WO1999058712A2 - Nachweis von genen - Google Patents

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Fawzy Abdelatty
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Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of genes and their expression.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a method with which genes can be detected in a simple and reliable manner and, if appropriate, their expression can be determined.
  • the present invention thus relates to a method which comprises the ampiification of DNA and its hybridization with a DNA library, wherein primers are used for the ampiification, the sequences of which are characteristic of genes.
  • the present invention is based on the knowledge of the applicant that sequences which are highly conserved are present in the transcribed 5 'region of genes, the so-called "CpG islands".
  • the applicant has found these sequences in genes of living beings, in particular animals and humans, viruses and plants.
  • the sequences are given in Table I. They have pallindrome structures and make complete or parts of recognition sequences less common Restriction enzymes.
  • the applicant has also recognized that DNA sequences of genes can be amplified using these sequences as primers and these can be used to detect the genes and their expression.
  • N is G or C
  • DNA includes any DNA from which sections are amplified can, if at least one of the primers of Table I is used.
  • the ampiification can be followed by customary methods, for example via gel electrophoresis (cf. FIG. 1 (A)).
  • the DNA can be a genomic or an extrachromosomal DNA. It can also be a cDNA.
  • genomic DNA encompasses both cell DNA and virus DNA which is integrated into the genome. An example of such virus DNA is HPV DNA.
  • extrachromosomal DNA encompasses any DNA that is not integrated into the genome, which applies to the DNA of lytic viruses.
  • the DNA can come from any cell. These can be kept in culture or freshly isolated from an individual.
  • the cells can be normal or changed or have pathogenic properties.
  • the cells can be tumor cells.
  • the expression "individual” encompasses any individual, in particular animals or humans and plants.
  • Hybrid animal cells are preferred according to the invention which contain the human X or Y chromosome or a human XY translocation, as a result of which the pseudoautosomal region Xp22.3 has been lost distal to MIC2.
  • Such hybrid animal cells are known (cf. Burk, RD et al., Mol. Cell Biol. 5 (1985), 576-581; Ropers, HH et al., Cytogenet. Cell Genet. 40 (1985), 736.
  • DNA library includes any DNA library with which the DNA can hybridize.
  • the DNA library can be a genomic DNA or a cDNA library.
  • hybridization indicates hybridization under normal conditions, in particular at 30 ° C. below the melting point of the DNA.
  • the DNA library can be made from DNA from any cell. These can be normal or changed or have pathogenic self-switching.
  • the cells can be tumor cells.
  • the cells can come from any individual, in particular animals or humans or plants.
  • a DNA library is preferred which contains the human X chromosome in the ⁇ vector Charon 35 (ATCC Cat.No. 57750).
  • the DNA and the DNA library can come from the same species, in particular from the same individual. They can also be from different individuals of the same species. It may also be beneficial if the DNA and DNA library are from different species.
  • the primers given in Table I are used to amplify a DNA.
  • the primers can be prepared by conventional methods.
  • the method according to the invention can be carried out under customary amplification and hybridization conditions. Reference is made to example 1.
  • genes With the present invention it is possible to detect genes. With the amplification of sequences characteristic of genes and the use of these in hybridization with a DNA library, genes can be assigned to specific clones. The genes can then be further characterized and sequenced using conventional methods. The expression of the genes can also be detected. For this it is advisable to use different cDNAs, e.g. a normal cell and a tumor cell to amplify and hybridize with a cDNA library. Expression differences can thus be determined. Such offers e.g. to find genes related to diseases. Furthermore, the present invention is characterized in that it can be carried out in a simple and reliable manner. In particular, the method according to the invention is generally applicable, i.e. genes from a wide variety of cells or individuals can be detected and their expression determined. The present invention thus makes a major contribution to the elucidation of genomes and their functions.
  • FIG. 1 shows the ampiification of a genomic DNA from the hybrid mouse cell line 578 which contains the human X chromosome (A). Hybridization of the amplified DNA with a genomic DNA library relating to the human X chromosome (ATCC Cat. No. 57750) is shown in (B). 2 shows 10 clones from the DNA library relating to the human X chromosome, which hybridized with the amplified DNA from cell 578. These clones were digested with the restriction enzymes BssHIl, Notl, Sacll and EcoRI, the latter restriction enzyme being used to separate the vector from the inserts. Of the first 3 restriction enzymes, their recognition sequences were used as primers in the amplification of the DNA from the cell line 578.
  • BssHII recognition sequence is found in seven clones, Sacll- in five clones and Notl- in two clones (A, B). Hybridization of the blot of (B) with the amplified DNA from cell line 578 is shown in (C).
  • FIG. 3 shows 16 clones from the DNA library relating to the human X chromosome, which hybridized with the amplified DNA from the cell line 578.
  • the clones were cleaved with EcoRI, separated on a 0.8% agarose gel, subjected to a blot method and hybridized with the amplified DNA from cell line 578. 15 defined bands can be seen (A).
  • the same filter was washed off and hybridized with the amplified DNA from the hybrid hamster cell 853, which contains the human Y chromosome (B). Four clones also hybridized.
  • the invention is illustrated by the following example.
  • Genomic DNA was isolated from the hybrid mouse cell line 578. 30 ng of the genomic DNA were subjected to an amplification reaction in which the primers BssHIl, Notl and Sacll (see Table I) were used.
  • the conditions for the amplification reaction were as follows: 1 min at 95 ° C, 1 min at 35 ° C, 1 min at 50 ° C; 30 cycles.
  • Cold amplification reaction 100 ⁇ l volume: 10 ⁇ l (30 ng) genomic DNA, 10 ⁇ i (200 ng) primer, 10 ⁇ l 2 mM dNTP, 10 ⁇ l 10 ⁇ reaction buffer, 60 ⁇ l H 2 O, 1 ⁇ l (5 units) Taq polymerase.
  • the amplification products obtained were separated in a 1.2% agarose gel.
  • the products obtained had a size of 100-2000 bp (see FIG. 1 (A)).
  • the amplification reaction was carried out in 10 cycles under the same conditions as for the cold amplification reaction. After completion of the amplification reaction, the labeled amplification products were separated from the unincorporated nucleotides using the "spin column S-400" from Pharmacia. The labeled amplification products were heated for 10 minutes, cooled on ice for 3 minutes and used for hybridization.
  • PIaques of 50,000 clones from a genomic DNA library relating to the human X chromosome were transferred to a Hybond N + membrane.
  • the membrane was then denatured with 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl and neutralized with 1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl pH 7.2, 1.0 mM EDTA pH 8.0.
  • the DNA was bound to the membrane by UV cross-linking.
  • the membrane was prehybridized in Church buffer (0.5 M sodium phosphate, pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA) for 18 h. The hybridization was carried out overnight at 65 ° C.
  • the phage DNA was isolated from ten positive clones and subjected to a restriction cleavage with the restriction enzymes BssHII, NotI, SacII and EcoRI (cf. FIG. 2 (A), (B)). Furthermore, the gel of FIG. 2 (B) was subjected to a blot method and hybridized with the amplified DNA from the hybrid cell 578 (cf. FIG. 2 (C)).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Genen und ihrer Expression, bei dem eine DNA mit für Gene spezifischen Primern amplifiziert und die amplifizierte DNA zur Hybridisierung mit einer DNA-Bibliothek verwendet wird.

Description

Nachweis von Genen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Genen und ihrer Expression.
Seit Jahren wird verstärkt daran gearbeitet, das Genom von Lebewesen, insbesondere Tieren bzw. dem Menschen, aufzuklären. Besonders wird versucht, Gene zu finden, die Entwicklungs- bzw. Stoffwechsel prozesse steuern. Auch wird nach Genen gesucht, die mit Erkrankungen in Verbindung stehen. Hierzu werden die verschiedensten Verfahren verwendet. Diese Verfahren leiden allerdings alle darunter, daß sie sehr aufwendig und schwer reproduzierbar sind.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem in einfacher und zuverlässiger Weise Gene nachgewiesen und gegebenenfalls ihre Expression ermittelt werden können.
Erfinduπgsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren, das die Ampiifikation von DNA und ihre Hybridisierung mit einer DNA-Bibliothek umfaßt, wobei Primer für die Ampiifikation verwendet werden, deren Sequenzen für Gene charakteristisch sind.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß im transkribierten 5'-Bereich von Genen, den sog. "CpG islands", Sequenzen vorliegen, die hochkonserviert sind. Der Anmelder hat diese Sequenzen in Genen von Lebewe- sen, insbesondere Tieren bzw. dem Menschen, Viren und Pflanzen gefunden. Die Sequenzen sind in Tabelle I angegeben. Sie weisen pallindrome Strukturen auf und stellen vollständige bzw. Teile von Erkennungssequenzen seltener Restriktionsenzyme dar. Ferner hat der Anmelder erkannt, daß mittels dieser Sequenzen als Primer DNA-Abschnitte von Genen amplifiziert und diese zum Nachweis der Gene und ihrer Expression verwendet werden können.
Erfindungsgemäß werden diese Erkenntnisse für ein Verfahren genutzt, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:
(a) Ampiifikation einer DNA mit einem bis allen der folgenden Primer:
5'-GCGCGCNN-3' 5'-GCGGCCGC-3'
5'-CCGCGGNN-3'
5'-CGCGNNNN-3'
5'-GGCGCGCC-3'
5'-GGGCCCNN-3' 5'-CGATCGNN-3'
5'-CGG(A.T)CCGN-3'
5'-CGGCCGNN-3'
5'-GGCCGGCC-3'
5'-ACGCGTNN-3' 5'-GCCGGCNN-3'
5'-GGCGCCNN-3'
5'-CCNNGGNN-3'
5'-TCGCGANN-3'
5'-CGGNCCGN-3' 5'-GTCGACNN-3'
5'-GGCCNNGGCC-3'
5'-CGCCGGCG-3'
5'-GCCCGGGC-3' wobei N G oder C ist, und
(b) Hybndisierung der amplifizierten DNA mit einer DNA-Bibliothek.
Der Ausdruck "DNA" umfaßt jegliche DNA, von der Abschnitte amplifiziert werden können, wenn mindestens einer der Primer von Tabelle I verwendet wird. Die Ampiifikation kann durch übliche Verfahren, z.B. über eine Gelelektrophorese, verfolgt werden (vgl. Fig. 1 (A)). Insbesondere kann die DNA eine genomische oder eine extrachromosomale DNA sein. Auch kann sie eine cDNA sein. Der Ausdruck "genom- ische DNA" umfaßt sowohl Zeil-DNA als auch Virus-DNA, die in das Genom integriert ist. Ein Beispiel solcher Virus-DNA ist HPV-DNA. Ferner umfaßt der Ausdruck "extrachromosomale DNA" jegliche DNA, die nicht in das Genom integriert ist, was für die DNA von lytischen Viren gilt. Die DNA kann aus jeglichen Zellen stammen. Diese können in Kultur gehalten oder frisch aus einem Individuum isoliert sein. Die Zellen können normal oder verändert sein bzw. pathogene Eigenschaften aufweisen. Insbesondere können die Zellen Tumorzellen sein. Der Ausdruck "Individuum" umfaßt jegliche Individuen, insbesondere Tiere bzw. den Menschen und Pflanzen. Erfindungsgemäß werden Hybrid-Tierzellen bevorzugt, die das humane X- oder Y-Chromosom bzw. eine humane X-Y Translokation enthalten, wodurch die pseudoautoso- male Region Xp22.3 distal zu MIC2 verloren gegangen ist. Solche Hybrid-Tierzellen sind bekannt (vgl. Burk, R.D. et al., Mol. Cell Biol. 5 (1985), 576-581 ; Ropers, H.H. et al., Cytogenet. Cell Genet. 40 (1985), 736.
Der Ausdruck "DNA-Bibliothek" umfaßt jegliche DNA-Bibliothek, mit der die DNA hybridisieren kann. Insbesondere kann die DNA-Bibliothek eine genomische DNA- oder eine cDNA-Bibliothek sein. Der Ausdruck "Hybridisierung" weist auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 30°C unter dem Schmelzpunkt der DNA hin. Die DNA-Bibliothek kann von einer DNA jeglicher Zellen hergestellt sein. Diese können normal oder verändert sein bzw. pathogene Eigen- schalten aufweisen. Insbesondere können die Zellen Tumorzellen sein. Des weiteren können die Zellen von jeglichem Individuum, insbesondere Tieren bzw. dem Menschen oder Pflanzen, stammen. Erfindungsgemäß wird eine DNA-Bibliothek bevorzugt, die im λ-Vektor Charon 35 das humane X-Chromosom enthält (ATCC Cat.No. 57750).
Die DNA und die DNA-Bibliothek können von der gleichen Spezies, insbesondere vom gleichen Individuum, stammen. Auch können sie von verschiedenen Individuen der gleichen Spezies stammen. Ferner kann es günstig sein, wenn die DNA und die DNA-Bibliothek von verschiedenen Spezien stammen.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren werden die in Tabelle I angegebenen Primer zur Ampiifikation einer DNA verwendet. Die Primer können durch übliche Verfahren hergestellt werden. Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren unter üblichen Amplifikations- und Hybridisierungsbedingungen durchgeführt werden. Es wird auf Beispiel 1 verwiesen.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Gene nachzuweisen. Mit der Ampiifikation von für Genen charakteristischen Sequenzen und der Verwendung dieser in der Hybridisierung mit einer DNA-Bibliothek können Gene bestimmten Klonen zugewiesen werden. Die Gene können dann durch übliche Verfahren weiter charakterisiert und sequenziert werden. Des weiteren kann die Expression der Gene nach- gewiesen werden. Hierzu bietet es sich an, verschiedene cDNAs, z.B. einer normalen Zelle und einer Tumorzelle, zu amplifizieren und mit einer cDNA-Bibliothek zu hybridisieren. Damit können Expressions-Unterschiede festgestellt werden. Solches bietet sich z.B. an, um Gene zu finden, die mit Erkrankungen in Verbindung stehen. - Desweiteren zeichnet sich die vorliegende Erfindung dadurch aus, daß sie in ein- facher und zuverlässiger Weise durchgeführt werden kann. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren generell anwendbar, d.h. es können Gene unterschiedlichster Zellen bzw. Individuen nachgewiesen und in ihrer Expression bestimmt werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung einen großen Beitrag zur Aufklärung von Genomen und ihrer Funktionen dar.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Fig. 1 zeigt die Ampiifikation einer genomischen DNA aus der Hybrid-Mauszellinie 578, die das menschliche X-Chromosom enthält (A). In (B) wird die Hybridisie- rung der amplifizierten DNA mit einer genomischen das humane X-Chromosom betreffenden DNA-Bibliothek (ATCC Cat. No. 57750) gezeigt. Fig. 2 zeigt 10 Klone aus der das humane X-Chromosom betreffenden DNA-Bibliothek, die mit der amplifizierten DNA aus der Zelliπie 578 hybridisierten. Diese Klone wurden mit den Restriktioπsenzymen BssHIl, Notl, Sacll und EcoRI gespalten, wobei letzteres Restriktionsenzym zur Abtrennungdes Vektors von den Inserts durchgeführt wurde. Von den ersteren 3 Restriktioπsenzymen wurden deren Erkenπungssequenzen als Primer in der Amplifizierung der DNA aus der Zellinie 578 verwendet. BssHII-Erkennungssequenz findet sich in sieben Klonen, Sacll- in fünf Klonen und Notl- in zwei Klonen (A,B). In (C) wird die Hybridisierung des Blots von (B) mit der amplifizierten DNA aus der Zellinie 578 gezeigt.
Fig. 3 zeigt 16 Klone aus der das humane X-Chromosom betreffenden DNA-Bibliothek, die mit der amplifizierten DNA aus der Zellinie 578 hybridisierten. Die Klone wurden mit EcoRI gespalten, auf einem 0,8 %igen Agarosegel aufge- trennt, einem Blot- Verfahren unterzogen und mit der amplifizierten DNA aus der Zellinie 578 hybridisiert. 15 definierte Banden sind zu erkennen (A). Der gleiche Filter wurde abgewaschen und mit der amplifizierten DNA aus der Hy- brid-Hamsterzelliπie 853, die das humane Y-Chromosom enthält, hybridisiert (B). Vier Klone hybridisierten ebenfalls. Drei Insert-Banden aus dem Klon X26, einschließlich der gemeinsamen XY-Bande, wurden aus dem Agarosegel isoliert und zur Hybridisierung mit geπomischen Southern Blots verwendet, die DNA aus den Zellinien 578, 853 bzw. 815 x175k7 (vgl. Beschreibung) enthielten. Die gemeinsame positive Bande ergab eine Schmier-Hybridisierung (Daten nicht gezeigt). Die kleinere Bande ergab eine X-spezifische Hybridisie- rung (C), während die kleinste Bande eine homologe Sequenz zwischen den
X- und Y-Chromosomen ergab, wobei unterschiedliche Hybridisieruπgsmuster für beide Chromosomen erhalten wurden (D).
Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel erläutert.
Beispiel: Nachweis von Genen des humanen X-Chromosoms 1. Ampiifikation von DNA aus der Hybrid-Mauszellinie 578
Aus der Hybrid-Mauszellinie 578 wurde genomische DNA isoliert. 30 ng der genomischen DNA wurden einer Ampiifikationsreaktion unterzogen, in der die Primer BssHIl, Notl und Sacll (vgl. Tabelle I) verwendet wurden.
Die Bedingungen für die Amplifikations-Reaktion waren wie folgt: 1 Min. bei 95°C, 1 Min.bei 35°C, 1 Min. bei 50°C; 30 Zyklen.
Kalte Amplifikations-Reaktion: 100 μl Volumen: 10 μl (30 ng) genomische DNA, 10 μi (200 ng) Primer, 10 μl 2 mM dNTP, 10 μl 10 x Reaktioπspuffer, 60 μl H2O, 1 μl (5 Einheiten) Taq-Polymerase.
Die erhaltenen Amplifikations-Produkte wurden in einem 1 ,2 % Agarosegel aufgetrennt. Die erhaltenen Produkte hatten eine Größe von 100-2000 bp (vgl. Fig. 1 (A)).
Radioaktive Markierung der Amplifikations-Produkte 100 μl Volumen:
10 μl kalte Amplifikations-Produkte, 10 μl (200 ng) Primer,
10 μl 10 x -C dNTP-Gemisch (200 μM dTTP, dGTP, dATP), 10 μl 10 x Reaktionspuffer, 50 μl H2O,
1 μl (5 Einheiten) Taq-Polymerase, und 10 μl (90 μCi)[α-3 p]dCTP.
Die Amplifikations-Reaktion wurde in 10 Zyklen unter den gleichen Bedingungen wie für die kalte Amplifikations-Reaktion durchgeführt. Nach Abschluß der Amplifikations- Reaktion wurden die markierten Amplifikations-Produkte von den nicht-eingebauten Nukleotiden unter Verwendung des "spin columns S-400" von Pharmacia abgetrennt. Die markierten Amplifikations-Produkte wurden 10 Min. erhitzt, 3 Min. auf Eis gekühlt und für eine Hybridisierung verwendet.
2. Hybridisierung der amplifizierten DNA mit einer DNA-Bibliothek
PIaques von 50000 Klonen einer das humane X-Chromosom betreffenden genomischen DNA-Bibliothek (ATCC Cat. No. 57750) wurden auf eine Hybond N+Membran übertragen. Anschließend wurde die Membran mit 0,5 M NaOH, 1 ,5 M NaCI denaturiert und mit 1 ,5 M NaCI, 0,5 M Tris-HCI pH7,2, 1 ,0 mM EDTA pH 8,0 neutralisiert. Die DNA wurde über UV-Cross-linking an die Membran gebunden. Die Membran wurde in "Church buffer (0,5 M Natriumphosphat, pH 7,2, 7 % SDS, 1 mM EDTA) 18 h vorhybridisiert. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 65°C in gleichem Puffer durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurde die Membran 3 x 20 Min. bei 65°C mit 50 mM W2-Puffer (Di-Natriumhydrogenphosphat-dihydratNa2HpO4.2H2O) pH 7,2 gewaschen und einer Autoradiographie unterworfen (vgl. Fig. 1 (B)).
Es zeigte sich, daß 500 Klone der 50000 Klone mit der amplifizierten DNA hybridisierten. 3. Charakterisierung von Klonen, die mit der DNA aus der Zellinie 578 hybridisierten
Aus zehn positiven Klonen wurde die Phagen-DNA isoliert und einer Restriktioπs- Spaltung mit den Restriktionsenzymen BssHIl, Notl, Sacll und EcoRI unterzogen (vgl. Fig. 2 (A),(B)). Ferner wurde das Gel von Fig. 2 (B) einem Blot-Verfahren unterzogen und mit der amplifizierten DNA aus der Hybrid-Zelliπie 578 hybridisiert (vgl. Fig. 2 (C)).
Es zeigte sich, daß sieben Klone BssHIl, fünf Klone Sacll und zwei Klone Notl-Restrik- tionsstellen enthielten.
Des weiteren wurden 16 Klone aus der das humane X-Chromosom betreffenden genomischen DNA-Bibliothek, die mit der amplifizierten DNA aus der Hybrid-Zellinie 578 hybridisierten, mit EcoRI gespalten, auf einem 0,8 %igen Agarosegel aufgetrennt, einem Blot-Verfahren unterzogen und mit der amplifizierten DNA aus der Hybrid- Zellinie 578 hybridisiert (vgl. Fig. 3 (A)).
Es zeigte sich, daß in 15 Klonen definierte Banden hybridisierten.
Der gleiche Filter wurde abgewaschen und mit der amplifizierten DNA aus der Zellinie 853, die ein humanes Y-Chromosom enthält, hybridisiert (vgl. Fig. 3 (B)).
Es zeigte sich, daß vier Klone hybridisierten.
Drei Insertbanden aus dem Klon X26, einschließlich der XY-gemeinsamen positiven Bande, wurden aus dem Agarosegel gereinigt und in genomischen Southern Blots, die DNA aus den Zellinien 578, 853 bzw. 815 x 175 k7 enthielten, hybridisiert (vgl. Fig. 3 (C), (D)).
Es zeigte sich, daß die gemeinsame positive Bande eine Schmier-Hybridisierung ergab (Daten nicht gezeigt). Die kleinere Bande ergab ein X-spezifisches Hybridisie- rungssignal (Fig. 3 (C), während die kleinste Bande eine homologe Sequenz zwischen den Chromosomen X und Y zeigte, obwohl unterschiedliche Hybridisierungs- muster für beide Chromosomen erkenntliche waren (Fig. 3 (D)).
Tabelle I
BssHIl 5'-GCGCGCNN-3'
Notl 5'-GCGGCCGC-3'
Sacll 5'-CCGCGGNN-3'
Accl 5'-CGCGNNNN-3'
Ascl 5'-GGCGCGCC-3'
Apal 5'-GGGCCCNN-3'
10 Bspl 5'-CGATCGNN-3'
Cspl 5'-CGG(A,ηCCGN-3'
EclXI 5'-CGGCCGNN-3'
Fsel 5'-GGCCGGCC-3'
Mlul 5'-ACGCGTNN-3'
15 Nael 5'-GCCGGCNN-3'
Narl 5'-GGCGCCNN-3'
NciL 5'-CCNNGGNN-3'
Nrul 5'-TCGCGANN-3'
Rsrll 5'-CGGNCCGN-3'
20 Sall 5'-GTCGACNN-3'
Sfil 5'-GGCCNNGGCC-3'
SgrAI 5'-CGCCGGCG-3'
Srfl 5'-GCCCGGGC-3' wobei N G oder C ist.
25

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von Genen, umfassend die folgenden Verfah- rensschritte:
(a) Ampiifikation einer DNA (a) mit einem bis allen der folgenden Primer:
5'-GCGCGCNN-3'
5'-GCGGCCGC-3'
5'-CCGCGGNN-3' 5'-CGCGNNNN-3'
5'-GGCGCGCC-3'
5'-GGGCCCNN-3'
5'-CGATCGNN-3'
5'-CGG(A,T)CCGN-3' 5'-CGGCCGNN-3'
5'-GGCCGGCC-3'
5'-ACGCGTNN-3'
5'-GCCGGCNN-3'
5'-GGCGCCNN-3' 5'-CCNNGGNN-3'
5'-TCGCGANN-3'
5'-CGGNCCGN-3'
5'-GTCGACNN-3'
5'-GGCCNNGGCC-3' 5'-CGCCGGCG-3'
5'-GCCCGGGC-3' wobei N G oder C ist, und
(b) Hybridisierung der amplifizierten DNA mit einer DNA-Bibliothek.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die DNA eine genomische DNA ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die DNA eine cDNA ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die DNA eine extrachromosomaie DNA ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die DNA-Bibliothek eine genomische DNA-Bibliothek ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die DNA-Bibliothek eine cDNA-Bibliothek ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei die DNA und die DNA-Biblio- thek von der gleichen Spezies stammen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die DNA und die DNA-Bibliothek vom gleichen Individium stammen.
9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die DNA und die DNA-Bibliothek von verschiedenen Individuen stammen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei die DNA und die DNA-Bibliothek von verschiedenen Spezien stammen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, wobei verschiedene cDNAs zur Hybridisierung mit einer DNA-Bibliothek eingesetzt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , wobei die Expression von Genen, insbesondere Expressions-Unterschiede, nachgewiesen werden.
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