類を有効成分とするヘリコバクタ一 · ピロリ感染による胃炎、 胃 潰瘍または十二指腸潰瘍の予防剤および治療剤。
5 . 硫酸基を含む多糖類および胃酸分泌抑制剤を有効成分とするヘリコバクタ
― · ピロリ感染による胃炎、 胃潰瘍または十二指腸潰瘍の予防剤および治療剤。
6 . 硫酸基を含む多糖類がデキストラン硫酸、 一力ラギ一ナン、 λ—力ラギ 一ナン、 へパリンまたは硫酸化力一ドランである請求の範囲第 4項または第 5項 記載の予防剤および治療剤。
7 . 請求の範囲第 1項記載の定着阻害剤を添加した胃炎、 胃潰瘍または十二指 腸潰瘍の予防または改善用食品。
8 . 硫酸基を含む多糖類がデキストラン硫酸、 /c一力ラギ一ナン、 ス一力ラギー ナン、 へパリンまたは硫酸化力一ドランである請求の範囲第 7項記載の食品。
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