WO1999064071A1

WO1999064071A1 - Procede de preparation d'un immunoadsorbant adn dans une resine carbonisee

Info

Publication number: WO1999064071A1
Application number: PCT/CN1999/000076
Authority: WO
Inventors: Yaoting Yu; Changzhi Chen; Deling Kong
Original assignee: Nankai University
Priority date: 1998-06-08
Filing date: 1999-06-07
Publication date: 1999-12-16
Also published as: US6262172B1; CN1209548A; JP2002517471A; GB2343511A; GB0002399D0

Description

碳化树脂 DNA免疫吸附剂的制备方法技术领域

本发明涉及医用吸附材料，特别表涉及一种免疫吸附剂。这种吸附剂将活性物质 DNA固定在作为载体材料 '的碳化树脂上，成为 DNA免疫吸附剂，可用于治疗系统性红斑良疮的血液灌流疗法。背景技术

系统性红斑狼疮（简称 SLE ) 是一种自身免疫性缺陷的疑难病症，临床上尚无有效疗法。 SLE 的病因不详，患者往往因全身重要器官的功能衰竭而死亡，死亡率较高。

使用 DNA 免疫吸附剂对患者进行血液灌流，是近十几年来发展起来的新型疗法。 Jnes, Frank R的欧洲专利 EP 0 272 792 A1 ( 1987 ) 对这种方法作了详细说明，该专利文献的全部内容作为本申请的参考。 DNA 免疫吸附剂血液灌流疗法是依靠 DNA对致病物质抗 DNA抗体的特异识别作用，清除患者血液中的致病物质，以緩解病情，改善患者的免疫功能，从而使患者逐渐恢复健康。这种疗法疗效显著，正日益受到临床医学界的重视。

美国的 Tennan DS等首次使用活性炭为载体材料，采用火棉胶包膜固定 DNA, 将制得的 DNA免疫吸附剂用血液灌流法治疗了一名重度 SLE患者，使患者生命延长了 31 天 [Lancet，1979,2(8147):S24-7],开辟了用免疫吸附剂治疗 SLE的新纪元。但是， Terman的吸附剂由于使用活性炭作载体，机械强度和耐磨性较差，微小颗粒容易脱落，会使毛细血管堵塞。

杨彦等人研究开发了采用日本碳化树脂为载体的吸附剂，这种吸附剂用火棉胶包膜固定 DNA, DNA 预先用氯化四氮唑兰（BT ) 络合 [中国生物医学工程学报， 1985， 4 ( 2 ) : 88-95; 高等学校化学学报， 1985 , 6 ( 9 ) : 843-847】。所得到的 DNA免疫吸附剂的机械强度大大提高了，而且， DNA不脱落。这种吸附剂已经在中国成功地应用于临床治疗 SLE, 疗效显著。但是，临床应用中发现，病人存在寒颤现象，说明吸附剂中存在热源物质。另外，有待改进包膜条件，以提高吸附剂的吸附性能。此外，目前的碳化树脂价格昂贵，有必要改进碳化树脂的制造工艺，以便降低成本，有利于推广免疫吸附剂的临床应用。发明内容

由于载体材料的结构性能以及与血液的相容性直接影响 DNA 免疫吸附剂的使用性能，因此，本发明的目的是提供一种改进的碳化树脂 DNA 免疫吸附剂的制备方法，这种方法改进了用碳化树脂包膜法固定 DNA 的包膜条

― 1 ―

替换页 (细则第 26条) 件，提高了吸附剂的吸附性能，并且在制备过程中遊免和消除了热源物质，使其更加符合临床医用要求。此外，这种方法还大大降低了吸附 '剂的制造成本。

本发明的 DNA 免疫吸附剂的制备方法使用碳化树脂作为载体，在其上固定了有效量的 DNA, DNA的含量为 0.3-0.5nig/ml树脂，其特正在于，该方法包括下列步骤：

( 1 ) 制备碳化树月旨

以苯乙烯和丙埗腈为单体，以二乙燫笨为交联剂，以三倍亍单体和交联剂（重量比）的曱笨和液体石蜡为致孔剂，以过氣化笨曱酰为引发剂，以 2%聚乙烯醇水溶液为分散介质，进行悬浮聚合，在 8(TC 溫度下反应 5小时；然后，在 96 t温度下蒸馏曱笨，再在 100 °C温度下将球体聚合煮^ 2-3小时，使其进一步聚合和硬化；然后，用热水洗涤，在 50 C 温度下烘千，再用石油醚淋洗脱蜡，获得三元共聚超大孔树脂；

将上迖树脂放入电阻炉中，在惰气保护下，在 100-300 C 的溫度下予烧 8-10小时，然后升温至 500-800 °C，再通入水蒸气活化 0.5-1.0 小时后冷却，即获得碳化树脂；

( 2 ) 制备碳化树脂 DNA免疫吸附剂

把小牛胸腺 DNA 溶液与火棉胶乙醚溶液混合均匀后，一边迅速搅拌，一边加入经过予处理的碳化树脂，使液^艮快被吸千，然后用 50-60 °C 的热水浴恒温淋洗 2小时，并不时搅拌，至溶剂完全挥发，再在 50fc温度下真空千燥 2 小时，用水漂洗数遍后装入洗涤塔淋洗，直到流出液在 260iim处无紫外吸收，然后再漂洗数遍，在 50t真空下干燥，即获得成品吸附剂。

采用本发明的方法制得的 DNA免疫吸附剂中 DNA的含量达 0.3-0.5mg/mi 树脂。

将按本发明制备的 DNA 免疫吸附剂装入特制吸附罐，经消毒处理成为医用血液灌流吸附装置。血液从患者动脉中引出，流经吸附装置，患者血液中的致病物质被 DNA 免疫吸附剂吸附，洁净的血液从装置中流出，由静脉流回患者体内。灌流治疗过程一般为 2-3 小时。血液灌流与血液透析相似，安全、简便、费用氐。

下面，详细描述本发明的方法。

1、制备碳化树脂

将 5.0-7.5%w/w 苯乙烯， 10.0-12.5%w/w二乙烯笨， 7.5-10.0%w/w 丙烯腈， 50.0%w/w 甲苯混合均匀，加入 0.15-0.3%vv/w 引发剂过氧化苯甲酰，溶解后加入 25.0%w/w 液体石蜡，充分混合均匀，成为有机相，致孔剂（曱笨和液体石蜡）是单体总量的三倍。在 3000ml 三口瓶中，加入 2 倍于有机相体积的 1-2%聚乙烯醇溶液，水浴加热至 50^：。将有机相加入到反应瓶中，搅

替换页 (细则第 26糸) 拌，升温至 80 ° (：，反应 3-5小时。升高水浴温度至 90-100 ^eC，蒸榴甲笨。在 100 °C下将球体聚合物煮沸 2小时，过滤，' 用热蒸馏水洗涤树脂数遍。 50 *C 烘干，用石油醚淋洗或加热提取，除去致孔剂液体石蜡，得到三元共聚超大孔树脂。用标准筛筛选 0.45-1.0mm合格树脂，

在管式电阻炉中加入大孔树脂， ' 100-300。C预烧 8-10 小时，在 Νζ·.气保护下，以 100 tV小时的速度升温至 500-800 °C , 在此温度下通入蒸气，活化 0.5-1 .0小时，自然冷却至室温，得到 0.45-0.9mm碳化树脂约 350mL

将得到的碳化树脂用 2倍体积的 5%盐酸煮沸 30分钟，用二次蒸馏氷洗至中性。再用 2倍体积的 5%氢氧化钠煮沸 30分钟，用二次蒸馏水淋洗至中性。 50t烘千。用热无水乙醇提取 24小时， '洪千备用。

2、制备碳化树脂 DN A免疫吸附剂

( 1 ) DNA 溶液配制：高纯度小牛胸腺 DNA 溶解于 0.2mol/l Tns- HCL(pH=7.4)緩沖溶液中，浓度为 4mg/ml。依次加入等体积氯化四氮唑兰铯和水溶液和等体积无水乙醇，搅拌或振荡至完全溶解。

( 2 ) 水棉胶配制： 5%火棉胶乙鲢溶液用无水乙醚稀释 7.4倍。

( 3 ) 包膜：

将 19-20%v/vDNA溶液与 21 .4-22.9v/v 火棉月交混合均匀，在搅拌下倒入 57.1-59.5%v/v碳化树脂，搅拌均匀，液体被迅速吸干。在 50-60 t热水浴上恒溫 1 -2小时，不时搅拌， 50 C真空干燥 2小时。用高纯度注射用水漂洗和淋洗，至流出液在 260nm处的紫外吸收为 0.000。 50 ^eC真空干燥数小时，即得成品碳化树脂 DNA免疫吸附剂。

本发明制备的碳化树脂 DNA免疫吸附剂装入吸附罐中，共 250ml，密封后消毒，使用前用无菌生理盐水浸泡 30分钟以上，再用 3000ml无菌生理盐水冲洗。在患者股动脉和臂静脉插.管，灌流前 10-20 分钟静脉注入肝素 1- 1.5mg/kg 体重。整个灌流系统保温 37 ° (：。接通动静脉后开始灌流，流速由 50ml/min 逐渐增力 σ至 200ml/nim。于动脉端取血，测定 DNA 抗体、免疫复合物及其它生化指标。

本发明采用新的工艺合成方法合成了性能优良的免疫吸附剂载体材料碳化树脂，首先采用超大量致孔剂（致孔剂用量为单体和交联剂总量的三倍），严格控制引发剂用量和升温速度，即严格控制聚合速度。另外，快速蒸馏出致孔剂曱笨，这样才能最终得到具有超大孔和大比表面积的树脂。碳化过程的预烧、程序升温、碳化温度和水蒸气活化至关重要，直接影响和决定碳化树脂的收率和结构性能，本发明制备的碳化树脂具有适宜的孔径和比表面积 (孔径 20—35A ，比表面积 800-1200n^ml ) ，是制备 DNA免疫吸附剂的优良栽体材料，同时具有非常好的血液相容性，对血小板、红细胞和白细胞的破坏率很低，临床应用结杲也证明本发明碳化树脂的优越性能。

一 3一

替换页 (细则第 26条) 本发明制备的碳化树脂 DNA免疫吸附剂，已在全国 17个城市 28 家医院进行了 150多例临床应用，有效率达 98%, 患者不仅延长了生命，而且恢复了健康和劳动能力。表 1和表 2分别列举了部分 SLE临床报告。如表 1所示，十名患者经血液灌流后，血液中的致病物质抗 ds-DNA抗体的浓度明显降低，尿蛋白、血沉和抗核抗体滴度:^明显改善。除一人死亡外（存活 38 个月），其余 9人已存活 32个月以上，恢复了生活和劳动能力另外如表 2 所示，通迚对 5名 SLE患者进行多次血波灌流治疗发现，患者血液生化指标、临床症状越来越改善，特别是患者经治疗后，均停止服用任何激素类药物，其中 4人目前已分别存活 9, 12, 24, 24 (随访日期至 1996年底），只有 1 人在存活一年后死于综合症。这表明 DNA免疫吸附剂疗法不仅能緩解病情，而且能改善患者的免疫系统功能，保持长期疗效，并有治愈的可能。本发明的聂佳实施方式

实施例 1.

制备碳化树脂。

将 45.0g笨乙烯， 60.0g二乙烯笨， 45.0g丙烯腈， 300.0g曱笨混合均匀，加入 1.5g引发剂过氧化苯甲酰，溶解后加入 160.0g液体石蜡，分混合均匀。在 3000ml三口瓶中，加入 1%聚乙烯醇水溶液 1150mi, 氷浴加热至 50°C, 将上迷单体溶液倒入反应瓶，搅拌，在 1小时内^^应液升温至 80 :, 反应 5 小时。升高水浴温度至 90 °C 以上，蒸曱笨约 1 小时，直到不再有甲笨蒸出为止。在 100 °C下将球体聚合物煮沸 2小时，使其进一步聚合和硬化，过滤，用热蒸憎水洗涤数遍，除去聚乙烯醇。 50 C烘千，用石油醚（ 60-90 淋洗树脂，除去致孔剂中的液体石蜂。用标准筛筛选 0.45-1.0mm范围的合格树脂，约 400ml。

在管式电阻炉中加入 1000ml上树脂， 200 ^eC预烧 10小时后，在 N₂气保护下，以 100 'C/小时的速度升溫至 800 t, 在此溫度下通入蒸气活化 1 小时，自然冷却至室温，得到约 350ml 0.45-0.9mm的合格碳化树脂。比表面积为 1000-120000²7 平均孔径20-35人。

制备碳化树脂 DNA免疫吸附剂。

取制得的碳化树脂 250ml, 用 2倍体积的 5%盐酸煮沸 30分钟，用重蒸水洗至中性。再用 2倍体积的 5%氢氧化钠溶液煮沸 30分钟，用重蒸水漂洗、淋洗至中性。 50'C烘干。在提取装置内用无水乙醇回流 24小时，烘千备用。

所用溶液均用注射用水配制，使用纯化 DNA。在洁净无菌的环境下操作，目的是保证产品无热源。

于 1000ml烧杯中加入 80ml小牛胸腺 DNA溶液（ DNA溶解在 0.2MpH=7.4 的 Tris-HCL緩冲溶液中，浓度为 4mg/ml, 然后依次加入等体积的氯化四氮

替换 ^ (细则第 26条）唑兰饱和水溶液和无水乙醇，搅拌至絮状^ 7完全溶解）， 90ml 火棉胶溶液 ( 55mI5%火棉胶的乙醚溶液，用 350ml无水乙稀释 ) ,在搅拌下加入 250ml 上迷经过预处理的碳化树脂，迅速搅拌均匀，液体被很快吸千。在 50-60 ¾ 热水浴上，恒温 2小时，不时搅拌，至溶剂完全挥发。 50'C真空干燥 2小时。用注射用水漂洗数遍，装入淋洗塔琳 '洗，直到流出液在 260nm处无紫外吸收。再漂洗数遍， 50 °C真空千燥，得到成品吸附剂。 DNA含量为 0.38m /mi树脂。用兔子进行热源实验，产品无热源。

实施例 2 '

本实施例在实施倒 1 的制备碳化树脂的过程中，将在管式电阻炉中的碳化溫度改为升温至 580 °C，结杲，所得到的碳化树脂的比表面 ^仅为 100m /g 左右。其余步骤均与实施例 1 相同。从这一参数的变化可知，所制得的成品吸附剂中的 DNA含量将大大减少。

实施例 3

在实施例 1 的制备碳化树脂的过程中，将制备碳化树脂过程中的水蒸汽活化时间改变为 0.5 小时。结杲，所得到的碳化树脂的比表面积略有减少，为 800-1000m² /g。其余步骤均与实施例 1相同。由此可推断，成品吸附剂中的 DNA含量也将相应减少

实施例 ·

在实施例 1 的制备碳化树脂的过程中，在将树脂加入管式电阻炉后，不经过 200 "C预烧 10小时的步骤，直接在 ^气保护下升温至 800 t：。结杲，碳化树脂的收得率很低，同样的投料量，仅收得不足 200ml 的碳化树脂。可见预烧步驟可大大提高产品的收得率。

实施例 5

在本实施例是在实施例 1 的制备碳化树脂 DNA免疫吸附剂的过程中，将小牛胸腺 DNA 溶液的投料量改为 87.5ml , 火棉交溶液的投料量改为 100ml, 碳化树脂的投料量改为 250ml。其余条件与实施例 1相同。结果，成品吸附剂中的 DNA含量提高到 0.42mg/ml树脂。

实施例 6

在实施例 1 的制备碳化树脂 DNA免疫吸附剂的过程中，工艺条件完全相同，只是漂洗和淋洗的水不使用注射用水，而全部使用重蒸水。结杲，用兔子对所得的成品吸附剂进行实验，发现有明显热源反应，说明产品中存在热源物质。可见，使用注射用水对于避免和消除热源物质有决定性作用。工业应用性

本发明的制备碳化树脂 DNA 免疫吸附剂的方法改进了碳化树脂包膜固定 DNA的包膜奈件，提高了吸附剂的吸附性能，并且在制备过程中避免和替换页（细则第 26条）消除了热源物质，从而能制成吸附效率更高，更加符合临床医用要求的 DNA 免疫吸附剂。此外，本发明的方法由亍原料容易获得，工艺合理，还能大大降低吸附剂的制造成本。

替换页（细则第 26条）

)

10例 SLE病例报告总结（随访至 1998年 2月）基本情况检验结果（灌流前 /灌流后 1周）

编吸附

转归号免疫球蛋抗核抗抗 ds-DNA 次数

性别年龄发病时间治疗时间尿蛋白血沉补体 c₃

白（g L) 体滴度抗体

存活 44个月，

1 女 23 1992,1 1994,6 ++/- 42/13 13.6/ 1280/240 0.42/1.23 34.8/16.2 2

恢复原工作存活 38个月，

2 女 34 1993,7 1994,7 +++/+ 38/12 18.6/14.3 800/80 0.31/0.81 36.5/16.0 2

死于败血症存活 40个月，

3 女 31 1994,4 1994,10 ++/- 58/14 19.3/14.1 1040/160 0.40/1.22 34.3/16.3 2

从事家务存活 39个月，

4 女 29 1992,11 1994,11 ++/- 40/16 14.4/ 160/ 0.51/1.31 18.0/ 2

从事家务存活 35个月，

5 男 31 1994,7 1995,3 ++/- 55/18 21.3/12.6 880/160 0.43/1.24 17.5/ 2

恢复原工作

存活 35个月，

6 男 32 1992,3 1995,3 +++/+ 43/16 19.3/11.4 1280/240 0.32/1.67 28.5/14.1 2

从事家务存活 35个月，

7 女 33 1994,11 1995,3 +/- 65/16 12.5/ 1280/240 0.81/ 33.4/14.5 1

恢复原工作存活 34个月，

8 女 41 1991,4 1995,4 +++/- 78/18 18.6/10.5 80/ 0.83/ 31.1/16.6 2

生活自理存活 33个月，

9 男 24 1995,3 1995,5 ++/- 66/14 20.2/13.2 1200/160 0.54/1.21 33.8/15.5 2

恢复车间工作存活 32个月，

10 女 26 1995,1 1995,6 +/- 52/16 19.2/12.7 1040/80 0.86/ 36.8/15.7 1

从事饮食业

表 2. 例 SLE病例报告总结（随访至 1996年底)

Claims

权利要求'

1、一种 DNA免疫吸附剂的制备方法，它使碳化树脂作为载体，在其上固定了有效量的 DNA, DNA的含量 Q.3-0.5mg/ml树脂，其特征在于，该方法包括下列步骤：

( 3 ) 制备碳化树脂

以笨乙烯和丙烯腈为单体，以二乙烯笨为交联剂，以三倍于单体和交联剂（重量比）的曱笨和液体 ^蜡为致孔剂，以过氧化苯曱酰为引发剂，以 1- 2%聚乙烯醇水溶液为分教介质，进行悬浮聚合，在 S0 °C 温度下反应 5小时；然后，在 96 t温度下蒸馏甲笨，再在 100 ^eC温度下将球体聚合物煮沸 2-3小时，使其进一步聚合和硬化；然后，用热水洗涤，在 50 ^eC 温度下烘干，再用石油醚淋洗脱碏 , 获得三元共聚超大孔树脂；

将上述树脂放入电阻炉中，在惰气保护下，在 100-300 ^eC 的温度下予烧 8-10小时，然后升温至 500-800 ^eC, 再通入水蒸气活化 0.5-1.0小时后冷却，即获得碳化树脂；

( ) 制备碳化树脂 DNA免疫'疆剂

把小牛胸腺 DNA溶液与火撺^ L乙瞇溶液混合均匀后，一边迅速搅拌，一边加入经迚予处理的碳化树脂，使液体很快被吸千，然后用 50-60 的热水浴恒温淋洗 2小^，并不时搅拌，至溶射完全揮发，再在 50° (：温度下真空干燥 2 '〗、时，用水漂洗数 ^洗条塔林' 直到流液在 260nm处无紫外吸收，然后再漂洗数遍，在 50t真空下干燥， ^"获得成品吸附剂。

2、如权利要求 1所迷的 DNA免疫吸 ^剂的制备方法，其特征在于，各种物料的配比为：

( 1 ) 制备碳化树脂过程中：有; 目由单体笨乙烯 5.0-7.5%w/w, 丙烯腈 7.5-10.0%w/w,交联剂二乙烯苯 10.0-12.5%w/w，致孔剂甲笨 50.0%w/w,液体石蜡 25.0%w/w 和引发剂过氧化笨甲酰 0.15- 0.3%w/w组成，引发剂过氧化苯曱酰为笨乙烯和二乙烯苯总量的 0.5-1.0%, 水相为 1-2%聚乙烯醇溶液，有机相与水相的重量比为 1 : 2;

( 2 ) 制备免疫吸附剂过程中：碳化树脂 57.1-59.5%v/v,DNA 溶液 19- 20%v/v,火棉胶乙醚溶液 21.4-22.9%v/v， DNA浓度为 1.33mg ml，火棉胶浓度为 0.68%,

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替换页（细则第 26条）